PT98470B

PT98470B - Processo para a preparacao de um veiculo imunogenico lipossomico para antigenes

Info

Publication number: PT98470B
Application number: PT98470A
Authority: PT
Inventors: Howard R Six; Nathalie Garcon
Original assignee: Res Dev Foundation
Priority date: 1990-07-27
Filing date: 1991-07-26
Publication date: 1998-02-27
Also published as: FI930319A; NO930202D0; IE912535A1; CA2088163A1; ATE157537T1; RU2107493C1; CA2088163C; DK0542923T3; GR3025377T3; ZA915755B; DE69127545T2; JPH06502630A; PT98470A; KR100213851B1; WO1992002243A1; NZ239072A; FI930319A0; AU8759791A; US5464630A; EP0542923A1

Description

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UM VEÍCULO IMUNOGÉNICO

LIPOSSÕMICO PARA ANTIGENES

ANTECEDENTES DA PRESENTE INVENÇÃO

1. Âmbito da presente invenção

A presente invenção refere-se a intensificação de res. posta dos anticorpos para um antigeno alvo, por incorporação do antigeno no interior de um lipossoma em simultâneo com um constituinte adicional que contenha, pelo menos, um sítio de reconhecimento de linfócitos auxiliares T.

2, Descrição da tecnologia que lhe esta associada

Um antigeno de uma vacina confere imunidade para a infecção induzindo o organismo a produzir uma resposta imunitária. No entanto, a utilidade dos antigenos varia consoante o vigor da resposta imunológica induzida por eles. Existem antigenos ine rentemente fortes e fracos em graus variáveis. Para além disso, podem classificar-se os antigenos como dependentes do timo (T) ou antigenos independentes de T, com base na sua capacidade de estimular a actividade auxiliar das células T. Esta actividade das células T encontra-se associada â produção de anticorpos das classes IgG e IgA. Os antigenos independentes de T induzem a pro dução de anticorpos IgM, mas não induzem as células B a ligarem-se a anticorpos IgG ou IgA de síntese. A produção de imunoglobulinas da classe IgM consiste numa resposta transitória em animais de laboratório e em seres humanos que se mantêm apenas du-Ί-

antigeno e especialmente para antigenos fracos, que nao conseguiriam originar uma produção suficiente de anticorpos.

As vesículas lipossômicas da presente invenção proporcionam uma nova abordagem para a concepção de vacinas de síntese. Podem incorporar-se cópias múltiplas de antigeno alvo e de péptido ou pêptidos auxiliares de acordo com um método fácil e rápido. Para além de proporcionar uma imunização eficaz e melhorada para o antigeno alvo, a presente abordagem per mite um ensaio fãcil de antigenos e de pêptidos auxiliares.

Por exemplo, a presente invenção proporciona um veículo simples para comparação da capacidade dos diversos pêptidos auxiliares T para intensificar a resposta imunogénica para um dado antigeno, Deste modo, a presente invenção também proporciona um veículo útil para pesquisar o mecanismo de resposta imunolõgica.

A partir da descrição que se segue dos aspectos presentemente preferenciais da presente invenção, outros aspectos, caracteristicas e vantagens tornar-se-ão evidentes.

DESCRIÇÃO· PORMENORIZADA DOS ASPECTOS PREFERENCIAIS

Pode utilizar-se a composição de vacinas da presente invenção para intensificar a resposta imunolõgica para qualquer antigeno alvo e, preferencialmente, para os antigenos independentes de T, A exemplificação da presente invenção é feita ten do como referência DNP-CapPE que se estudou pormenorizadamente como um antigeno independente de T. Será, no entanto, óbvio para o especialista que a presente invenção se aplica a qualquer antigeno. De acordo com o aspecto preferencial da presente invenção, sintetiza-se uma vacina de síntese que induz uma respo£> ta imunolõgica dependente de T para um antigeno independente de

T. Incorpora-se ο antigeno alvo na preparação lipossomica simultaneamante com um pêptido ou péptidos auxiliares que contêm um sítio de reconhecimento de células T. Pode utilizar-se qualquer pêptido que contenha um sítio de reconhecimento de cê lulas T como pêptido auxiliar, como por exemplo, péptidos na ti vos ou destoxifiçados a partir de toxõides, tais como os de in fluenza, tétano, pseudomonas diftêricas, estafilococus, estrep tococus, pertussis e Escherichia Coli. Pode efectuar-se um sim pies ensaio para se determinar se um pêptido hipotético contêm um sítio de reconhecimento de células T. Incorpora-se o pêptido na preparação lipossomica simultaneamente com um antigene, tal como DNP-CapPE, que contenha apenas um epitope de cê lula B. Se se verificar uma resposta IgG para a preparação lipossomica resultante no organismo hospedeiro, então o pêptido possui um sítio de reconhecimento de células T e pode servir como pêptido auxiliar da presente invenção.

