JPH06502630A - ワクチン抗原を弱めるための胸腺依存作用を提供するリポゾーム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称　ワクチン抗原を弱めるための胸腺依存作用を提供するりポゾーム 発明の背景 １、　発明の分野 本発明は少なくともひとつのＴ−ヘルパー・リンパ球認識部位を含んでいる追加 成分とともに一つのりボゾーム内に抗原を組み込むことによる、その標的抗原に 対する抗体反応の強化に関係するものである。

２、　関連技術の説明 ワクチンは免疫反応をつくりだす有機体を誘発することにより、感染症に対する 免疫性を与える。したがって、抗原はそれらが誘発する免疫反応の強さによって いるいろな有益性を発揮する。いろいろな程度で本質的に強い抗原と弱い抗原が 存在する。さらに、抗原は、それらがＴ−細胞からヘルパー作用を引き出せるか どうかに基づいて、胸腺（”Ｔ”）依存およびＴ−独立抗原に分類することがで きる。二〇Ｔ−細胞作用はＩｇＧおよびＩｇＡクラスの抗原の生産と関連してい る。Ｔ−独立抗原はＩｇＭ抗体の生産を誘発するが、Ｂ−細胞を誘発してＩｇＭ あるいはＩｇＡ抗体の合成に切換えをさせることはない。１８Ｍクラスの免疫グ ロブリンの生産は実験動物およびヒトに見られる一過性の反応で、数か月間しか 続かないが、ＩｇＭおよび１８Ｍクラスの抗原の生産は数年間継続する。したが って、抗原に対するＴ−依存反応を引き出すのが有利である。炭化水素あるいは 多糖類をベースとする抗原はＴ−独立抗原であり、児童に投与されるワクチンと して一定の有効性を持っている。同様に、交代認識部位を示す多くのポリペプチ ドはＴ−独立抗原であり、したがって、同様に、ワクチンに望ましいＩｇＧおよ びＩｇＡ抗体反応を発生できない。

免疫反応を増強するヘルパー蛋白に抗体を接合する（共有結合で結びつける）こ とにより、弱い抗原に対して強い抗体反応を引き出すことができることが知られ ている。例えば、米国特許１１ｈ４，７６１，２８３で、一定のバクテリア莢膜 ポリマーに対する弱い免疫原性反応が、それ自体の内部に抗原反応を含んでいる 細菌性ヘルパー蛋白にその抗原を接合することで強化されることが示された。例 えば、ジフテリア・トキソイドなどの毒素をヘルパー蛋白として用いるのは普通 のことである。しかしながら、そのような毒性ヘルパー蛋白を使用すると、その ヘルパー蛋白に固有の毒性が抗原−ヘルパー蛋白接種量に制限を加え、したがっ て、その有効性にも制限を加えるので、問題である。

エピトープ抑制効果をつくりだすヘルパー蛋白に対してその有機体がすでに免疫 性を有しており、そのためにその標的抗原に対する免疫反応が抑制されるという ことも普通のことである。宿主有機体がそのヘルパー蛋白に対して反応するよう に調整されている場合、その有機体は標的抗原−ヘルパー蛋白接合体の本体をク リアしてしまい、その標的抗原に対する免疫性反応を開始できないであろう。

これらこれまで用いられてきた接−合体はその抗原を共有結合でキャリア・ヘル パー蛋白に結合させることによりつくられる。免疫反応を強化することは、少な くとも一つのＴ−ヘルパー細胞認識部位を含んでいるペプチドに接合でき、その ことでＴ−独立抗原に対するＴ−依存反応性を獲得できるＴ−独立抗原にとって 特に重要である。しかしながら、現在用いられている共有結合で結合される接合 体は、共有結合プロセスによって課される構造的制約、例えば、コンフォーメー ション上の変化、結合部位への潜在的アクセス不可能性、そして成分の比率を変 えることができない性格などの故に、その有効性には限度がある。さらに、これ らの接合体は投与量上の制限およびエピトープ抑制効果などを示す場合もある。

リボゾームは水性媒体中に脂質を分散せることでつくられる膜状小胞である。リ ボゾームを作成する方法は当業者にはよく知られており、本明細書中に引用され ている以下の特許その他に、例示されている：米国特許Ｎｎ４．５６５．６９６ およびＮａ４．２３５．８７１゜リボゾームは低毒性、低免疫原性、および微生 物分解性という、インービボ・キャリアにめられるいくつかの特性を有している 。リボゾームが実験動物で抗原に対する抗体反応を強化できることも示されてい る。抗原はりポゾームの水性部分に取り込まれるが、あるいはその２層構造と結 びつく。例えば、米国特許走４．５６５，６９６は免疫原を共有結合でリボゾー ムの表面２層構造に結合させて、それにより免疫反応を可能にさせるプロセスに ついて述べている。

且更五１笠 本発明は、少なくとも一つのＴ−細胞認識部位を含んでいるようなヘルパー・ペ プチドの少なくとも一つと一緒に抗原をリボゾームに組み込むことにより、標的 抗原に対する強化抗原反応を提供することに関するものである。本発明は、ヘモ フィルス・インフルエンザ、髄膜炎菌、肺炎球菌、および連鎖球菌などの多糖類 、およびＢ型肝炎表面蛋白、ＨＩＶ表面蛋白、インフルエンザ・ウィルス蛋白、 パラインフルエンザ・ウィルス・ペプチドあるいは赤血球凝集素、ＲＳウィルス 表面グリコプロティン、およびコレラ表面グリコプロティンなどを含む抗原への 強化抗原反応を引き出すために用いることができる。

