CN116082496A - 靶向STAT3蛋白Ser701磷酸化的抗原肽、抗体及其应用 - Google Patents

靶向STAT3蛋白Ser701磷酸化的抗原肽、抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本申请公开了靶向STAT3蛋白Ser701磷酸化的抗原肽及其应用。该抗原肽具有与SEQ ID NO.1～4所示的氨基酸序列、或与该序列具有相同功能的同源序列。应用该抗原肽制备的抗体能检测出细胞和组织中的STAT3蛋白Ser701磷酸化水平，有助于研究STAT3蛋白Ser701磷酸化的分子机制和生物学功能；为研究STAT3在细胞周期进展、自噬、凋亡、代谢、炎症、侵袭和血管生成等细胞信号通路中的作用提供帮助。本申请中提供了一种STAT3蛋白Ser701磷酸化抗体的制备方法，该方法操作简单，通过此方法制得的抗体特异性强、纯度高、稳定性好。

Description

靶向STAT3蛋白Ser701磷酸化的抗原肽、抗体及其应用
技术领域
本申请属于STAT3蛋白磷酸化检测技术领域，本申请公开了靶向STAT3蛋白Ser701磷酸化的抗原肽及其应用，具体而言涉及能够将肽作为抗原，制备靶向识别STAT3蛋白Ser701磷酸化的抗体及其作为检测STAT3蛋白Ser701磷酸化水平的应用。
背景技术
信号传导及转录激活蛋白(signal transducer and activator oftranscription，STAT)是一种具有DNA结合活性的蛋白，包括STAT1～6，其中，STAT3蛋白是STAT家族中最重要的成员之一，作为一个显著的核转录因子，其与超过1000个基因产物的表达有关。
STAT3蛋白在结构上可分为以下几个功能区段：N-末端结构域、DNA结合域、卷曲螺旋结构域、SH2结构域、C-末端转录激活结构域，其中SH2结构域是最保守也是对其功能最重要的区段。通过位于SH2和C端的转录激活结构域之间的保守Tyr705残基的磷酸化，从而介导2个STAT3分子之间的相互作用，形成同源二聚体。
蛋白质翻译后修饰对STAT3蛋白的活性调控至关重要，而磷酸化修饰为最主要的一种。STAT3 Tyr705位点磷酸化可被多种细胞因子和生长因子激活，包括利用IL-6信号转导受体链gp130(如白介素-6、抗癌素M、白介素-11)或同二聚体细胞因子受体(如粒细胞集落刺激因子，G-CSF)，以及通过蛋白酪氨酸激酶受体(如表皮生长因子，EGF)起作用。细胞因子与受体结合后，激活受体复合物上的特定位点酪氨酸残基磷酸化，STAT3蛋白的SH2结构域与特异性受体磷酸酪氨酸序列相互作用，将STAT3蛋白招募到受体信号复合物中，使STAT3蛋白的Tyr705残基磷酸化并从细胞膜上脱落。Tyr705磷酸化的STAT3在细胞质内形成具有DNA结合活性的同源二聚体，可以转移至细胞核内，与靶基因启动子序列的特定位点结合，参与靶基因的转录调控。此外，Ser727位点发生磷酸化可使STAT3转位至线粒体，能够进入线粒体与mtDNA结合调节基因转录表达，并且能增加缺血损伤下电子传递链复合酶活性，降低ROS的产生，增加ATP的生成，减少组织损伤。
发明内容
本申请发明人通过对STAT3蛋白结构进行深入研究，发现其第701位氨基酸Ser存在发生磷酸化的可能，而该位置若发生磷酸化可能对STAT3蛋白的经典信号通路激活产生影响。因此，发掘有效检测STAT3蛋白第701位丝氨酸磷酸化的相关技术和方法，对探索STAT3 Ser701磷酸化在细胞内的机制以及在动物体和人体内的生物学功能及相关药物开发等方面具有积极意义。为此，本申请实施例至少公开了以下技术方案：
第一方面，本申请实施例公开了一种抗原肽，所述抗原肽是模拟STAT3蛋白Ser701磷酸化的肽或其功能片段。该肽或其功能片段能够在体内产生免疫应答，进而产生一种能够特异性结合STAT3第701位丝氨酸磷酸化的抗体，从而利用该抗体能够有效检测细胞中STAT3蛋白的Ser701位点磷酸化水平，可以间接探究细胞生长、增殖、代谢、炎症等生物学过程。
所述抗原肽具有靶向STAT3蛋白的Ser701磷酸化位点的免疫原性，其中，所述抗原肽为(I)～(IV)中的至少一项：
(I).SEQ ID NO.1～4所示的氨基酸序列；
(II).与(I)所述序列至少有75％相似性的氨基酸序列；
(III).具有与(I)或(II)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸序列获得的氨基酸序列，且与(I)或(II)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；
