JP3518866B2 - ワクチン抗原を弱めるための胸腺依存作用を提供するリポゾーム - Google Patents
ワクチン抗原を弱めるための胸腺依存作用を提供するリポゾームInfo
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Description
【発明の詳細な説明】
発明の背景
1. 発明の分野
本発明は少なくともひとつのＴ−ヘルパー・リンパ球
認識部位を含んでいる追加成分とともに一つのリポゾー
ム内に抗原を組み込むことによる、その標的抗原に対す
る抗体反応の強化に関係するものである。
認識部位を含んでいる追加成分とともに一つのリポゾー
ム内に抗原を組み込むことによる、その標的抗原に対す
る抗体反応の強化に関係するものである。
2. 関連技術の説明
ワクチン抗原は免疫反応をつくりだす有機体を誘発す
ることにより、感染症に対する免疫性を与える。したが
って、抗原はそれらが誘発する免疫反応の強さによって
いろいろな有益性を発揮する。いろいろな程度で本質的
に強い抗原と弱い抗原が存在する。さらに、抗原は、そ
れらがＴ−細胞からヘルパー作用を引き出せるかどうか
に基づいて、胸腺（“T"）依存およびＴ−独立抗原に分
類することができる。このＴ−細胞作用はIgGおよびIgA
クラスの抗体の生産と関連している。Ｔ−独立抗原はIg
M抗体の生産を誘発するが、Ｂ−細胞を誘発してIgGある
いはIgA抗体の合成に切換えをさせることはない。IgMク
ラスの免疫グロブリンの生産は実験動物およびヒトに見
られる一過性の反応で、数か月間しか続かないが、IgG
およびIgAクラスの抗体の生産は数年間継続する。した
がって、抗原に対するＴ−依存反応を引き出すのが有利
である。炭化水素あるいは多糖類をベースとする抗原は
Ｔ−独立抗原であり、児童に投与されるワクチンとして
一定の有効性を持っている。同様に、抗体認識部位を示
す多くのポリペプチドはＴ−独立抗原であり、したがっ
て、同様に、ワクチンに望ましいIgGおよびIgA抗体反応
を発生できない。
ることにより、感染症に対する免疫性を与える。したが
って、抗原はそれらが誘発する免疫反応の強さによって
いろいろな有益性を発揮する。いろいろな程度で本質的
に強い抗原と弱い抗原が存在する。さらに、抗原は、そ
れらがＴ−細胞からヘルパー作用を引き出せるかどうか
に基づいて、胸腺（“T"）依存およびＴ−独立抗原に分
類することができる。このＴ−細胞作用はIgGおよびIgA
クラスの抗体の生産と関連している。Ｔ−独立抗原はIg
M抗体の生産を誘発するが、Ｂ−細胞を誘発してIgGある
いはIgA抗体の合成に切換えをさせることはない。IgMク
ラスの免疫グロブリンの生産は実験動物およびヒトに見
られる一過性の反応で、数か月間しか続かないが、IgG
およびIgAクラスの抗体の生産は数年間継続する。した
がって、抗原に対するＴ−依存反応を引き出すのが有利
である。炭化水素あるいは多糖類をベースとする抗原は
Ｔ−独立抗原であり、児童に投与されるワクチンとして
一定の有効性を持っている。同様に、抗体認識部位を示
す多くのポリペプチドはＴ−独立抗原であり、したがっ
て、同様に、ワクチンに望ましいIgGおよびIgA抗体反応
を発生できない。
免疫反応を増強するヘルパー蛋白に抗体を接合する
（共有結合で結びつける）ことにより、弱い抗原に対し
て強い抗体反応を引き出すことができることが知られて
いる。例えば、米国特許No.4,761,283で、一定のバクテ
リア莢膜ポリマーに対する弱い免疫原性反応が、それ自
体の内部に抗原反応を誘導する細菌性ヘルパー蛋白にそ
の抗原を接合することで強化されることが示された。例
えば、ジフテリア・トキソイドなどの毒素をヘルパー蛋
白として用いるのは普通のことである。しかしながら、
そのような毒性ヘルパー蛋白を使用すると、そのヘルパ
ー蛋白に固有の毒性が抗原−ヘルパー蛋白接種量に制限
を加え、したがって、その有効性にも制限を加えるの
で、問題である。
（共有結合で結びつける）ことにより、弱い抗原に対し
て強い抗体反応を引き出すことができることが知られて
いる。例えば、米国特許No.4,761,283で、一定のバクテ
リア莢膜ポリマーに対する弱い免疫原性反応が、それ自
体の内部に抗原反応を誘導する細菌性ヘルパー蛋白にそ
の抗原を接合することで強化されることが示された。例
えば、ジフテリア・トキソイドなどの毒素をヘルパー蛋
白として用いるのは普通のことである。しかしながら、
そのような毒性ヘルパー蛋白を使用すると、そのヘルパ
ー蛋白に固有の毒性が抗原−ヘルパー蛋白接種量に制限
を加え、したがって、その有効性にも制限を加えるの
で、問題である。
エピトープ抑制効果をつくりだすヘルパー蛋白に対し
てその有機体がすでに免疫性を有しており、そのために
その標的抗原に対する免疫反応が抑制されるということ
も普通のことである。宿主有機体がそのヘルパー蛋白に
対して反応するように調整されている場合、その有機体
は標的抗原−ヘルパー蛋白接合体の本体をクリアしてし
まい、その標的抗原に対する免疫性反応を開始できない
であろう。
てその有機体がすでに免疫性を有しており、そのために
その標的抗原に対する免疫反応が抑制されるということ
も普通のことである。宿主有機体がそのヘルパー蛋白に
対して反応するように調整されている場合、その有機体
は標的抗原−ヘルパー蛋白接合体の本体をクリアしてし
まい、その標的抗原に対する免疫性反応を開始できない
であろう。
これらこれまで用いらてきた接合体はその抗原を共有
結合でキャリア・ヘルパー蛋白に結合させることにより
つくられる。免疫反応を強化することは、少なくとも一
つのＴ−ヘルパー細胞認識部位を含んでいるペプチドに
接合でき、そのことでＴ−独立抗原に対するＴ−依存反
応性を獲得できるＴ−独立抗原にとって特に重要であ
る。しかしながら、現在用いられている共有結合で結合
される接合体は、共有結合プロセスによって課される構
造的制約、例えば、コンフォーメーション上の変化、結
合部位への潜在的アクセス不可能性、そして成分の比率
を変えることができない性格などの故に、その有効性に
は限度がある。さらに、これらの接合体は投与量上の制
限およびエピトープ抑制効果などを示す場合もある。
結合でキャリア・ヘルパー蛋白に結合させることにより
つくられる。免疫反応を強化することは、少なくとも一
つのＴ−ヘルパー細胞認識部位を含んでいるペプチドに
接合でき、そのことでＴ−独立抗原に対するＴ−依存反
応性を獲得できるＴ−独立抗原にとって特に重要であ
る。しかしながら、現在用いられている共有結合で結合
される接合体は、共有結合プロセスによって課される構
造的制約、例えば、コンフォーメーション上の変化、結
合部位への潜在的アクセス不可能性、そして成分の比率
を変えることができない性格などの故に、その有効性に
は限度がある。さらに、これらの接合体は投与量上の制
限およびエピトープ抑制効果などを示す場合もある。
リポゾームは水性媒体中に脂質を分散せることでつく
られる膜状小胞である。リポゾームを作成する方法は当
業者にはよく知られており、本明細書中に引用されてい
る以下の特許その他に、例示されている：米国特許No.