（強化免疫原性が望まれる）標的抗原は、その抗原を活性機能性を持っている広 範な脂質素材の一つに取りつけることによって、リボゾーム性小胞に組み込むこ とができる。これらの脂質素材にはフオスファチジル・エーテル類あるいはフオ スファチジル・エステル類（フオスファチジルエタノールアミンおよびフオスフ ァチジルコリンなど）、グリセリド、セレブロシド、ガングリオシド、スフィン ゴミエリン、およびステロイド類（例えばコレステロール）などがある。米国特 許１１１ｏ、４．５６５．６９６および米国特許上４，２３５，８７１はりボゾ ームの調製に使える別の素材を開示している。

また、抗原が親油基を持っているか（米国特許ＮＯ，４、４４８，７６５）、あ るいは疎水基をその抗原に取りつけることができる場合、標的抗原を疎水力を利 用してリボゾーム性小胞に組み込むことができる。

ヘルパー・ペプチドの組み込みは共有結合反応あるいは疎水性反応のいずれかを 用いて行うこともできる。例えば、インフルエンザ・ウィルスのへマグルチニン （ＨＡ　）蛋白は二つのポリペプチド鎖（ＨＡ、とＨＡ、　）で構成されている 。ＨＡ、ポリペプチド鎖はそのポリペプチドのカルボキシ端近くにある疎水アミ ノ酸の配列を含んでおり、少なくとも、一つのＴ−ヘルパー細胞認識部位を含ん でいる。したがって、ＨＡ、ポリペプチド鎖はトランスメンプレイン疎水性領域 経由でリボゾームに組み込むことができる。米国特許Ｎ１１４．４４８．７６５ はインフルエンザ・ウィルスのりボゾームへの組み込みについて述べており、本 明細書に引例として組み込まれている。リボゾーム性メンプレインとの結合を促 進するために疎水性成分をヘルパー・ペプチドに加えることもできるし、また、 そのヘルパー・ペプチドを活性機能性を有している脂質素材に共有結合で直接取 りつけることもできる。

本発明は、例えば、米国特許１１ｈ４，７６１，２８３に開示されているような 、これまでに用いられている抗原キャリア接合体と比較していくつかの利点を持 っている。共有結合で結合される接合体においては、その共有結合によって、キ ャリア蛋白コンフォメーションの変更、および抗原コンフォメーションが変化し てしまう場合があり得る。こうした欠陥は、標的抗原およびヘルパー・ペプチド がリボゾームと結びつけられる本発明では克服することが可能である。本発明は 先行技術に関連した毒性およびエピトープ抑制効果を克服することができる。本 発明は非特性脂質を用い、好ましくは、ペプチドを含んでいる、分離された非毒 性Ｔ−ヘルパ一部位と共に用いられる。

本発明はまた、抗原密度、標的抗原とヘルパー・ペプチドの比率を変更すること ができ、複数のＴ−ヘルパー細胞認識部位含有ヘルパー・ペプチドを組み込むこ とができる点でも、これまで用いられている接合体より有利である。これらのフ ァクターは標的抗原に対してつくりだされる特定の抗体の量に影響を及ぼし得る 。これらのファクターは接合体合成時には簡単にコントロールされない。なぜな ら、これら二つの成分は共有結合で結びつけられねばならず、認識部位へのアク セスを保持しながら結びつけることが可能なファクターの数とタイプに関する物 理的制限をつくりだすからである。さらに、本発明は、一つの抗原のりポゾーム への組込みが抗原生産を増強することが示されているので、これらの接合体より 有利である。したがって、本発明は、特定の抗原に対する抗体、そして特に十分 な抗体生産をおこなわれないような弱い抗原に対する抗体の生産をさらに増強す るために、リボゾームのこの特性を用いる。

本発明によるこのリボゾーム性小胞は合成小胞のデザインに対する新しいアプロ ーチを提供してくれる。標的抗原の複数のコピーと一つあるいは複数のヘルパー ・ペプチドを迅速かつ簡単な方法で組み込むことができる。標的抗原に対する効 果的で増強された免疫を提供することに加えて、このアプローチは抗原およびヘ ルパー・ペプチドを簡単にテストすることを可能にする。例えば、本発明は種々 のＴ−ヘルパー・ペプチドの特定の抗原に対する免疫反応を強化する能力を比較 するための単純な小胞を提供する。したがって、本発明は免疫反応のメカニズム を実証するための有益な手段も提供する。