(IV).(I)、(II)或(III)所述肽或在其氨基酸序列中的部分或全部氨基酸残基处被修饰。
第二方面，一种抗原构建体，所述抗原构建体包含第一方面的抗原肽及用于负载或偶联所述第一方面的抗原肽的载体。
第三方面，本申请实施例还公开了第一方面所述的抗原肽及第二方面所述的抗原构建体的应用，所述应用包括如下至少一项：
(1)制备STAT3蛋白的Ser701磷酸化特异性抗体；
(2)制备STAT3蛋白的Ser701磷酸化相关疾病的疫苗；
(3)免疫激活剂。
第四方面，本申请实施例公开了一种抗体，所述抗体与第一方面限定的抗原肽、或与第二方面所述的构建体进行免疫反应。
第五方面，本申请实施例公开了第四方面所述抗体的制备方法，包括将第一方面所述的抗原肽与第二方面所述的构建体进行动物免疫，收集抗血清和纯化的步骤。
第六方面，本申请实施例公开了一种ELISA试剂盒，所述ELISA试剂盒包括第四方面所述的抗体，所述ELISA试剂盒用于检测STAT3蛋白Ser701位点的磷酸化水平。
第七方面，本申请实施例公开了一种药物组合物，包括第四方面或所述的抗体或第五方面所述的制备方法得到的抗体，以及药学上可接受的辅料或者载体。
与现有技术相比，本申请至少具有以下有益效果之一：
本申请提供一种靶向STAT3蛋白Ser701磷酸化的抗原肽以及由此制得的抗体，有助于研究STAT3在细胞周期进展、自噬、凋亡、代谢、炎症、侵袭和血管生成等细胞信号通路中的作用，以及STAT3在肿瘤、代谢性疾病、炎症性肠病、心血管疾病等多种疾病中的作用机理,为临床疾病的治疗提供潜在的作用靶点；可将STAT3蛋白Ser701位点磷酸化抗体运用于肿瘤的预后判定中。
附图说明
图1为本申请实施例提供的STAT3蛋白Ser701位点磷酸化质谱鉴定图。
图2为本申请实施例提供的磷酸化(上图)抗原肽和非磷酸化(下图)抗原肽HPLC纯度测定结果图。
图3为本申请实施例提供的不同STAT3蛋白突变体的表达质粒电泳图(a)、测序比对图(b)以及自制抗体用于检测细胞内的STAT3蛋白本底和IL-6刺激时的Ser701位点磷酸化信号的WesternBlot检测图(c)；
图3a中，从左至右的泳道依次为Marker、pCDNA3.1-GFP、pCDNA3.1-GFP-STAT3-FL和pCDNA3.1-GFP-STAT3-S701A；图3b中为pCDNA3.1-GFP-STAT3-FL和pCDNA3.1-GFP-STAT3-S701A的测序比对结果图；图3c中，竖向排列的泳道1、2、3均为pCDNA3.1-GFP-STAT3-FL转染Hela细胞所得细胞裂解液作为样品的WesternBlot检测结果，泳道4所示均为pCDNA3.1-GFP-STAT3-S701A转染Hela细胞所得细胞裂解液作为样品的WesternBlot检测结果。
图4为本申请实施例提供的自制抗体用于检测小鼠结肠组织中的STAT3蛋白Ser701位点磷酸化信号的WesternBlot检测图。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。本申请中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。
本申请发明人在研究STAT3相关的信号通路及其生物学功能时，关注了STAT3蛋白第701位的丝氨酸，丝氨酸具有羟基基团，可以和磷酸基团脱水生成磷酸酯，即可以发生磷酸化，磷酸化可以改变氨基酸的空间位阻、电荷、稳定性，从而控制蛋白质的活性、定位、稳定性和互作。现有技术中对STAT3蛋白三维结构解析已获得包括Tyr705在内的STAT3大体结构，然而Ser701所处位置的结构仍无法解析，提示该部位的结构具有不稳定性或者灵活性，可能具有调控功能。由于STAT3第701位丝氨酸的性质及结构的灵活性，提示其具有磷酸化的可能。
为此，本申请发明人进行了如下试验：
将Hela细胞接种至10cm2细胞培养皿内，培养于含10％胎牛血清的DMEM培养基中，在5％的CO2培养箱中生长至细胞密度为60％～70％左右时，取STAT3表达载体pCDNA3.1-Flag-STAT3-FL(参见“PCDNA3.1-GFP-LC3B真核表达载体的构建[J]安徽农业科学,2015第6期.”所示方法构建得到)按常规脂质体转染法转染Hela细胞，转染24小时后，使用胰蛋白酶消化收集细胞。使用RIPA裂解液裂解细胞后，使用偶联有Flag抗体的琼脂糖凝胶微球(金斯瑞生物科技，Cat.L00432)进行免疫沉淀，获得纯化的STAT3蛋白。将纯化产物进行SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色，切下目的蛋白条带，将切下的凝胶进行生物质谱检测。如图1所示的质谱结果显示，人类的STAT3蛋白的第701位的丝氨酸可以发生磷酸化。
