KR20020042537A - 컨쥬게이트의 비공유결합에 의해 형성된 에피토프 - Google Patents

컨쥬게이트의 비공유결합에 의해 형성된 에피토프 Download PDF

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Abstract

본 발명은 다수의 상이한 컨쥬게이트의 비공유 집합체(여기서, 각각의 컨쥬게이트는 헤드기와 테일기를 포함하고, 컨쥬게이트의 테일기는 소수성 응집체를 형성하고, 컨쥬게이트는 집합체 내에서 서로에 대해 자유롭게 이동성을 보유하여 리간드의 존재 하에 2개 이상의 헤드기는 각각의 헤드기가 개별적으로 상호작용하는 것보다 강력하게 리간드와 상호작용할 수 있는 에피토프를 형성하도록 적합하게 위치함)를 포함하는, 리간드와 상호작용하기 위한 조성물을 제공한다.

Description

컨쥬게이트의 비공유결합에 의해 형성된 에피토프{Epitopes Formed by Non-Covalent Association of Conjugates}
본 발명은 리간드와 상호작용하기 위한 조성물, 상기 조성물의 제조 방법 및 상기 조성물을 기초로 한 분자의 제조 방법에 관한 것이다.
단백질 수용체는 전체 단백질 분자의 작은 비율을 구성하는, 에피토프를 통해 그의 표적 리간드에 결합하는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 최대 결합 또는 상호작용을 위해 에피토프의 구조는 에피토프의 모든 필요한 성분을 매우 근접한 상태로 포함하는 결합 부위를 형성하도록 견고한 형태로 유지될 필요가 있다. 결합 부위를 포함하는 아미노산만으로 구성된 유사 펩티드를 제조하기 위한 시도는 이들 펩티드가 단백질 수용체와 동일한 생물학적 활성을 갖지 않기 때문에 종종 실패하였다. 이것은 유리(free) 용액 내에서 전체 단백질 수용체의 배열과 상이한 배열을 갖는 펩티드 때문에 발생한다. 또한, 단백질의 결합 부위가 단백질 사슬의 상이한, 비인접 부분의 올리고펩티드로 이루어진 경우, 단리된 올리고펩티드를 유리 용액 내에서 혼합할 경우에도 활성 결합 부위의 재구성을 유도하지 못한다.
결합 부위 에피토프를 제공하기 위해 상기 큰 단백질을 사용하여야 하는 것은 새로운 수용체 특이적 치료 전략의 개발에 많은 문제점을 야기한다. 한 문제는 큰 단백질은 면역 반응을 쉽게 유도할 수 있다는 것이다. 두번째 문제는 긴 펩티드 사슬은 엔도펩티다제, 예를 들어 소화관강의 엔도펩티다제에 의한 공격에 취약하다는 것이다. 마지막으로, 큰 단백질은 제조, 정제 및 안정한 형태로 보존하는 비용이 많이 소용될 수 있다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 선행기술의 단점을 극복하는 것이다.
제1 특징에서, 본 발명은 다수의 상이한 컨쥬게이트의 비공유 집합체(여기서, 각각의 컨쥬게이트는 헤드기와 테일기를 포함하고, 컨쥬게이트의 테일기는 소수성 응집체를 형성하고, 컨쥬게이트는 집합체 내에서 서로에 대해 자유롭게 이동할 수 있기 때문에 리간드의 존재 하에 2개 이상의 헤드기 (동일하거나 상이함)는 각각의 헤드기가 개별적으로 상호작용하는 것보다 강력하게 리간드와 상호작용할 수 있는 에피토프를 형성하도록 적합하게 위치함)를 포함하는, 리간드와 상호작용하기 위한 조성물을 제공한다. 헤드기는 일반적으로 친수성이고, 테일기는 일반적으로 소수성, 예를 들어 탄화수소 사슬로 구성된 친지질성이고, 플루오로탄소 사슬로 구성된 친할로겐성이거나 실란 기재이다.
본 발명에 따라 헤드기와 테일기를 갖는 컨쥬게이트를 제조함으써, 테일기는 서로 결합하여, 헤드기가 수성상에서 근접하게 위치하도록 컨쥬게이트가 존재하는 거대분자 집합체, 예를 들어 미셀, 라멜라 구조, 리포좀 또는 다른 지질 구조체인 소수성 집합체를 형성할 수 있다. 컨쥬게이트는 집합체 내에서 이동 가능하기 때문에, 헤드기는 집합체 내의 많은 상이한 위치를 점할 수 있다. 따라서, 일반적으로 동일하지 않은 헤드기는 집합체 내에서 자유롭게 이동할 수 있고, 놀라운 것은헤드기 자체가 유도할 수 없는 생물학적 활성을 서로 협조적으로 상호작용하여 유도한다는 것이다. 또다른 예기치 못한 발견은 상이한 헤드기의 조합으로 구성된 집합체는 생물학적 반응을 유도하거나 생물학적 수용체와의 결합에 참여할 수 있는 반면에, 한 종류의 헤드기로 구성된 집합체는 이러한 방식으로 작용할 수 없다는 것이다.
상기 언급한 바와 같이, 상기 거대분자 집합체는 자연 상태에서는 일반적으로 입자 또는 콜로이드 형태이고, 도 1a에 도시된 바와 같이 헤드기가 입자의 중심으로부터 외부로 지향하는 수백개의 하위 단위 (컨쥬게이트)를 일반적으로 포함한다. 각각의 컨쥬게이트는 집합체 내에서 그 위치를 변경시킬 수 있고, 브라운 운동 과정에 의해 인접 컨쥬게이트와 위치를 자유롭게 바꿀 수 있고, 이때 집합체의 전체 표면에 걸쳐 이동할 수 있다. 거대분자 집합체의 다른 형태는 입방상 및 코팅된 표면이다.
