BR112019013724A2

BR112019013724A2 - composições de vacina influenza universal

Info

Publication number: BR112019013724A2
Application number: BR112019013724A
Authority: BR
Inventors: Philip Ramila
Original assignee: Emergex Vaccines Holding Ltd
Priority date: 2017-01-03
Filing date: 2018-01-03
Publication date: 2020-04-14
Also published as: AU2018206291A1; CN110290805A; PH12019501569A1; US20190321460A1; EA201991377A1; EP3565590A1; CA3049190A1; JP2020504179A; US11273216B2; MX2019007973A; ZA201904505B; SG11201906190YA; US20220233679A1; WO2018127689A1

Abstract

a invenção fornece uma composição de vacina compreendendo um peptídeo de vírus influenza que compreende um epítopo de célula t cd8+ e um peptídeo de vírus influenza que compreende um epítopo de célula b, em que cada peptídeo é unido a uma nanopartícula.

Description

“COMPOSIÇÕES DE VACINA INFLUENZA UNIVERSAL”

Campo da invenção [0001] A invenção se refere a composições de vacina compreendendo peptídeos de influenza e ao uso dessas composições para o tratamento e a prevenção de infecção por vírus influenza.

Antecedentes da Invenção [0002] A influenza é um problema de saúde global significativo, infectando até 20 % da população mundial anualmente, causando até 5 milhões de casos de doença grave e >300.000 mortes mundialmente. Apenas nos EUA, uma estimativa de > 30.000 mortes e aproximadamente 300.000 hospitalizações são atribuídas à infecção por influenza a cada ano. Com o aparecimento recente de uma doença sazonal nova, grave e potencialmente recorrente, campanhas de vacinação difundidas que reduzem a incidência de pneumonia induzida por influenza estão sendo incentivadas pela Organização de Saúde Mundial. Reduzir efetivamente a incidência de influenza exigirá vigilância intensa continuada, uso aumentado de vacinas influenza atualmente disponíveis e a disponibilidade de vacinas alternativas e medicações antivirais que podem fornecer uma proteção mais ampla contra cepas de deslocamento e deriva de influenza. As campanhas de vacinação contra influenza bemsucedidas podem ter um impacto social e econômico enorme.

[0003] A resposta imune à influenza é regida tanto por imunidade inata quanto adaptativa. A resposta imune inata à influenza limita a replicação viral inicial, porém, é relativamente não específica. A folga eficaz de vírus influenza exige uma resposta imune adaptativa robusta, ativando tanto a imunidade humoral quanto mediada por célula. A imunidade humoral como mediada por IgA secretora e anticorpos de IgM fornece proteção contra o estabelecimento de infecção inicial, enquanto os anticorpos de IgG neutralizam vírus de replicação recente na infecção estabelecida.

[0004] As vacinas influenza convencionais têm por

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2/77 objetivo induzir a imunidade humoral ao vírus influenza. Entretanto, essas vacinas não são completamente protetoras devido à ocorrência de variações antigênicas. Além disso, acredita-se que as respostas de célula T possam ter uma função-chave na proteção contra influenza. As células T CD4+ desempenham uma função crítica na comutação de isótipo para IgG e na geração de anticorpos de afinidade superior e memória de CTL. Em seres humanos, as células T CD4+ específicas à hemaglutinina (HA) se proliferam após a vacinação contra influenza e auxiliam no desenvolvimento de resposta de anticorpo de influenza heterossubtípica. Os linfócitos T citotóxicos CD8+ (CTLs) mediam a folga viral e mostraram ter respostas de reação cruzada a diferentes subtipos de vírus influenza A. Isso pode explicar a paucidade relativa de doença entre indivíduos que são mais velhos, foram vacinados contra influenza ou foram anteriormente expostos à influenza.

[0005] As vacinas influenza atualmente no mercado são atualizadas anualmente. Seu projeto é baseado em recomendações de cepa tipo WHO anuais e são fabricadas antes do início de uma temporada ou pandemia de influenza. As vacinas atuais para influenza induzem uma resposta imune humoral protetora contra as glicoproteínas de HA e neuraminidase (NA) na superfície de vírion. Entretanto, glicoproteínas de HA e NA virais são altamente suscetíveis a deslocamento antigênico frequente e imprevisível e mutações de deriva menos frequentes, porém, mais graves, que resultam em perda de reconhecimento de anticorpo. Isso necessita do desenvolvimento frequente de novas vacinas para corresponder ao sorotipo (ou sorotipos) viral atual que infecta a população humana. Consequentemente, as vacinas influenza existentes são dispendiosas para produzir e é improvável que sejam protetoras contra as cepas novas que surgem no meio da temporada (por exemplo, gripe suína de H1N1 de 2009, H5N1, H7N9). Ademais, essas vacinas são projetadas para fornecer proteção à base de anticorpo, com pouca consideração dada à indução das respostas de célula T que são importantes para eliminar células infectadas por vírus do corpo.

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3/77 [0006] Várias vacinas quadrivalentes (que protegem contra dois vírus influenza A e dois vírus influenza B) foram aprovadas pelo FDA. Embora essas vacinas forneçam proteção mais ampla do que as vacinas influenza convencionais, ainda é improvável que sejam protetoras contra cepas novas que surgem no meio da temporada e são dispendiosas para produzir. Ademais, como as vacinas influenza convencionais, as vacinas quadrivalentes não são projetadas para surtir respostas de célula T que são importantes para eliminar as células infectadas por vírus do corpo.

[0007] Uma vacina influenza “universal” fornecendo ampla proteção contra todas as cepas de influenza sazonais e cepas pandêmicas por anos, se não uma vida inteira, portanto, é desejável. O desenvolvimento de uma vacina influenza universal eficaz reduziría os medos de pandemias de influenza futuras e seria mais econômico do que desenvolver e fabricar vacinas influenza sazonais anuais como é a prática atual.

[0008] Várias formulações de vacina universal estão em desenvolvimento. Essas vacinas universais podem ser amplamente caracterizadas pelo tipo de resposta imune protetora que os mesmos estimulam: 1) respostas de célula B (anticorpo), 2) respostas de célula T ou 3) respostas tanto de célula B quanto T. Kanekiyo et al. gerou nanopartículas de HA (HA fusionadas à ferritina) que induzem respostas de anticorpo de alta titulação que fornecem cobertura contra múltiplas cepas de influenza. Essa vacina ainda precisa entrar em testes clínicos. Uma vacina à base de célula T que alveja quatro epítopos relativamente conservados no genoma viral também está em desenvolvimento. Uma vacina de célula T com base em epítopos CD4 altamente conservados foi avaliada em um estudo de estímulo de fase II com respostas protetoras positivas contra várias cepas de influenza incluindo cepas pandêmicas. Uma vacina de poliepítopo recombinante, chamada Multimeric-001, que incorpora célula B, célula T CD4- e célula T CD8 conservada epítopos de nove proteínas de influenza diferentes está sendo testado em testes clínicos de estágio precoce. Uma vacina de proteína de fusão consistindo em

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4/77 nucleoproteína (NP) e o epítopo de célula B, M2e, unido a um adjuvante e peptídeo de M2e em nanopartícula de ouro em combinação com CpG também estão em desenvolvimento. A maioria das vacinas supracitadas são formuladas com vários adjuvantes que frequentemente induzem reações adversas quando usadas na clínica.

Sumário da invenção [0009] A presente invenção se refere a uma composição de vacina influenza que estimula uma resposta imune enquanto evita os efeitos clínicos adversos frequentemente associados às vacinas contendo adjuvante. Em um aspecto, a composição de vacina estimula tanto a produção de anticorpos específica para vírus influenza e uma resposta de célula T contra vírus influenza. A estimulação de respostas humoral e celular permite que a vacina simule a resposta imune à infecção viral natural (Figura 1). A composição de vacina pode fornecer a proteção contra cepas de influenza sazonal e pandêmica, por exemplo, a composição de vacina pode ser uma vacina universal.

[0010] Os presentes inventores surpreendentemente identificaram que uma nanopartícula, por exemplo, a nanopartícula de ouro pode ser usada para induzir uma resposta eficaz a uma composição de vacina projetada para estimular tanto a produção de anticorpos específicos para vírus influenza e uma resposta de célula T contra vírus influenza. O uso de uma nanopartícula revoga a necessidade de incluir um adjuvante tradicional na composição de vacina. Portanto, a probabilidade de um indivíduo que experimenta uma reação adversa após a administração da composição de vacina é reduzida.

[0011] Os presentes inventores também identificaram o número de peptídeos conservados que são conservados entre diferentes vírus influenza e são apresentados por moléculas de MHC em células infectadas com tais vírus. A inclusão de tais peptídeos conservados na composição de vacina pode conferir capacidade protetora contra ambas as cepas de influenza sazonal

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5/77 e pandêmica. Incluir na composição de vacina múltiplos peptídeos conservados que se ligam aos diferentes supertipos de HLA resulta em uma vacina que é eficaz em indivíduos que têm diferentes tipos de HLA.

[0012] Consequentemente, a presente invenção fornece uma composição de vacina que compreende um ou mais peptídeos de vírus influenza imunogênicos unidos a uma nanopartícula.

[0013] A presente invenção fornece adicionalmente:

- uma composição de vacina que compreende um peptídeo de vírus influenza que compreende um epítopo de célula T CD8+ e um peptídeo de vírus influenza que compreende um epítopo de célula B, em que cada peptídeo é unido a uma nanopartícula;

Uma composição de vacina que compreende um peptídeo de vírus influenza que compreende um ou mais dos epítopos de célula T CD8+ apresentados em SEQ ID NOs: 1 a 18, em que o peptídeo é unido a uma nanopartícula;

- um método de prevenir ou tratar uma infecção por vírus influenza, que compreende administrar a composição de vacina da invenção a um indivíduo infectado com, ou em risco de ser infectado com um vírus influenza; e

- a composição de vacina da invenção para uso em um método de prevenir ou tratar uma infecção por vírus influenza em um indivíduo.

Breve Descrição das Figuras [0014] Figura 1: A vacina para simular a resposta imune adaptativa gerada por infecção viral. Figura 2: A confirmação de sequências de peptídeos de influenza específicos.

[0015] Figura 3: Os CTLs de epítopos (P1-P5) específicos gerados in vitro com PBMCs humanas reconhecem tanto célulasalvo carregadas com peptídeo (painel A) quanto infectadas com vários vírus influenza (painel B).

[0016] Figura 4: Os CTLs específicos de epítopos (P1

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P5) gerados in vivo em camundongos transgênicos de HLA-A2 reconhecem tanto células-alvo carregadas de peptídeo (painel B) e infectadas com vários vírus influenza (painel C).

[0017] Figura 5: Os epítopos incorporados em NPs (NP 1-5) ativam vários CTLs específicos de vírus influenza em camundongos transgênicos de HLA-A2. Painéis A e B: ELISpot; Painel C: expressão de CD107.

[0018] Figura 6: A imunização de peptídeo de M2e + adjuvante (Pep 6) ou em NP (NP6) induz a resposta de anticorpo específico (painel A). Ausência de resposta de anticorpo com peptídeo livre sem adjuvante (painel B).

[0019] Figura 7: Os antissoros específicos de peptídeo de M2e se ligam ao epítopo de M2e em células infectadas por vírus influenza (PR8, X-31 ou JAP (verde, aqua, vermelho, respectivamente).

[0020] Figura 8: Figura 8: Neutralização de infecção mediada por anti-M2e. O soro usado nos painéis de topo é isolado dos camundongos imunizados com peptídeo, nos painéis de fundo de camundongos imunizados com NP.

[0021] Figura 9: Resposta de anticorpo de M2e de ocorrência natural em indivíduos saudáveis expostos ao vírus influenza.

[0022] Figura 10: A detecção de CTLs específicos de epítopo pré-existentes por meio de análise de dextrâmero de PBMCs de indivíduos soropositivos de dengue.

[0023] Figura 11: Figura 11: CTLs específicos de epítopo em indivíduos soropositivos reconhecem células-alvo carregadas com peptídeo (pep) e infectadas com vírus da dengue (DV2).

[0024] Figura 12: Os epítopos CD8 aninhados dentro de peptídeos mais longos são processados e apresentados em APCs. Painel de topo, complexos de SIIN:Kb detectados por citometria de fluxo. Painel de fundo, ativação de célula T específica de SUN em um ensaio de hibridoma.

Descrição Detalhada da Invenção

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Composições de vacina que estimulam respostas humoral e celular [0025] A presente invenção fornece uma composição de vacina que compreende um ou mais peptídeos de vírus influenza imunogênicos unidos a uma nanopartícula. Em particular, uma composição de vacina que compreende um peptídeo de vírus influenza que compreende um epítopo de célula T CD8+ e um peptídeo de vírus influenza que compreende um epítopo de célula B, em que cada peptídeo é unido a uma nanopartícula.

[0026] Essa composição de vacina tem inúmeras vantagens em relação às vacinas influenza convencionais conhecidas na técnica. As vantagens-chave são resumidas no presente documento. Entretanto, as vantagens adicionais se tornarão evidentes a partir da discussão abaixo.

[0027] Primeiramente, a composição de vacina da invenção compreende vantajosamente um peptídeo de vírus influenza compreendendo um epítopo de célula T CD8+ e um peptídeo de vírus influenza compreendendo um epítopo de célula B. A composição de vacina é, portanto, capaz de estimular respostas imunes tanto celulares quanto humorais contra um vírus influenza. Como descrito acima, as respostas imunes humorais fornecer uma primeira linha de defesa contra a infecção por vírus influenza. Em particular, a IgA secretora e anticorpos de IgM protegem contra o estabelecimento de infecção inicial por vírus influenza, por exemplo, prevenindo que o vírus se una às células epiteliais em superfícies mucosais. Posteriormente, durante a infecção estabelecida, os anticorpos de IgG neutralizam o vírus de replicação recente para ajudar a minimizar a reprodução viral. As respostas humorais, portanto, têm um papel importante na prevenção e o tratamento de infecção por vírus influenza. Entretanto, as respostas celulares, particularmente respostas de célula T, também são importantes. As células T CD4+ controlam a comutação de isótipo à IgG e, portanto, a neutralização de vírus de replicação. As células T CD4+ também contribuem para a geração de anticorpos de afinidade superior e para a memória de linfócito T citotóxico (CTL). Os próprios CTLs CD8+ mediam

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8/77 a folga viral por meio de sua atividade citotóxica contra células infectadas. Estimular tanto a imunidade humoral quanto a celular, portanto, fornece um ataque de duas frentes benéfico contra a infecção por vírus influenza.

