DD289469A5 - Verfahren zur herstellung von pharmazeutischen zubereitungen auf liposomenbasis mit antitumor-glykopeptiden als wirkkomponenten - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von pharmazeutischen Zubereitungen auf Liposomenbasis mit Antitumor-Glykopeptiden als Wirkkomponenten. Liposomendispersionen aus diesen Komponenten zeigen einen verstaerkten Antitumoreffekt im Vergleich zum freien Glykopeptid. Anwendungsgebiet ist die Medizin bzw. die pharmazeutische Industrie. Das erfindungsgemaesze Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dasz zwischen basischen Substituenten der Antitumor-Glykopeptide und sauren Gruppen in den zur Vesikelbildung verwendeten Amphiphilen Wechselwirkungen erfolgen. Dadurch wird eine weitgehende Bindung des Wirkstoffe an die Liposomen erreicht. Die erfindungsgemaeszen pharmazeutischen Zubereitungen zeichnen sich durch relativ einheitliche Groesze (50-200 nm) und hohe Lagerstabilitaet aus.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von pharmazeutischen Zubereitungen enthaltend ein zur Vesikelbildung befähigtes Amphiphil, ein Steroid, eine geladene Lipidkomponente und ein Antitumor-Glykopeptid. Liposomendispersionen aus diesen Komponenten zeigen einen verstärkten Antitumoreffekt im Vergleich zum freien Glykopeptid. Anwendungsgebiet ist die Medizin bzw. die pharmazeutische Industrie.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Liposomen sind geschlossene, kugelförmige Strukturen aus Amphiphilen, die wäßrige Kompartimente einschließen. Wegen ihrer Ähnlichkeit mit Zelloberflächen dienen sie einmal als Membranmodelle, wegen ihrer Fähigkeit Pharmaka, Diagnostika einzuschließen, haben sie als Carrier Bedeutung. Nahezu alle Klassen pharmakologisch aktiver Substanzen wurden in Liposomen verkapselt. Als Ergebnis der vesikulären Verkapselung werden in der Literatur (Knight, C.G., Herausgeber, Liposomes: From physical structure to therapeutic applications, Elsevier 1981, Seite 166) u.a. folgende Vorteile herausgestellt:

1. Liposomen können so hergestellt werden, daß sie von spezifischen Geweben aufgenommen werden.

2. Die Pharmakokinetik von Arzneimitteln kann durch liposomalen Einschluß in günstiger Weise verändert werden.

3. Chemisch und metabolisch labile Pharmaka können durch vesikuläre Verkapselung vor Reaktivierung geschützt werden.

4. Liposomen geeigneter Lipidzusammensetzung wirken als immunologische Adjuvanzien und verstärken die Immunantwort gegen ein verkapseltes Antigen.

Aufgrund dieser Vorteile wurden eine große Zahl biologisch aktiver Verbindungen in Liposomen eingeschlossen. Zu Übersichten vergleiche Gregoriadis, G., (Herausgeber) Liposome Technology, MII, CRC Press 1984; Arndt, D., Fichtner, I.: Liposomen, Darstellung, Eigenschaften, Anwendung, Akademie Verlag 1986, Gregoriadis, G., (Herausgeber) Liposomes as drug carriersrecent trends and progress, John Wiley & Sons 1988. Bei der Anwendung liposomal verkapselter Antineoplastika beobachtet man häufig eine Verminderung der Toxizität bei etwa gleicher therapeutischer Wirksamkeit von liposomaler und freier Form des Antineoplastikums.

Rahman, A., u.a.. Cancer Res. 45 (1985)796—803, berichten für Doxorubicin durch Liposomeneinschluß von einer verminderten Herzkonzentration und -toxizität sowie geringerer Leukopenie.

Von Patel, K. R., und Baldeschieler, J. D., Int. J. Cancer 34 (1984) 717-723, wird für liposomales Zytarabin ein Depoteffekt mit leicht verbesserter therapeutischer Wirksamkeit beobachtet.

Auch dieliposomale Verkapselung von Antitumor-Glykopeptide, z.B. Bleomyzin, ist beschrieben. Sur. P.E. U.A., Indian J. Exp. Biol. 22 (1984) 115-119, berichten von verminderter Toxizität (Blutbild) und einem verbesserten therapeutischen Effekt des vesikulär gebundenen Bleomyzins im Vergleich zum freien Pharmakon. Bei intracerebraler Applikation von liposomalem Bleomycin beobachten Firth, G.A., u.a., J. Neurol. Neurosurg. Psychiat. 47 (1984) 585-589, lange Retention ohne histologische Schäden in Rattenhirnen.

