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Diese
Erfindung betrifft im Allgemeinen die Modulation der Immunantwort
beim Menschen und bei Tieren, sowie insbesondere Lipide und/oder
lipid-ähnliche
Zubereitungen, um die Immunantwort sowohl systemisch als auch mucosal
auszulösen
oder zu modifizieren, welche Zubereitungen vorzugsweise, jedoch
nicht notwendigerweise durch transmucosale Verabreichung wirksam
sind. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung
von Lipiden und lipid-ähnlichen
Substanzen von nicht bakteriellem Ursprung in der Zubereitung einer
Zusammensetzung, um die mucosale und systemische Immunantwort auf
einen antigenen Auslöser
zu verstärken
oder zu modulieren, als ein Mittel, um den Infektions- und Immun-Krankheiten
vorzubeugen und diese zu behandeln.
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Hintergrund der Erfindung
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Die
Kontrolle von Infektionskrankheiten beim Menschen und bei Tieren
ist ein Gegenstand von großem
Interesse und der Forschung, da die vorhandenen Mittel zur Kontrolle
bekannte Mängel
aufweisen. Somit werden Antibiotika durch die Entwicklung von resistenten
Stämmen
von Mikroorganismen fortlaufend unwirksam gemacht.
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Eine
Gelegenheit hierzu bietet die Verstärkung der natürlichen
Immunantwort auf infektiöse
Agenzien in einem breiten Spektrum, als ein Mittel zur Behandlung
und Vorbeugung einer Vielzahl von Krankheiten. Da diejenigen Verfahren,
welche parenterale Injektionen beinhalten, ein Risiko von Infektionen
an der Injektionsstelle mit sich bringen können, insbesondere in den Ländern der
Dritten Welt, würde
es vorzuziehen sein, dass irgendeine solche Maßnahme auf dem Wege der oralen
Verabreichung wirksam sein soll, obwohl dies nicht ausschließlich so
ist.
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Es
wurde postuliert, dass bestimmte abgetötete Bakterien und Lipidextrakte
derselben, die in die Liposomen eingebaut sind, die Immunantwort
gegenüber
bestimmten Protein-Antigenen verstärken können, nachdem sie an Tiere
verabreicht wurden. Die Antigenizität von bestimmten bakteriellen
Lipiden, die parenteral verabreicht wurden, ist bekannt, und eine
Fähigkeit,
die Immunmodulation auszulösen,
wurde für
wenige lipid-ähnliche,
chemische Strukturen, die parenteral verabreicht wurden, beschrieben.
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Die
Steigerung der Wachstumsrate bei jungen Tieren und die Verminderung
des Auftretens von Durchfall bei Tieren, welche abgetötete bakterielle
Zubereitungen auf oralem Weg erhalten haben, wurde ebenso beschrieben,
und es wurde beschrieben, dass eine Steigerung der Wachstumsrate
bei Tieren, welche Lipide enthaltende Extrakte von solchen bakteriellen
Zubereitungen, die auf nicht lipid-artigen teilchenartigen Stoffen
adsorbiert waren, sowie bei Tieren, welche in ähnlicher Weise verabreichte
Zubereitungen von ganzen abgetöteten
Bakterien erhalten haben, erreichbar ist. Es wurde ebenso gezeigt,
dass ein Lipidextrakt von Bakterien, der mit Chloroform/Methanol
erhalten wurde und in Form von Liposomen über den Mund verabreicht wurde, die
zelluläre
und die Antikörper-Antwort
im Falle einer anschließenden
Auslösung
des Immunsystems verstärken
kann.
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Es
ist ebenso bekannt, dass antigene Substanzen aus Protein, die ausgehend
von den Eingeweiden Zugang zu dem reticulo-endothelialen System über das
Lymphgewebe in der Dünndarmwand
erhalten, zum Beispiel durch die Peyer'schen Plaques. Es ist darüber hinaus
bekannt, dass solche Materialien viel leichter Zugang erhalten,
falls sie in Liposomen, Bilosomen oder ähnlichen, Lipide enthaltenden
Vesikeln eingebaut sind, oder wenn sie, zum Beispiel durch Polyethylenglykol,
zu Kügelchen
geformt werden.
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Im
Allgemeinen gibt es ein geringes Wissen über die Identität von Lipiden,
welche die Immunantwort in Tieren und Menschen modulieren können, oder über die
Bedingungen, die notwendig sind, um die Verabreichung von Lipiden
für diesen
Zweck wirksam zu machen, insbesondere im Fall einer oralen Verabreichung.
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Es
ist nunmehr bekannt, dass es vielmehr theoretische Vorteile geben
kann, wenn Antigene und Hilfsstoffe über die Oberflächen der
Schleimhaut Zugang zum Immunsystem erhalten, als durch parenterale
Verabreichung, in dem Sinn, dass der Zugang zum Immunsystem erleichtert
wird.
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Wie
auch im Fall des gastro-enteralen Weges gibt der Zugang über die
Schleimhaut die Möglichkeit, die
mucosale sowie die systemische Immunantwort zu modulieren.
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Ein
wesentliches Ziel der Erfindung ist es, den Zugang zum Immunsystem
des Körpers
für bestimmte, nicht
bakterielle Lipide zu erleichtern, die vorzugsweise, jedoch nicht
notwendigerweise transmucosal und zum Teil oral verabreicht wurden,
wobei die Immunität
stimuliert und/oder die Immunantwort auf einen antigenen Reiz moduliert
wird. Ein Mittel wird ebenfalls gezeigt, wodurch die Immunantwort
gegenüber
Antigenen unterdrückt
werden kann, wenn es wünschenswert
sein kann, so vorzugehen, wie bei der Vorbeugung und Behandlung
einer Immunkrankheit.
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Es
wird gezeigt, dass Lipide mit bestimmten physikalisch-chemischen
Eigenschaften am besten für
die Zwecke dieser Erfindung geeignet sind.
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Hauptmerkmale der Erfindung
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Gemäß einem
Gesichtspunkt der Erfindung wird die Verwendung eines synthetischen
Lipids oder eines Lipids aus einem tierischen oder pflanzlichen Öl in Übereinstimmung
mit Anspruch 1 bereitgestellt.
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Für die Zwecke
dieser Anmeldung werden Lipide als Ester von Glycerin (Propan-1,2,3-triol) mit
Fettsäuren
definiert, die auch ein 1,2-Di-O-acylglycerin, das am Sauerstoff
3 mit einer glykosidischen Bindung an ein Kohlenhydrat gebunden
ist, und ebenso Derivate des Glycerins, in denen eine Hydroxygruppe,
gewöhnlicherweise,
jedoch nicht notwendigerweise eine primäre Hydroxygruppe, mit Fettsäuren verestert
ist, umfassen, so dass jene organischen Verbindungen ausgeschlossen
werden, die aus einer sich wiederholenden Einheit eines Trisaccharids
mit Oligosaccharid-Seitenketten und mit Acyl- oder Amin-Gruppen
verknüpften
Fettsäuren
bestehen.
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Das
vollständige
Produkt kann ein Lipid oder eine Mischung von einem oder mehreren
Phospho-, neutralen oder Glyco-Lipiden umfassen, welche synthetisiert
werden können,
oder die in natürlichen
Materialien enthalten sein können
oder von natürlichen
Materialien stammen, wie zum Beispiel tierischen oder pflanzlichen Ölen, aus
denen sie extrahiert oder konzentriert werden können, oder nicht, wie zum Beispiel
durch Destillation, Fraktionierung, Phorese oder andere bekannte
Verfahren.
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Die
Lipide sind solche, wie sie in den nachfolgenden Punkten a) bis
f) beschrieben werden, und die an einen Menschen oder an Tiere in
nicht teilchenartiger oder in teilchen artiger Form wie nachstehend
beschrieben durch parenterale oder transmucosale Verabreichung zum
Zwecke der Modulation der Immunantwort gegenüber Antigenen gegeben werden.
