CN110290805A

CN110290805A - 通用流感疫苗组合物

Info

Publication number: CN110290805A
Application number: CN201880012749.4A
Authority: CN
Inventors: 拉米拉·菲利普
Original assignee: Emerjax Vaccine Holdings Ltd
Current assignee: Emerjax Vaccine Holdings Ltd; Emergex Vaccines Holding Ltd
Priority date: 2017-01-03
Filing date: 2018-01-03
Publication date: 2019-09-27
Also published as: MX2019007973A; ZA201904505B; US20190321460A1; CA3049190A1; EP3565590A1; BR112019013724A2; AU2018206291A1; US20220233679A1; PH12019501569A1; US11273216B2; EA201991377A1; SG11201906190YA; JP2020504179A; WO2018127689A1

Abstract

本发明提供了一种疫苗组合物，其包含含有CD8+ T细胞表位的流感病毒肽和含有B细胞表位的流感病毒肽，其中每个肽与纳米颗粒连接。

Description

通用流感疫苗组合物

技术领域

本发明涉及包含流行性感冒（流感）肽的疫苗组合物，以及所述组合物用于治疗和预防流感病毒感染的用途。

背景技术

流感是一个严重的全球健康问题，每年感染世界人口的20%，导致全球多达500万例严重疾病和超过30万人死亡。仅在美国，每年估计有超过30,000人死亡以及近30万人住院治疗是由于流感感染。随着最近新的、严重的和可能复发的季节性疾病的出现，世界卫生组织正在鼓励开展广泛的疫苗接种运动，以降低流感引起的肺炎的发病率。有效地降低流感的发病率将需要持续的密集的监测、增加目前可用的流感疫苗的使用、以及能够提供更广泛的保护以防止流感的菌株移位和漂变（shift-and-drift）的替代的疫苗和抗病毒药物的实用性。成功的流感疫苗接种运动能够产生巨大的社会和经济影响。

对流感的免疫反应是由先天免疫和适应性免疫共同控制的。对流感的先天免疫反应限制了最初的病毒复制，但相对来说是非特异性的。流感病毒的有效清除需要强大的适应性免疫反应，激活体液和细胞介导的免疫。分泌性IgA和IgM抗体介导的体液免疫提供了对初始感染建立的保护，而IgG抗体在已建立的感染中中和新复制的病毒。

常规的流感疫苗旨在诱导对流感病毒的体液免疫。然而，由于抗原变异的发生，这些疫苗并不完全具有保护作用。此外，人们认为T细胞反应可能在预防流感中具有关键作用。CD4+ T细胞在同型转换为IgG中以及更高亲和力抗体和CTL记忆的产生中起着关键作用。在人类中，血凝素（HA）特异性CD4+ T细胞在流感疫苗接种后增殖，并有助于异型流感抗体反应的发展。CD8+ 细胞毒性T淋巴细胞（CTL）介导病毒清除，并且已显示出对不同亚型的甲型流感病毒具有交叉反应性反应。这可能解释了在年龄较大、接种过流感疫苗或以前接触过流感的个体中疾病相对较少的原因。

目前市场上的流感疫苗每年更新一次。它们的设计是基于世界卫生组织每年的菌株建议，并且它们是在流感季节或大流行开始之前制造的。目前的流感疫苗诱导针对病毒表面上HA和神经氨酸酶（NA）糖蛋白的保护性体液免疫反应。然而，病毒HA和NA糖蛋白极易受到频繁和不可预测的抗原移位以及导致抗体识别丧失的较不频繁但更严重的漂变的影响。这就需要经常开发新的疫苗，以匹配感染人群的目前的病毒血清型。因此，现有流感疫苗的生产成本很高，并且不太可能对季节中期出现的新毒株（例如2009年H1N1猪流感、H5N1、H7N9）起到保护作用。此外，这些疫苗被设计用于提供基于抗体的保护，很少考虑对于从体内消除病毒感染的细胞而言重要的T细胞应答的诱导。

FDA已经批准了几种四价疫苗（预防两种甲型流感和两种乙型流感病毒）。虽然这些疫苗提供了比常规的流感疫苗更广泛的保护，但它们仍然不太可能对季节中出现的新菌株起到保护作用并且生产成本高昂。此外，与常规的流感疫苗一样，四价疫苗不是被设计用于引起对于从体内清除病毒感染的细胞很重要的T细胞反应。

因此，需要一种针对所有季节性流感毒株和多年的大流行毒株（如果不是整个寿命）提供广泛保护的“通用”流感疫苗。开发有效的通用的流感疫苗可以减少对未来流感大流行的担忧，并且比按照目前的做法开发和制造年度的季节性流感疫苗更具成本效益。

几种通用的疫苗配方正在开发中。这些通用的疫苗能够通过以下它们刺激的保护性免疫应答的类型被广泛地表征：1）B细胞应答（抗体），2）T细胞应答，或3）B和T细胞应答。Kanekiyo等人产生了诱导对多种流感毒株提供覆盖的高滴度抗体反应的HA纳米颗粒（与铁蛋白融合的HA）。这种疫苗尚未进入临床试验。靶向病毒基因组中四个相对保守的表位的基于T细胞的疫苗也在开发中。一种对包括大流行毒株的各种流感毒株具有积极的保护反应的基于高度保守的CD4表位的T细胞疫苗已经在II期挑战研究中进行了评估。一种并入了来自9种不同的流感蛋白的B细胞、CD4 T细胞和CD8 T细胞保守表位的名为Multimeric-001的重组多表位疫苗目前正在进行早期临床试验。由核蛋白（NP）和与佐剂连接的B细胞表位M2e和金纳米颗粒中与CpG结合的M2e肽组成的融合蛋白疫苗也在开发中。大多数上面提到的疫苗都是用各种佐剂配制的，当在临床上使用时往往会引起不良反应。

发明概述

本发明涉及一种流感疫苗组合物，其刺激免疫应答，同时避免通常与含有佐剂的疫苗相关的不利的临床效果。一方面，所述疫苗组合物既刺激流感病毒特异性抗体的产生，又刺激T细胞对流感病毒的应答。刺激体液和细胞反应允许疫苗模仿对自然病毒感染的免疫反应（图1）。所述疫苗组合物可以提供对季节性和大流行性（pandemic）流感毒株的保护，例如，所述疫苗组合物可以是通用的疫苗。

本发明人惊奇地发现，纳米颗粒（例如金纳米颗粒）可以被用于诱导对疫苗组合物的有效反应，所述疫苗组合物被设计用于刺激流感病毒特异性抗体的产生和针对流感病毒的T细胞应答。纳米颗粒的使用消除了在疫苗组合物中包含传统的佐剂的需要。因此，降低了在施用疫苗组合物后个体经历不良反应的可能性。

本发明人还鉴定了许多在不同流感病毒之间是保守的并且由感染这些病毒的细胞上的MHC分子呈递的保守的肽。将这些保守的肽包含在疫苗组合物中，可以赋予对季节性和大流行性流感毒株的保护能力。在疫苗组合物中包括多个与不同的HLA超类型结合的保守的肽，导致在具有不同的HLA类型的个体中有效的疫苗。

因此，本发明提供一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包含连接至纳米颗粒的一种或多种免疫原性流感病毒肽。

本发明还提供：

-一种疫苗组合物，包含含有CD8+ T细胞表位的流感病毒肽和含有B细胞表位的流感病毒肽，其中每个肽被连接至纳米颗粒；

一种疫苗组合物，包含含有在SEQ ID NO：1至18中列出的CD8+ T细胞表位中的一个或多个的流感病毒肽，其中所述肽被连接至纳米颗粒；

-一种预防或治疗流感病毒感染的方法，包含

将本发明的疫苗组合物施用于感染或有风险感染流感病毒的个体；以及

-本发明的疫苗组合物用于预防或治疗个体中的流感病毒感染的方法中。

附图说明

图1：模拟由病毒感染产生的适应性免疫反应的疫苗。

图2：流感特异性肽序列的确认。

图3：在体外用人PBMC产生的表位（P1-P5）特异性CTL识别载有肽的（图A）和被各种流感病毒感染的（图B）靶细胞。

图4：在HLA A2转基因小鼠体内产生的表位（P1-P5）特异性CTL识别载有肽的（图B）和被各种流感病毒感染的（图C）靶细胞。

图5：并入NP中的表位（NP 1-5）激活HLA A2转基因小鼠中的各种流感病毒特异性CTL。图A&B：酶联免疫斑点法；图C：CD107表达。

图6：M2e肽+佐剂（Pep 6）或NP（NP6）的免疫诱导特异性的抗体应答（图A）。没有佐剂的游离肽没有抗体反应（图B）。

图7：M2e肽特异性的抗血清结合受流感病毒感染的细胞（PR8、X-31或JAP（分别为绿色、浅绿色、红色）上的M2e表位。

图8：图8：抗M2e介导的感染中和。上图中使用的血清是从肽免疫的小鼠分离的，下图中使用的血清是从NP免疫的小鼠中分离的。

图9：暴露于流感病毒的健康个体中天然存在的M2e抗体应答。

图10：通过来自登革热血清阳性个体的PBMC的加压分析检测预先存在的表位特异性CTL。

图11：图11：血清阳性个体中的表位特异性CTL识别载有肽的（pep）和被登革热病毒感染的（DV2）靶细胞。

图12：嵌入较长的肽中的CD8表位被加工并呈递在APC上。上图，通过流式细胞术检测的SIIN:Kb复合物。下图，杂交瘤测定中的SIIN特异性T细胞活化。

本发明的详细描述

疫苗组合物刺激体液和细胞反应

本发明提供一种疫苗组合物，其包含连接至纳米颗粒的一种或多种免疫原性流感病毒肽。特别地，疫苗组合物包含含有CD8+ T细胞表位的流感病毒肽和含有B细胞表位的流感病毒肽，其中每个肽被连接至纳米颗粒。

该疫苗组合物与本领域已知的常规的流感疫苗相比具有许多优点。这里总结了关键优点。然而，通过下面的讨论，其他优点将变得显而易见。

首先，本发明的疫苗组合物有利地包含含有CD8+ T细胞表位的流感病毒肽和含有B细胞表位的流感病毒肽。因此，所述疫苗组合物能够刺激针对流感病毒的细胞和体液免疫应答。如上所述，体液免疫应答提供针对流感病毒感染的第一道防线。特别地，分泌型IgA和IgM抗体防止初始流感病毒感染的建立，例如通过防止病毒连接至粘膜表面的上皮细胞。然后，在建立的感染期间，IgG抗体中和新复制的病毒，以帮助减少病毒繁殖。因此，体液反应在预防和治疗流感病毒感染中具有重要作用。然而，细胞反应也很重要，特别是T细胞反应。CD4+ T细胞控制同种型转换为IgG，因此控制复制病毒的中和。CD4+ T细胞还有助于更高亲和力的抗体的产生和细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）记忆。CD8+ CTL本身通过其对受感染的细胞的细胞毒活性而介导病毒的清除。因此，刺激体液和细胞免疫提供了针对流感病毒感染有益的双管齐下的攻击。

其次，所述疫苗组合物中的每种流感病毒肽被连接至纳米颗粒，例如金纳米颗粒。如下文更详细描述的，连接至纳米颗粒减少或消除了在疫苗组合物中包括佐剂的需求。因此，所述疫苗组合物在施用于个体时不太可能引起不利的临床效果。

流感病毒肽

本发明的疫苗组合物包含一种或多种免疫原性流感病毒肽。所述疫苗组合物可以包含约1至约50种流感病毒肽，例如约2至40、30至30、4至25、5至20、6至15、7、8、9或10种流感病毒肽。每个肽包含一个或多个表位，其可以是CD8+ T细胞表位、CD4+ T细胞表位和/或B细胞表位。

在一个方面，所述疫苗组合物包含含有CD8+ T细胞表位的流感病毒肽和含有B细胞表位的流感病毒肽。

流感病毒肽是由一种或多种流感病毒表达的肽。流感病毒是众所周知的正粘病毒科家族的成员。存在数百种流感病毒株，根据它们表达的HA和NA蛋白，可分为三大类：甲型流感、乙型流感或丙型流感。所述疫苗组合物可以包含来自流感的多种病毒株的流感病毒肽，例如流感的1至2000、100至1900、200至1800、300至1700、400至1600、500至1500、600至1400、700至1300、800至1200或900至1100株。例如，所述疫苗组合物可以包含再一种来自甲型流感、乙型流感和/或丙型流感的流感病毒肽。因此，包含CD8+ T细胞表位的流感病毒肽可以是由甲型流感、乙型流感和/或丙型流感病毒表达的肽。包含B细胞表位的流感病毒肽可以是由甲型流感、乙型流感和/或丙型流感病毒表达的肽。包含CD8+ T细胞表位的流感病毒肽和包含B细胞表位的流感病毒肽可以是由相同的流感毒株（例如甲型流感、乙型流感或丙型流感）表达的肽。可替代地，包含CD8+ T细胞表位的流感病毒肽和包含B细胞表位的流感病毒肽可以是由不同的流感病毒株表达的肽。

如果流感病毒肽是由甲型流感病毒表达的肽，则所述甲型流感病毒可以是例如H1N1、H5N1、H7H9或H3N2。优选地，所述流感病毒肽是由H1N1、H5N1、H7H9和H3N2甲型流感病毒中的两种或更多种表达的，例如H1N1和H3N2。流感病毒肽可以是由人流感病毒、猪流感病毒和/或禽流感病毒表达的肽。流感病毒可以是大流行性流感病毒或可能的大流行性流感病毒。流感病毒可以是人畜共患流感病毒。

流感病毒肽可以是在一种或多种流感病毒的表面上表达的肽，或在一种或多种流感病毒内的细胞内表达的肽。肽可以是结构肽或功能肽，例如参与流感病毒代谢或复制的肽。优选地，肽是内部的肽。优选地，肽在两种或更多种不同的流感毒株之间是保守的。

流感病毒肽可以含有任何数量的氨基酸，即具有任何长度。通常，流感病毒肽的长度为约8至约30、35或40个氨基酸，例如长度为约9至约29、约10至约28、约11至约27、约12至约26、约13至约25、约13至约24、约14至约23、约15至约22、约16至约21、约17至约20、或约18至约29个氨基酸。

流感病毒肽可以化学衍生自多肽流感病毒抗原，例如通过蛋白水解切割。更典型地，可以使用本领域熟知的方法合成流感病毒肽。

术语“肽”不仅包括其中氨基酸残基通过肽（-CO-NH-）键连接的分子，还包括其中肽键被逆转的分子。这种逆反（retro-inverso）模拟肽可以使用本领域已知的方法制备，例如Meziere et al (1997) J. Immunol.159, 3230-3237中描述的方法。该方法涉及制备含有涉及骨架的变化的伪肽，而不是侧链的方向。Meziere等（1997）表明，至少对于MHC II类和T辅助细胞应答，这些伪肽是有用的。含有NH-CO键而不是CO-NH肽键的逆反肽对蛋白质水解具有更强的抗性。

类似地，肽键可以被完全省略，条件是使用适合的连接部分保持氨基酸残基的碳原子之间的间隔；如果连接部分具有与肽键基本相同的电荷分布和基本相同的平面性，则是特别优选的。还应理解，肽可以方便地在其N-或C-末端被封闭，以帮助降低对外蛋白水解消化的易感性。例如，肽的N-末端氨基可以通过与羧酸反应来保护，肽的C-末端羧基可以通过与胺反应来保护。修饰的其他实施例包括糖基化和磷酸化。另一种可能的修饰是R或K的侧链胺上的氢可以被亚甲基取代（-NH2可以被修饰为-NH(Me)或-N(Me)₂）。

术语“肽”还包括在体内增加或减少肽的半衰期的肽变体。根据本发明使用的能够增加肽的半衰期的类似物的实施例包括肽的类肽类似物、肽的D-氨基酸衍生物和肽-类肽杂合物。根据本发明使用的变体多肽的另一个实施方案包括多肽的D-氨基酸形式。使用D-氨基酸而不是L-氨基酸制备多肽，大大降低了这种试剂通过正常代谢过程的任何不希望的分解，减少了需要施用的试剂的量以及其施用频率。

CD8+ T细胞表位

本发明的疫苗组合物优选地包含含有CD8+ T细胞表位的流感病毒肽。CD8+ T细胞表位是能够（i）通过I类MHC分子呈递和（ii）通过CD8+ T细胞上存在的T细胞受体（T cellreceptor，TCR）识别的肽。优选地，通过TCR的识别导致CD8+ T细胞的活化。CD8+ T细胞活化可以导致增殖增加、细胞因子产生和/或细胞毒性作用。

