DE60036106T2 - Durch nicht-kovalent assoziierte konjugate gebildete epitope - Google Patents

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Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Durchmusterung einer Zusammensetzung bezüglich der Wechselwirkung mit einem Liganden.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Es ist bekannt, dass Proteinrezeptoren normalerweise an ihre Ziel-Liganden über Epitope binden, welche einen kleinen Bruchteil des gesamten Proteinmoleküls bilden. Für eine maximale Bindung oder Wechselwirkung muss die Struktur des Epitops in einer starren Konformation beibehalten werden, damit sie eine Bindungsstelle bildet, welche alle notwendigen Komponenten des Epitops in großer räumlicher Nähe enthält. Versuche, ein analoges Peptid herzustellen, welches allein aus den Aminosäuren aufgebaut ist, welche die Bindungsstelle umfasst, schlagen oftmals fehl, da diese Peptide nicht die gleiche biologische Aktivität wie der Proteinrezeptor aufweisen. Dies wird der Tatsache zugeschrieben, dass das Peptid in freier Lösung eine unterschiedliche Konformation im Vergleich zu jener des vollständigen Proteinrezeptors aufweist. Zusätzlich führt, wenn die Bindungsstelle eines Proteins aus Oligopeptiden aus unterschiedlichen, nicht aneinander angrenzenden Abschnitten einer Proteinkette gebildet wird, ein Mischen von isolierten Oligopeptiden in freier Lösung nicht zur Rekonstitution der aktiven Bindungsstelle.
  • Dass man gezwungen ist, solche großen Proteine zu verwenden, um Bindungsstellen-Epitope präsentieren zu können, erzeugt mehrere Probleme bei der Entwicklung von neuen Rezeptor-spezifischen therapeutischen Strategien. Ein Problem besteht darin, dass solche großen Proteine leicht eine Immunantwort hervorrufen können. Ein zweites Problem ist, dass lange Peptidketten gegenüber einem Angriff durch Endopeptidasen, wie jene im Darmlumen, empfindlich sind. Schließlich können diese großen Proteine kostspielig herzustellen, zu reinigen und in stabiler Form aufrechtzuerhalten sein.
  • Die US-A-5,882,645 offenbart ein lipidisches, auf Aminosäuren basierendes Ankersystem, welches die Antigenität eines kurzen synthetischen Peptids maximal verstärken kann. Dieses Dokument stellt auch ein Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen durch schrittweise erfolgende Peptidsynthese, vorzugsweise schrittweise erfolgende Festphasen-Peptidsynthese, bereit.
  • Die EP-A-0338437 offenbart einen synthetischen Impfstoff gegen Maul- und Klauenseuche, welcher durch Konjugation von wenigstens einer Membranverankerungsverbindung mit wenigstens einer partiellen Sequenz eines Proteins des Maul- und Klauenseuchevirus hergestellt wird.
  • Die US-A-5,580,563 offenbart ein multiples antigenes Peptidsystem, welches einen dendritischen Kern und Peptid und eine lipophile Verankerungseinheit umfasst. Diese Kombination weist den Vorteil auf, dass sie die Notwendigkeit für das Hinzufügen von Adjuvantien, von denen festgestellt worden ist, dass sie für Menschen toxisch sind, beseitigt und die exponentielle Amplifizierung des antigenen Potentials eines daraus hergestellten Impfstoffs vereinfacht, da eine nicht-kovalente Amplifizierung durch Liposomen oder eine Mizellen-Form möglich ist.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die Erfindung zielt darauf ab, die Nachteile des Standes der Technik zu überwinden.
  • Unter einem ersten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Durchmusterung von Zusammensetzungen bezüglich der Wechselwirkung mit einem Ziel-Liganden bereit, wobei das Verfahren umfasst: (a) Bereitstellung einer Mehrzahl von unterschiedlichen Konjugaten, wobei jedes Konjugat eine Kopfgruppe und eine Schwanzgruppe umfasst, wobei die Konjugate mizellenbildend sind, die Kopfgruppen hydrophil sind und die Schwanzgruppen lipophil sind; und (b) Bilden aus der Mehrzahl von Konjugaten eine nicht-kovalente Assoziation derselben, welche eine Mizelle umfasst, in der die Schwanzgruppen hydrophob aggregieren und in der die Konjugate beweglich sind, so dass in Anwesenheit eines Liganden mindestens zwei der Kopfgruppen geeignet angeordnet sind, um ein Epitop zu bilden, das stärker mit dem Liganden Wechselwirken kann als jede der Kopfgruppen einzeln, wobei der Schritt der Bereitstellung der Mehrzahl von Konjugaten umfasst:
    (i) Auswählen eines Satzes von Konjugaten mit einer Anordnung von Kopfgruppen; (ii) Bilden einer nicht-kovalenten Assoziation daraus, in der die Schwanzgruppen hydrophob aggregieren und in der die Konjugate beweglich sind;
    (iii) Testen bezüglich der Wechselwirkung zwischen der nicht-kovalenten Assoziation und dem Liganden;
    (iv) gegebenenfalls Wiederholen der Schritte (i) bis (iii) unter Verwendung eines Satzes von Konjugaten mit einer modifizierten Anordnung von Kopfgruppen; und
    (v) beim Auffinden von Wechselwirkung im Schritt (iii) Auswählen des Satzes von Konjugaten als die Mehrzahl von Konjugaten in Schritt (a).
  • Jedes Konjugat ist vorzugsweise, wie nachfolgend definiert.
  • In dem Verfahren der Erfindung umfasst die Zusammensetzung für das Wechselwirken mit einem Liganden eine nicht-kovalente Assoziation, welche eine Mizelle umfasst, einer Mehrzahl von unterschiedlichen Konjugaten, wobei jedes Konjugat eine Kopfgruppe und eine Schwanzgruppe umfasst, wobei die Schwanzgruppen der Konjugate mizellenbildend sind und die Konjugate Bewegungsfreiheit in Bezug aufeinander innerhalb der Assoziation aufweisen, so dass in Anwesenheit eines Liganden wenigstens zwei der Kopfgruppen (die gleich oder unterschiedlich sind) geeignet angeordnet sind, um ein Epitop zu bilden, das stärker mit dem Liganden Wechselwirken kann als jede der Kopfgruppen einzeln. Die Kopfgruppen sind hydrophil und die Schwanzgruppen lipophil, z.B. bestehend aus Kohlenwasserstoffketten, halophil, bestehend aus Fluorkohlenstoffketten oder auf Silan basierend.
