DE19918088A1

DE19918088A1 - Glycosyl-Inosit-Phospho-Ceramide (GIPC), Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung

Info

Publication number: DE19918088A1
Application number: DE19918088A
Authority: DE
Inventors: Herbert Wiegandt; Richard Jennemann
Original assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Current assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Priority date: 1998-06-03
Filing date: 1999-04-21
Publication date: 2000-02-24

Abstract

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Isolierung von Glycosyl-Inosit-Phopho-Ceramiden und ihre Verwendung als Immunmodulatoren zur Verfügung. Das erfindungsgemäße Verfahren weist die folgenden grundlegenden Schritte auf: DOLLAR A A) Herstellen eines Aufschlusses von Basidiomyceten; DOLLAR A B) Entfernen des Wassers aus dem Aufschluss; DOLLAR A C) Herstellen einer Suspension des getrockneten Aufschlusses in einem organischen Lösungsmittel; DOLLAR A D) Trennen der Suspension in einen Festanteil und einen Überstand; und DOLLAR A E) Isolieren der Glycosyl-Inosit-Phospho-Ceramide aus dem Überstand mittels einer Säulenchromatographie. DOLLAR A Die Glycosyl-Inosit-Phopho-Ceramide weisen die Grundstruktur X-Manß-2Ins1-Phospho-Ceramid, wobei X ein glycosydischer Substituent ist.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Glycosyl-Inosit-Phospho-Ceramide (GIPC), ihre Isolierung aus Basidiomyceten und ihre Verwendung als Immunmodulatoren.

Als Immunmodulatoren bzw. Immunadjuvantien werden Stoffe bezeichnet, welche die Immunantwort auf andere Stoffe bei der Gabe in den Körper beeinflussen, im Falle der Adjuvantien beispielsweise zu verstärken vermögen. Immunmodulatoren können für die Effektivität von Impfstoffen von entscheidender Bedeu tung sein. Immunmodulatoren sind im Idealfall keine eigenen Antigene, so daß das Immunsystem keine gegen die Modulatoren gerichteten Antikörper bildet. Eine weitere Anforderung an Immunmodulatoren ist die Abwesenheit von unerwünschten Nebenwirkungen, wie Pyrogenität, Endotoxin-Wirksamkeit oder andere toxische Auswirkungen auf den mit ihnen behandelten Organismus. Allerdings zeigen viele, gerade die besonders wirksamen, Immunmodulatoren solche Nebenwirkungen und eine eigene Antigenizität, die ihre Verwendung bei der Immunisierung einschränken oder beispielsweise auf den Einsatz bei Tieren beschränken, bei denen solche Nebenwirkungen hinnehmbar sind. Darüberhinaus ist es bei aus biologischem Material isolierten Substanzen wichtig, daß ihre chemische Reinheit und ihre Unbedenklichkeit für den geplanten Einsatz garantiert werden können. Auch dies ist nicht bei allen derzeit am Markt befindlichen Immunmodulatoren gewährleistet.

Beispiele für bekannte Immunadjuvantien sind Mineralöle, Aluminiumverbindungen und inaktivierte Mycobakterien.

Die oben geschilderten Nachteile bei der Anwendung der bekannten Immunmodulatoren ließen den Wunsch nach nebenwirkungsfreien Immunmodulatoren unbeantwortet. Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, neue Immunmodulatoren zur Verfügung zu stellen, welche eine gute immunmodulatorische Wirkung aufweisen und die zugleich frei von Nebenwirkungen sind.

Diese Aufgabe wird durch die Gegenstände der Patentansprüche gelöst.

Glycolipide sind in die Plasmamembran eukaryontischer Zellen eingefügte Verbindungen, bei denen Zuckerreste in verschiedener Art und Weise an Lipide angeheftet sind. Bei Bakterien und Pflanzen stammen fast alle Glycolipide von Lipiden auf Glycerinbasis ab, während bei tierischen Zellen fast immer Ceramid, ein Amid aus einer Fettsäure mit einem 1,3-Hydroxy-2-amino-alkan (Sphingoid), die Ausgangsverbindung darstellt. Dieses Sphingoid kann weiter durch Doppelbindungen und Hydroxy-Gruppen modifiziert sein. Die Zuckerreste variieren nach Zahl, Typ und Bindung untereinander in starkem Maße. Sie sind über die 1-Hydroxy-Gruppe des Sphingoids mit dem Ceramid verbunden.

Der vorliegenden Erfindung liegen Untersuchungen an Basidiomyceten zugrunde. Es wurde überraschenderweise gefunden, daß eine aus Basidiomyceten isolierbare Stoffklasse immunmodulatorische Eigenschaften aufweist. Diese konnte als eine Gruppe von Glycosyl-Inosit-Phospho-Ceramiden identifiziert und als Basidiolipide bezeichnet werden.