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Das
Lipid (die Lipide), das (die) in der Zusammensetzung der vorliegenden
Erfindung vorhanden ist (sind), wird (werden) durch die folgenden
Eigenschaften gekennzeichnet:
- a) Es sollte
mindestens eine Alkyl- oder Acyl-Kette vorhanden sein.
- b) Die Kettenlänge
sollte 10 bis 22 Kohlenstoffatome betragen, vorzugsweise 12 bis
20 oder mehr, stärker bevorzugt
16 bis 20 oder auch 18 bis 20 Kohlenstoffatome.
- c) Wenn ein Lipid eine Kopfgruppe aufweist, soll der Kopf vorzugsweise
eine Masse von mindestens 269 atomaren Masseneinheiten (Atomic Mass
Units; AMU) und ein Volumen von mindestens 167 cm–3 mol–1 aufweisen.
- d) Wenn ein Lipid eine Kopfgruppe aufweist, kann es eine kombinierte
elektrische Partialladung von –1,015 eV
oder noch stärker
negativ, jedoch vorzugsweise von –1,044 eV oder noch stärker negativ
aufweisen.
- e) Wenn die Kopfgruppe eine Ladung hat, kann sie in einem einzelnen
Zentrum lokalisiert sein, jedoch sollte sie vorzugsweise in vielen
Zentren lokalisiert sein.
- f) Das Verhältnis
von Ladung zu Volumen der Kopfgruppe beträgt vorzugsweise –0,004 eV/cm–3 mol–1 oder noch
stärker
negativ, und stärker
bevorzugt –0,006
eV/cm–3 mol–1 oder
noch stärker
negativ.
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Obwohl
man postulieren kann, dass die Lipide, welche eines oder mehrere
der vorstehenden physikalisch-chemischen Kriterien erfüllen, in
besonderer Weise nützlich
bei der Erleichterung einer Verknüpfung zwischen Antigenen und
Rezeptormechanismen des Immunsystems sind, ist die Erfindung keinesfalls
auf diese Theorie beschränkt.
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Weitere Merkmale
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Die
Lipide können
transmucosal verabreicht werden, oder sie können parenteral verabreicht
werden. Wenn sie transmucosal zum Zwecke der Steigerung der Immunantwort
verabreicht werden, insbesondere oral, ist es wünschenswert, dass die Lipide
in Teilchenform verabreicht werden, obwohl es nicht notwendigerweise so
sein muss.
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Es
kann durch bekannte Verfahren, wie zum Beispiel durch mikroskopische Überprüfung oder
durch Verfahren zur Größenbestimmung,
welche eine Strahlung, wie zum Beispiel Laserstrahlen, verwenden,
sowie durch leicht erhältliche
Instrumente zur Größenbestimmung,
wie zum Beispiel den Malvern Mastersizer, festgestellt werden, dass
die Teilchengröße innerhalb
der vorgegebenen Grenzen liegt.
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Die
Lipide, wie sie in den vorstehenden Punkten a) bis f) beschrieben
wurden, und die aus natürlichen Materialien
bestehen oder aus natürlichen
Materialien durch Mittel, wie zum Beispiel durch Extraktion mit
Lösungsmitteln,
wie zum Beispiel Chloroform und Methanol, erhalten wurden, oder
die in alternativer Weise von synthetischem Ursprung sind, können in
eine Teilchenform überführt werden,
indem sie in oder auf Liposomen oder Bilosomen oder einem anderen,
teilchenartigen Material von geeigneter Größe eingebaut werden, wie zum
Beispiel Siliziumdioxid, Titandioxid, oder Kaolin-Teilchen, oder
einem anderen solchen Material, das zur Absorption oder zur Adsorption
von Lipiden imstande ist.
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Dies
kann zum Beispiel dadurch erreicht werden, dass das Lipid oder die
Lipide in eine Flüssigkeit
von geringer Viskosität überführt werden,
wie zum Beispiel durch Erhitzen, Auflösen in Lösungsmitteln, wie zum Beispiel
Chloroform oder Methanol, oder indem sie mittels eines emulgierenden
Mittels in eine wässrige
Zubereitung überführt werden,
um eine Emulsion oder ein Kolloid zu bilden.
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Die
zu beschichtenden Teilchen werden anschließend in der Flüssigkeit
durch Rühren,
schüttelnde Schwingungen,
Beschallung oder anderen bekannten Mitteln zur Dispersion dispergiert.
Die Flüssigkeit
kann anschließend
entfernt werden, um eine Beschichtung mit dem Lipid oder mit der
lipid-ähnlichen
Substanz auf den Oberflächen
des Teilchens zurückzulassen.
Dies kann zum Beispiel durch Verdampfung der Lösungsmittel oder des wässrigen
Mediums, durch Zentrifugation (chargenweise oder im kontinuierlichen
Betrieb) oder durch Filtration, vorzugsweise durch Kreuzstrom-Filtration, bewirkt
werden. Wenn man zeigen kann, dass das Lipid auf die Teilchen aufgetragen
werden kann, zum Beispiel durch mikroskopische Überprüfung, kann ein Träger in einem
geeigneten Volumen zugegeben werden, um eine zweckmäßige Dosierungsform
bereitzustellen.
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Es
ist vorzuziehen, dass, wenn das Lipid oder die Lipide (insbesondere,
wenn ein Lipid mit einer einzelnen Kette, ein neutrales oder ungesättigtes
Lipid) in Form von Liposomen, Bilosomen oder in einer anderen vesikularen
Form oder als eine Suspension verabreicht werden, das Protein oder
die Peptid-Antigene nicht unmittelbar mit dem Lipid gemischt oder
kombiniert, oder innerhalb von Vesikeln kombiniert werden sollen,
obwohl es nicht notwendigerweise so ist. Solche Antigene können jedoch
gleichzeitig mit dem Lipid oder den Lipiden in der gleichen formulierten
Dosis gegeben werden, falls sie nicht derart unmittelbar kombiniert
werden. In alternativer Weise können
sie durch gesonderte Verabreichung gegeben werden, wie bei der Modulation
der Immunantwort auf einen antigenen Auslöser, der von einer Infektion
oder einer anderen Ursache herrührt.
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Das
nicht bakterielle Lipid, sei es nun in Liposomen oder Bilosomen
eingebaut, oder mit Teilchen von geeigneter Größe verknüpft, kann in die teilchenartigen
Formulierungen eines feuchten oder trockenen Pulvers oder in die
kornartigen Mischungen eingebaut sein. In alternativer Weise können sie
in Flüssigkeiten
enthalten sein, wie zum Beispiel in Wasser, Öl, Milch oder beliebigen Getränken. Eine
Pulverformulierung kann in Form von Tabletten, Kapseln oder einer
Paste gegeben werden, oder sie kann in Nahrungsmittel eingearbeitet
sein.
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Im
Falle der Trägerteilchen
sollten diese vorzugsweise eine Größe im Bereich von 0,1 bis 100 μm, vorzugsweise
von 0,1 bis 25 μm
und am meisten bevorzugt von 0,2 bis 15 oder auch von 0,3 bis 10 μm aufweisen, und
in idealer Weise liegen sie im Bereich von 0,4 bis 8 μm oder von
0,5 bis 5 μm.
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Ein
Merkmal der Erfindung stellt somit eine Zubereitung von Lipiden
bereit, wie sie in den vorstehenden Punkten a) bis f) beschrieben
wurden, welche parenteral oder transmucosal in teilchenartiger Form
verabreicht werden können,
wobei die Abmessungen der Teilchen innerhalb der vorstehend festgelegten
Grenzen liegen, oder in nicht teilchenartiger Form.
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Die
Lipide, wie sie vorstehend beschrieben wurden, können Phospholipide, Glycolipide
oder neutrale Lipide, gesättigte
oder ungesättigte
Lipide, mit oder ohne Verzweigung in ihren Fettsäureketten darstellen, wobei
die Kategorien folgende sind:
Phosphatidsäuren
Phosphatidylethanolamine
Phosphatidylserine
Phosphatidylinositole
Phosphatidylcholine
Cardiolipine
Triglyceride
1,2-Diglyceride
1,3-Diglyceride
und
Monoglyceride
und ihre Isomere.