4,565,696およびNo.4,235,871。リポゾームは低毒性、
低免疫原性、および生分解性という、イン−ビボ・キャ
リアに求められるいくつかの特性を有している。リポゾ
ームが実験動物で抗原に対する抗体反応を強化できるこ
とも示されている。抗原はリポゾームの水性部分に取り
込まれるか、あるいはその２層構造と結びつく。例え
ば、米国特許No.4,565,696は免疫原を共有結合でリポゾ
ームの表面２層構造に結合させて、それにより免疫反応
を可能にさせるプロセスについて述べている。
られる膜状小胞である。リポゾームを作成する方法は当
業者にはよく知られており、本明細書中に引用されてい
る以下の特許その他に、例示されている：米国特許No.
4,565,696およびNo.4,235,871。リポゾームは低毒性、
低免疫原性、および生分解性という、イン−ビボ・キャ
リアに求められるいくつかの特性を有している。リポゾ
ームが実験動物で抗原に対する抗体反応を強化できるこ
とも示されている。抗原はリポゾームの水性部分に取り
込まれるか、あるいはその２層構造と結びつく。例え
ば、米国特許No.4,565,696は免疫原を共有結合でリポゾ
ームの表面２層構造に結合させて、それにより免疫反応
を可能にさせるプロセスについて述べている。
発明の要約
本発明は、少なくとも一つのＴ−細胞認識部位を含ん
でいるようなヘルパー・ペプチドの少なくとも一つと一
緒に抗原をリポゾームに組み込むことにより、標的抗原
に対する強化抗原反応を提供することに関するものであ
る。本発明は、ヘモフィルス・インフルエンザ、髄膜炎
菌、肺炎球菌、および連鎖球菌などの多糖類、およびＢ
型肝炎表面蛋白、HIV表面蛋白、インフルエンザ・ウィ
ルス蛋白、パラインフルエンザ・ウィルス・ペプチドあ
るいは赤血球凝集素、RSウィルス表面グリコプロテイ
ン、およびコレラ表面グリコプロテインなどを含む抗原
への強化抗原反応を引き出すために用いることができ
る。
でいるようなヘルパー・ペプチドの少なくとも一つと一
緒に抗原をリポゾームに組み込むことにより、標的抗原
に対する強化抗原反応を提供することに関するものであ
る。本発明は、ヘモフィルス・インフルエンザ、髄膜炎
菌、肺炎球菌、および連鎖球菌などの多糖類、およびＢ
型肝炎表面蛋白、HIV表面蛋白、インフルエンザ・ウィ
ルス蛋白、パラインフルエンザ・ウィルス・ペプチドあ
るいは赤血球凝集素、RSウィルス表面グリコプロテイ
ン、およびコレラ表面グリコプロテインなどを含む抗原
への強化抗原反応を引き出すために用いることができ
る。
（強化免疫原性が望まれる）標的抗原は、その抗原を
活性機能性を持っている広範な脂質素材の一つに取りつ
けることによって、リポゾーム性小胞に組み込むことが
できる。これらの脂質素材にはフォスファチジル・エー
テル類あるいはフォスファチジル・エステル類（フォス
ファチジルエタノールアミンおよびフォスファチジルコ
リンなど）、グリセリド、セレブロシド、ガングリオシ
ド、スフィンゴミエリン、およびステロイド類（例えば
コレステロール）などがある。米国特許No.4,565,696お
よび米国特許No.4,235,871はリポゾームの調製に使える
別の素材を開示している。
活性機能性を持っている広範な脂質素材の一つに取りつ
けることによって、リポゾーム性小胞に組み込むことが
できる。これらの脂質素材にはフォスファチジル・エー
テル類あるいはフォスファチジル・エステル類（フォス
ファチジルエタノールアミンおよびフォスファチジルコ
リンなど）、グリセリド、セレブロシド、ガングリオシ
ド、スフィンゴミエリン、およびステロイド類（例えば
コレステロール）などがある。米国特許No.4,565,696お
よび米国特許No.4,235,871はリポゾームの調製に使える
別の素材を開示している。
また、抗原が親油基を持っているか（米国特許No.4,4
48,765）、あるいは疎水基をその抗原に取りつけること
ができる場合、標的抗原を疎水力を利用してリポゾーム
性小胞に組み込むことができる。
48,765）、あるいは疎水基をその抗原に取りつけること
ができる場合、標的抗原を疎水力を利用してリポゾーム
性小胞に組み込むことができる。
ヘルパー・ペプチドの組み込みは共有結合あるいは疎
水相互作用のいずれかを用いて行うこともできる。例え
ば、インフルエンザ・ウィルスのヘマグルチニン（HA）
蛋白は二つのポリペプチド鎖（HA1とHA2）で構成されて
いる。HA2ポリペプチド鎖はそのポリペプチドのカルボ
キシ端近くにある疎水アミノ酸の配列を含んでおり、少
なくとも、一つのＴ−ヘルパー細胞認識部位を含んでい
る。したがって、HA2ポリペプチド鎖はトランスメンブ
レン疎水性領域経由でリポゾームに組み込むことができ
る。米国特許No.4,448,765はインフルエンザ・ウィルス
のリポゾームへの組み込みについて述べており、本明細
書に引例として組み込まれている。リポゾームメンブレ
ンとの結合を促進するために疎水性成分をヘルパー・ペ
プチドに加えることもできるし、また、そのヘルパー・
ペプチドを活性機能性を有している脂質素材に共有結合
で直接取りつけることもできる。
水相互作用のいずれかを用いて行うこともできる。例え
ば、インフルエンザ・ウィルスのヘマグルチニン（HA）
蛋白は二つのポリペプチド鎖（HA1とHA2）で構成されて
いる。HA2ポリペプチド鎖はそのポリペプチドのカルボ
キシ端近くにある疎水アミノ酸の配列を含んでおり、少
なくとも、一つのＴ−ヘルパー細胞認識部位を含んでい
る。したがって、HA2ポリペプチド鎖はトランスメンブ
レン疎水性領域経由でリポゾームに組み込むことができ
る。米国特許No.4,448,765はインフルエンザ・ウィルス
のリポゾームへの組み込みについて述べており、本明細
書に引例として組み込まれている。リポゾームメンブレ
ンとの結合を促進するために疎水性成分をヘルパー・ペ
プチドに加えることもできるし、また、そのヘルパー・
ペプチドを活性機能性を有している脂質素材に共有結合
で直接取りつけることもできる。
本発明は、例えば、米国特許No.4,761,283に開示され
ているような、これまでに用いられている抗原キャリア
接合体と比較していくつかの利点を持っている。共有結
合で結合される接合体においては、その共有結合によっ
て、キャリア蛋白コンフォメーションの変更、および抗
原コンフォメーションが変化してしまう場合があり得
る。こうした欠陥は、標的抗原およびヘルパー・ペプチ
ドがリポゾームと結びつけられる本発明では克服するこ
とが可能である。本発明は先行技術に関連した毒性およ
びエピトープ抑制効果を克服することができる。本発明
は非毒性脂質を用い、好ましくは、ペプチドを含んでい
る、分離された非毒性Ｔ−ヘルパー部位と共に用いられ
る。
ているような、これまでに用いられている抗原キャリア
接合体と比較していくつかの利点を持っている。共有結
合で結合される接合体においては、その共有結合によっ
て、キャリア蛋白コンフォメーションの変更、および抗
原コンフォメーションが変化してしまう場合があり得
る。こうした欠陥は、標的抗原およびヘルパー・ペプチ
ドがリポゾームと結びつけられる本発明では克服するこ
とが可能である。本発明は先行技術に関連した毒性およ
びエピトープ抑制効果を克服することができる。本発明