本発明の、現在の段階で好ましい実施例に関する以下の説明から、他の実施例、 特徴および利点が得られることは明らかであろう。

・ましい　ｊに　する。細な一 本発明によるワクチン組成物はどの標的抗原、そして最も好ましくはＴ−独立抗 原に対する免疫反応を強化するために利用することができる。以下に本発明につ いてＴ−独立抗原として十分に調べられているＤＮＰ−ＣａｐＰＥを参照として 説明する。しかしながら、本発明がどの抗原にも適用できることは、当業者には 明らかであろう。本発明の好ましい具体例において、Ｔ−独立抗原に対するＴ− 依存免疫反応を誘発する合成ワクチンが合成される。標的抗原はヘルパー・ペプ チド又はＴ−細胞認識部位を含むペプチド類と共にリボゾーム性調剤に組み込ま れる。例えば、本来体内にあるペプチドやインフルエンザ、破傷風、ジフテリア ・シュードモナス、ブドウ球菌、連鎖球菌、百日咳菌、および大腸菌などのトキ ソイドから無毒化されたペプチドなど、Ｔ−細胞認識部位を含んでいるどんなペ プチドでも用いることができる。候補となるペプチドがＴ−細胞認識部位を含ん でいるかどうかを判定するための簡単なテストを行うことができる。ペプチドが Ｂ−細胞エビトープだけを含んでいるＤＮＰ−ＣａｐＰＥなどの抗体と共にリボ ゾーム製剤に組み入れられる。その結果できるホスト有機体内のりポゾーム製剤 に対するＩｇＧ反応がある場合、そのペプチドはＴ−細胞認識部位を有しており 、本発明のヘルパー・ペプチドとして用いることができる。

インフルエンザ受身赤血球凝集素のＨＡヨサブユニットは良く調べられており、 少なくとも一つのＴ−ヘルパー細胞認識部位を持っているが、Ｂ−細胞認識部位 を有していることが分かっているので、ヘルパー・ペプチドとして好ましく用い られた。したがって、このペプチドは接合された抗原に対するＴ−依存免疫反応 を引き起こすが、それ自体に対する抗体反応は誘発しない。本発明の効果を発揮 させるためにこうした制約は必要ではなく、標的抗原への反応に加えて、ヘルパ ー・ペプチドに対する免疫反応が望ましいか、あるいは受け入れられる場合、Ｂ −細胞認識部位を含んでいるヘルパー・ペプチドなら、どれでも使うことができ る。しかしながら、ヘルパー・ペプチドが純粋なＴ−ヘルパー細胞エピトープで −あることが好ましい。同様に、標的抗原に対する反応に加えて細胞毒性反応が 望ましいか、あるいは受け入れられる場合、Ｔ−細胞毒性リンパ球認識部位を含 むヘルパー・ペプチドなら、どれでも用いることができる。

ＨＡ、サブユニットは、通常ウィルスの脂質エンベロープを通じて延びているカ ルボキシ端近くのアミノ酸疎水性配列を有しているので、ヘルパー・ペプチドと してさらに適している。このトランスメンブレン領域はりボゾームの脂質２層構 造（ｂｉｌａｙｅｒ）との結合をより容易にし、そしてＨＡ、はりボゾーム性小 胞と定量的に結びつけられる。前にも述べた通り、共有結合でペプチドを脂質に 結びつけたり、アミノ酸の疎水性配列をペプチドの一つの端に取りつけるなど、 ヘルパー・ペプチドを組み入れるための別の方法も可能である。ヘルパー・ペプ チドをリボゾームに組み込むための種々の方法が可能であることは当業者には明 らかであろう。

ＤＮＰ−ＣａｐＰＥが標的細胞として選ばれたのはそれがよく調べられており、 Ｔ−独立抗原であるからである。したがって、以下の実験で、ＤＮＰ−ＣａｐＰ Ｅに対するＴ−依存反応はそのヘルパー・ペプチドの影響で発生している。本発 明によるリボゾーム製剤は個体での免疫反応を増強するためにも用いることがで きる。「個体Ｊとは、どの動物、好ましくは哺乳類、そして最も好ましくは犬、 猫、牛、馬あるいはヒトを含んでいる。

例１−−堕７１立ソニニＡ（久Ｕ　本発明を実施するためには、フオスファチジ ル・エーテル類あるいはフオスファチジル・エステル類（例えば、フォスファチ ジルエタノールアミンおよびフォスファチジルコリン）、グリセリド、セレブロ シド、ガングリシド、スフィンゴミエリン、およびステロイド類（例えば、コレ ステロール）などを含む種々の脂質素材を用いることができる。以下はフォスフ ァチジルコリンを用いての調製の事例であるが、当業者は標的抗原およびヘルパ ー・プロティン又はプロティン類の組込みを可能にするどんなリボゾーム調製技 術でも用いることができることが分かるであろう。

リボゾームを調製する前に、組込みをより容易にするために、公知の技術の一つ を用いて、脂質成分の−っに、共有結合で標的抗原および／またはヘルパー・ペ プチドを取りつけることが必要な場合もあるであろう。卵の黄身（ＥＹＰＣ）か ら精製したフオスファチジルコリン（ＰＣ）　（Ａｖａｎｔｉ　ｐｏｌａｒｌｉ ｐｉｄｓ。

Ｐｅｌｈａｍ、　ＡＬ）がリボゾーム調製のために用いられた。ＥＹＰＣを丸底 フラスコに必要な量だけ加え、回転蒸発器（Ｂｕｃｈｉ　４６１）でグロロフォ ルムが取り除かれた。乾燥された脂質薄膜が、ＥＹＰＣの１０ｍＭ溶液をつくり だすのに必要な量だけ、殺菌された水あるいはりん酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）に 再懸濁された。ＤＮＰ−ＣａｐＰＥ抗原がリボゾームに組み込まれた時、Ｎ〜２ 　（２，４−ジニトリルフェニル　Ｅ−アミノカブロイルフォスファチジルエタ ノールアミン：　ＤＮＰ−ＣａｐＰＥ）がＥＹＰＣのグロロフォルム溶液に加え られた。Ａ／ＵＳＳＲ−９０７７７Ｈ，Ｎ、ウィルスの赤血球姿集素（ＨＡ）か ら得られた精製１（Ａ、サブユニット（Ｄｏｒｉｓ　Ｂｕｃｈｅｒ。

