PT1190255E - Epitopos formados por associação não covalente de conjugados - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "EPITOPOS FORMADOS POR ASSOCIAÇÃO NÃO COVALENTE DE CONJUGADOS" A presente invenção refere-se a um método para rastrear uma composição para a interacção com um ligando.

Antecedentes da Invenção

Os receptores proteicos são conhecidos, normalmente, por se ligarem aos seus ligandos alvo via epitopos, que constituem uma pequena porção da molécula proteica total. Para uma ligação ou interacção máxima, a estrutura do epitopo necessita de ser mantida numa conformação rígida de modo a formar um local de ligação contendo todos os componentes necessários do epitopo numa grande proximidade. As tentativas para produzir um péptido análogo constituído somente de aminoácidos, compreendendo o local de ligação, falham frequentemente porque estes péptidos não possuem a mesma actividade biológica que o receptor proteico. Isto é atribuído ao péptido apresentar uma conformação diferente, em solução livre, à do receptor proteico total. Além disso, quando o local de ligação de uma proteína é constituída por oligopéptidos de partes não contíguas diferentes de uma cadeia proteica, a mistura de oligopéptidos isolados em solução livre não resulta na reconstituição do local activo de ligação.

Estar limitado à utilização de proteínas tão grandes para apresentar epitopos de local de ligação, dá origem a vários problemas no desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas 1 específicas de receptor. Um problema é que estas proteínas grandes podem rapidamente suscitar uma resposta imunitária. Um segundo problema é que as cadeias peptídicas longas são susceptíveis de serem atacadas por endopeptidases, tais como aquelas no lúmen do intestino. Finalmente, estas proteínas grandes podem ser de preparação, purificação e manutenção na forma estável, dispendiosa. 0 documento UA-A-5882645 divulga um sistema lipídico de ancoragem baseado em aminoácido que pode potenciar, ao máximo, a antigenicidade de um péptido sintético pequeno. Este documento proporciona também um processo para a produção destes compostos por síntese peptídica sequencial, de um modo preferido, síntese peptídica sequencial em fase sólida. 0 documento EP-A-0338437 divulga uma vacina sintética, contra a febre aftosa, produzida por conjugação de, pelo menos, um composto de ancoragem à membrana com, pelo menos, uma sequência parcial de uma proteína do vírus da febre aftosa. 0 documento US-A-5580563 divulga um sistema peptídico antigénico múltiplo que compreende um núcleo dendrítico e péptido e uma porção de ancoragem lipofílica. Esta combinação tem uma vantagem ao eliminar a necessidade de inclusão de adjuvantes que são tóxicos para humanos e facilita a amplificação exponencial do potencial antigénico de uma vacina preparada a partir daí, uma vez que é possível amplificação monocovalente pela forma micelar ou lipossomal. 2

Sumário da Invenção A presente invenção tem como objectivo superar as desvantagens da técnica anterior.

Num primeiro aspecto a invenção proporciona um método para rastrear composições para a interacção com um ligando alvo, cujo método compreende: (a) proporcionar vários conjugados distintos, compreendendo cada conjugado um grupo de cabeça e um grupo de cauda, em que os conjugados apresentam capacidade para formar micelas, os grupos de cabeça são hidrofílicos e os grupos da cauda são lipofílicos; e (b) formar a partir dos vários conjugados, uma sua associação não covalente que compreende uma micela, na qual os grupos de cauda se agregam hidrofobicamente e na qual os conjugados são movíveis, de modo a que, na presença de um ligando, pelo menos, dois dos grupos da cabeça estejam posicionados apropriadamente para formar um epitopo capaz de interagir com o ligando de um modo mais forte que cada um dos grupos de cabeça individualmente, em que o passo de proporcionar vários conjugados compreende: (i) seleccionar um conjunto de conjugados com uma série de grupos de cabeça; (ii) formar uma associação não covalente a partir destes, na qual os grupos da cauda se agregam hidrofobicamente e na qual os conjugados são movíveis; 3 (iii) ensaiar a interacção entre a associação não covalente e o ligando; (iv) repetir, opcionalmente, os passos (i) a (iii) utilizando um conjunto de conjugados com uma série modificada de grupos da cabeça; e (v) ao encontrar interacção no passo (iii), seleccionar o conjunto de conjugados como os vários conjugados no passo (a).

Cada conjugado é, de um modo preferido, como definido abaixo.

No método da presente invenção, a composição para interagir com um ligando, compreende uma associação não covalente que compreende uma micela, dos vários conjugados distintos, compreendendo cada conjugado um grupo de cabeça e um grupo de cauda, em que os grupos de cauda dos conjugados apresentam capacidade para formar micelas e os conjugados apresentam liberdade de movimento em relação uns aos outros dentro da associação, de modo que, na presença de um ligando, pelo menos dois dos grupos de cabeça (que são iguais ou diferentes) estão apropriadamente posicionados para formar um epitopo capaz de interagir com o ligando, de um modo mais forte, que cada um dos grupos de cabeça individualmente. Os grupos de cabeça são hidrofílicos e os grupos de cauda lipofilicos, e. g., constituídos por cadeias hidrocarbonadas, halofílicos, construídos por cadeias fluorocarbonadas ou baseados em silano.