通常，CD8+ T细胞表位的长度为约9个氨基酸。CD8+ T细胞表位可以更短或更长。例如，CD8+ T细胞表位的长度可以是约8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。CD8+ T细胞表位的长度可以为约8至15、9至14或10至12个氨基酸。

包含CD8+ T细胞表位的流感病毒肽是本领域已知的。识别CD8+ T细胞表位的方法是本领域已知的。表位映射方法包括X射线共结晶学、基于阵列的寡肽扫描（有时称为重叠肽扫描或肽扫描分析）、定点诱变、高通量诱变映射、氢-氘交换、交联偶联质谱、噬菌体展示和限制性蛋白质水解。也可以使用MHC基序预测方法。

优选地，可以识别通过受流感病毒感染的细胞呈递的CD8+ T细胞表位，从而直接识别用于包含在疫苗组合物中的CD8 + T细胞表位。这是一种有效且合乎逻辑的方法，其能够被单独使用或用来确认由MHC基序预测方法识别的潜在的CD8+ T细胞表位的效用。为了进行该方法，用流感病毒来感染细胞并在培养物中维持约24小时。然后收获细胞并洗涤。接下来，裂解细胞并使用MHC分子特异性抗体通过免疫亲和层析分离MHC/肽复合物。对从MHC分子纯化的肽进行分馏，例如使用离线HPLC使用C-18反相（RP）柱。收集含肽的馏分，在真空下干燥，并通过质谱法分析来鉴定馏分的序列。然后针对所有数据库化的流感蛋白搜索获得的光谱数据，以识别与流感病毒相关的肽序列。然后可以根据鉴定的序列制备合成肽，并进行质谱分析来证实它们与含肽的馏分中的肽的同一性。

在该方法中，可以用流感病毒感染任何类型的细胞。细胞可以是抗原呈递细胞。细胞可以是肝细胞瘤细胞，例如HepG2细胞、EBV转化的淋巴母细胞样B细胞（例如JY细胞）、或淋巴母细胞（例如T2细胞）。

同样，任何感兴趣的流感病毒都可以被用于感染细胞。例如，流感病毒可以是甲型流感、乙型流感或丙型流感病毒。甲型流感病毒可以是例如H1N1、H5N1、H7H9或H3N2。

与MHC基序预测方法相比，由受流感病毒感染的细胞呈递的CD8+ T细胞表位的直接识别是有利的。免疫表位数据库（IEDB; http://www.iedb.org）是由基序预测方法而不是功能方法产生的，并包含数百个预测的HLA特异性流感T细胞表位，包括许多具有高MHC结合分数和有限的CTL表征的共有表位。由于显性和亚显性表位都是由受流感病毒感染的细胞呈现的，因此难以使用数据库来挑选天然存在的表位的优势层级。因此，仅从免疫表位数据库不清楚的是，当被包含在疫苗组合物中时，所列出的表位中的哪些可以预期会有效诱导CD8+ T细胞应答。上述直接识别方法提供了确认表位效用的机制。

此外，直接识别方法可用于识别由受不同流感病毒感染的细胞呈递的保守的CD8+T细胞表位。以这种方式，可以识别出适合包含在通用疫苗中的CD8+ T细胞表位。如“实施例”部分中所述，本发明人使用直接识别方法来识别甲型流感（H1N1和H3N2）和乙型流感菌株之间保守的CD8+ T细胞表位。识别出的序列列于表1中。

表1

SEQ ID NO:	肽	蛋白质	HLA基序
				1	PVAGGTSSIYI (P2)	聚合酶PB2	A2
2	TVIKTNMI (P3)	聚合酶PB1	A2/A24
				3	MTIIFLILM (P4)	血球凝集素	A2/A24
4	ITFHGAKEI	基质蛋白1	A2/A24
				5	AINGITNKV	血球凝集素	A2/A24
6	EEMGITTHF	RNA定向的RNA聚合酶催化亚基	B44
				7	VETPIRNEW	基质蛋白2	B44
8	REILTKTTV	聚合酶碱性蛋白2	B44
				9	KESDEALNMTMASTP	非结构蛋白NS1	B44
10	LENERTLDF	聚合酶酸性蛋白质	B44
				11	MEAVPLITI	血球凝集素	B44
12	VEQEIRTF	核输出蛋白	B44
				13	VEQELRTF	非结构蛋白2	B44
14	SPDDFALIVNA	聚合酶PB1	B7
				15	YPDTGKVM	神经氨酸酶	B7
16	YPDASKVM	神经氨酸酶	B7
				17	QPETCNQSII	神经氨酸酶	B7
18	VPESKRMSL	非结构蛋白（NS1）	B7

本发明人还证实，已知的肽YINTALLNA（P1; SEQ ID NO：19）、AIMDKNIIL（P5; SEQ IDNO：20）和LPFDRTTIM（SEQ ID NO：21）是甲型流感（H1N1和H3N2）和乙型流感毒株之间保守的CD8+ T细胞表位。

因此，包含CD8+ T细胞表位的流感病毒肽可以包含SEQ ID NO：1至21中的一种或多种。例如，包含CD8 + T细胞表位的流感病毒肽可以包含任何组合形式的SEQ ID NO：1至21中的两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、十种或更多种、十五种或更多种或二十种或更多种。包含CD8+ T细胞表位的流感病毒肽可以包含SEQ ID NO：1至21中的全部。

类似地，疫苗组合物可以包含一种或多种流感病毒肽，每一种流感病毒肽包含含有选自SEQ ID NO: 1至21的不同序列的CD8+ T细胞表位。例如，疫苗组合物可以包含两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、十种或更多种、十五种或更多种或二十种或更多种流感病毒肽，每一种流感病毒肽包含含有任何组合形式的选自SEQ ID NO:1至21中的不同序列的CD8+ T细胞表位。疫苗组合物可以例如包含21种流感病毒肽，每种流感病毒肽包含含有选自SEQ ID NO：1至21的不同序列的CD8+ T细胞表位。

B细胞表位

本发明的疫苗组合物可以包含含有B细胞表位的流感病毒肽。B细胞表位是能够被B细胞上存在的B细胞受体（B cell receptor，BCR）识别的肽。优选地，BCR的识别导致B细胞的活化和/或成熟。B细胞活化可以导致增殖增加和/或抗体产生。

包含B细胞表位的流感病毒肽是本领域已知的。B细胞表位可以是线性表位，即由流感病毒蛋白的特定区域的一级氨基酸序列限定的表位。替代地，表位可以是构象表位，即由天然流感蛋白的构象结构限定的表位。在这种情况下，表位可以是连续的（即与抗体相互作用的成分在蛋白质上依次彼此相邻）或不连续的（即与抗体相互作用的成分位于蛋白质的不同部分上，在折叠的天然蛋白质结构中彼此接近）。

通常，B细胞表位长度为约5至20个氨基酸，例如长度为6至19、7至18、8至17、19至16、10至15、11至14或12至13个氨基酸。

识别B细胞表位的方法也是本领域已知的。例如，表位映射方法可以被用于识别B细胞表位。这些方法包括结构方法和功能方法，结构方法中蛋白质的已知或建模结构被用于基于算法的方法来预测表面表位，功能方法中可以定量整个蛋白质、蛋白质片段或肽与抗体的结合，例如，使用酶联免疫吸附测定（ELISA）。也可以使用竞争映射、抗原修饰或蛋白质片段化方法。

B细胞表位可以是例如流感基质2蛋白（M2e）表位。M2e蛋白的细胞外结构域是甲型流感病毒的进化保守区域。因此，在疫苗组合物中包含含有M2e B细胞表位的流感肽可以有助于给予通用效用。

通用的疫苗组合物

本发明还提供了一种疫苗组合物，其包含含有SEQ ID NO：1至21中所示的一种或多种CD8 + T细胞表位的流感病毒肽，其中所述肽被连接至纳米颗粒。

在疫苗组合物中包含含有SEQ ID NO：1至21中列出的一种或多种CD8+ T细胞表位的流感病毒肽是有利的。如上所述，SEQ ID NO：1至21中列出的CD8+ T细胞表位是保守的CD8+ T细胞表位，其由被不同流感病毒感染的细胞上的MHC分子呈递。因此，通过用包含任何这些表位的组合进行疫苗接种产生的免疫应答，应当防止共享该表位的任何流感病毒的随后感染。换句话说，疫苗组合物具有内置交叉亚型功效，即它是通用的流感疫苗组合物。这种组合物能够防止新出现或重新出现的流感感染株的显著扩散。

此外，基于由受流感病毒感染的细胞呈递的表位的疫苗组合物（例如本疫苗组合物）优于基于病毒蛋白亚基或基序预测表位的疫苗。通过免疫系统加工的蛋白质可能改变天然病毒表位。基于被证明由受感染的细胞呈递的肽的疫苗组合物消除了这种不确定性的来源，因为所述肽已经经历了蛋白质加工。

将流感病毒肽连接至纳米颗粒（例如金纳米颗粒）上也是有益的。如下文更详细描述的，连接至纳米颗粒减少或消除了在疫苗组合物中包含佐剂的需要。因此，疫苗组合物在施用于个体时不太可能引起不利的临床效果。

包含SEQ ID NO：1至21的流感肽

疫苗组合物包含含有SEQ ID NO：1至21中列出的一种或多种CD8+ T细胞表位的流感病毒肽。包含SEQ ID NO：1至21的流感病毒肽在上文中关于刺激体液和细胞反应的疫苗组合物进行了详细描述。流感病毒肽可以包含SEQ ID NO：1至21中列出的CD8+ T细胞表位中的两种或更多种，例如三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、十种或更多种、十五种或更多种或20种或更多种。在这种情况下，流感病毒肽可以包含SEQ ID NO：1至21中列出的CD8+ T细胞表位的任何组合。流感病毒肽可以包含SEQ ID NO：1至21中列出的所有CD8+ T细胞表位。

疫苗组合物可以包含两种或更多种流感病毒肽，每种肽包含不同的CD8+ T细胞表位。两种或更多种肽中的每一种可以包含SEQ ID NO：1至21中列出的不同的CD8+ T细胞表位。替代地，两种或更多种肽中的一种或多种可以包含SEQ ID NO：1至21中未列出的CD8+ T细胞表位。CD8 + T细胞表位是本领域已知的。

纳米颗粒

在包含含有CD8+ T细胞表位的流感病毒肽和含有B细胞表位的流感病毒肽的疫苗组合物，以及包含含有一种或多种SEQ ID NO：1至21中列出的CD8+ T细胞表位的流感病毒肽的疫苗组合物中，每种流感病毒肽被连接至纳米颗粒。

如上所述并在以下“实施例”部分中证明的，将流感病毒肽连接至纳米颗粒（例如金纳米颗粒），减少或消除了在疫苗组合物中包括佐剂的需要。纳米颗粒可以含有免疫“危险信号”，其有助于有效诱导对流感病毒肽的免疫应答。纳米颗粒可以诱导树突细胞（DC）活化和成熟，这是强烈免疫应答所需要的。纳米颗粒可以含有非自身组分，其改善细胞（例如抗原呈递细胞）对纳米颗粒并因此对流感病毒肽的摄取。因此，流感病毒肽对纳米颗粒的连接可以增强抗原呈递细胞的能力来刺激病毒特异性B和/或T细胞。连接至纳米颗粒还有助于通过皮下的、皮内的、经皮的和口/口腔的途径递送疫苗组合物，从而在常规的流感疫苗的施用中提供更大的灵活性。

纳米颗粒是尺寸在1至100纳米（nm）之间的颗粒，其能够被用作固定配体的底物。在本发明的疫苗组合物中，纳米颗粒的平均直径可以是1至100、20至90、30至80、40至70或50至60 nm。优选地，纳米颗粒的平均直径为20至40 nm。平均直径为20至40 nm有助于将纳米颗粒吸收至胞液中。平均直径能够使用本领域熟知的技术进行测量，例如透射电子显微镜。

适合于递送抗原（例如流感病毒肽）的纳米颗粒是本领域已知的。制备这种纳米颗粒的方法也是已知的。

纳米颗粒可以是例如聚合的纳米颗粒、无机纳米颗粒、脂质体、免疫刺激复合物（ISCOM）、病毒样颗粒（VLP）、或自组装蛋白质。纳米颗粒优选为磷酸钙纳米颗粒、硅纳米颗粒或金纳米颗粒。

纳米颗粒可以是聚合的纳米颗粒。聚合的纳米颗粒可以包含一种或多种合成聚合物，例如聚乙丙交酯（PLG）、聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）、聚（g-谷氨酸）（g-PGA）m、聚乙二醇（PEG）或聚苯乙烯。聚合的纳米颗粒可以包含一种或多种天然聚合物，例如多糖，例如支链淀粉、藻酸盐、菊粉和壳聚糖。由于可以被包括在纳米颗粒中的聚合物的性质，使用聚合的纳米颗粒可以是有利的。例如，上述天然的和合成的聚合物可以具有良好的生物相容性和生物降解性、无毒性和/或能够被操作成所需形状和尺寸的能力。聚合的纳米颗粒可以形成水凝胶纳米颗粒。水凝胶纳米颗粒是一种纳米级亲水三维聚合物网络。水凝胶纳米颗粒具有有利的性质，包括柔性网目尺寸、用于多价缀合的大表面积、高含水量、以及对抗原的高负载能力。聚（L-乳酸）（PLA）、PLGA、PEG和多糖等聚合物特别适合于形成水凝胶纳米颗粒。

纳米颗粒可以是无机纳米颗粒。通常，无机纳米颗粒具有刚性结构并且是不可生物降解的。然而，无机纳米颗粒可以是可生物降解的。无机纳米颗粒可以包含壳，其中可以封装抗原。无机纳米颗粒可以包含可以与抗原共价连接的核心。核心可以包含金属。例如，核心可以包含金（Au）、银（Ag）或铜（Cu）原子。核心可以由一种以上的原子形成。例如，核心可以包括合金，例如Au/Ag、Au/Cu、Au/Ag/Cu、Au/Pt、Au/Pd或Au/Ag/Cu/Pd的合金。核心可以包含磷酸钙（CaP）。核心可以包括半导体材料，例如硒化镉。

其他示例性无机纳米颗粒包括碳纳米颗粒和硅基纳米颗粒。碳纳米颗粒具有良好的生物相容性，能够合成纳米管和中孔球。二氧化硅基纳米颗粒（SiNP）是生物相容的，并且能够用可调节的结构参数制备以适合其治疗应用。

纳米颗粒可以是硅纳米颗粒，例如元素硅纳米颗粒。纳米颗粒可以是中孔的或具有蜂窝孔结构。优选地，纳米颗粒是具有蜂窝孔结构的元素硅颗粒。此类纳米颗粒是本领域已知的并且提供可调节和受控的药物负载、靶向和释放，其能够适应几乎任何负载、施用途径、靶标或释放曲线。例如，此类纳米颗粒可以增加其负载的生物利用度，和/或改善肠道渗透性和口服施用的活性物质的吸收。由于纳米颗粒的多孔结构和大的表面积，纳米颗粒可以具有特别高的负载能力。纳米颗粒可以在数天、数周或数月内释放它们的负载，这取决于它们的物理性质。由于硅是人体中天然存在的元素，因此纳米颗粒可能不会引起免疫系统的反应。这有利于纳米颗粒的体内安全性。

上述任何SiNP可以是可生物降解的或不可生物降解的。可生物降解的SiNP可以溶解成原硅酸（硅的生物可利用形式）。已经证明，原硅酸有益于骨骼、结缔组织、头发和皮肤的健康。

纳米颗粒可以是脂质体。脂质体通常由可生物降解的无毒磷脂形成，并且含有具有水性核心的自组装磷脂双层壳。脂质体可以是包含单个磷脂双层的单层囊泡，或是包含由水层分开的几个同心磷脂壳的多层囊泡。因此，可以定制脂质体以将亲水性分子并入水性核心或磷脂双层内的疏水性分子。脂质体可以将抗原封装在核心内用于递送。脂质体可以将病毒包膜糖蛋白并入壳中以形成病毒体。许多基于脂质体的产品在本领域中已建立并且被批准用于人类。

纳米颗粒可以是免疫刺激复合物（immune-stimulating complex，ISCOM）。ISCOM是笼状颗粒，其通常由含胶体皂苷的胶束形成。ISCOM可以包含胆固醇、磷脂（例如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱）和皂苷（例如来自树木皂树（Quillaia saponaria）的Quil A）。ISCOM传统上用于捕获病毒包膜蛋白，例如来自单纯疱疹病毒1型、乙型肝炎或流感病毒的包膜蛋白。