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Insbesondere
können
sie umfassen:
Dioleoylphosphatidylcholin,
Trilinolenin
L-α-Phosphatidsäure
Dimyristoyl-L-α-phosphatidsäure
Dimyristoyl-L-α-phosphatidylcholin
Dipentadecanoyl-L-α-phosphatidylcholin
Diheptadecanoyl-L-α-phosphatidylcholin
Diheptadecanoyl-D,L-α-phosphatidylcholin
Distearoyl-L-α-phosphatidylethanolamin
Dimyristoyl-D,L-α-phosphatidylethanolamin
Dipalmitoyl-1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin
L-α-Phosphatidylethanolamin
Diheptadecanoyl-D,L-α-phosphatidyl-L-serin
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Die
vorstehenden Lipide werden im nachfolgenden Beispiel 4 als Lipide
der Gruppe 1 bezeichnet.
N-Palmitoyl-dihydroglucocerebrosid
Trimyristin
Tripentadecanoin
Tripalmitin
1,2-Dipalmitoyl-3-myristoyl-rac-glycerin1,2-Distearoyl-3-myristoyl-rac-glycerin
1,2-Distearoyl-3-palmitoyl-rac-glycerin
und
rac-1,2-Dimyristoyl-3-palmitoylglycerin.
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Die
vorstehenden Lipide werden im nachfolgenden Beispiel 4 als Lipide
der Gruppe 2 bezeichnet.
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Solche
Lipide können
transmucosal in Teilchenform wie vorstehend beschrieben verabreicht
werden, oder sie können
parenteral in Teilchenform oder nicht in Teilchenform verabreicht
werden. Die transmucosale Verabreichung kann zum Beispiel auf dem
oralen Weg, durch buccales oder sub-linguales Einbringen oder einen
Spray, oder durch einen intranasalen Spray erfolgen.
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Sie
können
zusammen mit dem Antigen oder den Antigenen als ein Adjuvans gegeben
werden, oder sie können
gesondert gegeben werden, insbesondere vor dem antigenen Auslöser, um
die Immunantwort zu steigern.
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Für manche
Zwecke der Immunmodulation, wenn zum Beispiel die Absicht besteht,
die Immunantwort auf einen antigenen Reiz eher zu unterdrücken als
zu steigern, zum Beispiel bei der Kontrolle von Immunkrankheiten,
können
die Lipidmaterialien auf einem transmukosalen Weg gegeben werden,
jedoch in nicht teilchenartiger Form. Für diese Zwecke können sie
dispergiert in flüssigen
Emulsionen, Kolloiden, Suspensionen, Lösungen oder anderen flüssigen Dispersionen,
oder in Gelen, Pasten oder dispergierbar in festen Formen verabreicht
werden, die zum Beispiel Stärke
oder Zellulose enthalten, oder sie können in Form von Aerosol-Sprays
verabreicht werden.
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Das
immunologisch aktive Material kann durch bekannte Verfahren zu Liposomen
geformt werden, oder es kann mit öligen oder viskosen Zubereitungen
gemischt werden, um Liposomen zu bilden, oder sie können in
anderer Weise in oder auf Trägerteilchen
eines teilchenartigen Materials von geeigneter Größe eingebaut
werden, wie zum Beispiel kolloidales Siliziumdioxid, Kieselsäure, Kaolinteilchen
oder anderes solches Material, das zur Absorption oder zur Adsorption
von Lipiden imstande ist. Solche Teilchen können in Pulver, Tabletten,
Kapseln, Nahrungsmittel, Flüssigkeiten
oder Getränke
eingearbeitet werden. Die Größe solcher
Liposomen oder Trägerteilchen,
welche das immunologisch aktive Material enthalten, kann eine Größe im Bereich
von 0,1 bis 100 μm,
vorzugsweise im Bereich von 0,2 bis 25 μm, am meisten bevorzugt von
0,2 bis 15 oder auch von 0,3 bis 10 μm sein, und in idealer Weise
liegt ihre Größe im Bereich
von 0,4 bis 8 μm
oder von 0,5 bis 5 μm.
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Die
Beispiele zur Bestätigung
werden nachfolgend beschrieben.
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Beispiel 1 (außerhalb
des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung)
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Nach
der oralen Verabreichung eines Testantigens wird ein Vergleich zwischen
zwei Tests zur Herstellung von Immunglobulinen in Mäusen gezogen,
bei dem die Mäuse
tägliche
Dosen von teilweise autolysiertem und autoklaviertem Bacillus subtilis
erhielten.
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In
Test A, wurde Bacillus subtilis in einem klaren flüssigen Medium,
das Hefeextrakt, Saccharose, Magnesium und andere lösliche Nährstoffe
enthielt, gemäß einem
gut eingeführten
Verfahren vermehrt. Die Bakterienzellen wurden von dem Kulturmedium
durch Zentrifugation getrennt, und man ließ sie für 24 Stunden bei Raumtemperatur
stehen. Die Zellen wurden grob äußerlich
und mikroskopisch in Abständen
von etwa 6 Stunden untersucht. Nach diesem Zeitraum und ehe irgendein
sichtbarer physikalischer Zerfall der Bakterien beobachtet wurde,
wurden die Zellen bei 115°C
für 20
Minuten autoklaviert. Mikroskopisch blieben alle Zellen im Wesentlichen
nach dem Autoklavieren intakt, wobei die ungefähren Abmessungen von 0,5 bis
1 × 1
bis 5 μm betrugen.
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Der
abgetötete
Bakterienbrei wurde in Wasser verdünnt und über eine Magenspülung täglich für 7 Tage
an 5 Mäuse
verabreicht, mit einer täglichen
Dosis, welche 400 μg
bakterieller Trockenmasse entspricht.
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Eine ähnliche
Gruppe von 5 Mäusen,
die als Kontrollgruppe diente, erhielt täglich orale Dosen von physiologischer
Saline.
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Beide
Gruppen wurden dann dem Hämocyanin
aus der Schlüssellochschnecke
mit Cholera-Toxin ausgesetzt. Beide Gruppen wurden in Bezug auf
die Immunglobuline untersucht.
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Die
Antwort in Bezug auf IgA in der Gruppe, welche die Präparation
von Bacillus subtilis erhielt, überstieg
jene der Kontrollgruppe um den Faktor 9.
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In
Test B wurde das vorstehende Verfahren wiederholt, mit der Ausnahme,
dass man die Präparation von
Bacillus subtilis bei Raumtemperatur für einen Zeitraum von 72 Stunden
stehen ließ,
so dass autolytische Veränderungen
fortschritten bis zu einem Stadium eines mikroskopisch sichtbaren
Zerfalls der Bakterienzellen.
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Nach
dem Autoklavieren ergab die Mikroskopie, dass die bakterielle Zubereitung
zu einem feinen Schlamm mit einer maximalen Teilchengröße von 0,2 μm zerfallen
war.
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Die
Exposition gegenüber
dem Antigen und die nachfolgende Untersuchung der Immunglobuline
wurden wie in Test A durchgeführt.
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Es
wurde in Test B gefunden, dass die IgA-Antwort auf die bakterielle
Zubereitung jene in der Kontrollgruppe um den viel geringeren Faktor
2 überstieg.
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Somit
zeigt Beispiel 1 klar die nützliche
Wirkung einer abgetöteten
Bakterienzubereitung, die oral als Teilchen von 0,5 bis 5 μm verabreicht
wurden, im Vergleich mit einer in ähnlicher Weise verabreichten
Zubereitung von Teilchen im Submikron-Bereich von 0,2 μm.