Ao construir conjugados com um grupo de cabeça e um grupo de cauda de acordo com a presente invenção, os grupos de cauda 4 podem estar associados de modo a formar uma agregação hidrofóbica que é uma micela, na qual o conjugado está orientado de modo a que os grupos da cabeça estejam em grande proximidade quando de encontram numa fase aquosa. Devido aos conjugados serem moviveis dentro da associação, os grupos da cabeça são capazes de adoptar várias posições diferentes dentro da associação . Os grupos da cabeça, que são tipicamente não idênticos são, por isso, livres de se moverem dentro da associação e, de um modo surpreendente, interagir cooperativamente para induzirem consequências biológicas que os grupos de cabeça por si só não são capazes de desencadear. Uma outra descoberta não esperada é que as associações constituídas por combinações de diferentes grupos de cabeça são capazes de induzir respostas biológicas ou participar na ligação com receptores biológicos, enquanto associações constituídas por grupos de cabeça individuais não são capazes de actuar deste modo.

Como indicado acima, estas associações são, tipicamente, de natureza particulada ou coloidal, compreendendo normalmente, muitas centenas de subunidades (os conjugados), todos orientados com os grupos de cabeça direccionados para fora do centro da partícula, como apresentado na Figura la. Cada um dos conjugados pode alterar a sua localização dentro da associação, sendo livre para trocar de lugar com conjugados adjacentes por um processo de movimento Browniano e, deste modo, podem migrar por toda a superfície da associação. Outras manifestações de associações são as fases cúbicas e superfícies revestidas.

Cada conjugado na associação pode apresentar um grupo de cabeça seleccionado de uma classe química ou biológica ou várias classes diferentes, tais como um aminoácido ou péptido; um 5 análogo peptídico; um mono-, di- ou polissacárido; um mono-, di-ou polinucleótido; um esterol, um alcaloide, um isoprenóide; um derivado de inositol; um núcleo aromático individual ou fundido; uma vitamina solúvel em água; um núcleo de porfirina ou heme; uma ftalocianina; um quelato de ião metálico; um fármaco solúvel em água; uma hormona ou um substrato enzimático.

Numa forma de realização preferida, cada grupo de cabeça compreende um aminoácido ou oligopéptido, que pode estar na porção terminal de uma cadeia peptidica. É desejável manter o comprimento do péptido o mais pequeno possível de modo a evitar a indução de uma resposta imunitária quando a composição é para ser utilizada in vivo. Consequentemente, é preferido que o péptido não apresente mais de seis aminoácidos de comprimento.

Os aminoácidos empregues podem ser qualquer um dos aminoácidos naturais, derivados substituídos, análogos e suas formas D.

Os grupos da cauda dos conjugados podem ser todos iguais ou podem ser uma mistura de grupos de cauda diferentes, cada um dos quais compreendendo um grupo lipofílico seleccionado de uma construção linear, ramificada, cíclica, policíclica, saturada ou insaturada, com ou sem heteroátomos incluídos na estrutura, que podem ser substituídos ou não substituídos, por exemplo, um análogo aminoácido lipídico, uma prostaglandina; um leucotrieno, um mono- ou diglicérido; um esterol; um derivado de esfingosina ou ceramida; e um derivado substituído com silício ou halogéneo de tal grupo hidrofóbico. 0 grupo da cauda apresenta, de um modo preferido, 6 a 24 átomos de carbono e, de um modo mais preferido, compreende de 10 a 14 átomos de carbono. Podem estar presentes mais de um grupo de cauda em cada conjugado. Por 6 exemplo, podem fazer parte de cada conjugado um ou mais aminoácidos lipídicos com cadeias laterais hidrocarbonadas, ligadas a um ou mais aminoácidos no grupo da cabeça.

Pode ser utilizado qualquer método químico para ligar o grupo de cabeça ao grupo da cauda. Por exemplo, cada conjugado pode ainda compreender um grupo espaçador ligando o grupo de cabeça ao grupo de cauda de modo a facilitar a apresentação do grupo de cabeça na superfície da associação não covalente. Tais grupos separadores são bem conhecidos e incluem, por exemplo, aminoácidos, ácidos hidroxílicos, açúcares e polietilenoglicol. A composição rastreada pelo método da presente invenção pode ser utilizada como um medicamento, um profilático ou para diagnóstico.

