CN1032236C - 对弱疫苗抗原提供胸腺相关帮助的脂质体的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供脂质体免疫原的制备方法，即将抗原与附加组分一起掺入到脂质体中。所述附加组分含有至少一个T辅助淋巴细胞识别部位。本发明制备的脂质体免疫原对弱疫苗提供胸腺相关帮助。

Description

对弱疫苗抗原提供胸腺相关帮助的脂质体的制备方法
本发明涉及通过把靶抗原与一附加组分一起掺入一脂质体，从而提高对靶抗原的抗体反应，其中该组分至少含有一T辅助淋巴细胞识别部位。
一个疫苗抗原通过诱导生物产生免疫反应来使该生物具有对感染的免疫性，因此，抗原作用的大小取决于它们诱导的免疫反应强度的高低。现有强度可变的固有的强和弱的抗原。此外，抗原可以分类为胸腺(“T”)相关或T独立抗原，这基于它们是否能够从T细胞引发出辅助活力。这种T细胞活力与IgG和IgA类抗体的产生有关；T独立抗原诱导IgM抗体的产生，但不诱导B细胞，以控制IgG或IgA抗体的合成与否。产生IgM类免疫球蛋白在实验动物和人类中是暂时的反应，仅持续几个月；但是产生IgG和IgA类抗体通常持续几年。因此，引出对特殊抗原的T相关反应是有益的。糖类或多糖类基抗原是T独立抗原，并且仅限于用作儿童疫苗。同样许多表示抗体识别部位的多肽是T独立抗原，因此，同样也不能产生对一种疫苗所希望的IgG和IgA抗体反应。
人们已经知道，通过把抗原接合(共价附着)到一个提高免疫反应的辅助蛋白质上，一个较强的抗体反应可能引出一弱抗原。例如美国专利4761283表明，通过把该抗原接合到一细菌辅助蛋白上，对待定的细菌胶囊状聚合物的弱的产生免疫性的反应被提高，细菌辅助蛋白本身诱导一抗原反应。用一毒素作辅助蛋白是人所共知的，例如，用白喉类毒素。但是，用这样一个有毒的辅助蛋白会引起一个问题，因为该辅助蛋白的内源毒性可能限制抗原—辅助蛋白接合体的剂量，从而限制了它的有效性。
生物对引起抗原决定部位抑制效应的辅助蛋白的早期免疫接种作用会抑制对靶抗原的免疫反应，这也是众所周知的。当宿主生物准备对辅助蛋白反应时，该生物将在它可能开始对靶抗原免疫反应前清除该靶抗原—辅助蛋白接合体。
这些以前应用的接合体是通过把抗原共价连接到载体辅助蛋白上来形成的。免疫反应的提高对T独立抗原是特别重要的，T独立抗原可以接合到一包含至少一个T辅助细胞识别部位的肽上，从而得到一个对T独立抗原的T相关反应。但是，现在应用的共价连接接合体效果有限，这是由于共价结合过程中带来的结构性的限制(即构象变化，结合部位潜在的不可及度，以及无法改变这些组分比率)。此外，这些接合体可能存在剂量上的限制以及抗原决定部位抑制效应。
脂质体是由类脂分散在水介质中形成的膜状的泡。制备脂质体的方法对该领域的普通技术人员来说是公知的，并且作为例子在作为参考文献列出的下述专利(而不限于这些专利)中被加以说明：美国专利4565696和4235871。脂质体具有对一活体内载体所需的几个性质，如低毒性，低免疫原性，并具有生物降解能力。它还表明在实验动物中脂质体可提高对抗原的抗体反应。抗原或者被俘获在脂质体的水溶性的部分，或者与双层相缔合。例如，美国专利4565696描述了对把免疫原共价连接到脂质体的表面双层上，并因此加强该免疫反应的步骤。
本发明涉及提供通过把该抗原与至少一个辅助肽(如至少包含一T细胞识别部位的辅助肽)一起掺进一种脂质体制剂中去，从而提高对一靶抗原的抗原反应。本发明可用于提高所引出的对任何抗原的抗原反应；包括(但不限于)聚多糖类抗原，如流感嗜血杆菌(Hemophilus influenza)、脑膜炎双球菌(Meningococci)、肺炎双球菌(Pneumocicci)和链球菌(Streptococci)，以及肽类，如肝炎B表面蛋白，HIV表面蛋白，流行性感冒病毒蛋白，副流行感冒病毒肽类或血球凝集素，以及霍乱表面糖蛋白。
通过把靶抗原附着到包含一活性官能度的许多种不同的类脂材料之一上来，可以把靶抗原(人们希望提高对它的免疫反应)掺入到脂质体泡中去。这些类脂材料包括磷脂酰醚或磷脂酰酯(例如磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱)、甘油酯类、脑苷脂类、神经节苷脂类、神经鞘磷脂类、以及类固醇类(例如，胆固醇)等等。美国专利4565696和4235871公开了用于制备脂质体的其它类脂材料。