纳米颗粒可以是病毒样颗粒（virus-like particle，VLP）。VLP是缺乏感染性核酸的自组装纳米颗粒，其通过生物相容性衣壳蛋白的自组装而形成。VLP的直径通常为约20至约150 nm，例如约20至约40 nm、约30至约140 nm、约40至约130 nm、约50至约120 nm、约60至约110 nm、约70至约100 nm、或约80至约90 nm。VLP有利地利用进化的病毒结构的能量，其自然地优化与免疫系统的相互作用。自然地优化的纳米颗粒大小和重复的结构顺序意味着即使在不存在佐剂的情况下，VLP也会诱导有效的免疫应答。

纳米颗粒可以是自组装蛋白质。例如，纳米颗粒可以包含铁蛋白。铁蛋白是一种能够自组装成接近球状的10 nm结构的蛋白质。纳米颗粒可以包含穹窿体主蛋白（majorvault protein，MVP）。MVP的96个单位能够自组装成筒状的拱形纳米颗粒，其尺寸约为40nm宽，70 nm长。

纳米颗粒可以是磷酸钙（calcium phosphate，CaP）纳米颗粒。CaP纳米颗粒可以包含含有一个或多个（例如两个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、50个或更多个、100个或更多个、200个或更多个、或500个或更多个）CaP分子的核。CaP纳米颗粒及其制备方法是本领域已知的。例如，通过在恒定混合下以预定比例混合钙和磷酸盐的无机盐溶液，可以产生稳定的CAP纳米颗粒的纳米悬浮液。

CaP纳米颗粒可以具有约80至约100nm的平均粒径，例如约82至约98nm、约84至约96nm、约86至约94nm、或约88至约92nm。与其他较大粒径相比，该粒径在免疫细胞摄取和免疫应答方面可以产生更好的性能。例如，当在1个月、2个月、3个月、6个月、12个月、18个月、24个月、36个月或48个月的时间段内测量时，粒径可以是稳定的（即没有显著变化）。

CaP纳米颗粒能够与一种或多种抗原共同配制，所述一种或多种抗原吸附在纳米颗粒的表面上或在颗粒合成期间与CaP共沉淀。例如，通过将肽溶解在DMSO（例如，浓度约为10 mg/ml）中，添加至CaP纳米颗粒与N-乙酰基-氨基葡萄糖（GlcNAc）（例如0.093 mol/L）和超纯水的悬浮液，并在室温下混合约4小时（例如，1小时、2小时、3小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时或10小时），可以将肽（例如流感病毒肽）连接至CaP纳米颗粒。

疫苗组合物可包含约0.15至约0.8％CaP纳米颗粒，例如0.2至约0.75％、0.25至约0.7％、0.3至约0.6％、0.35至约0.65％、0.4至约0.6％、或0.45至约0.55％。优选地，疫苗组合物包含约0.3％CaP纳米颗粒。

CaP纳米颗粒由于其与人体硬组织（例如骨和牙齿）的化学相似性而具有高度的生物相容性。因此，有利地，当用于治疗应用时，CaP纳米颗粒是无毒的。CaP纳米颗粒通过肌肉内的、皮下的、口服的、或吸入的途径施用是安全的。CaP纳米颗粒也易于商业合成。此外，CaP纳米颗粒可能与抗原的缓慢释放有关，这可以增强对连接至纳米颗粒的流感病毒肽的免疫应答的诱导。CaP纳米颗粒既可以用作佐剂，也可以用作药物递送载体。

纳米颗粒可以是金纳米颗粒。金纳米颗粒是本领域已知的并且特别描述于WO2002/32404、WO 2006/037979、WO 2007/122388、WO 2007/015105和WO 2013/034726中。连接至每种流感病毒肽的金纳米颗粒可以是WO 2002/32404、WO 2006/037979、WO 2007/122388、WO 2007/015105和WO 2013/034726中任一篇中描述的金纳米颗粒。

金纳米颗粒包含含有金（Au）原子的核心。核心可以进一步包含一个或多个Fe、Cu或Gd原子。核心可以由金合金形成，例如Au/Fe、Au/Cu、Au/Gd、Au/Fe/Cu、Au/Fe/Gd或Au/Fe/Cu/Gd。核心中的原子总数可以是100至500个原子，例如150至450、200至400或250至350个原子。金纳米颗粒的平均直径可以为1至100、20至90、30至80、40至70或50至60 nm。优选地，金纳米颗粒的平均直径为20至40 nm。

除流感病毒肽之外的一种或多种配体可以与纳米颗粒连接，纳米颗粒可以是上述纳米颗粒中的任何类型。配体可以形成“电晕（corona）”，这是可以部分或完全覆盖核心表面的层或涂层。电晕可以被认为是围绕或部分围绕纳米颗粒的核心的有机层。电晕可以提供或参与钝化纳米颗粒的核心。因此，在某些情况下，电晕可以是足够完整的涂层来稳定核心。电晕可以促进本发明的纳米颗粒的溶解度，例如水溶性。

纳米颗粒可以包含至少10、至少20、至少30、至少40或至少50个配体。配体可以包括一种或多种肽、蛋白质结构域、核酸分子、脂质基团、碳水化合物基团、阴离子基团或阳离子基团、糖脂和/或糖蛋白。碳水化合物基团可以是多糖、寡糖或单糖基团（例如葡萄糖）。配体中的一种或多种可以是非自身组分，由于其与致病成分的相似性，使得纳米颗粒更可能被抗原呈递细胞吸收。例如，一种或多种配体可以包含碳水化合物部分（例如细菌碳水化合物部分）、表面活性剂部分和/或谷胱甘肽部分。示例性配体包括葡萄糖、N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）、谷胱甘肽、2'-硫代乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷和2'-硫代乙基-D-吡喃葡萄糖苷。优选的配体包括形成糖纳米颗粒的糖复合物。

可以通过接头促进配体与核心的连接。接头可以包含硫醇基、烷基、二醇基或肽基。例如，接头可以包含C2-C15烷基和/或C2-C15二醇。接头可以包含含硫基团、含氨基团、含磷酸基团或含氧基团，其能够共价连接至核心。替代地，配体可以直接连接到核心，例如，通过配体中包含的含硫基团、含氨基团、含磷酸基团或含氧基团。

连接至纳米颗粒

流感病毒肽可以在其N-末端连接至纳米颗粒。通常，流感病毒肽连接至纳米颗粒的核心，但也可以连接至电晕或配体。

流感病毒肽中的一种或多种可以直接连接至纳米颗粒，例如通过将肽中含硫基团、含氨基团、含磷酸基团或含氧基团中的原子共价键结合至纳米颗粒或其核心中的原子。

接头可以被用于将一种或多种流感病毒肽与纳米颗粒连接。接头可以包含含硫基团、含氨基团、含磷酸基团或含氧基团，其能够共价连接核心中的原子。例如，接头可以包含硫醇基、烷基、二醇基或肽基。

接头可以包含肽部分和非肽部分。肽部分可以包含序列X₁X₂Z₁，其中X₁是选自A和G的氨基酸；X₂是选自A和G的氨基酸；Z₁是选自Y和F的氨基酸。肽部分可以包含序列AAY或FLAAY。接头的肽部分可以与流感病毒肽的N-末端连接。接头的非肽部分可以包含C2-C15烷基和/或C2-C15二醇，例如硫代乙基或硫代丙基。

接头可以是（i）HS-(CH₂)₂-CONH-AAY；（ii）HS-(CH₂)₂-CONH-LAAY；（iii）HS-(CH₂)₃-CONH-AAY；（iv）HS-(CH₂)₃-CONH-FLAAY；（v）HS-(CH₂)₁₀-(CH₂OCH₂)₇-CONH-AAY；和（vi）HS-(CH₂)₁₀-(CH₂OCH₂)₇-CONH-FLAAY。在这种情况下，接头的非肽部分的硫醇基团将接头与核心连接。

用于将流感病毒连接至纳米颗粒的其他合适的接头是本领域已知的，并且可以由技术人员容易地识别和实施。

当疫苗组合物包含含有CD8+ T细胞表位的流感病毒肽和含有B细胞表位的流感病毒肽时，每种流感病毒肽可以连接至不同的纳米颗粒。在这种情况下，每种流感病毒肽被连接至的纳米颗粒可以是相同类型的纳米颗粒。例如，每种流感病毒肽可以被连接至金纳米颗粒。每种流感病毒肽可以被连接至CaP纳米颗粒。每种流感病毒肽连接至的纳米颗粒可以是不同类型的纳米颗粒。例如，一种流感病毒肽可以被连接至金纳米颗粒，而另一种流感病毒肽可以被连接至CaP纳米颗粒。然而，优选地，包含CD8+ T细胞表位的流感病毒肽和包含B细胞表位的流感病毒肽被连接至相同的纳米颗粒。例如，包含CD8+ T细胞表位的流感病毒肽和包含B细胞表位的流感病毒肽可以被连接至相同的金纳米颗粒。这提供了能够刺激流感病毒特异性细胞反应和流感病毒特异性体液反应的单个颗粒。

CD4+ T细胞表位

本发明的疫苗组合物可以进一步包含含有CD4+ T细胞表位的流感病毒肽。CD4+ T细胞表位如上所定义。

疫苗组合物可以包含两种或更多种包含CD4+ T细胞表位的流感病毒肽，例如三种或更多种、四种或更多种、五种更多种、十种或更多种、十五种或更多种或二十种或更多种。此类肽是本领域已知的。

包含CD4+ T细胞表位的流感病毒肽可以是与编码CD8+ T细胞的流感病毒肽和编码B细胞表位的流感病毒肽不同的肽。包含CD4+ T细胞表位的流感病毒肽可以是与编码CD8+ T细胞的流感病毒肽相同的肽。也就是说，包含CD8+ T细胞表位的流感病毒肽可以进一步包含CD4+ T细胞表位。

当包含CD8+ T细胞表位的流感病毒肽包含CD4+ T细胞表位时，CD8+表位可以嵌入CD4+ T细胞表位内。CD4+ T细胞表位通常比CD8+ T细胞表位更长。因此，延伸CD8+ T细胞表位的一个或两个末端可以产生更长的CD4+ T细胞表位，其序列仍包含CD8 + T细胞表位。因此，CD4+ T细胞表位可以包含CD8+ T细胞表位，例如SEQ ID NO：1至21中列出的CD8+ T细胞表位，在其N-末端或C-末端延伸。CD8+ T细胞表位可以在其N末端延伸1、2、3、4或5个氨基酸。CD8+ T细胞表位可以在其C末端延伸1、2、3、4或5个氨基酸。优选地，CD8+ T细胞表位在N末端延伸3个氨基酸，在C末端延伸3个氨基酸。然而，CD8+ T细胞表位不需要在每个末端延伸相同数量的氨基酸。

嵌入延伸的肽内的CD8+ T细胞表位可能能够产生强烈的CTL应答。延伸的肽（CD4+T细胞表位）能够诱导T辅助细胞介导的细胞因子反应。因此，在疫苗组合物中包含含有CD8+T细胞表位和CD4+ T细胞表位的流感病毒肽可以使疫苗组合物诱导细胞毒性和辅助性T细胞应答，从而提供改善的抗流感免疫力。

如“实施例”部分中所列出的，本发明人已鉴定了许多潜在的CD4+ T细胞表位，其中嵌入了SEQ ID NO：1至21中列出的CD8+ T细胞表位。这些列于表2中。

表2

因此，包含CD8+ T细胞表位和CD4+ T细胞表位的流感病毒肽可以包含SEQ ID NO：22至27中列出的一个或多个肽。包含CD8+ T细胞表位和CD4+ T细胞表位的流感病毒肽可以包含任何组合形式的SEQ ID NO：22至27中列出的两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或五种或更多种肽。包含CD8+ T细胞表位和CD4+ T细胞表位的流感病毒肽可以包含SEQ IDNO：22至27中列出的所有肽。

包含CD4+ T细胞表位的流感病毒肽可以被连接至纳米颗粒。纳米颗粒可以是金纳米颗粒。纳米颗粒及其连接如上所述。

与HLA超型相互作用

疫苗组合物可以包含至少两种含有CD8+ T细胞表位的流感病毒肽，每种都与不同的HLA超型相互作用。在疫苗组合物中包括多种这样的肽，允许疫苗组合物在更大比例的施用疫苗组合物的个体中引发CD8+ T细胞应答。这是因为疫苗组合物应该能够在HLA超型的所有个体中引起CD8+ T细胞应答，所述HLA超型与多种流感病毒肽中包含的CD8+ T细胞表位之一相互作用。每个CD8+ T细胞表位可以与HLA-A1、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A24、HLA-B7、HLA-B8、HLA-B27、HLA-B44、HLA-B58或HLA-B62或、或任何其他本领域已知的HLA超型相互作用。包含这种CD8+ T细胞表位的流感病毒肽的任何组合都是可能的。

疫苗组合物可以包含至少一种与至少两种不同HLA超型相互作用的免疫原性肽。同样，这允许疫苗组合物在更大比例的施用疫苗组合物的个体中引发CD8+ T细胞应答。疫苗组合物可以包含至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少两种、至少十五种、或至少二十种免疫原性肽，其各自与至少两种不同的HLA亚型相互作用。每种免疫原性肽可以与至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少7种、至少8种、至少9种或至少10种不同的HLA超型相互作用。每种免疫原性肽可以与任何组合形式的HLA-A1、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A24、HLA-B7、HLA-B8、HLA-B27、HLA-B44、HLA-B58或HLA-B62、或本领域已知的其他HLA超型中的两种或更多种相互作用。优选地，疫苗组合物包含与HLA-A2和HLA-24相互作用的免疫原性肽。在这种情况下，疫苗组合物可以例如包含含有CD8+ T细胞表位的流感病毒肽，所述肽包含SEQ ID NO：3至5中列出的一种或多种肽。

药物、方法和治疗用途

本发明提供预防或治疗流感病毒感染的方法，包含将本发明的疫苗组合物施用于感染或有风险感染流感病毒的个体。本发明还提供了本发明的疫苗组合物，其用于预防或治疗个体的流感病毒感染的方法中。

流感病毒可以是甲型流感、乙型流感和/或丙型流感病毒。甲型流感病毒可以是例如H1N1、H5N1、H7H9或H3N2。流感病毒可以是人流感病毒、猪流感病毒或禽流感病毒。流感病毒可以是大流行性流感病毒或可能的大流行性流感病毒。

疫苗组合物可以作为药物组合物提供。药物组合物优选包含药学上可接受的载体或稀释剂。可以使用任何合适的方法配制药物组合物。可以使用药物领域中常规的方法进行具有标准的药学上可接受的载体和/或赋形剂的细胞的配制。制剂的确切性质取决于若干因素，包括待施用的细胞和所需的施用途径。制剂的合适的类型在Remington'sPharmaceutical Sciences, 19th Edition, Mack Publishing Company, EasternPennsylvania, USA中有充分描述。

疫苗组合物或药物组合物可以通过任何途径施用。合适的途径包括但不限于静脉内的、肌肉内的、腹膜内的、皮下的、皮内的、经皮的和口/口腔的途径。

组合物可以与生理上可接受的载体或稀释剂一起制备。通常，这样的组合物是以肽连接的纳米颗粒的液体悬浮形式制备的。纳米颗粒可以与药学上可接受的且与活性成分相容的辅料混合。合适的辅料是例如水、盐水、葡萄糖、甘油等及其组合。

此外，如果需要，则药物组合物可以含有少量辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、和/或pH缓冲剂。

肽连接的纳米颗粒以与剂量制剂相容的方式施用，并且这样的量是治疗有效的。施用量取决于待治疗的对象、待治疗的疾病和对象免疫系统的能力。需要施用的纳米颗粒的精确量可以取决于从业者的判断，并且可能是每个对象特有的。

可以向对象施用任何合适数量的纳米颗粒。例如，可以给患者施用至少或约每千克0.2 x 10⁶、0.25 x 10⁶、0.5 x 10⁶、1.5 x 10⁶、4.0 x 10⁶或5.0 x 10⁶个纳米颗粒。例如，可以施用至少或约10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹个细胞。作为指导，施用的本发明纳米颗粒的数量可以是10⁵至10⁹，优选10⁶至10⁸。

应理解，所公开的产品和方法的不同应用可以根据本领域的特定需要而定制。还应理解，本文使用的术语仅用于描述本发明的特定实施方案的目的，而不是限制性的。

另外，如在本说明书和所附权利要求中使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指示物，除非内容另有明确说明。因此，例如，提及“一个CAR”包括“多个CAR”，提及“一个T细胞”包括两个或更多个这样的T细胞，提及“一种成分”包括两种或更多种这样的成分，等等。

本文（无论上文或下文）引用的所有出版物、专利和专利申请均通过引用整体并入本文。

本发明的进一步实施方案

1. 一种药物组合物中的分离的寡肽或肽，其包含至少一种具有选自SEQ ID NO：1至18的氨基酸序列的肽，所述寡肽或肽由8至约30个氨基酸残基组成，其中所述寡肽或肽与I类MHC分子结合或者能够被加工为与I类MHC分子结合并激活T淋巴细胞应答，并且其中所述寡肽或肽是药学上可接受的盐的形式。