Uma vantagem da composição é que interacções de ligação específicas fortes podem ser alcançadas com conjugados nos quais os grupos de cabeça são pequenos em comparação com os receptores biológicos convencionais. Por exemplo, se o grupo de cabeça é um oligopéptido, então o comprimento da cadeia peptídica não irá, normalmente, exceder dez aminoácidos e irá, de um modo preferido, ser de seis ou menos. Consequentemente, as composições podem ser muito menos imunogénicas que as suas proteínas homologas. A formulação pode, não só, ser formulada de modo a interagir com um ligando in vitro, como também pode ser utilizada in vivo, formulada opcionalmente com um diluente, excipiente ou veículo adequado, de acordo com uma via de distribuição adequada. 7

Os conjugados podem ser dispersos na fase aquosa através de várias metodologias conhecidas para a preparação de vesículas lipídicas, incluído mistura mecânica, exposição a forças de cisalhamento elevadas, sonicação, dispersão em solvente ou co-dissolução com detergentes. Tipicamente, as associações não covalentes formadas deste modo serão compostas por vários conjugados diferentes misturados. Podem ser opcionalmente adicionados materiais lipídicos adicionais para alterar as propriedades da superfície, para auxiliar na dispersão dos conjugados, para estabilizar a associação não covalente dos conjugados, para auxiliar na apresentação dos grupos da cabeça dos conjugados ou para permitir a construção dos veículos que podem ser direccionadas pelos epitopos formados após movimento aleatório dos conjugados e posicionamento adequado dos grupos de cabeça dentro da associação. 0 passo de proporcionar os vários dos conjugados, inclui ensaiar a interacção entre a associação não covalente e o ligando.

Exemplos de ensaios para uma "interacção" suficiente podem incluir ensaios de ligação, tais como aqueles utilizando o princípio de ELISA para detecção de associação entre o anticorpo e o antigénio. Outros ensaios in vitro adequados, incluem modificação da fluorescência de sondas fluorescentes ligadas à membrana sensíveis ao ambiente, reacções de precipitação, aumento ou inibição da actividade enzimática, etc. Podem também ser apropriados ensaios baseados na capacidade dos materiais para alterar o comportamento de células cultivadas in vitro, tais como ensaios de morte celular, proliferação celular, apoptose, inibição ou estimulação do contacto célula-a-célula, secreção de citocinas ou outros produtos solúveis, síntese de ARNm específico, transporte vesicular intracelular, alteração dos processos de sinalização celular, etc. Podem também ser efectuados ensaios in vivo em animais inteiros ou humanos, por exemplo, incorporação de marcadores radioactivos nas unidades supramoleculares, seguido por investigação da sua distribuição subsequente após administração através de várias vias.

De acordo com o método da presente invenção, é utilizada uma abordagem combinatória na qual é preparada uma gama de associações não covalentes diferentes (ou "sondas"), cada uma contendo uma combinação diferente de conjugados seleccionados de um banco pré-sintetizado. A selecção dos conjugados apropriados pode ser baseada em propriedades conhecidas do ligando alvo ou podem simplesmente envolver a utilização de uma gama muito vasta de grupos de cabeça para aumentar a probabilidade de dois ou mais dos grupos de cabeça formarem um epitopo para o ligando. Deste modo, seguindo o ensaio para uma interacção suficiente entre a sonda e o ligando, como descrito acima, a combinação dos conjugados que parece ser a mais eficaz pode ser modificada por adição de outros grupos de cabeça, remoção de alguns grupos de cabeça ou ambos e ensaiando as sondas resultantes, mais uma vez, para interacção suficiente. Eventualmente, a combinação mais favorável dos grupos de cabeça pode ser identificada e seleccionada para utilização na composição.

Por isso, a presente invenção apresenta uma vantagem muito evidente em relação à química combinatória tradicional . Na química combinatória, a identificação da sequência mais favorável para ligação a um receptor específico deve ser efectuada por síntese de centenas de combinações possíveis de diferentes grupos, tais como aminoácidos, em diferentes ordens, sendo cada uma testada para a eficácia. Este processo é moroso, 9 dispendioso e está limitado pela natureza da química que pode ser efectuada na liqação dos diferentes componentes. Em contraste, a presente invenção baseia-se, simplesmente, na proximidade dos grupos de cabeça para proporcionar epitopos derivados da associação. Uma vez sintetizado um conjunto de conjugados, não é mais necessária química sintética, apenas a mistura simples dos conjugados para formar as diferentes sondas por associação não covalente.

Numa forma de realização simples preferida, o presente método utiliza conjugados com um aminoácido terminal individual ligado, via um espaçador, a um grupo de cauda lipídico que pode ser simplesmente combinado por mistura em meio aquoso para formar micelas nas quais cadeias laterais de aminoácidos diferentes serão apresentadas em conjunto em várias configurações. Consequentemente, é contornada a necessidade de apresentar os aminoácidos numa ordem especifica ou com um espaçamento ou orientação específicas. Em campos estatísticos, uma proporção das subunidades de aminoácido individuais irão estar sempre associadas numa configuração ideal.

Num arranjo, cada um dos conjugados apresentará a estrutura linear: X-espaçador-espaçador-lípido-lípido, onde X representa um aminoácido individual diferente de cada um dos conjugados distintos empregues.

Quando se pretende construir epitopos compostos por aminoácidos naturais, é possível simplificar mais o número de grupos de cabeça para selecção. Pode-se categorizar os resíduos de aminoácidos encontrados em materiais proteicos naturais em seis classes fundamentais utilizando, de um modo preferido, em qualquer uma das classes um aminoácido em vez de todos os 10 membros dessa classe, devido à flexibilidade espacial aumentada dos aminoácidos na posição terminal do grupo de cabeça. Isto tem o efeito de reduzir, consideravelmente, o número total de aminoácidos necessários para construir o banco pré-sintetizado de conjugados e, deste modo, o número total de grupos de cabeça utilizados. As classes principais de aminoácidos são apresentadas na Tabela 1 abaixo.