は非毒性脂質を用い、好ましくは、ペプチドを含んでい
る、分離された非毒性Ｔ−ヘルパー部位と共に用いられ
る。
本発明はまた、抗原密度、標的抗原とヘルパー・ペプ
チドの比率を変更することができ、複数のＴ−ヘルパー
細胞認識部位含有ヘルパー・ペプチドを組み込むことが
できる点でも、これまで用いられている接合体より有利
である。これらのファクターは標的抗原に対してつくり
だされる特定の抗体の量に影響を及ぼし得る。これらの
ファクターは接合体合成時には簡単にコントロールされ
ない。なぜなら、これら二つの成分は共有結合で結びつ
けられねばならず、認識部位へのアクセスを保持しなが
ら結びつけることが可能なファクターの数とタイプに関
する物理的制限をつくりだすからである。さらに、本発
明は、一つの抗原のリポゾームへの組込みが抗原生産を
増強することが示されているので、これらの接合体より
有利である。したがって、本発明は、特定の抗原に対す
る抗体、そして特に十分な抗体生産をおこなわれないよ
うな弱い抗原に対する抗体の生産をさらに増強するため
に、リポゾームのこの特性を用いる。
チドの比率を変更することができ、複数のＴ−ヘルパー
細胞認識部位含有ヘルパー・ペプチドを組み込むことが
できる点でも、これまで用いられている接合体より有利
である。これらのファクターは標的抗原に対してつくり
だされる特定の抗体の量に影響を及ぼし得る。これらの
ファクターは接合体合成時には簡単にコントロールされ
ない。なぜなら、これら二つの成分は共有結合で結びつ
けられねばならず、認識部位へのアクセスを保持しなが
ら結びつけることが可能なファクターの数とタイプに関
する物理的制限をつくりだすからである。さらに、本発
明は、一つの抗原のリポゾームへの組込みが抗原生産を
増強することが示されているので、これらの接合体より
有利である。したがって、本発明は、特定の抗原に対す
る抗体、そして特に十分な抗体生産をおこなわれないよ
うな弱い抗原に対する抗体の生産をさらに増強するため
に、リポゾームのこの特性を用いる。
本発明によるこのリポゾーム性小胞は合成ワクチンの
デザインに対する新しいアプローチを提供してくれる。
標的抗原の複数のコピーと一つあるいは複数のヘルパー
・ペプチドを迅速かつ簡単な方法で組み込むことができ
る。標的抗原に対する効果的で増強された免疫を提供す
ることに加えて、このアプローチは抗原およびヘルパー
・ペプチドを簡単にテストすることを可能にする。例え
ば、本発明は種々のＴ−ヘルパー・ペプチドの特定の抗
原に対する免疫反応を強化する能力を比較するための単
純な小胞を提供する。したがって、本発明は免疫反応の
メカニズムを実証するための有益な手段も提供する。
デザインに対する新しいアプローチを提供してくれる。
標的抗原の複数のコピーと一つあるいは複数のヘルパー
・ペプチドを迅速かつ簡単な方法で組み込むことができ
る。標的抗原に対する効果的で増強された免疫を提供す
ることに加えて、このアプローチは抗原およびヘルパー
・ペプチドを簡単にテストすることを可能にする。例え
ば、本発明は種々のＴ−ヘルパー・ペプチドの特定の抗
原に対する免疫反応を強化する能力を比較するための単
純な小胞を提供する。したがって、本発明は免疫反応の
メカニズムを実証するための有益な手段も提供する。
本発明の、現在の段階で好ましい実施例に関する以下
の説明から、他の実施例、特徴および利点が得られるこ
とは明らかであろう。
の説明から、他の実施例、特徴および利点が得られるこ
とは明らかであろう。
好ましい具体例に関する詳細な説明
本発明によるワクチン組成物はどの標的抗原、そして
最も好ましくはＴ−独立抗原に対する免疫反応を強化す
るために利用することができる。以下に本発明について
Ｔ−独立抗原として十分に調べられているDNP−CapPEを
参照として説明する。しかしながら、本発明がどの抗原
にも適用できることは、当業者には明らかであろう。本
発明の好ましい具体例において、Ｔ−独立抗原に対する
Ｔ−依存免疫反応を誘発する合成ワクチンが合成され
る。標的抗原はヘルパー・ペプチド又はＴ−細胞認識部
位を含むペプチド類と共にリポゾーム性調剤に組み込ま
れる。例えば、インフルエンザ、破傷風、ジフテリア・
シュードモナス、ブドウ球菌、連鎖球菌、百日咳菌、お
よび大腸菌などのトキソイドからの天然の、あるいは無
毒化されたペプチドなど、Ｔ−細胞認識部位を含んでい
るどんなペプチドでもヘルパーペプチドとして用いるこ
とができる。候補となるペプチドがＴ−細胞認識部位を
含んでいるかどうかを判定するための簡単なテストを行
うことができる。ペプチドがＢ−細胞エピトープだけを
含んでいるDNP−CapPEなどの抗原と共にリポゾーム製剤
に組み入れられる。その結果できるホスト有機体内のリ
ポゾーム製剤に対するIgG反応がある場合、そのペプチ
ドはＴ−細胞認識部位を有しており、本発明のヘルパー
・ペプチドとして用いることができる。
最も好ましくはＴ−独立抗原に対する免疫反応を強化す
るために利用することができる。以下に本発明について
Ｔ−独立抗原として十分に調べられているDNP−CapPEを
参照として説明する。しかしながら、本発明がどの抗原
にも適用できることは、当業者には明らかであろう。本
発明の好ましい具体例において、Ｔ−独立抗原に対する
Ｔ−依存免疫反応を誘発する合成ワクチンが合成され
る。標的抗原はヘルパー・ペプチド又はＴ−細胞認識部
位を含むペプチド類と共にリポゾーム性調剤に組み込ま
れる。例えば、インフルエンザ、破傷風、ジフテリア・
シュードモナス、ブドウ球菌、連鎖球菌、百日咳菌、お
よび大腸菌などのトキソイドからの天然の、あるいは無
毒化されたペプチドなど、Ｔ−細胞認識部位を含んでい
るどんなペプチドでもヘルパーペプチドとして用いるこ
とができる。候補となるペプチドがＴ−細胞認識部位を
含んでいるかどうかを判定するための簡単なテストを行
うことができる。ペプチドがＢ−細胞エピトープだけを
含んでいるDNP−CapPEなどの抗原と共にリポゾーム製剤
に組み入れられる。その結果できるホスト有機体内のリ
ポゾーム製剤に対するIgG反応がある場合、そのペプチ
ドはＴ−細胞認識部位を有しており、本発明のヘルパー
・ペプチドとして用いることができる。
インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質のHA2サブユ
ニットは良く調べられており、少なくとも一つのＴ−ヘ
ルパー細胞認識部位を持っているが、Ｂ−細胞認識部位
を有していないことが分かっているので、ヘルパー・ペ
プチドとして好ましく用いられた。したがって、このペ
プチドは接合された抗原に対するＴ−依存免疫反応を引
き起こすが、それ自体に対する抗体反応は誘発しない。
本発明の効果を発揮させるためにこうした制約は必要で
はなく、標的抗原への反応に加えて、ヘルパー・ペプチ
ドに対する免疫反応が望ましいか、あるいは受け入れら
れる場合、Ｂ−細胞認識部位を含んでいるヘルパー・ペ
プチドを使うことができる。しかしながら、ヘルパー・
ペプチドが純粋なＴ−ヘルパー細胞エピトープであるこ
とが好ましい。同様に、標的抗原に対する反応に加えて
細胞毒性反応が望ましいか、あるいは受け入れられる場
合、Ｔ−細胞障害性リンパ球認識部位を含むヘルパー・
ペプチドなら、どれでも用いることができる。