Nachteilig bei den bisher verwendeten liposomalen Pharmaka ist weiterhin der Umstand, daß bei der Liposomenbildung nur ein sehr kleiner Teil des in der Dispersion vorhandenen pharmazeutischen Wirkstoffs in die Vesikel eingeschlossen wird. Der nicht verkapselte Anteil muß nach Liposomenbildung abgetrennt werden, z. B. durch Dialyse, Gelchromatographie, Ionenaustausch oder Zentrifugation.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung Antitumor-Glykopeptid-haltiger Liposomen hoher Beladungsdichte, hoher Stabilität und im Vergleich zum freien Pharmakon verbesserter therapeutischer Wirksamkeit.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, pharmazeutische Zubereitungen auf Liposomenbasis mit Antitumor-Glykopeptiden als Wirkkomponente herzustellen, die einen hohen Anteil des eingesetzten Wirkstoffs gebunden enthalten und eine besonders gute therapeutische Wirksamkeit bei verschiedenen Tumoren ergeben.

Erfindungsgemäß werden pharmazeutische Zubereitungen hergestellt enthaltend

a) ein natürliches, halbsynthetisches oder vollsynthetisches Phospholipid der Formel I

CH^-O-R.

R₂-O-CH

CH.

CH

worin R₁ und R₂ Сю-Сго-АІкапоуІ, -Alkenoyl, -Alkyl, Alkenyl darstellen, b) ein Steroid der Formel Il

CH.

R = H Cholesterol

R = C₂H₅ ß-Sitosterol

eine geladene Lipidkomponente.

Eine geladene Lipidkomponente ist vorzugsweise das Anion des Dicetylphosphats, der Palmitinsäure, der Stearinsäure,

sowie das Anion eines Phospholipids, z. B. Phosphatidylserin oder Phosphatidsäure, bzw. das Anion eines Sphingolipids, z. B.

Sulfatid.

ein Antitumor-Glykopeptid.

Ein Antitumor-Glykopeptid ist vorzugsweise Bleomycin (Gemisch 70% Bleomycin A₂,30% Bleomycin B₂), Bleomycetin

(Bleomycin A₅), Peplomycin, Liblomycin.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß zwischen basischen Substituenten der Antitumor-Glykopeptide und sauren Gruppen in den zur Vesikelbildung verwendeten Amphiphilen Wechselwirkungen bestehen. Dadurch wird eine weitgehende Bindung des Wirkstoffs an die Liposomen erreicht. Zusatzmaßnahmen zur Abtrennung des nicht vesikulär verkapselten Antitumor-Glykopeptids (Dialyse, Gelchromatographie, Zentrifugation) sind daher in den meisten Fällen nicht erforderlich.

Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitungen zeichnen sich durch relativ einheitliche Größe (50-200 nm) und hohe Lagerstabilität aus. Die Lagerung kann dabei sowohl in flüssiger Form bei Temperaturen von +4 bis +8⁰C als auch in lyophilisierter Form nach Zusatz von Kryoprotektoren wie Trehalose oder Saccharose erfolgen. Die Resuspendierung des Lyophilisats durch Zugabe von Wasser und einfaches Schütteln liefert ohne weitere Trennoperationen Liposomen-Wirkstoff-Komplexe, die in ihrer therapeutischen Wirksamkeit frisch hergestellten Liposomen entsprechen.

Das zur Herstellung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitungen angewandte Gemisch der Phospholipide der Formel I, Steroide der Formel Il und der geladenen Lipidkomponenten steht im Molverhältnis von 1:0,3:0,1 bis 1:1:0,5. Dabei werden die Mengen von geladener Lipidkomponente und Antitumor-Glykopeptid so gewählt, daß ein Molverhältnis von 2:1 bis 10:1 besteht.

Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitungen liegen in steriler, wäßriger Dispersion der Liposomen in phosphatgepufferter, isotonischer Kochsalzlösung vor, ggf. enthält die Dispersion Zusätze, die die Erhaltung der Liposomenstruktur bei der Lyophilisierung gewährleisten, insbesondere Trehalose oder Saccharose.