2. 根据条款1所述的寡肽，其中所述寡肽包含至少两个表位肽。

3. 根据条款1所述的寡肽，其中所述寡肽包含至少三个表位肽。

4. 根据条款1所述的寡肽，其中所述寡肽包含至少四个表位肽。

5. 根据条款1所述的寡肽或肽，其中所述寡肽或肽与SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18不同，其中所述不同不超过一个氨基酸单位。

6. 根据条款5所述的寡肽或肽，其中所述一个氨基酸不同是保守氨基酸取代的结果。

7. 根据条款5所述的寡肽或肽，其中所述一个氨基酸不同是一个疏水性氨基酸被另一个疏水性氨基酸取代。

8. 根据条款5所述的寡肽或肽，其中所述氨基酸不同是向所述表位肽或从所述表位肽添加或缺失一个氨基酸。

9. 一种药物组合物中的多核苷酸，其包含选自以下的多核苷酸：（a）编码条款1所述的寡肽或肽的多核苷酸，以及（b）（a）的完整补体，其中所述多核苷酸是药学上可接受的盐的形式。

10. 根据条款9所述的多核苷酸，其中所述（a）的多核苷酸是DNA。

11. 根据条款9所述的多核苷酸，其中所述（a）的多核苷酸是RNA。

12. 一种用于免疫接种和治疗流感感染的对象的方法，所述感染细胞表达任何I类MHC分子，所述方法包含向所述对象施用结合I类MHC分子或能够被加工为结合I类MHC分子的组合物，所述组合物包含：包含含有选自SEQ ID NO：1至18的氨基酸序列的表位肽的至少一种多肽，其量足以诱导对所述感染细胞的CTL应答并且为药学上可接受的盐的形式；或者，包含与选自SEQ ID NO：1至18的氨基酸序列相比具有至少一个氨基酸差异的表位肽的至少一种多肽，其量足以诱导对所述感染细胞的CTL应答并且为药学上可接受的盐的形式。

13. 一种用于免疫接种和治疗流感感染的对象的方法，所述感染细胞表达任何I类MHC分子，所述方法包含向所述对象施用结合I类MHC分子或能够被加工为结合I类MHC分子的组合物，所述组合物包含：包含编码含有选自SEQ ID NO：1至18的氨基酸序列的至少一个多肽的核酸序列的多肽，其量足以诱导对所述感染细胞的CTL应答并且为药学上可接受的盐的形式；或者包含与选自SEQ ID NO：1至18的氨基酸序列相比含有一个氨基酸差异的表位肽的至少一种多肽，其量足以诱导对所述感染细胞的CTL应答并且为药学上可接受的盐的形式。

14. 一种使用来自受感染流感的对象的T细胞离体产生免疫应答的方法，所述方法包含：刺激用于被动免疫疗法的CTL应答的产生，其中所述T细胞与以下多肽反应：包含选自SEQ ID NO：1至18的氨基酸序列并且是药学上可接受的盐的形式的至少一个多肽；或者与选自SEQ ID NO：1至18的氨基酸序列相比包含一个氨基酸差异并且是药学上可接受的盐的形式的至少一个多肽。

15. 根据条款14所述的方法，其中所述T细胞过继疗法由自体或HLA匹配的对象产生。

16. 一种用于评估或诊断感染流感或对流感和相关病毒接种疫苗的对象中的免疫应答的方法，所述方法包含：刺激CTL应答的产生，其中所述T细胞与以下多肽反应：包含选自SEQ ID NO：1至18的氨基酸序列并且是药学上可接受的盐的形式的至少一个多肽；或者与选自SEQ ID NO：1至18的氨基酸序列相比包含一个氨基酸差异并且是药学上可接受的盐的形式的至少一个多肽。

17. 一种使用药学上可接受的盐的形式的SEQ ID NO：1至18对人类接种流感感染疫苗的方法。

以下实施例说明本发明。

实施例1

说明

流感是一个严重的全球健康问题，每年感染世界人口的20%，导致全球多达500万例严重疾病和超过30万人死亡。仅在美国，每年估计有超过30,000人死亡以及近30万人住院治疗是由于流感感染（1）。随着最近新的、严重的和可能复发的季节性疾病的出现，世界卫生组织正在鼓励开展广泛的疫苗接种运动，以降低流感引起的肺炎的发病率。有效地降低流感的发病率将需要持续的密集的监测、增加目前可用的流感疫苗的使用、以及能够提供更广泛的保护以防止流感的菌株移位和漂变的替代的疫苗和抗病毒药物的实用性（1）。成功的流感疫苗接种运动能够产生巨大的社会和经济影响（2）。

对流感病毒的免疫应答

对流感的免疫反应是由先天免疫和适应性免疫共同控制的。对流感的先天免疫反应限制了最初的病毒复制，但相对来说是非特异性的（3）。流感病毒的有效清除需要强大的适应性免疫反应，激活体液和细胞介导的免疫。分泌性IgA和IgM抗体介导的体液免疫提供了对初始感染建立的保护，而IgG在已建立的感染中中和新复制的病毒（4, 5）。虽然诱导对流感的体液免疫是目前常规的流感疫苗的目标，但由于抗原变异的发生，这些疫苗不能完全保护（6）（7）。此外，数据表明T细胞反应对于预防流感非常重要。CD4+ T细胞在同型转换为IgG中以及更高亲和力抗体（8）和CTL记忆（9-11）的产生中起着关键作用。在人类中， HA特异性CD4+ T细胞在流感疫苗接种后增殖（12），并有助于异型流感抗体反应的发展（13, 14）。CD8+细胞毒性T淋巴细胞（CTL）介导病毒清除，并且重要的是，已显示出对不同亚型的甲型流感病毒具有交叉反应性反应（15-17）。这可能解释了在年龄较大、可能接种疫苗或接触过的H1N1感染的个体中疾病相对较少的原因。

流感病毒疫苗研发的现状

目前市场上的流感疫苗每年更新一次，并且它们的设计是基于WHO每年的菌株建议（16, 18），并且它们是在流感季节或大流行开始之前制造的。目前的流感疫苗诱导针对病毒表面上HA和NA糖蛋白的保护性体液免疫反应（7, 19, 20）。然而，病毒HA和NA糖蛋白极易受到频繁和不可预测的抗原移位以及导致抗体识别丧失的较不频繁但更严重的漂变的影响，这就需要经常开发新的疫苗，以匹配感染人群的目前的病毒血清型（21-25）。此外，这些疫苗生产成本高，并且不能防御可能在季节中出现的新菌株（例如2009年H1N1猪流感、H5N1、H7N9）。最重要的是，这些疫苗专注于基于抗体的保护，并诱导有限的T细胞反应，后者对于消除体内受感染的细胞至关重要。

三种改进的季节性流感疫苗目前已获得FDA批准。这些四价疫苗提供针对两种甲型流感病毒和两种乙型流感病毒的覆盖。（近年来，两种乙型流感病毒在流感季节共同流行，并且提供的三价疫苗不能防御这些菌株之一）。FluMist是一种四价减毒活疫苗，由于有限的蛋白质合成（在灭活疫苗中不存在），可为免疫系统提供更多靶标。FluMist（http://www.cdc.gov/flu/protect/vaccine/vaccines.htm）目前作为三价灭活疫苗的替代品而被分发。Fluarix和FluZone是四价灭活疫苗，可刺激对目前三价灭活疫苗的类似免疫反应。这些将在2013-2014流感季节被分发（http://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/Vaccines/ApprovedProducts/ucm295057.htm）。尽管四价疫苗提供了覆盖范围，但它们仍然是季节性的，并且遭受与三价疫苗相同的衰败，即生产时间和成本以及缺乏消除感染细胞的强烈的T细胞反应，以及对季节中期紧急情况的保护。显而易见的是，提供针对大多数（如果不是全部）流感病毒株的保护的通用疫苗是必需的。

迄今为止，多种通用疫苗制剂正在开发中。这些疫苗能够通过以下被刺激的保护性免疫应答的类型被广泛地表征：1）B细胞应答（抗体），2）T细胞应答，或3）B和T细胞应答。Kanekiyo等人产生诱导对多种流感毒株提供覆盖的高滴度抗体反应的HA纳米颗粒（与铁蛋白融合的血凝素（HA）蛋白）（26）。这种疫苗尚未进入临床试验。靶向病毒基因组中四个相对保守的表位的基于T细胞的疫苗（27）也在开发中。一种对包括大流行毒株的各种流感毒株具有积极的保护反应的基于高度保守的CD4表位的T细胞疫苗已经在II期挑战研究中进行了评估（28）。一种并入了来自9种不同的流感蛋白的B细胞、CD4- T细胞和CD8 T细胞保守表位的名为Multimeric-001的重组多表位疫苗（29）目前正在进行早期临床试验。由核蛋白（NP）和与佐剂连接的B细胞表位M2e和金纳米颗粒中与CpG结合的M2e肽组成的融合蛋白疫苗（30）也在开发中。大多数上面提到的疫苗都是用会引起临床不良反应的各种佐剂配制成蛋白质或肽。相比之下，我们的全合成的通用流感疫苗制剂由一组保守的CD4、CD8和B细胞激活表位组成，这些表位在金纳米颗粒疫苗递送中配制，具有内置的佐剂特性，旨在刺激针对许多流感病毒株（包括新出现的菌株）的强效T细胞和B细胞免疫应答。

流感感染的合成的通用疫苗的概念

理想的疫苗应该尝试模拟由感染产生的天然免疫（图1），从而产生适应性体液和细胞免疫记忆（31）。正在做出巨大努力来开发一种能够对抗所有类型流感的通用流感疫苗。

目标是为所有季节性流感病毒株和大流行毒株提供多年（如果不是一辈子）的保护，使流感免疫更像传统疫苗。有效的通用流感疫苗的开发将消除（或减轻）对未来流感大流行的恐惧，并且与开发和制造年度季节性流感疫苗相比具有成本效益。这种通用疫苗必须靶向不随菌株而变化的保守的流感病毒表位，并且更重要的是，这种通用疫苗应该由受感染的细胞上的MHC分子呈递。最终，最有希望的通用流感疫苗候选物可能来自对T和B细胞免疫的抗原组合。基于动物模型和人体研究，结合所有可能的T和B细胞配体（图1）来配制有活性的合成的疫苗是有道理的。为了是有活性的，疫苗必须在一定的大小范围内以允许胞液摄取内置的危险信号以靶向抗原呈递细胞。具有这些特性的新型的金糖纳米颗粒已被证明可诱导有效的疫苗反应（32, 33）。开发一种基于并入金纳米颗粒中的共享T细胞和B细胞表位的合成的通用疫苗是本申请的焦点。

创新

本发明有两个主要的、新的区别：（1）开发一种全合成的能够诱导针对流感感染的多种菌株的T辅助细胞、细胞毒性T细胞和抗体反应的通用疫苗，以及（2）一种新的全合成的新的金糖纳米颗粒疫苗递送平台的表征，该平台具有作为对任何亚单位疫苗的有效的佐剂的先天性和适应性免疫刺激分子。与现有疫苗相比，所建议的疫苗方法具有几个优点。首先，它将具有多个被天然加工并呈递在感染细胞上的保守的MHC I类限制性CD8+ T细胞表位（34）、嵌入CD4表位内的CD8表位和来自各种流感病毒蛋白的抗体表位。其次，这些表位将在含有免疫“危险信号”的合成的糖纳米颗粒中传递（35, 36）。最后，这种20-40 nm大小的新的糖纳米颗粒与其他纳米颗粒不同，除了含有流感特异性T和B细胞激活表位外，还含有非自身成分（如细菌碳水化合物，GlcNAc），由于其与病原体的相似性，其更可能被抗原呈递细胞靶向并被摄取，用于有效激活抗原特异性T细胞和抗体反应。预计这些糖纳米颗粒也会诱导DC成熟/活化，从而产生强烈的免疫反应，这对于成功的、特异性的亚单位疫苗反应至关重要（37, 38）。除了皮内的和皮下的注射递送模式之外，这些纳米颗粒还适合于各种递送途径，包括经皮肤的和口/口腔的。

该建议还旨在加速新出现的疫苗策略的临床前开发，该策略具有内置跨亚型功效，其可以防止新出现或重新出现的流感感染株的显著扩散。含有免疫原性共有序列表位的跨亚型疫苗可以实现这一目标。越来越多的证据表明，有效的通用疫苗必须诱导细胞介导的免疫和体液免疫的激活。我们假设，基于通过被感染的细胞呈递的确定的表位的疫苗，将远远优于病毒蛋白亚基或基序预测的基于表位的疫苗，因为通过免疫系统加工的蛋白质可能改变天然病毒表位。此外，嵌入延伸的肽内的CD8表位不仅产生强大的CTL反应，而且延伸的肽也能够诱导T辅助介导的细胞因子反应，这对于抵抗流感感染至关重要（28）。向该合成的疫苗制剂中添加通用抗体表位，将免疫系统的两个臂结合起来进行完全保护。

如我们的初步数据所证明的，直接识别由被感染的细胞呈递的T细胞表位是识别用于疫苗应用的T细胞表位的有效且合乎逻辑的方法。我们的分析证实了通过MHC基序预测方法的一些T细胞表位。由于免疫表位数据库（http://www.iedb.org）含有数百种预测的HLA特异性流感T细胞表位，包括许多具有高MHC结合分数和有限的CTL表征的共有表位，因此确认和使用由受病毒感染的细胞呈递的疫苗应用表位是至关重要的。另外，因为IEDB数据库是由基序预测方法产生的，而不是功能方法，所以很难整理自然呈现的表位的优势层级。Thomas等人（39）简洁地证明了显性和亚显性表位均由被感染的细胞呈递，这很难使用IEDB数据库中的数据进行分类。基序预测的表位的另一个缺点是，大多数情况下，使用来自被感染的个体的CTL筛选它们的功能特异性可能已经被耐受。

在靶向的、免疫激活和调节的、全合成的、柔性的纳米颗粒疫苗递送系统中配制的T细胞（CD8和CD4）表位和抗体表位（M2e）的首次组合将实现显著的创新。我们强调，使用由被感染的细胞天然呈递的保守的T细胞表位和并入纳米颗粒中的B细胞表位代表了疫苗技术的重大飞跃，而不是对疫苗成分的小幅调整。如果成功，则这种方法能够导致预防性和治疗性疫苗配方的范式转变。我们的工作也将有助于推进对T细胞介导的流感病毒感染的免疫反应的一般的理解。该信息对于开发抗病毒药物以及预防性和治疗性通用疫苗来对抗和预防严重的、以及有些致命的流感病毒感染的病例至关重要。

结果

我们从被感染的细胞中鉴定了一组HLA-A2特异性保守表位。使用从HLA-A2阳性健康供体获得的外周血单核细胞（PBMC），我们表征了所选择的表位用于CTL活性并且在体外证明了交叉反应性。

MHC I类呈递的流感表位的鉴定

JY（HLA-A2和B7阳性EBV转化的B细胞系）和HLA-A2和A24阳性的HepG2（肝癌细胞系）和由来自健康个体的HLA-A2阳性外周血淋巴细胞（PBL）产生的树突细胞（DC），被甲型和乙型流感病毒株（A/New Caledonia/20/99（H1N1）、A/Wisconsin/67/2005（H3N2）、B/Malaysia/2506/2004）感染。对于JY和DC，已发表的研究表明，使用~10 HAU（40）16-24小时后对流感感染最为成功，细胞感染率为~50％（41）。如果被感染的细胞显示> 50％的感染性，则将其用于MHC肽的分离。制备细胞裂解物，并使用与1 mL蛋白A/G珠结合的1 mg W6/32（pan MHC I类特异性抗体）进行两轮免疫沉淀（34）。从珠中洗脱结合的MHC复合物，纯化肽混合物并使用C18反相（RP）柱分馏。将肽馏分单独注射到LC-MS/MS系统（nanoAcquity UPLC-LTQorbitrap）中来识别MHC肽。通过使用bioworks/蛋白质组发现软件（Thermo）在NCBI流感数据库中搜索原始数据来识别MHC肽及其相应的蛋白质。制备合成的肽来验证和确认序列。在与实验相同的碰撞条件下对合成的肽进行LC-MS/MS分析，并通过将它们的MS/MS谱与它们的合成类似物进行比较来确认它们的序列。