  • Durch Konstruieren von Konjugaten mit einer Kopfgruppe und einer Schwanzgruppe gemäß der Erfindung können die Schwanzgruppen assoziieren unter Bildung einer hydrophoben Aggregation, die eine Mizelle ist, in welcher die Konjugate orientiert sind, wodurch die Kopfgruppen in große Nähe gebracht werden, wenn sie sich in einer wässrigen Phase befinden. Da die Konjugate innerhalb der Assoziation beweglich sind, sind die Kopfgruppen in der Lage, innerhalb der Assoziation verschiedene unterschiedliche Positionen einzunehmen. Die Kopfgruppen, die typischerweise nicht-identisch sind, sind dementsprechend frei, sich innerhalb der Assoziation zu bewegen und überraschenderweise um kooperativ wechselzuwirken, um biologische Konsequenzen zu induzieren, die die Kopfgruppen allein nicht auslösen können. Eine weitere unerwartete Feststellung ist, dass aus Kombinationen von unterschiedlichen Kopfgruppen bestehende Assoziationen in der Lage sind, biologische Reaktionen auszulösen oder an der Bindung an biologische Rezeptoren teilzunehmen, während aus einer einzigen Art von Kopfgruppen gebildete Assoziationen nicht in der Lage sind, auf diese Weise zu wirken.
  • Wie oben angegeben, sind diese Assoziationen typischerweise von teilchenförmiger oder kolloidaler Natur, wobei sie üblicherweise viele Hunderte von Untereinheiten (die Konjugate) umfassen, die allesamt mit den Kopfgruppen vom Zentrum des Teilchens nach außen gerichtet orientiert sind, wie in 1a gezeigt. Jedes der Konjugate kann seine Lage innerhalb der Assoziation verändern, wobei es frei ist, Plätze mit benachbarten Konjugaten durch einen Prozess von Brownscher Bewegung zu tauschen, und indem es dies tut, kann es über die gesamte Oberfläche der Assoziation wandern. Andere Manifestationen von Assoziationen sind kubische Phasen und beschichtete Oberflächen.
  • Jedes Konjugat in der Assoziation kann eine Kopfgruppe aufweisen, die ausgewählt ist aus einer chemischen oder biologischen Klasse oder verschiedenen unterschiedlichen Klassen, wie einer Aminosäure oder einem Peptid; einem Peptid-Analogon; einem Mono-, Di- oder Polysaccharid; einem Mono-, Di- oder Polynukleotid; einem Sterol; einem Alkaloid; einem Isoprenoid; einem Inositol-Derivat; einem einzelnen oder kondensierten aromatischen Kern; einem wasserlöslichen Vitamin; einem Porphyrin- oder Härn-Kern; einem Phthalocyanin; einem Metallionen-Chelat; einem wasserlöslichen Arzneistoff; einem Hormon; oder einem Enzymsubstrat.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst jede Kopfgruppe eine Aminosäure oder ein Oligopeptid, die bzw. das der terminale Abschnitt einer Peptidkette sein kann. Es ist wünschenswert, die Länge des Peptids minimal zu halten, um zu vermeiden, eine Immunantwort auszulösen, wenn die Zusammensetzung in vivo verwendet werden soll. Dementsprechend ist bevorzugt, dass das Peptid nicht mehr als sechs Aminosäuren lang ist.
  • Die eingesetzten Aminosäuren können beliebige der natürlichen Aminosäuren, substituierte Derivate, Analoga und D-Formen davon sein.
  • Die Schwanzgruppen der Konjugate können allesamt die gleichen sein oder können eine Mischung von unterschiedlichen Schwanzgruppen sein, von denen jede eine lipophile Gruppe umfasst, die ausgewählt ist aus einem linearen, verzweigten, cyclischen, polycyclischen, gesättigten oder ungesättigten Konstrukt, mit oder ohne in der Struktur enthaltene Heteroatome, das substituiert oder unsubstituiert sein kann, beispielsweise einem lipidischen Aminosäure-Analogon; einem Prostaglandin; einem Leukotrien; einem Mono- oder Diglycerid; einem Sterol; einem Sphingosin- oder Ceramid-Derivat; und einem Silicium- oder Halogen-substituierten Derivat einer derartigen hydrophoben Gruppe. Die Schwanzgruppe weist vorzugsweise 6 bis 24 Kohlenstoffatome auf und umfasst mehr bevorzugt 10 bis 14 Kohlenstoffatome. In jedem Konjugat kann mehr als eine Schwanzgruppe vorhanden sein. Beispielsweise können eine oder mehrere lipidische Aminosäuren mit Kohlenwasserstoff-Seitenketten einen Teil von jedem Konjugat bilden, wobei sie mit einer oder mehreren Aminosäuren in der Kopfgruppe verknüpft sind.
  • Es kann ein jegliches chemisches Verfahren verwendet werden, um die Kopfgruppe mit der Schwanzgruppe zu verknüpfen. Beispielsweise kann jedes Konjugat des Weiteren eine Abstandshaltergruppe, welche die Kopfgruppe mit der Schwanzgruppe verknüpft, um die Präsentation der Kopfgruppe an der Oberfläche der nicht-kovalenten Assoziation zu vereinfachen, umfassen. Solche Abstandshaltergruppen (Spacer-Gruppen) sind wohlbekannt und umfassen beispielsweise Aminosäuren, Hydroxysäuren, Zucker und Polyethylenglycol.
  • Die durch das Verfahren der Erfindung durchmusterte Zusammensetzung kann als ein Arzneimittel, ein prophylaktisches oder ein diagnostisches Agens verwendet werden.
  • Ein Vorteil der Zusammensetzung besteht darin, dass mit Konjugaten, in denen die Kopfgruppen im Vergleich zu herkömmlichen biologischen Rezeptoren klein sind, starke spezifische Bindungswechselwirkungen erzielt werden können. Wenn die Kopfgruppe beispielsweise ein Oligopeptid ist, dann würde die Länge der Peptidkette normalerweise zehn Aminosäuren nicht überschreiten und würde vorzugsweise sechs oder weniger sein. Dementsprechend können Zusammensetzungen hergestellt werden, die weit weniger immunogen als ihre Protein-Gegenstücke sind.