另一方面，如果靶抗原带有一亲脂基团的话，该靶抗原可以通过疏水力掺入到脂质体泡中去，见美国专利4448765，或者，一疏水基团可附着到该抗原上。
也可用共价相互作用或疏水相互作用使肽掺入进去，例如，流行性感冒病毒的血球凝集素(HA)蛋白是由两个多肽链(HA1和HA2)组成。HA2多肽链包含一个靠近该多肽羧基末端的疏水氨基酸的序列，并至少包含一个T辅助细胞识别部位。这样，HA2多肽链可以通过贯通膜疏水区域掺入到脂质体中去。美国专利4448765描述了流行性感冒病毒亚单位掺入到脂质体中去，该专利在此列入以供参考。为了促进与脂质体膜的缔合，疏水组分可以交替地加到该辅助肽中去，或者该辅助肽可以直接共价地附着到包含一活性官能度的类脂材料上。
本发明与以前所用的抗原载体接合体(例如在美国专利4761283中所述的接合体)相比，有几个优点。在共价结合的接合体中，由于共价键的作用，在载体蛋白构象中的变更和在抗原构象中的变更都是可能的。在本发明中这个缺点可以克服，在此，靶抗原和辅助肽与脂质体缔合。本发明克服了与已有技术中存在的毒性和抗原决定部位抑制效应。本发明使用的是无毒类脂，并且最好用离析出来的、无毒的含肽的T辅助部位。
本发明比以前所用的接合体的优越之处还在于它考虑到了对抗原密度以及对靶抗原对辅助肽的比的改善，并且允许多于一个携带辅助肽的T辅助细胞识别部位的掺入。这些因素可能影响对靶抗原所产生的特定抗体的数量。当接合体由合成法制成时，因为两种组分一定是由共价键结合，这些因素不容易控制，导致对因素的数目和类型的实际限制，当保持靠近识别部位时，这些因素结合在一起。此外，本发明相对于接合体有优点，因为现已表明抗原掺入到脂质体中可以提高抗体的产量。这样，本发明用脂质体的这个性质附带地增进了对一给定抗原(并且特别是对不能产生足够抗体的弱抗原)抗体的产量。
本发明的脂质体泡提供了一种设计合成疫苗的新方法。靶抗原和辅助肽(或肽)的多重复制可通过一个快速简便的方法来实现。除了能有效地提高对靶抗原的免疫接种效果之外，这个方法还易于试验抗原和辅助肽。例如，本发明提供了一简单的载体，用于比较各种T辅助肽增进对一给定抗原的免疫原反应的能力。这样，本发明也提供了一个用于探测免疫反应机理的有用载体。
根据下面本发明的现在优选的实施例的说明，其它和进一步的实施例、特点和优点将是明显的。
本发明的疫苗组成可以用于增进对任何靶抗原，特别适于T独立抗原的免疫反应。本发明以DNP-CapPE为例，它作为T独立抗原，对之人们已进行了充分的研究。但是，对本领域普通技术人员来说，本发明对任何抗都显然适用。在本发明优选的实施例中，一合成的疫苗被合成，它诱导对一T相关抗原的T相关免疫反应。靶抗原与包含一T细胞识别部位的一个辅助肽或多个肽一起掺入到脂质体的制剂中。含有一T细胞识别部位的任何肽都可以用作辅助肽，例如，天然的或已解毒的来处类毒素(如流感、破伤风、白喉绿浓杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌、百日咳和大肠杆菌)的肽。可以用一个简单的试验来确定一候选肽是否包含一T细胞识别部位。这个肽与一种仅包含一B细胞抗决定部位的抗原(如DNP-CapPE抗原)一起被掺入到脂质体制剂中。在宿主生物中如有对所得到的脂质体制剂的IgG反应，那么这个肽就有T细胞识别部位，并可用作本发明的辅助肽。
流感血球凝集素蛋白的HA2亚单位可以优选来用作辅助肽，因为它已被准确测定，并且已知其具有至少一个T辅助细胞识别部位而没有B细胞识别部位。这样，这个肽引起对一接合体抗原的T相关免疫反应，而不诱导自身的抗体反应。对本发明的功能，这个限制不是必须的；如果希望产生对辅助肽的免疫反应，那么包含一B细胞识别部位的任何辅助肽都可使用，或者除了对靶抗原的反应外，该反应也是可接受的。但是辅助肽最好是纯T辅助细胞抗原决定部位。如果希望产生一细胞毒性反应，或者除了对靶抗原一个反应外，该反应也允许存在，那么同样，任何包含一个T细胞毒性淋巴细胞识别部位的辅助肽也都适用。