由此，STAT3的Ser701确实可以发生磷酸化，STAT3的Ser701的磷酸化是否会对经典信号通路活化位点Tyr705/Ser727产生影响，具体如何影响等对于填补STAT3当前研究的空白领域、STAT3的信号通路转导及生物学功能意义非凡。作为STAT3全新的磷酸化位点，目前国内外市场上缺乏可用于研究Ser701磷酸化的STAT3抗体,因而无法开展相关研究与应用。因此有必要研发出一种STAT3蛋白的Ser701磷酸化抗体，来探索STAT3 Ser701磷酸化在细胞内的机制以及在动物体和人体内的生物学功能及相关药物开发等。
抗原肽
为此，本申请实施例公开了一种抗原肽，所述抗原肽具有靶向STAT3蛋白的Ser701磷酸化位点的免疫原性，其中，所述抗原肽(I)～(IV)中的至少一项：
(I).SEQ ID NO.1～4所示的氨基酸序列；
(II).与(I)所述序列至少有75％相似性的氨基酸序列；
(III).具有与(I)或(II)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸序列获得的氨基酸序列，且与(I)或(II)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；
(IV).(I)、(II)或(III)所述抗原肽或在其氨基酸序列中的部分或全部氨基酸残基处被修饰。
本文中使用的术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换，且定义为意指由通过肽键连接的氨基酸组成的生物分子。
术语“肽”是氨基酸(通常是L-氨基酸)的链，该氨基酸的α碳通过肽键连接，该肽键由一个氨基酸的α碳的羧基与另一氨基酸的α碳的氨基之间的缩合反应形成。链一端(即氨基端)的末端氨基酸具有自由氨基，而链另一端(即羧基端)的末端氨基酸具有自由羧基。因此，术语“氨基端”(缩写为N端)指肽的氨基酸端氨基酸上的自由α氨基，或指肽内任意其他位置上的氨基酸的α氨基(参与肽键时为亚氨基)。类似地，术语“羧基端”(缩写为C端)指肽的羧基端氨基酸上的自由羧基，或指肽内任意其他位置上的氨基酸的羧基。
本申请中，“其氨基酸序列中的部分或全部氨基酸残基处被修饰”，此类修饰的肽可以通过本领域中已知的任何方法来制备。例如，修饰的肽可以通过构成该肽的氨基酸残基的侧链的官能团的修饰来制备，所述修饰诸如酯化、烷基化、卤化、磷酸化、磺化或酰胺化。而且，多种物质可以与肽在N-和/或C-末端结合。例如，氨基酸、肽或其类似物可以与肽结合。当此物质与上述的“(I)、(II)或(III)所述抗原肽”结合时，可以通过任何方法，例如通过体内酶促反应或通过细胞内加工，来除去该物质，如此最终产生抗原肽。此种“修饰”的目的可以为调节肽的溶解度；改善肽的稳定性，诸如蛋白酶抗性；将肽递送至特定的组织或器官；或增加抗原呈递细胞对肽的摄取。例如，此种“修饰”的目的还可以是提高抗原肽的免疫原性，促进抗原肽与STAT3蛋白Ser701磷酸化表位的特异性结合。
本文中使用的术语“功能相同或相似的氨基酸序列”或“功能片段”指具有与本文中定义的肽(例如，分别如SEQ ID NO.1～4中所示)基本上相同的(生物)活性的功能肽片段，即该片段仍能够在生物中，但尤其是在动物，尤其是哺乳动物或人内引起高特异性免疫应答(即具有免疫原活性)，以产生能够特异性识别和结合STAT3蛋白Ser701磷酸化表位的抗体。
本文中用术语“残基”来指通过酰胺键掺入肽中的氨基酸。因此，氨基酸可以是天然存在的氨基酸，或者，除非另有限制，可以包含以类似于天然存在的氢基酸的方式发挥作用的天然氨基酸的已知类似物(即氨基酸类似物)。
为了保持STAT3蛋白Ser701磷酸化表位的免疫原性，可以修饰(添加、缺失和/或取代)少数(例如，1个、2个或数个)或小百分比的氨基酸。这里，术语“数个”意指7个以下的氨基酸，如6个或5个以下。要被修饰的氨基酸的百分比优选为20％以下，更优选15％以下，更优选10％以下，进一步更优选或1-5％。
本领域技术人员应当理解的是，改变氨基酸序列中的单个氨基酸或少数百分比氨基酸的个别添加、缺失或取代会导致原始氨基酸侧链的特性得以保留。因此其被称作“保守替代”或“保守修饰”，该改变意指用化学上相似的氨基酸取代氨基酸，其中对蛋白质的改变导致具有类似的功能的蛋白质。提供功能上相似的氨基酸的保守性取代表为本领域公知。以下1)～8)项各自包含互为保守性取代的氨基酸：
1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；