Demgemäß ist die vorliegende Erfindung gerichtet auf ein Verfahren zur Isolierung von Glycosyl-Inosit-Phospho-Ceramiden aus Basidiomyceten. Dieses Verfahren weist die folgenden grundlegenden Schritte auf:

A) Herstellen eines Aufschlusses von Basidiomyceten;
B) Entfernen von Wassers aus dem Aufschluss;
C) Herstellen einer Suspension des getrockneten Aufschlusses in einem organischen Lösungsmittel;
D) Trennen der Suspension in einen Festanteil und einen Überstand; und
E) Isolieren der Glycosyl-Inosit-Phospho-Ceramide aus dem Überstand mittels Säulenchromatographie.

Das Aufschliessen der Zellen (Schritt A)) kann unter zusätzlicher Zugabe von Wasser erfolgen, was den entstehenden Brei geschmeidiger macht. Das eigentliche Aufschliessen erfolgt üblicherweise mechanisch, d. h. durch Zerkleinern der Zellen mit einem Homogenisator oder einem Pürierstab.

Schritt A) kann vorzugsweise folgende Teilschritte umfassen:

1. Homogenisieren von Basidiomyceten;
2. Zumischen von Wasser in einem Volumenverhältnis von 1 : 1 bis 4 : 1 Volumenteile Wasser zu Volumenteilen homogenisierter Basidiomyceten;
3. Rühren des Ansatzes für 1 Stunde bei 4°C.

Schritt B) umfasst vorzugsweise folgende Teilschritte:

1. Trennen des Aufschlusses in einen Festanteil und einen Überstand;
2. Trocknen des Überstandes.

Die Trennung in Schritt B1) kann beispielsweise durch Zentrifugieren erfolgen, während das Trocknen in Schritt B2) bevorzugt durch Rotationsvakuum-Trocknung erfolgen kann.

Zwischen den Teilschritten B1) und B2) werden vorzugsweise folgende Teilschritte durchgeführt:

1. Einengen des Überstandes auf ein Volumen, das 1 bis 10% des Ausgangsvolumens an Überstand beträgt; und
2. Dialysieren des eingeengten Überstandes gegen Wasser.

Das Dialysieren kann dabei unter üblichen Bedingungen durchgeführt werden, wobei jeweils ein größeres Volumen Wasser verwendet und dieses über mehrere Tage mehrmals ausgetauscht wird. Auch eine Druckdialyse ist möglich.

Alternativ zum obigen Vorgehen kann in Schritt B) der Aufschluss auch einfach lyophilisiert werden, ohne daß vorher im optionalen Schritt A2) Wasser zugesetzt wird. Dazu wird der Zellbrei nach dem Homogenisieren (Schritt A1)) zunächst eingefroren, beispielsweise bei -20°C.

Das für das erfindungsgemäße Verfahren verwendete organische Lösungsmittel (Schritt C)) ist vorzugsweise eine Mischung von Chloroform, Methanol und Wasser. Eine typische Zusammensetzung enthält 30 Volumenteile Chloroform, 60 Teile Methanol und 8 Teile Wasser (im folgenden mit 30 : 60 : 8 bezeichnet). Alternativ kann das Lösungsmittel auch eine Mischung von Propanol-2, n-Hexan und Wasser sein, beispielsweise aus 55 Teilen Propanol-2, 35 Teilen n-Hexan und 10 Teilen Wasser (55 : 35 : 10). Dieses Lösungsmittel findet vorzugsweise Verwendung, wenn der Zellaufschluß unmittelbar lyophilisiert worden war und danach resuspendiert werden soll. Zur Lösung des lyophilisierten Zellaufschlusses kann auch ein Lösungsmittel verwendet werden, welches Methanol und/oder Ethanol enthält bzw. das aus einer dieser Substanzen besteht. Selbstverständlich können auch andere Lösungsmittel verwendet werden, wenn diese geeignet sind, die erfindungsgemäßen Basidiolipide aus den Zellauf schlüssen zu extrahieren.

Ein bevorzugtes Trennverfahren in Schritt D) ist Zentrifugieren. Es sind jedoch auch andere Trennverfahren möglich, wie beispielsweise Filtrieren der Suspension, sofern gewährleistet ist, daß die zu isolierenden Basidiolipide im Lösungsmittel verbleiben und eine möglichst vollständige Trennung von anderen Bestandteilen erfolgt.