HA2亚单位作为辅助肽更合适，因为在接近羧基未端处它携带一个疏水的氨基酸序列，该序列常穿过该病毒的类脂被膜而延伸，这个贯通膜区域促进与脂质体类脂双层的缔合，并且HA2是定量地与脂质体泡缔合的。如以前所讨论的那样，其它掺入辅助肽的方法也是可行的，如把肽共价地附着到一类脂上，或把一疏水氨基酸序列附着到肽的一端。对一个本专业的普通技术人员，很显然，用于把辅助肽掺入到脂质体的各种方法都是可行的。
挑选DNP-CapPE作靶抗原，因为对它已进行了充分的研究，并且它是一个T独立抗原。这样在下述的试验中，由于辅助肽的作用，致使发生了对DNP-CapPE的T相关反应，本发明的脂质体制剂可用作在个体中增大免疫反应。术语“个体”意味着包括任何动物，哺乳动物比较合适，最好是狗、猫、母牛、马或人。
例1 脂质体的制备
多种类脂材料可用于实施本发明，包括(但不限于)：磷脂酰醚或磷脂酰酯(例如，磷脂酰胆乙醇胺和磷脂酰胆碱)，甘油酯类，脑苷脂类，神经节苷酯类，神经鞘磷脂类，以及类固醇(例如，胆固醇)。下面是用磷脂酰胆碱制备脂质体的一个例子。当然，本领域的普通技术人员都知道：只要考虑到靶抗原和辅助蛋白或蛋白的掺入，任何脂质体制剂技术都可以利用。在制备脂质体之前，可能需要按照公知的方法之一把靶抗原和/或辅助肽共价附着到类脂组分之一上，以实现掺入。由蛋黄中提取的磷脂酰胆碱(PC)(亚拉巴马州Pelham的Avanti极性脂质体)(即EYPC)用于制备脂质体。将EYPC按所需要的量加到圆底烧瓶中，并用一个旋转蒸发器(Buchi 461)除去氯仿。干燥的类脂膜在无菌水或磷酸盐缓冲溶液(PBS)中再悬浮，量要足够产生10mM的EYPC溶液。当该DNP-CapPE抗原被掺入到脂质体中时，把N—2(2，4二硝基苯基)E—氨基己酰基磷脂酰乙醇胺(DNP-CapPE)加入到EYPC的氯仿溶液中，将从A/USSR-90/77 H1N病毒的血细胞凝素中衍生出来的、纯化的HA2亚单位(由纽约州Mt.Sinia的Doris Bucher提供)也加到类脂膜中，用作在脂质体的包含物。通过在无菌PBS中该类脂混合物悬浮或通过在正辛基葡萄糖苷(在PBS中5％W/Vol)中溶解该类脂混合物，随后对PBS透析16小时，形成脂质体。包含在制备的单个脂质体制剂中的DNP-CapPE和HA2的量根据实验的需要而变。
例2 脂质体特性
用I125HA2来检验HA2对脂质体结构的缔合。为了检验DNP-CapPE对脂质体的掺入，把起始悬浮液的等分试样(10ul)溶解在990ul甲醇中，在分光光度计上读出360mM波长处的吸光度。在制剂中HA2缔合百分比在随后以PBS重结晶和透析过程中，没有随HA2的改变而明显变化，一直在90％以上。在所有的制剂中，DNP-CappPE在制剂中的缔合百分比大于95％。在各次注射之间没有观测到DNP的释放。DNP-CapPE保持与脂质体结构的缔合。
例3免疫接种方案
采用6—8周龄远系繁殖的白化的IRC雌性小鼠(德克萨斯州休斯敦市T)，这些动物从尾静脉取血，并给0.1毫升空白对照剂(PBS)，对照脂质体(无HA2或半抗原)或包含指示量的半抗原和/或HA2肽的脂质体。3—4周后这些小鼠由尾静脉取血，以与初次接种同样的制剂、同样的剂量进行加强接种。9到14天后这些动物再从尾静脉取血。任意地，这些小鼠后一次注射8周后还可进行第三次接种，并在两周后取血。所有接种都在后腿肌肉内进行。这些小鼠在弹性笼(每笼4个)用档板滤器保养，并且允许它们无限制地进食和饮水。在2000×g档、4℃下离心5分钟来分离血清，在试验前-20℃下贮存。在单个试验中，对每个试验中的所有血清样品进行一次抗体产生的检验。
例4 抗—二硝基苯基(DNP)血清抗体试验
用二硝基苯基化的牛血清清蛋白(DNP-BSA)试验该抗原，未衍生的BSA用作对照抗原，把二硝基氟苯按10∶1的摩尔比加到BSA溶液中，制成DNP-BSA制剂；加三乙醇胺直到pH值达到9—9.5为止。在20℃下培养16小时后，用PBS透析除去未结合的DNP。初步试验确定：用这样摩尔比衍生出的BSA测定血清抗体比包含较高或较低的DNP摩尔比的蛋白质更有效。血清抗体的水平用ELISA和SPIRA法两者来测定。