집합체 내의 각각의 컨쥬게이트는 하나의 화학적 또는 생물학적 클래스 또는 많은 상이한 클래스, 예를 들어 아미노산 또는 펩티드, 펩티드 유사체, 단당류, 이당류 또는 다당류, 모노뉴클레오티드, 디뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드, 스테롤, 알칼로이드, 이소프레노이드, 이노시톨 유도체, 단일 또는 융합 방향족 핵, 수용성 비타민, 포르피린 또는 햄 핵, 프탈로시아닌, 금속 이온 킬레이트, 수용성 약물, 호르몬 또는 효소 기질로부터 선택되는 헤드기를 가질 수 있다.
한 바람직한 실시태양에서, 각각의 헤드기는 아미노산 또는 펩티드 사슬의 말단부일 수 있는 올리고펩티드를 포함한다. 펩티드의 길이는 조성물이 체내에서사용될 경우 면역 반응의 유도를 방지하기 위해 최소로 유지하는 것이 바람직하다. 따라서, 펩티드는 아미노산 6개 이하의 길이가 바람직하다.
사용되는 아미노산은 천연 아미노산, 이의 치환 유도체, 유사체 및 D-형태일 수 있다.
컨쥬게이트의 테일기는 모두 동일할 수 있거나 또는 치환 또는 치환될 수 없는 구조 내에 헤테로 원자가 포함되거나 포함되지 않은 직쇄, 분지쇄, 시클릭, 폴리시클릭, 포화 또는 불포화 구조체로부터 선택된 소수성 기, 예를 들어 지질성 아미노산 유사체, 프로스타글란딘, 류코트리엔, 모노글리세라이드 또는 디글리세라이드, 스테롤, 스핑고신 또는 세라미드 유도체, 및 상기 소수성기의 규소 또는 할로겐 치환된 유도체를 각각 바람직하게 포함하는 상이한 테일기의 혼합물일 수 있다. 테일기는 바람직하게는 6 내지 24개, 보다 바람직하게는 10 내지 14개의 탄소 원자를 포함한다. 2개 이상의 테일기가 각각의 컨쥬게이트에 존재할 수 있다. 예를 들어, 탄화수소 측쇄를 갖는 하나 이상의 지질성 아미노산은 헤드기의 하나 이상의 아미노산에 연결된, 각 컨쥬게이트의 일부를 형성할 수 있다.
헤드기를 테일기에 연결하기 위해 임의의 화학적 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 각각의 컨쥬게이트는 비공유 결합체의 표면 상에 헤드기의 제시를 촉진하기 위해 헤드기를 테일기에 연결하는 스페이서기를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 스페이서기는 공지되어 있고, 예를 들어 아미노산, 히드록시산, 당 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다.
다른 특징에서, 본 발명은 의약, 예방제 또는 진단제로 사용하기 위한 상기조성물을 제공한다.
본 발명의 잇점은 헤드기가 종래의 생물학적 수용체보다 작은 컨쥬게이트를 사용하여 강한 특이적 결합 상호작용을 달성할 수 있다는 것이다. 예를 들어, 헤드기가 올리고펩티드인 경우, 펩티드 사슬의 길이는 일반적으로 10개의 아미노산을 초과하지 않고, 바람직하게는 6개 이하이다. 따라서, 본 발명에 따른 조성물은 그의 단백질 대응물보다 면역원성을 훨씬 작게 만들 수 있다.
본 발명의 상기 특징에 따르면, 본 발명의 조성물은 시험관 내에서 리간드와 상호작용하도록 제제화할 수 있을 뿐만 아니라 적합한 투여 경로에 따라 임의로 적합한 희석제, 부형제 또는 담체와 함께 제제화되어 체내에서 사용될 수 있다.
다른 특징에서, 본 발명은 헤드기와 테일기를 포함하는 컨쥬게이트의 상기 조성물 제조를 위한 용도를 제공한다.
또한, (a) 헤드기 및 테일기를 각각 포함하는 다수의 상이한 컨쥬게이트를 제공하는 단계 및 (b) 비공유 결합에 의해 다수의 컨쥬게이트로부터 테일기가 소수성에 의해 응집하고 컨쥬게이트가 서로에 대해 자유로이 이동하여 리간드의 존재 하에 2개 이상의 헤드기가 적합하게 위치하여 각각의 헤드기가 단독으로 리간드와 상호작용하는 것보다 강력하게 리간드와 상호작용할 수 있는 에피토프를 형성하는 집합체를 형성시키는 단계를 포함하는, 리간드와 상호작용하기 위한 조성물의 제조 방법을 제공한다. 상기 컨쥬게이트는 상기 정의한 것이 바람직하다.