Nach dem Abtrennen von Überstand und Feststoffanteil kann der Festanteil aus Schritt D) nochmals in einem organischen Lösungsmittel suspendiert werden. Diese neuerliche Resuspendierung dient der Verbesserung der Ausbeute und kann mehrfach, typischerweise zweimal, durchgeführt werden. Die so erhaltene Suspension wird wiederum in einen Feststoffanteil und einen Überstand getrennt. Als Lösungsmittel können wiederum die oben beschriebenen Mischungen oder organischen Flüssigkeiten verwendet werden. Bevorzugt ist, insbesondere bei einem vorherigen Aufschluß mit Chloroform/Methanol/Wasser, die weitere Verwendung dieser Mischung, allerdings in einem Verhältnis von 60 Volumenteilen Chloroform, 35 Teilen Methanol und 8 Teilen Wasser, mithin mit einem höheren Anteil an Chloroform.

Es wird erfindungsgemäß bevorzugt, daß Schritt E), der den eigentlichen Isolierungsschritte darstellt, folgende Teilschritte umfasst:

1. Trocknen des in Schritt D) erhaltenen Überstandes oder der Überstände;
2. Suspendieren des Trocknungsrückstandes in einem organischen Lösungmittel;
3. Beschicken einer Ionenaustauschersäule mit der in Schritt E2) erhaltenen Suspension;
4. Auswaschen unerwünschter Substanzen mit dem organischen Lösungsmittel; und
5. Elution der Glycosyl-Inosit-Phospho-Ceramide mit einem organischen Lösungmittel, dem Anionen zu gegeben sind.

Die hierbei verwendeten Lösungsmittel können die gleichen sein wie bereits oben beschrieben. Zudem kann zur Elution der GIPC grundsätzlich das gleiche Lösungsmittel wie zur Suspendierung und zur Elution unerwünschter Substanzen verwendet werden. Maßgeblich für die erfolgreiche Elution ist, daß dem ver wendeten Lösungsmittel Anionen, beispielsweise in Form von Kaliumacetat oder Natriumchlorid, zugegeben worden ist. Eine geeignete Konzentration an Anionen ergibt sich beispielsweise durch die Verwendung einer 0,08 M Kaliumacetat-Lösung.

Alternativ können verschiedene Lösungsmittel für die Schritte verwendet werden. Beispielsweise kann die Resuspension in Schritt E2 und das Waschen (Eluieren unerwünschter Substanzen) mit Chloroform/Methanol/Wasser im Verhältnis 60 : 35 : 8 erfolgen und das anschließende Eluieren der GIPC mit 0.08 M Kalium acetat in Methanol.

Die Ionenaustauschersäule (Anionenaustauschersäule) wird hierbei vorzugsweise mit DEAE Sephadex A-25 (Fa. Pharmacia, Upsala) beschickt, das mit dem zur Suspendierung der GIPC verwendeten Lösungsmittel equilibriert wird.

Hierbei kann zwischen den Teilschritten E2 und E3 folgender Teilschritt durchgeführt werden:

1. Dialysieren der Suspension gegen Wasser.

Die zusätzliche Dialyse dient der Reinigung der die GIPC enthaltenden Lösung und führt zudem zu einer Entsalzung.

Das oben beschriebene, erfindungsgemäße Verfahren führt zu einer Lösung der erfindungsgemäßen GIPC in dem zur Elution verwendeten Lösungsmittel von hoher Reinheit. Für bestimmte Anwendungen und weitergehende Untersuchungen kann es darüberhinaus auch gewünscht sein, die verschiedenen, in der Lösung enthaltenen GIPC voneinander zu trennen. Dies kann erfindungsgemäß dadurch geschehen, daß das Verfahren den weiteren Schritt umfasst:

A) Auftrennen der verschiedenen, in Schritt E) isolierten Glycosyl-Inosit-Phospho-Ceramide mittels einer Silicagel-Trennsäule und einem Stufen gradienten von organischem Lösungsmittel.

Hierbei kann beispielsweise Silicagel Si60 LiChroprep Material (Fa. Merck, Darmstadt) verwendet werden, das in eine geeignete Säule gefüllt wird und mit Chloroform/Methanol im Verhältnis von 8 : 2 Volumenteilen gewaschen wird. Die Elution der verschiedenen GIPC erfolgt mittels eines Stufengradienten von Chloroform/Methanol/Wasser von 65 : 25 : 4 und 65 : 27 : 5 Volumenteilen.

Der verwendete Zellaufschluß wird vorzugsweise nur aus den Hüten von Basidiomyceten hergestellt. Die Basidiomyceten können beispielsweise zu den Species Agarius campestris oder Agaricus bisporus gehören, die sich beide als besonders geeignet zur Isolierung der erfindungsgemäßen Verbindungen herausgestellt haben und zudem leicht verfügbar sind.