Ｍｔ、５ｉｎｉａ、　ＮＹより提供）もリボゾームに組み込むためその脂質薄膜 に加えられた。そして、その脂質混合物を殺菌されたＰＢＳに懸濁させるか、あ るいはその脂質混合物をｎ−オクチルグルコシド（ＰＢＳ中に５％Ｗ／Ｖｏｌ） に溶解して、次にＰＢＳに対して１６時間の透析を行うことによって、リボゾー ムがつくられた。個々のりボゾーム製剤に含まれるＤＮＰ−ＣａｐＰＥおよびＨ Ａ、の量は実験の必要性に応じて変えられた。

例２−リポゾームの　・け　リボゾーム構造へのＨＡ、の結合を評価するために 、■””　ｌ（Ａ、が用いられた。リボゾームへのＤＮＰ−ＣａｐＰＥの組み込 みを評価するために、最初の懸濁液の一部（１０μｍ）が９９０ｕｌメタノール に溶解され、３６０ｍＭの波長での吸収環が分光計で測定された。ＰＢＳによる 再構成と透析を行った後の製剤中のＨＡ、の結合度はＨＡ、の量を変えても大幅 には変化せず、９０％以上であった。製剤中のＤＮＰ−ＣａｐＰＥの結合度はす べての製剤で９５％以上であった。注入と注入の間にＤＮＰの放出は認められな かった。そして、ＤＮＰ−ＣａｐＰＥはリボゾーム構造と結合したままであった 。

例３−文反王皿　生後６〜８週間の雌の異系交配されたアルピノＩＲＣマウス（ Ｔｉｍｃｏ、　Ｈｏｕｓｔｏｎ、　ＴＸ）が用いられた。これらの動物は尾葉脈 から採血され、次に、Ｏ，１ｍｌのプラセボ（ＰＢＳ）　、コントロール・リボ ゾーム（ＨＡっおよびハプテンを含んでいないもの）と指示された量のハブテン および／またはＨＡ、ペプチドを含んでいるリボゾームが与えられた。３週間か ら４週間後、それらのマウスの尾葉脈から血液が採取され、最初の摂取の場合と 同じ製剤が同じ量だけブースター注射で接種された。９日から１４日後、動物の 尾葉脈から再び採血が行われた。任意に最後の接種が行われてから８週間後に、 それらのマウスに対して３回目の接種が行われ、その２週間後に採血が行われた 。すべての接種は後足に筋肉的注射（’ＩＭ）の形で行われた。マウスはバリア ー・フィルターを取りつけたプラスチック製の檻（１檻当り４匹）に入れて飼育 され、リビタムで水と餌が与えられた。血清は２０００ｘｇ、４℃の温度下で５ 分間遠心分離処理され、テストまで一２０℃の温度下で保存された。各実験で採 取したすべての血清標本は１回のテストでその抗体生産に関する評価が行われた 。

例４−−ジニトリルフェニル　ＤＮＰ　血゛　−スト　抗原をテストするために 、ジニトロフェニル処理された仔ウシ血清アルブミン（ＤＮＰ−ＢＳＡ）が用い られた。コントロール抗原として非誘導ＢＳＡが用いられた。ＤＮＰ−ＢＳＡは ジニトロフルオロベンゼンをＢＳＡの溶液に１０：ｌの比率で加えて調製され、 ｐＨが９−９．５になるまで、トリエタノールアミンが加えられた。

２０℃で１６時間培養した後、ＰＢＳに対する透析で非結合ＤＮＰが取り除かれ た。予備的な実験で、二〇モル比で誘導されたＢＳＡがより高い、あるいはより 低いモル比のＤＮＰを含んでいる蛋白より効率的に血清抗体を探知することが証 明された。血清抗体レベルはＥＬＩＳＡと５ＰＩＴＡ手順の両方で判定された。

虱工臥：　イミューロン■プレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ、　Ｄｅｔｒｏｉｔ、　 ＭＩ）は０．０５Ｍカーボネート・バッファー（ｐＨ９，６）内でＤＮＰ−ＢＳ Ａ（１ウェル当り］、Ｏｕｇ）でコートされ、コントロール・ウェルは１ウェル 当りｌｏｕｇのＢＳＡでコートされた。４℃で１６時間後、プレートはＰＢＳ内 で５％（Ｖｏｌ／Ｖｏｌ）　Ｆｅ２でポストコートされた。これおよび他のすべ ての培養後、プレートは１％ＦＣ３および０．２％ツイーン２０を含んでいるＰ ＢＳで洗浄された。１％ＢＳＡを含んでいるＰＢＳで、１：１００かも出発して ２倍ずつ連続的に希釈した血清の希釈液が２重に用意され、各希釈液の０．１ｍ ｌサンプルが抗原およびコントロール・ウェルに加えられた。２０℃の温度下で ５時間培養後、接種されたマウスＩｇＧ重鎮アルカリ性フォスファターゼに固有 の効果を発揮するヤギ抗体、　（Ｆｃスペシフィック、Ｃａｐｐｅｌ　ｌａｂ、 　Ｗｅｓｔ　Ｃｈｅｓｔｅｒ。