  • Die Zusammensetzung kann nicht nur so formuliert werden, dass sie mit einem Liganden in vitro wechselwirkt, sondern die Zusammensetzung kann auch in vivo verwendet werden, wobei sie gegebenenfalls mit einem geeigneten Verdünnungsmittel, Hilfsstoff oder Träger in Übereinstimmung mit einer geeigneten Abgaberoute formuliert wird.
  • Die Konjugate können in wässriger Phase dispergiert werden durch verschiedene von bekannten Methodiken für die Herstellung von Lipidvesikeln, einschließlich mechanisches Mischen, Exposition gegenüber hohen Scherkräften, Beschallung, Lösemitteldispersion oder Coauflösung mit Detergentien. Typischerweise werden die dadurch hergestellten nicht-kovalenten Assoziationen aus mehreren unterschiedlichen Konjugaten, die miteinander vermischt sind, bestehen. Zusätzliche lipidische Materialien können gegebenenfalls hinzugefügt werden, um Oberflächeneigenschaften zu verändern, um die Dispergierung der Konjugate zu unterstützen, um die nicht-kovalente Assoziation von Konjugaten zu stabilisieren, um die Präsentation von Kopfgruppen der Konjugate zu unterstützen oder um die Konstruktion von Vehikeln zu ermöglichen, die durch die Epitope, die durch zufällige Bewegung der Konjugate und geeignete Anordnung der Kopfgruppen innerhalb der Assoziation gebildet werden, mit Zielgerichtetheit („targeting") ausgestattet sein können.
  • Der Schritt der Bereitstellung der Mehrzahl von Konjugaten umfasst das Testen bezüglich einer Wechselwirkung zwischen der nicht-kovalenten Assoziation und dem Liganden.
  • Beispiele von Assays bezüglich einer ausreichenden „Wechselwirkung" können Bindungsassays, wie jene, die das ELISA-Prinzip für einen Nachweis einer Assoziation zwischen Antikörper und Antigen einsetzen, umfassen. Andere geeignete in vitro-Assays umfassen eine Modifizierung der Fluoreszenz von gegenüber ihrer Umgebung empfindlichen membrangebundenen fluoreszierenden Sonden, Präzipitationsreaktionen, eine Verstärkung oder Inhibition von Enzymaktivität u.s.w. Assays, welche auf der Fähigkeit von Materialien, das Verhalten von in vitro kultivierten Zellen zu verändern, beruhen, können auch geeignet sein, wie Assays bezüglich Zelltod, Zellproliferation, Apoptose, Inhibition oder Stimulation von Zell-Zell-Kontakten, Sekretion von Zytokinen oder anderen löslichen Produkten, Synthese von spezifischer mRNA, intrazellulärem vesikulärem Transport, Veränderung von Zell/Zell-Informationsweitergabeprozessen durch Substanzfreisetzung u.s.w. In vivo-Assays in vollständigen Tieren oder Menschen können ebenfalls ausgeführt werden, beispielsweise ein Einbau einer radioaktiven Markierung in die supramolekularen Zusammenlagerungen, gefolgt von einer Untersuchung von deren nachfolgender Verteilung nach Verabreichung über verschiedene Routen.
  • Gemäß dem Verfahren der Erfindung wird ein kombinatorischer Ansatz verwendet, in welchem ein Spektrum von unterschiedlichen nicht-kovalenten Assoziationen (oder „Sonden") hergestellt wird, wobei jede eine unterschiedliche Kombination von Konjugaten, welche aus einer vorab synthetisierten Bank ausgewählt werden, enthält. Die Auswahl der geeigneten Konjugate kann auf bekannte Eigenschaften des Ziel-Liganden gegründet werden oder kann einfach die Verwendung eines sehr breiten Spektrums von Kopfgruppen umfassen, um die Wahrscheinlichkeit, dass zwei oder mehrere der Kopfgruppen ein Epitop für den Liganden bilden werden, zu erhöhen. Auf diese Weise kann in der Folge des Assays bezüglich ausreichender Wechselwirkung zwischen der Sonde und dem Liganden, wie oben beschrieben, die Kombination von Konjugaten, von der festgestellt worden ist, dass sie am wirkungsvollsten ist, modifiziert werden, indem weitere Kopfgruppen hinzugefügt werden, einige Kopfgruppen entfernt werden oder beides und die resultierenden Sonden erneut bezüglich ausreichender Wechselwirkung getestet werden. Schließlich kann die günstigste Kombination von Kopfgruppen identifiziert und für eine Verwendung in der Zusammensetzung ausgewählt werden.
  • Die Erfindung weist dementsprechend einen sehr deutlichen Vorteil gegenüber der traditionellen kombinatorischen Chemie auf. Im Rahmen der kombinatorischen Chemie muss die Identifizierung der günstigsten Sequenz für das Binden an einen speziellen Rezeptor durch die Synthese von Hunderten von möglichen Kombinationen von unterschiedlichen Gruppen, wie Aminosäuren, in unterschiedlichen Reihenfolgen, die jeweils auf Wirksamkeit getestet werden müssen, ausgeführt werden. Dieses Verfahren ist zeitaufwändig, teuer und wird durch die Natur der Chemie, die beim Verknüpfen der verschiedenen Komponenten miteinander ausgeführt werden kann, beschränkt. Im Gegensatz dazu beruht die Erfindung einfach auf der räumlichen Nähe der Kopfgruppen, um sich aus der Assoziation ableitende Epitope bereitzustellen. Ist einmal ein Satz von Konjugaten synthetisiert worden, ist keine weitere synthetische Chemie erforderlich, nur einfaches Mischen der Konjugate, um die verschiedenen Sonden durch nicht-kovalente Assoziation zu bilden.
  • In einer bevorzugten einfachen Ausführungsform verwendet das Verfahren Konjugate, welche eine einzelne terminale Aminosäure, die über einen Abstandshalter mit einer Lipid-Schwanzgruppe verknüpft ist, aufweisen, die einfach kombiniert werden können durch Mischen in wässrigem Medium, um Mizellen zu bilden, in denen unterschiedliche Aminosäureseitenketten zusammen in einer Vielzahl von unterschiedlichen Konfigurationen präsentiert werden würden. Dementsprechend wird die Notwendigkeit, Aminosäuren in einer speziellen Reihenfolge oder mit einem speziellen räumlichen Abstand oder einer speziellen Orientierung zu präsentieren, umgangen. Aus statistischen Gründen wird immer ein Teil der individuellen Aminosäure-Untereinheiten in einer idealen Konfiguration assoziiert sein.