2)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；
3)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
4)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
5)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
6)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；
7)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；和
8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)。
此类保守修饰肽也被视为本发明的肽。然而，本发明的肽不限于此，可包括非保守修饰，只要该肽保留原始肽的STAT3蛋白Ser701位点磷酸化的免疫原性。
在本申请的某些实施例中，所述抗原肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1～4所示，如表1所示。表1中还示出了用以对比试验的对照肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.5～8所示。表1中，“p-”表示该位点的氨基酸残基被磷酸化，“-NH2”表示该位点的氨基酸残基被酰胺化。
表1
抗原肽 序列信息
磷酸化肽1 <![CDATA[CPEADPG(p-S)AAPYL-NH<sub>2</sub>，如SEQ ID NO.1所示]]>
磷酸化肽2 CEHPEADPG(p-S)AAPY，如SEQ ID NO.2所示
磷酸化肽3 <![CDATA[HPEADPG(p-S)AAPYLKT-NH<sub>2</sub>，如SEQ ID NO.3所示]]>
磷酸化肽4 CHPEADPG(p-S)AAPYLK，如SEQ ID NO.4所示
对照肽1 <![CDATA[CPEADPGSAAPYL-NH<sub>2</sub>，如SEQ ID NO.5所示]]>
对照肽2 CEHPEADPGSAAPY，如SEQ ID NO.6所示
对照肽3 <![CDATA[HPEADPGSAAPYLKT-NH<sub>2</sub>，如SEQ ID NO.7所示]]>
对照肽4 CHPEADPGSAAPYLK，如SEQ ID NO.8所示
另外一方面，本申请实施例公开了一种抗原构建体，所述抗原构建体包含第一方面的抗原肽及用于负载或偶联所述第一方面的抗原肽的载体。该载体尤其是还具有作为产生超分子抗原构建体的佐剂的功能性的载体。在某些实施例中，通过附着在例如脂质体上或重构在例如脂质体中来修饰根据第一方面的抗原肽，以产生WO公开WO2005/081872中所述的“超分子抗原构建体”，该WO公开的描述在此以其整体引入作为参考。如此得到的“超分子抗原构建体”使得其表面上显示独特的抗原肽呈递，该呈递导致增强的抗原暴露，并最终导致显示高构象敏感度的抗体的产生。具体而言，通过与便于插入脂质体载体/免疫佐剂的脂双层的亲脂或疏水部分结合来修饰根据本申请的抗原肽或其功能片段，尤其是通过作为肽在脂质体双层中的锚发挥作用，且具有导致肽靠近脂质体表面定位和稳定化的尺寸的亲脂或疏水部分。
在一些实施例中，亲脂或疏水部分是脂肪酸、甘油三酯或磷脂，尤其是含有C12和C24之间的碳链的脂肪酸、甘油三酯或磷脂，但尤其是棕榈酸。
在一些实施例中，通过至少两分子棕榈酸与该抗原肽的N端和C端末端共价结合和通过在脂质体载体中重构来对本申请的抗原肽进行修饰。
在一些实施例中，缀合物中的肽各与四分子棕榈酸偶联；因此它们是四棕榈酰化的。
在一些实施例中，两分子棕榈酸与抗原肽的N端末端偶联，两分子棕榈酸与肽或片段的C端末端偶联。
在一些实施例中，本申请提供的抗原肽，其通过与亲脂或疏水部分，例如棕榈酸结合来修饰并重构在脂质体中，其中该脂质体制剂可以还包含产生超分子抗原构建体的佐剂，例如脂质A、明矾、磷酸钙、白细胞介素1和/或多糖和蛋白质的微囊，尤其是去毒脂质A，如单磷酰或二磷酰脂质A，或明矾。
在本申请的一个实施例中，本申请涉及的超分子构建体，其每个载体分子包含本申请中所述的一个或多个抗原肽，尤其是两个或多个抗原肽。
在本申请的一个实施例中，该载体分子是脂质体。
在一些实施例中，本申请涉及的超分子构建体和如本文中所述的超分子构建体，其每个载体分子包含两个或多个SEQIDNO.1～4其中之一所示的抗原肽的组合。