表31总结了我们从受流感病毒感染的细胞中识别的MHC I类相关肽。我们识别了具有HLA-A2结合基序的7个表位，并且7个表位中的5个具有HLA-A24交叉结合基序。此外，我们识别了几个含有HLA-B7和B44基序的表位。所有表位源自多种流感毒株之间保守的蛋白质区域。使用合成肽在共洗脱实验中证实了这些肽。有趣的是，我们识别了三个之前报道过的表位，两个使用基序预测和离体CTL分析被识别的HLA-A2特异性表位（P1和P5）（42），以及一个在大流行的H1N1-2009和H1N1-1918甲型流感病毒之间被证明是保守的HLA-B7特异性表位（表3中的LPF）（43）。

SEQ ID	肽	蛋白质	HLA基序
					YINTALLNA* (P1)	聚合酶PA	A2
1	PVAGGTSSIYI (P2)	聚合酶PB2	A2
				2	TVIKTNMI (P3)	聚合酶PB1	A2/A24
3	MTIIFLILM (P4)	血球凝集素	A2/A24
					AIMDKNIIL* (P5)	非结构蛋白1	A2/A24
4	ITFHGAKEI	基质蛋白1	A2/A24
				5	AINGITNKV	血球凝集素	A2/A24
6	EEMGITTHF	RNA定向的RNA聚合酶催化亚基	B44
				7	VETPIRNEW	基质蛋白2	B44
8	REILTKTTV	聚合酶碱性蛋白2	B44
				9	KESDEALNMTMASTP	非结构蛋白NS1	B44
10	LENERTLDF	聚合酶酸性蛋白质	B44
				11	MEAVPLITI	血球凝集素	B44
12	VEQEIRTF	核输出蛋白	B44
				13	VEQELRTF	非结构蛋白2	B44
	LPFDRTTIM*	核衣壳蛋白	B7
				14	SPDDFALIVNA	聚合酶PB1	B7
15	YPDTGKVM	神经氨酸酶	B7
				16	YPDASKVM	神经氨酸酶	B7
17	QPETCNQSII	神经氨酸酶	B7

表3：由受流感病毒感染的细胞呈递的MHC I类表位

*之前报道过的表位

在CTL功能表征实验之前，我们使用其合成的肽类似物证实了5种HLA-A2特异性肽（P1-P5）（表3）的可靠性。如图2所示，如表示的质量所示，实验鉴定的肽（图2：P1-A–P5-A）的ms/ms光谱中的大多数片段离子与其相应的合成肽（图2：P1-B–P5-B）的光谱相匹配（34）。此外，我们进一步手动验证了ms/ms光谱，以确认所有实验观察到的肽的身份（identity）。将T细胞表位配制到纳米颗粒中并测试表位特异性CTL的诱导和体外交叉反应性。

为了验证被感染的细胞的这些表位的呈递，使用来自健康HLA-A2+供体的PBMC和对应于所鉴定表位的合成肽，产生对5种肽中的每一种都有特异性的CTL。在ELISpot测定中，通过检测抗原特异性IFNγ分泌来测量CTL功能。如图3A所示，受PR8感染的JY和HepG2细胞刺激所有五种流感表位特异性的T细胞。另外，使用用各种甲型流感毒株（X31、H3N2和JAP、H2N2）感染的HepG2靶细胞证明了与其他毒株的交叉反应性，表明这些表位在各种流感毒株感染的细胞中呈递（图3B）。

为了进一步表征这些表位在体内产生的免疫应答，我们用上述五个表位的混合物免疫HLA-A2+转基因小鼠。在作为佐剂的Montanide ISA 51的存在下，使用这些肽进行免疫（图4A）。我们通过在ELISpot测定中测量鼠的IFNγ分泌来确定流感特异性T细胞应答。使用用单个肽1-5脉冲的T2细胞，我们观察到免疫后对所有5种肽的应答（图4B）。结合上述体外结果，当将受不同流感毒株感染的HepG2和JY细胞用作靶标时，对这些肽特异性的体内产生的CTL同样好地受到刺激（图4C），表明在多个流感感染中这些表位被加工并被呈递。除IFNγ释放外，我们还测量了来自脾细胞的CD8+ T细胞关于CD107a的表型变化，CD107a是一种活化标记物，存在于制粒效应CTL上（44, 45）。如图4D所示，与未受感染的靶标相比，当与受感染的靶标温育时，CD8+ T细胞显示出更高强度的CD107a染色。

我们生成了并入HLA-A2特异性表位（NP 1-5）的金纳米颗粒（NP），并与来自流感基质2蛋白（M2e）的共有抗体表位（NP 6）组合。我们用肽+ montanide 51或NP中的肽免疫HLA-A2转基因小鼠，并使用ELISpots（图5A和B）和CD107a表达（图5C）通过IFNγ释放评估CTL应答。并入NP中的肽不添加任何佐剂在体内激活强烈的抗病毒CTL应答。NP除了将肽递送至抗原呈递细胞之外，本身还充当佐剂。没有montanide佐剂的肽没有引起CTL应答（数据未显示）。

除了表征CTL应答外，我们还评估了对来自流感基质2蛋白（M2e）的通用抗体表位的抗体应答。为此，除了来自M2（M2e）的胞外域的肽（P6或NP6）外，我们用MHCI肽（P1-5）或GNP（NP1-5）中的肽免疫一组小鼠（46, 47）。通过IFNγ ELISpot测定（图5A和B）和CD107a（图5C）流式细胞术分析测量的T细胞应答，在用单独的T细胞表位（1-5）或用M2e肽（1-6）的T细胞表位免疫的组之间是类似的。然后使用从免疫小鼠的末端出血收集的血清，通过标准ELISA，测量循环M2e特异性抗体的浓度。如图6所示，用具有montanide佐剂（Pep6）或在GNP（NP6）中的M2e肽免疫的小鼠产生强力的M2e特异性IgG应答（图6A）。然而，当M2e肽与MHC1肽（Pep1-5或NP1-5）组合时，针对M2e的抗体滴度略微降低。如我们在T细胞应答中观察到的，在抗体应答中肽+montanide佐剂和没有任何佐剂的GNP之间没有差异。然而，当我们将不含任何佐剂的游离肽与NP进行比较时，我们观察到NP的抗体反应更强（图6B）。总之，我们证明，与需要引起临床毒性的佐剂的表位相比，GNP掺入的MHCI和抗体表位产生强力的CTL和抗体应答。

然后通过用我们已经测试的所有三种流感病毒株（PR8、X-31或JAP）感染HepG2和JY细胞来表征由肽+montanide佐剂（P1-6，P6）和肽在NP（NP1-6，NP6）中产生的交叉反应产生的M2e抗血清的功能。使用流式细胞仪，我们用从肽+montanide或NP免疫小鼠获得的M2e特异性抗血清处理被感染的细胞，并证明抗体特异性结合PR8、X-31或JAP（分别为绿色、浅绿色、红色）感染的细胞，表明该表位存在于各种流感毒株感染的细胞中（图7）。

最后，通过向感染了PR8病毒的HepG2细胞添加抗血清来测定这些抗体的中和能力。在来自MHCI肽（P1-5或NP1-5）或pM2e肽（pM2e或NP M2e）免疫的小鼠的血清的存在下，以1:50稀释度用低剂量PR8脉冲HepG2细胞1小时。在用相同水平的血清温育过夜后，固定细胞并对流感NP进行细胞内染色。描绘了阳性细胞百分比。灰色填充的直方图是未感染的对照。如图8所示，当使用从具有montanide佐剂的M2e肽（图8A）或GNP中的M2e肽（图8B）获得的含有抗M2e抗体的血清时，感染水平较低，表明M2e特异性抗体的功能。

总结

这是对受流感病毒感染的细胞的MHC I类相关的肽分析进行报道的首次综合研究。值得注意的是，所有表位在不同的流感毒株之间共享。有趣的是，我们还鉴定了一些已经报道的基序预测的受感染细胞上的表位。继MHCI表位表征，我们还证明了抗M2e抗体表位的抗体的广泛抗病毒活性。我们还生成了用T和抗体表位配制的金纳米颗粒（GNP），并在体外和体内研究中表征了抗病毒T和抗体反应。我们生成的数据将对通用流感疫苗的开发、配方和表征产生重大影响。我们的工作也将有助于推进对T细胞介导的流感病毒感染的免疫反应的一般理解。该信息对于开发抗病毒药物以及预防性和治疗性通用疫苗来对抗和预防严重的、以及有些致命的流感病毒感染的病例至关重要。

未来的工作

我们建议评估季节性接种疫苗的个体中对这些表位特异的T细胞和M2e抗体应答的频率，以评估流感感染中的内源性细胞介导的和体液的应答。根据这一目标，我们初步调查了暴露于流感感染的一般人群中M2e特异性抗体的存在，并进行了季节性疫苗接种。我们从10名健康个体（5名男性和5名女性）获得（购买自Research Blood Components LLC，Brighton，MA）血清样品。使用标准ELISA测定，评估抗保守的M2e表位的抗体的存在。

将各种稀释度的血清样品应用于M2e肽包被的ELISA孔，并用抗人IgG二抗和Licor检测剂进行处理（34）。ELISA孔的实际图像显示了具有4种不同稀释度的每个个体。图9中显示的数据清楚地表明，一些个体确实产生针对保守的M2e表位的抗体。然而，一些个体的滴度非常低。值得注意的是，流感感染（可能是季节性疫苗接种）确实诱导对这种通用抗体表位的内源性抗体反应。用这种通用表位免疫并产生强力的抗体反应，可以诱导有效的保护。我们计划在第二阶段建议中测试这一假设。

除了对通用B细胞表位的抗体反应外，我们还计划评估对我们在I期建议中识别和表征的MHCI表位特异性的T细胞频率。为了完成这项任务，我们建议合成具有特定表位的MHC四聚体或dextramer，并从暴露于流感病毒并接种季节性流感疫苗的个体筛选PBL。我们在使用源自登革热病毒感染的T细胞表位的MHC dextramer分析方面拥有丰富的经验。我们使用3个含有dextramer的HLA-A2特异性T细胞表位，筛选了几名登革热病毒血清阳性的患者。该dextramer由Immudex（Fairfax，VA）合成。从全血中纯化PBMC并用抗CD8抗体和dextramer染色。在Guava流式细胞仪中分析被染色的细胞，并使用Guavasoft InCyte软件产生阳性数据百分比。四名患者具有三种不同表位（NIQ、VTL、KLA）特异性的dextramer数据显示在图10中。所有患者均具有一定水平（0.5％-4％）的循环CD8+ T细胞，其特异性结合T细胞表位dextramer。我们还在体外短期培养物中用特异性肽刺激这些T细胞，并获得特异性CTL应答数据（图11）。来自显示高百分比的dextramer染色的登革热血清阳性患者p151（图10）的PBL用培养物中的肽刺激7天。通过IFNγ产生的细胞内染色和流式细胞术分析评估活化的T细胞的CTL功能。如图11所示，针对载有单个肽的靶标（NIQ pep、KLA pep、VTLpep）以及受登革病毒血清型2（DV2）感染的靶标（NIQ DV2、KLA DV2、VTL DV2），CTL活性是显著的（0.7％-1.1％）。dextramer和CTL分析数据可能无法被直接比较，但是，值得注意的是，dextramer阳性细胞能够被特异性的表位重新活化，并且CTL在识别病毒感染细胞中起作用。

为了利用病毒特异性CD4和CD8T细胞应答的激活，我们建议合成嵌入含有内源序列的延伸的15mer肽中的所识别的CD8T细胞表位。这些较长的肽具有刺激CD4+ T细胞的潜力。为了评估这种较长的肽诱导CTL活化的功效，我们测试了来自卵清蛋白（SIINFEKL）的充分表征的典型CD8 T细胞表位（48）。我们通过在SIINFEKL（QLE SIINFEKL TEW）的N和C末端包括三个内源的侧翼aa残基来合成延伸的肽，并评估待处理和呈递CD8表位用于T细胞活化的较长的肽。

如图12A和B所示，当包含延伸肽的模型卵清蛋白H2Kb表位由APC（LKb细胞）处理和呈递（图12A）并且实现T细胞识别和活化（图12B）时，表明CD8表位嵌入的较长的肽是能够被处理和激活T细胞的。尽管Ext SIIN脉冲LKb细胞中CD8表位的递呈与游离肽装载相比较低（这是预期的，因为Ext SIIN需要内化和进一步加工），但T细胞的活化在Ext SIIN脉冲APC中相当，这更为关键。假设的是这些较长的肽也将在体内充当辅助肽，用于有效的CTL和B细胞活化用于抗流感疫苗应答。

纳米颗粒递送安全性验证

虽然GNP疫苗组合物从未在人类中进行过测试，但已经在I期临床研究中评估了它们在健康志愿者中胰岛素肽的安全性和递送，证明了目前为止具有良好的安全性。此外，之前的体内和体外安全性研究表明，在大型动物毒理学研究中，颗粒在非常高的浓度下是安全的。纳米颗粒的所有单独组分都是合成的，并且当单独施用时没有显示出毒性。已经在使用各种癌细胞系、全血和人颊粘膜进行细胞增殖、细胞因子释放和细胞毒性的体外研究中测试了GNP制剂的安全性，没有观察到不良反应。已经使用各种疫苗和转移肿瘤模型，使用纳米颗粒疫苗制剂进行毒理学研究，未检测到毒性。此外，在小鼠脑GL261胶质瘤模型和视网膜血管研究中，在CSIS体内成像研究中未观察到毒性。进行GLP毒理学研究，每天以5.4 mg/kg的理论剂量给小鼠静脉注射纳米颗粒，连续5天，尿液、粪便排泄物中或脑、肝、肾、心脏、脾脏和肺等器官中无临床毒性症状。

之前工作的总体结论

这个部分介绍的工作突出了GNP作为多表位疫苗递送平台的多样性，以及我们在病毒感染免疫分析方面的优势。与该研究特别相关的是，我们在MHC相关肽分析、T细胞表位鉴定和疫苗递送系统中T细胞功能表位表征方面的丰富的经验（49-52）。根据我们在癌症（53,54）和传染病（包括流感（34）和登革热（55））方面的初步工作，我们相信我们将成功完成建议的项目。值得注意的是，疫苗递送平台和T细胞表位识别方法也广泛适用于其他传染病。

方法

CTL频率分析

来自接受了季节性流感疫苗接种的HLA-A2或A24阳性健康个体的血沉棕黄层样品将会从Research Blood Components LLC（Brighton，MA）购买。我们建议评估6-10名患者。将会获得具有HLA-A2和A24特异性肽的肽MHC四聚体（Proimmune）和Dextramer（Immudex）构建体。按照标准方法从血沉棕黄层中纯化PBMC。按照制造商的方案，PBMC将会用四聚体（56）或dextramer（57）构建体染色。将细胞与抗CD8抗体FITC结合物共染色。在Guava流式细胞仪（Millipore）中分析染色的细胞，并使用Guavasoft InCyte软件产生百分比阳性数据（图10）。双染色细胞将会被计为总PBMC百分比。不相关的、现成的肽MHC四聚体或dextrame将会被用作阴性对照。

激活记忆和初始CTL

为了激活初始T细胞，获得来自HLA-A2或A24阳性健康供体（购买自Research BloodComponents，LLC.Brighton，MA）的外周血。使用淋巴细胞分离培养基（Mediatech），使用标准方法的差速离心，纯化外周血单核细胞（PBMC）。PBMC将会在完整的RPMI 1640培养基中培养过夜。移除非贴壁细胞并保存。将塑料贴壁细胞用50 μg/mL合成肽和1.5 μg/mL人β2-微球蛋白（EMB Biosciences，Gibbstown，NJ）在完全培养基中脉冲2小时。然后将非贴壁细胞加回5 mL完全培养基中，补充5 ng/mL的IL-7、25 ng/mL的粒细胞单核细胞集落刺激因子（GM-CSF）、50 ng/mL的IL-4（所有细胞因子和生长因子均购买自Peprotech，Rocky Hill，NJ）。将平板在37℃、含有5％CO₂的潮湿培养箱中培养12天。用自体CD4+/CD8+ T细胞耗尽的PBMC重新刺激T细胞一次，所述PBMC在含有5 ng/mL IL-7和的10 U/mL IL-2完全培养基中以10 μg/mL合成肽和1.5 μg/mL人β2-微球蛋白脉冲5天。在用于CTL测定之前，重复刺激将会重复三次。如公开文献（34）中所述，将会使用载有肽的T2细胞和用不同流感毒株感染的靶细胞进行CTL测定。对于记忆T细胞活化，在CTL测定之前，PBMC将会如上所述用肽脉冲的APC激活一次（图11）。