ニットは良く調べられており、少なくとも一つのＴ−ヘ
ルパー細胞認識部位を持っているが、Ｂ−細胞認識部位
を有していないことが分かっているので、ヘルパー・ペ
プチドとして好ましく用いられた。したがって、このペ
プチドは接合された抗原に対するＴ−依存免疫反応を引
き起こすが、それ自体に対する抗体反応は誘発しない。
本発明の効果を発揮させるためにこうした制約は必要で
はなく、標的抗原への反応に加えて、ヘルパー・ペプチ
ドに対する免疫反応が望ましいか、あるいは受け入れら
れる場合、Ｂ−細胞認識部位を含んでいるヘルパー・ペ
プチドを使うことができる。しかしながら、ヘルパー・
ペプチドが純粋なＴ−ヘルパー細胞エピトープであるこ
とが好ましい。同様に、標的抗原に対する反応に加えて
細胞毒性反応が望ましいか、あるいは受け入れられる場
合、Ｔ−細胞障害性リンパ球認識部位を含むヘルパー・
ペプチドなら、どれでも用いることができる。
HA2サブユニットは、通常のウィルスの脂質エンベロ
ープを通じて延びているカルボキシ端近くのアミノ酸疎
水性配列を有しているので、ヘルパー・ペプチドとして
さらに適している。このトランスメンブレン領域はリポ
ゾームの脂質２層構造（bilayer）との結合をより容易
にし、そしてHA2はリボゾーム性小胞と定量的に結びつ
けられる。前にも述べた通り、共有結合でペプチドを脂
質に結びつけたり、アミノ酸の疎水性配列をペプチドの
一つの端に取りつけるなど、ヘルパー・ペプチドを組み
入れるための別の方法も可能である。ヘルパー・ペプチ
ドをリポゾームに組み込むための種々の方法が可能であ
ることは当業者には明らかであろう。
ープを通じて延びているカルボキシ端近くのアミノ酸疎
水性配列を有しているので、ヘルパー・ペプチドとして
さらに適している。このトランスメンブレン領域はリポ
ゾームの脂質２層構造（bilayer）との結合をより容易
にし、そしてHA2はリボゾーム性小胞と定量的に結びつ
けられる。前にも述べた通り、共有結合でペプチドを脂
質に結びつけたり、アミノ酸の疎水性配列をペプチドの
一つの端に取りつけるなど、ヘルパー・ペプチドを組み
入れるための別の方法も可能である。ヘルパー・ペプチ
ドをリポゾームに組み込むための種々の方法が可能であ
ることは当業者には明らかであろう。
DNP−CapPEが標的抗原として選ばれたのはそれがよく
調べられており、Ｔ−独立抗原であるからである。した
がって、以下の実験で、DNP−CapPEに対するＴ−依存反
応はそのヘルパー・ペプチドの影響で発生している。本
発明によるリポゾーム製剤は個体での免疫反応を増強す
るためにも用いることができる。『個体』は、どの動
物、好ましくは哺乳類、そして最も好ましくは犬、猫、
牛、馬あるいはヒトを含んでいる。
調べられており、Ｔ−独立抗原であるからである。した
がって、以下の実験で、DNP−CapPEに対するＴ−依存反
応はそのヘルパー・ペプチドの影響で発生している。本
発明によるリポゾーム製剤は個体での免疫反応を増強す
るためにも用いることができる。『個体』は、どの動
物、好ましくは哺乳類、そして最も好ましくは犬、猫、
牛、馬あるいはヒトを含んでいる。
例１−リポゾームの調製 本発明を実施するためには、
フォスファチジル・エーテル類あるいはフォスファチジ
ル・エステル類（例えば、フォスファチジルエタノール
アミンおよびフォスファチジルコリン）、グリセリド、
セレブロシド、ガングリシド、スフィンゴミエリン、お
よびステロイド類（例えば、コレステロール）などを含
む種々の脂質素材を用いることができる。以下はフォス
ファチジルコリンを用いての調製の事例であるが、当業
者は標的抗原およびヘルパー・プロテイン又はプロテイ
ン類の組込みを可能にするどんなリポゾーム調製技術で
も用いることができることが分かるであろう。リポゾー
ムを調製する前に、組込みをより容易にするために、公
知の技術の一つを用いて、脂質成分の一つに、共有結合
で標的抗原および／またはヘルパー・ペプチドを取りつ
けることが必要な場合もあるであろう。卵の黄身（EYP
C）から精製したフォスファチジルコリン（PC）（Avant
i polarlipids,Pelham,AL）がリポゾームのために用い
られた。EYPCを丸底フラスコに必要な量だけ加え、回転
蒸発器（Buchi 461）でクロロフォルムが取り除かれ
た。乾燥された脂質薄膜が、EYPCの10mM溶液をつくりだ
すのに必要な量だけ、殺菌された水あるいはりん酸塩緩
衝食塩水（PBS）に再懸濁された。DNP−CapPE抗原がリ
ポゾームに組み込まれた時、Ｎ−２（2,4−ジニトリル
フェニル Ｅ−アミノカプロイルフォスファチジルエタ
ノールアミン:DNP−CapPE）がEYPCのクロロフォルム溶
液に加えられた。A/USSR−90/77 H1H1ウィルスの赤血球
凝集素（HA）から得られた精製HA2サブユニット（Doris
Bucher,Mt.Sinia,NYより提供）もリポゾームに組み込
むためその脂質薄膜に加えられた。そして、その脂質混
合物を殺菌されたPBSに懸濁させるか、あるいはその脂
質混合物をｎ−オクチルグルコシド（PBS中に５％W/Vo
l）に溶解して、次にPBSに対して16時間の透析を行うこ
とによって、リポゾームがつくられた。個々のリポゾー
ム製剤に含まれるDNP−CapPEおよびHA2の量は実験の必
要性に応じて変えられた。
フォスファチジル・エーテル類あるいはフォスファチジ
ル・エステル類（例えば、フォスファチジルエタノール
アミンおよびフォスファチジルコリン）、グリセリド、
セレブロシド、ガングリシド、スフィンゴミエリン、お
よびステロイド類（例えば、コレステロール）などを含
む種々の脂質素材を用いることができる。以下はフォス
ファチジルコリンを用いての調製の事例であるが、当業
者は標的抗原およびヘルパー・プロテイン又はプロテイ
ン類の組込みを可能にするどんなリポゾーム調製技術で
も用いることができることが分かるであろう。リポゾー
ムを調製する前に、組込みをより容易にするために、公
知の技術の一つを用いて、脂質成分の一つに、共有結合
で標的抗原および／またはヘルパー・ペプチドを取りつ
けることが必要な場合もあるであろう。卵の黄身（EYP
C）から精製したフォスファチジルコリン（PC）（Avant
i polarlipids,Pelham,AL）がリポゾームのために用い
られた。EYPCを丸底フラスコに必要な量だけ加え、回転
蒸発器（Buchi 461）でクロロフォルムが取り除かれ
た。乾燥された脂質薄膜が、EYPCの10mM溶液をつくりだ
すのに必要な量だけ、殺菌された水あるいはりん酸塩緩
衝食塩水（PBS）に再懸濁された。DNP−CapPE抗原がリ
ポゾームに組み込まれた時、Ｎ−２（2,4−ジニトリル
フェニル Ｅ−アミノカプロイルフォスファチジルエタ
ノールアミン:DNP−CapPE）がEYPCのクロロフォルム溶
液に加えられた。A/USSR−90/77 H1H1ウィルスの赤血球
凝集素（HA）から得られた精製HA2サブユニット（Doris
Bucher,Mt.Sinia,NYより提供）もリポゾームに組み込
むためその脂質薄膜に加えられた。そして、その脂質混
合物を殺菌されたPBSに懸濁させるか、あるいはその脂
質混合物をｎ−オクチルグルコシド（PBS中に５％W/Vo