Die nachfolgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung ohne sie zu beschränken. Temperaturangaben erfolgen in Graden Celsius.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1

Eine Mischung aus 1 250 mg Eiphosphatidylcholin (Herstellung entsprechend Singleton et al., J. Am. Oil Chemist's Soc. 42 [1965] 53-56), 625 mg Cholesterol (entspr. AB DDR, DAB 7, USPXVIII), 90mg Dicetylphosphat (Dihexadecylhydrogenphosphat), reinst, (Serva) und 75mg eines Gemischsder Bleomycine A₂ und B₂ (50-70% A₂, 25-35% B₂) wird in 24ml steriler, Calcium-freier, Phosphat-gepufferter (pH7,2-7,4) Kochsalzlösung (Dulbecco) dispergiert.

Die entstandene Dispersion multischichtiger Liposomen wird bei 0-5⁰C in einem Gefäß intermittierend (gleiche Puls- und Pausenzeiten) bei 20KHz solange beschallt, bis ein Trübungswert 0,1 erreicht ist. Nach 30minütigem Stehen wird bei 7°C und 10⁵g eine Stunde zentrifugiert. Der Überstand wird vom Pellet abdekantiert und durch Sterilfiltration (Membranfilter 0,8; 0,45 und 0,2 μηι) keimfrei gemacht. Die erhaltene Liposomendispersion ist bei 4°C lagerfähig und eignet sich zur parenteralen (i.v.) Applikation.

Beispiel 2

Eine Mischung aus 1000mg hydriertem Eiphosphatidylcholin (Herstellung entsprechend Nuhnetal., Pharmazie 40 [1985] 705-709), 500mg Cholesterol und 60mg Dicetylphosphat (Dihexadecylhydrogenphosphat) wird in 10ml Cyclohexan gelöst und der nach Gefriertrocknung erhaltene Rückstand bei50°C mit einer Lösung von 60mg Bleomycin (Gemisch A₂ und B₂ wie in Beispiel 1) in 20 ml steriler, Calcium-freier, Phosphat-gepufferter (pH 7,2-7,4) Kochsalzlösung versetzt und die Liposomendispersion bei 50-55⁰C nacheinander durch Filtermembranen 2,0; 1,0; 0,8; 0,4 und 0,2 μηι extrudiert. Die erhaltene Liposomendispersion ist bei 4°C lagerfähig und eignet sich zu perenteralen (i.v.) Applikation.

Beispiel 3

Eine Mischung aus 280mg Eiphosphatidylcholin (Herstellung entsprechend Singletonetal., J. Am. Oil Chemist's Soc. 42 [1965] 53-56), 100mg ?-Sitosterol, reinst, (VEB Jenapharm), 9,0mg Palmitinsäure, p. A., (Serva) und 15mg Bleomycin A₅ wird in 5,5ml steriler, Calcium-freier, Phosphat-gepufferter (pH 1',2-7',4) Kochsalzlösung (Dulbecco) dispergiert und in gleicherweise weiterbehandelt wie Beispiel 1 beschrieben. Die erhaltene Liposomendispersion ist bei 4°C lagerfähig und eignet sich zur parenteralen (i.v.) Applikation.

Beispiel 4

Eine Mischung aus 700mg hydriertem Eiphosphatidylcholin (Herstellung entsprechend Nuhnetal.,Pharmazie40 [1985] 705-709), 300mg Natrium-i^-di-O-cis-octa-decenoyD-S-sn-phosphatidyl-tSJ-serin (Herstellung entsprechend Browning et al., Chem. and Physics of Lipids 24 [1979] 103-110), 500mg Cholesterol und 75 mg Bleomycin-4-(Gemisch wie Beispiel 1) wird in 20ml steriler, Calcium-freier, Phosphat-gepufferter (pH 7,2-7,4) Kochsalzlösung versetzt und in gleicherweise weiterbehandelt wie in Beispiel 1 beschrieben. Die erhaltene Liposomendispersion ist bei4°C lagerfähig und eignet sich zur parenteralen (i.v.) Applikation.

Beispiel 5

Eine Mischung aus 1 000mg hydriertem Eiphosphatidylcholin (Herstellung entsprechend Nuhn et. al., Pharmazie 40 [1985] 705-709), 500mg Cholesterol und 60 mg Dicetylphosphat (Dihexadecylhydrogenphosphat) wird in 30 ml eines 1:1 Gemisches von Diisopropylether und Chloroform gelöst, mit einer Lösung von 60mg Bleomycin (Gemisch wie in Beispiel Din 20ml steriler, Calcium-freier, Phosphat-gepufferter (pH 7,2-7,4) Kochsalzlösung versetzt und kurzzeitig bis zur Bildung einer gleichmäßigen Emulsion beschallt (20 KHz). Anschließend wird am Rotationsverdampfer bei mäßigem Vakuum das organische Lösungsmittel abdestilliert und die sich über eine Gelzwischenphase bildende Liposomendispersion über Filtermembranen extrudiert wie in Beispiel 2 beschrieben. Die erhaltene Liposomendispersion ist bei 4°C lagerfähig und eignet sich zur parenteralen (i.v.) Applikation.