Die vorliegende Erfindung ist weiterhin auf die Verwendung von Glycosyl-Inosit-Phospho-Ceramiden als Immunmodulatoren gerichtet. Vorzugsweise werden dabei die Glycosyl-Inosit-Phospho-Ceramide als Immunadjuvantien verwendet, sollen also einer Verstärkung der Immunantwort auf die Gabe von Antigenen dienen.

Die Glycosyl-Inosit-Phospho-Ceramide, die erfindungsgemäß verwendet werden können, sind beispielsweise erhältlich nach dem oben geschilderten Verfahren. Die zur erfindungegemäßen Verwendung geeigneten Glycosyl-Inosit-Phospho-Ceramide können dabei aus Basidiomyceten gewonnen werden. Es sind jedoch auch andere Quellen für diese Ceramid-haltigen Glykoinositphospholipide möglich, beispielsweise Pflanzen oder Tiere, oder auch andere Familien von Pilzen. Die Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung ist daher nicht beschränkt auf solche Glycosyl-Inosit-Phospho-Ceramide, die aus Basidiomyceten isolierbar sind, sofern sie nur die gewünschten, immunmodulatorischen Eigenschaften aufweisen, die sie für die vorliegende Verwendung geeignet machen.

Die Erfindung ist weiterhin gerichtet auf eine Gruppe von Glycosyl-Inosit-Phospho-Ceramiden mit immunoadjuvanter bzw. immunmodulatorischer Wirkung der allgemeinen Formel:

X-Manosylβ-2Ins1-Phospho-Ceramid,

wobei X ausgewählt ist aus -OH, [Fucα,2)-Galβ-, Galα-6[Fucα,2]-Galβ-, Galα-6Galα-6[Fucα,2]-Galβ- und Galα-6Galα-6Galα-6[Fucα,2]-Galβ- usw.; und wobei das Ceramid von einem Sphingoid und einer langkettigen Fettsäure, vorzugsweise einer C-22 Fettsäure oder einer C-24 Fettsäure, abgeleitet ist. Ins- bedeutet Inosit, Fuc- bedeutet Fucosyl, Gal- bedeutet Galactosyl. Die Definition von X läßt sich beliebig anhand der obigen Kette fortsetzen. Diese konkret genannten Verbindungen stellen nur bevorzugte Vertreter der Gruppe der Glycosyl-Inosit-Phospho-Ceramide dar, die eine immunadjuvante Wirkung aufweisen.

Vorzugsweise sind die Ceramidfettsäurebestandteile 2- Hydroxycarbonsäuren. Bevorzugt ist die C-22 Fettsäure 2-Hydroxy-Docosansäure, während die C-24 Fettsäure vorzugsweise 2-Hydroxy-Tetracosansäure oder 2-Methoxy-Tri cosansäure ist.

Bei dem in den erfindungsgemäßen Verbindungen vorhandenem Sphingoid handelt es sich bevorzugt um Phytosphingosin mit der Formel 1,3, 4-Trihydroxy-2-Amino-Octadecan.

Die Anwesenheit von Phosphat (PO₄ ^(-)) in den erfindungsgemäßen Verbindungen wurde durch NMR-Spektroskopie sowie durch colorimetrische Bestimmung mit Ammoniumheptamolybdat nachgewiesen.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen waren bei Anwendung im Kaninchen frei von pyrogener Wirkung. Bei Anwendung des dem Fachmann bekannten Limulus-Tests konnte kein Endotoxin bestimmt werden. Ebenfalls konnte keine hämolysierende Wirkung auf Schafserythrozyten nachgewiesen werden. Insgesamt erscheinen die erfindungsgemäßen Verbindungen mithin als nicht toxisch und frei von störenden Nebenwirkungen.

Die erfindungsgemäßen GIPC und ihre Verwendung weisen somit eine Reihe von Vorteilen auf. Sie werden aus einem biologisch einheitlichen und unbedenklichen Material gewonnen, die Methode ihrer Isolierung und Reindarstellung garantiert ihre chemische und biologische Reinheit, sie stellen Einzelkomponenten mit definierter Struktur dar, sie weisen sich im Tierversuch als starke Immunadjuvantien aus, sind selbst nur marginal immunogen und zeigen bei intraperitonealer und subkutaner Applikation beim Tier keinerlei Toxizität. Diese Eigenschaften prädestinieren die erfindungsgemäßen Verbindungen als immunadjuvante Zusätze bei der Herstellung von Impfstoffen oder weiteren Immunmodulatorischen Ver wendungen. Beispielsweise können die erfindungsgemäßen Verbindungen als Immunmodulatoren als Ersatz für Mistellektine in der Tumortherapie verwendet werden.

Weitere bevorzugte Anwendungen der erfindungsgemäßen Verbindungen beruhen auf ihrer antibakteriellen, antiparasitären, antifungalen, antiviralen und/oder antidiabetischen Wirkung.