컨쥬게이트는 기계적 혼합, 고전단력에 노출, 초음파 처리, 용매 분산 또는 세제를 사용한 공용해를 포함하여 지질 비지클 제조를 위한 다양한 공지의 방법에의해 수성상 중에 분산될 수 있다. 일반적으로, 상기와 같이 형성된 비공유 거대분자 집합체는 서로 혼합된 다수의 상이한 컨쥬게이트로 구성될 것이다. 표면 특성의 변경, 컨쥬게이트의 분산 촉진, 컨쥬게이트의 비공유 결합된 집합체의 안정화, 컨쥬게이트의 헤드기의 제시 촉진, 또는 컨쥬게이트의 랜덤한 이동 및 집합체 내에 헤드기의 적합한 위치에 의해 형성된 에피토프에 의해 표적화될 수 있는 비히클의 제조 허용을 위해 또다른 지질성 물질을 임의로 첨가할 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 중요한 특징은 목적하는 생물학적 활성을 갖는 다수의 컨쥬게이트를 확인하는 단계를 포함한다. 바람직한 특징에서, 이 단계는 (i) 헤드기 어레이를 갖는 컨쥬게이트 세트를 선택하는 단계, (ii) 이로부터 테일기가 소수성에 의해 응집하고 컨쥬게이트가 서로에 대해 자유로운 이동성을 보이는 비공유 결합체를 형성하는 단계, (iii) 비공유 결합체와 리간드 사이의 충분한 상호작용을 분석하는 단계, (iv) 헤드기의 변형 어레이를 갖는 컨쥬게이트 세트를 사용하여 단계 (i) 내지 (iii)을 임의로 반복하는 단계 및 (v) 단계 (iii)에서 충분한 상호작용의 발견시에 그 컨쥬게이트 세트를 단계 (a)의 다수의 컨쥬게이트로서 선택하는 단계를 포함한다.
"충분한 상호작용"의 분석의 예는 항체와 항원 사이의 결합을 검출하기 위한 ELISA 원칙을 이용하는 것과 같은 결합 분석법을 포함할 수 있다. 다른 적합한 시험관내 분석법은 환경 감수성의 멤브레인 결합 형광 프로브의 형광 변형, 침전 반응, 효소 활성의 증강 또는 억제 등을 포함한다. 시험관 내에서 배양된 세포의 행동을 변경시키는 물질의 능력에 따른 분석, 예를 들어 세포 사멸, 세포 증식, 아폽토시스(apoptosis), 세포 대 세포 접촉의 억제 또는 촉진, 시토킨 또는 다른 가용성 산물의 분비, 특이적 m-RNA의 합성, 세포내 비지클 수송, 세포 신호전달 과정의 변형 분석 등도 적합할 수 있다. 동물 또는 인간의 체내 분석, 예를 들어 방사성 표지의 거대분자 집합체 내로의 도입과 상이한 경로에 의한 투여 후 표지의 분포 조사도 실시할 수 있다.
상기 방법에 따르면, 예비합성된 은행(bank)으로부터 선택된 컨쥬게이트의 상이한 조합을 각각 포함하는 많은 상이한 거대분자 집합체 (또는 "프로브")를 제조하는 조합 방법이 사용된다. 적합한 컨쥬게이트의 선택은 표적 리간드의 공지의 특성에 기초할 수 있거나 또는 단순히 2개 이상의 헤드기가 리간드에 대한 에피토프를 형성할 가능성을 증가시키기 위해 매우 광범위한 헤드기의 사용을 포함할 수 있다. 이러한 방식에서, 상기한 바와 같은 프로브와 리간드 사이의 충분한 상호작용 분석 후에, 추가로 헤드기를 첨가하고 일부 헤드기를 제거한 후 생성되는 프로브의 충분한 상호작용을 다시 분석함으로써 가장 효과적인 것으로 밝혀진 컨쥬게이트의 조합을 변형시킬 수 있다. 최종적으로, 가장 유리한 헤드기 조합을 확인하고 조성물에 사용하기 위해 선택할 수 있다.
따라서, 본 발명은 전통적인 조합 화학법에 비해 매우 분명한 잇점을 갖는다. 조합 화학법에서는, 특정 수용체에 결합하기 위해 가장 바람직한 서열의 확인은 상이한 기, 예를 들어 아미노산의 가능한 수백 가지의 조합물을 상이한 순서로 합성하여 각각에 대해 효능 시험을 수행하여야 한다. 이 방법은 시간이 많이 소요되고, 비경제적이며, 상이한 성분을 함께 연결할 때 수행할 수 있는 화학법의 특성에 의해 제한된다. 이와 대조적으로, 본 발명은 결합에 의해 유도된 에피토프를 제공하기 위해 헤드기의 근접성에만 의존할 뿐이다. 한 세트의 컨쥬게이트가 일단 합성된 후에는 추가의 합성 화학법이 필요하지 않으며, 단지 비공유 결합에 의해 상이한 프로브를 형성시키기 위해 컨쥬게이트의 간단한 혼합만을 필요로 한다.
바람직한 간단한 실시태양에서, 본 발명은 상이한 아미노산 측쇄가 다수의 상이한 배열로 함께 제시되는 미셀을 형성하기 위해 단순히 수성 매질에서 혼합하여 조합될 수 있는, 한개의 말단 아미노산이 스페이서를 통해 지질 테일기에 연결된 컨쥬게이트를 사용한다. 따라서, 특정 순서로 또는 특정 공간 또는 배향을 갖는 아미노산을 제공할 필요가 없다. 통계적으로, 일정 비율의 개별 아미노산 하위단위가 항상 이상적인 배열로 결합할 것이다.
한 형태에서, 각각의 컨쥬게이트는 선형 구조 X-스페이서-스페이서-지질-지질 (여기서, X는 사용된 상이한 컨쥬게이트 각각에 대해 상이한 하나의 아미노산을 의미함)를 갖는다.