将会在相应的ELISPOT测定中测定抗原刺激的干扰素-γ（IFN-γ）和颗粒酶B释放作为CTL活化的量度（58, 59）。肽脉冲的T2细胞以及不相关的HLA-A2肽脉冲的T2细胞（1 微克/mL肽在37℃下2小时）将会被用作对照，被流感感染和未被感染的细胞作为靶标。此外，将会通过MagPix Luminex技术（Millipore）评估各种细胞因子（IFN-γ、TNF-α、颗粒酶B）的分泌。所有测定中都包括用来刺激CTL作为阴性和阳性对照的非特异性IFN-γ诱导的适当的对照（包括肽未脉冲的T2和PHA）。

M2e特异性抗体反应

来自接受了季节性流感疫苗接种的健康个体的血清样品将会被用于使用标准ELISA技术分析保守的M2e表位特异性抗体的存在（图9）。另外，血清样品将会被用于测量被感染的细胞表面上M2e抗体表位的识别。如前所述，HepG2细胞将会被PR8、X31和JAP病毒感染（34）。温育过夜后，将细胞用1:50稀释的血清样品染色，然后用FITC标记的抗小鼠IgG（Invitrogen）二抗染色。使用Guava流式细胞仪和GuavaSoft InCyte软件分析样品。

配制具有嵌入了CD8表位的较长肽的NP，并在体外和体内表征CD4和CD8应答

由主要组织相容性复合物（MHC）I类限制性CD8+细胞毒性T淋巴细胞（CTL）引发的细胞介导的免疫（CMI），在控制流感病毒感染中起重要作用（60-63）（6）。由于交叉反应的表位（通常来自病毒亚型之间保守的内部病毒蛋白）的识别，由原发性流感感染产生的CMI提供针对血清学上不同的病毒的实质性保护（64-66）。重要的是，除了CTL在介导病毒清除中的作用外（67, 68），人类的CD8+ T细胞对甲型流感病毒的不同亚型显示出交叉反应的急性（15-17）和记忆反应（25）。小鼠中的流感感染研究表明，病毒清除是由抗原特异性CD8+效应T细胞介导的，而记忆CD4+ T细胞在维持CD8+ T和B细胞记忆反应中很重要（69）。最近，效应CD4+和CD8+ T细胞都参与肺部炎症的控制，并通过产生白细胞介素-10来限制过度的组织损伤（70）。通过体外研究表明CD4+ T细胞具有潜在的保护作用，证明CD4+ T细胞对先前未被感染的菌株的反应性，例如，季节性菌株引发的CD4+ T细胞对禽H5N1的反应性（71-74）。在没有预先存在的保护性抗体的大流行的背景下，T细胞可以介导保护或限制人类流感相关疾病的严重程度（75）。已经证明，在现有抗体的情况下，已经存在的T细胞应答调节流感的严重程度（15）。最近，Wilkinson等人在健康志愿者的人类激发（challenge）模型中，使用来源于流感基因组保守区域的延伸的CD4活化肽来研究CMI在限制流感中的作用，所述健康志愿者对激发菌株缺乏可检测的体液免疫并且表现出广谱保护（28）。有趣的是，在某些情况下，这些延伸的肽嵌入之前报道的激活CD8+ T细胞应答的MHC I类表位（28, 34）。鉴于CD4和CD8阳性T细胞应答在保护免受流感感染方面的重要作用，我们建议配制具有所鉴定的CD8T细胞表位的疫苗，所述CD8T细胞表位嵌入具有激活CD4+ T细胞潜力的延伸肽内。在该目的中，我们将通过在A2和A24表位的N和C末端包括三个内源的侧翼aa残基来合成延伸的肽。将这些延伸的肽配制在金纳米颗粒中，并在体外用人PBMC测试CD4和CD8阳性T细胞应答，并在A2转基因小鼠体内测试CTL应答。

具有表位的纳米颗粒的制备

CD8和延伸的CD4肽（表4）都将在合成阶段衍生，以含有与组织蛋白酶B可切割的二肽（其与所选择的肽表位邻接）连接的混合脂肪族的/聚乙烯接头。肽结合物通过单步、自缔合化学反应结合到纳米颗粒中，其产生具有~1.6 nm的金金属核心和如之前所述的用葡萄糖和二至五碳间隔物修饰的混合配体电晕的纳米颗粒（35）。将肽混合物（各0.94 mg，0.35 μmol）溶解在TFA（20 μL）中，并将溶液在氩气流下浓缩直至形成油状物。加入MeOH（1250微升）并将反应涡旋20秒。然后将Glc-配体（1.34 mg，5.60 μmol）和GlcNHAc-配体（1.23mg，4.37μmol）加入到甲醇溶液中，用TFA（2 μL）将pH调节至2。加入HAuCl4（300微升，7.5微摩尔）的水溶液，将溶液涡旋20秒。将取50微升的等分试样用于进一步金含量的分析。在快速摇动下，将1N NaBH4水溶液（165微升，165微摩尔）分几部分加入剩余溶液中。形成的黑色悬浮液将通过离心摇动和沉淀。然后将沉淀溶解在水中并透析。如前所述，纳米团簇表面上不同配体的比例将通过比较初始混合物、形成的NP和在自组装过程后回收的母液的1H NMR光谱来评估（35）。

CD8表位	延伸的表位（潜在的CD4表位）	蛋白质	HLA基序
				YINTALLNA	kgvYINTALLNAsca	聚合酶PA	A2
PVAGGTSSIYI	rflPVAGGTSSIYIevl	聚合酶PB2	A2
				TVIKTNMI	igvTVIKTNMInnd	聚合酶PB1	A2/A24
AIMDKNIIL	mdqAIMDKNIILkan	非结构蛋白1	A2/A24
				ITFHGAKEI	kreITFHGAKEIsls	基质蛋白1	A2/A24
AINGITNKV	tqnAINGITNKVnsv	血球凝集素	A2/A24

表4：CD8表位和延伸的潜在CD4表位。显示了对CD8表位的HLA限制。

体外表位特异性CD4+和CD8+ T细胞应答的评估

我们建议评估纳米颗粒疫苗制剂激活特异性CD4+和CD8+ T细胞应答的能力。如上所述，PBMC将会从供体中分离，并用NP疫苗制剂或作为对照的单独的合成肽脉冲。表位特异性T细胞通过使用与CD4或CD8抗体连接的珠子（Dynabeads，Invitrogen）的阳性选择进行纯化，从珠子上分离（DetahABead，Invitrogen），并被用于下游应用。将新鲜纯化的表位特异性CD4+或CD8+ T细胞与用相关肽脉冲或用不同流感毒株（PR、X31、JAP）感染的抗原呈递细胞培养过夜。将会以三种方式评估T细胞活化：1）IFN-γ ELISpot测定，2）通过MagPixLuminex技术（IFN-γ、TNF-α、颗粒酶B、IL-2）并且对于CD8+ T细胞应答检测的细胞因子分泌，3）流式细胞术检测CD8+ T细胞上脱粒标记物CD107a的表达。在所有实验中，未感染的和未脉冲的APC将会用作阴性对照。

预期的结果和技术挑战：我们预测NP制剂将会比单独的肽诱导更强力的CD4+和CD8+ T细胞应答，并且这些T细胞将会识别用每种不同的流感毒株感染的靶细胞。然而，我们可能观察到延伸的肽不能有效激活CD4 T细胞。在这种情况下，我们可以扩展肽长度以包含更多残基或直接在制剂中添加经验证的CD4 T细胞表位。我们预计实验本身不会出现问题，因为我们对所建议的技术（包括流感病毒感染）有丰富的经验。如果任何上述技术确实成为问题，例如由于细胞数量问题，我们能够使用多参数流式细胞仪评估关键细胞因子（IFN-g、TNF-α、颗粒酶B）的内部水平，以鉴定单一培养物中活化的CD4和CD8+ T细胞。

体内表位特异性CD8+ T细胞应答的评估

HLA-A2和A24转基因小鼠（Taconic，Hudson，NY）研究将会外包给Lampire BiologicsLaboratories（Pipersville，PA）。简单地说，4-8周龄的雌性小鼠将会用10 μg每种含有延伸肽的疫苗制剂在两个位置进行免疫：在尾巴的基部皮内注射（i.d.）和在侧面皮下注射（s.c.）。作为对照，用PBS或肽+montanide佐剂免疫小鼠。所有小鼠各自被免疫三次：第0、10和30天。最后一次免疫后7天，收获脾脏，在无菌磨砂玻璃载玻片之间压碎，并通过0.45 μm网孔过滤器过滤，得到单细胞悬浮液。单细胞悬浮液将会用于通过阴性选择纯化CD8+ T细胞。将会在上述体外部分中描述的相同过夜测定中立即使用细胞：ELISpot、细胞因子分泌和流式细胞术以检测脱粒。除了功能测定之外，将会使用如目标1中所述的MHC-I四聚体技术评估CD8+ T细胞特异性。

预期的结果和技术挑战：我们预期在免疫小鼠体内观察到肽抗原特异性T细胞活化。此外，我们预测，与PBS或肽+montanide组相比，用NP制剂免疫的小鼠对肽脉冲的或感染的APC具有更强力的T细胞应答。如果我们观察到一些肽在这些小鼠中没有诱导反应，我们可以以直接的方式用另外的保守的表位改变疫苗制剂。我们对HLA-A2和HLA-A24转基因模型有丰富的经验，因此我们预计在使用这些转基因小鼠模型系统时不会出现任何问题。

使用HLA-A2和A24转基因小鼠评估病毒激发模型中NP疫苗制剂的体内保护

理由：为了使疫苗被认为是有效的，如果不能完全防止病原体建立感染，则它必须显著降低疾病的持续时间和严重程度。如果能够诱导针对大多数菌株的广泛保护，则将会显著改善针对多菌株病原体（如流感病毒）的疫苗。为此，我们在病毒激发模型中直接测试含有T和B细胞表位的NP疫苗制剂，并确定该疫苗是否能够降低针对两种不同流感病毒株的发病率和死亡率。我们将会使用HLA-A2转基因小鼠模型进行完整研究，如果成功，则我们将会重复HLA-A24转基因小鼠模型中的体重减轻和致死的激发研究。

方法：为了评估NP疫苗免疫后的体内保护，我们将会使用由我们的合作者Drexel大学的Peter Katsikis博士建立的流感激发模型（76）。HLA-A2转基因小鼠（Taconic，Hudson，NY）菌株将会被用于评估由含有流感病毒特异性T和B细胞表位的NP配制的疫苗诱导的保护。简单地说，我们计划使用雌性小鼠并测试3次免疫接种的疫苗接种时间（第0、10和30天）。在两个位置用10 μg每种肽NP疫苗制剂免疫小鼠：在尾巴基部皮内注射或在侧面皮下注射。作为对照，还将会施用含有和不含佐剂（Montanide ISA 51）的肽。

接种疫苗后，我们将会解决一些重要问题。NP疫苗接种是否能够1）在流感病毒激发后诱导强力的继发性CTL应答，2）减少病毒载量或加速病毒清除，3）防止亚致死流感病毒感染引起的发病率和4）防止流感病毒的强毒株的致命激发。对于发病率研究，我们将会在免疫接种后45天用亚致死剂量的感染性甲型流感病毒PR8（H1N1、A/Puerto Rico/8/34）激发接种疫苗的动物。小鼠被i.n.感染并且将会通过两种方式评估发病率：体重和病毒诱导的肺病理学。通过在病毒激发当天开始的14天的过程中每天对小鼠称重来监测体重的变化（76, 77）。我们将会使用每组n=9只动物（参见用于功效分析的建议的脊椎动物部分进行）。这些数字将会在三个独立的实验中进行。基于初步数据，当将感染后8-10天的野生型动物的体重减轻与第0天的进行比较时，效果大小为20.4％。假定接种疫苗的小鼠体重减轻50％，效果大小为10.2％。效果大小（d）与标准差（s）为~5.2％的这种差异将会需要每组6只动物，用于α=0.05、80％功效和双尾测试。由于麻醉或感染可能不会总是产生感染或动物死亡，我们每个实验组使用9只小鼠以确保我们有足够数量的动物。

在PR8感染后，将会评估病毒诱导的肺部炎症和病理学。在感染后第6天和第10天，处死小鼠并收获肺。肺将会用于病理学，并且一些肺叶将会用于制备胶原酶+DNA酶消化的单细胞悬浮液。单细胞悬浮液将会用于量化CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、NK细胞、B细胞、DC、巨噬细胞和浸润肺的粒细胞的绝对数量。另外，通过染色CD25、CD69、CD80/86和MHC-II的细胞悬浮液，用流式细胞术检查这些细胞的活化谱。此外，我们将会评估肺病理学。评估基于肺的大小、外观和颜色的总体病理学变化以及通过苏木精和伊红染色评估的组织病理学变化（78, 79）。肺病理学将会允许我们评估疫苗接种是否可以防止肺损伤。肺病理学将会通过H＆E染色和通过病理科的工作人员进行组织学评估。除了发病率的测量之外，将会通过在感染后第3、6和10天实时PCR扩增病毒的基质基因（76）来评估肺中的病毒载量。

评估疫苗效力的重要性在于确定疫苗团是否引发有效的二级应答。为了评估我们的多表位NP疫苗接种是否导致强力的二次应答，我们将会测量流感病毒感染后的CD8+ T细胞应答和抗M2e抗体应答。在感染后第3天、第6天和第10天收获肺和脾，并且通过肽载有的MHC-I类四聚体和肽刺激的细胞内IFNγ染色来分析CD8+ T细胞应答。收获时收集血液，通过ELISA测定血清M2e抗体。使用血细胞凝集抑制测定法测定血清中的中和抗流感抗体。

最后，为了确保NP疫苗配方能够防御一系列流感病毒并抵御致命激发，我们将会使用10x LD50的甲型流感病毒Eq/Lon（H7N7 A/Equine/London/1416/73）（一种在小鼠中具有高致病性的菌株）进行致命激发（80, 81）。与PR8感染一样，将监测体重发病率作为保护的读数。在两种病毒模型中，将会在i.n.激发之后分析B和T细胞应答。对于使用Eq/Lon感染的致命激发研究，我们包括每组n=15（参见用于功效分析建议的脊椎动物部分进行）。接种疫苗组的生存概率为0.6（60％）以及对照组的生存概率为0.1（10％）的功效分析，为了功效为0.8以及组比为1的α值为0.05，需要总样本量为30只动物（每组15只）。激发后，通过目视检查临床症状，每天监测动物两次。当动物符合以下标准时被处死：1）对外来刺激无反应，2）虚脱大于1h，3）呼吸困难，4）持续性震颤，或5）持续驼背。记录所有观察结果。失去>25％体重的动物将被移除，并且在生存分析中计数未存活。死亡不会成为这项研究的终点。（IACUC不允许死亡作为终点）。

目标4：毒理学和安全性研究

理由：尽管在人类临床研究（初步研究）中已经评估了空的纳米颗粒和含有胰岛素肽的纳米颗粒的安全性，但是具有任何抗原表位的NP从未在人体中进行过安全性测试。由于这些表位对人HLA-A2和A24分子具有特异性并且具有与人免疫应答相关的特定生物学功能，因此在相关动物模型中评估疫苗制剂的安全性也是至关重要的。如上所述，HLA转基因小鼠模型广泛用于评估基于表位的疫苗制剂的体内功效。为此，我们将会使用这些转基因小鼠模型评估纳米颗粒的安全性。

方法：纳米颗粒疫苗制剂将会以各种剂量（多达来自目标3的疫苗剂量的10倍）通过皮内、皮下或静脉施用连续5天。施用体积为100μL/动物。在48小时内监测体重和饲料消耗。在研究期间的不同时间点，24小时内收集尿液和粪便样品，并收集每只动物的总尿液和粪便，并在室温下称重并储存在-80±10℃。在预先设定的时间获得血液样品并收集到EDTAK3管中并保持在冷浴中直至离心（3500 rpm，10分钟，4℃）。然后将获得的血浆冷冻至-80±10℃。在血液提取后，将动物处死以获得以下组织样品：脑、肝、肾、心脏、脾和肺。将组织样品称重并在液氮中快速冷冻，然后储存于-80±10℃。进行血液和组织样品的毒理学分析，并且分析所有数据的统计学显著性。用收集的血液样品进行血液化学分析。评估肝功能标记物（丙氨酸转氨酶、天门冬氨酸氨基转移酶、白蛋白、碱性磷酸酶、总胆红素和直接胆红素以及乳酸脱氢酶）、肾功能（血尿素氮、肌酐、尿酸和总蛋白）和心脏功能（天门冬氨酸氨基转移酶和乳酸脱氢酶）。此外，测试中还将会包括过敏标记物（嗜酸性粒细胞、球蛋白、淋巴细胞和单核细胞计数）和血液学疾病（血红蛋白、血细胞比容、红细胞和白细胞计数）。还将会通过透射电子显微镜（TEM）研究组织样品的金颗粒积累（82,83）。

参考文献

1.Neuzil KM. Influenza: New Insights Into an Old Disease. Curr InfectDis Rep. 2000;2(3):224-30. PubMed PMID: 11095860.