Tabela 1

Classe Representante Abreviatura Hidrofóbico Leucina L Hidroxilico Serina S Acidico Glutamato E Amida Glutamina Q Básico Histidina H Aromático Tirosina Y ;tão disponíveis várias estratégias para identificar combinações activas dos conjugados contendo aminoácidos.

Numa forma de realização, é empregue um número restrito de conjugados para formar uma gama de sondas distintas, onde cada sonda é uma suspensão aquosa de unidades supra-moleculares, cada unidade consistindo de conjugados seleccionados misturados em conjunto e cada um diferindo do outro como um resultado da inclusão de um conjugado adicional diferente, como apresentado abaixo, onde cada uma das letras apresentadas representa um conjugado com um aminoácido terminal diferente: 11

Sonda 1

ABC D

Sonda 2 ABC E

Sonda 3 ABC F

Sonda 3 ABC G

Sonda x ABC Z

Cada uma das sondas é testada separadamente nos ensaios biológicos para ligação suficiente como delineado acima.

Numa segunda forma de realização simples, pode ser construída uma sonda inicial que contém um grande número de conjugados diferentes do banco e a sua eficácia comparada com sondas, cada uma faltando um conjugado diferente, de modo a determinar quais os grupos de cabeça do banco são essenciais e quais são redundantes para a interacção biológica a ser investigada. Esta abordagem é ilustrada abaixo:

Sonda 1 A B C D E... Z

Sonda 2 A C D E... Z

Sonda 3 A B D E. . . Z 12

Sonda x A B C D E...

Podem ser preparadas combinações das abordagens alternativas como descrito acima.

Um conhecimento do ligando alvo pode auxiliar na concepção de uma série de partida adequada. Por exemplo, se o ligando é conhecido como sendo básico, fará sentido conferir um carácter acidico aos conjugados ao apresentá-los na forma onde esteja exposto um grupo carboxilico livre do aminoácido terminal. Introduzindo uma funcionalidade adicional ao utilizar um aminoácido particular, como um grupo espaçador adjacente ao aminoácido terminal, pode também conferir especificidade aumentada. Nos casos em que envolvimento de, digamos, uma sequência oligopeptidica curta de estrutura conhecida, tenha sido já implicada na ligação ao ligando alvo, tal sequência pode ser incorporada num conjugado para ser incluído no conjunto de conjugados que constituem a composição. A composição proporcionada no método da presente invenção pode ser utilizada num método para produzir uma molécula para interagir com um ligando. 0 método compreende produzir uma composição de acordo com um dos métodos definidos acima; identificar, pelo menos, os dois grupos de cabeça que formam um epitopo para o ligando na composição; e produzir uma molécula incorporando os grupos funcionais de, pelo menos, dois grupos de cabeça, opcionalmente separados por um ou mais grupos ligandos, de modo a que a molécula seja capaz de interagir com o ligando de um modo mais forte que cada um dos grupos de cabeça individualmente. 13

Enquanto as composições utilizadas no método da presente invenção podem, elas próprias, ser úteis em sistemas in vitro ou in vivo, talvez para induzir uma resposta biológica num método terapêutico, profilático ou de diagnóstico, nalgumas circunstâncias, pode ser produzida uma molécula baseada na estrutura das composições acima. Ao identificar os grupos funcionais de, pelo menos, dois grupos de cabeça que formam o epitopo para o ligando, pode ser produzida uma nova molécula análoga à composição, contendo o mesmo epitopo ou semelhante. Os grupos funcionais podem, por exemplo, ser incorporados num oligopéptido linear individual, possivelmente, com um ou mais grupos ligandos para separar os grupos funcionais uns dos outros.

Breve Descrição das Figuras A invenção irá agora ser descrita em maior detalhe, apenas como meio de exemplo, com referência aos seguintes Exemplos e figuras em anexo, nos quais: A FIGURA 1 mostra uma representação esquemática da superfície de uma unidade supramolecular e como tal composição utilizada no método de acordo com a presente invenção se liga a um ligando alvo; e A FIGURA 2 mostra uma representação esquemática da superfície de uma unidade supramolecular composta por dois conjugados não idênticos cujos grupos de cabeça consistem em péptidos lineares de cadeia curta. 14

Descrição Detalhada da Invenção

No que se refere à Figura 1, uma secção 1 de uma composição utilizada no método de acordo com a presente invenção é apresentada na forma de uma micela na qual os grupos 2 de cabeça e os grupos 3 de cauda formam, em conjunto, conjugados 4 (Fig. IA) . É apresentado um ligando 5 alvo à composição 1. Porque os conjugados são moviveis, ocorre um rearranjo (Fig. 1B) para permitir o posicionamento dos grupos 2 de cabeça para se ligarem ao ligando 5 alvo. Em relação à Figura 2, é apresentada uma secção de uma composição utilizada no método de acordo com a presente invenção na forma de uma unidade supramolecular, na qual a ligação de um ligando à superfície do conjunto é efectuada pela criação de um epitopo construído via associação não covalente de dois conjugados compostos por péptidos de cadeia curta (A), sendo este epitopo capaz de interagir com o ligando de um modo mais forte que qualquer um dos conjugados individuais isolados (B) . Aplica-se o mesmo princípio para os grupos de cabeça contendo outras estruturas que não aminoácidos.