l）に溶解して、次にPBSに対して16時間の透析を行うこ
とによって、リポゾームがつくられた。個々のリポゾー
ム製剤に含まれるDNP−CapPEおよびHA2の量は実験の必
要性に応じて変えられた。
例２−リポゾームの特徴付け リポゾーム構造へのHA2
の結合を評価するために、I125HA2が用いられた。リポ
ゾームへのDNP−CapPEの組み込みを評価するために、最
初の懸濁液の一部（10μｌ）が990ulメタノールに溶解
され、360mMの波長での吸収度が分光計で測定された。P
BSによる再構成と透析を行った後の製剤中のHA2の結合
度はHA2の量を変えても大幅には変化せず、90％以上で
あった。製剤中のDNP−CapPEの結合度はすべての製剤で
95％以上であった。注入と注入の間にDNPの放出は認め
られなかった。そして、DNP−CapPEはリポゾーム構造と
結合したままであった。
の結合を評価するために、I125HA2が用いられた。リポ
ゾームへのDNP−CapPEの組み込みを評価するために、最
初の懸濁液の一部（10μｌ）が990ulメタノールに溶解
され、360mMの波長での吸収度が分光計で測定された。P
BSによる再構成と透析を行った後の製剤中のHA2の結合
度はHA2の量を変えても大幅には変化せず、90％以上で
あった。製剤中のDNP−CapPEの結合度はすべての製剤で
95％以上であった。注入と注入の間にDNPの放出は認め
られなかった。そして、DNP−CapPEはリポゾーム構造と
結合したままであった。
例３−免疫手順 生後６〜８週間の雌の異系交配された
アルビノIRCマウス（Timco,Houston,TX）が用いられ
た。これらの動物は尾静脈から採血され、次に、0.1ml
のプラセボ（PBS），コントロール・リポゾーム（HA2お
よびハプテンを含んでいないもの）と指示された量のハ
プテンおよび／またはHA2ペプチドを含んでいるリポゾ
ームが与えられた。３週間から４週間後、それらのマウ
スの尾静脈から血液が採取され、最初の摂取の場合と同
じ製剤が同じ量だけブースター注射で接種された。９日
から14日後、動物の尾静脈から再び採血が行われた。任
意に最後の接種が行われてから８週間後に、それらのマ
ウスに対して３回目の接種が行われ、その２週間後に採
血が行われた。すべての接種は後足に筋肉内注射（IM）
の形で行われた。マウスはバリアー・フィルターを取り
つけたプラスチック製の檻（１檻当り４匹）に入れて飼
育され、リビタムで水と餌が与えられた。血清は2000x
g、４℃の温度下で５分間遠心分離処理され、テストま
で−20℃の温度下で保存された。各実験で採取したすべ
ての血清標本は１回のテストでその抗体生産に関する評
価が行われた。
アルビノIRCマウス（Timco,Houston,TX）が用いられ
た。これらの動物は尾静脈から採血され、次に、0.1ml
のプラセボ（PBS），コントロール・リポゾーム（HA2お
よびハプテンを含んでいないもの）と指示された量のハ
プテンおよび／またはHA2ペプチドを含んでいるリポゾ
ームが与えられた。３週間から４週間後、それらのマウ
スの尾静脈から血液が採取され、最初の摂取の場合と同
じ製剤が同じ量だけブースター注射で接種された。９日
から14日後、動物の尾静脈から再び採血が行われた。任
意に最後の接種が行われてから８週間後に、それらのマ
ウスに対して３回目の接種が行われ、その２週間後に採
血が行われた。すべての接種は後足に筋肉内注射（IM）
の形で行われた。マウスはバリアー・フィルターを取り
つけたプラスチック製の檻（１檻当り４匹）に入れて飼
育され、リビタムで水と餌が与えられた。血清は2000x
g、４℃の温度下で５分間遠心分離処理され、テストま
で−20℃の温度下で保存された。各実験で採取したすべ
ての血清標本は１回のテストでその抗体生産に関する評
価が行われた。
例４−抗−ジニトリルフェニル（DNP）血清抗体テスト
抗原をテストするために、ジニトロフェニル処理され
た仔ウシ血清アルブミン（DNP−BSA）が用いられた。コ
ントロール抗原として非誘導BSAが用いられた。DNP−BS
AはジニトロフルオロベンゼンをBSAの溶液に10:1の比率
で加えて調製され、pHが９−9.5になるまで、トリエタ
ノールアミンが加えられた。20℃で16時間インキュベー
ションした後、PBSに対する透析で非結合DNPが取り除か
れた。予備的な実験で、このモル比で誘導されたBSAが
より高い、あるいはより低いモル比のDNPを含んでいる
蛋白より効率的に血清抗体を探知することが証明され
た。血清抗体レベルはELISAとSPITA手順の両方で判定さ
れた。
抗原をテストするために、ジニトロフェニル処理され
た仔ウシ血清アルブミン（DNP−BSA）が用いられた。コ
ントロール抗原として非誘導BSAが用いられた。DNP−BS
AはジニトロフルオロベンゼンをBSAの溶液に10:1の比率
で加えて調製され、pHが９−9.5になるまで、トリエタ
ノールアミンが加えられた。20℃で16時間インキュベー
ションした後、PBSに対する透析で非結合DNPが取り除か
れた。予備的な実験で、このモル比で誘導されたBSAが
より高い、あるいはより低いモル比のDNPを含んでいる
蛋白より効率的に血清抗体を探知することが証明され
た。血清抗体レベルはELISAとSPITA手順の両方で判定さ
れた。
ELISA:イミューロンＩプレート（Dynatech,Detroit,M
I）は0.05Mカーボネート・バッファー（pH9.6）内でDNP
−BSA（１ウェル当り10ug）でコートされ、コントロー
ル・ウェルは１ウェル当り10ugのBSAでコートされた。
４℃で16時間後、プレートはPBS内で５％（Vol/Vol）FC
Sでポストコートされた。これおよび他のすべてのイン
ベーション後、プレートは１％FCSおよび0.2％ツイーン
20を含んでいるPBSで洗浄された。１％BSAを含んでいる
PBSで、1:100から出発して２倍ずつ連続的に希釈した血
清の希釈液が２重に用意され、各希釈液の0.1mlサンプ
ルが抗原およびコントロール・ウェルに加えられた。20
℃の温度下で５時間インキュベーション後、接種された
マウスIgG重鎖アルカリ性フォスファターゼに特異性を
有するヤギ抗体、（Fcスペシフィック、Cappel lab,Wes
t Chester,PA）、あるいは、ヤギ抗マウスIgGサブクラ
スが、最もうまく抗体を検出するのに必要な量を上回る
ように、予備的な実験で予め決められた濃度で加えられ
た。IgGサブクラスの場合、ヤギIgGに対して特異性を有
するアルカリ性フォスファターゼ接種ブタ抗体が加えら
れた。pH9.8の10％ジエタノールアミンにｐ−ニトロフ
ェニル・フォスフェートを加えたもの（1mg/ml）が加え
られた（１ウェル当たり0.1ml）。1/2時間後、Dynatech
MR 600分光計で410nmでの光学密度が測定された。抗体
の力価はコントロール・ウェルより0.2以上高い光学密
度を示した最高の希釈度の血清を基準として示されてい
る。
I）は0.05Mカーボネート・バッファー（pH9.6）内でDNP
−BSA（１ウェル当り10ug）でコートされ、コントロー
ル・ウェルは１ウェル当り10ugのBSAでコートされた。
４℃で16時間後、プレートはPBS内で５％（Vol/Vol）FC