2.Mullooly JP, Bennett MD, Hornbrook MC, Barker WH, Williams WW,Patriarca PA, et al. Influenza vaccination programs for elderly persons:cost-effectiveness in a health maintenance organization. Ann Intern Med.1994;121(12):947-52. PubMed PMID: 7978721.

3.Hensley SE, Pinto AK, Hickman HD, Kastenmayer RJ, Bennink JR, VirginHW, et al. Murine norovirus infection has no significant effect on adaptiveimmunity to vaccinia virus or influenza A virus. J Virol. 2009;83(14):7357-60. PubMed PMID: 19403665.

4.Murphy BR, Nelson DL, Wright PF, Tierney EL, Phelan MA, Chanock RM.Secretory and systemic immunological response in children infected with liveattenuated influenza A virus vaccines. Infect Immun. 1982;36(3):1102-8.PubMed PMID: 7095844.

5.Burlington DB, Clements ML, Meiklejohn G, Phelan M, Murphy BR.Hemagglutinin-specific antibody responses in immunoglobulin G, A, and Misotypes as measured by enzyme-linked immunosorbent assay after primary orsecondary infection of humans with influenza A virus. Infect Immun. 1983;41(2):540-5. PubMed PMID: 6874068.

6.Subbarao K, Murphy BR, Fauci AS. Development of effective vaccinesagainst pandemic influenza. Immunity. 2006;24(1):5-9. PubMed PMID: 16413916.

7.Johansson BE, Bucher DJ, Kilbourne ED. Purified influenza virushemagglutinin and neuraminidase are equivalent in stimulation of antibodyresponse but induce contrasting types of immunity to infection. J Virol.1989;63(3):1239-46. PubMed PMID: 2915381.

8.Paul WE, Benacerraf B. Functional specificity of thymus- dependentlymphocytes. Science. 1977;195(4284):1293-300. PubMed PMID: 320663.

9.Shedlock DJ, Shen H. Requirement for CD4 T cell help in generatingfunctional CD8 T cell memory. Science. 2003;300(5617):337-9. PubMed PMID:12690201.

10.Ngo-Giang-Huong N, Candotti D, Goubar A, Autran B, Maynart M, SicardD, et al. HIV type 1-specific IgG2 antibodies: markers of helper T cell type1 response and prognostic marker of long-term nonprogression. AIDS Res HumRetroviruses. 2001;17(15):1435-46. PubMed PMID: 11679156.

11.Heeney JL. Requirement of diverse T-helper responses elicited by HIVvaccines: induction of highly targeted humoral and CTL responses. Expert RevVaccines. 2004;3(4 Suppl):S53-64. PubMed PMID: 15285705.

12.Novak EJ, Liu AW, Nepom GT, Kwok WW. MHC class II tetramers identifypeptide-specific human CD4(+) T cells proliferating in response to influenzaA antigen. J Clin Invest. 1999;104(12):R63-7. PubMed PMID: 10606632.

13.Kamperschroer C, Dibble JP, Meents DL, Schwartzberg PL, Swain SL. SAPis required for Th cell function and for immunity to influenza. J Immunol.2006;177(8):5317-27. PubMed PMID: 17015717.

14.Marshall D, Sealy R, Sangster M, Coleclough C. TH cells primed duringinfluenza virus infection provide help for qualitatively distinct antibodyresponses to subsequent immunization. J Immunol. 1999;163(9):4673-82. PubMedPMID: 10528164.

15.McMichael AJ, Gotch FM, Noble GR, Beare PA. Cytotoxic T-cell immunityto influenza. N Engl J Med. 1983;309(1):13-7. PubMed PMID: 6602294.

16.De Groot AS, Ardito M, McClaine EM, Moise L, Martin WD.Immunoinformatic comparison of T-cell epitopes contained in novel swine-origin influenza A (H1N1) virus with epitopes in 2008-2009 Conventionalinfluenza vaccine. Vaccine. 2009;27(42):5740-7. PubMed PMID: 19660593.

17. Greenbaum J. http://iedb.zendesk.com/forums/45499/entries/35037Knowledgebase and Forums / Epitope analysis in emerging H1N1 swine fluviruses / Analysis version 1.0) 2009.

18.Kilbourne ED. What are the prospects for a universal influenzavaccine. Nat Med. 1999;5(10):1119-20. PubMed PMID: 10502805.

19.Choppin PW, Tamm I. Studies of two kinds of virus particles whichcomprise influenza A2 virus strains. II. Reactivity with virus inhibitors innormal sera. J Exp Med. 1960;112:921-44. PubMed PMID: 13693272.

20.Epstein SL, Misplon JA, Lawson CM, Subbarao EK, Connors M, Murphy BR.Beta 2-microglobulin-deficient mice can be protected against influenza Ainfection by vaccination with vaccinia-influenza recombinants expressinghemagglutinin and neuraminidase. J Immunol. 1993;150(12):5484-93. PubMedPMID: 8390536.

21.Price GE, Ou R, Jiang H, Huang L, Moskophidis D. Viral escape byselection of cytotoxic T cell-resistant variants in influenza A viruspneumonia. J Exp Med. 2000;191(11):1853-67. PubMed PMID: 10839802.

22.Woodland DL, Hogan RJ, Zhong W. Cellular immunity and memory torespiratory virus infections. Immunol Res. 2001;24(1):53-67. PubMed PMID:11485209.

23.Boon AC, de Mutsert G, Graus YM, Fouchier RA, Sintnicolaas K,Osterhaus AD, et al. Sequence variation in a newly identified HLA-B35-restricted epitope in the influenza A virus nucleoprotein associated withescape from cytotoxic T lymphocytes. J Virol. 2002;76(5):2567-72. PubMedPMID: 11836437.

24.Ben-Yedidia T, Marcus H, Reisner Y, Arnon R. Intranasal administrationof peptide vaccine protects human/mouse radiation chimera from influenzainfection. Int Immunol. 1999;11(7):1043-51. PubMed PMID: 10383936.

25.Jameson J, Cruz J, Ennis FA. Human cytotoxic T-lymphocyte repertoireto influenza A viruses. J Virol. 1998;72(11):8682-9. PubMed PMID: 9765409.

26.Kanekiyo M, Wei CJ, Yassine HM, McTamney PM, Boyington JC, Whittle JR,et al. Self-assembling influenza nanoparticle vaccines elicit broadlyneutralizing H1N1 antibodies. Nature. 2013;499(7456):102-6. Epub 2013/05/24.doi: 10.1038/nature12202. PubMed PMID: 23698367.

27.Pleguezuelos O, Robinson S, Stoloff GA, Caparros-Wanderley W.Synthetic Influenza vaccine (FLU-v) stimulates cell mediated immunity in adouble-blind, randomised, placebo-controlled Phase I trial. Vaccine. 2012;30(31):4655-60. Epub 2012/05/12. doi: 10.1016/j.vaccine.2012.04.089. PubMedPMID: 22575166.

28.Wilkinson TM, Li CK, Chui CS, Huang AK, Perkins M, Liebner JC, et al.Preexisting influenza-specific CD4+ T cells correlate with disease protectionagainst influenza challenge in humans. Nat Med. 2012;18(2):274-80. Epub 2012/01/31. doi: 10.1038/nm.2612. PubMed PMID: 22286307.

29.Atsmon J, Kate-Ilovitz E, Shaikevich D, Singer Y, Volokhov I, Haim KY,et al. Safety and immunogenicity of multimeric-001--a novel universalinfluenza vaccine. Journal of clinical immunology. 2012;32(3):595-603. Epub2012/02/10. doi: 10.1007/s10875-011-9632-5. PubMed PMID: 22318394.

30.Tao W, Ziemer KS, Gill HS. Gold nanoparticle-M2e conjugatecoformulated with CpG induces protective immunity against influenza A virus.Nanomedicine (Lond). 2013. Epub 2013/07/09. doi: 10.2217/nnm.13.58. PubMedPMID: 23829488.

31.Testa JS, Philip R. Role of T-cell epitope-based vaccine inprophylactic and therapeutic applications. Future virology. 2012;7(11):1077-88. Epub 2013/05/01. doi: 10.2217/fvl.12.108. PubMed PMID: 23630544; PubMedCentral PMCID: PMC3636528.

32.Fifis T, Gamvrellis A, Crimeen-Irwin B, Pietersz GA, Li J, Mottram PL,et al. Size-dependent immunogenicity: therapeutic and protective propertiesof nano-vaccines against tumors. J Immunol. 2004;173(5):3148-54. PubMed PMID:15322175.

33.Reddy ST, van der Vlies AJ, Simeoni E, Angeli V, Randolph GJ, O'NeilCP, et al. Exploiting lymphatic transport and complement activation innanoparticle vaccines. Nat Biotechnol. 2007;25(10):1159-64. PubMed PMID:17873867.

34.Testa JS, Shetty V, Hafner J, Nickens Z, Kamal S, Sinnathamby G, etal. MHC class I-presented T cell epitopes identified by immunoproteomicsanalysis are targets for a cross reactive influenza-specific T cell response.PLoS One. 2012;7(11):e48484. Epub 2012/11/13. doi: 10.1371/journal.pone.0048484. PubMed PMID: 23144892; PubMed Central PMCID:PMC3492461.

35.Ojeda R, de Paz JL, Barrientos AG, Martin-Lomas M, Penades S.Preparation of multifunctional glyconanoparticles as a platform for potentialcarbohydrate-based anticancer vaccines. Carbohydr Res. 2007;342(3-4):448-59.PubMed PMID: 17173881.

36. Kircheis R, Vondru P, Zinocker I, Haring D, Nechansky A, Loibner H,et al. Immunization of Rhesus monkeys with the conjugate vaccine IGN402induces an IgG immune response against carbohydrate and protein antigens, andcancer cells. Vaccine. 2006;24(13):2349-57. PubMed PMID: 16406172.

37.Beyer M, Schultze JL. Immunoregulatory T cells: role and potential asa target in malignancy. Curr Oncol Rep. 2008;10(2):130-6. PubMed PMID:18377826.

38.Dredge K, Marriott JB, Todryk SM, Dalgleish AG. Adjuvants and thepromotion of Th1-type cytokines in tumour immunotherapy. Cancer ImmunolImmunother. 2002;51(10):521-31. PubMed PMID: 12384803.

39.Thomas PG, Brown SA, Keating R, Yue W, Morris MY, So J, et al. Hiddenepitopes emerge in secondary influenza virus-specific CD8+ T cell responses.J Immunol. 2007;178(5):3091-8. PubMed PMID: 17312156.

40.Huang Q, Liu D, Majewski P, Schulte LC, Korn JM, Young RA, et al. Theplasticity of dendritic cell responses to pathogens and their components.Science. 2001;294(5543):870-5. PubMed PMID: 11679675.

41. Fonteneau JF, Gilliet M, Larsson M, Dasilva I, Munz C, Liu YJ, et al.Activation of influenza virus-specific CD4+ and CD8+ T cells: a new role forplasmacytoid dendritic cells in adaptive immunity. Blood. 2003;101(9):3520-6.PubMed PMID: 12511409.

42. Man S, Newberg MH, Crotzer VL, Luckey CJ, Williams NS, Chen Y, et al.Definition of a human T cell epitope from influenza A non-structural protein1 using HLA-A2.1 transgenic mice. Int Immunol. 1995;7(4):597-605. Epub 1995/04/01. PubMed PMID: 7547687.

43.Gras S, Kedzierski L, Valkenburg SA, Laurie K, Liu YC, Denholm JT, etal. Cross-reactive CD8+ T-cell immunity between the pandemic H1N1-2009 andH1N1-1918 influenza A viruses. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010;107(28):12599-604. Epub 2010/07/10. doi: 10.1073/pnas.1007270107. PubMed PMID: 20616031;PubMed Central PMCID: PMC2906563.

44.Mittendorf EA, Storrer CE, Shriver CD, Ponniah S, Peoples GE.Evaluation of the CD107 cytotoxicity assay for the detection of cytolytic CD8+ cells recognizing HER2/neu vaccine peptides. Breast cancer research andtreatment. 2005;92(1):85-93. Epub 2005/06/28. doi: 10.1007/s10549-005-0988-1.PubMed PMID: 15980996.

45. Betts MR, Brenchley JM, Price DA, De Rosa SC, Douek DC, Roederer M,et al. Sensitive and viable identification of antigen-specific CD8+ T cellsby a flow cytometric assay for degranulation. J Immunol Methods. 2003;281(1-2):65-78. Epub 2003/10/29. PubMed PMID: 14580882.

46. Fiers W, De Filette M, Birkett A, Neirynck S, Min Jou W. A "universal" human influenza A vaccine. Virus research. 2004;103(1-2):173-6.Epub 2004/05/28. doi: 10.1016/j.virusres.2004.02.030. PubMed PMID: 15163506.

47. Grandea AG, 3rd, Olsen OA, Cox TC, Renshaw M, Hammond PW, Chan-HuiPY, et al. Human antibodies reveal a protective epitope that is highlyconserved among human and nonhuman influenza A viruses. Proc Natl Acad Sci US A. 2010;107(28):12658-63. Epub 2010/07/10. doi: 10.1073/pnas.0911806107.PubMed PMID: 20615945; PubMed Central PMCID: PMC2906546.

48.Wherry EJ, Puorro KA, Porgador A, Eisenlohr LC. The induction ofvirus-specific CTL as a function of increasing epitope expression: responsesrise steadily until excessively high levels of epitope are attained. JImmunol. 1999;163(7):3735-45. PubMed PMID: 10490969.

49. Ramakrishna V, Ross M, Petersson M, Gatlin C, Lyons C, Miller C, etal. Naturally occurring peptides associated with HLA-A2 in ovarian cancercell lines identified by mass spectrometry are targets of HLA-A2-restrictedcytotoxic T cells. Int Immunol. 2003;15(6).

50. Philip R, Murthy S, Krakover J, Sinnathamby G, Zerfass J, Keller L,et al. Shared immunoproteome for ovarian cancer diagnostics andimmunotherapy: potential theranostic approach to cancer. J Proteome Res.2007;6(7):2509-17. PubMed PMID: 17547437.

51. Sinnathamby G, Lauer, P., Zerfass, J., Hanson, B., Karabudak, A.,Krakover, J., Secord, A.A., Clay, T.M., Morse, M.A.,Dubensky, T.W.,Brockstedt D.G., Philip, R., and Giedlin, M. Priming and Activation of humanovarian and breast cancer-specific CD8+ T cells by polyvalent Listeriamonocytogenes-based vaccines. J Immunotherapy. 2009;32(8):856-69.

52.Karkada M, Weir, G.M., Quinton,T., Sammatur, L., MacDonald, L.D.,Grant, A.,Liwski, R., Juskevicius, R., Sinnathamby, G., Phillip, R., Mansour,M. A Novel Breast/Ovarian Cancer Peptide Vaccine Platform that PromotesSpecific Type-1 but not Treg/Tr1-Type Responses J Immunotherapy. 2009:inpress.

53.Morse MA, Alvarez Secord A, Blackwell KL, Hobeika A, Sinnathamby G,Osada T, et al. MHC class I-presented tumor antigens identified in ovariancancer by immunoproteomic analysis are targets for T cell responses againstbreast and ovarian cancer. Clin Cancer Res. PubMed PMID: 21300761.

54. Shetty V, Sinnathamby G, Nickens Z, Shah P, Hafner J, Mariello L, etal. MHC class I-presented lung cancer-associated tumor antigens identified byimmunoproteomics analysis are targets for cancer-specific T cell response. JProteomics.74(5):728-43. PubMed PMID: 21362506.

55.Testa JS, Shetty V, Sinnathamby G, Nickens Z, Hafner J, Kamal S, etal. Conserved MHC class I-presented dengue virus epitopes identified byimmunoproteomics analysis are targets for cross-serotype reactive T-cellresponse. J Infect Dis. 2012;205(4):647-55. Epub 2012/01/17. doi: 10.1093/infdis/jir814. PubMed PMID: 22246683.

56.Meidenbauer N, Marienhagen J, Laumer M, Vogl S, Heymann J, AndreesenR, et al. Survival and tumor localization of adoptively transferred Melan-A-specific T cells in melanoma patients. J Immunol. 2003;170(4):2161-9. PubMedPMID: 12574389.

57.Batard P, Peterson DA, Devevre E, Guillaume P, Cerottini JC, RimoldiD, et al. Dextramers: new generation of fluorescent MHC class I/peptidemultimers for visualization of antigen-specific CD8+ T cells. J ImmunolMethods. 2006;310(1-2):136-48. PubMed PMID: 16516226.