ELISA法：用在0.05M碳酸盐缓冲液(pH值9.6)中DNP-BSA(每穴10ug)涂布Immulon I板(密执安州底特律市Dynatech提供)，对照穴以每穴10ug的BSA涂布。在4℃下16小时后该板用在PBS中5％(体积/体积)的FCS后涂布，在这次和其他培养后，用含1％FCS和0.2％吐温20的PBS洗涤这些板。在含1％BSA的PBS中制备从1∶100开始的一系列浓度两倍递减的血稀释液，每种浓度制成两份，并把每个稀释液的0.1毫升样品加到抗原和对照穴中。在20℃下培养5小时后，加入专用于鼠科碱性磷酸酯结合重链的山羊抗体(宾州西切斯特的FCspecific Cappel lab提供)，或山羊抗鼠科IgG亚类，加入浓度超过预备试验中最佳抗体测定所需浓度。在IgG亚类的情况，加入碱性磷酸酶结合体的猪抗体(专用于山羊IgG)。在10％二乙醇胺缓冲液中加入—硝基苯磷酸酯(1mg/ml)(每穴0.1ml)。半小时后在Dynatech的MR600分光光度计上读出在410nm处的光学密度。按照最高稀释的血清表示抗体滴定度，该血清产生高于对照穴0.2光密度。
SPIRA法：与ELISA法相比，用SPIRA法确定DNP抗体水平的评定方法有两个改进：采用了柔韧的聚氯乙烯微滴定板，用I125标记的亲和纯化(重链比的)兔抗鼠IgG来检测结合到DNP抗原上的鼠科抗体。如以前所述的那样计算抗体滴定度，而用标准交叉排线试验(Standard Cross-hatch tests)来估价标记兔抗—鼠科抗体的专一性，该试验用如所述的鼠科—单克隆抗体具有对流行性感冒病毒的HA2单一性。
当两组鼠包括在单个试验中时，根据Mann—Witney试验来比较抗体滴定度。当比较多于两组数据时，可采用Krusdall—Wallis方法。
例5含有DNP-CapPE和/或HA2亚单位的脂质体的免疫原性
每隔4周，用EYPC脂质体制剂(750ug)，或含HA2(3.7ug)、DNP-CapPE(30ug)的EYPC脂质体制剂，或者两者(表1)对远系繁殖的数组小鼠进行注射。用间接的ELISA法分析IgG和Ig反应，并以抗体滴定度的平均数表示分析结果。类脂对DNP和HA2的摩尔比是6000∶2001。ELISA读数表明，包含DNP-CapPE(无论带有或不带有HA2)的两种制剂产生7个小鼠的7次IgM反应。但是，当滴定抗DNP的IgM血清抗体时，在脂质体DNP组的数值急剧下降，给出的滴定度类似于对照组，而用DNP/HA2脂质体免疫的小鼠有效地诱发出较高水平的血清专门抗DNPIgG。
表I
  脂质体组分   IgG滴定度  反应比  IgG滴定度    反应比
PBS 210±55 3/7 119±21 3/7
脂质体空白   313±145   3/7  290±85     3/7
    HA2   205±65   3/7  384±190     3/7
    DNP   188±73   3/7  1312±791     7/7
DNP-CapPE/HA2  1974±925   3/7  1490±506     7/7
在各类免疫球蛋白中的这种偏移仅仅归于在同样脂质体结构中HA2和DNP的缔合，因为当用水溶液形式的HA2和DNP-CapPE混合物或用DNP-CapPE脂质体和HA2一起注射时，没有IgG抗DNP产生(表2)。为了刺激IgG抗DNP抗体的产生，在同样的脂质体中两组分必须同时采用。
               表2
    脂质体组分DNP-CapPE HA2      IgG滴定度    反应比      IgG滴定度    反应比
    10μg  1μg      333±143     6/6      344±134      5/6
    10μg  3μg      391±124     6/6      300±165      6/6
10μg  9μg 766±298 6/6 336±117 6/6
    30μg  1μg      358±165     6/6      364±145      5/6
    30μg  3μg     1241±336     6/6      396±119      6/6
    30μg  9μg     2100±1127     6/6     1038±445      6/6
    10μgDNP-BSA10μgDNP-CapPE和HA2的水溶液10μg*+1μg*+3μg*+9μg*     2245±8980000     6/60/60/60/60/6         0155±63******      0/62/6