[0028] Em segundo lugar, cada peptídeo de vírus influenza na composição de vacina é unido a uma nanopartícula, por exemplo, uma nanopartícula de ouro. Como descrito em mais detalhes abaixo, a união a uma nanopartícula reduz ou elimina a necessidade de incluir um adjuvante na composição de vacina. Assim, a composição de vacina é menos propensa a causar efeitos clínicos adversos mediante a administração a um indivíduo.

Peptídeos de vírus influenza [0029] A composição de vacina da invenção compreende um ou mais peptídeos de vírus influenza imunogênicos. A composição de vacina pode compreender de cerca de um a cerca de 50 peptídeos de vírus influenza, como cerca de 2 a 40, 30 a 30, 4 a 25, 5 a 20, 6 a 15, 7, 8,9 ou 10 peptídeos de vírus influenza. Os peptídeos, cada, compreendem um ou mais epítopos, que podem ser um epítopo de célula T CD8+, um epítopo de célula T CD4+ e/ou um epítopo de célula B.

[0030] Em um aspecto, a composição de vacina compreende um peptídeo de vírus influenza que compreende um epítopo de célula T CD8+ e um peptídeo de vírus influenza que compreende um epítopo de célula B.

[0031] Um peptídeo de vírus influenza é um peptídeo que é expresso por um ou mais vírus influenza. Os vírus influenza são membros bem conhecidos da família ortomixovirdae (Orthomyxovirdae). Há centenas de cepas de vírus influenza, os quais podem ser classificados em três categorias principais, Influenza A, Influenza B ou Influenza C, com base nas proteínas de HA e NA que expressam. A composição de vacina pode compreender peptídeos de vírus influenza de múltiplas cepas de influenza, como 1 a 2000, 100 a 1900, 200 a 1800, 300 a 1700, 400 a 1600, 500 a 1500, 600 a 1400, 700 a 1300, 800 a 1200 ou 900 a 1100 cepas de influenza.

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9/77 [0032] Por exemplo, a composição de vacina pode compreender um peptídeo a mais de vírus influenza de Influenza A, Influenza B e/ou Influenza C. Assim, o peptídeo de vírus influenza compreendendo um epítopo de célula T CD8+ compreendido pode ser um peptídeo que é expresso pelo vírus Influenza A, Influenza B e/ou Influenza C. O peptídeo de vírus influenza compreendendo um epítopo de célula B pode ser um peptídeo que é expresso pelo vírus Influenza A, Influenza B e/ou Influenza C. O peptídeo de vírus influenza compreendendo um epítopo de célula T CD8+ e o peptídeo de vírus influenza compreendendo um epítopo de célula B pode consistir em peptídeos que são expressos pela mesma cepa de influenza, como Influenza A, Influenza B ou Influenza C. Alternativamente, o peptídeo de vírus influenza compreendendo um epítopo de célula T CD8+ e o peptídeo de vírus influenza compreendendo um epítopo de célula B podem ser peptídeos que são expressos por diferentes cepas de influenza.

[0033] Se o peptídeo de vírus influenza for um peptídeo que é expresso por vírus Influenza A, o vírus Influenza A pode ser, por exemplo, H1N1, H5N1, H7H9 ou H3N2. Preferencialmente, o peptídeo de vírus influenza é expresso por dois ou mais dentre vírus Influenza A H1N1, H5N1, H7H9 e H3N2, como, por exemplo, H1N1 e H3N2. O peptídeo de vírus influenza pode ser um peptídeo que é expresso por um vírus influenza humano, um vírus influenza suíno e/ou um vírus influenza aviário. O vírus influenza pode ser um vírus influenza pandêmico ou um vírus influenza potencialmente pandêmico. O vírus influenza pode ser um vírus influenza zoonótico.

[0034] O peptídeo de vírus influenza pode ser um peptídeo que é expresso na superfície de um ou mais vírus influenza, ou intracelularmente dentro de um ou mais vírus influenza. O peptídeo pode ser um peptídeo estrutural ou um peptídeo funcional, como um peptídeo envolvido no metabolismo ou replicação do vírus influenza. Preferencialmente, o peptídeo é um peptídeo interno. Preferencialmente, o peptídeo é conservado entre dois ou mais cepas de influenza diferentes.

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10/77 [0035] O peptideo de virus influenza pode conter qualquer número de aminoácidos, isto é, de qualquer comprimento. Tipicamente, o peptídeo de vírus influenza tem cerca de 8 a cerca de 30,35 ou 40 aminoácidos de comprimento, como cerca de 9 a cerca de 29, cerca de 10 a cerca de 28, cerca de 11 a cerca de 27, cerca de 12 a cerca de 26, cerca de 13 a cerca de 25, cerca de 13 a cerca de 24, cerca de 14 a cerca de 23, cerca de 15 a cerca de 22, cerca de 16 a cerca de 21, cerca de 17 a cerca de 20 ou cerca de 18 a cerca de 29 aminoácidos de comprimento.

[0036] O peptídeo de vírus influenza pode ser quimicamente derivado de um antígeno de vírus influenza de polipeptídeo, por exemplo, por divagem proteolítica. Mais tipicamente, o peptídeo de vírus influenza pode ser sintetizado usando métodos bem conhecidos na técnica.

[0037] O termo peptídeo inclui, não apenas moléculas em que os resíduos de aminoácido são unidos por ligações de peptídeo (-CO-NH-), mas também, moléculas em que a ligação de peptídeo é invertida. Tal peptidomimética retroinversa pode ser realizada com o uso de métodos conhecidos na técnica, por exemplo, como aqueles descritos no documento Meziere et al (1997) J. Immunol.159, 3230-3237. Essa abordagem envolve realizar pseudopeptídeos contendo alterações envolvendo a estrutura principal, e não a orientação de cadeias laterais. Meziere et al (1997) mostra que, pelo menos, para respostas de célula auxiliar de T e de classe de MFC II, esses pseudopeptídeos são úteis. Os peptídeos retroinversos, que contêm ligações de NH-CO em vez de ligações de peptídeo de CO-NH, são muito mais resistentes à proteólise.

[0038] De modo similar, a ligação de peptídeo pode ser totalmente dispensada, desde que uma fração de ligante adequada que retém o espaçamento entre os átomos de carbono dos resíduos de aminoácido seja usada; é particularmente preferencial se a fração de ligante tiver substancialmente a mesma distribuição de carga e substancialmente a mesma planura que uma ligação de peptídeo. Também será observado que o peptídeo

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11/77 pode ser convenientemente bloqueado em sua terminação N ou C de modo que ajude a reduzir a suscetibilidade à digestão exoproteolítica. Por exemplo, o grupo amino N terminal dos peptídeos pode ser protegido através da reação com um ácido carboxílico e o grupo carboxila C terminal do peptídeo pode ser protegido através da reação com uma amina. Outros exemplos de modificações incluem glicosilação e fosforilação. Outra modificação potencial é que hidrogênios nas aminas de cadeia lateral de R ou K podem ser substituídos por grupos metileno (-NH2 pode ser modificado por -NH(Me) ou -N(Me)2).

[0039] O termo “peptídeo” também inclui variantes de peptídeo que aumentam ou diminuem a meia vida do peptídeo in vivo. Os exemplos de análogos capazes de aumentar a meia vida de peptídeos usados de acordo com a invenção incluem análogos peptoides dos peptídeos, derivados de D-aminoácido dos peptídeos e híbridos de peptídeo-peptoide. Uma modalidade adicional dos polipeptídeos variantes usados de acordo com a invenção compreende formas de D-aminoácido do polipeptídeo. A preparação de polipeptídeos com o uso de D-aminoácidos em vez de L-aminoácidos diminui amplamente qualquer decomposição indesejada de tal agente por processos metabólicos normais, diminuindo as quantidades de agente que precisam ser administradas, junto com a frequência de sua administração.

Epítopos de célula T CD8+ [0040] A composição de vacina da invenção compreende preferencialmente um peptídeo de vírus influenza compreendendo um epítopo de célula T CD8+. Um epítopo de célula T CD8+ é um peptídeo que é capaz de (i) apresentação por uma molécula de classe de IMHC e (ii) reconhecimento por um receptor de célula T (TCR) presente em uma célula T CD8+. Preferencialmente, reconhecimento por um TCR resulta na ativação da célula T CD8+. A ativação célula T CD8+ por levar à proliferação aumentada, produção de citocina e/ou efeitos citotóxicos.

[0041] Tipicamente, o epítopo de célula T CD8+ tem cerca de 9 aminoácidos de comprimento. O epítopo de célula T CD8+, no

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12/77 entanto, pode ser mais curto ou mais longo. Por exemplo, o epítopo de célula T CD8+ pode ter cerca de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 aminoácidos de comprimento. O epítopo de célula T CD8+ pode ter cerca de 8 a 15, 9 a 14 ou 10 a 12 aminoácidos de comprimento.

[0042] Os peptídeos de vírus influenza compreendendo um epítopo de célula T CD8+ são conhecidos na técnica. Os métodos para identificar os epítopos de célula T CD8+ são conhecidos na técnica. Os métodos de mapeamento de epítopo incluem cocristalografia de raios X, varredura de oligopeptídeo com base em arranjo (por vezes chamada de varredura de peptídeo de sobreposição ou análise de pepvarredura (pepscan)), mutagênese direcionada ao sítio, mapeamento de mutagênese de alta produtividade, troca de hidrogênio-deutério, espectrometria de massa acoplada por reticulação, exibição de fago e proteólise limitada. As metodologias de previsão de motivo de MHC também podem ser usadas.

[0043] Preferencialmente, os epítopos de célula T CD8+ apresentados por células infectadas com vírus influenza podem ser identificados para identificar diretamente epítopos de célula T CD8+ para inclusão na composição de vacina. Esse é um método eficaz e lógico que pode ser usado em separado ou para confirmar a utilidade de epítopos de célula T CD8+ potenciais identificados por metodologias de previsão de motivo de MHC. Para realizar o método, as células são infectadas com vírus influenza e mantidas em cultura por um período de cerca de 24 horas. As células são, então, colhidas e lavadas. Em seguida, as células são lisadas e complexos de peptídeo/MHC isolados por cromatografia de imunoafinidade com o uso de anticorpos específicos de molécula de MHC. Os peptídeos purificados das moléculas de MHC são fracionados, por exemplo, com o uso de uma coluna de fase invertida (RP) de C-18 com o uso de uma HPLC offline. As frações contendo peptídeo são coletadas, secas a vácuo e analisadas por espectrometria de massa para identificar as sequências das frações. Os dados espectrais adquiridos, então, são buscados em todas as proteínas de influenza em banco de dados para

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13/77 identificar as sequências de peptídeo associadas ao vírus influenza. Os peptídeos sintéticos, então, podem ser feitos de acordo com as sequências identificadas e submetidos à espectrometria de massa para confirmar sua identidade para os peptídeos nas frações contendo peptídeo.

[0044] Nesse método, qualquer tipo de células pode ser infectado com o vírus influenza. As células podem ser células apresentando antígeno. As células podem ser células de hepatoma como células de HepG2, células B linfoblastoides transformadas por EBV como células JY ou linfoblastos como células T2.

[0045] De modo similar, qualquer vírus influenza de interesse pode ser usado para infectar as células. Por exemplo, o vírus influenza pode ser um vírus Influenza A, Influenza B ou Influenza C. O vírus Influenza A, por exemplo, pode ser H1N1, H5N1, H7H9 ou H3N2.

[0046] A identificação direta de epítopos de célula T CD8+ apresentada pelas células infectadas com vírus influenza é vantajosa em comparação com as metodologias de previsão de motivo de MHC. O banco de dados de epítopo imune (IEDB; http://www.iedb.org) é gerado pelos métodos de previsão de motivo, e mão métodos funcionais, e contém várias centenas de epítopos de célula T de influenza específica de HLA previstos, incluindo inúmeros epítopos compartilhados com pontuações de ligação de alto MHC e caracterização de CTL limitada. Como tanto os epítopos dominantes quanto os subdominantes são apresentados por células infectadas com vírus influenza, é difícil classificar as hierarquias de dominância de epítopos apresentados naturalmente com o uso do banco de dados. Assim, não é claro a partir do banco de dados de epítopo imune em separado qual dos epítopos listados podem ser esperados para induzir de modo eficaz uma resposta de célula T CD8+ quando incluído em uma composição de vacina. O método de identificação direta definido acima fornece um mecanismo para confirmar a utilidade dos epítopos.

[0047] Ademais, o método de identificação direta pode ser usado para identificar epítopos de célula T CD8+ conservados

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14/77 apresentados por células infectadas por vírus influenza diferentes. Dessa forma, epítopos de célula T CD8+ adequados para a inclusão em uma vacina universal podem ser identificados. Como definido nos exemplos, os presentes inventores usaram o método de identificação direta para identificar epítopos de célula T CD8+ conservados entre cepas Influenza A (H1N1 e H3N2) e Influenza B. As sequências identificadas são definidas na Tabela 1.