Utiliza-se preferencialmente a sub-unidade HA^ da proteína hemaglutinina de influenza como pêptido auxiliar, devido ao facto de se encontrar bem definida e de se saber que possui, pelo menos, um sítio de reconhecimento de células auxi liares T, não possuindo, no entanto, o sítio de reconhecimento de células B, Deste modo, este pêptido origina uma resposta imunolôgica dependente de T para o antigene conjugado mas não induz uma resposta óes anticorpos contra si prõprio. Esta limitação não é necessária para o funcionamento da presente invenção? também se pode utilizar qualquer pêptido auxiliar que con tenha um sítio de reconhecimento de células B se se pretender uma resposta Imunolôgica ao pêptido auxiliar ou se essa respojs ta imunolôgica for aceitável para além da resposta do antigene

39alvo. No entanto, considera-se preferencial que o péptido auxi liar seja um epitope puro de células auxiliares T. De modo idêntico, pode também utilizar-se qualquer péptido auxiliar que contenha um sítio de reconhecimento linfocítico T-citotoxico se se pretender uma resposta citotóxica ou se esta resposta for desejável ou aceitável para além da resposta do antigene alvo.

Para além disto, a sub-unidade HA₂ é adequada como um péptido auxiliar devido ao facto de ser portadora duma sequência hidrofobica de aminoãcidos próxima da extremidade carboxi, que se estende, normalmente, através de um invólucro lipídico do virus. Esta região de transmembrana facilita a associação com as bi-camadas lipídicas dos lipossomas e HA₂ encontra-se quantitativamente associada com as vesículas lipossómicas. Tal como se expôs anteriormente, também ê possível aplicarem-se mé todos alternativos de incorporação de péptidos auxiliares, tais como, por exemplo, a ligação covalente do péptido ou lípido ou a ligação de uma sequência hidrofóbica de aminoãcidos a uma ex tremidade do péptido. Será óbvio para um especialista que ê possível utilizarem-se diversos métodos para incorporação de péptidos auxiliares nos lipossomas.

Escolheu-se o DNP-CapPE como o antigene alvo, devido ao facto de se encontrar bem estudado e de ser um antigene independente de T. Deste modo, nos exemplos que se seguem a resposta dependente de T a DNP-CapPE surge em função da influência do péptido auxiliar. Pode utilizar-se a preparação lipossó mica da presente invenção para aumentar a resposta imunológica num indivíduo. 0 termo indivíduo refere-se a qualquer animal, de preferência a um mamífero e de um modo a que se dá maior preferência a cães, gatos, vacas, cavalos ou seres humanos.

-10Exemplo 1- Preparação de lipossomas. Para se levar a efeito a presente invenção pode utilizar-se uma ampla variedade de materiais lipídicos, que englobam, embora a isso não se limitem, esteres fosfatidílicos ou éteres fosfatidílicos (como por exem pio, fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina), gliceridos, ce rebrosidos, gangliósidos, esfingomielinas ou esteroides (como por exemplo, colesterol). A seguir, apresenta-se um exemplo de uma preparação em que se utiliza fosfatidilcolina, embora o es pecialista verifique que se pode utilizar qualquer técnica de preparação lipossõmica que permita a incorporação do antigene alvo e da proteína ou proteínas auxiliares. Antes de se efectuar a preparação do lipossoma, pode ser necessário ligar de modo covalente o antigene alvo e/ou o pêptido auxiliar a um dos componentes lipidlcos, de acordo com um dos métodos bem conhecidos, no sentido da facilitar a sua incorporação. Utilizou-se fosfatidilcolina (FC) (Avanti polar lipids, Pelham, AL) purificada a partir de gema de ovo (FCGO) para se prepararam os lipossomas. Adicionou-se FCGO a um balão de fundo redondo na quan tidade desejada e eliminou-se o clorofórmio num evaporador rotativo (Buchi 461). Efectuou-se uma suspensão da película lipidlca lavada em ãgua esterilizada ou em solução salina de fosfato tampão (SFT) em quantidades suficientes'para se produzir uma solução 10 mM de FCGO. Quando se incorporou o antigene DNP-rCapPE nos lipossomas, adicionou-se a solução de clorofórmio de FCGO, N-2(2,4 dinitrofenil-E-aminocaproilfosfatidiletanolamina (DNPv-CapPE) . A sub-unidade HA₂ purificada (proporcionada por Doris Bucher, Mt. Sinia, NY) é derivada de hemaglutinina (HA) do virus A/USSR-90/77 e também foi adicionada â película lipidlca para inclusão nos lipossomas. Formaram-se,assim,