Sでポストコートされた。これおよび他のすべてのイン
ベーション後、プレートは１％FCSおよび0.2％ツイーン
20を含んでいるPBSで洗浄された。１％BSAを含んでいる
PBSで、1:100から出発して２倍ずつ連続的に希釈した血
清の希釈液が２重に用意され、各希釈液の0.1mlサンプ
ルが抗原およびコントロール・ウェルに加えられた。20
℃の温度下で５時間インキュベーション後、接種された
マウスIgG重鎖アルカリ性フォスファターゼに特異性を
有するヤギ抗体、（Fcスペシフィック、Cappel lab,Wes
t Chester,PA）、あるいは、ヤギ抗マウスIgGサブクラ
スが、最もうまく抗体を検出するのに必要な量を上回る
ように、予備的な実験で予め決められた濃度で加えられ
た。IgGサブクラスの場合、ヤギIgGに対して特異性を有
するアルカリ性フォスファターゼ接種ブタ抗体が加えら
れた。pH9.8の10％ジエタノールアミンにｐ−ニトロフ
ェニル・フォスフェートを加えたもの（1mg/ml）が加え
られた（１ウェル当たり0.1ml）。1/2時間後、Dynatech
MR 600分光計で410nmでの光学密度が測定された。抗体
の力価はコントロール・ウェルより0.2以上高い光学密
度を示した最高の希釈度の血清を基準として示されてい
る。
SPIRA:SPIRAによるDNP抗体レベルのアセスメントはELIS
Aアッセイの場合に述べたのと同様の方法で判定された
が、二つの点で修正が行われた。可撓性ポリビニルクロ
ライド・マイクロタイター・プレートが用いられ、DNP
抗原に結合したマウス抗体を検出するために25Iでラベ
ルした親和性精製（重鎖に対して特異性を有する）ウサ
ギ抗マウスIgGが用いられた。抗体の力価は上に述べた
方法で計算され、上に述べたようなインフルエンザ・ウ
ィルスのHA2に対する特異性を有するマウス−モノクロ
ーナル抗体を用いる標準クロス−ハッチ・テストでこの
ラベルされたウサギ抗マウス抗体の特性が確認された。
Aアッセイの場合に述べたのと同様の方法で判定された
が、二つの点で修正が行われた。可撓性ポリビニルクロ
ライド・マイクロタイター・プレートが用いられ、DNP
抗原に結合したマウス抗体を検出するために25Iでラベ
ルした親和性精製（重鎖に対して特異性を有する）ウサ
ギ抗マウスIgGが用いられた。抗体の力価は上に述べた
方法で計算され、上に述べたようなインフルエンザ・ウ
ィルスのHA2に対する特異性を有するマウス−モノクロ
ーナル抗体を用いる標準クロス−ハッチ・テストでこの
ラベルされたウサギ抗マウス抗体の特性が確認された。
二つのマウス・グループが１回の実験に含まれている
時は、マン−ホイットニー・テストによって抗体力価の
比較が行われた。三つ以上のグループの比較が必要な場
合、クルシュダール−ウォリスの方法が用いられた。
時は、マン−ホイットニー・テストによって抗体力価の
比較が行われた。三つ以上のグループの比較が必要な場
合、クルシュダール−ウォリスの方法が用いられた。
例５−DNP−CapPEおよび／またはHA2サブユニットを含
むリポゾームの免疫原性 異系交配マウスの複数のグル
ープに対してEYPCリポゾーム（750ug）、あるいはHA
2（3.7ug）、DNP−CapPE（30ug）、あるいはその両方を
含んでいるEYPCの製剤を用いて、４週間の間隔を置いて
２度注射が行われた。IgGおよびIgM反応が間接ELISAで
分析され、抗体力価の平均で示された。脂質とDNPおよ
びHA2のモル比は6000:200:1であった。ELISA測定で、DN
P−CapPE（HA2を含んでいる場合と含んでいない場合の
両方）を含んでいる両方の製剤とも７匹のマウス中の７
匹にIgM反応を発生したことが示された。しかしなが
ら、抗DNP IgG血清抗体の力価を測定すると、リポゾー
ムDNPグループでは結果が急激に減少し、コントロール
・グループの場合と同様の力価が得られたが、DNP/HA2
リポゾームで免疫化されたマウスはかなり高いレベルの
血清固有抗DNP IgGを誘発した。
むリポゾームの免疫原性 異系交配マウスの複数のグル
ープに対してEYPCリポゾーム（750ug）、あるいはHA
2（3.7ug）、DNP−CapPE（30ug）、あるいはその両方を
含んでいるEYPCの製剤を用いて、４週間の間隔を置いて
２度注射が行われた。IgGおよびIgM反応が間接ELISAで
分析され、抗体力価の平均で示された。脂質とDNPおよ
びHA2のモル比は6000:200:1であった。ELISA測定で、DN
P−CapPE（HA2を含んでいる場合と含んでいない場合の
両方）を含んでいる両方の製剤とも７匹のマウス中の７
匹にIgM反応を発生したことが示された。しかしなが
ら、抗DNP IgG血清抗体の力価を測定すると、リポゾー
ムDNPグループでは結果が急激に減少し、コントロール
・グループの場合と同様の力価が得られたが、DNP/HA2
リポゾームで免疫化されたマウスはかなり高いレベルの
血清固有抗DNP IgGを誘発した。
水溶液でHA2およびDNP−CapPEの混合物か、あるいはD
NP−CapPEリポゾームおよびHA2リポゾームを一緒に注射
してマウスを免疫化した場合にIgG抗DNP抗体は発生しな
かったので、免疫グロブリン・クラスにおけるこの変化
は、完全にその原因を同じリポゾーム構造内でのHA2とD
NPの結合に求めることができる（表２）。IgG抗DNP抗体
の生産を刺激するためには両方の成分が共に存在してい
ることが必要である。
NP−CapPEリポゾームおよびHA2リポゾームを一緒に注射
してマウスを免疫化した場合にIgG抗DNP抗体は発生しな
かったので、免疫グロブリン・クラスにおけるこの変化
は、完全にその原因を同じリポゾーム構造内でのHA2とD
NPの結合に求めることができる（表２）。IgG抗DNP抗体
の生産を刺激するためには両方の成分が共に存在してい
ることが必要である。
例６−リポゾーム性DNPおよびHA2に対する用量反応 こ
の実験においては、三つの免疫化グループについての研
究が行われた。一定の量のDNP−CapPE（１回の注射量:
5,10,30ug）に対して、異なった量のHA2（1,3あるいは9
ug）もEYPCで構成されたリポゾーム製剤に組み込まれた
（750ug/注射１回）。動物からの採血は１回のブースタ
ー注射の１日前と９日後に行われた。抗DNP IgGおよびI
gMに対して、ELISAアッセイで血清の分析が行われた。
さらに、二つのグループのマウスが10ugのDNP−BSAか、
あるいは水溶液中で混合したDNP−CapPEとHA2のいずれ
かを使って免疫化された。
の実験においては、三つの免疫化グループについての研
究が行われた。一定の量のDNP−CapPE（１回の注射量:
5,10,30ug）に対して、異なった量のHA2（1,3あるいは9
ug）もEYPCで構成されたリポゾーム製剤に組み込まれた
（750ug/注射１回）。動物からの採血は１回のブースタ
ー注射の１日前と９日後に行われた。抗DNP IgGおよびI
gMに対して、ELISAアッセイで血清の分析が行われた。
さらに、二つのグループのマウスが10ugのDNP−BSAか、
あるいは水溶液中で混合したDNP−CapPEとHA2のいずれ
かを使って免疫化された。
IgM ELISA値（表２）を統計的に分析したが、５およ