  • In einer Anordnung würde jedes der Konjugate die lineare Struktur: X-Abstandshalter-Abstandshalter-Lipid-Lipid, wobei X für eine einzelne Aminosäure, welche für jedes der eingesetzten unterschiedlichen Konjugate verschieden ist, steht, aufweisen.
  • Wird danach gestrebt, Epitope zu konstruieren, die aus natürlichen Aminosäuren bestehen, ist es möglich, die Anzahl von Kopfgruppen für die Auswahl weiter zu vereinfachen. Man kann die Aminosäurereste, die in natürlichen proteinartigen Materialien gefunden werden, in sechs grundlegende Klassen einteilen, indem vorzugsweise in einer jeglichen Klasse nur eine Aminosäure anstelle von allen Mitgliedern von jener Klasse verwendet wird aufgrund der erhöhten räumlichen Flexibilität von Aminosäuren in der terminalen Position der Kopfgruppe. Dies hat den Effekt, dass die gesamte Anzahl von Aminosäuren, die für das Konstruieren der vorab synthetisierten Bank von Konjugaten benötigt wird, und dadurch die gesamte Anzahl von verwendeten Kopfgruppen beträchtlich verringert werden. Die Hauptklassen von Aminosäuren sind in der nachfolgenden Tabelle 1 aufgeführt. Tabelle 1
    Klasse Repräsentatives Beispiel Abkürzung
    Hydrophob Leucin L
    Hydroxylisch Serin S
    Sauer Glutamat E
    Amid Glutamin Q
    Basisch Histidin H
    Aromatisch Tyrosin Y
  • Für das Identifizieren von aktiven Kombinationen von Aminosäuren enthaltenden Konjugaten stehen verschiedene Strategien zur Verfügung.
  • In einer Ausführungsform wird eine begrenzte Anzahl von Konjugaten eingesetzt, um ein Spektrum von unterschiedlichen Sonden zu bilden, wobei jede Sonde eine wässrige Suspension von supramolekularen Zusammenlagerungen ist, wobei jede Zusammenlagerung aus ausgewählten, miteinander vermischten Konjugaten besteht und jede sich von den anderen unterscheidet als Ergebnis der Aufnahme eines zusätzlichen unterschiedlichen Konjugats, wie nachfolgend gezeigt, wobei jeder der angegebenen Buchstaben für ein Konjugat mit einer unterschiedlichen terminalen Aminosäure steht:
    Sonde 1 A B C D
    Sonde 2 A B C E
    Sonde 3 A B C F
    Sonde 3 A B C G
    .....
    .....
    Sonde x A B C Z
  • Jede der Sonden wird separat in den biologischen Assays bezüglich ausreichender Bindung, wie oben erläutert, getestet.
  • In einer zweiten einfachen Ausführungsform kann eine anfängliche Sonde konstruiert werden, welche eine große Anzahl von unterschiedlichen Konjugaten aus der Bank enthält, und ihre Wirksamkeit verglichen werden mit Sonden, denen wiederum jeweils ein unterschiedliches Konjugat fehlt, um zu bestimmen, welche Kopfgruppen in der Bank für die biologische Wechselwirkung, die untersucht wird, essentiell sind und welche überflüssig sind. Dieser Ansatz wird nachfolgend veranschaulicht:
    Sonde 1 A B C D E . . . Z
    Sonde 2 A C D E . . . Z
    Sonde 3 A B D E . . . Z
    .....
    Sonde x A B C D E . . .
  • Es können Kombinationen der alternativen Ansätze, wie oben erläutert, gemacht werden.
  • Eine Kenntnis des Ziel-Liganden kann dazu beitragen, eine geeignete Ausgangsanordnung zu gestalten. Wenn beispielsweise bekannt ist, dass der Ligand basisch ist, würde es Sinn machen, den Konjugaten einen sauren Charakter zu verleihen, indem sie in einer Form präsentiert werden, bei welcher eine freie Carboxylgruppe der terminalen Aminosäure exponiert ist. Das Einführen von zusätzlicher Funktionalität durch Einsatz einer bestimmten Aminosäure als eine Abstandshaltergruppe angrenzend an die terminale Aminosäure kann auch erhöhte Spezifität verleihen. Wenn die Beteiligung von beispielsweise einer kurzen Oligopeptidsequenz von bekannter Struktur bereits mit dem Binden an den Ziel-Liganden in Verbindung gebracht worden ist, kann eine solche Sequenz in ein Konjugat, das in den Satz von Konjugaten, welche die Zusammensetzung bilden, aufgenommen werden soll, eingebaut werden.
  • Die im Rahmen des Verfahrens der Erfindung bereitgestellte Zusammensetzung kann in einem Verfahren zur Herstellung eines Moleküls für das Wechselwirken mit einem Liganden verwendet werden. Das Verfahren umfasst, eine Zusammensetzung gemäß einem der oben definierten Verfahren herzustellen; die wenigstens zwei Kopfgruppen, die ein Epitop für den Liganden in der Zusammensetzung bilden, zu identifizieren; und ein Molekül herzustellen, welches die funktionellen Gruppen der wenigstens zwei Kopfgruppen enthält, die gegebenenfalls durch eine oder mehrere Linkergruppen von einander räumlich beabstandet sind, so dass das Molekül in der Lage ist, mit dem Liganden stärker zu wechselwirken als jede der Kopfgruppen einzeln.