os lipossomas, quer por suspensão da mistura lipídica em SFT esterilizada ou por dissolução da mistura lipídica em n-octil glicosido (5% p/vol em SFT) seguida de diãlise contra SFT. durante 16 horas. As quantidades de DNP-CapPE e de HA₂ incluídas nas preparações lipossomicas individuais variaram consoante as necessidades do ensaio.

Exemplo 2 - Caracterização dos lipossomas; no sentido de se ensaiar a associação de HA₂ as estruturas lipossomicas, utili125 zou-se I HA₂· ^{Para se ensaaar a} incorporação de DNP-CapPE nos lipossomas, dissolveram-se aliquotas (10 yil) da suspensão inicial em 990 jtl de metanol e leu-se a absorvância a um comprimento de onda 360 mM, num espectrofotometro. A percentagem de associação de HA₂ nas preparações, seguida da reconstituição com SFT e de diãlise não se alterou significativamente com quantidades variáveis de HA₂, tendo sido superior a 90%. A per centagem de associação de DNP-CapPE na preparação foi superior a 95% em todas as preparações. Não se verificou a libertação de DNP entre as injecções. A DNP-CapPE conservou-se associada âs estruturas lipossõmicas.

Exemplo 3 - Protocolo de imunização: utilizaram-se fêmeas de ratos albinos híbridos IRC (Timco, Houston, Tx) com idade compreendida entre 6 e 8 semanas. Recolheu-se o sangue dos animais a partir da veia da cauda e depois administrou-se-lhes 0,1 ml de placebo (SFT) , lipossomas de controlo (sem ser HA₂ ou hajo teno) ou lipossomas contendo as quantidades indicadas de hapteno e/ou do pêptido HA₂· Três a quatro semanas mais tarde recolheu-se novamente o sangue dos ratos, a partir da veia da cauda e administrou-se-lhes uma inoculação de reforço com a mesma

preparação e com a mesma quantidade da inoculação inicial. Nove a catorze dias mais tarde recolheu-se novamente o sangue dos animais a partir da veia da cauda. Opcionalmente, administrou-se ao rato uma terceira inoculação oito semanas após a última injecção e recolheu-se novamente o sangue dos animais duas sema nas mais tarde. Todas as inoculações foram administradas por via intra-muscular (IM) nas patas posteriores. Conservaram-se os ra tos em gaiolas de plástico (quatro animais por gaiola) com filtros de barreira e foi-lhes fornecida alimentação e ãgua at libitum. Separou-se o soro por centrifugação a 2000 x g durante 5 minutos, a 4 C e armazenou-se a -20 C ate se ensaiar. Todos os espécimes de soro de cada um dos ensaios foram ensaiados para se verificar a acção de anticorpos num único ensaio.

Exemplo 4- Ensaios de anti-corpos séricos anti-dinitrofenilo (DNF). Utilizou-se albumina de soro de bovino di-nitrofenilada (DNP-BSA) para se ensaiar o antigene e utilizou-se BSA não derivatizada como um antigene de controlo. Preparou-se DNP-BSA adicionando dinitrofluorobenzeno a uma solução de BSA numa proporção molar de 10:1; adicionou-se trietanolamina até se atingir um pH compreendido entre 9 e 9,5. Após incubação a 20°C, durante 16 horas, eliminou-se o DNP não ligado por diãlise contra SFT. Os ensaios preliminares demonstraram que o SFT derivatizado nesta proporção molar detectava os anticorpos séri cos de um modo mais eficaz do que as proteínas contendo proporções molares mais elevadas ou mais baixas que DNP. Determinaram τ-se os níveis de anticorpos séricos de acordo com os procedimen tos ELISA e SPIRA;