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Beispiel 2 (außerhalb
des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung)
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Es
wird ein Vergleich zwischen zwei gesonderten Tests gezogen. In Test
C erhielten Kücken
im Alter von 1 bis 21 Tagen eine Nahrung, die mit einem Extrakt
von Bacillus subtilis mit Methanol und Chloroform im Verhältnis 2:1
ergänzt
worden war, in einem Anteil des Extrakts, der aus 100 mg getrockneter
Biomasse von Bacillus subtilis erhalten wurde, pro kg Nahrungsmittel.
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Der
Extrakt mittels Methanol und Chloroform, der seiner Natur nach ein
Lipid darstellt, wurde auf eine staubige und fein gekörnte Zubereitung
von expandiertem Glimmer aufgetragen, der einen hohen Anteil an Teilchen
von annähernd
0,2 bis 100 μm
enthielt, ehe er in das Nahrungsmittel eingearbeitet wurde. Die
Wachstumsgeschwindigkeit der behandelten Kücken überstieg diejenige der Kontrolle
um 14,1%.
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In
Test D erhielten die Mäuse
eine tägliche
Dosis eines Lipidextraktes von Bacillus subtilis mittels Methanol
und Chloroform, welcher Lipidextrakt über eine Magenspülung verabreicht
wurde. Die tägliche
Dosis war der Extrakt, der aus annähernd 400 mg getrockneter Biomasse
erhalten wurde. Im Vergleich mit den Kontrolltieren wurde keine
Steigerung der Gewichtszunahme oder eine Steigerung der Immunantwort
nachgewiesen.
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Beispiel
2 zeigt klar die nützliche
Wirkung der Verwendung einer oral verabreichten bakteriellen Zubereitung
oder eines Extrakts in Teilchenform im Vergleich mit einer nicht
teilchenartigen Form.
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Beispiel 3 (außerhalb
des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung)
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Die
Zellen von Bacillus subtilis, die kultiviert und einer teilweisen
Autolyse wie in Beispiel 1, Test A, unterzogen wurden, wurden für 48 Stunden
in einer Mischung von Chloroform und Methanol im Verhältnis 2:1 geschüttelt. Nach
der Zentrifugation wurde der Überstand
durch Verdampfen eingeengt, um einen Lipidextrakt zu ergeben.
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Der
Extrakt wurde mit Liposomen in einer Lösung einer gepufferten Saline
vereinigt, um dispergierte Teilchen des Lipids/der Liposomen von
annähernd
1 bis 3 μm
im Durchmesser zu ergeben. Dieser wurde an 5 Mäuse mittels einer Magenspülung täglich für 5 Tage
mit einer Gesamttagesdosis pro Maus von 0,2 ml verabreicht, so dass
sich eine Gesamtdosis pro Maus von 0,59 mg eines extrahierten Lipids
ergibt. Fünf
Kontrollmäuse
erhielten die gleiche Liposomen-Zubereitung, jedoch ohne den bakteriellen
Lipidextrakt, wobei die Liposomen-Zubereitung in einer in gleicher
Weise gepufferten Saline suspendiert war und ebenso in einer Dosis von
0,2 ml pro Maus und Tag verabreicht wurde.
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Am
7. und 15. Tag wurden alle Mäuse
mit einer Magenspülung
mit Hämocyanin
aus der Schlüssellochschnecke
(5 mg) in 200 μl
physiologischer Saline, die Cholera-Toxin (10 μg) enthielt, immunisiert. Am
21. Tag ließ man
alle Mäuse
ausbluten und die mesenterischen Lymphknoten wurden entfernt.
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Die
Tests auf spezifische Antikörper
im Serum mittels ELISA zeigten IgA-Gehalte in den Mäusen, die mit
Lipidextrakt behandelt wurden, welche diejenigen Gehalte der Kontrollmäuse um den
Faktor 8 überstiegen.
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Die
Zellkulturen von mesenterischen Lymphknoten zeigten eine T-Zell-Proliferation
in den Knoten von behandelten Tieren als Reaktion auf das Hämocyanin
aus der Schlüssellochschnecke,
welche diejenige der Kontrolltiere um die Faktoren 35 bzw. 16 nach
3 bzw. 5 Tagen der Kultur überstiegen.
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Die
Ergebnisse zeigten daher eine erhebliche Modulation der Immunantwort
durch eine orale Vorbehandlung mit bakteriellen Lipidextrakten,
die in Teilchen von annähernd
1 bis 3 μm
verabreicht wurden.
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Es
sollte bemerkt werden, dass das Verfahren zur Extraktion, welches
in Beispiel 3 verwendet wurde, speziell ausgewählt wurde, um ausschließlich Lipide
aus den Bakterien zu extrahieren. Lipopolysaccharide, wie zum Beispiel
jene, die als Lipid A bekannt sind, können durch das verwendete Verfahren
nicht extrahiert werden.
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Beispiel 4 (außerhalb
des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung)
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Beispiele
eines Produkts in Übereinstimmung
mit der Erfindung umfassen Mischungen von annähernd den gleichen Mengen aller
Lipide, welche die vorstehende Gruppe 1 und ebenso die vorstehende
Gruppe 2 umfassen. Alle diese Lipide können synthetisch hergestellt
werden.
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Ein
weiteres Beispiel, das getestet wurde, war ein Extrakt mittels Chloroform
und Methanol (2:1), der aus Zellen von Bacillus subtilis erhalten
wurde, und in Liposomen enthalten war, die gemäß dem Verfahren von Bangham
und Horne (1964) gebildet wurden.
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Derselbe
Extrakt aus Bacillus subtilis mittels Chloroform und Methanol wurde
ebenso durch orale Verabreichung des Extrakts getestet, der auf
1,5 μm große Teilchen
von Siliziumdioxid aufgetragen wurde. Die Lipide der Gruppen 1 und
2 wurden ebenso oral auf diese Weise verabreicht.
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Testverfahren
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Die
vorstehenden beispielhaften Produkte wurden mit vier Gruppen von
Mäusen
getestet, denen die Produkte oral verabreicht wurden, und sie wurden
mit zwei Kontrollgruppen verglichen. Bei allen Gruppen wurden die
Messungen der systemischen und mucosalen Immunantworten auf das
Protein-Antigen (Hämocyanin aus
der Schlüssellochschnecke;
keyhole limpet hemocyanin, KLH) durchgeführt, die auf die Behandlung
mit den beispielhaften Produkten folgte.
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Material und Methoden
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Mäuse
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Weibliche
Balb/c-Mäuse,
die 6–8
Wochen alt waren und 20–22
g wogen, wurden verwendet und während
der gesamten Studie auf einer normalen Mausdiät gehalten.
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Vorbereitung der Proben
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Die
Proben wurden für
die Behandlungen der Gruppen wie folgt vorbereitet:
- A) Gepufferte physiologische Saline (PBS) (Kontrollbehandlung).
- B) Chloroform/Methanol-Extrakt von Bacillus subtilis, hergestellt
in Liposomen gemäß dem Verfahren
von Bangham und Horne (1964).
- C) Chloroform/Methanol-Extrakt von Bacillus subtilis, der auf
1,5 μm große Teilchen
van Siliziumdioxid aufgetragen wurde.
- D) Nicht bakterielle Phospholipide (vorstehend Gruppe 1), die
auf Teilchen von Siliziumdioxid wie in C) aufgetragen wurden.
- E) Nicht bakterielle, neutrale Lipide und Glykolipide (vorstehend
Gruppe 2), die auf Teilchen aus Siliziumdioxid wie in C) aufgetragen
wurden.
- F) Liposomen, die gemäß dem Verfahren
von Bangham und Horne (1964) hergestellt wurden, und kein Testlipid
oder einen bakteriellen Extrakt enthielten. (Zusätzliche Kontrollbehandlung)
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Die
Zubereitungen B, C, D und E lieferten tägliche orale Dosen pro Maus
von 53 μg
an gesamten Lipiden oder eines bakteriellen Lipidextrakts mittels
Chloroform und Methanol, welche Dosen mit PBS auf eine tägliche intragastrale
Gesamtdosis von 0,2 ml pro Maus eingestellt wurden.