Tabela 1

SEQ ID NO:	Peptídeo	Proteína	Motivo de HLA
1	PVAGGTSSIYI (P2)	polimerase PB2	A2
2	TVIKTNMI (P3)	polimerase PB1	A2/A24
3	MTIIFLILM (P4)	hemaglutinina	A2/A24
4	ITFHGAKEI	Proteína de matriz 1	A2/A24
5	AINGITNKV	Hemaglutinina	A2/A24
6	EEMGITTHF	Subunidade catalítica de RNA polimerase direcionada ao RNA	B44
7	VETPIRNEW	Proteína de matriz 2	B44
8	REILTKTTV	Proteína básica de polimerase 2	B44
9	KESDEALNMTMASTP	Proteína não estrutural NS1	B44
10	LENERTLDF	Proteína ácida da polimerase	B44
11	MEAVPLITI	Hemaglutinina	B44
12	VEQEIRTF	Proteína de exportação nuclear	B44
13	VEQELRTF	Proteína não estrutural 2	B44
14	SPDDFALIVNA	polimerase PB1	B7
15	YPDTGKVM	Neuraminidase	B7
16	YPDASKVM	Neuraminidase	B7
17	QPETCNQSII	Neuraminidase	B7
18	VPESKRMSL	Proteína não estrutural (NS1)	B7

[0048] Os inventores também confirmaram que os

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15/77 peptídeos conhecidos YINTALLNA (PI; SEQ ID NO: 19), AIMDKNIIL (P5; SEQ ID NO: 20) e LPFDRTTIM (SEQ ID NO: 21) são epítopos de célula T CD8+ conservados entre cepas Influenza A (H1N1 e H3N2) e Influenza B.

[0049] O peptídeo de vírus influenza compreendendo um epítopo de célula T CD8+, portanto, pode compreender um ou mais dentre SEQ ID NOs: 1 a 21. Por exemplo, o peptídeo de vírus influenza compreendendo um epítopo de célula T CD8+ pode compreender dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, dez ou mais, quinze ou mais ou vinte ou mais de SEQ ID NOs: 1 a 21 em qualquer combinação. O peptídeo de vírus influenza compreendendo um epítopo de célula T CD8+ pode compreender todos dentre SEQ ID NOs: 1 a 21.

[0050] De modo similar, a composição de vacina pode compreender um ou mais peptídeos de vírus influenza, cada um compreendendo um epítopo de célula T CD8+ compreendendo uma sequência diferente selecionada a partir de SEQ ID NOs: 1 a 21. Por exemplo, a composição de vacina pode compreender dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, dez ou mais, quinze ou mais, ou vinte ou mais peptídeos de vírus influenza, cada um compreendendo um epítopo de célula T CD8+ compreendendo uma sequência diferente selecionada a partir de SEQ ID NOs: 1 a 21, em qualquer combinação. A composição de vacina, por exemplo, pode compreender 21 peptídeos de vírus influenza, cada um compreendendo um epítopo de célula T CD8+ compreendendo uma sequência diferente selecionada a partir de SEQ ID NOs: 1 a 21.

Epítopos de célula B [0051] A composição de vacina da invenção pode compreender um peptídeo de vírus influenza compreendendo um epítopo de célula B. Um epítopo de célula B é um peptídeo que é capaz de reconhecimento por um receptor de célula B (BCR) presente em uma célula B. Preferencialmente, o reconhecimento pelos resultados de BCR em ativação e/ou maturação da célula B. A ativação de célula B pode levar à proliferação aumentada, e/ou

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16/77 produção de anticorpo.

[0052] Os peptídeos de vírus influenza compreendendo um epítopo de célula B são conhecidos na técnica. O epítopo de célula B pode ser um epítopo linear, isto é, um epítopo que é definido pela sequência de aminoácidos primário de uma região particular de um proteína de vírus influenza. Alternativamente, o epítopo pode ser um epítopo conformacional, isto é, um epítopo que é definido pela estrutura conformacional de uma proteína de influenza nativa. Nesse caso, o epítopo pode ser contínuo (isto é, os componentes que interagem com o anticorpo são situados próximos um ao outro sequencialmente na proteína) ou descontínuo (isto é, os componentes que interagem com anticorpo são situados em partes díspares da proteína, que são aproximadas uma da outra na estrutura de proteína nativa dobrada).

[0053] Tipicamente, o epítopo de célula B tem cerca de 5 a 20 aminoácidos de comprimento, como 6 a 19, 7 a 18, 8 a 17, 9 a 16, 10 a 15, 11 a 14 ou 12 a 13 aminoácidos de comprimento.

[0054] Métodos para identificar epítopos de célula B também são conhecidos na técnica. Por exemplo, os métodos de mapeamento de epítopo podem ser usados para identificar epítopos de célula B. Esses métodos incluem abordagens estruturais, em que a estrutura conhecida ou modelada de uma proteína deve ser usada em uma abordagem baseada em algoritmo para prever epítopos de superfície, e abordagens funcionais, em que a ligação de proteínas integrais, fragmentos de proteína ou peptídeos a um anticorpo pode ser quantizada, por exemplo, com o uso de um Ensaio Imunossorvente Ligado à Enzima (ELISA). Os métodos de mapeamento de competição, modificação de antígeno ou fragmentação de proteína também podem ser usados.

[0055] O epítopo de célula B, por exemplo, pode ser um epítopo de 2 proteínas de matriz de influenza (M2e). O domínio extracelular de proteína M2e é uma região conservada de modo evolutivo em vírus influenza A. Assim, a inclusão de um peptídeo de influenza compreendendo um epítopo

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17/77 de M2e de célula B na composição de vacina pode ajudar a conferir utilidade universal.

Composições de vacina universais [0056] A presente invenção também fornece uma composição de vacina que compreende um peptídeo de vírus influenza que compreende um ou mais dos epítopos de célula T CD8+ apresentados em SEQ ID NOs: 1 a 21, em que o peptídeo é unido a uma nanopartícula.

[0057] A inclusão de um peptídeo de vírus influenza que compreende um ou mais dos epítopos de célula T CD8+ apresentados em SEQ ID NOs: 1 a 21 na composição de vacina é vantajosa. Como apresentado acima, os epítopos de célula T CD8+ apresentados em SEQ ID NOs: 1 a 21 são epítopos de célula T CD8+ conservados que são apresentados por moléculas de MHC em células infectadas por vírus influenza diferentes. Consequentemente, uma resposta imune gerada por vacinação com uma composição que compreende qualquer um desses epítopos deve proteger contra infecção subsequente com qualquer vírus influenza que compartilha tal epítopo. Em outras palavras, a composição de vacina tem eficácia de subtipo cruzado embutido, isto é, a mesma é uma composição de vacina influenza universal. Tal composição podería prevenir a difusão significativa de uma cepa emergente ou re-emergente de infecção por influenza.

[0058] Ademais, as composições de vacina baseadas em epítopos apresentados por células infectadas com vírus influenza, como a presente composição de vacina, são superiores às vacinas com base em uma subunidade de proteína viral ou um epítopo previsto de motivo. O processamento de proteína pelo sistema imunológico é propenso a alterar os epítopos virais nativos. Basear uma composição de vacina em peptídeos demonstrou ser apresentado por célula infectada remove essa fonte de incerteza, visto que os peptídeos já foram submetidos ao processamento de proteína.

[0059] Unir o peptídeo de vírus influenza a uma nanopartícula, por exemplo, uma nanopartícula de ouro, também é benéfico.

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Como descrito em mais detalhes abaixo, a união a uma nanopartícula reduz ou elimina a necessidade de incluir um adjuvante na composição de vacina. Assim, a composição de vacina é menos propensa a causar efeitos clínicos adversos mediante a administração a um indivíduo.

[0060] Peptídeos de influenza compreendendo SEQ ID NOs: 1 a 21 [0061] A composição de vacina compreende um peptídeo de vírus influenza que compreende um ou mais dos epítopos de célula T CD8+ apresentados em SEQ ID NOs: 1 a 21. Os peptídeos de vírus influenza compreendendo SEQ ID NOs: 1 a 21 são descritos em detalhes acima em relação a composições de vacina estimulando respostas humoral e celular. O peptídeo de vírus influenza pode compreender dois ou mais, como três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, dez ou mais, quinze ou mais ou 20 ou mais dos epítopos de célula T CD8+ apresentados em SEQ ID NOs: 1 a 21.

[0062] Nesse caso, o peptídeo de vírus influenza pode compreender qualquer combinação dos epítopos de célula T CD8+ apresentados em SEQ ID NOs: 1 a 21. O peptídeo de vírus influenza pode compreender todos os epítopos de célula T CD8+ apresentados em SEQ ID NOs: 1 a 21.

[0063] A composição de vacina pode compreender dois ou mais peptídeos de vírus influenza, cada um compreendendo um epítopo de célula T CD8+ diferente. Cada um dos dois ou mais peptídeos pode compreender um epítopo de célula T CD8+ diferente apresentado em SEQ ID NOs: 1 a 21. Alternativamente, um ou mais dos dois ou mais peptídeos pode compreender um epítopo de célula T CD8+ que não é apresentado em SEQ ID NOs: 1 a 21. Os epítopos de célula T CD8+ são conhecidos na técnica.

Nanooartículas [0064] Tanto na composição de vacina compreendendo um peptídeo de vírus influenza compreendendo um epítopo de célula T CD8+ e um peptídeo de vírus influenza compreendendo um epítopo de

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19/77 célula B quanto na composição de vacina compreendendo um peptídeo de vírus influenza compreendendo um ou mais dos epítopos de célula T CD8+ apresentados em SEQ ID NOs: 1 a 21, cada um dos peptídeos de vírus influenza é unido a uma nanopartícula.

[0065] Como apresentado acima e demonstrado nos exemplos abaixo, a união dos peptídeos de vírus influenza a uma nanopartícula (como uma nanopartícula de ouro) reduz ou elimina a necessidade de incluir um adjuvante na composição de vacina. As nanopartículas podem conter “sinais de perigo” imune que ajudam a induzir de modo eficaz uma resposta imune aos peptídeos de vírus influenza. As nanopartículas podem induzir ativação e maturação de célula dendrítica (DC), necessárias para uma resposta imune robusta. As nanopartículas podem conter componentes não próprios que aprimoram a absorção das nanopartículas e, assim, os peptídeos de vírus influenza por células como células apresentando antígeno. A união de um peptídeo de vírus influenza a uma nanopartícula, portanto, pode aprimorar a capacidade de células apresentando antígeno de estimular células T e/ou B específicas de vírus. A união a uma nanopartícula também facilita a entrega das composições de vacina por meio das vias subcutânea, intradérmica, transdérmica e oral/bucal, fornecendo uma flexibilidade maior em administração do que as vacinas influenza convencionais.

[0066] As nanopartículas são partículas entre 1 e 100 nanômetros (nm) de tamanho que podem ser usadas como um substrato para imobilizar os aglutinantes. Nas composições de vacina da invenção, a nanopartícula pode ter um diâmetro médio de 1 a 100, 20 a 90, 30 a 80, 40 a 70 ou 50 a 60 nm. Preferencialmente, a nanopartícula tem um diâmetro médio de 20 a 40 nm. Um diâmetro médio de 20 a 40 nm facilita a absorção da nanopartícula ao citosol. O diâmetro médio pode ser medido com o uso de técnicas bem conhecidas na técnica como microscopia de elétron de transmissão.

[0067] As nanopartículas adequadas para a entrega

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20/77 de antígeno, como um peptídeo de vírus influenza, são conhecidas na técnica. Os métodos para a produção de tais nanopartículas também são conhecidos.

[0068] A nanopartícula, por exemplo, pode ser uma nanopartícula polimérica, uma nanopartícula inorgânica, um lipossomo, um complexo de estimulação imune (ISCOM), uma partícula tipo vírus (VLP) ou uma proteína de automontagem. A nanopartícula é preferencialmente uma nanopartícula de fosfato de cálcio, uma nanopartícula de silício ou uma nanopartícula de ouro.

[0069] A nanopartícula pode ser uma nanopartícula polimérica. A nanopartícula polimérica pode compreender um ou mais polímeros sintéticos, como poli(d,1-lactida-co-glicolida) (PLG), ácido poli(d,l-lactídeocoglicólico) (PLGA), ácido poli(g-glutâmico) (g-PGA)m poli(etilenoglicol) (PEG) ou poliestireno. A nanopartícula polimérica pode compreender um ou mais natural polímeros como um polissacarídeo, por exemplo, pululano, alginato, inulina e quitosano. O uso de uma nanopartícula polimérica pode ser vantajoso devido às propriedades dos polímeros que podem ser incluídos na nanopartícula. Por exemplo, os polímeros naturais e sintéticos mencionados acima podem ter boa biocompatibilidade e biodegradabilidade uma natureza não tóxica e/ou a capacidade de ser manipulada em formatos e tamanhos desejados. A nanopartícula polimérica pode formar uma nanopartícula de hidrogel.

[0070] As nanopartículas de hidrogel são um tipo de rede de polímero tridimensional hidrofílica nanodimensionada. As nanopartículas de hidrogel têm propriedades favoráveis incluindo tamanho de mescla flexível, área de superfície grande para conjugação multivalente, alto teor de água e alta capacidade de carregamento para antígenos. Os polímeros como ácido poli(Llático) (PLA), PLGA, PEG e polissacarídeos são particularmente adequados para formar nanopartículas de hidrogel.

[0071] A nanopartícula pode ser uma nanopartícula inorgânica. Tipicamente, as nanopartículas inorgânicas têm uma estrutura rígida e são não biodegradáveis. Entretanto, a nanopartícula inorgânica pode ser

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21/77 biodegradável. A nanopartícula inorgânica pode compreender um invólucro em que um antígeno pode ser encapsulado. A nanopartícula inorgânica pode compreender um núcleo ao qual um antígeno pode ser covalentemente unido. O núcleo pode compreender um metal. Por exemplo, o núcleo pode compreender átomos de ouro (Au), prata (Ag) ou cobre (Cu). O núcleo pode ser formado por mais de um tipo de átomo. Por exemplo, o núcleo pode compreender uma liga, como uma liga de Au/Ag, Au/Cu, Au/Ag/Cu, Au/Pt, Au/Pd ou Au/Ag/Cu/Pd. O núcleo pode compreender fosfato de cálcio (CaP). O núcleo pode compreender um material semicondutor, por exemplo, seleneto de cádmio.