ELISA: Cobriram-se placas Immulon I (Dynatech, Detroit MI) com DNP-BSA (10 ug por tubo) em tampão de carbonato 0,05 M (pH 9,6)_ζ revestiram-se os tubos de controlo com 10Jig por tubo de BSA, Decorridas 16 horas a 4°C, revestiram-se posteriormente as placas com 5% (volune/volume) de FCS em SFT. Após esta e outras incubações, lavaram-se as placas com SFT contendo 1% de FCS e 0,2% de Tween 20. Preparam-se diluições duplas em série de soro com inicio numa proporção de 1:100 em SFT contendo 1% de BSA em duplicado e amostras de 0,1 ml de cada uma das diluições foram adicionadas ao tubo com antigene e aos tubos de controlo. Apõs incubação de 5 horas a 20 C, adicionaram-se anticor pos de cabras específicos para a cadeia pesada da IgG do murino conjugados com fosfatase alcalina, (FC-específicos, Cappel lab, West Chester, PA) ou sub-classes de IgG de murino numa concentração que se determinou em ensaios preliminares encontrar-se em excesso em relação ao que seria necessário para a detecção õptima dos anticorpos. No caso das sub-classes de IgG, adicionaram-se então anticorpos de suino conjugados com fosfatase alcalina específicos para a IgG da cabra. Adicionou-se (0,1 ml por tubo) de p-nitrofenilo (1 mg/ml) em tampão de dietanolamina a 10%, a um pH de 9,8. Fez-se a leitura das densidades õpticas a 410 nm, 1/2 hora depois, num espectrofotómetro Dynatech MR 600, As titulações de anticorpos expressaram-se como a diluição de soro mais elevada que proporcionou uma densidade õptica de 0,2 acima dos tubos de controlo.

SPIRA: Determinaram-se os níveis de anticorpos de DNF pelo ensaio SPIRA, tal como se descreveu para o ensaio ELISA apenas com duas modificações. Utilizaram-se placas de micro-titulação de cloreto de polivinilo, flexíveis e utilizou-se anti-lgG desenvolvida no coelho, purificada por afinidade e marcado com 125-1 (específica da cadeia pesada), para se detectar

-14a ligação dos anticorpos de murino ao antigeno DNF. Calcularam -se as titulações de anticorpos, tal como se descreveu anterior mente e determinaram-se especificamente os anticorpos anti-murino desenvolvidos no coelho e marcados radioactivamente, de acordo com ensaios normalizados de traços cruzados utilizando monoclonais de murino com especificidade para o HA₂ do virus da influenza, tal como se descreveu anteriormente.

Efectuaram-se as comparações das titulações dos anticorpos de acordo com o ensaio de Mann-Witney em que se incluiram dois grupos de ratos num único ensaio. Sempre que se encontravam envolvidas comparações entre mais do que dois grupos, utilizou-se o método de Krusdall-Wallis.

Exemplo 5 - Imunogenicidade dos lipossomas contendo DNP-CapPE e/ou a sub-unidade HA^. Injectaram-se, separadamente, grupos de ratos duas vezes, durante quatro semanas, com preparações de lipossomas de FCGO (750 yig) ou com lipossomas de FCGO contendo HA₂ (3,7 Jag) , DNP-CapPE (30 ^jtig) ou ambos (quadro 1). Analisaram-se as respostas de IgG e de IgM de acordo com o ensaio ELISA indirecto e expressaram-se com uma média das titulações de anticorpos. A proporção molar de lípido para DNP e HA₂ foi de 6000:200:1. As leituras do ELISA demonstraram que ambas as preparações que continham DNP-CapPE (com ou sem HA₂) originaram uma resposta de IgM em sete dos sete ratos. No entanto, quando se efectuou a titulação dos anticorpos séricos IgG anti-DNP os resultados mostraram-se drasticamente reduzidos no grupo de lipossomas DNP, proporcionando titulações idêndicas aos grupos de controlo, enquanto que os ratos imunizados com lipossomas de DNP/HA₂ induziram níveis significativamente superiores de IgG anti-DNP, séricos e especificos.