在本申请的“超分子抗原构建体”中，脂质体可以具有双重功能，其可以用作包含之前本文中所述的超分子构建体的载体，同时作为佐剂发挥作用来在待用本申请的治疗性疫苗治疗的靶动物或人内增加或刺激免疫应答。还应理解，本申请的超分子抗原构建体组合物可以进一步包含其他佐剂，其包括但不限于匙孔槭血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、鸡卵白蛋白(OVA)、牛甲状腺球蛋白(THY)和其他佐剂，例如脂质A、明矾、磷酸钙、白细胞介素1，和/或多糖和蛋白质的微囊，但尤其是去毒脂质A，如单磷酰或二磷酰脂质A，或明矾；其他防腐剂；稀释剂；乳化剂；稳定剂；和已知并用于现有技术的疫苗中的其他成分。此外，可以将本领域已知的任意佐剂系统用于本申请的组合物中。这类佐剂包括但不限于弗氏不完全佐剂；弗氏完全佐剂；多分散β-(1,4)连接乙酰化甘露聚糖；聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物佐剂；修饰的脂质佐剂；皂苷衍生物佐剂；灭活百日咳毒素；血蓝蛋白；B群脑膜炎球菌外膜蛋白；绿脓杆菌外毒素A；霍乱毒素B亚单位；细菌外膜蛋白；大肠杆菌热敏感肠毒素；肺炎球菌溶血素；淋球菌菌毛蛋白；革兰氏阴性菌的脂多糖(LPS)；大的聚合阴离子，如硫酸葡聚糖；和无机凝胶，如明矾、氢氧化铝或磷酸铝。
在本申请的某些实施例中，可根据化学领域中通常所用的合成方法和/或生物合成第一方面所述的肽。
本文中术语“分离的”指实质上或本质上游离于见于它的天然状态中的正常伴随它的成分的物质。因此，本文中所述的肽不包含正常情况下与它们的原位环境结合的物质。通常，通过银染凝胶上的条带强度测量，本文中所述的分离的免疫原肽至少约HPLC 90％(纯)。
可以通过本领域公知的许多方法来显示蛋白质纯度或同质性，如蛋白质样品的聚丙烯酰胺凝胶电泳后通过染色显示。为了某些目的，将需要高分辨率，利用HPLC或类似的手段进行纯化。
当免疫原肽的长度相对短(即少于约50个氨基酸)时，通常用标准的化学肽合成技术合成它们。例如，采用本领域技术人员熟知的固相合成方法，固相合成是用于化学合成本文中所述的免疫原肽的优选方法，其中将序列的C端氨基酸与不可溶支持物连接，然后连续添加序列中的其余氨基酸。
例如，在一个实施例中，参照“基于FmOc策略的O-磷酸化多肽化学合成研究[J]高等学校化学学报,第2001年第s1期”提供的经典的Fmoc固相合成方法，以亚磷酰胺为磷酸化试剂，以单体磷酸化法合成了具有如SEQ ID NO.1～8所示的氨基酸序列中的磷酸化氨基酸酸，并且参照“L-脯氨酰胺的合成新工艺[J]山东工业技术,第2016年,第9期”合成其中碳端的酰胺化氨基酸酸，再以Fmoc固相合成方法依次合成如SEQ ID NO.1～8所示的氨基酸序列的多肽，经过纯化的了HPLC纯度均大于90％的冻干品(结果如图2)。
备选地，可以采用本领域技术人员熟知的重组表达的生物合成方法与化学修饰相结合的方法得到本文中所述的抗原肽或其功能片段。一般而言，这涉及产生编码肽的核酸序列，将核酸在特定启动子控制下放置在表达盒中，在宿主中表达肽，分离所表达的肽，并根据需要复性肽。足以指导技术人员完成这类方法的技术见于文献中。本领域熟知地，通过宿主表达的免疫原肽，即可以按照包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析、凝胶电泳等的标准方法纯化重组肽。对于用作治疗剂，优选约50％至95％同质性，且最优选80％至95％或更大同质性的基本上纯的组合物。
抗体
另外一方面，本申请实施例还公开了一种抗体，其与上述实施例公开的抗原肽可以进行特异性的免疫反应。具体的，该抗体可以通过将抗原肽、或者抗原构建体作为抗原注射体内，引起免疫应答而制得。
在一些实施例中，该抗体的制备包括如下过程：
1、抗原的制备
本实施例中，将如表1所示的磷酸化肽1～4分别与血蓝蛋白(keyhole limpethemocyamin,简称KLH)偶联(偶联剂为Sulfo-SMCC)作为免疫抗原。磷酸化肽1～4及对照肽分别与牛血清白蛋白(BSA)偶联(偶联剂为戊二醛)作为检测抗原；偶联方法参照“合成环瓜氨酸化蛋白短肽的免疫原性和致关节炎性研究[J]中国免疫学杂志，2017，第1期”。制备的抗原用磷酸缓冲盐溶液(PBS)将免疫抗原分别稀释为1mg/mL，分装冻存于-20℃冰箱。
2、动物免疫