[0072] Outras nanopartículas inorgânicas exemplificativas incluem nanopartículas de carbono e nanopartículas à base de silica. As nanopartículas de carbono têm boa biocompatibilidade e podem ser sintetizadas em nanotubos e esferas mesoporosas. As nanopartículas à base de silica (SiNPs) são biocompatíveis e podem ser preparadas com parâmetros estruturais ajustáveis para se adequar à sua aplicação terapêutica.

[0073] A nanopartícula pode ser uma nanopartícula de silício, como uma nanopartícula de silício elementar. A nanopartícula pode ser mesoporosa ou ter uma estrutura de poro de colmeia. Preferencialmente, a nanopartícula é uma partícula de silício elementar que tem uma estrutura de poro de colmeia. Tais nanopartículas são conhecidas na técnica e oferecem carregamento de fármaco ajustável e controlado, alvejamento e liberação que podem ser adaptados a quase qualquer carga, via de administração, perfil de liberação ou alvo. Por exemplo, tais nanopartículas podem aumentar a biodisponibilidade de sua carga e/ou aprimorar a permeabilidade intestinal e a absorção de ativos administrados oralmente. As nanopartículas podem ter uma capacidade de carregamento excepcionalmente alta devido à sua estrutura porosa e área de superfície grande. As nanopartículas podem liberar sua carga ao longo de dias, semanas ou meses, dependendo de suas propriedades físicas. Visto que o silício é um elemento de ocorrência natural do corpo humano, as nanopartículas podem não surtir resposta do sistema imunológico. Isso é

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22/77 vantajoso para a segurança in vivo das nanopartículas.

[0074] Qualquer uma das SiNPs descritas acima podem ser biodegradáveis ou não biodegradáveis. Uma SiNP biodegradável pode dissolver ao ácido ortossílico, a forma biodisponível de silício. O ácido ortossílico mostrou ser benéfico para a saúde dos ossos, tecido conectivo, cabelo e pele.

[0075] A nanopartícula pode ser um lipossomo. Os lipossomos são tipicamente formados a partir de fosfolipídeos não tóxicos biodegradáveis e compreendem um invólucro de bicamada de fosfolipídeo de automontagem com núcleo aquoso. Um lipossomo pode ser uma vesícula unilamelar compreendendo uma bicamada única de fosfolipídeo ou uma vesícula multilamelar que compreende vários invólucros de fosfolipídeos concêntricos separados por camadas de água. Como uma consequência, os lipossomos podem ser adaptados para incorporar moléculas hidrofílicas no núcleo aquoso ou moléculas hidrofóbicas dentro das bicamadas de fosfolipídeo. Os lipossomos podem encapsular o antígeno dentro do núcleo para a entrega. Os lipossomos podem incorporar glicoproteínas de envelope viral ao invólucro para formar virossomos. Inúmeros produtos à base de lipossomo são estabelecidos na técnica e são aprovados para uso humano.

[0076] A nanopartícula pode ser um complexo imunoestimulante (ISCOM). Os ISCOMs são partículas tipo gaiola que são tipicamente formadas a partir de micelas contendo saponina coloidal. Os ISCOMs podem compreender colesterol, fosfolipídeo (como fosfatidiletanolamina ou fosfatidilcolina) e saponina (como Quil A da árvore Quillaia saponaria). Os ISCOMs foram tradicionalmente usados para capturar proteínas de envelope viral, como proteínas de envelope do vírus de herpes simplex tipo 1, hepatite B ou vírus influenza.

[0077] A nanopartícula pode ser uma partícula tipo vírus (VLP). As VLPs são nanopartículas de automontagem que são desprovidas de ácido nucleico infeccioso, que são formadas por automontagem de proteína

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23/77 de capsídeo biocompatível. As VLPs têm tipicamente cerca de 20 a cerca de 150 nm, como cerca de 20 a cerca de 40 nm, cerca de 30 a cerca de 140 nm, cerca de 40 a cerca de 130 nm, cerca de 50 a cerca de 120 nm, cerca de 60 a cerca de 110 nm, cerca de 70 a cerca de 100 nm ou cerca de 80 a cerca de 90 nm de diâmetro. As VLPs vantajosamente exploram a potência de estrutura viral evoluída, que é naturalmente otimizada para a interação com o sistema imunológico. O tamanho de nanopartícula naturalmente otimizada e a ordem estrutural repetitiva significam que as VLPs induzem respostas imunes potentes, mesmo na ausência de adjuvante.

[0078] A nanopartícula pode ser uma proteína de automontagem. Por exemplo, a nanopartícula pode compreender ferritina. A ferritina é uma proteína que pode realizar a automontagem em estruturas de 10 nm quase esféricas. A nanopartícula pode compreender proteína de vault principal (MVP). Noventa e seis unidades de MVP podem realizar a automontagem em uma nanopartícula de vault em formato de tambor, com um tamanho de aproximadamente 40 nm de largura e 70 nm de comprimento.

[0079] A nanopartícula pode ser uma nanopartícula de fosfato de cálcio (CaP). As nanopartículas de CaP podem compreender um núcleo compreendendo uma ou mais (como duas ou mais, 10 ou mais, 20 ou mais, 50 ou mais, 100 ou mais, 200 ou mais ou 500 ou mais) moléculas de CaP. As nanopartículas de CaP e os métodos para sua produção são conhecidos na técnica. Por exemplo, uma nanossuspensão estável de nanopartículas de CAP pode ser gerada através da mistura de soluções de sal inorgânico de cálcio e fosfatos em razões predeterminadas sob mistura constante.

[0080] A nanopartícula de CaP pode ter um tamanho médio de partícula de cerca de 80 a cerca de 100 nm, como cerca de 82 a cerca de 98 nm, cerca de 84 a cerca de 96 nm, cerca de 86 a cerca de 94 nm ou cerca de 88 a cerca de 92 nm. Esse tamanho de partícula pode produzir um melhor desempenho em termos de absorção de célula imune e resposta imune do que outros tamanhos de partícula maiores. O tamanho de partícula pode ser estável

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24/77 (isto é, não mostrar alteração significativa), por exemplo, quando medido ao Longo de um período de 1 mês, 2 meses, 3 meses, 6 meses, 12 meses, 18 meses, 24 meses, 36 meses ou 48 meses.

[0081] As nanopartículas de CaP podem ser coformuladas com um ou múltiplos antígenos adsorvidos na superfície da nanopartícula ou coprecipitadas com CaP durante a síntese de partícula. Por exemplo, um peptídeo, como um peptídeo de vírus influenza, pode ser unido à nanopartícula de CaP através da dissolução do peptídeo em DMSO (por exemplo, a uma concentração de cerca de 10 mg/ml), adição a uma suspensão de nanopartículas de CaP, junto com N-acetilglucosamina (GlcNAc) (por exemplo, a 0,093 mol/l e água ultrapura e mistura à temperatura ambiente por um período de cerca de 4 horas (por exemplo, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas ou 10 horas).

[0082] A composição de vacina pode compreender cerca de 0,15 a cerca de 0,8 %, como 0,2 a cerca de 0,75 %, 0,25 a cerca de 0,7 %, 0,3 a cerca de 0,6 %, 0,35 a cerca de 0,65 %, 0,4 a cerca de 0,6 %, ou 0,45 a cerca de 0,55 % de nanopartículas de CaP. Preferencialmente, a composição de vacina compreende cerca de 0,3 % de nanopartículas de CaP.

[0083] As nanopartículas de CaP têm um alto grau de biocompatibilidade devido à sua similaridade química aos tecidos rígidos humanos como o osso e dentes. Vantajosamente, portanto, as nanopartículas de CaP são não tóxicas quando usadas para aplicações terapêuticas. As nanopartículas de CaP são seguras para administração por meio de vias intramuscular, subcutânea, oral ou de inalação. As nanopartículas de CaP também são simples para sintetizar comercialmente. Ademais, as nanopartículas de CaP podem ser associadas à liberação lenta de antígeno, que pode aprimorar a indução de uma resposta imune a um peptídeo de vírus influenza unido à nanopartícula. As nanopartículas de CaP podem ser usadas tanto como um adjuvante quando como um veículo de entrega de fármaco.

[0084] A nanopartícula pode ser uma nanopartícula

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25/77 de ouro. As nanopartículas de ouro são conhecidas na técnica e são descritas, em particular, nos documentos WO 2002/32404, WO 2006/037979, WO 2007/122388, WO 2007/015105 e WO 2013/034726. A nanopartícula de ouro unida a cada peptídeo de vírus influenza pode ser uma nanopartícula de ouro descrita em qualquer um dentre os documentos WO 2002/32404, WO 2006/037979, WO 2007/122388, WO 2007/015105 e WO 2013/034726.

[0085] As nanopartículas de ouro compreendem um núcleo compreendendo um átomo de ouro (Au). O núcleo pode compreender adicionalmente um ou mais átomos de Fe, Cu ou Gd. O núcleo pode ser formado a partir de um ouro liga como Au/Fe, Au/Cu, Au/Gd, Au/Fe/Cu, Au/Fe/Gd ou Au/Fe/Cu/Gd. O número total de átomos no núcleo pode ser 100 a 500 átomos, como 150 a 450, 200 a 400 ou 250 a 350 átomos. A nanopartícula de ouro pode ter um diâmetro médio de 1 a 100, 20 a 90, 30 a 80, 40 a 70 ou 50 a 60 nm. Preferencialmente, a nanopartícula de ouro tem um diâmetro médio de 20 a 40 nm.

[0086] Um ou mais aglutinantes além dos peptídeos de vírus influenza podem ser unidos à nanopartícula, que podem ser de qualquer dos tipos de nanopartícula descrita acima. Os aglutinantes podem formar uma “corona”, uma camada ou revestimento que pode cobrir parcial ou completamente a superfície do núcleo. A corona pode ser considerada uma camada orgânica que circunda ou circunda parcialmente o núcleo de nanopartícula. A corona pode fornecer ou participar no apassivamento do núcleo da nanopartícula. Assim, em certos casos, a corona pode ser uma camada de revestimento suficientemente completa para estabilizar o núcleo. A corona pode facilitar a solubilidade, como a solubilidade de água das nanopartículas da presente invenção.

[0087] A nanopartícula pode compreender pelo menos 10, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40 ou pelo menos 50 aglutinantes. Os aglutinantes podem incluir um ou mais peptídeos, domínios de proteína, moléculas de ácido nucleico, grupos lipídicos, grupos de carboidrato,

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26/77 grupos aniônicos ou grupos catiônicos, glicolipídios e/ou glicoproteínas. O grupo de carboidrato pode ser um polissacarídeo, um oligossacarídeo ou um grupo de monossacarídeo (por exemplo, glicose). Um ou mais dos aglutinantes podem ser um componente não próprio, que torna a nanopartícula mais propensa a ser absorvida por células apresentando antígeno devido à sua similaridade a um o. Por exemplo, um ou mais aglutinantes podem compreender uma fração de carboidrato (como uma fração de carboidrato bacteriana), uma fração de tensoativo e/ou uma fração de glutationa. As aglutinantes exemplificativos incluem glicose, N-acetilglucosamina (GlcNAc), glutationa, 2'-tioetil-3-Dglucopiranosídeo e 2'-tioetil-D-glucopiranosídeo. Os aglutinantes preferenciais incluem glicoconjugados, que formam gliconanopartículas.

[0088] A ligação dos aglutinantes ao núcleo pode ser facilitada por um ligante. O ligante pode compreender um grupo tiol, um grupo alquila, um grupo glicol ou um grupo de peptídeo. Por exemplo, o ligante pode compreender C2-C15 alquila e/ou C2-C15 glicol. O ligante pode compreender um grupo contendo enxofre, grupo contendo amino, grupo contendo fosfato ou grupo contendo oxigênio que é capaz de união covalente ao núcleo. Alternativamente, os aglutinantes podem ser diretamente unidos ao núcleo, por exemplo, por meio de um grupo contendo enxofre, um grupo contendo amino, um grupo contendo fosfato ou um grupo contendo oxigênio compreendido no aglutinante.

União às nanopartículas [0089] Os peptídeos de vírus influenza podem ser unidos em sua terminação N à nanopartícula. Tipicamente, os peptídeos de vírus influenza são unidos ao núcleo da nanopartícula, porém, a união à corona ou um aglutinante também pode ser possível.

[0090] Um ou mais dos peptídeos de vírus influenza podem ser diretamente unidos à nanopartícula, por exemplo, por ligação covalente de um átomo em um grupo contendo enxofre, um grupo contendo amino, um grupo contendo fosfato ou um grupo contendo oxigênio no peptídeo

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27/77 a um átomo na nanopartícula ou seu núcleo.

[0091] Um ligante pode ser usado para ligar um ou mais dentre os peptídeos de vírus influenza à nanopartícula. O ligante pode compreender um grupo contendo enxofre, grupo contendo amino, grupo contendo fosfato ou grupo contendo oxigênio que é capaz de união covalente a um átomo no núcleo. Por exemplo, o ligante pode compreender um grupo tiol, um grupo alquila, um grupo glicol ou um grupo de peptídeo.

[0092] O ligante pode compreender uma porção de peptídeo e uma porção de não peptídeo. A porção de peptídeo pode compreender a sequência X1X2Z1, em que X1 é um aminoácido selecionado a partir de A e G; X2 é um aminoácido selecionado de A e G; e Z1 é um aminoácido selecionado a partir de Y e F. A porção de peptídeo pode compreender a sequência AAY ou FLAAY. A porção de peptídeo do ligante pode ser unida à terminação N do peptídeo de vírus influenza. A porção de não peptídeo da ligante pode compreender um grupo C2-C15 alquila e/ um C2-C15 glicol, por exemplo, um grupo tioetila ou um grupo tiopropila.

[0093] O ligante pode ser (i) HS-(CH₂)2-CONH-AAY; (ii) HS-(CH₂)2-CONH-LAAY; (iii) HS-(CH₂)3-CONH-AAY; (iv) HS-(CH₂)3-CONHFLAAY; (v) HS-(CH2)io-(CH₂OCH2)7-CONH-AAY; e (vi) HS-(CH2)io-(CH₂OCH2)7CONH-FLAAY. Nesse caso, 0 grupo tiol da porção de não peptídeo do ligante liga 0 ligante ao núcleo.