EXEMPLOS

Nos exemplos apresentados abaixo, é empregue a convenção padrão para a representação de aminoácidos por letras individuais do alfabeto, excepto que em todos os casos a letra refere-se aos conjugados, como descrito acima, nos quais esse aminoácido particular ocupa a posição terminal na cadeia peptídica. Nos exemplos aqui descritos, o lípido compreende dois aminoácidos ligados através de uma cadeia peptídica, na qual ambos os aminoácidos são análogos de glicina, onde, em cada caso, o hidrogénio alfa foi substituído por uma cadeia 15 hidrocarbonada linear contendo 12 ou 14 carbonos. As ligações entre o grupo da cabeça e o espaçador e entre o espaçador e o lípido são todas efectuadas via ligações peptídicas. 0 grupo de cabeça contém um grupo amino livre e a extremidade livre do lípido contém um grupo CONH2. A estrutura de cada conjugado é, assim: NH2-grupo de cabeça-espaçador-aminoácido (cadeia lateral Ci4)-aminoácido (cadeia lateral Ci2)-CONH2.

Exemplo 1: Estimulação da secreção de TNF de macrófagos 1. Foram preparados conjugados individuais E, Y, Q, S & H (ligados ao lípido via um espaçador serina-glicina) como soluções em metanol/diclorometano 1:1 a uma concentração de 5 mg/mL.

2. Foram colocadas soluções dos conjugados em frascos de 7 mL em proporções iguais, para proporcionar um volume final de 400 pL (2 mg de sólido) em todos os frascos, como apresentados no exemplo seguinte. Nos casos onde o volume de solução orgânica disponível foi insuficiente, foi efectuado ajuste numa fase posterior, quando a quantidade de água adicionada para reconstituição foi, como apresentado, consequentemente reduzida. 3. Os conteúdos de todos os frascos foram completamente secos sob um fluxo de azoto, depois expostos a um vácuo de, pelo menos, 1 mbar de um dia para o outro, num liofilizador. 4. No dia seguinte, foi adicionada água destilada em volumes, como indicado na tabela seguinte, para proporcionar uma concentração final de 1 mg/mL em todos os frascos. Os frascos 16 foram tapados, aquecidos até 37 °C e sonicados num banho até ser alcançada transparência. 5. As amostras foram depois aplicadas em poços de placas cluster de 24 poços, os quais tinham plaqueados com células da linha celular de macrófaqos J774A-1 (5 x 104 células/mL/poço). Foram adicionados volumes de 100 μΐ e 10 μΐ de amostra aos poços individuais e as células foram incubadas de um dia para o outro a 37 °C numa atmosfera de 5% de C02/ar.

No dia seguinte, foram recolhidos, de cada poço, volumes duplicado de 50 pL de sobrenadante e determinada concentração de TNF num ensaio ELISA de captura. resultados obtidos são apresentados na tabela abaixo. Volume do conjugado Volume de fornecido água adicionado E Y Q s H E 260 ÇL 1,3 mL Y 400 pL 2,0 mL Q 310 pL 1,55 mL s 360 pL 1,8 mL H 400 pL 2,0 mL EY 200 pL 200 pL 2,0 mL EQ 200 pL 200 pL 2,0 mL ES 200 pL 200 pL 2,0 mL EH 200 pL 200 pL 2,0 mL YQ 200 pL 200 pL 2,0 mL YS 200 pL 200 pL 2,0 mL 17 (Continuação)

Volume do conjugado Volume de fornecido água adicionado E Y f Q S H YH 200 pL 200 pL 2,0 mL QS 200 pL 200 pL 2,0 mL QH 200 pL 200 pL 2,0 mL SH 2 00 pL 200 pL 2,0 mL QSH 133 pL 133 pL 133 pL 2,0 mL YSH 133 pL 133 pL 133 pL 2,0 mL YQH 133 pL 133 pL 133 pL 2,0 mL YQS 133 pL 133 pL 133 pL 2,0 mL ESH 133 pL 133 pL 133 pL 2,0 mL EQH 133 pL 133 pL 133 pL 2,0 mL EYH 133 pL 133 pL 133 pL 2,0 mL EYS 133 pL 133 pL 133 pL 2,0 mL EYQ 133 pL 133 pL 133 pL 2,0 mL EQS 133 pL 133 pL 133 pL 2,0 mL EYQS 50 pL 50 pL 50 pL 50 pL 1,0 mL EYQH 50 pL 50 pL 50 pL 50 pL 1,0 mL EYSH 50 pL 50 pL 50 pL 50 pL 1,0 mL EQSH 50 pL 50 pL 50 pL 50 pL 1,0 mL YQSH 50 pL 50 pL 50 pL 50 pL 1,0 mL EYQSH 40 pL 40 pL 40 pL 40 pL 40 pL 1,0 mL 18 OD450 nos sobrenadantes de J774 100 pg 10 pg E 0, 628 0,098 Y 0,313 0,053 Q 0, 083 0,015 s 0,348 0,143 H 0, 632 0,206 EY 0,198 0,027 EQ 0,113 0,022 ES 0,211 0,225 EH 0,167 0,037 YQ 0,245 0,034 YS 0, 786 0,363 YH 0,541 0,133 QS 0,212 0,025 QH 0,135 0,027 SH 0,515 0,177 QSH 0,253 0,032 YSH 0, 712 0,229 YQH 0,290 0,020 YQS 0,519 0,119 ESH 0,380 0,246 EQH 0,107 0,026 EYH 0,254 0,042 EYS 1,289 0,355 EYQ 0,191 0,064 EQS 0,209 0,027 EYQS 0, 777 0,206 EYQH 0,224 0,067 EYSH 0,262 0,146 EQSH 0,149 0,185 0 pg 0,013 19 (Continuação) OD450 nos sobrenadantes de J774 100 pg 10 pg 0 pg YQSH 0,319 0,045 EYQSH 0,375 0,073