•QUADRO 1

Composição

Lipossomica

IgG

Titulação

Proporção de Reacção'

IgM

Titulação

Proporção de Reacção

PBS	210	+ 55	3/7	119	± ²¹	3/7
Lipossoma vazio	313	+ 145	3/7	290	+ 85	3/7
BA₂	205	+ 65	3/7	384	+ 190	3/7
DNP	188	+ 73	3/7	1312	+ 791	7/7
DNP-CapPE/HA₂	1974	+ 925	7/7	1490	+ 506	7/7

Esta variação nas classes de imunoglobulinas é unica mente atribuível à associação de HA₂ e DNP nas mesmas estruturas lipossômicas, uma vez que não se originaram anticorpos IgG anti-DNP quando se imunizaram os ratos com qualquer das mistu ras de HA₂ e DNP-CapPE em solução aquosa ou se injectaram conjuntamente lipossomas DNP-CapPE e lipossomas HA₂ (quadro 2). Ambos os componentes se encontram necessariamente em conjunto no mesmo lipossoma no sentido de estimular a produção de anticorpos IgG anti-DNP.

• ·. / · · *

QUADRO 2

Composição	IgG Titulação	Proporção	IgM Titulação	Proporção de Reacção
Lipossomica DNP-CapPE I	—2
de Reacção
lOjig	lyig	333 + 143	6/6	344 + 134	5/6
lOjig	3pg	391 + 124	6/6	300 + 165	6/6
10)ig	9jag	766 + 298	6/6	336 + 117	6/6
30^ig	i^g	358 + 165	6/6	364 + 145	5/6
30p.g	3^g	1241+ 336	6/6	396 + 119	6/6
30jjg	9jUg	2100+ 1127	6/6	1038 + 445	6/6
lOyig DNP-BSA		2245+ 898	6/6	0	0/6
lOJtig DNP-CapPE e	0	0/6	155 + 63	2/6

ΗΑ₂ em solução aquosa lOjig*

+ lp.g*	0	0/6	**
3/ig*	0	0/6	* *
9jig*	0	0/6	**
* DNP-CApPE e HA₂	foram	incorporados em	lipossomas separados e

administrados simultaneamente ** Ensaio não efectuado

Exemplo 6 - ' Respostas dependentes da dose DNP e HA, lipossômicas. Neste ensaio, estudaram-se três grupos de imunização, Para uma dada quantidade de DNP-CapPE (5, 10, 30 jig por injecção.) também se incorporaram quantidades variáveis de HA₂

-17- , /

(1, 3 ou 9 ^ig) nas preparações lipossomicas compostas por FCGO (750 yig/injecção). Recolheu-se o sangue dos animais um dia antes e nova dias depois de uma injecção de reforço idêntica. Analisaram-se os soros para se fazer o despiste de IgG anti-DNP e de IgM anti-DNP, de acordo com o ensaio ELISA. Para além disso, imunizaram-se dois grupos de ratos com lOyig de DNP-BSA ou DNP-CapPE e HA₂ simultaneamente misturados numa solução aquo sa.

Quando se analisaram estatisticamente os valores de IgM, do ELISA (quadro 2), os dois grupos que representavam 5 e lOjjg de DNP-CapPE não apresentaram diferenças significativas no que se refere a quantidades crescentes de HA₂ e por isso os resultados do grupo de 5 jag de DNP-CapPE não são apresentados. No entanto, observou-se uma diferença significativa quando se imunizaram os ratos com lipossomas, contendo 30yig de DNP-CapPE e 1, 3 ou 9jag de HA₂, proporcionando a taxa mais elevada, a titulação de IgM mais elevada. Não se observou qualquer resposta de IgM quando se imunizaram os ratos com 10 jug de DNP-BSA e apenas dois dos seis ratos proporcionaram uma resposta de IgM no grupo imunizado com DNP-CapPE e HA₂ em solução aquosa.

Quando se analisaram estatisticamente os valores de

IgG do ELISA (quadro 2), as respostas para uma dada quantidade de HA₂ (1, 3 ou 9^jig) e para quantidades crescentes de DNP-CapPE (5, 10 ou 30jjg) verificou-se que existiam diferenças significativas o que confirmou um efeito de resposta à dose, tanto pa ra DNP como para HA₂. Novamente se demonstra que a produção in tensificada de IgG se deve â presença simultânea do antigene alvo e do péptido auxiliar no mesmo lipossoma. Os ratos imunizados com DNP-BSA proporcionaram uma resposta de IgG comparavel à do grupo imunizado com a dose mais elevada de HA₂ e de DNP nos lipossomas que se ensaiou,. Não se detectou qualquer resposta de IgG no que se refere aos ratos imunizados com DNPem solução aquosa.