Im folgenden soll die vorliegende Erfindung anhand von Beispielen erläutert werden, wobei auf die beigefügten Zeichnungen Bezug genommen wird, in denen folgendes dargestellt ist:

Fig. 1 ist ein Graph, der die immunadjuvante Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen zeigt

Fig. 2 ist ein Graph, der die Dosisabhängigkeit der immunadjuvanten Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen zeigt

Fig. 3 ist ein Graph, der den zeitlichen Verlauf der immunadjuvanten Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen zeigt

Fig. 4 ist ein Graph, der die immunadjuvante Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen bei Immunisierung mit verschiedenen Antigenen zeigt.

Zur Isolierung stehen verschiedene, oben beschriebene Verfahrensmodifikationen zur Verfügung, die man allgemein in wässerige und organische Isolierungen unterteilen kann. Bei den Isolierverfahren mit organischem Lösungmittel wird dabei unmittelbar im Anschluß an das Herstellen eines Zellaufschlusses in Schritt A) der Aufschluß lyophilisiert und danach in dem organischen Lösungsmittel resuspendiert. Demgegenüber wird der Zellaufschluß beim wässerigen Isolierverfahren vor seiner Trocknung in Schritt B noch verschiedenen Zwischenschritten unterworfen.

Beispiel 1 Wässerige Isolierung von Glycosyl Inosit-Phospho-Ceramiden

Von geeigneten Basidiomyceten werden die Stiele entfernt. 2 kg der Hüte werden unter Verwendung eines Pürierstabes zu einem Brei zerkleinert, mit mindestens 4 l Wasser versetzt und für eine Stunde bei 4°C stehengelassen, wobei optional permanent oder intermittierend der Zellaufschluß gerührt werden kann. Nach Zentrifugation des Ansatzes (4000 l/min. 20 min. 4°C) wird der wässerige Überstand im Rotationsvakuum bei Zimmertemperatur auf ein Volumen von 100-200 ml eingeengt. Alternativ kann die Einengung auch bis zur völligen Trocknung erfolgen. Im Anschluß an die Einengung erfolgt eine ausgiebige Dialyse gegen destilliertes bzw. demineralisiertes Wasser für mehrere Tage.

Das Dialysat wurde wiederum eingedampft, beispielsweise durch eine erneute Rotationsevakuierung.

Der Rückstand wird in 500 ml Chloroform/Methanol/Wasser (30 : 60 : 8 Volumenteile) resuspendiert. Die Suspension wird erneut zentrifugiert (4000 l/min. 20 min. 4°C oder 4000 l/min. 10 min. bei Raumtemperatur) und der Überstand weiterverwendet.

Optional kann der Rückstand nochmals in Chloroform/Methanol/Wasser (diesmal 60 : 35 : 8 Volumenteile), resuspendiert und erneut unter gleichen Bedingungen zentrifugiert werden. Dies kann zwei- oder mehrmals durchgeführt werden, um sicherzustellen, daß alle erfindungsgemäßen GIPC aus dem Zellaufschluß gelöst werden.

Die Überstände werden vereinigt und wieder durch Rotationsvakuum eingedampft. Der zurückbleibende Rückstand wird in einem geeigneten Volumen eines organischen Lösungsmittels resuspendiert, beispielsweise wieder in Chloroform/Methanol/Wasser (60 : 35 : 8). Eine 250 ml Glassäule wird mit DEAE-Sephadex A-25 befüllt und mit dem gleichen Lösungsmittel equilibriert. Die Suspension wird auf die Säule gegeben, die daraufhin mit 1 l Chloroform/Methanol/Wasser (60 : 35 : 8) und danach mit 1 l Methanol gewaschen wird, um unerwünschte Verunreinigungen zu entfernen.

Im Anschluß werden die erfindungsgemäßen Ceramide mit einer 0.08 M Kaliumacetat-Lösung in Methanol eluiert, beispielsweise mit 1 l Methanol. Das Eluat wird wiederum eingedampft und nach Resupension in Wasser für mehrere Tage gegen Wasser dialysiert, wobei das Wasser häufig gewechselt wird. Das die erfindungsgemäßen GIPC enthaltende Dialysat kann weiterverwendet oder lyophilisiert werden.

Beispiel 2 Isolierung von Glycosyl-Inosit-Phospho-Ceramiden mit organischem Lösungsmittel

Von geeigneten Basidiomyceten werden die Stiele entfernt. 2 kg der Hüte werden unter Verwendung eines Pürierstabes zu einem Brei zerkleinert und nach Einfrieren bei -20°C lyophilisiert. Das Lyophilisat wird in 20 ml pro g des Lyophilisats eines organischen Lösungmittels, beispielsweise Propanol-2/n-Hexan/ Wasser (55 : 35 : 10 Volumenteile), resuspendiert und die Suspension für 1 Std. bei 50°C inkubiert. Die Suspension wird erneut zentrifugiert (4000 l/min. 20 min. 4°C oder 4000 l/min. 10 min. bei Raumtemperatur) und der Überstand weiterverwendet.