천연 아미노산으로 구성된 에피토프를 제조하고자 할 때, 선택되는 헤드기의 수를 추가로 단순화시킬 수 있다. 헤드기의 말단 위치에서 아미노산의 공간 유연성 증가 때문에 클래스의 모든 구성 아미노산보다는 한 클래스에 한 아미노산을 사용하여 천연 단백질 물질에서 발견되는 아미노산 잔기를 6개의 기본적인 클래스로 분류할 수 있다. 이것은 예비합성된 컨쥬게이트 은행의 제조에 필요한 아미노산의 총수 및 이에 따라 사용되는 헤드기의 총수를 상당히 감소시키는 효과를 갖는다. 아미노산의 주요 클래스를 하기 표 1에 나타내었다.
클래스 대표 아미노산 약어
소수성 류신 L
히드록시 세린 S
산성 글루타메이트 E
아미드 글루타민 Q
염기성 히스티딘 H
방향족 티로신 Y
아미노산 함유 컨쥬게이트의 조합 활성을 확인하기 위한 많은 전략을 사용할 수 있다.
한 실시태양에서, 제한된 수의 컨쥬게이트를 사용하여 일정 범위의 상이한 프로브를 형성하고, 여기서 각각의 프로브는 거대분자 집합체의 수성 현탁액이고, 각각의 집합체는 함께 혼합되는 선택된 컨쥬게이트로 구성되고, 아래에 나타낸 바와 같은 추가의 상이한 컨쥬게이트를 포함시킨 결과로 인해 다른 것과 상이하다.
프로브 1 A B C D
프로브 2 A B C E
프로브 3 A B C F
프로브 4 A B C G
........
........
프로브 x A B C Z
여기서, 각각의 문자는 상이한 말단 아미노산을 갖는 컨쥬게이트를 의미한다.
각각의 프로브는 상기 언급한 바와 같이 충분한 결합에 대한 생물학적 분석에서 별개로 시험한다.
제2의 간단한 실시태양에서, 컨쥬게이트 은행으로부터 많은 상이한 컨쥬게이트를 포함하는 초기 프로브를 제조하고, 컨쥬게이트 은행에서 어느 헤드기가 조사되는 생물학적 상호작용에 필수적이고 어느 헤드기가 불필요한 것인지를 결정하기 위해 한개의 상이한 컨쥬게이트를 차례로 각각 배제한 프로브와 그 효능을 비교한다. 이러한 방법을 아래에 예시한다.
프로브 1 A B C D E . . . Z
프로브 2 A C D E . . . Z
프로브 3 A B D E . . . Z
........
프로브 x A B C D E . . .
상기한 바와 같은 교대 방법을 조합하여 사용할 수 있다.
표적 리간드에 대한 지식은 적합한 출발 어레이의 고안에 도움이 될 수 있다. 예를 들어, 리간드가 염기성인 것으로 알려져 있다면, 말단 아미노산의 유리 카르복실기가 노출되는 형태로 컨쥬게이트를 제시함으로써 컨쥬게이트에 산성을 부여할 수 있다. 말단 아미노산에 인접한 스페이서기로서 특정 아미노산을 사용하여 추가의 관능성을 도입하여 특이성을 증가시킬 수도 있다. 예를 들어, 공지 구조의 짧은 올리고 펩티드 서열이 표적 리간드에 대한 결합에 관련되는 경우, 이러한 서열은 조성물을 구성하는 컨쥬게이트 세트에 포함되는 컨쥬게이트에 포함될 수 있다.
마지막 특징에서, 본 발명은 리간드와 상호작용하기 위한 분자의 제조 방법을 제공한다. 이 방법은 상기 정의한 방법 중의 하나에 따라 조성물을 제조하는 단계, 상기 조성물에서 리간드에 대한 에피토프를 형성하는 2개 이상의 헤드기를 확인하는 단계 및 각각의 헤드기가 리간드에 대해 개별적으로 상호작용하는 것보다 강력하게 분자가 리간드와 상호작용할 수 있도록 하나 이상의 링커기에 의해 임의로 일정 거리로 존재하는 2개 이상의 헤드기의 관능기를 포함하는 분자를 제조하는 단계를 포함한다.
본 발명의 조성물은 그 자체로 치료, 예방 또는 진단 방법에서 생물학적 반응을 유도하기 위해 시험관내 또는 체내 시스템에서 유용할 수 있지만, 특정 환경에서는 상기 조성물의 구조를 기초로 하여 특정 분자를 제조할 수 있다. 리간드에 대한 에피토프를 형성하는 2개 이상의 헤드기의 관능기를 확인함으로써, 조성물에 유사한, 동일하거나 유사한 에피토프를 포함하는 새로운 분자를 제조할 수 있다. 관능기는 예를 들어 관능기를 일정 거리를 두고 존재하게 하는 하나 이상의 링커기와 함께 하나의 선형 올리고 펩티드 내에 포함될 수 있다.
도면의 간단한 설명
본 발명을 하기 실시예 및 첨부 도면을 참고로 하여 단지 예시를 위해 보다 상세하게 설명한다.
도 1은 거대분자 집합체 표면의 모식도로서 본 발명에 따른 조성물이 어떻게 표적 리간드에 결합하는지를 보여준다.
도 2는 그 헤드기가 단쇄 선형 펩티드로 구성된 2개의 동일하지 않은 컨쥬게이트로 이루어진 거대분자 집합체 표면의 모식도이다.