Exemplo 7 - Efeito de uma terceira injeeção de lipossomas de DNP-CapPE na resposta de anticorpos dos ratos previamente imunizados com lipossomas de DNP/HA₂. No sentido de se en saiar a existência de uma resposta em memória contra o antigene alvo de DNP quando se imunizavam previamente os ratos com lipojs somas de DNP-CapPE/HA₂, injectou-se um grupo de sete ratos, uma terceira vez, com lipossomas contendo apenas DNP-CapPE (proporcionando assim apenas sítios de células B). Este ensaio demonstra que apenas se produz uma resposta em memória quando DNP-CapPE se encontram simultaneamente presentes na preparação lipossõmica inicial. Este facto também demonstra que a presente invenção produz uma resposta imunolõgica dependente do timo bona fide, e uma memória Imunolõgica para o antigene alvo que pode produzir anticorpos IgG como resposta ao antigene alvo sem uma necessidade adicional da presença do sítio de reconhecimento das células T.

Tal como anteriormente se demonstrou, os ratos imunizados com lipossomas de DNP-CapPE/HA₂ originaram uma resposta de IgG anti/DNP. Quando se injectaram os mesmos ratos pela terceira vez, com lipossomas contendo apenas DNP-CapPE (grupo 1), as leituras do ensaio SPIRA aumentaram de modo drástico, em comparação com a primeira ou segunda recolhas, demonstrando a re-estimulação das células B especificas a um nível superior do que o produ zido pela primeira imunização. Os ratos imunizados com os lipossomas de HA₂ e depois, re-estimulados com lipossomas de DNP-CapPE ζ

(grupo 3) não produziram qualquer titulação de anticorpos IgG anti DNP detec.ta.veis . Os ratos injectados com lipossomas de DNP -CapPE/HA₂ uma so vez (grupo 2) proporcionaram um nível de anti corpos IgG anti DNP para a primeira imunização. Um grupo de con trolo (grupo 4) injectado com lipossomas cheios de FCGO demonstrou não existir qualquer produção de anticorpos IgG anti DNP.

QUADRO 3

Grupo ff	Recolhas ff	Titulação	Proporção de Reacção
1	1	1974 ± 975	7/7
	2	817 ± 270	7/7
	3	4071 + 1058	7/7
2	1	158 ± 28	3/7
	3	288 ± 75	3/7
3	0	—	0
4	0	____	0

Exemplo 8 - Membrana exterior de HA_O versus membrana ^Ύ,ΊΙ Η·' interna de HA₂ na resposta imunolôgica. Imunizaram-se quatro grupos de ratos híbridos com lipossomas de FCGO compostos por 30 jug de DNP-CapPE e diversas quantidades de HA₂ (3, 1, 0,5 e 0 Jig). Para alem disso, imunizou-se um grupo de ratos com liposso mas de DNP-CapPE/HA₂ (respectivamente, 30 e 3 yig) após tratamen to prévio dos lipossomas com bromelaina (100 yig/ml). O tratamen to com bromelaina cliva as proteínas de superfície, deixando ape nas a parte posterior inclusa da membrana e a sub-unidade HA₂ in terna e intacta. Quando se analisou estatisticamente a titulação do ELISA, observou-se um efeito de resposta â dose novamente com

-20Ζ £

uma quantidade crescente de HA₂» Quadro 4, Uma quantidade tão pequena quanto 0,5 Jtig de HA₂ nos lipossomas de DNP-CapPE por injecção, era suficiente para induzir uma resposta de IgG esta tisticamente diferente dos lipossomas de DNP-CapPE. No entanto, não se observou qualquer diferença estatística quando se imuni zaram os ratos com lipossomas tratados com bromelaina, em comparação com a resposta obtida para os mesmos lipossomas não tra tados. Estes resultados indicam que o HA₂ exterior aos lipossomas não ê necessário e que os lipossomas podem ser tratados no sentido de possuirem a combinação dos epitopes das células B e T para as células imunocompetentes.

QUADRO 4

Composição

Lipossomica

IgG

Grupo #	DNP-CapPE	HA_O	Titulação	Proporção de
1	30jag	3jHg	944 + 291	7/7
2	30jig	1/ig	471 + 97	7/7
3	30yig	0.5^jg	438 + 121	7/7
4	30/ig	0	198 + 88	2/7
5			808 + 315	7/7
	grupo i apos
	tratamento	dOS
	lipossomas	com
	bromelaina.