Beispiel 6

Eine Mischung aus 1 250 mg Eiphosphatidylcholin (Herstellung entsprechend Singleton et. al., J. Am. Oil Chemist's Soc. 42 [1965] 53-56), 400 mg Cholesterol, 250 mg Sulfatide, rein (Sigma) und 45mg Bleomycin (Gemisch wie in Beispiel 1) wird in 24 ml steriler, Calcium-freier, Phosphat-gepufferter (pH 7,2-7,4) Kochsalzlösung (Dulbecco) dispergiert und in gleicher Weise weiterbehandelt wie in Beispiel 1 beschrieben. Die erhaltene Liposomendispersion ist bei 4°C lagerfähig und eignet sich zur parenteralen (i.v.) Applikation.

Beispiel 7

Eine Mischung aus 2100 mg Eiphosphatidylcholin (Herstellung entsprechend Singleton et. al., J. Am. Oil Chemist's Soc. 42 (1965) 53-56), 1 050 mg Cholesterol, 150mg Dicetylphosphat (Dihexadecylhydrogenphosphat), 150 mg Bleomycin (Gemisch wie in

Beispiel 1) wird in 40 ml steriler, Calcium-freier, Phosphat-gepufferter (pH 7,2-7,4), Saccharose-haltiger (338 )

Kochsalzlösung dispergiert und in gleicherweise weiterbehandelt wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Liposomendispersion wird in einer Gefriertrocknungsanlage lyophilisiert und unter Schutzgas verschlossen.

Vordem Gebrauch werden zu diesem Trockenpräparat unter sterilen Bedingungen 40 ml destilliertes Wasser (steril, pyrogenfrei) gegeben und das Gefäß auf einem Vortex-Mischer zehn Minuten lang geschüttelt. Die resultierende Liposomendispersion eignet sich zur parenteralen (i.v.) Applikation.

Claims (4)

1. Verfahren zur Herstellung von pharmazeutischen Zubereitungen enthaltend

a) ein natürliches, halbsynthetisches oder vollsynthetisches Phospholipid der Formel I

b) ein Steroid der Formel Il

c) eine geladene Lipidkomponente.

Eine geladene Lipidkomponente ist vorzugsweise das Anion des Dicetylphosphats, der Palmitinsäure, der Stearinsäure, sowie das Anion eines Phospholipids, z. B. Phosphatidylserin oder Phosphatidsäure, bzw. das Anion eines Sphingolipids, z. B. Sulfatid.

d) ein Antitumor-Glykopeptid.

Ein Antitumor-Glykopeptid ist vorzugsweise Bleomycin (Gemisch 70% Bleomycin A₂,30% Bleomycin B₂), Belomycetin (Bleomycin A₅), Peplomycin, Liblomycin.

e) eine Trägerflüssigkeit und zusätzliche Hilfsstoffe

und, dadurch gekennzeichnet, daß man in an sich bekannter Weise aus den unter a—e genannten Komponenten Liposomendispersionen herstellt und nach der Liposomenherstellung bzw. der Resuspendierung lyophilisierter Präparate keine Trennoperationen durchführt und die Gesamtmenge des eingesetzten Antitumor-Glykopeptids zur therapeutischen Anwendung kommt.

2. Verfahren gemäß Punkt 1 zur Herstellung von pharmazeutischen Zubereitungen enthaltend Phospholipide der Formel I, Steroide der Formel Il und eine geladene Lipidkomponente in einem Molverhältnis von 1:0,3:0,1 bis 1:1:0,5.

3. Verfahren gemäß Punkt 1 und 2 zur Herstellung von pharmazeutischen Zubereitungen bei dem das Molverhältnis von geladener Lipidkomponente und Antitumor-Glykopeptid zwischen 2:1 und 10:1 liegt.

4. Verfahren gemäß Punkt 1-3 zur Herstellung von pharmazeutischen Zubereitungen, dadurch gekennzeichnet, daß man in an sich bekannter Weise den Prozeß zur Herstellung der Liposomendispersionen so gestaltet, daß der Vesikeldurchmesser zwischen 30-250nm, vorzugsweise zwischen 80-130 nm liegt.