  • Obwohl die in dem Verfahren der Erfindung verwendeten Zusammensetzungen ihrerseits in in vitro- oder in vivo-Systemen nützlich sein können, vielleicht, um eine biologische Reaktion in einem therapeutischen, prophylaktischen oder diagnostischen Verfahren zu induzieren, kann unter gewissen Umständen ein Molekül basierend auf der Struktur der obigen Zusammensetzungen hergestellt werden. Indem die funktionellen Gruppen der wenigstens zwei Kopfgruppen, die das Epitop für den Liganden bilden, identifiziert werden, kann ein neues Molekül-Analogon zu der Zusammensetzung hergestellt werden, das das gleiche oder ein ähnliches Epitop enthält. Die funktionellen Gruppen können beispielsweise in ein einzelnes lineares Oligopeptid, möglicherweise mit einer oder mehreren Linkergruppen, um die funktionellen Gruppen voneinander räumlich zu beabstanden, eingebaut werden.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Die Erfindung wird jetzt lediglich beispielhaft detaillierter beschrieben unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele und die beigefügten Zeichnungen, in welchen:
  • 1 eine schematische Darstellung der Oberfläche einer supramolekularen Zusammenlagerung zeigt, und wie eine solche Zusammensetzung, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, an einen Ziel-Liganden bindet; und
  • 2 eine schematische Darstellung der Oberfläche einer supramolekularen Zusammenlagerung, gebildet aus zwei nicht-identischen Konjugaten, deren Kopfgruppen aus kurzkettigen linearen Peptiden bestehen, zeigt.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Unter Bezugnahme auf 1 ist ein Teil 1 einer in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Zusammensetzung in Form einer Mizelle, in welcher die Kopfgruppen 2 und Schwanzgruppen 3 zusammen Konjugate 4 bilden, gezeigt (1A). Ein Ziel-Ligand 5 wird der Zusammensetzung 1 präsentiert. Da die Konjugate beweglich sind, tritt eine Umlagerung auf (1B), wodurch ermöglicht wird, dass sich die Kopfgruppen 2 so anordnen, dass sie den Ziel-Liganden 5 binden. Unter Bezugnahme auf 2 ist ein Teil einer in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Zusammensetzung gezeigt in Form einer supramolekularen Zusammenlagerung, in welcher das Binden eines Liganden an die Oberfläche der Zusammenlagerung ermöglicht wird durch die Erzeugung eines Epitops, welches über die nichtkovalente Assoziation von zwei Konjugaten, welche aus kurzkettigen Peptiden bestehen, zusammengefügt wird (A), wobei dieses Epitop in der Lage ist, mit dem Liganden stärker zu Wechselwirken als jedes der individuellen Konjugate, wenn sie isoliert vorliegen (B). Das gleiche Prinzip gilt für Kopfgruppen, die andere Strukturen als Aminosäuren enthalten.
  • BEISPIELE
  • In den nachfolgend angegebenen Beispielen wird die Standardkonvention für die Darstellung von Aminosäuren durch einzelne Buchstaben des Alphabets eingesetzt mit der Ausnahme, dass in allen Fällen der Buchstabe sich auf Konjugate, wie oben beschrieben, bezieht, in denen jene bestimme Aminosäure die terminale Position in der Peptidkette einnimmt. In den hier beschriebenen Beispielen umfasst das Lipid zwei Aminosäuren, die über eine Peptidbindung verknüpft sind, bei welchen beide der Aminosäuren Glycin-Analoga sind, wobei in jedem Falle das α-Wasserstoffatom durch eine lineare Kohlenwasserstoffkette, welche entweder 12 oder 14 Kohlenstoffatome enthält, ersetzt worden ist. Verknüpfungen zwischen der Kopfgruppe und dem Abstandshalter und dem Abstandshalter und dem Lipid erfolgen allesamt über Peptidbindungen. Die Kopfgruppe trägt eine freie Aminogruppe und das freie Ende des Lipids trägt eine CONH2-Gruppe. Die Struktur von jedem Konjugat ist folglich: NH2-Kopfgruppe-Abstandshalter-Aminosäure (C14-Seitenkette)-Aminosäure (C12-Seitenkette)-CONH2.
  • Beispiel 1: Stimulation von TNF-Sekretion aus Makrophagen
    • 1. Individuelle Konjugate E, Y, Q, S & H (verknüpft mit Lipid über einen Serin-Glycin-Abstandshalter) wurden als Lösungen in Methanol/Dichlormethan 1:1 mit einer Konzentration von 5 mg/ml hergestellt.
    • 2. Lösungen der Konjugate wurden in gleichen Anteilen in 7 ml-Glasfläschen verteilt, wodurch ein Endvolumen von 400 μl (2 mg Feststoff) in allen Fläschchen erhalten wurde, wie in dem Beispiel auf der nächsten Seite gezeigt. In Fällen, wo das zur Verfügung stehende Volumen von organischer Lösung nicht ausreichend war, wurde zu einem späteren Zeitpunkt eine Anpassung vorgenommen, indem die für die Rekonstitution zugesetzte Menge Wasser entsprechend verringert wurde, wie gezeigt.
    • 3. Der Inhalt von allen Fläschchen wurde unter einem Stickstoffstrom vollständig getrocknet, dann einem Vakuum von wenigstens 1 mbar über Nacht in einem Lyophilisator ausgesetzt.
    • 4. Am folgenden Tag wurde destilliertes Wasser in Volumen, wie in der Tabelle auf der nächsten Seite angegeben, zugesetzt, um eine Endkonzentration in allen Fläschchen von 1 mg/ml zu erhalten. Die Fläschchen wurden mit einer Kappe verschlossen, auf 37°C erwärmt und im Wasserbad beschallt, bis Klarheit erzielt wurde.
    • 5. Die Proben wurden dann in Vertiefungen von 24 Vertiefungen aufweisenden Cluster-Platten („custer plates"), in welchen Zellen der J774A-1-Makrophagen-Zeltlinie ausplattiert worden waren (5 × 104 Zellen/ml/Vertiefung), eingebracht. Volumen von 100 μl und 10 μl von Probe wurden zu individuellen Vertiefungen zugegeben und die Zellen wurden über Nacht bei 37°C in einer Atmosphäre von 5%CO2/Luft inkubiert.
    • 6. Am folgenden Tag wurden doppelte Volumen von 50 μl Überstand aus jeder Vertiefung entnommen und hinsichtlich der TNF-Konzentration in einem „ELISA-Capture-Assay" gemessen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle gezeigt.