도 1을 참고로 설명하면, 본 발명에 따른 조성물의 섹션 (1)은 헤드기 (2) 및 테일기 (3)이 함께 컨쥬게이트 (4)를 형성하는 미셀의 형태로 도시된 것이다 (도 1A). 표적 리간드 (5)는 조성물 (1)에 제시된다. 컨쥬게이트는 이동가능하기 때문에, 재배열이 발생하여 헤드기 (2)가 표적 리간드 (5)에 결합하도록 위치하는 것이 가능해진다 (도 1B). 도 2를 참고로 하면, 본 발명의 조성물의 섹션은 거대분자 집합체의 형태로 도시된 것으로서, 단쇄 펩티드로 구성된 2개의 컨쥬게이트의 비공유결합을 통해 만들어진 에피토프의 생성에 의해 리간드가 집합체의 표면에 결합하게 되고 (도 2A), 상기 에피토프는 개별 컨쥬게이트 단독의 경우보다 강력하게 리간드와 상호작용할 수 있다 (도 2B). 동일한 원칙이 아미노산 이외의 다른 구조체를 함유하는 헤드기에도 적용된다.
아래에 설명하는 실시예에서, 모든 경우에 문자는, 특정 아미노산이 펩티드 사슬의 말단 위치에 존재하는 상기 설명한 바와 같은 컨쥬게이트를 의미한다는 것을 제외하고는, 알파벳 단일 문자로 아미노산을 나타내기 위한 표준 규약을 사용한다. 본 명세서의 실시예에서 지질은 펩티드 결합을 통해 연결된 2개의 아미노산을 포함하고, 이 2개의 아미노산은 모두 글리신 유사체이며, 각각의 경우에 알파 수소는 12개 또는 14개의 탄소를 포함하는 선형 탄화수소 사슬로 치환되었다. 헤드기와 스페이서 사이 및 스페이서와 지질 사이의 연결은 모두 펩티드 결합을 통해 이루어진다. 헤드기는 유리 아미노기를 갖고, 지질의 자유 말단은 CONH2기를 갖는다. 따라서, 각 컨쥬게이트의 구조는 NH2-헤드기-스페이서-아미노산 (C14측쇄)-아미노산 (C12측쇄)-CONH2이다.
실시예 1: 대식세포로부터 TNF 분비의 자극
1. 개별 컨쥬게이트 E, Y, Q, S 및 H (세린-글리신 스페이서를 통해 지질에 연결됨)를 5 mg/ml의 농도로 메탄올/디클로로메탄(1:1) 중의 용액으로서 제조하였다.
2. 컨쥬게이트 용액을 동일 비율로 7 ml 유리 바이알에 분산시켜 모든 바이알의 최종 부피를 400 ㎕ (고형물 2 mg)로 만들었다. 사용가능한 유기 용액의 부피가 불충분한 경우, 다음 단계에서 조절하여 재구성을 위해 첨가되는 물의 양을 그에 따라 감소시켰다.
3. 모든 바이알의 내용물을 질소 스트림 하에서 건조시킨 후, 동결건조기에서 적어도 1 mbar의 진공에 철야 노출시켰다.
4. 다음날, 증류수를 하기 표에 나타낸 바와 같은 부피로 첨가하여 모든 바이알의 최종 부피를 1 mg/ml로 만들었다. 바이알에 마개를 씌우고, 37 ℃로 가온한 후, 투명해질 때까지 조에서 초음파처리하였다.
5. 이어서, 시료를 J774A-1 대식세포 세포주의 세포가 플레이팅(5 x 104세포/ml/웰)된 24웰 클러스터 플레이트의 웰에 도입하였다. 부피 100 ㎕ 및 10 ㎕의시료를 각 웰에 첨가하고, 세포를 5% CO2/공기 분위기 중에서 37℃에서 철야 인큐베이션하였다.
6. 다음날, 50 ㎕의 상등액을 각 웰에서 2회 채취하여 캡쳐 ELISA 분석에서 TNF 농도를 측정하였다. 얻어진 결과를 하기 표에 나타내었다.
상이한 헤드기 조합은 전부는 아니지만 그 일부가 강한 생물학적 반응을 유도하고, 이것은 이 반응이 특정 조합에 특이적이라는 것을 의미함을 알 수 있다. 본 실시예는 상기 나타낸 컨쥬게이트가 목적하는 생물학적 반응 유도를 위해 효과를 보이는 조합을 확인하기 위한 조합식 방법에 사용될 수 있는 방법을 입증한다.
실시예 2: 대식세포로부터 TNF 분비
<컨쥬게이트 혼합물을 포함하는 거대분자 집합체와 하나의 컨쥬게이트만을 각각 포함하는 거대분자 집합체 혼합물의 비교>
아래에서 설명하는 추가의 지질 물질을 포함하거나 포함하지 않는 시료를 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하였다. 컨쥬게이트 Y, S 및 L의 조합은 실시예 1에서의 실험에서 우수한 효과를 보였기 때문에 선택하였다.
포스포리피드 대 컨쥬게이트의 중량비가 2:1이 되도록 포스파티딜 콜린을 포함하는 프로브를 제조하였다.
글라이코리피드 대 컨쥬게이트의 중량비가 1:1이 되도록 옥틸 글루코시드를 포함하는 프로브를 제조하였다.
하기 표에 나타낸 결과는 18 시간 배양 상등액에 대해 수행한 TNF ELISA의 450 nm에서의 광학밀도이다. 각 웰의 컨쥬게이트 농도는 10 ㎍/ml이었다.