Pode-se observar que algumas, mas não todas, as combinações de grupos de cabeça diferentes induzem fortes respostas biológicas, indicando que a resposta é especifica para essas combinações em particular. 0 exemplo ilustra o modo através do qual os conjugados descritos podem ser empregues na abordagem combinatória para identificar combinações eficazes para o objectivo de induzir uma resposta biológica desejada.

Exemplo 2: Secreção de TNF de macrófagos

Comparação de unidades supramoleculares contendo uma mistura de conjugados, com uma mistura de unidades supramoleculares contendo, cada uma, um único conjugado

As amostra foram preparadas como descrito no Exemplo 1, com ou sem a inclusão de materiais lipidicos adicionais, como descrito abaixo. Foi escolhida a combinação de conjugados Y, S e L uma vez que esta combinação proporcionou um bom desempenho na experiência descrita no Exemplo 1.

Foram preparadas sondas contendo fosfatidilcolina numa proporção de fosfolípido para conjugado de 2:1 em p/p. 20

Foram preparadas sondas contendo octilglucósido numa proporção de glicolípido para conjugado de 1:1 em p/p.

Os resultados na tabela abaixo são densidades ópticas a 450 nm de ELISA para o TNF efectuadas com sobrenadantes de cultura de 18 h. A concentração de conjugado nos poços foi de 10 yg/mL. EYS OD45o de TNF ELISA 0,390 E+Y+S 0,059 meio de controlo 0,000 EYS:OG 0,559 (E+Y+S):OG 0,193 controlo OG 0,228 EYS:PC 0,320 (E+Y+S):PC 0,130 controlo PC 0,081

Este exemplo mostra que combinações dos conjugados podem induzir respostas biológicas quando apresentados isolados ou quando presentes em conjunto com outros lípidos, tais como fosfolipidos ou açúcares lipidicos. Também mostra que para a eficácia ser manifestada é importante que todos os conjugados sejam apresentados em combinação na mesma unidade supramolecular e que não é observada actividade se os mesmos conjugados estiverem presentes em conjunto em simultâneo, mas separados em 21 diferentes unidades supramoleculares. Isto sugere que é importante apresentar os conjugados muito próximos uns dos outros, de modo a permitir a formação de epitopos formados pela associação não covalente dos conjugados, que participam na ligação especifica com os receptores de superfície celular.

Exemplo 3: Aumento da Absorção Oral 1. Foram preparados conjugados individuais L, S, E & Q (conjugados ao lípido via um espaçador tirosina-glicina) como soluções em álcool benzílico a uma concentração de 10 mg/mL. 2. Foram colocados 75 pL de 14C-oleato de colesterol (3,7 MBq/mL em tolueno) no interior de quarto frascos de vidro de 7 mL com tampa de rosca e completamente secos sobre um fluxo de azoto. 3. Foram adicionados 400 μL de cada uma das soluções em (1) a um dos frascos em (2) e agitados de um dia para o outro à temperatura ambiente. 4. As soluções dos conjugados foram adicionadas a frascos de vidro de 7 mL em proporções iguais, para proporcionar um volume final de 80 pL (0,8 mg de sólido) em todos os frascos, como indicado no exemplo abaixo. 22