分别在第1、15、29、43天，每种免疫抗原取1ml加入1ml福氏完全佐剂，乳化(检验乳化程度：将一滴乳化抗原液滴入生理盐水中，若不散开，表明已达到要求)，颈背部皮下多点(至少8点)免疫，每种抗原免疫2只新西兰白兔(江苏艾菱菲)。第53天时，颈动脉采血，大量收集抗血清。兔血在4℃冰箱静置过夜，次日无菌操作，将兔血分装进50ml离心管内，4℃，10000rpm/min，离心30分钟，收集上清，即为免疫后抗血清，贮存于-20℃。
3、抗体纯化
(1)使用SEQIDNO.1～4所示磷酸化肽1～4分别制备亲和纯化柱，亲和纯化磷酸化特异性抗体。多肽连接到活化的Sulfolink Resin(货号20401，Thermo FisherScientific)上，制备抗原亲和柱，1ml Sulfolink Resin偶联1mg多肽。
(2)使用10倍柱体积PBS平衡亲和柱，流尽溶液；兔血清经0.45um滤膜过滤。
(3)血清过抗原亲和柱，流尽溶液，收集流穿。
(4)10倍柱体积PBS平衡，流尽溶液。
(5)加入5ml抗体洗脱液，分管收集洗脱液，每管1ml。
(6)收集的洗脱液检测280nm处的吸光度，吸光度大于1.0的组分合并，对PBS透析。
4、透析后的抗体鉴定
采用紫外吸收法检测蛋白浓度，通过酶联免疫吸附法检测抗体效价。供试品为上述SEQ ID NO.1～4所示的磷酸化肽1～肽4分别制得的抗原免疫新西兰白兔后，经过上述纯化步骤的抗体，将抗体用包被稀释液稀释成1:1250、1:2500、1:5000、1:10000、1:20000、1:40000和1:80000的比例，按照下述如(1)～(6)所述的步骤进行。
(1)包被：将包被抗原用包被缓冲液稀释为1ug/ml，加入酶标板中，每孔100ul，4℃孵育过夜。
(2)封闭：将包被液弃去，每孔加入200ul封闭液(5％脱脂奶粉)，37℃静置孵育1.5小时。
(3)加入待测样品：弃去封闭液，加入样品(血清或者抗体)，每孔100ul加入酶标板，37℃静置孵育1小时；用洗涤缓冲液冲洗10次，拍干孔内液体。
(4)二抗孵育：酶标羊抗兔二抗用封闭液稀释至工作浓度，每孔100ul加入酶标板，37℃静置孵育30分钟；用洗涤缓冲液冲洗10次，拍干孔内液体。
(5)显色：加入TMB显色底物：每孔100ul加入酶标板，37℃静置15分钟。
(6)终止及读数：每孔加入50ul 2M H2SO4终止反应，使用酶标仪OD450nm读取数值。
5、结果
分别对利用SEQ ID NO.1～8所示的肽偶联牛血清白蛋白制备的检测抗原来检测生成的抗体效价，结果如表2所示，其中Ag-1～4为使用SEQ ID NO.1～4所示的磷酸化肽偶联BSA制备的检测抗原，Ag-control-1～4为使用SEQ ID NO.5～8所示的对照肽分别与BSA偶联制备的检测抗原。Ab-1～4为使用SEQ ID NO.1～4所示的磷酸化肽1～4偶联血蓝蛋白，经动物免疫、抗体纯化等步骤获得的磷酸化抗体。结果显示STAT3蛋白的Ser701磷酸化特异性抗体针对磷酸化多肽的ELISA效价大于1：80000。
表2OD450nm值
Figure BDA0003818577990000111
应用
为此，本申请实施例实质上还公开了第一方面所述的抗原肽、第二方面的抗原构建体的应用。所述应用包括如下至少一项：
(1)制备STAT3蛋白的Ser701磷酸化特异性抗体；
(2)制备STAT3蛋白的Ser701磷酸化相关疾病的药物；
(3)用作免疫激活剂。
另外，为检测一些细胞、组织或有机体的STAT3蛋白Ser701磷酸化水平，本申请实施例还公开了一种试剂盒，用于检测STAT3蛋白Ser701位点磷酸化水平，所述试剂盒包括上述实施例公开的抗体。通过该抗体靶向识别细胞、组织或有机体的STAT3蛋白Ser701位点，制备成免疫印迹试剂盒或ELISA试剂盒以实现检测。
在本申请的一些实施例中，该检测试剂盒包含包被有STAT3蛋白的Ser701磷酸化抗体的酶标板、洗涤缓冲液、封闭液、包被缓冲液、酶标抗体、TMB显色液、终止液。
在一个实施例中，本申请检测STAT3蛋白Ser701磷酸化的ELISA检测试剂盒具体包括以下组分：
上述实施例提供的STAT3蛋白Ser701磷酸化抗体；
酶标抗体；
洗涤缓冲液：PBST缓冲液：1000mL 0.01mol/L PBS+0.5m L Tween-20；
封闭液：含有5％脱脂奶粉PBS缓冲液；
包被缓冲液：包含0.015M Na2CO3和0.035M NaHCO3，pH 9.6；
TMB母液：为10mg TMB充分溶于5m L无水乙醇；
TMB显色液：包含0.5mL TMB母液、10mL底物缓冲液和2.1μL 30％质量百分比的H2O2水溶液，使用时新鲜配制；以及
终止液：2M的H2SO4。
上述试剂盒可以用于识别STAT3蛋白Ser701磷酸化，例如使用Elisa方法检测第701位的Ser磷酸化STAT3蛋白或者其肽段。在一个实施例中，该检测试剂盒的制备方法还包括将STAT3蛋白Ser701磷酸化抗体包被酶标板的步骤。