*DNP-CapPE和HA2被掺入分离的脂质体中并且一起掺入。**实验未进行。
例6对脂质体的DNP和HA2的剂量反应
在这个试验中，研究了三个免疫组。对一给定量的DNP-CapPE(每次注射5，10，30ug)，改变HA2的量(1，3或9ug)，并把它掺入到由EYPC(750ug/注射)组成的脂质体制剂中。在相同的加强接种前一天和接种后9天抽取动物的血。用ELISA法分析血清中的抗DNP的IgG和IgM。此外，或者用10ug的DNP-BSA或用DNP-CapPE和HA2的混合水溶液对两组小鼠进行免疫接种。
当统计分析IgM的ELISA值(表2)时，代表5和10ug DNP的两组没有表明随着HA2量的增加有显著差异，因而，表中没有示出5ug DNP-CapPE组的结果。但是，当用含有30ug DNP-CapPE和1，3或9ugHA2的脂质体对小鼠进行免疫接种时，观察到明显的差异，较高的比给出较高的IgM滴定度。当用10ug DNP-BSA免疫小鼠时，没有观察到IgM反应，而用DNP-CapPE和HA2的水溶液免疫时，该组6个小鼠中仅有2个有IgM反应。
在统计分析IgG的ELISA数值(表2)时，对一给定的HA2的量(1，3或9ug)，增加DNP-CapPE(5，10或30ug)的量，反应表现出显著的差异，该差异可确定对DNP和HA2两者的剂量反应效应。这再次表明IgG产量的提高是由于在同样的脂质体中同时存在靶抗原和辅助肽。用DNP-CapPE免疫的小鼠所给出的IgG反应比得上用所试验的脂质体中最高剂量HA2和DNP免疫的那组的IgG反应。对用DNP/HA2水溶液免疫的小鼠末检测到IgG反应。
例7第三次注射DNP-CapPE脂质体对以前用DNP/HA2脂质体免疫过的小鼠的抗体的影响
为了测定在以前用DNP-CapPE/HA2脂质体免疫过的小鼠对DNP靶抗原记忆反应是否出现，用仅含DNP-CapPE(这样仅产生B细胞部位)的脂质体第三次注射一组7个小鼠。这个试验表明，仅当DNP-CapPE和HA2一起存在于起始脂质体制剂中时记忆反应才会产生。它还表明，本发明产生一个对靶抗原的真正的胸腺相关免疫反应和一个对靶抗原的免疫记忆，该免疫记忆不再需要T细胞识别部位的存在就可产生相应于该靶抗原的IgG抗体。
如前面所示，用DNP-CapPE/HA2脂质体免疫过的小鼠产生一IgG抗DNP反应，当用仅含DNP-CapPE的脂质体第三次注射这些同样的小鼠(组1)时，SPIRA读数与第一或第二次放血相比急剧增加，表明特异B细胞再刺激处于比用第一次免疫产生的刺激高的水平。用HA2脂质体免疫，然后用DNP-CapPE脂质体再刺激的小鼠(组3)不产生任何可测出的抗DNP的IgG抗体滴定度。曾用DNP-CapPE脂质体注射过的小鼠(组2)给出关于初次免疫的抗DNP的IgG抗体的水平。用空白EYPC脂质体注射的对照组(组4)表明没有抗DNP的IgG抗体产生。
                    表3
 组# 第#次取血    滴定度 反应比
  1234     1231300   1974±975817±2704071±1058158±28288±75………………  7/77/77/77/73/700
例8在免疫反应中外部膜HA2与内部HA2的比较
用由30ug的DNP-CapPE和不同量的HA2(3，1，0.5和0ug)组成的EYPC脂质体对四组远系繁殖的小鼠进行免疫，另外在用菠萝蛋白酶(100ug/ml)对脂质体进行预先处理以后用DNP-CapPE/HA2对一组小鼠进行免疫。用菠萝蛋白酶切开表面蛋白，仅仅留下插入尾的膜和完整的内在化的HA2。在统计分析ELISA滴定度时，随着HA2量的增加，再一次观测到剂量反应效应，见表4。每次向DNP-CapPE脂质体中注射如同0.5ug HA2那样小的量就足以诱导出一个与DNP-CapPE脂质体相比统计差别足够显著的IgG反应。然而，与从相同的未处理的脂质体得到的反应相比，当用菠萝蛋白酶处理过的脂质体免疫小鼠时，没有观测到统计上差别。这些结果表明HA2以外的脂质体是不需要的，同时为了实现B细胞和T细胞抗原决定部位在免疫活性的表现，必须对脂质体进行处理。
表4
        脂质体组分          IgG