[0094] Outros ligantes adequados para unir um vírus influenza a uma nanopartícula são conhecidos na técnica, e podem ser prontamente identificados e implementados pela pessoa versada.

[0095] Quando a composição de vacina compreende um peptídeo de vírus influenza que compreende um epítopo de célula T CD8+ e um peptídeo de vírus influenza compreendendo um epítopo de célula B, cada peptídeo de vírus influenza pode ser unido a uma nanopartícula diferente. Nesse caso, a nanopartícula à qual cada peptídeo de vírus influenza é unida pode ser do mesmo tipo de nanopartícula. Por exemplo, cada peptídeo de vírus influenza

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28/77 pode ser unido a uma nanopartícula de ouro. Cada peptídeo de vírus influenza pode ser unido a uma nanopartícula de CaP. A nanopartícula à qual cada peptídeo de vírus influenza é unido pode ser um tipo diferente de nanopartícula. Por exemplo, um peptídeo de vírus influenza pode ser unido a uma nanopartícula de ouro e o outro peptídeo de vírus influenza pode ser unido a uma nanopartícula de CaP. No entanto, preferencialmente, o peptídeo de vírus influenza compreendendo um epítopo de célula T CD8+ e o peptídeo de vírus influenza compreendendo um epítopo de célula B são unidos à mesma nanopartícula. Por exemplo, o peptídeo de vírus influenza compreendendo um epítopo de célula T CD8+ e o peptídeo de vírus influenza compreendendo um epítopo de célula B podem ser unidos à mesma nanopartícula de ouro. Isso fornece uma única partícula que é capaz de estimular tanto uma resposta celular específica de vírus influenza quanto uma resposta humoral específica de vírus influenza.

Epítooos de célula T CD4+ [0096] Uma composição de vacina da invenção pode compreender adicionalmente um peptídeo de vírus influenza compreendendo um epítopo de célula T CD4+. Os epítopos de célula T CD4+ são definidos acima.

[0097] A composição de vacina pode compreender dois ou mais, como três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, dez ou mais, quinze ou mais ou vinte ou mais peptídeos de vírus influenza compreendendo um epítopo de célula T CD4+. Tais peptídeos são conhecidos na técnica.

[0098] O peptídeo de vírus influenza compreendendo um epítopo de célula T CD4+ pode ser um peptídeo diferente do peptídeo de vírus influenza que codifica a célula T CD8+ e o peptídeo de vírus influenza que codifica o epítopo de célula B. O peptídeo de vírus influenza que compreende um epítopo de célula T CD4+ pode ser o mesmo peptídeo que o peptídeo de vírus influenza que codifica a célula T CD8+. Ou seja, o peptídeo de vírus influenza compreendendo um epítopo de célula T CD8+ pode compreender adicionalmente um epítopo de célula T CD4+.

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29/77 [0099] Quando o peptídeo de vírus influenza compreendendo um epítopo de célula T CD8+ compreende um epítopo de célula T CD4+, o epítopo CD8+ pode ser aninhado dentro do epítopo de célula T CD4+. Os epítopos de célula T CD4+ são tipicamente mais longos do que epítopos de célula T CD8+. Portanto, estender uma ou ambas as terminações do epítopo de célula T CD8+ pode produzir um epítopo de célula T CD4+ mais longo cuja sequência ainda compreende o epítopo de célula T CD8+. Portanto, o epítopo de célula T CD4+ pode compreender um epítopo de célula T CD8+, como um epítopo de célula T CD8+ apresentado em SEQ ID NOs: 1 a 21, estendido nessa terminação N ou terminação C. O epítopo de célula T CD8+ pode ser estendido por 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos em sua terminação N. O epítopo de célula T CD8+ pode ser estendido por 1,2, 3, 4 ou 5 aminoácidos em sua terminação C. Preferencialmente, o epítopo de célula T CD8+ é estendido por 3 aminoácidos na terminação N, e 3 aminoácidos na terminação C. Entretanto, o epítopo de célula T CD8+ não precisa ser estendido pelo mesmo número de aminoácidos em cada terminação.

[0100] O epítopo de célula T CD8+ aninhado dentro de peptídeos estendidos pode ser capaz de gerar uma resposta de CTL robusta. O peptídeo estendido (epítopo de célula T CD4+) é capaz de induzir respostas de citocina mediadas por auxiliar T. Assim, a inclusão de um peptídeo de vírus influenza compreendendo um epítopo de célula T CD8+ e um epítopo de célula T CD4+ na composição de vacina pode permitir que a composição de vacina induza tanto respostas de célula T citotóxica e auxiliar, fornecendo imunidade anti-influenza aprimorada.

[0101] Como apresentado nos exemplos, os inventores identificaram inúmeros epítopos de célula T CD4+ potenciais em que um epítopo de célula T CD8+ apresentado nos SEQ ID NOs: 1 a 21 é aninhado. Esses são apresentados na Tabela 2.

Tabela 2

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epítopo CD8	Epítopo estendido (epítopo CD4 potencial)	Proteína	Motivo de HLA
Y1NTALLNA (SEOIDNO: 19)	kgvYINTALLNAsca (SEO ID NO: 22)	polimerase PA	A2
PVAGGTSSIYI (SEO ID NO: 1)	rflPVAGGTSSIYIevl (SEO ID NO: 23)	polimerase PB2	A2
TVIKTNMI (SEOIDNO:2)	igvTVlKTNMInnd (SEO ID NO: 24)	polimerase PB1	A2/A24
AIMDKNIIL (SEO ID NO: 20)	mdqAIMDKNIILkan (SEO ID NO: 25)	Proteína não estrutural 1	A2/A24
ITFHGAKEI (SEO ID NO: 4)	krelTFHGAKEIsls (SEO ID NO: 26)	Proteína de matriz 1	A2/A24
AINGITNKV (SEQ ID NO: 5)	tqnAINGITNKVnsv (SEQ ID NO: 27)	Hemaglutinina	A2/A24

[0102] Assim, o peptídeo de vírus influenza compreendendo um epítopo de célula T CD8+ e um epítopo de célula T CD4+ pode compreender um ou mais dos peptídeos apresentados em SEQ ID NOs: 22 a 27. O peptídeo de vírus influenza compreendendo um epítopo de célula T CD8+ e um epítopo de célula T CD4+ pode compreender dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais ou cinco ou mais dos peptídeos apresentados nos SEQ ID NOs: 22 a 27, em qualquer combinação. O peptídeo de vírus influenza compreendendo um epítopo de célula T CD8+ e um epítopo de célula T CD4+ pode compreender todos os peptídeos apresentados em SEQ ID NOs: 22 a 27.

[0103] O peptídeo de vírus influenza compreendendo um epítopo de célula T CD4+ pode ser unido a uma nanopartícula. A nanopartícula pode ser uma nanopartícula de ouro. As nanopartículas e união às mesmas são descritas acima.

Interação com supertipos de HLA [0104] A composição de vacina pode compreender pelo menos dois peptídeos de vírus influenza compreendendo um epítopo de

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31/77 célula T CD8+, cada um dos quais interage com um supertipo de HLA diferente. Incluindo uma pluralidade de tais peptídeos na composição de vacina permite a composição de vacina para surtir uma resposta de célula T CD8+ em uma proporção maior de indivíduos aos quais a composição de vacina é administrada. Isso se deve ao fato de que a composição de vacina deve ser capaz de surtir uma resposta de célula T CD8+ em todos os indivíduos de um supertipo de HLA que interage com um dos epítopos de célula T CD8+ compreendido na pluralidade de peptídeos de vírus influenza. Cada epítopo de célula T CD8+ pode interagir com HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A24, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B27, HLA-B44, HLA-B58 ou HLA-B62, ou qualquer outro supertipo de HLA conhecido na técnica. Qualquer combinação de peptídeos de vírus influenza compreendendo como um epítopo de célula T CD8+ é possível.

[0105] A composição de vacina pode compreender pelo menos um peptídeo imunogênico que interage com pelo menos dois supertipos de HLA diferente. Novamente, isso permite que a composição de vacina substitua uma resposta de célula T CD8+ em uma proporção maior de indivíduos aos quais a composição de vacina é administrada. A composição de vacina pode compreender pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos dois, pelo menos quinze, ou pelo menos vinte peptídeos imunogênicos, cada um dos quais interage com pelo menos dois subtipos de HLA diferente. Cada peptídeo imunogênico pode interagir com pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9 ou pelo menos 10 supertipos de HLA diferente. Cada peptídeo imunogênico pode interagir com dois ou mais dentre HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A24, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B27, HLAB44, HLA-B58 ou HLA-B62, ou qualquer outro supertipo de HLA conhecido na técnica, em qualquer combinação. Preferencialmente, a composição de vacina compreende um peptídeo imunogênico que interage com HLA-A2 e HLA-24. Nesse caso, a composição de vacina, por exemplo, pode compreender um peptídeo de vírus influenza que compreende um epítopo de célula T CD8+ que

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32/77 compreende um ou mais dos peptídeos apresentados nos SEQ ID NOs: 3 a 5. Medicamentos, métodos e uso terapêutico [0106] A invenção fornece um método de prevenir ou tratar uma infecção por vírus influenza, que compreende administrar a composição de vacina das invenções a um indivíduo infectado com, ou em risco de ser infectado com um vírus influenza. A invenção também fornece uma composição de vacina da invenção para uso em um método de prevenir ou tratar uma infecção por vírus influenza em um indivíduo.

[0107] O vírus influenza pode ser um vírus Influenza A, Influenza B e/ou Influenza C. O vírus Influenza A, por exemplo, pode ser H1N1, H5N1, H7H9 ou H3N2. O vírus influenza pode ser um vírus influenza humano, um vírus influenza suíno ou um vírus influenza aviário. O vírus influenza pode ser um vírus influenza pandêmico ou um vírus influenza potencialmente pandêmico.

[0108] A composição de vacina pode ser fornecida como uma composição farmacêutica. A composição farmacêutica preferencialmente compreende um carreador ou diluente farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica pode ser formulada com o uso de qualquer método adequado. A formulação de células com carreadores e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis padrão pode ser executado com o uso de métodos de rotina na técnica farmacêutica. A natureza exata de uma formulação dependerá de vários fatores incluindo as células a serem administradas e a via de administração desejada. Os tipos adequados de formulação são totalmente descritos em Remington's Pharmaceutical Sciences, 19^â Edição, Mack Publishing Company, Eastern Pennsilvania, EUA.

[0109] A composição de vacina ou composição farmacêutica pode ser administrada qualquer via. As vias adequadas incluem, mas sem limitações, as vias intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, subcutânea, intradérmica, transdérmica e oral/bucal.

[0110] As composições podem ser preparadas junto

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33/77 com um carreador ou diluente fisiologicamente aceitável. Tipicamente, tais composições são preparadas como suspensões líquidas de nanopartículas unidas ao peptídeo. As nanopartículas podem ser misturadas com um excipiente que é farmaceuticamente aceitável e compatível com o ingrediente ativo. Os excipientes adequados são, por exemplo, água, solução salina, dextrose, glicerol ou similares e combinações dos mesmos.

[0111] Além disso, se for desejado, as composições farmacêuticas podem conter quantidades menores de substâncias auxiliares como agentes umectantes e emulsificantes e/ou agentes de tamponamento de pH.

[0112] As nanopartículas unidas ao peptídeo são administradas de uma maneira compatível com a formulação de dosagem e em tal quantidade serão terapeuticamente eficazes. A quantidade a ser administrada depende do indivíduo a ser tratado, da doença a ser tratada e da capacidade do sistema imunológico do indivíduo. As quantidades precisas de nanopartículas que precisam ser administradas podem depender do parecer do técnico e pode ser peculiar a cada indivíduo.

[0113] Qualquer número adequado de nanopartículas pode ser administrado a um indivíduo. Por exemplo, pelo menos ou cerca de 0,2 x 10⁶, 0,25 x 10⁶, 0,5 x 10⁶, 1,5 x 10⁶, 4,0 x 10⁶ ou 5,0 x 10⁶ nanopartículas por kg do paciente podem ser administradas. Por exemplo, pelo menos, ou cerca de, 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹ células podem ser administradas. Como um guia, o número de nanopartículas da invenção a ser administrada pode ser de 10⁵ a 10⁹, preferencialmente de 10⁶ a 10⁸.

[0114] Deve ser entendido que diferentes aplicações dos produtos revelados e métodos podem ser adaptados às necessidades específicas na técnica. Também deve ser entendido que uma terminologia usada no presente documento tem uma finalidade de descrever apenas modalidades particulares da invenção e não se destina a ser limitativa.

[0115] Além disso, como usado no presente relatório

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34/77 descritivo e nas reivindicações anexas, as formas singulares um, uma e a/o incluem referentes no plural, exceto se o conteúdo claramente declarar de outro modo. Assim, por exemplo, a referência a “um CAR” inclui “CARs”, a referência a “uma célula T” inclui duas ou mais de tais células T, a referência a “um componente” inclui dois ou mais de tais componentes e similares.

[0116] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente citados no presente documento, independentemente de ser acima ou abaixo, são incorporados por meio deste, a título de referência em sua totalidade.

Modalidades Adicionais da Invenção

1. Um oligopeptídeo ou peptídeo isolado em uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos um peptídeo que tem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1 a 18, o dito oligopeptídeo ou peptídeo consistindo em 8 a cerca de 30 resíduos de aminoácido, em que o dito oligopeptídeo ou peptídeo se liga às moléculas de MHC de classe I ou pode ser processado para se ligar às moléculas de MHC de classe I e ativar resposta ao linfócito T e em que o oligopeptídeo ou peptídeo está na forma de um sal farmaceuticamente aceitável.

2. O oligopeptídeo do item 1, em que o dito oligopeptídeo compreende pelo menos dois peptídeos epitópicos.

3. O oligopeptídeo do item 1, em que o dito oligopeptídeo compreende pelo menos três peptídeos epitópicos.

4. O oligopeptídeo do item 1, em que o dito oligopeptídeo compreende pelo menos quatro peptídeos epitópicos.

5. O oligopeptídeo ou peptídeo do item 1, em que o dito oligopeptídeo ou peptídeo difere de SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 13,14,15,16,17 ou 18, em que a dita diferença não é maior que uma unidade de aminoácido.