在一个实施例中，利用上述制得的抗体对STAT3蛋白Ser701位点的磷酸化检测步骤包括：
(1)构建表达载体
参见“PCDNA3.1-GFP-LC3B真核表达载体的构建[J]安徽农业科学,2015第6期.”所示方法，分别构建含STAT3蛋白表达载体pCDNA3.1-GFP-STAT3-FL和Ser701去磷酸化的STAT3蛋白表达载体pCDNA3.1-GFP-STAT3-S701A。这些表达质粒的琼脂糖凝胶电泳及测序结果分别如图3a和图3b所示。
(2)构建真核表达细胞
将人源Hela细胞(ATCC细胞库)接种至六孔板内，培养于含10％胎牛血清的DMEM培养基，并置于5％的CO2培养箱中培养；当细胞生长至密度为60～70％左右时，取上述两种载体按常规脂质体转染法分别转染Hela细胞；转染24小时后,不使用或使用浓度为10ng/ml的IL-6刺激30min后，收集细胞，即为分别过表达STAT3 FL型和Ser701A突变体的细胞。
(3)免疫印迹检测
收集上述各种细胞液，使用500μl加入蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液(碧云天生物技术，Cat.P0013C)裂解细胞，按照PPase(New England Biolabs，NEB，Cat.P0753S)说明书所示方法进行制样用于免疫印迹方法检测。对照组：使用PPase消化的细胞样品，消化结束后的样品用于免疫印迹方法(Western Blot，后文简称WB)检测。
结果如图3c所示，自制的Ser701抗体可以识别细胞中STAT3蛋白的Ser701位点即701位丝氨酸磷酸化信号。
在一个实施例中，本申请还公开了一种检测结肠炎小鼠组织中STAT3蛋白Ser701位点磷酸化的方法，该方法包括：
(1)结肠炎模型小鼠的构建：将SPF级的8～10周雄性C57BL/6J小鼠(北京华阜康生物科技股份有限公司)参照“Zhang HX,Xu ZS,Lin H,Li M,Xia T,Cui K,Wang SY,Li Y,Shu HB,Wang YY.TRIM27 mediates STAT3 activation at retromer-positivestructures to promote colitis and colitis-associated carcinogenesis.NatCommun.2018Aug 24；9(1):3441.IF＝11.878”所示方法进行DSS诱导建模，建立结肠炎模型小鼠。
(2)待检测样品的制备
取C57BL/6J小鼠作为对照组，将结肠炎模型小鼠作为试验组，分别取对照组和实验组小鼠结肠组织放入预冷的研钵中，进行液氮冷冻研磨。裂解液在使用前数分钟内加入PMSF(碧云天生物技术，Cat.ST506)，使PMSF的最终浓度为1mM。按照每20mg组织加入150-250μl裂解液的比例加入预冷的裂解液(碧云天生物技术，Cat.P0013C)进行裂解。充分裂解后，10000～14000g离心3～5分钟，将上清液转移至新的离心管内，处理结束后样品用于免疫印迹方法检测检测。
结果如图4所示，自制的Ser701抗体可以识别小鼠组织中的STAT3蛋白的Ser701位点即701位丝氨酸磷酸化信号。
药物组合物
为此，本申请实施例还公开了一种药物组合物，其包括上述实施例提供的抗体以及药学上可接受的辅料或载体。
术语“药学上可接受的”意指经有关管理机构批准或公认药典中所列用于动物，更特别地用于人的。术语“载体”是指与试剂一起施用的稀释剂、佐剂(例如，弗氏完全和不完全佐剂)、赋形剂或媒介物。这样的载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，包括例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内施用药物和/或诊断组合物时，水是常用载体。盐水溶液以及葡萄糖和甘油水溶液也可被用作液体载体，特别是用于可注射溶液。适当的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、无水脱脂乳、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。