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Im
Falle der Zubereitungen C, D und E wurden die Lipide oder bakteriellen
Extrakte auf annähernd kugelförmige Teilchen
von Siliziumdioxid mit 1,5 μm
Durchmesser gemäß dem folgenden
Verfahren aufgetragen:
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Herstellungsverfahren
für die
Beschichtung von SiO2
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Die
Suspensionsmatrix für
die Siliziumdioxid-Kügelchen
wurde anhand der folgenden Schritte hergestellt:
- 1.
Es wurde Natriumcarbonat-Puffer hergestellt. 100 ml einer 0,05 M
NaHCO3-Lösung
wurden verwendet. Der pH-Wert der Lösung wurde auf einen pH-Wert
von 9,7–9,9
mit 0,1 M NaOH-Lösung
eingestellt. Der eingestellte Puffer wurde mit 200 ml sterilisiertem
Wasser verdünnt.
- 2. Die Suspensionsmatrix wurde hergestellt. 50 ml des Natriumcarbonat-Puffers
wurden genommen, und zu diesen wurden 100 ml Glycerin gegeben. Die
beiden wurden vollständig
miteinander vermischt.
- 3. Die Suspensionsmatrix wurde anschließend autoklaviert. Die Suspensionsmatrix
war dann vollständig.
Die
Lipide oder der Extrakt wurden für
die Mischung mit dem Siliziumdioxid anhand der folgenden Schritte hergestellt.
Bei
sämtlichem,
in diesen Verfahren verwendeten SiO2 handelte
es sich um SiO2-Pulver von 1,5 μm.
- 4. Die Probe des Extrakts wurde gelöst und mit SiO2 vermischt.
Die Probe des Extrakts wurde in einen sauberen Behälter eingewogen.
Jeweils 25 mg des Extrakts wurden in 1 ml Chloroform/Methanol (2:1)
gelöst. Das
SiO2 wurde in einen Be hälter für die endgültige Verarbeitung eingewogen.
10 mg SiO2 wurden für jeweils 5 mg des Extrakts
verwendet. Die Lösung
des Extrakts wurde zu dem SiO2 gegeben,
und mit einem Wirbler gemischt, um die beiden zu vermischen. Das
Lösungsmittel
wurde sorgfältig
entfernt, indem ein Strom von trockenem Stickstoffgas hindurchgeleitet
wurde. Der Extrakt war nunmehr auf das SiO2 aufgetragen
und war bereit für
die Herstellung der Suspensionsmatrix.
- 5. Die Phospholipid-Probe wurde gelöst und mit SiO2 vermischt.
Jeweils 25 mg des Lipids wurden in 1 ml Chloroform/Methanol (2:1)
gelöst.
Das SiO2 wurde in den Behälter für die endgültige Verarbeitung
eingewogen. 10 mg SiO2 wurden für jeweils
5 mg Extrakt verwendet. Die Lösung
des Lipids wurde zu dem SiO2 gegeben, und
mit einem Wirbler gemischt, um die beiden zu vermischen. Das Lösungsmittel
wurde sorgfältig
entfernt, indem ein Strom von trockenem Stickstoffgas hindurchgeleitet
wurde. Das Lipid war nunmehr auf das SiO2 aufgetragen
und war bereit für
die Herstellung der Suspensionsmatrix.
- 6. Die Glykolipid-Probe wurde gelöst und mit SiO2 vermischt.
Jeweils 25 mg des Lipids wurden in 1 ml Chloroform/Methanol (2:1)
gelöst.
Das SiO2 wurde in den Behälter für die endgültige Verarbeitung
eingewogen. 10 mg SiO2 wurden für jeweils
5 mg Extrakt verwendet. Die Lösung
des Lipids wurde zu dem SiO2 gegeben, und
mit einem Wirbler gemischt, um die beiden zu vermischen. Das Lösungsmittel
wurde sorgfältig
entfernt, indem ein Strom von trockenem Stickstoffgas hindurchgeleitet
wurde. Das Lipid war nunmehr auf das SiO2 aufgetragen
und war bereit für
die Herstellung der Suspensionsmatrix.
- 7. Die Probe des Neutrallipids wurde gelöst und mit SiO2 vermischt.
Jeweils 25 mg des Lipids wurden in 1 ml Chloroform/Methanol (2:1)
gelöst.
Das SiO2 wurde in den Behälter für die endgültige Verarbeitung
eingewogen. 10 mg SiO2 wurden für jeweils
5 mg Extrakt verwendet. Die Lösung
des Lipids wurde zu dem SiO2 gegeben, und
mit einem Wirbler gemischt, um die beiden zu vermischen. Das Lösungsmittel
wurde sorgfältig
entfernt, indem ein Strom von trockenem Stickstoffgas hindurchgeleitet
wurde. Das Lipid war nunmehr auf das SiO2 aufgetragen
und war bereit für
die Herstellung der Suspensionsmatrix.
Das beschichtete SiO2 wurde durch die folgenden Schritte suspendiert:
- 8. Das SiO2 wurde durch die Matrix suspendiert.
Für jeweils
10 mg SiO2 (und daher 5 mg des Lipids) wurden 10
ml Suspensionsmatrix verwendet. Die Suspensionsmatrix wurde zu dem
beschichteten SiO2 gegeben. Die Mischung
wurde geschüttelt,
um das beschichtete SiO2 von den Wänden des
Gefäßes zu lösen. Die Mischung
in ihrem verschlossenen Behälter
wurde in ein Ultraschallbad gegeben. Die Mischung wurde für 15 Min.
mit Ultraschall behandelt. Dies ergab eine feine Dispersion von
beschichtetem SiO2 innerhalb der Matrix.
Das SiO2 präzipitierte während dieses
Prozesses oder mit der Zeit manchmal auf den Boden des Behälters. Das
Schütteln
des Behälters
suspendierte das SiO2 erneut in der Matrix.
Falls eine weitere Behandlung mit Ultraschall für die vollständige Dispersion
erforderlich war, wurde die Beschallung für weitere 15 Min. wiederholt.
Es ist notwendig, keine Beschallung mit Ultraschall oberhalb der
Temperatur Tm (Übergangstemperatur) des Lipids
vorzunehmen. Wenn man dies dennoch ausführt, kann es eher zur Bildung großer vielschichtiger
Vesikel als zu einer Beschichtung kommen.
-
Die
Suspension war nunmehr vollständig
und bereit für
die Verwendung.
-
Immunisierungsschema
-
Es
gab 6 experimentelle Gruppen, die jeweils 5 Mäuse umfassten. 200 μl einer jeden
Zubereitung (oder PBS oder die Liposomen-Kontrolle) wurden den 6
Gruppen von jeweils 5 Mäusen
an 5 aufeinanderfolgenden Tagen intragastral verabreicht. Am 7.
Tag und am 17. Tag wurden die Mäuse
einer jeden Gruppe intragastral mit KLH (5 mg) und Cholera-Toxin
(10 μg)
in 200 μl
PBS immunisiert.
-
Proben
-
Im
Anschluss an eine intraperitoneale Injektion von 50 μl Pilocarpin
(0,5%, w/v) wurden am 20. Tag Speichelproben gesammelt. Am 21. Tag
wurden die Mäuse
getötet,
und die mesenterischen Lymphknoten wurden entfernt.
-
Herstellung einer Einzelzell-Suspension
von mesenterischen Lymphknoten
-
Die
Mäuse wurden
seziert und die mesenterischen Lymphknoten (mesenteric lymph nodes,
MLN) wurden entfernt und in ein Gewebekultur-Medium (RPMI 1640)
gegeben. Die mesenterischen Lymphknoten wurden aus allen Mäusen der
Gruppe jeweils vereinigt, homogenisiert, und eine Einzelzell-Suspension
wurde erhalten, indem die Lösung
durch ein Nylonfilter mit 70 μm
Maschenabstand hindurchgeleitet wurde.