TNF ELISA의 OD450
EYS 0.390
E+Y+S 0.059
배지 대조군 0.000
EYS:OG 0.559
(E+Y+S):OG 0.193
OG 대조군 0.228
EYS:PC 0.320
(E+Y+S):PC 0.130
PC 대조군 0.081
본 실시예는 단독으로 제시될 때, 또는 다른 지질, 예를 들어 포스포리피드 또는 지질 당과 함께 제시될 때 컨쥬게이트의 조합물이 생물학적 반응을 유도할 수 있음을 보여준다. 또한, 본 실시예는 효능이 분명하게 나타난 바와 같이 동일한 거대분자 집합체에 모든 컨쥬게이트가 조합되어 제시되는 것이 중요하고, 동일한 컨쥬게이트가 동시에 함께 제시되더라도 상이한 거대분자 집합체 상에 분리될 경우 활성이 관찰되지 않는다는 것을 보여준다. 이것은 세포-표면 수용체와의 특이적 결합에 참가할 수 있는, 컨쥬게이트의 비공유결합에 의해 형성된 에피토프의 형성을 가능하게 하기 위해서는 컨쥬게이트를 서로 근접하게 제시하는 것이 중요하다는 것을 시사한다.
실시예 3: 경구 흡수의 증강
1. 개별 컨쥬게이트 L, S, E 및 Q (티로신-글리신 스페이서를 통해 지질에 컨쥬게이션됨)를 10 mg/ml의 농도로 벤질 알콜 중의 용액으로서 제조하였다.
2.14C-콜레스테롤 올레에이트 (톨루엔 중의 3.7 MBq/ml) 75 ㎕를 스크류 마개를 씌운 4개의 7 ml 유리 바이알에 분산시키고 질소 스트림 하에서 건조시켰다.
3. (1)의 각각의 용액 400 ㎕를 (2)의 바이알 중의 하나에 첨가하고 실온에서 철야 진탕하였다.
4. 컨쥬게이트 용액을 동일 비율로 7 ml 유리 바이알에 분산시켜 아래 표에 나타낸 바와 같이 모든 바이알의 최종 부피를 80 ㎕ (고형물 0.8 mg)로 만들었다.
5. 볼텍싱하면서 2 ml의 증류수를 각 바이알에 첨가하였다. 이어서, 바이알에 마개를 하고 20분 동안 조에서 초음파 처리하였다.
6. 이어서, 시료를 액체 질소로 동결시키고 철야 동결건조시켰다.
7. 다음날, 각 바이알을 2 ml의 증류수로 재구성하여 투명한 분산액이 얻어질 때까지 초음파 처리하였다.
8. 시료를 동물당 0.3 ml의 투여량으로 Balb/c 마우스 암컷 (20 내지 25 g - 군당 4마리)에 경구 투여 튜브로 투여하였다.
9. 투여 45, 90 및 180분 후에 꼬리 정맥천자에 의해 75 ㎕의 헤파린 처리된 혈액 시료를 채취하였다.
10. 각각의 시료를 0.5 ml PBS로 희석한 후, 원심분리하여 0.4 ml의 상등액을 신틸레이션 바이알에 옮기고, 2 ml의 Optiphase Hisafe 3 (Wallac)을 혼합하면서 첨가하였다.
11. 시료의 활성을 신틸레이션 계수기로 측정하였다.
흡수율은 2 ml의 혈액 부피 (1 ml은 혈장으로 가정)를 기초로 하여 추정하였다.
그 결과를 하기 표에 나타내었다.
상이한 헤드기의 조합은 전부는 아니지만 그 일부가 경구 경로를 통한 표지의 흡수를 증강시키고, 이것은 반응이 특정 조합에 특이적이라는 것을 의미함을 알 수 있다. 본 실시예는 상기 나타낸 컨쥬게이트가 리간드를 표적화하는 작용을 할 수 있는 효능있는 조합을 확인하기 위한 조합식 방법에 사용될 수 있는 방식을 입증한다.
실시예 4: ELISA Fc 결합
1. 염소 IgG (1 mg/ml) 100 ㎕를 20 ml의 PBS에 첨가하고, 100 ㎕를 평면 바닥 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 도입하였다.
2. 플레이트를 4℃에서 수일 동안 인큐베이션하였다.
3. 각각 2 mg의 컨쥬게이트 Y, F, W, L, S, E, Q 및 R (각각 세린-글리신 스페이서를 통해 지질에 연결됨)를 칭량하여 1 ml 유리 바이알에 도입하고, 200 ㎕의 벤질 알콜을 첨가하여 10 mg/ml의 농도로 각각의 컨쥬게이트 용액을 제조하였다.
4. 용액을 스크류 마개를 씌운 7 ml 유리 바이알에 다음과 같이 분산시켰다.
5. 각 바이알의 내용물을 볼텍싱에 의해 잘 혼합한 후, 1.5 ml의 증류수를 각 바이알에 첨가하였다.
6. 바이알에 마개를 하고, 5분 동안 조에서 초음파 처리를 실시하여 투명 결정 분산액을 제조하였다.
7. 단계 (2)의 플레이트를 PBS/0.02% Tween 20으로 세척하고, PBS 중의 1% BSA (300 ㎕/웰)과 함께 1시간 동안 인큐베이션하여 블로킹하였다.
8. 이어서, 플레이트를 상기와 같이 세척하고, 단계 (6)의 각 바이알로부터 시료 100 ㎕를 취하여 열 (1) 내지 (7)의 컬럼 (1)의 웰에 첨가하였다. 열 (8)은 블랭크 대조군으로 사용하였다.