组#    DNP-CapPE    HA2   滴定度    反应比
 12345     30μg      3μg30μg      1μg30μg     0.5μg30μg       0菠萝蛋白酶处理脂质体后的组1  944±291    7/7471±97     7/7438±121    7/7198±88     2/7808±315    7/7
例9在免疫反应中IgG免疫球蛋白亚类的再分
对ELISA读数进行的分析表明，IgG1抗体是主要的亚类。
对低剂量的DNP-CapPE(表1)而言，远系繁殖的小鼠对DNP的IgG1反应在不同的HA2浓度上是相似的。对较高浓度的DNP-CapPE(30ug)，随着HA2量的增加，观测到剂量反应效应。EYPC、DNP-CapPE和HA2含量分别为750、30和9ug的脂质体制剂给出一个与用10ug的DNP-CapPE(一个典型的半抗原系统)免疫的小鼠组相当的IgG1反应。
没有发现采用IgG2a和IgG2b抗体亚类有明显的差别(表5)。没有检测到IgG2a和IgG2b抗体的唯一的一组是用含1ug HA2、10ugDNP-CapPE(IgG2a和IgG2b)、3ugHA2和10ugDNP-CapPE脂质体(IgG2)免疫的小鼠的那些组。对较高剂量的DNP-CapPE或HA2，反应没有表现出明显的差异。反应与用DNP-BSA免疫的小鼠的反应相当。
用IgG3抗体亚类时没有观测到明显的差别。对每一组，检测其滴定度，免疫后的6个小鼠中至少有4个出现响应(表5)。不过，只有两个用10ug DNP-BSA免疫的小鼠所出现的反应使滴定度提高得显著低于用脂质体制剂免疫的小鼠组。
表5
      脂质体组分DNP-CapPE   HA2       IgG1反应比    滴定度        IgG2a反应比      滴定度
    10μg    1μg10μg    3μg10μg    9μg30μg    1μg30μg    3μg30μg    9μg10μg DNP-BSA10μg DNP-CapPE和3μgHA2的水剂  3/6     180±704/6     222±796/6     255±524/6     275±1026/6     370±1866/6     803±4026/6     941±5780/6  0/64/6       190±506/6       241±784/6       326±926/6       366±1266/6       371±776/6       258±850/6
     脂质体组分DNP-CapPE   HA2        IgG2b反应比    滴定度       IgG3反应比    滴定度
  10μg    1μg10μg    3μg10μg    9μg30μg    1μg30μg    3μg30μg    9μg10μg DNP-BSA10μg DNP-CapPE和3μgHA2的水剂     0/6    180±700/65/6    308±212/6    223±1045/6    250±1416/6    275±915/6    302±980/6  4/6      177±204/6      217±935/6      280±965/6      280±1056/6      333±1106/6      376±712/6      190±280/6
现已充分地描述了本发明，对于本领域普通技术人员来说很明显，对上述内容可以进行变化和改进，而不违反本发明所述的精神和范围。

Claims (2)

1.制备脂质体免疫原的方法，其特征在于：包括将DNP—CapPE抗原、脂质体和流行性感冒病毒的血球凝集素HA2多肽亚单位结合的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述脂质体为磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、甘油脂、脑苷脂、胆固醇或其混合物。
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