L S E Q L 80 μL - - - S - 80 pL - - E - - 80 pL - Q - - - 80 pL LS 40 pL 4 0 pL - - LE 40 pL - 40 pL - LQ 40 pL - - 40 pL SE - 4 0 pL 40 pL - SQ - 40 pL - 40 pL EQ - - 40 pL 40 pL LSE 27 pL 27 pL 27 pL - LSQ 27 pL 27 pL - 27 pL LEQ 27 pL - 27 pL 27 pL SEQ - 27 pL 27 pL 27 pL LSEQ 20 pL 20 pL 20 pL 20 pL 5. Foram adicionados 2 mL de água destilada a cada um dos frascos foi agitado como vórtex. Os frascos foram depois tapados e sonicados no banho durante 20 minutos. 6. As amostras foram depois congeladas em azoto liquido e liofilizadas de um dia para o outro. 7. No dia seguinte, cada frasco foi reconstituído com 2 mL de água destilada e novamente sonicado até serem obtidas dispersões límpidas. 8. As amostras foram administradas através de sonda gástrica a murganhos Balb/C fêmeas (20-25 g de peso - quatro murganhos por grupo) a uma dose de 0,3 mL por animal. 23 9. Foram recolhidas amostras de 75 yL de sangue com heparina por punção da venosa da cauda 45, 90 e 180 minutos depois da administração. 10. Cada amostra foi diluída em 0,5 mL de PBS, que foram depois centrifugadas e 0,4 mL do sobrenadante foram transferidos para um frasco de cintilação ao qual foram adicionados, com mistura, 2 mL de Optiphase Hisafe 3 (Wallac). 11. A actividade nas amostras foi determinada num contador de cintilações. A percentagem de absorção foi estimada com base num volume de 2 mL, dos quais se assumiu que 1 mL era plasma.

Os resultados são apresentados na tabela abaixo. % de absorção na corrente sanguínea 45 min 90 min 180 min

L

S

E

Q

LS

LE

LQ

SE

SQ EQ

LSE

LSQ 0, 90 1,39 0, 61 1,12 1,14 0,81 0. 85 1,55 0,79 1,40 3,00 0,81 2,87 2,38 0,66 2,59 2,22 0,49 5,05 2,15 0,45 4,21 1,66 0,70 4,67 1,45 0,67 3,72 2,65 0,59 1, 91 1,20 0, 97 6,23 1, 90 0, 80 24 leq 2,77 1,73 o, 98 SEQ 3,06 1,52 o, 63 LSEQ 2,45 1,74 o, 81

Pode ser observado que algumas, mas não todas, as combinações de diferentes grupos de cabeça aumentam a absorção de marcador através da via oral, indicando que a resposta é especifica para essas combinações em particular. 0 exemplo ilustra o modo através do qual os conjugados descritos podem ser empregues na abordagem combinatória, para identificar combinações eficazes capazes de actuar como ligando de direccionamento.

Exemplo 4: Ligação de Fc por ELISA 1. Foram adicionados 100 pL de IgG de cabra (1 mg/mL) a 20 mL de PBS e 100 pL foram colocados em cada um dos poços de uma placa de microtitulação de fundo plano. 2. A placa foi incubada durante vários dias a +4 °C. 3. Foram pesadas 2 mg de cada um dos conjugados Y, F, W, L, S, E, Q & R (cada um ligado ao lípido via um espaçador serina-glicina) para o interior de frascos de vidro de 1 mL e foram adicionados 200 pL de álcool benzílico para proporcionar soluções de cada conjugado a uma concentração de 10 mg/mL. 4. As soluções foram adicionadas a frascos de vidro de 7 mL com tampa de rosca, como abaixo: 25

Frasco N° Y F n L 1 2 0 pL 20 pL 20 pL - 2 2 0 pL 20 pL - 20 pL 3 2 0 pL - 20 pL 20 pL 4 - 20 pL 20 pL 20 pL

5 20 pL 20 pL 20 pL - 6 20 pL 20 pL - 20 pL 7 20 pL - 20 pL 20 pL 5. Os conteúdos de cada frasco foram bem misturados por vórtex, depois foram adicionados 1,5 mL de água destilada a cada frasco. 6. Os frascos foram tapados e sonicados em banho durante cinco minutos para proporcionar dispersões de cristais límpidas. 7. A placa do passo (2) foi lavada em PBS/Tween 20 a 0,02% e depois bloqueada por incubação durante uma hora com BSA a 1% em PBS (300 pL/poço). 8. A placa foi depois lavada como acima, e foram adicionados 100 pL de amostra de cada um dos frascos no passo (6) aos poços na coluna (1) entre as linhas (1) e (7) . A linha (8) foi deixada como um branco de controlo. 9. Foram efectuadas diluições em duplicado ao longo da placa por transferência de 100 pL dos poços na coluna (1) para o poço adjacente na mesma linha na coluna (2) e mistura, depois transferência de 100 pL para a coluna seguinte, como anteriormente, etc. 26 10. A placa foi depois incubada de um dia para o outro a +4 °C. 11. No dia seguinte, a placa foi lavada como acima, e foram adicionados 100 pL de conjugado peroxidase de rábano-IgG comercial (diluído 1/1000 em PBS) a cada poço e incubada à temperatura ambiente durante 40 minutos. 12. A placa foi depois novamente lavada e foram adicionados a cada poço 100 pL de substrato OPD para a peroxidase e incubada à temperatura durante 30 minutos. 13. Foram depois adicionados 20 pL de ácido sulfúrico 3 M, a cada poço, para interromper a reacção. 14. A densidade óptica de cada um dos poços foi determinada a 4 50 nm num leitor de placas e os resultados obtidos, após ajuste pela linha de base, são apresentados abaixo. 1 em 4 1 em 8 1 em 16 1 em 32 1 em 64 Amostra 1 YFW 0,001 0,039 0,048 0,053 0,083 2 YFL 1,504 1,484 1,325 0,723 0,051 3 YWL 0,803 0,192 0,022 0,023 0,060 4 FWL 1,034 0,778 0,208 0,031 0,034 5 SEQ 0,029 0,041 0,055 0,057 0,091 6 SER 0,013 0,030 0,044 0,062 0,075 7 SQR 0,000 0,045 0,031 0,054 0,065 27

Observa-se que a ligação máxima é obtida com as amostras 2, 3 e 4 (i. e., combinações YFL, YWL e FWL).