6. O oligopeptídeo ou peptídeo do item 5, em que a dita diferença de um aminoácido é o resultado de uma substituição conservadora de aminoácido.

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7. O oligopeptídeo ou peptídeo do item 5, em que a dita diferença de um aminoácido é a substituição de um aminoácido hidrofóbico por outro aminoácido hidrofóbico.

8. O oligopeptídeo ou peptídeo do item 5, em que a dita diferença de aminoácido é a adição ou deleção de um aminoácido para ou do dito peptídeo epitópico.

9. Um polinucleotídeo em uma composição farmacêutica compreendendo um polinucleotídeo selecionado a partir do grupo consistindo em: (a) um polinucleotídeo que codifica um oligopeptídeo ou peptídeo do item 1, e (b) cujo complemento total, (a) em que o polinucleotídeo está em uma forma de um sal farmaceuticamente aceitável.

10. O polinucleotídeo do item 9, em que o polinucleotídeo de (a) é DNA.

11. O polinucleotídeo do item 9, em que o polinucleotídeo de (a) é RNA.

12. Um método para vacinar e tratar um indivíduo para infecção de Influenza, em que as ditas células infectadas expressam qualquer molécula de MHC de classe I, compreendendo administrar ao dito indivíduo uma composição que se liga às moléculas de MHC de classe I ou pode ser processada para se ligar às moléculas de MHC de classe I compreendendo: pelo menos um polipeptídeo compreendendo um peptídeo epitópico compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1 a 18 em uma quantidade suficiente para induzir uma resposta de CTL às ditas células infectadas e em uma forma de um sal farmaceuticamente aceitável; ou pelo menos um polipeptídeo que compreende um peptídeo epitópico que tem a diferença de pelo menos um aminoácido de uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1 a 18 em uma quantidade suficiente para induzir uma resposta de CTL às ditas células infectadas e em uma forma de um sal farmaceuticamente aceitável.

13. Um método para vacinar e tratar um indivíduo com

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36/77 infecção de Influenza, em que as ditas células infectadas expressam qualquer molécula de MHC de classe I, em que o dito método compreende administrar ao dito indivíduo uma composição que se liga às moléculas de MHC de classe I ou pode ser processada para se ligar às moléculas de MHC de classe I compreendendo: um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica pelo menos um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1 a 18 em uma quantidade suficiente para induzir uma resposta de CTL às ditas células infectadas e em uma forma de um sal farmaceuticamente aceitável; ou pelo menos um polipeptídeo que compreende um peptídeo epitópico que compreendendo a diferença de um aminoácido de uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1 a 18 em uma quantidade suficiente para induzir uma resposta de CTL às ditas células infectadas e em uma forma de um sal farmaceuticamente aceitável.

14. Um método para gerar uma resposta imune ex vivo com o uso de células T de um indivíduo infectado com Influenza, em que o dito método compreende: estimular a produção de resposta de CTL par o uso na imunoterapia passiva, em que as ditas células T reagem com pelo menos um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1 a 18 e em uma forma de um sal farmaceuticamente aceitável; ou pelo menos um polipeptídeo compreendendo a diferença de um aminoácido de uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1 a 18 e em uma forma de um sal farmaceuticamente aceitável.

15. O método do item 14, em que a dita célula T terapia adotiva gerada de indivíduos correspondentes autólogos ou HLA.

16. Um método para avaliar ou diagnosticar uma resposta imune em um indivíduo infectado com Influenza ou vacinado para Influenza e vírus relacionados, em que o dito método compreende: estimular a produção de resposta de CTL, em que as ditas células T reagem com pelo menos um

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37/77 polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionados a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1 a 18 e em uma forma de um sal farmaceuticamente aceitável; ou pelo menos um polipeptídeo compreendendo a diferença de um aminoácido de uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1 a 18 e em uma forma de um sal farmaceuticamente aceitável.

17. Um método para vacinar seres humanos contra a infecção de Influenza com o uso de SEQ IDs 1 a 18 em uma forma de um sal farmaceuticamente aceitável

Os seguintes Exemplos ilustram a invenção.

Exemplo 1

Introdução [0117] A influenza é um problema de saúde global significativo, infectando até 20 % da população mundial anualmente, causando até 5 milhões de casos de doença grave e >300.000 mortes mundialmente. Apenas nos EUA, uma estimativa de > 30.000 mortes e aproximadamente 300.000 hospitalizações são atribuídas à infecção por influenza a cada ano (1). Com o aparecimento recente de uma doença sazonal nova, grave e potencialmente recorrente, campanhas de vacinação difundidas que reduzem a incidência de pneumonia induzida por influenza estão sendo incentivadas pela Organização de Saúde Mundial. Reduzir efetivamente a incidência de influenza exigirá vigilância intensa continuada, uso aumentado de vacina influenza atualmente disponível e a disponibilidade de vacinas alternativas e medicações antivirais que podem fornecer uma proteção mais ampla contra cepas de deslocamento e deriva de influenza (1). As campanhas de vacinação contra influenza bem-sucedidas podem ter um impacto social e econômico enorme (2).

Resposta imune ao vírus influenza [0118] A resposta imune à influenza é regida tanto por imunidade inata quanto adaptativa. A resposta imune inata à influenza limita a replicação viral inicial, porém, é relativamente não específica (3). A folga eficaz

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38/77 de virus influenza exige uma resposta imune adaptativa robusta, ativando tanto a imunidade humoral quanto mediada por célula, a imunidade humoral, como mediada por IgA secretora e IgM. Os anticorpos fornecem proteção contra o estabelecimento de infecção inicial, enquanto a IgG neutraliza o vírus de replicação recente na infecção estabelecida (4, 5). Embora induzir a imunidade humoral à influenza seja o objetivo de vacinas influenza convencionais atuais, essas não são completamente protetoras devido à ocorrência de variações antigênicas (6) (7). Adicionalmente, os dados indicam que as respostas de célula T são extremamente importantes para a proteção contra influenza. As células T CD4+ desempenham uma função crítica na comutação de isótipo em IgG e na geração de anticorpos de afinidade (8) superior e memória de CTL (9-11). Em seres humanos, as células T CD4+ específicas à HA se proliferam após a vacinação contra influenza (12) e auxiliam no desenvolvimento de resposta de anticorpo de influenza heterossubtípica (13,14). Os linfócitos T citotóxicos CD8+ (CTLs) mediam a folga viral e, de modo importante, mostraram ter respostas de reação cruzada a diferentes subtipos de vírus influenza A (15-17). Isso pode explicar a paucidade relativa de doença entre indivíduos mais velhos, potencialmente vacinados, ou expostos à infecção por H1N1.

Situação atual do desenvolvimento de vacina vírus influenza [0119] As vacinas influenza agora no mercado são atualizadas anualmente e são projetadas com base em recomendações de cepa tipo WHO anuais (16, 18) e fabricadas antes do início de uma temporada ou pandemia de influenza. As vacinas atuais para influenza induzem uma resposta imune humoral protetora contra as glicoproteínas de HA e NA na superfície de vírion (7, 19, 20). Entretanto, as glicoproteínas de HA e NA virais são altamente suscetíveis ao deslocamento antigênico frequente e imprevisível e mutações de deriva menos frequentes, porém, mais graves, que resultam em perda de reconhecimento de anticorpo, precisando do desenvolvimento frequente de novas vacinas para corresponder do sorotipo (ou sorotipos) viral atual infectando

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39/77 a população humana (21-25). Além disso, essas vacinas são dispendiosas para produzir e não protegerão contra cepas novas que podem emergir ao longo da temporada (isto é, gripe suína de H1N1 de 2009, H5N1, H7N9). Sobretudo, essas vacinas focalizadas em proteção baseada em anticorpo e induzem respostas de célula T limitadas que são essenciais para eliminar as células infectadas do corpo.

[0120] Três vacinas influenza sazonais aprimoradas atualmente têm aprovação da FDA. Essas vacinas quadrivalentes fornecem cobertura contra dois vírus de influenza A e dois vírus de influenza B. (Nos últimos anos, dois vírus influenza B cocircularam durante as temporadas de influenza e as vacinas trivalentes oferecidas não protegem contra uma dessas cepas). FluMist, uma vacina atenuada viva quadrivalente que pode fornecer mais alvos para o sistema imunológico, devido à síntese de proteína limitada (que é ausente em vacinas inativadas). FluMist (httD://www.cdc.qov/flu/orotect/vaccine/vaceines.htm) é atualmente distribuída como uma alternativa à vacina inativa trivalente. Fluarix e FluZone são vacinas inativadas quadrivalentes que estimulam uma resposta imune similar à vacina inativa trivalente atual. Essas serão distribuídas na temporada de influenza 20132014 (httD://www.fda.qov/BioloqicsBloodVaccines/Vaccines/ADorovedProducts/ucm2 95057.htm). Apesar da cobertura oferecida pelas vacinas quadrivalentes, essas ainda são sazonais e sofrem das mesmas desvantagens que a vacina trivalente, a saber, os tempos de produção e custos e a falta de respostas de célula T fortes que eliminam células infectadas e proteção contra emergentes durante a temporada. É prontamente evidente que é necessária uma a vacina universal que oferece proteção contra a maioria, se não todas, as cepas de influenza.

[0121] Até o presente momento, múltiplas formulações de vacina universal estão em desenvolvimento. Essas vacinas podem ser amplamente caracterizadas pelo tipo de resposta imune protetora que é estimulada: 1) respostas de célula B (anticorpo), 2) respostas de célula T ou 3)

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40/77 respostas tanto de célula B quanto T. Kanekiyo et al. geraram nanopartículas de HA (proteína de hemaglutinina (HA) de influenza é fusionada à ferritina) que induzem respostas de anticorpo de alta titulação que fornecem cobertura contra múltiplas cepas de influenza (26). Essa vacina ainda precisa entrar em testes clínicos. Uma vacina à base de célula T que tem como alvo quatro epítopos relativamente conservados no genoma viral (27) também está em desenvolvimento. Uma vacina de célula T à base de epítopos CD4 altamente conservados foi avaliada em um estudo de estímulo de fase II com respostas protetoras positivas contra várias cepas de influenza incluindo cepas pandêmicas (28). Uma vacina de poliepítopo recombinante, chamada Multimeric-001, que incorpora célula B, célula T CD4- e célula T CD8 conservada epítopos de nove proteínas de influenza (29) diferentes está sendo testado em testes clínicos de estágio precoce. Uma vacina de proteína de fusão consistindo em nucleoproteína (NP) e o epítopo de célula B, M2e, unido a um adjuvante e peptídeo de M2e em nanopartícula de ouro em combinação com CpG (30) também estão em desenvolvimento. A maioria das vacinas mencionadas acima é formulada como proteína ou peptídeos com vários adjuvantes que induzem reações adversas clínicas. Em contraste, a presente formulação de vacina influenza universal totalmente sintética consiste em um painel de CD4, CD8 e célula B conservadas que ativam epítopos formulados em uma entrega de vacina de nanopartícula de ouro que tem propriedades de adjuvante embutidas, projetada para estimular respostas imunes de células T e B potentes direcionadas contra muitas cepas de vírus influenza incluindo as cepas recémemergentes.

Conceito de vacina universal sintética para infecção por influenza [0122] Uma vacina ideal deve tentar simular a imunidade natural (Fig. 1) gerada por infecção de uma maneira em que a memória imune celular e humoral adaptativa é gerada (31). Enormes esforços estão sendo realizados para desenvolver uma vacina da gripe universal que

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41/77 funcionaria contra todos os tipos de influenza.

[0123] O objetivo é fornecer proteção por anos, se não por toda a vida, contra todas as cepas de influenza sazonais e as cepas pandêmicas, tornando a imunização contra gripe muito mais como essa para as vacinas tradicionais. O desenvolvimento de uma vacina influenza universal eficaz eliminaria (ou reduziría) os medos de pandemias de influenza futuras e seria econômico em comparação com o desenvolvimento e a fabricação das vacinas influenza sazonais anuais. Tal vacina universal deve ter como alvo epítopos de vírus influenza conservados que não variam de cepa para cepa e, sobretudo, deve ser apresentado pelas moléculas de MHC nas células infectadas. Por fim, a candidata à vacina influenza universal mais promissora pode ser proveniente da combinação dos antígenos para a imunidade de células T e B. Com base em modelos animais e estudos humanos, combinar todos os aglutinantes de células T e B possíveis (Fig. 1) para formular uma vacina sintética ativa faz sentido. Para ser ativa, a vacina deve estar na faixa de tamanho para permitir a absorção de citosol com sinais de perigo embutidos para alvejar células apresentando antígeno. As gliconanopartículas de ouro inovadoras com essas propriedades mostraram induzir respostas de vacina eficazes (32, 33). O desenvolvimento de uma vacina universal sintética com base em epítopos de célula T e de célula B compartilhados incorporados na nanopartícula de ouro é o foco do presente pedido.