-
Die
Zellen wurden anschließend
dreimal bei 1200 UpM mit RPMI bei 4°C gewaschen, das 5% fötales Kälberserum
enthielt. Die Zellen wurden schließlich in 1 ml vollständigem Medium
suspendiert, in einem Hämocytometer
mit Trypanblau gezählt,
um die Lebensfähigkeit
abzuschätzen,
und sie wurden für
Proliferations-Assays verwendet.
-
T-Zell-Proliferations-Assay
-
Die
Zellen wurden mit 8 × 106 Zellen/ml in dreifacher Kopie in eine 96-Napf-Platte
für die
Gewebekultur gegeben, mit oder ohne KLH bei zwei Konzentrationen,
100 μg/ml
und 50 μg/ml.
Die Zellen wurden für
5 Tage bei 37°C
inkubiert, und sie wurden mit 2 μCi
pro Napf mit Tritium enthaltenden Thymidin in den letzten 15 Stunden
gepulst, und anschließend
auf Filtern geerntet, und in einem Scintillationszähler für eine Matrix
aus 96 Näpfen
gezählt.
Die Ergebnisse wurden als Stimulations-Index ausgedrückt, d.h.
die Aktivität
der Näpfe,
die mit Antigen oder Mitogen stimuliert wurden, dividiert durch
die Aktivität
der zur Kontrolle dienenden (nicht stimulierten) Näpfe.
-
ELISA-Assay
-
Der
Gehalt an spezifischem anti-KLH IgA-Antikörper einer Speichelprobe aus
jedem Individuum wurde in einem gängigen ELISA-Verfahren bestimmt,
und gegen eine Positivkontrolle eines Antiserums standardisiert,
das durch Hyperimmunisierung von Mäusen mit KLH (100 μg) mit Cholera-Toxin
(10 μg)
in unvollständigem
Freund'schem Adjuvans
erhalten wurde. Die Platten wurden mit KLH mit einer Konzentration
von 2 μg/ml beschichtet,
und über
vier zweifache Verdünnungsschritte
der Proben (100 μl)
bei 37°C
für 2 Stunden
inkubiert. Die anfängliche
Verdünnung
der Speichel- und Vaginal-Proben betrug 1:10. Anti-Maus-IgA aus
dem Schaf wurde mit einer Verdünnung
von 1:1.000 für
2 Stunden bei 37°C
verwendet. Anti-Schaf-IgG aus dem Esel, das mit alkalischer Phosphatase
konjugiert war, wurde in einer Verdünnung von 1:250 für IgA-Assays
für 1 Stunde bei
37°C verwendet.
Die Ergebnisse wurden als Antikörper- Einheiten ausgedrückt, die
aus der Standardkurve berechnet wurden, welche von dem gepoolten
Maus-Immunserum erhalten wurde, dem ein willkürlicher Antikörper-Wert
von 100.000 IgA Einheiten/ml zugrundegelegt wurde. Die Standardkurve
wurde von 1:100 auf 1:3.200 für
IgA-Proben verdünnt.
Der Wert für
jede Probenverdünnung,
die auf die Standardkurve entfällt,
wurde berechnet, und der Mittelwert wurde als Wert für die Probe
angenommen.
-
Ergebnisse
-
Zellassay
-
Mesenterische
Lymphknotenzellen aus den 5 Mäusen
innerhalb der Gruppe wurden vereinigt. Die Proliferation der MLN-Zellen
gegenüber
KLH ist in allen Gruppen erheblich, im Vergleich mit den Kontrollen (1).
Der Stimulationsindex ist in allen experimentellen Gruppen B–E erhöht, jedoch
war er besonders hervorragend für
die Gruppen B und E. Das KLH, das bei Konzentrationen von 100 μg/ml und
50 μg/ml
verwendet wurde, erbrachte ähnliche
Ergebnisse.
-
Mucosale Antikörper
-
Speichel:
Orale Immunisierungen mit Antigenen führten zu Antikörpern im
Speichel, die spezifisch für KLH
waren. Die Gruppen B, C, D und E zeigen höhere spezifische IgA-Antikörper im
Speichel gegenüber
KLH im Vergleich mit den Kontrollen (2).
-
Schlussfolgerungen aus
Beispiel 4
-
- 1. Die Ergebnisse bestätigen, dass die bakteriellen
Lipidextrakte, die in Form von Liposomen intragastral vom 7. bis
zum 2. Tag vor der Immunisierung verabreicht wurden, die zelluläre und die
Antikörper-Immunantwort
steigerten.
- 2. Es wurde gezeigt, dass das Verfahren der Präsentation
der Lipide (sowohl extrahiertes als auch synthetisiertes Lipid),
indem sie vor der intragastralen Verabreichung auf Partikel von
Siliziumdioxid als Schicht aufgetragen wurden, bei der Steigerung
der Immunantwort gegenüber
Antigenen wirksam ist.
- 3. Es wurde gezeigt, dass synthetische Phospholipide (11 wurden
gleichzeitig gegeben) und synthetische, neutrale und Glykolipide
(8 wurden gleichzeitig gegeben) bei der Steigerung der Immunantwort
gegenüber Antigenen
wirksam sind, wenn sie durch die beschriebenen Verfahren verabreicht
werden.
-
Beispiel 5 (außerhalb
des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung)
-
Dies
ist ein Vergleich der Behandlungen in Beispiel 2 (Test A) und Beispiel
3 (Test B). Es wird ein Vergleich zwischen zwei Tests in Mäusen gezogen,
wobei die Reaktion der MLN-T-Zell-Proliferation gegenüber KLH
durch das in Beispiel 4 (Zellassay) beschriebene Verfahren untersucht
wurde.
-
Bei
beiden Tests wurde Bacillus subtillis in einem klaren flüssigen Medium,
das Hefeextrakt, Saccharose, Magnesium und andere lösliche Nährstoffe
enthielt, nach gut bekannten Verfahren vermehrt. Die Zellen wurden
von der Kultur durch Zentrifugation getrennt und einer partiellen
Autolyse unterzogen, und das Lipid wurde durch Schütteln für 48 Stunden
in einer Mischung von Chloroform und Methanol im Verhältnis 2:1
extrahiert. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand durch Verdampfung
eingeengt, um den Lipidextrakt zu ergeben.
-
Im
Test A wurde der Lipidextrakt in einem wässrigen Medium mittels eines
kommerziell erhältlichen emulgierenden
Mittels (Crillet 4) dispergiert, und an 5 Mäuse durch eine Magenspülung täglich an
5 aufeinanderfolgenden Tagen mit einer Dosierung von 53 μg eines Extrakts
pro Maus und Tag in 0,2 ml PBS verabreicht.
-
Im
Test B wurde der Lipidextrakt hergestellt und an Mäuse vom
gleichen Alter und vom gleichen Stamm (junge weibliche Balb/C-Mäuse) auf
demselben Weg und mit derselben Dosis verabreicht, jedoch war er
in Liposomen vom Bilosom-Typ (Verfahren von J. Brewer, Strathclyde
University) von annähernd
1–3 μm Durchmesser
eingebaut.
-
Bei
beiden Tests erhielten ähnliche
Gruppen von Kontrollmäusen
täglich
intragastrale Verabreichungen von 0,2 ml PBS.
-
Am
7. und 25. Tag wurden die Mäuse
sowohl aus der Behandlungs- als auch aus der Kontroll-Gruppe in
beiden Tests intragastral mit KLH (5 μg) und Cholera-Toxin (10 μg) wie in
Beispiel 1 immunisiert.
-
Die
mesenterischen Lymphknoten wurden am 21. Tag entfernt, und die Tests
der T-Zell-proliferativen Reaktion gegenüber KLH wurden wie in Beispiel
1 durchgeführt.
-
Die
Ergebnisse wurden in Ausdrücken
des Einbaus von 3H-Thymidin bestimmt, und
in Zerfällen
pro Minute (CPM) vor dem entsprechenden Hintergrund ausgedrückt.