ＰＡ）、あるいは、ヤギ抗マウスＩｇＧサブクラスが、最もうまく抗体を検出す るのに必要な量を上回るように、予備的な実験で予め決められた濃度で加えられ た。ＩｇＧサブクラスの場合、ヤギＩｇＧに対して特別の効果を発揮するアルカ リ性フォスファターゼ接種ブタ抗体が加えられた。ｐＨ９，８の１０％ジェタノ ールアミンにｐ−二トロフェニル・フォスフェートを加えたもの（ｌ　ｍｇ／ｍ ｌ）が加えられた（ｌウェル当たり０，１ｍ１）　。

１７２時間後、Ｄｙｎａｔｅｃｈ　ＭＲ６００分光計で４１０ｎｍでの光学密度 が測定された。抗体の力価はコントロール・ウェルより０．２以上高い光学密度 を示した最高の希釈度の血清を基準として示されている。

計１ｔＡ　：　５ＰＩＲＡによるＤＮＰ抗体レベルのアセスメントはＥＬＩＳＡ アッセイの場合に述べたのと同様の方法で判定されたが、二つの点で修正が行わ れた。可撓性ポリビニルクロライド・マイクロタイター・プレートが用いられ、 ＤＮＰ’抗原に結合したマウス抗体を検出するために”°工でラベルした親和性 精製（重鎮に対して特有の効果を発揮する）ウサギ抗マウスＩｇＧが用いられた 。抗体の力価は上に述べた方法で計算され、上に述べたようなインフルエンザ・ ウィルスのＨＡ、に対する特性を有するマウス−モノグローナル抗体を用いる標 準クロス−ハツチ・テストでこのラベルされたウサギ抗マウス抗体の特性が確認 された。

二つのマウス・グループが１回の実験に含まれている時は、マンーホイットニー ・テストによって抗体力価の比較が行われた。三つ以上のグループの比較が必要 な場合、クルシュダールーウオリスの方法が用いられた。

例５−ＤＮＰ−ＣａＰＥ゛よび　または）ＩＡサブユニツ　・リポゾームの　異 系交配マウスの複数のグループに対してＥＹＰＣリボゾーム（７５０ｕｇ）　、 あるいはＨＡ、　（３，７）　、　ＤＮＰ−ＣａｐＰＥ　（３０ｕｇ）　、ある いはその両方を含んでいるＥＹＰＣの製剤を用いて、４週間の間隔を置いて２度 注射が行われた。ＩｇＧおよびＩｇＭ反応が間接ＥＬＩＳＡで分析され、抗体力 価の平均で示された。脂質とＤＮＰおよびＨＡ、のモル比は６０００　：　２０ ０　：　１であった。ＥＬＴＳＡ測定で、ＤＮＰ−ＣａｐＰＥ　（ＨＡ、を含ん でいる場合と含んでいない場合の両方）を含んでいる両方の製剤とも７匹のマウ ス中の７匹にＩｇＭ反応を発生したことが示された。しかしながら、抗ＤＮＰ　 ＩｇＧ血清抗体の力価を測定すると、リボゾームＤＮＰグループでは結果が急激 に減少し、コントロール・グループの場合と同様の力価が得られたが、ＤＮＰ／ ＨＡ、リポゾームで免疫化されたマウスはかなり高いレベルの血清固有抗ＤＮＰ 　ＩｇＧを誘発した。

五−上 ＰＢＳ　２１０±５５　３／７　１１９±２１　３／７Ｌｉｐｏｓｏｍｅ　ｅｍ ｐｔｙ　３１３±１４５　３／７　２９０±８５　３／７ＨＡ、　２０５±６５ 　３／７　３８４±１９０　３／７ＤＮＰ　＋８８±７３　３７７　１３１２± ７９１　７／７ＤＮＰ−ＣａｐＰＥ／ＨＡ、　１９７４±９２５　”／／１　１ ４９０±５０６　７７７水溶液でＨＡ、およびＤＮＰ−ＣａｐＰＨの混合物か、 あるいはＤＮＰ−ＣａｐＰＥミルＰＥリボゾームＡ、リポゾームを一緒に注射し てマウスを免疫化した場合にＩｇＧ抗ＤＮＰ抗体は発生しなかったので、免疫グ ロブリン・クラスにおけるこの変化は、完全にその原因を同じリポゾーム構造内 でのＨＡ、とＤＮＰの結合にめることができる（表２）。ＩｇＧ抗ＤＮＰ抗体の 生産を刺激するためには両方の成分が共に存在していることが必要である。

以下余白 一表一」− １０ｕｇ　ｌ■　３３３±１４３　６／６　３４４±１３４　５／６１０ｕｇｓ ｏｍｅ　３重ｇ　３９１±１２４　６／６　３００±１６５　６／６ＩＱｕｇ　 ９重ｇ　７６６±２９８　６／６　３３６±１１７　６／６３０ｕｇ　ｌｕｇ　 ３５８±１６５　６／６’　３６壮１４５　５／６３０ｕｇ　３重ｇ　１２４１ ±３３６　６／６　３９６±１１９　６／６３０ｕｇ　９重ｇ　２１００±１１ ２７　６／６　１０３８±４４５　６／６１０ｕｇ　ＤＮＰ−ＢＳＡ　２２４５ ±８９８　６／６　０　０／６１０１ｉｇＤＮＰ和ａｐＰＥａｎｄ００／６１５ ５±６３２／６ＨＡ、　ｉｎ　ａｑｕｅｏｕｓ １犯？ ＊　ＤＩＩＪＰ−ＣａｐＰＥおよび胤、は別個のりポゾームに組み込まれ、−緒 に投与された。