  • Verteiltes Volumen von Konjugat Zugesetztes Volumen von Wasser
    E Y Q S H
    E 260ul 1.3ml
    Y 400ul 2.0ml
    Q 310ul 1.55ml
    S 360ul 1.6ml
    H 400 2.0ml
    EY 200ul 200ul 2.0ml
    EQ 200ul 200ul 2.0ml
    ES 200ul 200ul 2.0ml
    EH 200ul 200ul 2.0ml
    YQ 200ul 200ul 2.0ml
    YS 200ul 200ul 2.0ml
    YH 200ul 200ul 2.0ml
    QS 200ul 200ul 2.0ml
    QH 200ul 200ul 2.0ml
    SH 200ul 200ul 2.0ml
    QSH 133ul 133ul 133ul 2.0ml
    YSH 133ul 133ul 133ul 2.0ml
    YQH 133ul 133ul 133ul 2.0ml
    YQS 133ul 133ul 133ul 2.0ml
    ESH 133ul 133ul 133ul 2.0ml
    EQS 133ul 133ul 133ul 2.0ml
    EYH 133ul 133ul 133ul 2.0ml
    EYS 133ul 133ul 133ul 2.0ml
    EYQ 133ul 133ul 133ul 2.0ml
    EQS 133ul 133ul 133ul 2.0ml
    EYQS 50ul 50ul 50ul 50ul 1.0ml
    EYQH 50ul 50ul 50ul 50ul 1.0ml
    EYSH 50ul 50ul 50ul 50ul 1.0ml
    EQSH 50ul 50ul 50ul 50ul 1.0ml
    YQSH 50ul 50ul 50ul 50ul 1.0ml
    EYQSH 40ul 40ul 40ul 40ul 40ul 1.0ml
    OD450 in J774-Überständen
    100μg 10μg 0μg
    E 0.628 0.098 0.013
    Y 0.313 0.053
    Q 0.083 0.015
    S 0.348 0.143
    H 0.632 0.206
    EY 0.198 0.027
    EQ 0.113 0.022
    ES 0.211 0.225
    EH 0.167 0.037
    YQ 0.245 0.034
    YS 0.786 0.363
    YH 0.541 0.133
    QS 0.212 0.025
    QH 0.135 0.027
    SH 0.515 0.177
    QSH 0.253 0.032
    YSH 0.712 0.229
    YQH 0.290 0.020
    YQS 0.519 0.119
    ESH 0.380 0.246
    EQH 0.107 0.026
    EYH 0.254 0.042
    EYS 1.289 0.355
    EYQ 0.191 0.064
    EQS 0.209 0.027
    EYQS 0.777 0.206
    EYQH 0.224 0.067
    EYSH 0.262 0.146
    EQSH 0.149 0.185
    YQSH 0.319 0.045
    EYQSH 0.375 0.073
  • Es kann ersehen werden, dass einige, aber nicht alle der Kombinationen von unterschiedlichen Kopfgruppen starke biologische Reaktionen auslösen, was anzeigt, dass die Reaktion spezifisch für jene besonderen Kombinationen ist. Das Beispiel veranschaulicht die Art und Weise, auf welche die beschriebenen Konjugate im Rahmen des kombinatorischen Ansatzes eingesetzt werden können, um wirksame Kombinationen für den Zweck, eine gewünschte biologische Reaktion auszulösen, zu identifizieren.
  • Beispiel 2: TNF-Sekretion aus Makrophagen
  • Vergleich von supramolekularen Zusammenlagerungen, welche eine Mischung von Konjugaten enthalten, mit einer Mischung von supramolekularen Zusammenlagerungen, die jeweils ein einzelnes Konjugat enthalten.
  • Proben wurden hergestellt, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit oder ohne die Aufnahme von zusätzlichen lipidischen Materialien, wie nachfolgend beschrieben.
  • Die Kombination der Konjugate Y, S und L wurde gewählt, da diese Kombination in dem in Beispiel 1 beschriebenen Experiment gut funktioniert hatte.
  • Sonden, welche Phosphatidylcholin enthielten, wurden mit einem Phospholipid-Konjugat-Verhältnis von 2:1 (Gew./Gew.) hergestellt.
  • Sonden, welche Octylglucosid enthielten, wurden mit einem Glycolipid-Konjugat-Verhältnis von 1:1 (Gew./Gew.) hergestellt.
  • Die in der nachfolgenden Tabelle gezeigten Ergebnisse sind optische Dichten bei 450 nm der an 18 h-Kulturüberständen ausgeführten TNF-ELISAs. Die Konjugat-Konzentration in den Vertiefungen betrug 10 μg/ml.
    OD450 des TNT-ELISA
    EYS 0.390
    E+Y+S 0.059
    Mediumkontrolle 0.000
    EYS:OG 0.559
    (E+Y+S):OG 0.193
    OG-Kontrolle 0.228
    EYS:PC 0.320
    (E+Y+S):PC 0.130
    PC-Kontrolle 0.081
  • Dieses Beispiel zeigt, dass Kombinationen der Konjugate biologische Reaktionen auslösen können entweder, wenn sie allein präsentiert werden oder wenn sie in Verbindung mit anderen Lipiden, wie Phospholipiden oder Lipidzuckern, präsentiert werden. Es zeigt auch, dass, damit sich Wirksamkeit manifestieren kann, es für alle Konjugate wichtig ist, dass sie in Kombination auf der gleichen supramolekularen Zusammenlagerung präsentiert werden, und dass Aktivität nicht beobachtet wird, wenn die gleichen Konjugate zusammen zum gleichen Zeitpunkt, aber getrennt auf unterschiedlichen supramolekularen Zusammenlagerungen präsentiert werden. Dies legt nahe, dass es wichtig ist, die Konjugate in großer räumlicher Nähe zueinander zu präsentieren, um die Bildung von durch nicht-kovalente Assoziation der Konjugate gebildeten Epitopen, die an der spezifischen Bindung von Zelloberflächenrezeptoren teilnehmen können, zu erlauben.
  • Beispiel 3: Verstärkung einer oralen Aufnahme
    • 1. Individuelle Konjugate L, S, E & Q (konjugiert mit Lipid über einen Tyrosin-Glycin-Abstandshalter) wurden als Lösungen in Benzylalkohol mit einer Konzentration von 10 mg/ml hergestellt.
    • 2. 75 μl 14C-Cholesterololeat (3,7 MBq/ml in Toluol) wurden in vier mit Schraubkappen verschließbaren 7 ml-Glasfläschchen verteilt und unter einem Stickstoffstrom vollständig getrocknet.
    • 3. 400 μl von jeder der Lösungen unter (1) wurden zu einem der Fläschchen unter (2) zugegeben und über Nacht bei Raumtemperatur geschüttelt.
    • 4. Lösungen der Konjugate wurden in gleichen Anteilen in 7 ml-Glasfläschen verteilt, um ein Endvolumen von 80 μl (0,8 mg Feststoff) in allen Fläschchen zu erhalten, wie in dem nachfolgenden Beispiel gezeigt.
  • L S E Q
    L 80ul – – –
    S – 80ul – –
    E – – 80ul –
    Q – – – 80ul
    LS 40ul 40ul – –
    LE 40ul – 40ul –
    LQ 40ul – – 40ul
    SE – 40ul 40ul –
    SQ – 40ul – 40ul
    EQ – – 40ul 40ul
    LSE 27ul 27ul 27ul –
    LSQ 27ul 27ul – 27ul
    LEQ 27ul – 27ul 27ul
    SEQ – 27ul 27ul 27ul
    LSEQ 20ul 20ul 20ul 20ul
    • 5. Zu jedem der Fläschchen wurden 2 ml destilliertes Wasser unter Vortexen zugegeben. Die Fläschchen wurden dann mit Kappen verschlossen und in einem Wasserbad 20 min beschallt.