Optional kann der Rückstand nochmals in Propanol-2/n-Hexan/Wasser (55 : 35 : 10) resuspendiert und erneut unter gleichen Bedingungen zentrifugiert werden. Dies kann zwei- oder mehrmals durchgeführt werden, um sicherzustellen, daß alle erfindungsgemäßen GIPC aus dem Zellaufschluß gelöst werden.

Die Überstände werden vereinigt und wieder durch Rotationsvakuum eingedampft. Der zurückbleibende Rückstand wird in einem geeigneten Volumen eines organischen Lösungsmittels resuspendiert, beispielsweise in Chloroform/Methanol/Wasser (60 : 35 : 8). Eine 250 ml Glassäule wird mit DEAE Sephadex A-25 befüllt und mit dem gleichen Lösungsmittel equilibriert. Die Suspension wird auf die Säule gegeben, die daraufhin mit 1 l Chloroform/Methanol/Wasser (60 : 35 : 8) und danach mit 1 l Methanol gewaschen wird, um unerwünschte Verunreinigungen zu entfernen.

Im Anschluß werden die erfindungsgemäßen GIPC mit einer 0.08 M Kaliumacetat-Lösung in Methanol eluiert, beispielsweise mit 1 l Methanol. Das Eluat wird wiederum eingedampft und nach Resupension in Wasser für mehrere Tage gegen Wasser dialysiert, wobei das Wasser häufig gewechselt wird. Das die erfindungsgemäßen Ceramide enthaltende Dialysat kann weiterverwendet oder lyophilisiert werden.

Beispiel 3 Trennung der einzelnen erfindungsgemäßen Ceramide

Eine 250 ml Glassäule wird mit Silicagel Si60 LiChroprep befüllt und mit 500 ml Chloroform/Methanol (8 : 2 Volumenteile) equilibriert. Ein die GIPC von 2 kg Ausgangsmaterial enthaltendes Lyophilisat wird in 100 ml Chloroform/Methanol (8 : 2 Volumenteile) resuspendiert und auf die Säule gegeben. Die Säule wird mit 1 l dieses Lösungsmittels und im Anschluß mit 1 l Chloroform/Methanol/Wasser (65 : 25 : 4) gewaschen. Die Elution der erfindungsgemäßen GIPC erfolgt mittels eines Stufengradienten von Chloroform/Methanol/Wasser von 65 : 25 : 4 und 65 : 27 : 5 Volumenteilen in 100 ml Aliquots, die im Anschluß auf ihren Ceramid-Gehalt untersucht werden können. Bei Verwendung von Basidiomyceten finden sich u. a. die oben konkret genannten GIPC:

Manβ-2Ins1-Phospho-Ceramid,
[Fucα,2]-Galβ-6Manβ-2Ins1-Phospho-Ceramid,
Galα-6[Fucα,2]-Galβ-6Manβ-2Ins1-Phospho-Ceramid,
Galα-6Galα-6[Fucα,2]-Galβ-6Manβ-2Ins1-Phospho-Ceramid, und
Galα-6Galα-6Galα-6[Fucα,2]-Galβ-6Manβ-2Ins1-Phospho-Cer amid

Beispiel 4 Immunadjuvante Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen

Um eine immunadjuvante Wirkung nachweisen zu können, werden sechs Wochen alte Balb/c Mäuse mit bovinem Serum-Albumin (BSA) als Antigen immunisiert, dem die verschiedenen erfindungsgemäßen GIPC als potentielle Immunadjuvantien zu gegeben werden. Als Kontrolle wird einer Gruppe von Mäusen nur BSA verabreicht. Eine weitere Kontrollgruppe erhält BSA zusammen mit Monophosphoryllipid-A (MPL-A), das ein bekanntes Immunadjuvans darstellt.

Es werden dann jeweils 5 µg BSA intraperitoneal in Woche 0, 1 und 3 injiziert, wobei 4 Mäuse pro Ansatz verwendet werden. Immunseren werden eine Woche nach der letzten Immunisierung entnommen und ihr Gehalt an anti-BSA Antikörpern mittels eines ELISA-Tests unter üblichen Bedingungen nachgewiesen.