び10ug DNP−CapPEをそれぞれ投与した二つのグループ
はHA2の量は増えたものの、有意差は見られなかった。5
ugのDNP−CapPEを投与したグループの結果は示していな
い。しかしながら、30ugのDNP−CapPEおよび1,3または9
ugのHA2を含んだリポゾームでマウスを免疫化した場
合、有意差が認められ、比率が高ければ高い程、IgM力
価は高かった。マウスを10ugのDNP−BSAで免疫化した場
合、IgM反応は認められなかった。そして水溶液中でDNP
−CapPEとHA2を混合したもので免疫化したグループで
は、６匹のマウスのうち２匹だけがIgM反応を示した。
び10ug DNP−CapPEをそれぞれ投与した二つのグループ
はHA2の量は増えたものの、有意差は見られなかった。5
ugのDNP−CapPEを投与したグループの結果は示していな
い。しかしながら、30ugのDNP−CapPEおよび1,3または9
ugのHA2を含んだリポゾームでマウスを免疫化した場
合、有意差が認められ、比率が高ければ高い程、IgM力
価は高かった。マウスを10ugのDNP−BSAで免疫化した場
合、IgM反応は認められなかった。そして水溶液中でDNP
−CapPEとHA2を混合したもので免疫化したグループで
は、６匹のマウスのうち２匹だけがIgM反応を示した。
IgG ELISA値（表２）を統計的に分析し、一定の量のH
A2（1,3または9ug）に対する反応とDNP−CapPEの量を増
大（5,10あるいは30ug）した結果とから、DNPとHA2の両
方に対して用量反応が実証された。このこともIgG生産
の増強は同じリポゾーム内に標的抗原とヘルパー・ペプ
チドの両方が存在していることに原因が求められること
を示している。DNP−BSAで免疫化されたマウスはテスト
されたリポゾームでのHA2とDNPの用量が最も高くして免
疫化したグループと同等のIgG反応を示した。水溶液内
でDNPとHA2の混合したもので免疫化したマウスの場合、
IgG反応は認められなかった。
A2（1,3または9ug）に対する反応とDNP−CapPEの量を増
大（5,10あるいは30ug）した結果とから、DNPとHA2の両
方に対して用量反応が実証された。このこともIgG生産
の増強は同じリポゾーム内に標的抗原とヘルパー・ペプ
チドの両方が存在していることに原因が求められること
を示している。DNP−BSAで免疫化されたマウスはテスト
されたリポゾームでのHA2とDNPの用量が最も高くして免
疫化したグループと同等のIgG反応を示した。水溶液内
でDNPとHA2の混合したもので免疫化したマウスの場合、
IgG反応は認められなかった。
例７−DNP/HA2リポゾームで予め免疫化されたマウスの
抗体反応に対するDNP−CapPEリポゾームの３回目の注射
の影響 マウスを事前にDNP−CapPE/HA2リポゾームで免疫した
場合のDNP標的抗原に対する記憶応答の発現に関する評
価を行うために、７匹のマウスのグループに対して、DN
P−CapPEだけを含むリポゾームで３回目の注射が行われ
（したがって、Ｂ細胞箇所だけが提供され）た。この実
験は、DNP−CapPEおよびHA2が最初のリポゾーム製剤内
に一緒に存在している場合だけ、記憶応答がつくりださ
れることを示している。また、本発明は正真正銘の胸腺
依存免疫反応と、Ｔ−細胞認識部位の存在をさらに必要
としなくても、標的抗原に反応してIgG抗体をつくりだ
すことができる標的抗原に関する免疫記憶をつくりだす
ことも示している。
抗体反応に対するDNP−CapPEリポゾームの３回目の注射
の影響 マウスを事前にDNP−CapPE/HA2リポゾームで免疫した
場合のDNP標的抗原に対する記憶応答の発現に関する評
価を行うために、７匹のマウスのグループに対して、DN
P−CapPEだけを含むリポゾームで３回目の注射が行われ
（したがって、Ｂ細胞箇所だけが提供され）た。この実
験は、DNP−CapPEおよびHA2が最初のリポゾーム製剤内
に一緒に存在している場合だけ、記憶応答がつくりださ
れることを示している。また、本発明は正真正銘の胸腺
依存免疫反応と、Ｔ−細胞認識部位の存在をさらに必要
としなくても、標的抗原に反応してIgG抗体をつくりだ
すことができる標的抗原に関する免疫記憶をつくりだす
ことも示している。
前にも示した通り、DNP−CapPE/HA2リポゾームで免疫
されたマウスはIgG抗DNP反応をつくりだした。同じマウ
スにDNP−CapPE（グループ１）だけを含んでいるリポゾ
ームで３回目の注射を行うと、SPIRAに関する目盛りが
第１回あるいは第２回の採血時と比較して急激に増大
し、最初の免疫化によってつくりだされたものより高い
レベルでの特定のＢ細胞の再刺激が行われることが示さ
れた。HA2リポゾームで免疫化し、次にDNP−CapPEリポ
ゾームで再刺激されたマウス（グループ３）は検出でき
るレベルの抗DNP IgG抗体力価をつくりださなかった。D
NP−CapPE/HA2リポゾームで一度だけ注射されたマウス
（グループ２）は第１次の免疫化の場合と同様の抗DNP
IgG抗体レベルを示した。中空EYPCリポゾームを注射し
たコントロール・グループ（グループ４）では抗IgG抗
体生産は観察されなかった。
されたマウスはIgG抗DNP反応をつくりだした。同じマウ
スにDNP−CapPE（グループ１）だけを含んでいるリポゾ
ームで３回目の注射を行うと、SPIRAに関する目盛りが
第１回あるいは第２回の採血時と比較して急激に増大
し、最初の免疫化によってつくりだされたものより高い
レベルでの特定のＢ細胞の再刺激が行われることが示さ
れた。HA2リポゾームで免疫化し、次にDNP−CapPEリポ
ゾームで再刺激されたマウス（グループ３）は検出でき
るレベルの抗DNP IgG抗体力価をつくりださなかった。D
NP−CapPE/HA2リポゾームで一度だけ注射されたマウス
（グループ２）は第１次の免疫化の場合と同様の抗DNP
IgG抗体レベルを示した。中空EYPCリポゾームを注射し
たコントロール・グループ（グループ４）では抗IgG抗
体生産は観察されなかった。
例８−免疫反応における外膜HA2と内膜HA2の比較 異系
交配マウスの四つのグループが、30ugのDNP−CapPEと種
々の量のHA2（3,1,0.5および0ug）で構成されたEYPCリ
ポゾームで免疫化された。さらに、一つのグループのマ
ウスは予めリポゾームをブロメライン（100ug/ml）で処
理した後、DNP−CapPE/HA2リポゾーム（それぞれ30およ
び3ug）で免疫化された。ブロメラインで処理すると表
面蛋白が壊され、膜挿入テイルと無傷の内部化されたHA
2だけが残される。ELISA力価を統計的に分析すると、こ
の場合も、HA2の量の増加につれて用量反応効果が観察
された。DNP−CapPEリポゾームの場合と統計的に有意差
のあるIgG反応を誘発するためには、１回の注射でDNP−
CapPEリポゾーム内に0.5ug程度のHA2があれば十分であ
る。しかしながら、マウスをブロメラインで処理したリ
ポゾームで免疫化した場合、処理されなかったリポゾー
ムの場合と比較して、統計的に有意差は認められなかっ
た。これらの結果は、リポゾーム外のHA2は必要ではな
いこと、そして、免疫能力を有する細胞にＢおよびＴ細