    • 6. Die Proben wurden dann in flüssigem Stickstoff eingefroren und über Nacht lyophilisiert.
    • 7. Am folgenden Tag wurde jedes Fläschchen mit 2 ml destilliertem Wasser rekonstituiert und erneut beschallt, bis klare Dispersionen erzielt wurden.
    • 8. Die Proben wurden durch orale Zwangsernährung mittels Magensonde an weibliche Balb/c-Mäuse (20–25 g Gewicht – vier Mäuse pro Gruppe) in einer Dosis von 0,3 ml pro Tier verabreicht.
    • 9. 75 μl heparinisierte Blutproben wurden durch Schwanzvenenpunktion zum Zeitpunkt 45, 90 und 180 min nach der Verabreichung abgenommen.
    • 10. Jede Probe wurde in 0,5 ml PBS verdünnt, die dann zentrifugiert wurde, und es wurde 0,4 ml des Überstands in ein Szintillationsfläschchen transferiert, zu welchem 2 ml Optiphase Hisafe 3 (Wallac) unter Mischen zugegeben wurde.
    • 11. Die Aktivität in den Proben wurde in einem Szintillationszähler gemessen. Die prozentuale Aufnahme wurde auf der Grundlage eines Blutvolumens von 2 ml, von dem angenommen wurde, dass 1 ml aus Plasma bestand, abgeschätzt.
  • Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle gezeigt.
    % Aufnahe in Blutstrom
    45min 90min 180min
    Z 0.90 1.39 0.61
    S 1.12 1.14 0.81
    E 0.85 1.55 0.79
    Q 1.40 3.00 0.81
    LS 2.87 2.38 0.66
    LE 2.59 2.22 0.49
    LQ 5.05 2.15 0.45
    SE 4.21 1.66 0.70
    SO 4.67 1.45 0.67
    EQ 3.72 2.65 0.59
    LSE 1.91 1.20 0.97
    LSQ 6.23 1.90 0.80
    LEQ 2.77 1.73 0.98
    SEQ 3.06 1.52 0.63
    LSEQ 2.45 1.74 0.81
  • Es kann ersehen werden, dass einige, aber nicht alle der Kombinationen von unterschiedlichen Kopfgruppen die Aufnahme von Markierung über die orale Route verstärken, was anzeigt, dass die Reaktion für jene speziellen Kombinationen spezifisch ist. Das Beispiel veranschaulicht die Art und Weise, auf welche die beschriebenen Konjugate im Rahmen des kombinatorischen Ansatzes eingesetzt werden können, um wirksame Kombinationen zu identifizieren, welche in der Lage sind, als Targeting-Liganden (das zielgerichtete Ansteuern eines Wirkorts dirigierende Liganden) zu wirken.
  • Beispiel 4: ELSA-Fc-Bindung
    • 1. 100 μl Ziege-IgG (1 mg/ml) wurde zu 20 ml PBS zugegeben und 100 μl wurden in jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit flachen Böden gegeben.
    • 2. Die Platte wurde mehrere Tage bei +4°C inkubiert.
    • 3. 2 mg von jedem der Konjugate Y, F, W, L, S, E, Q & R (jeweils mit Lipid verknüpft über einen Serin-Glycin-Abstandshalter) wurden in 1 ml-Glasfläschchen abgewogen und 200 μl Benzylalkohol zugegeben, um Lösungen von jedem Konjugat mit einer Konzentration von 10 mg/ml zu erhalten.
    • 4. Die Lösungen wurden in mit Schraubkappen verschließbaren 7 ml-Glasfläschchen, wie folgt, verteilt:
  • Fläschch. Nr. Y F W L S E Q R
    1 20ul 20ul 20ul –
    2 20ul 20ul – 20ul
    3 20ul – 20ul 20ul
    4 – 20ul 20ul 20ul
    5 20ul 20ul 20ul –
    6 20ul 20ul – 20ul
    7 20ul – 20ul 20ul
    • 5. Der Inhalt von jedem Fläschchen wurde durch Vortexen gut gemischt, dann wurde 1,5 ml destilliertes Wasser zu jedem Fläschchen zugegeben.
    • 6. Die Fläschchen wurden mit einer Kappe verschlossen und in einem Wasserbad fünf Minuten beschallt, um kristallklare Dispersionen zu erhalten.
    • 7. Die Platte aus Schritt (2) wurde mit PBS/0,02% Tween 20 gewaschen und dann durch Inkubieren für eine Stunde mit 1% BSA (Rinderserumalbumin) in PBS (300 μl/Vertiefung) blockiert.
    • 8. Die Platte wurden dann gewaschen, wie zuvor, und 100 μl Probe aus jedem der Fläschchen in Schritt (6) wurden zu Vertiefungen in der Spalte (1) der Reihen (1) bis (7) zugegeben. Reihe (8) wurde als Leerwertkontrolle übriggelassen.
    • 9. Verdopplungsverdünnungen wurden quer durch die Platte hindurch ausgeführt, indem 100 μl aus Vertiefungen in Spalte (1) zu der angrenzenden Vertiefung in derselben Reihe in Spalte (2) transferiert wurden und gemischt wurde, dann 100 μl zu der nächsten Spalte transferiert wurden, wie zuvor, u.s.w.
    • 10. Die Platte wurde dann über Nacht bei +4°C inkubiert.
    • 11. Am folgenden Tag wurde die Platte, wie zuvor, gewaschen und 100 μl kommerzielles Meerrettich-Peroxidase-IgG-Konjugat (1/1000 in PBS verdünnt) wurden zu jeder Vertiefung zugegeben und bei Raumtemperatur 40 min inkubiert.
    • 12. Die Platte wurde dann erneut gewaschen und 100 μl OPD-Substrat für Peroxidase wurde zu jeder Vertiefung zugegeben und bei Raumtemperatur 30 min inkubiert.
    • 13. 20 μl 3 M Schwefelsäure wurden dann zu jeder Vertiefung zugegeben, um die Reaktion zu beenden.
    • 14. Die optische Dichte von jeder der Vertiefungen wurde bei 450 nm auf einem Plattenlesegerät gemessen und die erhaltenen Ergebnisse, nach Anpassung bezüglich des Hintergrunds, sind nachfolgend aufgezeichnet.