Fig. 1 zeigt die Ergebnisse einer "Optische Dichte Messung" der ELISA-Tests für verschiedene Antikörper, IgG-1, IgG-2a, IgG-2b und IgG-3.
Teil 1 von Fig. 1 zeigt hierbei die Ergebnisse bei Immunisierung nur mit BSA,
Teil 2 von Fig. 1 mit BSA + 20 µg Manβ-2Inosit1-Phospho-Ceramid,
Teil 3 von Fig. 1 mit BSA + 20 µg Gal-α-6[Fuc-α, 2]-Galβ-6Manβ-2Inosit1-Phospho-Ceramid,
Teil 4 von Fig. 1 mit BSA + 20 µg Gal-α-6Gal-α-6[Fuc-α,2]-Galβ-6Manβ-2Inosit1-Phospho-Ceramid,
Teil 5 von Fig. 1 mit BSA + 20 µg Gal-α-6Gal-a-6Gal-α-6[Fuc-α,2]-Galβ-6Manβ-2Inosit1- Phospho-Ceramid, und
Teil 6 von Fig. 1 mit 8 µg Monophosphoryllipid-A (MPL-A), einem vorbekannten Immunadjuvans, als Kontrolle.

Es zeigt sich, daß bei Injektion von BSA ohne Zusatzstoffe nur eine marginale Immunantwort bei den Mäusen erfolgt, während sie mit einem der erfindungsgemäßen GIPC oder mit MPL-A drastisch verstärkt wird. Hierbei zeigten sich bei allen untersuchten erfindungsgemäßen GIPC deutlich immunadjuvante Wirkungen, wenn auch mit individuellen Unterschieden der Komponenten. Bei den verschiedenen, untersuchten Antikörperty pen dominierte ganz klar IgG-1.

Beispiel 5 Dosisabhängigkeit der Ceramid-Immunadjuvansgabe

Wie in Beispiel 4 beschrieben, werden jetzt zwei Mäuse pro Ansatz mit BSA immunisiert, wobei verschiedenene Mengen an Galα-6Galα-6[Fucα,2]-Galβ-6Manβ-2Inosit1-Phospho-Ceramid zugegeben werden. Fig. 2 zeigt, daß bereits bei Zugabe von 5 µg erfindungsgemäßem Ceramid eine stark immunadjuvante Wirkung zu beobachten ist, die sich durch eine weitere Dosiserhöhung nur noch begrenzt steigern läßt.

Beispiel 6 Zeitlicher Verlauf der immunadjuvanten Wirkung

Wie in Beispiel 4 beschrieben, werden vier Mäuse pro Ansatz mit 5 µg BSA immunisiert, wobei 20 µg Galα 6Galα-6[Fucα,2]-Galβ-6Manβ-2Inosit1-Phospho-Ceramid zugegeben werden. Zu unterschiedlichen Zeiten nach der Immunisierung werden Serumproben entnommen und mittels ELISA der Antikör per-Titer bestimmt. Fig. 3 zeigt, daß bereits nach 3 Wochen eine deutliche Zunahme der IgG feststellbar ist, sich deren Titer jedoch in den darauffolgenden 2 Wochen stark erhöht.

Beispiel 7 Wirkung bei verschiedenen Antigenen

Wie in Beispiel 4 werden Mäuse mit BSA und einem weiteren Antigen, KLH-Gangliosid-Konjugat (keyhole-limpet Hemocyanin-Gangliosid IV2Fuc,II3NeuAc-Gg4Cer-Konjugat), immunisiert, wobei jeweils ohne und mit Immunadjuvans (Galα-6Galα6[Fucα,2]-Galβ-6Manβ-2Inosit1-Phospho-Ceramid) immunisiert wurde. Fig. 4 zeigt, daß bei Gabe von erfindungsgemäßen GIPC (schraffierte Säulen) die Immunantwort bei beiden Antigenen stark verbessert ist.

Claims

1. Verfahren zur Isolierung von Glycosyl-Inosit-Phospho-Ceramiden aus Basidiomyceten mit folgenden Schritten:

A) Herstellen eines Aufschlusses von Basidiomyceten;
B) Entfernen von Wassers aus dem Aufschluss,
C) Herstellen einer Suspension des getrockneten Aufschlusses in einem organischen Lösungsmittel,
D) Trennen der Suspension in einen Festanteil und einen Überstand, und
E) Isolieren der Glycosyl-Inosit-Phospho-Ceramide aus dem Überstand mittels Säulenchromatogra phie.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Schritt A) folgende Teilschritte umfasst:

1. Homogenisieren von Basidiomyceten;
2. Zumischen von Wasser in einem Volumenverhältnis von 1 : 1 bis 4 : 1 Volumenteile Wasser zu Volumenteilen homogenisierter Basidiomyceten zellen;
3. Rühren des Ansatzes für 1 Stunde bei 4°C.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß Schritt B folgende Teilschritte umfasst:

1. Trennen des Aufschlusses in einen Festanteil und einen Überstand;
2. Trocknen des Überstandes

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Trennen in Schritt B1) durch Zentrifugieren erfolgt.