药学上可接受的载体、赋形剂和稳定剂的另外实例包括但不限于缓冲剂例如磷酸盐、柠檬酸盐以及其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸；低分子量多肽；蛋白质，例如血清白蛋白和明胶；亲水性聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸例如甘氨酸,谷氨酰胺,天冬酰胺,精氨酸或赖氨酸；单糖,二糖以及其它糖类包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂例如EDTA；糖醇例如甘露醇或山梨醇；形成盐的抗衡离子例如钠；和/或非离子型表面活性剂例如TWEENTM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM，如本领域中已知的。除了上述成分外，本发明的药物和/或诊断组合物还可包括润滑剂、湿润剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂和防腐剂。这些组合物可采取溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、持续释放制剂等形式。
综上所述，本申请公开了STAT3蛋白Ser701磷酸化抗原肽及其应用，所述抗体能用于检测细胞和小鼠组织中STAT3蛋白Ser701磷酸化水平；本申请中提供的所述抗体的制备方法，该方法操作简单，通过此方法制得的抗体特异性强、纯度高、稳定性好。
以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种分离的抗原肽，所述抗原肽具有靶向STAT3蛋白的Ser701磷酸化位点的免疫原性，其中，所述抗原肽为(I)～(IV)中的至少一项：
(I)SEQ ID NO.1～4所示的氨基酸序列；
(II)与(I)所述序列至少有75％相似性的氨基酸序列；
(III)具有与(I)或(II)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸序列获得的氨基酸序列，且与(I)或(II)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；
(IV)(I)、(II)或(III)所述抗原肽或在其氨基酸序列中的部分或全部氨基酸残基处被修饰。
2.一种抗原构建体，所述抗原构建体包含权利要求1所述的抗原肽及用于负载或偶联权利要求1所述的抗原肽的载体。
3.根据权利要求2所述的抗原构建体，其中，所述载体是脂质体。
4.根据权利要求2所述的抗原构建体，其中，所述载体选自匙孔槭血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、鸡卵白蛋白(OVA)、牛甲状腺球蛋白(THY)、灭活百日咳毒素、B群脑膜炎球菌外膜蛋白、绿脓杆菌外毒素A、霍乱毒素B亚单位、细菌外膜蛋白、大肠杆菌热敏感肠毒素、肺炎球菌溶血素、淋球菌菌毛蛋白和革兰氏阴性菌的脂多糖中的一种。
5.权利要求1所述的抗原肽、权利要求2所述的抗原构建体的应用，所述应用包括如下至少一项：
(1)用作制备STAT3蛋白的Ser701磷酸化特异性抗体；
(2)用作制备STAT3蛋白的Ser701磷酸化相关疾病的疫苗；
(3)用作免疫激活剂。
6.一种抗体，所述抗体与权利要求1所述的抗原肽、或权利要求2～4任一所述的抗原构建体进行特异性结合。
7.权利要求6所述抗体的制备方法，包括将权利要求1所述的抗原肽、权利要求2所述的抗原构建体进行动物免疫，收集抗血清和纯化的步骤。
8.一种ELISA试剂盒，用于检测STAT3蛋白Ser701磷酸化水平，所述ELISA试剂盒包括权利要求6所述的抗体或权利要求7所述的制备方法得到的抗体。
9.如权利要求8所述的ELISA试剂盒，其包含：包被有STAT3蛋白Ser701磷酸化抗体的酶标板和洗涤缓冲液、封闭液、包被缓冲液、酶标抗体、TMB显色液、终止液；
优选地，所述ELISA试剂盒包含：
如权利要求6所述的抗体或权利要求7所述的制备方法得到抗体；
酶标抗体；
洗涤缓冲液：为PBST缓冲液：1000mL 0.01mol/L PBS+0.5mL Tween-20；
封闭液：含有5％脱脂奶粉PBS缓冲液；
包被缓冲液：包含0.015M Na2CO3和0.035M NaHCO3，pH 9.6；
TMB母液：为10mg TMB充分溶于5mL无水乙醇制得；
TMB显色液：包含0.5mL TMB母液、10mL底物缓冲液和2.1μL 30％质量百分比的H2O2水溶液；以及
终止液：2M的H2SO4。
10.一种药物组合物，包括权利要求6所述的抗体或权利要求7所述的制备方法制得的抗体，以及药学上可接受的辅料或者载体。
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