Exemplo 9 - Distribuição das sub-classes de imunoglobulina IgG durante a resposta imunológica. Quando se analisaram os resultados do ELISA o anticorpo IgGl demonstrou ser a sub-cla

21* se predominante.

A resposta de IgGl dos ratos híbridos a DNP foi idên tica ãs doses inferiores de DNP-CapPE (quadro 1) para diferentes concentrações de HA₂· Para concentrações mais elevadas de DNP-CapPE (30 jig), observou-se um efeito de resposta à dose pa ra quantidades crescentes de HA₂· Uma preparação lipossomica de PCGO, DNP-CapPE e de HA₂ de 750, 30 e 9yig, respectivamente, proporcionou uma resposta de IgGl comparável ã do grupo de ratos imunizados com 10 yig de DNP-BSA, um sistema veicular carac teristico de hapteno.

Não se observaram diferenças significativas com as sub-classes de anticorpos IgG2a e IgG2b (quadro 5). Os únicos grupos nos quais não foi possível detectar anticorpos?:IgG2a ou IgG2b foram os grupos de ratos imunizados com lipossomas de FCGO contendo 1 jig de HA₂ e 10 jig de DNP-CapPE (lgG2a e IgG2b) e 3 jig de HA₂ e 10 jig de DNP-CapPE (lgG2b). Para doses superiores de DNP-CapPE ou de HA₂, não se observaram diferenças significativas nas respostas. As respostas eram comparáveis ãs dos ratos imunizados com DNP-BSA.

Não se observaram diferenças significativas com a sub-classe de anticorpos IgG3. Em cada um dos grupos, foi detectada uma titulação e pelo menos quatro em seis ratos imunizados responderam (quadro 5). No entanto, apenas dois ratos imunizados com 10 ^ig de DNP-BSA reagiram, proporcionando titulações significati vamente inferiores ãs dos grupos de ratos imunizados com as preparações de lipossomas.

•. · / · · ·

QUADRO 5

Composição

Lipossomica IgG^ IgGn^

Proporção	Proporção
DNP-CapPE HA_n	de Reacção	Titulação	de Reacção	Titulação
lOyig ljig	3/6	180 + 70	0/6
lOjig 3jig	4/6	222 ± 79	4/6	190 ± 50
lOjjg 9jag	6/6	255 ± 52	6/6	241 + 78
30yig lyig	4/6	275 ± 102	4/6	326 t 92
30/ig 3jbg	6/6	370 í 186	6/6	366 t 126
30yig Rpg	6/6	803 í 402	6/6	371 ± 77
10/ig DNP-BSA	6/6	941 í 578	6/6	258 í 85
lOjig DNP-CapPE	0/6		0/6
3jag HA21 em solução aquosa

Composição

Lipossomica ^T9^G2b IgGg

DNP-CapPE HA_n	Proporção de Reacçao	Titulação	Proporção
de Reacção	Titulaçao
lO^ig ljig	0/6	180 í 70	4/6	177 í 20
lOjug 3jjg	0/6		4/6	217 í 93
lOjig 9jig	5/6	308 ± 21	5/6	280 ± 96
30jig l^ig	2/6	223 + 104	5/6	280 ± 105
30jig 3Jjg	5/6	250 í 141	6/6	333 + 110
3 Opg 9jig	6/6	275 ± 91	6/6	376 í 71
lOjig DNP-BSA	5/6	302 t 98	2/6	190 ± 28
lOjig DNP-CapPE	0/6		0/6
3jág HA₂, em solução aquosa