5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Trocknen durch Rotationsvakuum-Trocknung erfolgt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen den Teilschritten B1) und B2) folgende Teilschritte durchgeführt werden:

1. Einengen des Überstandes auf ein Volumen, daß 1 bis 10% des Ausgangsvolumens an Überstand beträgt; und
2. Dialysieren des eingeengten Überstandes gegen Wasser.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt B) der Aufschluss lyophilisiert wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Lösungsmittel eine Mischung von Chloroform, Methanol und Wasser ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Lösungsmittel eine Mischung von Propanol-2, n-Hexan und Wasser ist.

10. Verfahren nach Anspruch einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Lösungsmittel Methanol und/oder Ethanol enthält.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Trennung in Schritt D) durch Zentrifugieren erfolgt.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Festanteil aus Schritt D) nochmals in einem organischen Lösungsmittel suspendiert wird und diese Suspension wiederum in einen Fest stoffanteil und einen Überstand getrennt wird.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß Schritt E folgende Teilschritte umfasst:

1. Trocknen des in Schritt D) erhaltenen Überstandes oder der Überstände;
2. Suspendieren des Trocknungsrückstandes in einem organischen Lösungmittel
3. Beschicken einer Ionenaustauschersäule mit der in der in Schritt E2) erhaltenen Suspension;
4. Elution unerwünschter Substanzen mit dem organischen Lösungsmittel, und
5. Elution der Glycosyl-Inosit-Phospho-Ceramide mit einem organischen Lösungmittel, dem Kaliumionen zugegeben sind.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen den Teilschritten E2) und E3) folgender Teilschritt durchgeführt wird:

1. Dialysieren der Suspension gegen Wasser.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß es den weiteren Schritt umfasst:

A) Auftrennen der verschiedenen, in Schritt E) isolierten Glycosyl-Inosit-Phospho-Ceramide mittels einer Silicagel-Trennsäule und einem Stufengradienten von organischem Lösungsmittel.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Aufschluß aus Hüten von Basidiomyceten hergestellt wird.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Basidiomyceten zur Species Agarius campestris gehören.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Basidiomyceten zur Species Agaricus bisporus gehören.

19. Verwendung von Glycosyl-Inosit-Phospho-Ceramiden als Immunmodulatoren.

20. Verwendung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Glycosyl-Inosit-Phospho-Ceramide als Immunadjuvantien verwendet werden.

21. Verwendung nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Glycosyl-Inosit-Phospho-Ceramide nach dem Verfahren eines der Ansprüche 1 bis 18 erhältlich sind.

22. Verwendung nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Glycosyl-Inosit-Phospho-Ceramide aus Basdiomyceten gewonnen sind.

23. Verwendung nach einem der Ansprüche 19 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Glycosyl-Inosit-Phospho-Ceramide die allgemeine Formel aufweisen:
X-Manβ-2Ins1-Phospho-Ceramid,
wobei X ausgewählt ist aus -OH, [Fucα,2]-Galβ-, Galα-6[Fucα,2]-Galβ-, Galα-6Galα-6[Fuc-,2]-Galβ- und Galα-6Galα-6Galα-6[Fucα,2]-Galβ-; und wobei das Ceramid von einem Sphingoid und einer langkettigen Fettsäure abgeleitet ist.

24. Glycosyl-Inosit-Phospho-Ceramid mit der allgemeinen Formel:
X-Manβ-2Ins1-Phospho-Ceramid,
wobei X ausgewählt ist aus -OH, [Fucα,2]-Galβ-, Galα-6[Fucα,2]-Galβ-, Galα-6Galα-6[Fuc-,2]-Galβ- und Galα-6Galα-6Galα-6[Fucα,2]-Galβ-; und wobei das Ceramid von einem Sphingoid und einer langkettigen Fettsäure abgeleitet ist.

25. Glycosyl-Inosit-Phospho-Ceramid nach Anspruch 24, wobei die langkettige Fettsäure eine C-22 Fettsäure oder C-24 Fettsäure ist.

26. Glyco-Inositol-Phospho-Ceramid nach Anspruch 24 oder 25, wobei die C-22 Fettsäure 2-Hydroxy-Docosansäure bzw. die C-24 Fettsäure 2-Hydroxy-Tetracosansäure ist.

27. Glyco-Inositol-Phospho-Ceramid nach einem der Ansprüche 24 bis 26, wobei das Sphingoid aus Phytosphingosin mit der Formel 1,3,4-Trihydroxy-2-Amino-Octadecan besteht.