木本　実験なし。

例６−リポゾーム　ＤＮＰおよびＨＡに・　る　、　この実験においては、三つ の免疫化グループについての研究が行われた。一定の量のＤＮＰ−ＣａｐＰＥ　 （１回の注射量：　５　、１０．３０ｕｇ）に対シテ、異なった量のＨＡ、（１ ，３あるいは９　ｕｇ）もＥＹＰＣで構成されたりボゾーム製剤に組み込まれた （７５０ｕｇ／注射１回）。動物からの採血は１回のブースター注射の１日前と ９日後に行われた。抗ＤＮＰ　ＩｇＧおよびＩｇＭｌこ対して、ＥＬＩＳＡアッ セイで血清の分析が行われた。さらに、二つのグループのマウスがｌｏｕｇのＤ ＮＰ−ＢＳＡか、あるいは水溶液中で混合したＤＮＰ−ＣａｐＰＥとＨＡ、のい ずれかを使って免疫化された。

ＩｇＭ　ＥＬＩＳＡ値（表２）を統計的に分析したが、５および１０ｕｇ　ＤＮ Ｐ−ＣａｐＰＥをそれぞれ投与した二つのグループはＨＡ、の量は増えたものの 、有意差は見られなかった。５ｕｇのＤＮＰ−ＣａｐＰＥを投与したグループの 結果は示していない。しかしながら、３０ｕｇのＤＮＰ−ＣａｐＰＥおよび１． ３または９ｕｇの１−ＩＡＩを含んだりポゾームでマウスを免疫化した場合、有 意差が認められ、比率が高ければ高い程、ＩｇＭ力価は高かった。マウスを１０ ｕｇのＤＮＰ−ＢＳＡで免疫化した場合、ＩｇＭ反応は認められなかった。

そして水溶液中でＤＮＰ−ＣａｐＰＥとＨＡ、を混合したもので免疫化したグル ープでは、６匹のマウスのうち２匹だけがＩｇＭ反応を示した。

ＩｇＧ　ＥＬＩＳＡ値（表２）を統計的に分析し、一定の量のＨＡ。

（１，３または９ｕｇ）に対する反応とＤＮＰ−ＣａｐＰＥの量を増大（５，１ ０あるいは３０ｕｇ）　した結果とから、ＤＮＰとＨＡ、の両方に対して用量反 応が実証された。この二ともＩｇＧ生産の増強は同じリボゾーム内に標的抗原と ヘルパー・ペベタイドの両方が存在していることに原因がめられることを示して いる。

ＤＮＰ−ＢＳＡで免疫化されたマウスはテストされたりボゾームでのＨＡ、とＤ ＮＰの用量が最も高くして免疫化したグループと同等のＩｇＧ反応を示した。水 溶液内でＤＮＰとＨＡ、の混合したもので免疫化したマウスの場合、ＩｇＧ反応 は認められなかった。

例７−ＤＮＰＨＡリボゾームで　め　化されたマウスの応に女・　るＤＮＰ−Ｃ ａＰＥリボゾームの３回目の２　のマウスを事前にＤＮＰ−ＣａｐＰＥ／ＨＡ、 リポゾームで免疫した場合のＤＮＰ標的抗原に対する記憶反応の発現に関する評 価を行うために、７匹のマウスのグループに対して、ＤＮＰ−ＣａｐＰＥだけを 含むリポゾームで３回目の注射が行われ（したがって、Ｂ細胞箇所だけが提供さ れ）だ。この実験は、ＤＮＰ−ＣａｐＰＥおよびＨＡ、が最初のりボゾーム製剤 内に一緒に存在している場合だけ、記憶反応がつくりだされることを示している 。また、本発明は正真正銘の胸腺依存免疫反応と、Ｔ−細胞認識部位の存在をさ らに必要としなくても、標的抗原に反応してＩｇＧ抗体をつくりだすことができ る標的抗原に関する免疫記憶をつくりだすことも示している。

前にも示した通り、ＤＮＰ−ＣａｐＰＥ／ＨＡ、リポゾームで免疫されたマウス はＩｇＧ抗ＤＮＰ反応をつくりだした。同じマウスにＤＮＰ−ＣａｐＰＥ　（グ ループ１）だけを含んでいるリポゾームで３回目の注射を行うと、５ＰＩＲＡに 関する目盛りが第１回あるいは第２回の採血時と比較して急激に増大し、最初の 免疫化によってつくりだされたものより高いレベルでの特定のＢ細胞の再刺激が 行われることが示された。ＨＡ、リポゾームで免疫化し、次にＤＮＰ−ＣａｐＰ ＥミルＰＥリボゾームされたマウス（グループ３）は検出できるレベルの抗ＤＮ Ｐ　ＩｇＧ抗体力価をつくりださなかった。ＤＮＰ−ＣａｐＰＥ／ＨＡ、リポゾ ームで一度だけ注射されたマウス（グループ２）は第１次の免疫化の場合と同様 の抗ＤＮＰ　ＩｇＧ抗体レベルを示した。中空ＥＹＰＣリボゾームを注射したコ ントロール・グループ（グループ４）では抗ＩｇＧ抗体生産は観察されなかった 。