Inovação [0124] Esta proposta tem duas distinções inovadoras principais: (1) o desenvolvimento de uma vacina universal totalmente sintética que é capaz de induzir respostas de auxiliar T, citotóxica, célula T e anticorpo contra múltiplas cepas de infecção por influenza e (2) a caracterização de uma plataforma de entrega de vacina de gliconanopartícula de ouro inovadora totalmente sintética inovadora equipada com moléculas que estimulam o sistema imune inato e adaptativo que servirão como um adjuvante potente para qualquer vacina de subunidade. A abordagem de vacina proposta teria várias vantagens

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42/77 em relação às vacinas existentes. Primeiro, a mesma teria múltiplos epítopos de célula T CD8+ restringidos de classe I de MHC conservados naturalmente processados e apresentados em células infectadas (34), epítopos CD8 aninhados em epítopos CD4 e epítopo (ou epítopos) de anticorpo de várias proteínas de influenza viral. Em segundo lugar, esses epítopos serão entregues em gliconanopartícula sintética que contém “sinais de perigo” imune (35, 36). Por fim, essas gliconanopartículas inovadoras com 20-40 nm de tamanho, diferente de outras nanopartículas, contêm componentes não próprios (como carboidratos bacterianos, GlcNAc) além dos epítopos de ativação de célula T e B específicos de influenza, são mais propensas a alvejar e serem absorvidas por células apresentando antígeno devido à sua similaridade a um patógeno, para a ativação eficaz de respostas de célula T e anticorpo específicas ao antígeno. Também é previsto que essas gliconanopartículas induzam maturação/ativação de DC, e assim, uma resposta imune robusta, que são essenciais para uma resposta de vacina de subunidade específica e bem-sucedida (37, 38). Essas nanopartículas também são passíveis a várias vias de entrega, incluindo transdérmica e oral/bucal, além do modo de entrega de injeção intradérmica e subcutânea.

[0125] Essa proposta também se destina a acelerar o desenvolvimento pré-clínico de uma estratégia de vacina emergente inovadora que tem eficácia de subtipo cruzado embutido, que podería prevenir a difusão significativa de uma cepa emergente ou re-emergente de infecção por influenza. Uma vacina de subtipo cruzado contendo epítopos de sequência de consenso imunogênico podería alcançar esse objetivo. A evidência crescente sugere que uma vacina universal eficaz deve induzir a ativação de imunidade tanto humoral quanto mediada por célula. Há a hipótese de que as vacinas baseadas em epítopos definidos apresentados pelas células infectadas seriam bem superiores a uma vacina baseada em subunidade de proteína viral ou em um epítopo previsto de motivo, visto que o processamento de proteína pelo sistema imunológico pode alterar os epítopos virais nativos. Além disso, o epítopo CD8 aninhado com peptídeos estendidos, não apenas geram uma resposta de CTL

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43/77 robusta, mas, os peptídeos estendidos também são capazes de induzir respostas de citocina mediadas por auxiliar T, que são críticas ao combate à infecção por influenza (28). Uma adição de um epítopo de anticorpo universal a essa formulação de vacina sintética incorpora ambos os braços do sistema imunológico para a proteção completa.

[0126] Como demonstrado pelos dados preliminares, a identificação direta de epítopos de célula T apresentados pelas células infectadas é um método eficaz e lógico para identificar os epítopos de célula T para aplicações de vacina. A presente análise confirmou alguns epítopos de célula T que foram selecionados por metodologias de previsão de motivo de MHC. Visto que o banco de dados de epítopo imune (http://www.iedb.org) contém várias centenas de epítopos de célula T de influenza específicos de HLA previstos, incluindo inúmeros epítopos compartilhados com pontuações de ligação de alto MHC e caracterização de CTL limitada, é crítico confirmar e usar para epítopos de aplicação de vacina que são apresentados pelas células infectadas por vírus;. Adicionalmente, visto que o banco de dados de IEDB é gerado por métodos de previsão de motivo, e não por métodos funcionais, seria difícil classificar as hierarquias de dominância de epítopos apresentados naturalmente. Thomas et al. (39) demonstrou de modo elegante que tanto epítopos dominantes quanto subdominantes são apresentados pelas células infectadas, o que seria difícil de classificar com o uso dos dados no banco de dados de IEDB. Uma desvantagem adicional dos epítopos previstos de motivo é que frequentemente foram triados para especificidade funcional com o uso de CTL de indivíduos infectados, que pode ter sido tolerado.

[0127] A inovação significativa será realizada na primeira combinação de epítopos de célula T (CD8 e CD4) e um epítopo de anticorpo (M2e) formulado em um sistema de entrega de vacina de nanopartícula flexível totalmente sintética de regulação e ativação imune alvejada. É enfatizado que o uso dos epítopos de célula T conservados que são naturalmente apresentados pelas células infectadas e o epítopo de célula B incorporado nas

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44/77 nanopartículas representam um grande salto na tecnologia de vacina, em vez de um pequeno ajuste aos constituintes de vacina. Se for bem-sucedido, esse método podería levar a um deslocamento de paradigma em como as vacinas profiláticas e terapêuticas são formuladas. O presente trabalho também será útil em avançar o entendimento geral da resposta imune mediada por célula T à infecção por vírus influenza. Essas informações são críticas para o desenvolvimento de fármacos antivirais e vacinas profiláticas e terapêuticas universais para combater e prevenir infecção por vírus influenza grave e, em alguns casos, letal.

Resultados [0128] Identificou-se um painel de epítopos conservados específicos de HLA-A2 das células infectadas. Com o uso de células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC) obtidas a partir de doadores saudáveis positivos para HLA-A2 foram caracterizados epítopos selecionados para atividade de CTL e demonstrados através de reatividade in vitro.

Identificação de epítopos de influenza apresentados de classe I de MHC [0129] JY, uma linhagem de célula B transformada de EBV positiva para HLA-A2 e B7 e HepG2 positiva para HLA-A2 e A24, uma linhagem celular de hepatoma e células dendríticas (DCs) geradas a partir de linfócitos sanguíneos periféricos positivos de HLA-A2 (PBL) de indivíduos saudáveis foram infectados com cepas virais de Influenza A e B (A/New Caledonia/20/99 (H1N1), A/Wisconsin/67/2005 (H3N2), B/Malaysia/2506/2004). Tanto para JY quanto para DC, os estudos publicados mostraram que a infecção celular é ~50 % mediante o uso de ~10 HAU (40) por 16-24 h são mais bemsucedidos para infecções de influenza (41). As células infectadas foram usadas para o isolamento de peptídeos de MHC se mostrassem >50 % de inefetividade. Os Usados celulares foram preparados e submetidos a dois ciclos de imunoprecipitação com o uso de 1 mg de W6/32 (anticorpo específico de classe

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I de pan MHC ) conjugado a 1 ml de proteína de microesferas de A/G (34). Os complexos de MHC unidos foram eluidos das microesferas e misturas de peptídeo foram purificadas e fracionadas com o uso de coluna de fase inversa de C18 (RP). As frações de peptídeo foram injetadas individualmente no sistema de LC-MS/MS (nanoAcquity UPLC -LTQ orbitrap) para identificar os peptídeos de MHC. Os peptídeos de MHC e suas proteínas correspondentes foram identificados através da busca dos dados brutos no banco de dados de influenza de NCBI usando o software descobridor de biotrabalho/proteoma (Thermo). Os peptídeos sintéticos foram produzidos para validar e confirmar as sequências. Os peptídeos sintéticos foram submetidos à análise de LC-MS/MS sob condições de colisão idênticas às experimentais e suas sequências foram confirmadas por comparação de seus espectros de MS/MS com aquele de seus análogos sintéticos.

[0130] A Tabela 31 resume os peptídeos associados à classe I de MHC que foram identificados a partir das células infectadas por vírus influenza. Foram identificados 7 epítopos com o motivo de ligação de HLAA2 e 5 dos 7 epítopos tiveram um motivo de ligação cruzada de HLA-A24. Além disso, foram identificados vários epítopos contendo motivo de HLA-B7 e B44. Todos os epítopos se originam de regiões das proteínas que são conservadas entre múltiplas cepas de influenza. Esses peptídeos foram confirmados em experimentos de coeluição com o uso de peptídeos sintéticos. Curiosamente, foram identificados três epítopos anteriormente relatados, dois epítopos específicos de HLA-A2 (P1 e P5) (42), que foram identificados com o uso de previsão de motivo e análise de CTL ex vivo e um epítopo específico de HLA-B7 (LPF na tabela 3) que mostra ser conservado entre vírus influenza A de H1N12009 e H1N1 -1918 pandêmicos (43).

Seq ID	Peptídeo	Proteína	Motivo de HLA
	YINTALLNA* (P1)	polimerase PA	A2
1	PVAGGTSSIYI (P2)	polimerase PB2	A2

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Seq ID	Peptídeo	Proteína	Motivo de HLA
2	TVIKTNMI (P3)	polimerase PB1	A2/A24
3	MTIIFLILM (P4)	hemaglutinina	A2/A24
	AIMDKNIIL* (P5)	Proteína não estrutural 1	A2/A24
4	ITFHGAKEI	Proteína de matriz 1	A2/A24
5	AINGITNKV	Hemaglutinina	A2/A24
6	EEMGITTHF	RNA polimerase catalítica direcionada ao RNA	B44
7	VETPIRNEW	Proteína de matriz 2	B44
8	REILTKTTV	Proteína básica de polimerase 2	B44
9	KESDEALNMTMASTP	Proteína não estrutural NS1	B44
10	LENERTLDF	Proteína ácida da polimerase	B44
11	MEAVPLITI	Hemaglutinina	B44
12	VEQEIRTF	Proteína de exportação nuclear	B44
13	VEQELRTF	Proteína não estrutural 2	B44
	LPFDRTTIM*	proteína de nucleocapsídeo	B7
14	SPDDFALIVNA	polimerase PB1	B7
15	YPDTGKVM	Neuraminidase	B7
16	YPDASKVM	Neuraminidase	B7
17	QPETCNQSII	Neuraminidase	B7
Tabela 3: Os epítopos de classe I d	e MHC apresentados

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47/77 por células infectadas por vírus influenza * Epítopos anteriormente relacionados [0131] Antes de experimentos de caracterização funcionais de CTL, foi confirmada a autenticidade de 5 peptídeos específicos de HLA-A2, P1-P5 (Tabela 3) com o uso de seus análogos de peptídeo sintético. Como ilustrado na Figura 2, a maioria dos íons de fragmento nos espectros de ms/ms de peptídeos experimentalmente identificados (Figura 2: P1-A-P5-A) correspondentes com os espectros de seus peptídeos sintéticos correspondentes como indicado pelas massas denotadas (Figura 2: P1-B-P5-B) (34). Além disso, verificou-se adicionalmente os espectros de ms/ms manualmente para confirmar a identidade de todos os peptídeos experimentalmente observados. Os epítopos de célula T foram formulados nas nanopartículas e testados quanto à indução de CTL específico de epítopo e reatividade cruzada in vitro.

[0132] Para verificar a apresentação desses epítopos por células infectadas, os CTLs específicos para cada um dos 5 peptídeos foram gerados com o uso de PBMCs de doadores de HLA-A2+ saudáveis e peptídeos sintéticos correspondentes aos epítopos identificados. Em ensaios de ELISpot, a funcionalidade de CTL foi medida por detecção de secreção de IFNy específico ao antígeno. Como ilustrado na Figura 3A, células de JY e HepG2 infectadas com PR8 estimularam todas as cinco dentre as células T específicas de epítopo de influenza. Adicionalmente, a reatividade cruzada a outras cepas foi demonstrada com o uso de células-alvo de HepG2 infectadas com várias cepas de influenza A (X31, H3N2 e JAP, H2N2), indicando a apresentação desses epítopos em várias células infectadas por cepa de influenza (Figura 38/ [0133] Para caracterizar adicionalmente a resposta imune gerada por esses epítopos in vivo, foram imunizados camundongos transgênicos de HLA-A2+ com uma mistura dos cinco epítopos supracitados. As imunizações foram executadas com o uso desses peptídeos na presença de Montanide ISA 51 como um adjuvante (Figura 4A). Foi determinada a resposta

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48/77 de célula T específica de influenza através da medição de secreção de IFNy murina em um ensaio de ELISpot. Com o uso de células T2 pulsadas com peptídeos individuais 1-5, foi observada uma resposta a todos os 5 peptídeos após a imunização (Figura 4B). Em conjunto com os resultados in vitro acima, CTLs geradas in vivo específicas para esses peptídeos foram estimuladas igualmente bem quando células de HepG2 e JY infectadas com diferentes cepas de influenza foram usadas como alvos (Figura 4C) indicando que esses epítopos são processados e apresentados em múltiplas infecções de influenza. Além da liberação de IFNy, também foram medidas as alterações fenotípicas de células T CD8+ de esplenócitos em relação a CD107a, um marcador de ativação presente em CTLs efetoras de granulação (44, 45). Como ilustrado na Figura 41), as células T CD8+ exibiram uma intensidade superior de mancha de CD107a quando incubadas com alvos infectados comparados com alvos não infectados.

[0134] Foram geradas nanopartículas de ouro (NP) incorporando epítopos específicos de HLA-A2 (NP 1-5) e combinados com um epítopo de anticorpo compartilhado (NP 6) da proteína de 2 matrizes de influenza (M2e). Foram imunizados camundongos transgênicos de HLA-A2 com peptídeo+montanídeo 51 ou peptídeos em NPs e avaliou-se a resposta de CTL por liberação de IFNy com o uso de ELISpots (Fig. 5A e B) e expressão de CD107a (Fig. 5C). Peptídeos incorporados em NPs ativaram uma forte resposta de CTL antivitral in vivo sem qualquer adição de adjuvante. As NPs em si atuaram como adjuvantes além de entregar peptídeos às células apresentando antígeno. Os peptídeos sem adjuvante de montanídeo não surtiram uma resposta de CTL (dados não mostrados).

[0135] Além de caracterizar respostas de CTL, também foram avaliadas respostas de anticorpo a um epítopo de anticorpo universal de proteína de 2 matrizes de influenza (M2e). Para essa finalidade, imunizou-se um grupo de camundongos com peptídeos de MHCI (PI-5) ou peptídeos em GNP (NP1-5) além de um peptídeo (P6 ou NP6) do ectodomínio

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49/77 de M2 (M2e) (46,47). A resposta de célula T como medido por ensaio de ELISpot de IFNy (Figura 5A&B) e análise de citometria de fluxo de CD107a (Figura 5C) foram comparáveis entre os grupos imunizados com epítopos de célula T em separado (1-5) ou epítopos de célula T com o peptídeo de M2e (1-6). A concentração de anticorpo específico de M2e de circulação, então, foi medida por um ELISA padrão com o uso de soro coletado das sangrias de terminal de camundongos imunizados. Como ilustrado na Figura 6, os camundongos imunizados com o peptídeo de M2e com adjuvante de montanídeo (Pep6) ou em GNPs (NP6) gerou uma resposta de IgG específica de M2e e robusta (Fig. 6A). Entretanto, quando o peptídeo de M2e é combinado com os peptídeos de MHCI (Pep1 -5 ou NP1 -5), a titulação de anticorpo contra M2e foi ligeiramente reduzida. Não houve diferença entre os peptídeos+adjuvante de montanídeo e GNPs sem qualquer adjuvante na resposta de anticorpo como foi observado na resposta de célula T. Entretanto, quando foi comparado o peptídeo livre sem qualquer adjuvante com NPs, foi observada uma resposta de anticorpo maior com NPs (Fig. 6B). Em suma, foi demonstrado que epítopos de MHCI e anticorpo incorporados com GNP geraram respostas robustas tanto de VTL quanto de anticorpo em comparação com os epítopos que exigem adjuvantes, que induzem toxicidade clínica.