-
Im
Test A, in welchem der Lipidextrakt in nicht teilchenartiger Form
verabreicht wurde, zeigten die Zellen aus den behandelten Mäusen keine
proliferative Reaktion nach einer Inkubation für 3 Tage, im Vergleich mit
37.000 Zerfällen
pro Minute vor einem Hintergrund für Kontrollen. In diesem Fall
wurde die proliferative Reaktion der T-Zellen daher stark durch
die Behandlung unterdrückt.
-
Im
Test B, bei dem der Lipidextrakt in Teilchenform in Liposomen verabreicht
wurde, zeigten die behandelten Mäuse
eine proliferative Reaktion nach einer Inkubation für 3 Tage
von 140.000 Zerfällen
pro Minute vor dem Hintergrund, im Vergleich mit 12.000 Zerfällen für die Kontrollen.
In diesem Fall war die proliferative Reaktion der T-Zellen durch
die Behandlung deutlich und stark erhöht.
-
Dieses
Beispiel zeigt, dass die Wirkung der Lipide, welche auf die Oberflächen von
Schleimhäuten
aufgetragen wurden, bei der Immunantwort der Tiere gegenüber Antigenen
von der physikalischen Form grundlegend beeinflusst werden, mit
der die Lipide verabreicht werden. In Abhängigkeit von der physikalischen
Form kann die Immunantwort auf die Antigene gesteigert oder unterdrückt werden.
-
Beispiel 6
-
In
einem weiteren Test wurden zwei Gruppen von Mäusen, wie sie in Beispiel 2
verwendet wurden, durch zwei Verabreichungen eines Antigens im Abstand
von 14 Tagen auf intraperitonealem und intragastralem Weg immunisiert.
Diese Verabreichungen wurden durch gleichzeitige Verabreichungen
von Lipiden der Gruppe 2 (Glycolipide und neutrale Lipide), wie
sie in Beispiel 4 verwendet wurden, begleitet.
-
Die
verwendeten Materialien waren:
-
Intraperetoneale Verabreichung
-
Synthetische
Lipide wie in Beispiel 4,
| Gruppe
2 | 0,14 μg in 50 μl wässriger
Dispersion |
| KLH | 0,5 μg in 50 μl wässriger
Dispersion |
-
Intragastrale Verabreichung
-
Synthetische
Lipide wie in Beispiel 4,
| Gruppe
2 | 14 μg auf SiO2-Teilchen in 0,2 ml PBS |
| KLH | 5
mg in 0,2 ml PBS |
-
Die
Ergebnisse von Beispiel 6 sind in den 3, 4 und 5 gezeigt.
-
Die
Ergebnisse zeigen, dass die Lipide der Gruppe 2 als Adjuvantien,
die gleichzeitig mit Antigenen verabreicht werden, sowohl parenteral
als auch über
die Schleimhaut des Magen-Darm-Trakts verwendet werden können.
-
Beispiel 7 (außerhalb
des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung)
-
Der
Gegenstand dieser Studie bestand darin, die Eigenschaften von 19
unterschiedlichen Lipiden als Adjuvantien zu untersuchen.
-
Materialien und Methoden
-
Mäuse
-
Weibliche
Balb/c-Mäuse
im Alter von 6–8
Wochen und einem Gewicht von etwa 20–22 g wurden verwendet und
während
der gesamten Studie auf einer normalen Mausdiät gehalten.
-
Lipidzubereitungen
-
Die
folgenden Lipidzubereitungen wurden hergestellt:
-
-
Experimentelle Gruppen
und Immunisierungsschema
-
Es
gab 22 Gruppen von Mäusen,
die alphabetisch von A–V
markiert wurden. Die Gruppe A (8 Mäuse) war die Negativkontrolle
(KLH + Saline), die Gruppe B (8 Mäuse) war die Positivkontrolle
(KLH + IFA). Die Gruppen C–V
waren die experimentellen Gruppen, die jeweils 6 Mäuse umfassten.
100 μl der
Antigen-Zubereitung, welche 5 μl
Lipid + 45 μl
Saline + 50 μl
(2 mg/ml KLH) umfasst, wurden an 20 Gruppen von jeweils 6 Mäusen verabreicht,
in der 0. Woche, gefolgt von einem Boost in der 2. Woche.
-
Proben
-
Am
7. und 21. Tag nach der Booster-Dosis wurde den Mäusen Blut über den
Schwanz entnommen, das Serum wurde abgetrennt, aliquotiert und bei
4°C gelagert.
-
ELISA-Assay
-
Der
Gehalt an spezifischen anti-KLH-IgG- und IgM-Antikörpern in
der Serumprobe eines jeden Individuums wurde mittels eines gängigen ELISA-Assays
bestimmt, und gegenüber
einer Positivkontrolle eines Antiserums standardisiert, das durch
Hyperimmunisierung von Mäusen
mit KLH (100 μg)
in unvollständigem Freund'schem Adjuvants erhalten
wurde. Die Platten wurden mit KLH bei einer Konzentration von 2 μg/ml beschichtet,
und über
vier zweifache Verdünnungsschritte
der Proben (100 μl)
bei 37°C
für 2 Stunden
inkubiert. Die anfängliche
Verdünnung
der Serumproben betrug 1:50 für
den IgA-Assay und 1:100 für
die IgG- und IgM-Assays. IgA und IgM aus Schaf und Maus wurden bei
einer Verdünnung
von 1:1.000, und IgG wurde bei einer Verdünnung von 1:2.000 für 2 Stunden
bei 37°C
verwendet. Die Ergebnisse wurden als Antikörper-Einheiten ausgedrückt, die
aus der Standardkurve berechnet wurden, welche aus dem vereinigten
Immunserum der Mäuse
erhalten wurde, dem ein willkürlicher
Antikörper-Wert
von 100.000 IgA-Einheiten pro ml bzw. von 1 × 106 IgG-
und IgM-Einheiten pro ml zugrundegelegt wurde. Die Standardkurve
wurde 1:100 bis 1:3.200 für IgA,
1:4.000 bis 1:256.000 für
IgG, und 1:1.000 bis 1:32.000 für
IgM-Proben verdünnt.
Der Wert für
jede Probenverdünnung,
die auf die Standardkurve fällt,
wurde berechnet, und der Mittelwert wurde als der Wert für diese
Probe angenommen.
-
Ergebnisse
-
Die
Ergebnisse sind in der Form von Histogrammen (9 bis 14)
angegeben, wobei die Ig-Antwort (Einheiten/ml) gegen die Versuchsgruppen
aufgetragen ist. Ausgehend von diesen Daten wurde jeder Versuchsgruppe
ein numerischer Wert zugeordnet, der auf dem Ergebnis im Vergleich
mit der Kontrolle beruht. Die Nummer bezeichnet das Vielfache der
Antwort der Kontrolle.
-
-
-
Beobachtungen
-
Die
Trends innerhalb dieses Tests sind wie folgt:
-
Gleichförmigkeit
der Kette
-
Wenn
viele verschiedene Ketten in einem Lipid vorhanden sind, ist es
vorzuziehen, dass mindestens zwei unterschiedliche Längen auf
demselben Lipidmolekül
vorliegen.
-
Dies
wird gezeigt durch Vergleich von DSP, DSM gegenüber TPal und TM. Sowohl DSP
als auch DSM weisen gemischte Kettenlängen auf, und das erhaltene
Ergebnis ist gut (Rang 39 bzw. 45). TPal und TM weisen jeweils drei
Fettsäureketten
auf, die die gleiche Länge
besitzen. Diese sind in der Länge
mit jenen von DSP und DSM vergleichbar. Ihr Ergebnis im Versuch
war mangelhaft (Rang 15 bzw. 17).
-
Optische Isomerie
-
Wenn
ein Lipid eine optische Isomerie aufweist, ist es vorzuziehen, das
D-Isomer zu verwenden.