１　１　１９７４±９７５　７／７ ２８１７±２７０　７／７ ３　４０７１±１０５８　７／７ ２　１　１５８±２８　３／７ ３２８８±７５　３／７ 例８−　、に゛ける　ＨＡと内　ＨＡの比　異系交配マウスの四つのグループが 、３０ｕｇのＤＮＰ−ＣａｐＰＥと種々の量のＨＡ、　（３，ｌ、　０．５およ びＯｕｇ）で構成されたＥＹＰＣリボゾームで免疫化された。さらに、一つのグ ループのマウスは予めリポゾームをプロメライン（１００ｕｇ／ｍｌ　）で処理 した後、ＤＮＰ−ＣａｐＰＥ／ＨＡ、リポゾーム（それぞれ３０およびａｕｇ） で免疫化された。プロメラインで処理すると表面蛋白が壊され、誤挿入テイルと 無傷の内部化されたＨＡ、だけが残される。　ＥＬＩＳＡ力価を統計的に分析す ると、この場合も、ＨＡ、の量の増加につれて用量反応効果が観察された。ＤＮ Ｐ−ＣａｐＰＥミルＰＥリポゾーム統計的に有意差のあるＩｇＧ反応を誘発する ためには、１回の注射でＤＮＰ−ＣａｐＰＥミルＰＥリポゾーム５ｕｇ程度のＨ Ａ、があれば十分である。しかしながら、マウスをプロメラインで処理したりポ ゾームで免疫化した場合、処理されなかったりボゾームの場合と比較して、統計 的に有意差は認められなかった。

これらの結果は、リボゾーム外のＨＡ、は必要ではないこと、そして、免疫能力 を有する細胞にＢおよびＴ細胞エピトープが組み合わされて提示されるようにす るためには、リポゾームを処理する必要があることを示している。

表−土 １　３０ｕｇ　３ｕｇ　９４４±２９１　７／７２　３０ｕｇ　ｌｕｇ　４７１ ±９７　７／７３　３０ｕｇ　０．５ｕｇ　４３８±１２１　７／７４　３０ｕ ｇ　Ｏ１９８±８８　２／７ＥＬＩＳＡ測定値の分析で、ＩｇＧ、抗体が優勢な サブクラスであった。

異系交配マウスのＤＮＰに対するＩｇＧ、反応はＤＮＰ−ＣａｐＰＥの用量が低 い場合（表１　）　、　ＨＡ、の濃度が低くても同様であった。

ＤＮＰ−ＣａｐＰＥの濃度が高い場合（３０ｕｇ）　、　ＨＡ、の量が増大する と用量反応効果が認められた。ＥＹＰＣ，ＤＮＰ−ＣａｐＰＥおよびＨＡ、にょ ろりボゾーム製剤をそれぞれ７５０．３０および９ｕｇ投与した場合、標準的な ハブテン・キャリア・システムであるＤＮＰ−ＢＳＡｌｏｕｇで免疫したマウス のグループの場合とほぼ等しいＩｇＧ、反応が示された。

ＩｇＧ、、およびＩｇＧ、、抗体サブクラスの場合、統計的な差は認められなか った（表５）。ＩｇＧ、　、あるいはＩｇＧ、、抗体を検出できなかった唯一の グループはｌｕｇのＨＡ、と１０ｕｇのＤＮＰ−ＣａｐＰＥ（ＩｇＧ、、および ＩｇＧ−ｂ）　、およびａｕｇのＨＡ、および１０ｕｇのＤＮＰ−ＣａｐＰＥ　 （ＩｇＧ＝ｂ）を含んでいるＥＹＰＣリポゾームで免疫化されたマウスのグルー プであった。ＤＮＰ−ＣａｐＰＥまたはｌ（Ａ、の用量が高い場合、反応におけ る有意差は認められなかった。その反応はマウスをＤＮＰ−ＢＳＡで免疫した場 合の反応とほぼ同様であった。

ｒｇＧ、抗体サブクラスの場合、有意差は認められなかった６各グループで、力 価が検出され、免疫化された６匹のマウスのうちの少なくとも４匹は反応を示し た（表５）。しかしながら、１０ｕｇのＤＮＰ−ＢＳＡで免疫された２匹のマウ スだけが力価の上昇を示したが、その値はりボゾーム製剤で免疫化されたマウス のグループよりはるかに低かった。

に−１ １０ｕｇ　Ｊｕｇ　３／６　１８０±７０　０／６１０ｕｇ　３ｕｇ　４／６　 ２２２±７９　４／６　１９０±５０１０ｕｇ　９ｕｇ　６／６　２５５±５２ 　６／６　２４１±７８３０ｕｇ　ｔｕｇ　４／６　２７５土１０２　４／６　 ３２６±９２３０ｕｇ　３ｕｇ　６／６　３７０±１８６　６／６　３６６±１ ２６３０ｕｇ　９ｕｇ　６／６　８０３±４０２　６／６　３７１±７７１０ｕ ｇ　ＤＮＰ−ＢＳＡ　６／６　９４１＋５７８　６／６　２５８ｆ８５１０ｕｇ 　Ｊｕｇ　Ｏ／６　１８０±７０　４／６　１７７±２０１０ｕｇ　３ｕｇ　Ｏ ／６　４／６　２１７±９３１０ｕｇ　９ｕｇ　５／６　３０８±２１　５／６ 　２８０±９６３０ｕｇ　ｌｕｇ　２／６　２２３±１０４　５／６　２８０± １１０５３０ｕ　３ｕｇ　５／６　２５０±１４１　６／６　３３３±１１０頷 昭　９ｕｇ　６／６　２７５±９１　６／６　３７６±７１１０ｕｇ　ＤＮＰ− ＢＳＡ　５／６　３０２±９８　２／６　１９０±２８以上に、本発明について 十分に説明したので、ここに記載した本発明の精神あるいは範囲を逸脱すること なしに変更および修正が可能であることは、この技術に通じている人なら誰にで も明らかであろう。