58.Ramakrishna V, Ross MM, Petersson M, Gatlin CC, Lyons CE, Miller CL,et al. Naturally occurring peptides associated with HLA-A2 in ovarian cancercell lines identified by mass spectrometry are targets of HLA-A2-restrictedcytotoxic T cells. Int Immunol. 2003;15(6):751-63. PubMed PMID: 12750359.

59.Morse MA, Nair SK, Mosca PJ, Hobeika AC, Clay TM, Deng Y, et al.Immunotherapy with autologous, human dendritic cells transfected withcarcinoembryonic antigen mRNA. Cancer Invest. 2003;21(3):341-9. PubMed PMID:12901279.

60.Doherty PC, Allan W, Eichelberger M, Carding SR. Roles of alpha betaand gamma delta T cell subsets in viral immunity. Annu Rev Immunol. 1992;10:123-51. PubMed PMID: 1534240.

61.Eichelberger M, Allan W, Zijlstra M, Jaenisch R, Doherty PC. Clearanceof influenza virus respiratory infection in mice lacking class I majorhistocompatibility complex-restricted CD8+ T cells. J Exp Med. 1991;174(4):875-80. PubMed PMID: 1919440.

62. Epstein SL, Lo CY, Misplon JA, Bennink JR. Mechanism of protectiveimmunity against influenza virus infection in mice without antibodies. JImmunol. 1998;160(1):322-7. PubMed PMID: 9551987.

63. Graham MB, Braciale TJ. Resistance to and recovery from lethalinfluenza virus infection in B lymphocyte-deficient mice. J Exp Med. 1997;186(12):2063-8. PubMed PMID: 9396777.

64. Rimmelzwaan GF, Osterhaus AD. Cytotoxic T lymphocyte memory: role incross-protective immunity against influenza Vaccine. 1995;13(8):703-5. PubMedPMID: 7483784.

65.Yewdell JW, Bennink JR, Smith GL, Moss B. Influenza A virusnucleoprotein is a major target antigen for cross-reactive anti-influenza Avirus cytotoxic T lymphocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 1985;82(6):1785-9.PubMed PMID: 3872457.

66.Tan PT, Khan AM, August JT. Highly conserved influenza A sequences asT cell epitopes-based vaccine targets to address the viral variability. HumVaccin. 2011;7(4):402-9. Epub 2011/04/08. PubMed PMID: 21471731.

67.Yap KL, Braciale TJ, Ada GL. Role of T-cell function in recovery frommurine influenza infection. Cell Immunol. 1979;43(2):341-51. PubMed PMID:113108.

68.Yap KL, Ada GL, McKenzie IF. Transfer of specific cytotoxic Tlymphocytes protects mice inoculated with influenza virus. Nature. 1978;273(5659):238-9. PubMed PMID: 306072.

69. Stambas J, Guillonneau C, Kedzierska K, Mintern JD, Doherty PC, LaGruta NL. Killer T cells in influenza. Pharmacology & therapeutics. 2008;120(2):186-96. Epub 2008/09/20. doi: 10.1016/j.pharmthera.2008.08.007. PubMedPMID: 18801385.

70. Sun J, Madan R, Karp CL, Braciale TJ. Effector T cells control lunginflammation during acute influenza virus infection by producing IL-10. NatMed. 2009;15(3):277-84. Epub 2009/02/24. doi: 10.1038/nm.1929. PubMed PMID:19234462; PubMed Central PMCID: PMC2693210.

71.McKinstry KK, Strutt TM, Swain SL. Hallmarks of CD4 T cell immunityagainst influenza. Journal of internal medicine. 2011;269(5):507-18. Epub2011/03/03. doi: 10.1111/j.1365-2796.2011.02367.x. PubMed PMID: 21362069;PubMed Central PMCID: PMC3395075.

72. Richards KA, Topham D, Chaves FA, Sant AJ. Cutting edge: CD4 T cellsgenerated from encounter with seasonal influenza viruses and vaccines havebroad protein specificity and can directly recognize naturally generatedepitopes derived from the live pandemic H1N1 virus. J Immunol. 2010;185(9):4998-5002. Epub 2010/10/05. doi: 10.4049/jimmunol.1001395. PubMed PMID:20889549.

73. Lee LY, Ha do LA, Simmons C, de Jong MD, Chau NV, Schumacher R, etal. Memory T cells established by seasonal human influenza A infection cross-react with avian influenza A (H5N1) in healthy individuals. J Clin Invest.2008;118(10):3478-90. Epub 2008/09/20. doi: 10.1172/JCI32460. PubMed PMID:18802496; PubMed Central PMCID: PMC2542885.

74.Roti M, Yang J, Berger D, Huston L, James EA, Kwok WW. Healthy humansubjects have CD4+ T cells directed against H5N1 influenza virus. J Immunol.2008;180(3):1758-68. Epub 2008/01/23. PubMed PMID: 18209073; PubMed CentralPMCID: PMC3373268.

75.Kreijtz JH, Bodewes R, van Amerongen G, Kuiken T, Fouchier RA,Osterhaus AD, et al. Primary influenza A virus infection induces cross-protective immunity against a lethal infection with a heterosubtypic virusstrain in mice. Vaccine. 2007;25(4):612-20. PubMed PMID: 17005299.

76.Boesteanu AC, Babu NS, Wheatley M, Papazoglou ES, Katsikis PD.Biopolymer encapsulated live influenza virus as a universal CD8+ T cellvaccine against influenza virus. Vaccine. 2010;29(2):314-22. Epub 2010/11/03.doi: 10.1016/j.vaccine.2010.10.036. PubMed PMID: 21034826; PubMed CentralPMCID: PMC3004745.

77.Manicassamy B, Manicassamy S, Belicha-Villanueva A, Pisanelli G,Pulendran B, Garcia-Sastre A. Analysis of in vivo dynamics of influenza virusinfection in mice using a GFP reporter virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010;107(25):11531-6. Epub 2010/06/11. doi: 10.1073/pnas.0914994107. PubMed PMID:20534532; PubMed Central PMCID: PMC2895123.

78. Fukushi M, Ito T, Oka T, Kitazawa T, Miyoshi-Akiyama T, Kirikae T, etal. Serial histopathological examination of the lungs of mice infected withinfluenza A virus PR8 strain. PLoS One. 2011;6(6):e21207. Epub 2011/06/28.doi: 10.1371/journal.pone.0021207. PubMed PMID: 21701593; PubMed CentralPMCID: PMC3118813.

79. Shirey KA, Lai W, Scott AJ, Lipsky M, Mistry P, Pletneva LM, et al.The TLR4 antagonist Eritoran protects mice from lethal influenza infection.Nature. 2013;497(7450):498-502. Epub 2013/05/03. doi: 10.1038/nature12118.PubMed PMID: 23636320.

80. Kawaoka Y. Equine H7N7 influenza A viruses are highly pathogenic inmice without adaptation: potential use as an animal model. J Virol. 1991;65(7):3891-4. PubMed PMID: 2041098.

81.Christensen JP, Doherty PC, Branum KC, Riberdy JM. Profound protectionagainst respiratory challenge with a lethal H7N7 influenza A virus byincreasing the magnitude of CD8(+) T-cell memory. J Virol. 2000;74(24):11690-6. PubMed PMID: 11090168.

82. Brandenberger C, Rothen-Rutishauser B, Muhlfeld C, Schmid O, FerronGA, Maier KL, et al. Effects and uptake of gold nanoparticles deposited atthe air-liquid interface of a human epithelial airway model. Toxicol ApplPharmacol.242(1):56-65. PubMed PMID: 19796648.

83.Uboldi C, Bonacchi D, Lorenzi G, Hermanns MI, Pohl C, Baldi G, et al.Gold nanoparticles induce cytotoxicity in the alveolar type-II cell linesA549 and NCIH441. Part Fibre Toxicol. 2009;6:18. PubMed PMID: 19545423.。

序列表

<110> 埃默杰克斯疫苗控股有限公司

<120> 用于预防、治疗和诊断流感病毒感染的细胞毒性t淋巴细胞诱导免疫原

<130> N410919WO

<150> US 62/441,659

<151> 2017-01-03

<160> 31

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> 流感病毒

<400> 1

Pro Val Ala Gly Gly Thr Ser Ser Ile Tyr Ile

1 5 10

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 流感病毒

<400> 2

Thr Val Ile Lys Thr Asn Met Ile

1 5

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 流感病毒

<400> 3

Met Thr Ile Ile Phe Leu Ile Leu Met

1 5

<210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213> 流感病毒

<400> 4

Ile Thr Phe His Gly Ala Lys Glu Ile

1 5

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> 流感病毒

<400> 5

Ala Ile Asn Gly Ile Thr Asn Lys Val

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 流感病毒

<400> 6

Glu Glu Met Gly Ile Thr Thr His Phe

1 5

<210> 7

<211> 9

<212> PRT

<213> 流感病毒

<400> 7

Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp

1 5

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 流感病毒

<400> 8

Arg Glu Ile Leu Thr Lys Thr Thr Val

1 5

<210> 9

<211> 15

<212> PRT

<213> 流感病毒

<400> 9

Lys Glu Ser Asp Glu Ala Leu Asn Met Thr Met Ala Ser Thr Pro

1 5 10 15

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> 流感病毒

<400> 10

Leu Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe

1 5

<210> 11

<211> 9

<212> PRT

<213> 流感病毒

<400> 11

Met Glu Ala Val Pro Leu Ile Thr Ile

1 5

<210> 12

<211> 8

<212> PRT

<213> 流感病毒

<400> 12

Val Glu Gln Glu Ile Arg Thr Phe

1 5

<210> 13

<211> 8

<212> PRT

<213> 流感病毒

<400> 13

Val Glu Gln Glu Leu Arg Thr Phe

1 5

<210> 14

<211> 11

<212> PRT

<213> 流感病毒

<400> 14

Ser Pro Asp Asp Phe Ala Leu Ile Val Asn Ala

1 5 10

<210> 15

<211> 8

<212> PRT

<213> 流感病毒

<400> 15

Tyr Pro Asp Thr Gly Lys Val Met

1 5

<210> 16

<211> 8

<212> PRT

<213> 流感病毒

<400> 16

Tyr Pro Asp Ala Ser Lys Val Met

1 5

<210> 17

<211> 10

<212> PRT

<213> 流感病毒

<400> 17

Gln Pro Glu Thr Cys Asn Gln Ser Ile Ile

1 5 10

<210> 18

<211> 9

<212> PRT

<213> 流感病毒

<400> 18

Val Pro Glu Ser Lys Arg Met Ser Leu

1 5

<210> 19

<211> 9

<212> PRT

<213> 流感病毒

<400> 19

Tyr Ile Asn Thr Ala Leu Leu Asn Ala

1 5

<210> 20

<211> 9

<212> PRT

<213> 流感病毒

<400> 20

Ala Ile Met Asp Lys Asn Ile Ile Leu

1 5

<210> 21

<211> 9

<212> PRT

<213> 流感病毒

<400> 21

Leu Pro Phe Asp Arg Thr Thr Ile Met

1 5

<210> 22

<211> 15

<212> PRT

<213> 流感病毒

<400> 22

Lys Gly Val Tyr Ile Asn Thr Ala Leu Leu Asn Ala Ser Cys Ala

1 5 10 15

<210> 23

<211> 17

<212> PRT

<213> 流感病毒

<400> 23

Arg Phe Leu Pro Val Ala Gly Gly Thr Ser Ser Ile Tyr Ile Glu Val

1 5 10 15

Leu

<210> 24

<211> 14

<212> PRT

<213> 流感病毒

<400> 24

Ile Gly Val Thr Val Ile Lys Thr Asn Met Ile Asn Asn Asp

1 5 10

<210> 25

<211> 15

<212> PRT

<213> 流感病毒

<400> 25

Met Asp Gln Ala Ile Met Asp Lys Asn Ile Ile Leu Lys Ala Asn

1 5 10 15

<210> 26

<211> 15

<212> PRT

<213> 流感病毒

<400> 26

Lys Arg Glu Ile Thr Phe His Gly Ala Lys Glu Ile Ser Leu Ser

1 5 10 15

<210> 27

<211> 15

<212> PRT

<213> 流感病毒

<400> 27

Thr Gln Asn Ala Ile Asn Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val

1 5 10 15

<210> 28

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 实施例中使用的OVA肽

<400> 28

Ser Ile Ile Asn

1

<210> 29

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头序列

<400> 29

Phe Leu Ala Ala Tyr

1 5

<210> 30

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 实施例中使用的OVA肽

<400> 30

Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu

1 5

<210> 31

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 实施例中使用的OVA肽

<400> 31

Gln Leu Glu Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Thr Glu Trp

1 5 10

Claims

1.一种疫苗组合物，其包含含有CD8+ T细胞表位的流感病毒肽和含有B细胞表位的流感病毒肽，其中每个肽与纳米颗粒连接。

2.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述纳米颗粒是金纳米颗粒、磷酸钙纳米颗粒、或硅纳米颗粒。

3.根据权利要求1或2所述的疫苗组合物，其中所述含有CD8+ T细胞表位的流感病毒肽和所述含有B细胞表位的流感病毒肽与相同的纳米颗粒连接。

4.根据前述权利要求的任一项所述的疫苗组合物，其中所述含有CD8+ T细胞表位的流感病毒肽通过接头与所述纳米颗粒连接和/或所述含有B细胞表位的流感病毒肽通过接头与所述纳米颗粒连接。

5.根据前述权利要求的任一项所述的疫苗组合物，其中所述含有CD8+ T细胞表位的流感病毒肽包含SEQ ID NO：1至21中列出的肽中的一种或多种。

6.根据前述权利要求的任一项所述的疫苗组合物，其中所述B细胞表位是流感基质2蛋白（M2e）表位。

7.一种疫苗组合物，包含含有SEQ ID NO：1至21中列出的CD8+ T细胞表位中的一种或多种的流感病毒肽，其中所述肽与纳米颗粒连接。

8.根据权利要求7所述的疫苗组合物，其中所述纳米颗粒是金纳米颗粒、磷酸钙纳米颗粒、或硅纳米颗粒。

9.根据权利要求8所述的疫苗组合物，其中所述含有CD8+ T细胞表位的流感病毒肽通过接头与所述纳米颗粒连接。

10.根据前述权利要求的任一项所述的疫苗组合物，其包含两种或更多种流感病毒肽，每种都包含不同的CD8+ T细胞表位。

11.根据权利要求10所述的疫苗组合物，其中所述两种或更多种流感病毒肽是SEQ IDNO：1至21中列出的肽中的两种或更多种。

12.根据前述权利要求的任一项所述的疫苗组合物，进一步包含含有CD4+ T细胞表位的流感病毒肽。

13.根据权利要求12所述的疫苗组合物，其中所述含有CD4+ T细胞表位的流感病毒肽与纳米颗粒连接。

14.根据权利要求13所述的疫苗组合物，其中与所述含有CD4+ T细胞表位的流感病毒肽连接的所述纳米颗粒是金纳米颗粒、磷酸钙纳米颗粒、或硅纳米颗粒。

15.根据权利要求13或14所述的疫苗组合物，其中所述含有CD4+ T细胞表位的流感病毒肽通过接头与所述纳米颗粒连接。

16.根据前述权利要求的任一项所述的疫苗组合物，其中所述含有CD8+ T细胞表位的流感病毒肽进一步包含CD4+ T细胞表位。

17.根据权利要求16所述的疫苗组合物，其中包含CD8+ T细胞表位和CD4+ T细胞表位的所述流感病毒肽包含SEQ ID NO：22至27中列出的肽中的一种或多种。

18.根据前述权利要求的任一项所述的疫苗组合物，其包含至少两种含有CD8+ T细胞表位的流感病毒肽，每种都与不同的HLA超型相互作用。

19.根据前述权利要求的任一项所述的疫苗组合物，其包含至少一种与至少两种不同的HLA超型相互作用的免疫原性肽。

20.根据权利要求18或19所述的疫苗组合物，其中所述至少两种不同的HLA超型选自HLA-A1、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A24、HLA-B7、HLA-B8、HLA-B27、HLA-B44、HLA-B58和HLA-B62。

21.根据权利要求20所述的疫苗组合物，其中所述所述至少两种不同的HLA超型是HLA-A2和HLA-A24。

22.一种预防或治疗流感病毒感染的方法，包含将前述权利要求的任一项所述的疫苗组合物施用于感染流感病毒或有风险感染流感病毒的个体。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述流感病毒是大流行性流感病毒。

24.权利要求1-21的任一项所述的疫苗组合物在预防或治疗个体中的流感病毒感染的方法中的应用。

25.根据权利要求24所述的疫苗组合物的应用，其中所述流感病毒是大流行性流感病毒。