9. 컬럼 (1)의 웰로부터 100 ㎕를 컬럼 (2)의 동일한 열에 위치한 인접 웰로 이송하고 혼합한 후, 이와 동일하게 100 ㎕를 다음 컬럼으로 이송하여 2회 희석하였다.
10. 이어서, 플레이트를 4℃에서 철야 인큐베이션하였다.
11. 다음날, 플레이트를 이전과 동일하게 세척하고, 시판되는 양고추냉이 퍼옥시다제-IgG 컨쥬게이트 (PBS로 1/000 희석됨) 100 ㎕를 각 웰에 첨가하여 실온에서 40분 동안 인큐베이션하였다.
12. 이어서, 플레이트를 다시 세척하고, 퍼옥시다제의 OPD 기질 100 ㎕를 각 웰에 첨가하고 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다.
13. 3M 황산 20 ㎕를 각 웰에 첨가하여 반응을 중지시켰다.
14. 각 웰의 광학 밀도를 플레이트 판독기로 450 nm에서 측정하고, 그 결과를 배경(background)에 대해 조정한 후 아래와 같이 기록하였다.
시료 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64
1 YFW 0.001 0.039 0.048 0.053 0.083
2 YFL 1.504 1.484 1.325 0.723 0.051
3 YWL 0.803 0.192 0.022 0.023 0.060
4 FWL 1.034 0.778 0.208 0.031 0.034
5 SEQ 0.029 0.041 0.055 0.057 0.091
6 SER 0.013 0.030 0.044 0.062 0.075
7 SQR 0.000 0.045 0.031 0.054 0.065
최대 결합은 시료 2, 3 및 4 (즉, 조합 YFL, YWL 및 FWL)을 사용할 때 달성되었음을 알 수 있다.
상이한 헤드기 조합은 전부는 아니지만 그 일부가 강한 결합 상호작용에 참여하고, 이것은 반응이 특정 조합에 특이적이라는 것을 의미함을 알 수 있다. 본 실시예는 상기 컨쥬게이트가 목적하는 결합 상호작용의 유도에 효과를 보이는 조합을 확인하기 위한 조합식 방법에 사용될 수 있는 방법을 입증한다.

Claims (31)

  1. 다수의 상이한 컨쥬게이트의 비공유 결합체(여기서, 각각의 컨쥬게이트는 헤드기와 테일기를 포함하고, 컨쥬게이트의 테일기는 소수성 응집체를 형성하고, 컨쥬게이트는 결합체 내에서 이동가능하여 리간드의 존재 하에 2개 이상의 헤드기가 각각의 헤드기가 개별적으로 리간드와 상호작용하는 것보다 강력하게 리간드와 상호작용할 수 있는 에피토프를 형성하도록 적합하게 위치함)를 포함하는, 리간드와 상호작용하기 위한 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 각각의 컨쥬게이트가 아미노산 또는 펩티드, 펩티드 유사체, 단당류 또는 다당류, 모노뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드, 스테롤, 수용성 비타민, 포르피린 또는 햄 핵, 금속 이온 킬레이트, 수용성 약물, 호르몬 또는 효소 기질로부터 선택되는 헤드기를 갖는 것인 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 각각의 헤드기가 아미노산을 포함하는 것인 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 각각의 헤드기가 아미노산을 포함하는 펩티드를 포함하는 것인 조성물.
  5. 제3항 또는 4항에 있어서, 에피토프를 형성하는 헤드기가 소수성 아미노산,히드록실 아미노산, 산성 아미노산, 아미드 아미노산, 염기성 아미노산 및 방향족 아미노산 중의 2개 이상으로부터 선택되는 말단 아미노산을 포함하는 것인 조성물.
  6. 제1항 내지 5항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 테일기가 동일하거나 상이하고, 탄소수 8 이상의 직쇄 또는 분지쇄 지방산, 알콜 또는 알데히드, 지질성 아미노산 유사체, 프로스타글란딘, 류코트리엔, 모노글리세라이드 또는 디글리세라이드, 스테롤, 스핑고신 또는 세라미드 유도체로부터 선택되는 친지질성기, 및 상기 친지질성기의 규소 또는 할로겐 치환된 유도체를 포함하는 것인 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 각각의 친지질성기가 탄소수 10 내지 14의 지방산을 포함하는 것인 조성물.
  8. 제1항 내지 7항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 컨쥬게이트가 헤드기를 테일기에 연결시키는 스페이서기를 더 포함하는 것인 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 스페이서기가 친수성인 조성물.
  10. 제8항 또는 9항에 있어서, 스페이서기가 아미노산, 히드록시산, 당 또는 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 것인 조성물.
  11. 제1항 내지 10항 중 어느 한 항에 있어서, 비공유결합체가 라멜라 구조, 미셀 또는 리포좀을 포함하는 것인 조성물.
  12. 제1항 내지 11항 중 어느 한 항에 있어서, 의약, 예방제 또는 진단제로서 사용하기 위한 것인 조성물.
  13. 제1항 내지 12항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 제조를 위한, 헤드기 및 테일기를 포함하는 컨쥬게이트의 용도.
  14. 제13항에 있어서, 헤드기가 아미노산 또는 펩티드, 펩티드 유사체, 단당류 또는 다당류, 모노뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드, 스테롤, 수용성 비타민, 포르피린 또는 햄 핵, 금속 이온 킬레이트, 수용성 약물, 호르몬 및 효소 기질로부터 선택되는 것인 용도.
  15. 제14항에 있어서, 헤드기가 아미노산을 포함하는 것인 용도.
  16. 제15항에 있어서, 헤드기가 아미노산을 포함하는 펩티드를 포함하는 것인 용도.