Feita a descrição completa da presente invenção, tornar-se-ã evidente parao especialista que se podem fazer à mesma alterações e modificações sem fugir ao espírito ou ao âmbito da presente invenção.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. - Processo para a preparação de um veículo' imunogénico lipossómico para antigenes, caracterizado pelo facto de compreender as fases que consistem em purificar um lípido, adicionar um antigene alvo ao referido lípido e adicionar um péptido auxiliar ao citado lípido para se obter o referido veículo lipossómico.
2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o referido péptido auxiliar ser uma unidade polipeptídica de uma toxina seleccionada entre o grupo constituído por influença, tétano, difteria, pseudomonas, estafilococus, estreptococus, coqueluche, Escherichia Coli e suas misturas.
3. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de o referido péptido auxiliar não possuir sítios de identificação de células B.
4. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o referido péptido auxiliar pos2 suir um sítio de identificação de linfócitos citotóxicos T.
5. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o referido péptido auxiliar ser uma sub-unidade polipeptídica do vírus da influença.
6. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o lípido ser seleccionado entre o grupo constituído por éter fosfatidílico, éster fosfatidílico, fosfatidil-etalnolamina, fosfatidilcolina, glicerido, cerebrosido, gangliosido, esfingomielina, esteróide e colesterol, e suas misturas.
7. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o referido péptido auxiliar estar associado ao lipossoma por interacções hidrofóbicas.
8. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o péptido auxiliar estar associa do ao lipossoma por uma ligação covalente a um lípido.
9. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de o veículo compreender aproximadamente uma molécula HA2 por 120 000 moléculas lipídicas.
10. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o referido antigene alvo ser um antigene independente T.
11. - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de o referido péptido ou péptidos au xiliar(es) possuir(em) um sítio de identificação de linfócitos citotóxicos-T.
12.- Método para elicitar uma resposta imune em mamíferos contra um antigene alvo, caracterizado pelo facto de se administrar uma quantidade imunogénica compreendida entre cerca de 0,1 micrograma e cerca de 10 miligramas de um veículo imunogénico lipossómico de acordo com a reivindicação

1.
13.- Método para elicitar uma resposta imune em mamíferos contra um antigene alvo, caracterizado pelo fac. to de se administrar uma quantidade imunogénica compreendida entre cerca de 0,1 micrograma e cerca de 10 miligramas de um veículo imunogénico lipossómico de acordo com a reivindicação

2.
14.- Método para elicitar uma resposta imune em mamíferos contra um antigene alvo, caracterizado pelo facto

Ή de se administrar uma quantidade imunogénica compreendida entre cerca de 0,1 micrograma e cerca de 10 miligramas de um veículo imunogénico lipossómico de acordo com a reivindicação 3.
15.- Método para elicitar uma resposta imune em mamíferos contra um antigene alvo, caracterizado pelo facto de se administrar uma quantidade imunogénica compreendida entre cerca de 0,1 micrograma e cerca de 10 miligramas de um veículo imunogénico lipossómico de acordo com a reivindicação 4.
16.- Método para elicitar uma resposta imune em mamíferos contra um antigene alvo, caracterizado pelo facto de se administrar uma quantidade imunogénica compreendida entre cerca de 0,1 micrograma e cerca de 10 miligramas de um veículo imunogénico lipossómico de acordo com a reivindicação 5.
17.- Método para elicitar uma resposta imune em mamíferos contra um antigene alvo, caracterizado pelo facto de se administrar uma quantidade imunogénica compreendida entre cerca de 0,1 micrograma e cerca de 10 miligramas de um veículo imunogénico lipossómico de acordo com a reivindicação 6.
18.- Método para elicitar uma resposta imune em *1 mamíferos contra um antigene alvo, caracterizado pelo facto de se administrar uma quantidade imunogénica compreendida entre cerca de 0,1 micrograma e cerca de 10 miligramas de um veículo imunogénico lipossómico de acordo com a reivindicação 7.
19.- Método para elicitar uma resposta imune em mamíferos contra um antigene alvo, caracterizado pelo facto de se administrar uma quantidade imunogénica compreendida entre cerca de 0,1 micrograma e cerca de 10 miligramas de um veículo imunogénico lipossómico de acordo com a reivindicação 8.
20. - Método para elicitar uma resposta imune em mamíferos contra um antigene alvo, caracterizado pelo facto de se administrar uma quantidade imunogénica compreendida entre cerca de 0,1 micrograma e cerca de 10 miligramas de um veículo imunogénico lipossómico de acordo com a reivindicação 9.
21. - Método para elicitar uma resposta imune em mamíferos contra um antigene alvo, caracterizado pelo facto de se administrar uma quantidade imunogénica compreendida entre cerca de 0,1 micrograma e cerca de 10 miligramas de um veículo imunogénico lipossómico de acordo com a reivindicação 10.
22.- Método para elicitar uma resposta imune em mamíferos contra um antigene alvo, caracterizado pelo facto de se administrar uma quantidade imunogénica compreendida entre cerca de 0,1 micrograma e cerca de 10 miligramas de um veículo imunogénico lipossómico de acordo com a reivindicação 11.
23. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o referido péptido auxiliar possuir um sítio de identificação de células B.
24. - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de os referidos ésteres fosfatidílicos serem fosfatidil-etanolamina e fosfatidilcolina.
25. - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de o referido esteróide ser colesterol.