国際調査報告

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. １．脂質、標的抗原、および少なくとも１のＴ−ヘルパー細胞認識部位を有して いる少なくとも１のヘルパーペプチドで構成されている、抗原のためのリポゾー ム性免疫原性キャリア。
2. ２．該ヘルパー・ペプチドがインフルエンザ、ジフテリア、シュードモナス、ブ ドウ球菌、連鎖球菌、大腸菌、およびそれらの混合物で構成されるグループから 選択されるトキシンのポリペプチド・ユニットである請求項１のリポゾーム性免 疫原性キャリア。
3. ３．該ヘルパー・ペプチドがＢ−細胞認識部位である請求項２のリポゾーム性免 疫原性キャリア。
4. ４．該ヘルパー・ペプチドがＴ−細胞毒性リンパ球認識部位を有している請求項 １のリボゾーム性免疫原性キャリア。
5. ５．該ヘルパー・ペプチドがインフルエンザ・ウイルスのＨＡｚポリペプチド・ サブユニットである請求項１のリポゾーム性免疫原性キャリア。
6. ６．フォスファチジル・エーテル、フオスファチジル・エステル、グリセリド、 セレブロシド、ガンダリオシド、スフインゴミエリン、ステロイド、およびそれ らの混合物で構成されるグループから選択される脂質でできているリポゾーム性 免疫原性キャリア。
7. ７．該ヘルパー・ペプチドが疎水性相互作用を通じてリポゾームに結びつけられ る、請求項１のリボゾーム性免疫原性キャリア。
8. ８．ヘルパー・ペプチドが脂質への供給結合によってリボゾームに結びつけられ る、請求項１のリポゾーム性免疫原性キャリア。
9. ９．キャリアが１２０，０００脂質分子あたりほぼ１のＨＡｘ〜分子で構成され ている、請求項５のリポゾーム性免疫原性キャリア。
10. １０．該標的抗原がＴ−独立抗原である、請求項１のリボゾーム性キャリア。
11. １１．ひとつまたは複数の該ヘルパー・ペプチドがＴ−細胞毒性リンパ球認識部 位を有している、請求項３のリポゾーム性免疫原性キャリア。
12. １２．請求項１のリポゾーム性免疫原性キャリアを免疫原性を発揮する量だけ投 与することで構成される、哺乳動物で標的抗原に対しての免疫反応を引き出す方 法。
13. １３．請求項２のリポゾーム性免疫原性キャリアを免疫原性を発揮する量だけ投 与することで構成される、哺乳動物で標的抗原に対する免疫反応を引き出す方法 。
14. １４．請求項３のリポゾーム性免疫原性キャリアを免疫原性を発揮する量だけ投 与することで構成される、哺乳動物で標的抗原に対する免疫反応を引き出す方法 。
15. １５．請求項４のリポゾーム性免疫原性キャリアを免疫原性を発揮する量だけ投 与することで構成される、哺乳動物で標的抗原に対する免疫反応を引き出す方法 。
16. １６．請求項５のリボゾーム性免疫原性キャリアを免疫原性を発揮する量だけ投 与することで構成される、哺乳動物で標的抗原に対する免疫反応を引き出す方法 。
17. １７．請求項６のリポゾーム性免疫原性キャリアを免疫原性を発揮する量だけ投 与することで構成される、哺乳動物で標的抗原に対する免疫反応を引き出す方法 。
18. １８．請求項７のリポゾーム性免疫原性キャリアを免疫原性を発揮する量だけ投 与することで構成される、哺乳動物で標的抗原に対する免疫反応を引き出す方法 。
19. １９．請求項８のリポゾーム性免疫原性キャリアを免疫原性を発揮する量だけ投 与することで構成される、哺乳動物で標的抗原に対する免疫反応を引き出す方法 。
20. ２０．請求項９のリポゾーム性免疫原性キャリアを免疫原性を発揮する量だけ投 与することで構成される、哺乳動物で標的抗原に対する免疫反応を引き出す方法 。
21. ２１．請求項１０のリポゾーム性免疫原性キャリアを免疫原性を発揮する量だけ 投与することで構成される、哺乳動物で標的抗原に対する免疫反応を引き出す方 法。
22. ２２．請求項１１のリポゾーム性免疫原性キャリアを免疫原性を発揮する量だけ 投与することで構成される、哺乳動物で標的抗原に対する免疫反応を引き出す方 法。
23. ２３．該ヘルパー・ペプチドがＢ−細胞認識部位を有している、請求項１のリポ ゾーム性免疫原性キャリア。
24. ２４．該フォスファチジル・エステル類がフオスファチジルエタノールアミドお よびフオスファチジルコリンである、請求項６のリポゾーム性免疫原性キャリア 。
25. ２５．該ステロイドがコレステロールである、請求項６のリポゾーム性免疫原性 キャリア。