Pode ser observado que algumas, mas não todas, as combinações de diferentes grupos de cabeça participam em interacções de ligação fortes, indicando que a resposta é especifica para essas combinações em particular. 0 exemplo ilustra o modo através do qual os conjugados descritos podem ser empregues na abordagem combinatória para identificar combinações eficazes para o objectivo de induzir uma interacção de ligação desejada.

Lisboa, 6 de Setembro de 2007 28

Claims (15)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Método para rastrear composições para a interacção com um ligando alvo, cujo método compreende: (a) proporcionar vários conjugados distintos, compreendendo cada conjugado um grupo de cabeça e um grupo de cauda, em que os conjugados apresentam capacidade para formar micelas, os grupos de cabeça são hidrofílicos e os grupos da cauda são lipofílicos; e (b) formar a partir dos vários conjugados, uma sua associação não covalente que compreende uma micela, na qual os grupos de cauda se agregam hidrofobicamente e na qual os conjugados são moviveis, de modo a que, na presença de um ligando, pelo menos, dois dos grupos da cabeça estejam posicionados apropriadamente para formar um epitopo capaz de interagir com o ligando de um modo mais forte que cada um dos grupos de cabeça individualmente, em que o passo de proporcionar vários conjugados compreende: (i) seleccionar um conjunto de conjugados com uma série de grupos de cabeça; (ii) formar uma associação não covalente a partir destes, na qual os grupos da cauda se agregam hidrofobicamente e na qual os conjugados são moviveis; (iii) ensaiar a interacção entre a associação não covalente e o ligando; 1 (iv) repetir, opcionalmente, os passos (i) a (iii) utilizando um conjunto de conjugados com uma série modificada de grupos da cabeça; e (v) ao encontrar interacção no passo (iii), seleccionar o conjunto de conjugados como os vários conjugados no passo (a).
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que cada conjugado tem um grupo de cabeça seleccionado de: um aminoácido ou péptido; um análogo peptídico; um mono- ou polissacárido; um mono- ou polinucleótido; um esterol, uma vitamina solúvel em água; um núcleo porfirina ou heme; um quelato de ião metálico; um fármaco solúvel em água; uma hormona ou um substrato enzimático.
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 2, em que cada grupo de cabeça compreende um aminoácido.
4. 4. Método de acordo com a reivindicação 3, em que cada grupo de cabeça compreende um péptido compreendendo o aminoácido.
5. 5. Método de acordo com a reivindicação 3 ou reivindicação 4, em que os grupos de cabeça que formam o epitopo compreendem aminoácidos terminais seleccionados de, pelo menos, dois dos seguintes: aminoácidos hidrofóbicos, aminoácidos hidroxilicos, aminoácidos acídicos, aminoácidos amida, aminoácidos básicos e aminoácidos aromáticos. 2
6. 6. Método de acordo com a reivindicação 3 ou reivindicação 4, em que o aminoácido é seleccionado de aminoácidos naturais, derivados substituídos análogos e suas formas D.
7. 7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que cada grupo da cauda é igual ou diferente e compreende um grupo lipofilico seleccionado de um ácido gordo de cadeia linear ou ramificada, álcool ou aldeído com, pelo menos, 8 átomos de carbono; um análogo aminoácido lipídico; uma prostaglandina; um leucotrieno, um mono- ou diglicérido; um esterol; um derivado de esfingosina ou ceramida; e um derivado substituído com silício ou halogéneo de tal grupo lipofilico.
8. 8. Método de acordo com a reivindicação 7, em que cada grupo lipofilico compreende um hidrocarboneto Cio a C14.
9. 9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que cada conjugado compreende ainda um grupo espaçador ligando o grupo da cabeça ao grupo da cauda.
10. 10. Método de acordo com a reivindicação 9, em que o grupo espaçador é hidrofílico.
11. 11. Método de acordo com a reivindicação 9 ou reivindicação 10, em que o grupo espaçador é seleccionado de aminoácidos, ácidos hidroxílicos, açúcares e polietilenoglicol.
12. 12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, em que cada um dos conjugados apresenta a estrutura: X-espaçador-espaçador-lípido-lípido, onde X representa um 3 aminoácido individual diferente de cada um dos conjugados distintos empregues.
13. 13. Método de acordo com a reivindicação 1, em que cada conjugado inclui um ou mais aminoácidos lipidicos que apresentam uma cadeia lateral compreendendo o hidrocarboneto Cio a Ci4.
14. 14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a associação não covalente compreende também material lipídico adicional.
15. 15. Método de acordo com a reivindicação 14, em que o material lipídico adicional compreende um fosfolípido ou açúcar lipídico. Lisboa, 6 de Setembro de 2007 4