  • 1 in 4 1 in 8 1 in 16 1 in 32 1 in 64
    Probe
    1 YFW 0.001 0.039 0.048 0.053 0.083
    2 YFL 1.504 1.484 1.325 0.723 0.051
    3 YWL 0.803 0.192 0.022 0.023 0.060
    4 FWL 1.034 0.778 0.208 0.031 0.034
    5 SEQ 0.029 0.041 0.055 0.057 0.091
    6 SER 0.013 0.030 0.044 0.062 0.075
    7 SQR 0.000 0.045 0.031 0.054 0.065
  • Es kann ersehen werden, dass eine maximale Bindung mit den Proben 2, 3 und 4 (d.h. den Kombinationen YFL, YWL und FWL) erzielt wird.
  • Es kann ersehen werden, dass einige, aber nicht alle der Kombinationen von unterschiedlichen Kopfgruppen in starke Bindungswechselwirkungen eintreten, was anzeigt, dass die Reaktion für jene besonderen Kombinationen spezifisch ist. Das Beispiel veranschaulicht die Art und Weise, auf welche die beschriebenen Konjugate im Rahmen des kombinatorischen Ansatzes eingesetzt werden können, um wirksame Kombinationen für den Zweck, eine gewünschte Bindungswechselwirkung auszulösen, zu identifizieren.

Claims (15)

  1. Verfahren zur Durchmusterung von Zusammensetzungen bezüglich der Wechselwirkung mit einem Ziel-Liganden, wobei das Verfahren umfasst: (a) Bereitstellung einer Mehrzahl von unterschiedlichen Konjugaten, wobei jedes Konjugat eine Kopfgruppe und eine Schwanzgruppe umfasst, wobei die Konjugate mizellenbildend sind, die Kopfgruppen hydrophil sind und die Schwanzgruppen lipophil sind; und (b) Bilden aus der Mehrzahl von Konjugaten eine nicht-kovalente Assoziation derselben, welche eine Mizelle umfasst, in der die Schwanzgruppen hydrophob aggregieren und in der die Konjugate beweglich sind, so dass in Anwesenheit eines Liganden mindestens zwei der Kopfgruppen geeignet angeordnet sind, um ein Epitop zu bilden, das stärker mit dem Liganden Wechselwirken kann als jede der Kopfgruppen einzeln, wobei der Schritt der Bereitstellung der Mehrzahl von Konjugaten umfasst: (i) Auswählen eines Satzes von Konjugaten mit einer Anordnung von Kopfgruppen; (ii) Bilden einer nicht-kovalenten Assoziation daraus, in der die Schwanzgruppen hydrophob aggregieren und in der die Konjugate beweglich sind; (iii) Testen bezüglich der Wechselwirkung zwischen der nicht-kovalenten Assoziation und dem Liganden; (iv) gegebenenfalls Wiederholen der Schritte (i) bis (iii) unter Verwendung eines Satzes von Konjugaten mit einer modifizierten Anordnung von Kopfgruppen; und (v) beim Auffinden von Wechselwirkung im Schritt (iii) Auswählen des Satzes von Konjugaten als die Mehrzahl von Konjugaten in Schritt (a).
  2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem jedes Konjugat eine Kopfgruppe aufweist, die ausgewählt ist aus: einer Aminosäure oder einem Peptid; einem Peptid-Analogon; einem Mono- oder Polysaccharid; einem Mono- oder Polynukleotid; einem Sterol, einem wasserlöslichen Vitamin; einem Porphyrin- oder Häm-Kern; einem Metallionen-Chelat; einem wasserlöslichen Arzneistoff; einem Hormon; und einem Enzymsubstrat.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem jede Kopfgruppe eine Aminosäure umfasst.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem jede Kopfgruppe ein Peptid umfasst, welches die Aminosäure umfasst.
  5. Verfahren nach Anspruch 3 oder Anspruch 4, bei dem die Kopfgruppen, welche das Epitop bilden, terminale Aminosäuren umfassen, welche aus mindestens zwei der folgenden ausgewählt sind: hydrophoben Aminosäuren, Hydroxyl-Aminosäuren, sauren Aminosäuren, Amidaminosäuren, basische Aminosäuren und aromatische Aminosäuren.
  6. Verfahren nach Anspruch 3 oder Anspruch 4, bei dem die Aminosäure ausgewählt ist aus natürlichen Aminosäuren, substituierten Derivaten, Analoga und D-Formen derselben.
  7. Verfahren nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, bei dem jede Schwanzgruppe die gleiche oder verschieden ist und eine lipophile Gruppe umfasst, die aus einer geraden oder verzweigtkettigen Fettsäure, einem Alkohol oder Aldehyd mit mindestens 8 Kohlenstoffatomen; einem lipidischen Aminosäure-Analogon; einem Prostaglandin; einem Leukotrien; einem Mono- oder Diglycerid; einem Sterol; einem Sphingosin- oder Ceramid-Derivat; und einem Silicium- oder Halogen-substituierten Derivat einer derartigen lipophilen Gruppe ausgewählt ist.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem jede lipophile Gruppe einen C10- bis C14-Kohlenwasserstoff umfasst.
  9. Verfahren nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, bei dem jedes Konjugat weiter eine Abstandshaltergruppe umfasst, welche die Kopfgruppe mit der Schwanzgruppe verknüpft.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem die Abstandshaltergruppe hydrophil ist.
  11. Verfahren nach Anspruch 9 oder Anspruch 10, bei dem die Abstandshaltergruppe ausgewählt ist aus Aminosäuren, Hydroxysäuren, Zuckern und Polyethylenglycol.
  12. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 9 bis 11, bei dem jedes der Konjugate die Struktur: X-Abstandshalter-Abstandshalter-Lipid-Lipid aufweist, worin X eine einzelne Aminosäure darstellt, die bei jedem der eingesetzten Konjugate verschieden ist.
  13. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem jedes Konjugat eine oder mehrere lipidische Aminosäuren einschließt, welche eine Seitenkette aufweisen, die den C10- bis C14-Kohlenwasserstoff umfasst.
  14. Verfahren nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, bei dem die nicht-kovalente Assoziation weiter zusätzliches lipidisches Material umfasst.
  15. Verfahren nach Anspruch 14, bei dem das zusätzliche lipidische Material ein Phospholipid oder einen Lipidzucker umfasst.
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