-
Dies
kann durch den Vergleich von PEP gegenüber PEH gezeigt werden. Beide
sind strukturell ähnlich,
jedoch liefert PEP, welches ein D-Isomer enthält, ein besseres Ergebnis als
PEH, das nur ein L-Isomer enthält
(Rang 40 bzw. 28).
-
Kettenlänge
-
Die
Länge der
Fettsäurekette
ist wichtig als Steuerprinzip. Es ist vorzuziehen, eine Kettenlänge zu verwenden,
die aus mehr als 14 Kohlenstoffatomen und in idealer Weise aus 18
bis 20 Kohlenstoffatomen besteht.
-
Dies
kann durch den Vergleich von PEP und PSP gegenüber PAM und PCM gezeigt werden.
Sowohl PEP als auch PSP weisen Fettsäureketten auf, die 18 Kohlenstoffatome
enthalten, und beide liefern ein gutes Ergebnis (Rang 40 bzw. 70);
PAM und PCM weisen beide Kettenlängen
auf, die 14 Kohlenstoffatome enthalten, und liefern ein mangelhaftes
Ergebnis im Experiment (Rang 18 bzw. 12).
-
Struktur der Kopfgruppe
-
Die
Größe der Kopfgruppe
ist wichtig. Es ist vorzuziehen, eine große Kopfgruppe zu verwenden
(sowohl bezüglich
des Volumens als auch bezüglich
der Masse). In idealer Weise sollte die Masse 269 AMU oder mehr
betragen, und das Volumen sollte 167 cm–3 mol–1 oder
mehr betragen.
-
Dies
kann durch Vergleich von PEP und PSP gegenüber PAM und TM gezeigt werden.
Sowohl PEP als auch PSP besitzen große Kopfgruppen. Beide Lipide
liefern ein gutes Ergebnis (Rang 40 bzw. 70). Sowohl PAM als auch
TM besitzen kleinere Kopfgruppen; diese beiden Lipide liefern ein
mangelhaftes Ergebnis (Rang 18 bzw. 17).
-
Die
Ladung der Kopfgruppe ist wichtig. Es ist vorzuziehen, dass die
Kopfgruppe eine kombinierte Partialladung von –1,015 eV oder noch stärker negativ
aufweist. In idealer Weise sollte die kombinierte Partialladung –1,044 eV
oder noch stärker
negativ betragen.
-
Dies
kann durch Vergleich von PEP und PSP gegenüber PAM und TM gezeigt werden.
Sowohl PEP als auch PSP weisen stark negative Kopfgruppen auf; diese
beiden Lipide liefern ein gutes Ergebnis (Rang 40 bzw. 70). Sowohl
PAM als auch TM weisen schwach geladene Kopfgruppen auf; diese beiden
Lipide liefern ein mangelhaftes Ergebnis (Rang 18 bzw. 17).
-
Wenn
die Kopfgruppe eine Partialladung aufweist, ist es vorzuziehen,
dass die Ladung in vielen verschiedenen Zentren lokalisiert ist.
-
Dies
kann durch Vergleich von PEP und PSP gegenüber PAM und TM gezeigt werden.
Sowohl PEP als auch PSP besitzen Kopfgruppen mit vielen verschiedenen
Ladungszentren. Diese beiden Lipide liefern ein gutes Ergebnis (Rang
40 bzw. 70). Sowohl PAM als auch TM besitzen Kopfgruppen mit einem
einzelnen Ladungszentrum; diese beiden Lipide liefern ein mangelhaftes
Ergebnis (Rang 18 bzw. 17).
-
Das
Verhältnis
der Ladung der Kopfgruppe zum Volumen sollte verhältnismäßig groß sein.
Es ist vorzuziehen, eine Ladung von –0,004 eV/cm–3 mol–1 oder
mehr pro Einheit zu verwenden. In idealer Weise sollte das Verhältnis der
Ladung zum Volumen –0,006
eV/cm–3 mol–1 oder
noch stärker
negativ betragen.
-
Dies
kann durch Vergleich von PEP und PSP gegenüber PAM und TM gezeigt werden.
Sowohl PEP als auch PSP weisen Kopfgruppen mit einem ziemlich stark
negativen Verhältnis
der Ladung zum Volumen auf. Diese beiden Lipide liefern ein gutes
Ergebnis (Rang 40 bzw. 70). Sowohl PAM als auch TM weisen Kopfgruppen
mit einem einem schwach negativen Verhältnis der Ladung zum Volumen
auf; diese beiden Lipide liefern ein mangelhaftes Ergebnis (Rang
18 bzw. 17).
-
Beispiel 8
-
Die
Gegenstände
dieses Experiments waren:
- a) Die Wirkungen
der ungesättigten
Lipide bei der Steigerung der Immunantwort gegenüber Antigenen zu testen, im
Vergleich zu den gesättigten
Analoga mit der größten Ähnlichkeit.
- b) Die Wirkung von natürlich
vorkommenden Lipiden pflanzlichen Ursprungs auf die Steigerung dieser
Antwort zu testen, die in teilchenartiger Form oral verabreicht
wurden.
-
Materialien und Methoden
-
7
Gruppen von 6 Mäusen,
wie sie in Beispiel 4 verwendet wurden, wurden durch drei Verabreichungen von
Testlipiden an drei aufeinanderfolgenden Tagen immunisiert (Tage
1, 2 und 3). Am 7. und 14. Tag wurden die Mäuse intragastral mit KLH (5
mg) in 200 μl
Saline immunisiert, die 10 μg
Cholera-Toxin enthielt, wie es in Beispiel 4 verwendet wurde.
-
Verwendete
Materialien: Intragastrale
Verabreichung des Lipids
-
-
Die
Mäuse wurden
am 21. Tag getötet.
Proben von mesenterischen Lymphknoten wurden für Untersuchungszwecke in Bezug
auf die proliferative zelluläre
Reaktion gegenüber
KLH entnommen.
-
Die
Ergebnisse sind in 15 gezeigt.
-
Der
Vergleich der Kontrollbehandlung, in welcher keine Vorbehandlung
mit einem Lipid (KLH + CT) erfolgte, mit der Positivkontrolle, in
der eine Vorbehandlung mit einem Phospholipid (PHOS + KLH + CT)
erfolgte, (von der vorstehend in Beispiel 4 gezeigt wurde, dass
sie wirksam ist), bestätigt
die Gültigkeit
dieses Tests. Die Ergebnisse zeigen einen Vergleich zwischen Distearoylphosphatidylcholin,
einem gesättigten
Lipid, das ein gutes Ergebnis in Beispiel 7 lieferte, und Dioleoylphosphatidylcholin,
einem strukturell ähnlichen,
ungesättigten
Analogon. Innerhalb dieser Ergebnisse wird Trimyristin, ein gesättigtes
Lipid, das ein mangelhaftes Ergebnis in Beispiel 7 lieferte, mit
Trilinolenin, einem strukturell ähnlichen,
ungesättigten
Analogon, verglichen. Diese beiden Vergleiche zeigen, dass die ungesättigten
Analoga ein besseres Ergebnis als ihre gesättigten Äquivalente liefern, und eine
starke proliferative Reaktion im Vergleich zur Kontrolle ergeben.
Diese Ergebnisse bestätigen
daher die Wirksamkeit von ungesättigten
Lipiden bei der Steigerung der Immunantwort. Ebenso zeigt dieses
Beispiel, dass Lipide von pflanzlichem Ursprung bei der Erreichung
dieses Zwecks nützlich
sind.
-
Die
Versuchsgruppe COM, welche ausgewählte Lipide auf pflanzlicher
Basis erhielt, um einen Gehalt zu ergeben, der mit den synthetischen
Beispielen – wie
sie in Beispiel 4, Gruppe 1, verwendet wurden – vergleichbar ist, zeigte
eine starke, proliferative Reaktion, wenn sie mit der Kontrollgruppe
verglichen wird. In diesem Fall nahm die T-Zellproliferative Reaktion
durch die Behandlung stark zu.