  17. 제15항 또는 16항에 있어서, 아미노산이 친수성 아미노산, 히드록실 아미노산, 산성 아미노산, 아미드 아미노산, 염기성 아미노산 및 방향족 아미노산으로부터 선택되는 말단 아미노산을 포함하는 것인 용도.
  18. 제13 내지 17항 중 어느 한 항에 있어서, 테일기가 탄소수 8 이상의 직쇄 또는 분지쇄 지방산, 알콜 또는 알데히드, 지질성 아미노산 유사체, 프로스타글란딘, 류코트리엔, 모노글리세라이드 또는 디글리세라이드, 스테롤, 스핑고신 또는 세라미드 유도체로부터 선택되는 친지질성기, 및 상기 친지질성기의 규소 또는 할로겐 치환된 유도체를 포함하는 것인 용도.
  19. 제18항에 있어서, 친지질성기가 탄소수 10 내지 14의 지방산을 포함하는 것인 용도.
  20. 제13항 내지 19항 중 어느 한 항에 있어서, 컨쥬게이트가 헤드기를 테일기에 연결시키는 스페이서기를 더 포함하는 것인 용도.
  21. 제20항에 있어서, 스페이서기가 친수성인 용도.
  22. 제21항에 있어서, 스페이서기가 아미노산, 히드록시산, 당 또는 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 것인 용도.
  23. (a) 헤드기 및 테일기를 각각 포함하는 다수의 상이한 컨쥬게이트를 제공하는 단계 및
    (b) 다수의 컨쥬게이트로부터, 테일기가 소수성에 의해 응집하고 컨쥬게이트가 이동가능하여 리간드의 존재 하에 각각의 헤드기가 단독으로 리간드와 상호작용하는 것보다 강력하게 리간드와 상호작용할 수 있는 에피토프를 형성하도록 2개 이상의 헤드기가 적합하게 위치하는 비공유결합체를 형성시키는 단계
    를 포함하는, 리간드와 상호작용하기 위한 조성물의 제조 방법.
  24. 제23항에 있어서, 각각의 컨쥬게이트가 제13항 내지 22항 중 어느 한 항에 정의된 것인 방법.
  25. 제23항 또는 24항에 있어서, 비공유결합체가 라멜라 구조, 미셀 또는 리포좀을 포함하는 것인 방법.
  26. 제23항 내지 25항 중 어느 한 항에 있어서, 다수의 컨쥬게이트를 제공하는 단계가
    (i) 헤드기 어레이를 갖는 컨쥬게이트 세트를 선택하는 단계,
    (ii) 이로부터 테일기가 소수성에 의해 응집하고 컨쥬게이트가 이동가능한 비공유결합체를 형성하는 단계,
    (iii) 비공유 결합체와 리간드 사이의 충분한 상호작용을 분석하는 단계,
    (iv) 헤드기의 변형 어레이를 갖는 컨쥬게이트 세트를 사용하여 단계 (i) 내지 (iii)을 임의로 반복하는 단계 및
    (v) 단계 (iii)에서 충분한 상호작용의 발견시에 그 컨쥬게이트 세트를 단계 (a)의 다수의 컨쥬게이트로서 선택하는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 헤드기의 어레이가 (i) 소수성 아미노산, 히드록실 아미노산, 산성 아미노산 및 아미드 아미노산의 클래스 각각으로부터 선택되는 하나 이상의 말단 아미노산 및 (ii) 하나 이상의 염기성 아미노산과 하나 이상의 방향족 아미노산을, 또는 2개 이상의 염기성 아미노산 또는 방향족 아미노산을 포함하는 2개 이상의 추가의 말단 아미노산을 포함하는 것인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 단계 (iv)에서 사용되는 헤드기의 변형 어레이가, 2개 이상의 추가의 말단 아미노산이 단계 (i) 내지 (iii)에서 사용된 것과 상이한, 단계 (i) 내지 (iii)에서 사용된 헤드기의 어레이를 포함하는 것인 방법.
  29. 제26항에 있어서, 헤드기의 어레이가 (i) 소수성 아미노산, 히드록실 아미노산, 산성 아미노산, 아미드 아미노산, 염기성 아미노산 및 방향족 아미노산의 클래스 각각으로부터 선택되는 하나 이상의 말단 아미노산을 포함하는 것인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 단계 (iv)에서 사용되는 헤드기의 변형 어레이가 아미노산 클래스의 하나로부터 선택된 하나 이상의 말단 아미노산이 존재하지 않거나 그의 하전 형태로 치환된, 단계 (i) 내지 (iii)에서 사용된 헤드기의 어레이를 포함하는 것인 방법.
  31. (1) 제23항 내지 30항 중 어느 한 항의 방법에 따라 조성물을 제조하는 단계,
    (2) 상기 조성물에서 리간드에 대한 에피토프를 형성하는 2개 이상의 헤드기를 확인하는 단계 및
    (3) 각각의 헤드기가 리간드에 대해 개별적으로 상호작용하는 것보다 강력하게 분자가 리간드와 상호작용할 수 있도록 하나 이상의 링커기에 의해 임의로 일정 거리로 존재하는 2개 이상의 헤드기의 관능기를 포함하는 분자를 제조하는 단계
    를 포함하는, 리간드와 상호작용하기 위한 분자의 제조 방법.
KR1020017016715A 1999-06-28 2000-06-27 컨쥬게이트의 비공유결합에 의해 형성된 에피토프 KR100917285B1 (ko)

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