胞エピトープが組み合わされて提示されるようにするた
めには、リポゾームを処理する必要があることを示して
いる。
交配マウスの四つのグループが、30ugのDNP−CapPEと種
々の量のHA2（3,1,0.5および0ug）で構成されたEYPCリ
ポゾームで免疫化された。さらに、一つのグループのマ
ウスは予めリポゾームをブロメライン（100ug/ml）で処
理した後、DNP−CapPE/HA2リポゾーム（それぞれ30およ
び3ug）で免疫化された。ブロメラインで処理すると表
面蛋白が壊され、膜挿入テイルと無傷の内部化されたHA
2だけが残される。ELISA力価を統計的に分析すると、こ
の場合も、HA2の量の増加につれて用量反応効果が観察
された。DNP−CapPEリポゾームの場合と統計的に有意差
のあるIgG反応を誘発するためには、１回の注射でDNP−
CapPEリポゾーム内に0.5ug程度のHA2があれば十分であ
る。しかしながら、マウスをブロメラインで処理したリ
ポゾームで免疫化した場合、処理されなかったリポゾー
ムの場合と比較して、統計的に有意差は認められなかっ
た。これらの結果は、リポゾーム外のHA2は必要ではな
いこと、そして、免疫能力を有する細胞にＢおよびＴ細
胞エピトープが組み合わされて提示されるようにするた
めには、リポゾームを処理する必要があることを示して
いる。
例９−免疫反応中の免疫グロブリン・サブクラスの再分
割 ELISA測定値の分析で、IgG1抗体が優勢なサブクラ
スであった。
割 ELISA測定値の分析で、IgG1抗体が優勢なサブクラ
スであった。
異系交配マウスのDNPに対するIgG1反応はDNP−CapPE
の用量が低い場合（表１）、HA2の濃度が低くても同様
であった。DNP−CapPEの濃度が高い場合（30ug）、HA2
の量が増大すると用量反応効果が認められた。EYPC,DNP
−CapPEおよびHA2によるリポゾーム製剤をそれぞれ750,
30および9ug投与した場合、標準的なハプテン・キャリ
ア・システムであるDNP−BSA10ugで免疫したマウスのグ
ループの場合とほぼ等しいIgG1反応が示された。
の用量が低い場合（表１）、HA2の濃度が低くても同様
であった。DNP−CapPEの濃度が高い場合（30ug）、HA2
の量が増大すると用量反応効果が認められた。EYPC,DNP
−CapPEおよびHA2によるリポゾーム製剤をそれぞれ750,
30および9ug投与した場合、標準的なハプテン・キャリ
ア・システムであるDNP−BSA10ugで免疫したマウスのグ
ループの場合とほぼ等しいIgG1反応が示された。
IgG2aおよびIgG2b抗体サブクラスの場合、統計的な差
は認められなかった（表５）。IgG2aあるいはIgG2b抗体
を検出できなかった唯一のグループは1ugのHA2と10ugの
DNP−CapPE（IgG2aおよびIgG2b）、および3ugのHA2およ
び10ugのDNP−CapPE（IgG2b）を含んでいるEYPCリポゾ
ームで免疫化されたマウスのグループであった。DNP−C
apPEまたはHA2の用量が高い場合、反応における有意差
は認められなかった。その反応はマウスをDNP−BSAで免
疫した場合の反応とほぼ同様であった。
は認められなかった（表５）。IgG2aあるいはIgG2b抗体
を検出できなかった唯一のグループは1ugのHA2と10ugの
DNP−CapPE（IgG2aおよびIgG2b）、および3ugのHA2およ
び10ugのDNP−CapPE（IgG2b）を含んでいるEYPCリポゾ
ームで免疫化されたマウスのグループであった。DNP−C
apPEまたはHA2の用量が高い場合、反応における有意差
は認められなかった。その反応はマウスをDNP−BSAで免
疫した場合の反応とほぼ同様であった。
IgG3抗体サブクラスの場合、有意差は認められなかっ
た。各グループで、力価が検出され、免疫化された６匹
のマウスのうちの少なくとも４匹は反応を示した（表
５）。しかしながら、10ugのDNP−BSAで免疫された２匹
のマウスだけが力価の上昇を示したが、その値はリポゾ
ーム製剤で免疫化されたマウスのグループよりはるかに
低かった。
た。各グループで、力価が検出され、免疫化された６匹
のマウスのうちの少なくとも４匹は反応を示した（表
５）。しかしながら、10ugのDNP−BSAで免疫された２匹
のマウスだけが力価の上昇を示したが、その値はリポゾ
ーム製剤で免疫化されたマウスのグループよりはるかに
低かった。
以上に、本発明について十分に説明したので、ここに
記載した本発明の精神あるいは範囲を逸脱することなし
に変更および修正が可能であることは、この技術に通じ
ている人なら誰にでも明らかであろう。
記載した本発明の精神あるいは範囲を逸脱することなし
に変更および修正が可能であることは、この技術に通じ
ている人なら誰にでも明らかであろう。
フロントページの続き
(72)発明者 ハウアド アー．シクス
アメリカ合衆国，18301 ペンシルヴェ
イニア，イースト ストラウズバーグ,
ボグ ロウド ２番地
(72)発明者 ナタリ ガーソン
ベルギー，1330 リクゼンス アヴェニ
ュー アレクスサーンダー 10番地
(56)参考文献 特開 平２−184635（ＪＰ，Ａ)
特開 昭51−26218（ＪＰ，Ａ)
特開 昭61−200924（ＪＰ，Ａ)
Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｙ ，1985，Ｖｏｌ
134，Ｎｏ１ ，ｐｐ616〜622
Ｎａｔｕｒｅ 317 ：Ｐ359〜361
（1985)
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ Ｎｏ85（1988）ｐ1610〜
1614
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
A61K 39/00
A61K 9/127
Claims (5)
- 【請求項１】脂質、標的抗原、および少なくとも１のＴ
−ヘルパー細胞認識部位を有している少なくとも１のヘ
ルパーペプチドで構成されている、抗原のためのリポゾ
ーム性免疫原性キャリアであって、該標的抗原がDNP−C
apPEであり、該ヘルパーペプチドが疎水性相互作用を通
じてリポゾームに結びつけられるインフルエンザ・ウィ
ルスのHA2ポリペプチド・サブユニットであることを特
徴とするリポゾーム性免疫原性キャリア。 - 【請求項２】フォスファチジル・エーテル、フォスファ
チジル・エスエル、グリセリド、セレブロシド、ガング
リオシド、スフィンゴミエリン、ステロイド、およびそ
れらの混合物で構成されるグループから選択される脂質
でできている請求項１のリポゾーム性免疫原性キャリ
ア。 - 【請求項３】キャリアが120,000脂質分子あたりほぼ１
のHA2分子で構成されている、請求項１のリポゾーム性
免疫原性キャリア。 - 【請求項４】該フォスファチジル・エステル類がフォス
ファチジルエタノールアミドおよびフォスファチジルコ
リンである、請求項２のリポゾーム性免疫原性キャリ
ア。 - 【請求項５】該ステロイドがコレステロールである、請
求項２のリポゾーム性免疫原性キャリア。
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