[0136] A funcionalidade dos antissoros de M2e gerados por peptídeo+adjuvante de montanídeo (P1 -6, P6) e peptídeos em NPs (NP1-6, NP6) para reatividade cruzada foi, então, caracterizada através da infecção de células de HepG2 e JY com todas as três cepas de vírus influenza (PR8, X-31 ou JAP) que foram testados até o presente momento. Usando a citometria de fluxo, trataram-se as células infectadas com os antissoros específicos de M2e obtidos a partir de camundongos imunizados com peptídeo+montanídeo ou NP e demonstraram a ligação do anticorpo especificamente em PR8, X-31 ou JAP (verde, aqua, vermelho respectivamente) células infectadas indicando a presença desse epítopo em várias células infectadas com cepas de influenza (Fig. 7).

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50/77 [0137] Por fim, a capacidade de neutralização desses anticorpos foi determinada através da adição de antissoros às células de HepG2 infectadas com vírus PR8. As células de HepG2 foram pulsadas com uma baixa dose de PR8 na presença de soro a partir de camundongos imunizados com peptídeos de MHCI (P1-5 ou NP 1-5) ou peptídeo de pM2e (pM2e ou NP M2e) a uma diluição de 1:50 por 1 h. Após a incubação durante a noite com os mesmos níveis de soro, as células foram fixas e intracelularmente coradas por NP de influenza. A porcentagem de células positivas é representada. Os histogramas preenchidos com cinza são controles não infectados. Como ilustrado na Figura 8, os níveis de infecção foram inferiores quando o soro contendo anticorpo antiM2e obtido a partir do peptídeo de M2e com adjuvante de montanídeo (Fig. 8A) ou peptídeo de M2e em GNP (Fig. 8B) foi usado indicando a capacidade funcional dos anticorpos específicos de M2e.

Sumário [0138] Esse é o primeiro estudo compreensivo relatado sobre análise de peptídeos associados de classe I de MHC de células infectadas por vírus influenza. Significativamente, todos os epítopos são compartilhados entre diferentes cepas de influenza. Curiosamente, também foram identificados alguns epítopos previstos de motivo já relatados nas células infectadas. Além da caracterização de epítopos de MHCI, também foi demonstrado a ampla atividade antiviral dos anticorpos contra o epítopo de anticorpo de M2e. Também foi gerada a nanopartícula de ouro (GNP) formulada com epítopos T e de anticorpo e caracterizadas as respostas de T e de anticorpo antivirais em estudos in vitro e in vivo. Os dados que foram gerados terão um impacto significativo no desenvolvimento, na formulação e na caracterização de vacina influenza universal. O presente trabalho também será útil em avançar o entendimento geral da resposta imune mediada por célula T à infecção por vírus influenza. Essas informações são críticas para o desenvolvimento de fármacos antivirais e vacinas profiláticas e terapêuticas universais para combater e prevenir infecção por vírus influenza grave e, em alguns casos, letal.

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Trabalho futuro [0139] É proposta a avaliação da frequência de células T específicas para essa resposta de epítopos e de anticorpo de M2e nos indivíduos vacinados sazonalmente para avaliar a célula endógena mediada e respostas humorais na infecção por influenza. Na linhagem com esse objetivo, foi preliminarmente investigada a presença de anticorpos específicos de M2e em uma população geral exposta à infecção por influenza e que apresentava vacinação sazonal. Foram obtidas amostras de soro (adquiridas junto à Research Blood Components LLC, Brighton, MA) de 10 indivíduos saudáveis (5 machos e 5 fêmeas). A presença de anticorpos contra o epítopo de M2e conservado foi avaliada com o uso de ensaio de ELISA padrão.

[0140] Várias diluições das amostras de soro foram aplicadas aos poços de ELISA revestidos com peptídeo de M2e e tratadas com anticorpos secundários de IgG anti-humana e agente de detecção de Licor (34). A imagem real dos poços de ELISA é mostrada para cada um dos indivíduos com 4 diluições diferentes. Os dados mostrados na Figura 9 claramente indicam que alguns dos indivíduos produzem anticorpos contra o epítopo de M2e conservado. Entretanto, as titulações de alguns dos indivíduos foram muito baixas. É interessante observar que a infecção por influenza, e pode ser a vacinação sazonal, realmente induz resposta de anticorpo endógena a esse epítopo de anticorpo universal. A imunização com esse epítopo universal e gerar uma resposta de anticorpo robusta pode induzir proteção eficaz. Planeja-se o teste dessa hipótese na proposta de fase II.

[0141] Além da resposta de anticorpo ao epítopo de célula B universal, também é planejada a avaliação da frequência de células T específicas para os epítopos de MHCI que foram identificados e caracterizados na proposta de fase I. Para alcançar essa tarefa, é proposta a síntese de tetrâmeros ou dextrâmeros com os epítopos específicos e PBL de triagem de indivíduos que foram expostos ao vírus influenza e receberam a vacinação de gripe sazonal. Há uma extensa experiência na análise de dextrâmero de MHC

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52/77 com o uso de epítopos de célula T derivadas de infecção de vírus da dengue. Foram triados vários pacientes soropositivos para o vírus da dengue com o uso de 3 dextrâmeros contendo epítopo de célula T específicos de HLA-A2. Os dextrâmeros foram sintetizados por Immudex (Fairfax, VA). As PBMCs foram purificadas do sangue integral e coradas com anticorpos anti-CD8 e dextrâmeros. As células coradas foram analisadas em citometria de fluxo de Guava e os dados positivos de porcentagem foram gerados com o uso do software Guavasoft InCyte. Quatro pacientes com três diferentes dados de dextrâmero específico de epítopo (NIQ, VTL, KLA) são mostrados na Figura 10. Todos os pacientes tiveram algum nível (0,5 % - 4 %) de células T CD8+ em circulação que se ligaram especificamente aos dextrâmeros de epítopo de célula T. Essas células T também foram estimuladas com peptídeos específicos em culturas a curto prazo in vitro e obteve-se dados de resposta de CTL específicos (Fig. 11). O PBL de paciente soropositivo de dengue que mostrou alta porcentagem de coloração de dextrâmero, p151 (Fig. 10) foi estimulado com peptídeos em cultura por 7 dias. As células T ativadas foram avaliadas quanto à função de CTL por coloração intracelular de análise de citometria de fluxo e produção de IFNy. Como mostrado na Figura 11, a atividade de CTL foi significativa (0,7% - 1,1 %) contra alvos carregados com peptídeo individual (NIQ pep, KLA pep, VTL pep) assim como alvos infectados de sorotipo de vírus da dengue 2 (DV2) (NIQ DV2, KLA DV2, VTL DV2). Os dados de dextrâmero e análise de CTL podem não ser diretamente comparáveis, entretanto, é interessante observar que as células positivas de dextrâmero são capazes de ser reativadas com epítopos específicos e os CTLs são funcionais no reconhecimento de células infectadas por vírus.

[0142] Para explorar a ativação de ambas as respostas de vírus específicos de célula T CD4 e CD8, é proposta a síntese dos epítopos identificados de célula T CD8 aninhados com peptídeo de 15mero estendido contendo sequências endógenas. Esses peptídeos mais longos têm o potencial de estimular células T CD4+. Para avaliar a eficácia de tal peptídeo

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53/77 mais longo para induzir a ativação de CTL, foi testado um epítopo de célula T CD8 de modelo bem caracterizado de ovalbumina (SIINFEKL) (48). Foi sintetizado um peptídeo estendido incluindo três resíduos de aa flanqueantes endógenos tanto na terminação N quanto na terminação C de SIINFEKL (QLE SIINFEKL TEW) e avaliou-se o peptídeo mais longo para ser processado e apresentar o epítopo CD8 para a ativação de célula T.

[0143] Como demonstrado na Figura 12A e B, quando o peptídeo estendido contendo epítopo de H2KB de ovalbumina de modelo e processado e apresentado pelas APCs (células de LK^b) (Fig. 12A) e o reconhecimento e ativação de célula T foram alcançados (Fig. 12B) indicando que o peptídeo mais longo aninhado ao epítopo CD8 é capaz de ser processado e ativar células T. Embora a apresentação do epítopo CD8 tenha sido inferior em células de LK^b pulsadas de Ext SUN em comparação com o carregamento de peptídeo livre, que foi esperado visto que a Ext SUN exige internalização e processamento adicional, a ativação de células T foi equivalente em APC pulsada com Ext SUN, que é mais crítica. A suposição é que esses peptídeos mais longos também atuem como peptídeo auxiliar in vivo para ativação de CTL e célula B potente para resposta de vacina anti-influenza.

Validação de segurança de entrega de nanopartícula [0144] Embora as composições de vacina de GNP nunca tenham sido testadas em serem humanos, as mesmas já foram avaliadas em um estudo clínico de fase I quanto à segurança e a entrega de peptídeo de insulina em voluntários saudáveis demonstrando boa segurança até o momento. Além disso, estudos anteriores de segurança in vivo e in vitro indicam que as partículas são seguras em concentrações muito altas em estudos toxicológicos de animais de grande porte. Todos os componentes individuais das nanopartículas são sintéticos e não mostraram toxicidade quando administrados individualmente. A segurança das formulações de GNP foi testada em estudos in vitro com o uso de várias linhagens celulares de câncer, sangue integral e mucosa bucal humana para proliferação celular, liberação de citocina e

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54/77 citotoxicidade sem efeitos adversos observados. Vários modelos de tumor de metástase e vacina foram usados para realizar estudos de toxicologia usando as formulações de vacina de nanopartícula sem toxicidade detectada. Além disso, nenhuma toxicidade foi observada em estudos de imageamento de CSIS in vivo em um modelo de glioma de GL261 de cérebro de camundongo e estudos de vaso retinal. Os estudos de toxicologia de GLP foram realizados com as nanopartículas administradas de modo intravenoso diariamente aos camundongos por 5 dias consecutivos a uma dose teórica de 5,4 mg/kg sem sinal clínico de toxicidade na urina, excreções fecais ou nos órgãos, incluindo o cérebro, fígado, rim, coração, baço e pulmão.

Conclusão geral do trabalho anterior [0145] O trabalho apresentado nesta seção destaca a natureza versátil das GNPs como uma plataforma de entrega de vacina de múltiplos epítopos e as forças em análise imune de infecção viral. É particularmente relevante para esse estudo a extensa experiência com análise de peptídeo associado a MHC, identificação de epítopo de célula T e caracterização de epítopos para funções de célula T em sistemas de entrega de vacina (49-52). Com base no trabalho preliminar sobre câncer (53,54) e doenças infecciosas incluindo influenza (34) e dengue (55), acredita-se que a conclusão do projeto proposto será bem-sucedida. É importante observar que a plataforma de entrega de vacina e as metodologias de identificação de epítopo de célula T são amplamente aplicáveis a outras doenças infecciosas também.

Métodos

Análise de frequência de CTL [0146] As amostras de Buffy coat de indivíduos saudáveis positivos para HLA-A2 ou A24 que receberam a vacinação de gripe sazonal serão adquiridas junto à Research Blood Components LLC (Brighton, MA). É proposta a avaliação de 6-10 pacientes. Construtos de tetrâmero (Proimmune) e dextrâmero (Immudex) de MHC de peptídeo cp, peptídeos específicos de HLA-A2 e A24 serão obtidos. As PBMCs serão purificadas a partir

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55/77 de buffy coats seguindo os métodos-padrão. As PBMCs serão coradas com construtos de tetrâmero (56) ou dextrâmero (57) seguindo o protocolo do fabricante. As células serão cocoradas com conjugado de FITC de anticorpo antiCD8. As células coradas foram analisadas em citometria de fluxo de Guava (Millipore) e os dados positivos de porcentagem foram gerados com o uso do software Guavasoft InCyte (Fig. 10). As células duplamente coradas serão enumeradas como PBMC totais por cento. Os tetrâmeros ou dextrâmero de peptídeo irrelevantes, da prateleira, serão usados como controles negativos.

Ativação de memória e CTL puro [0147] Para a ativação de células T puras, o sangue periférico de doadores saudáveis positivos de HLA-A2 ou A24 (adquiridos junto à Research Blood Components, LLC. Brighton, MA) serão obtidos. As células mononucleares de sangue periférico (PBMC) serão purificadas com o uso de meio de separação de linfócito (Mediatech) usando centrifugação diferencial seguindo os métodos-padrão. As PBMC serão dispostas em placas em meio de 1640 RPMI completo durante a noite. As células não aderentes serão removidas e poupadas. As células aderentes plásticas serão pulsadas com 50 pg/ml de peptídeo sintético e 1,5 pg/ml de 32-microglobulina humana (EMB Biosciences, Gibbstown, NJ) em meio completo para 2 h. As células não aderentes, então, serão adicionadas de volta em 5 ml de meio completo suplementado com IL-7 a 5 ng/ml, Fator Estimulante de Colônia de Monócito de Granulócito (GM-CSF) a 25 ng/ml e IL-4 a 50 ng/ml (todas as citocinas e fatores de crescimento foram adquiridos junto à Peprotech, Rocky Hill, NJ). As placas serão incubadas a 37 °C em um incubador umidificado com 5 % de CO2 por 12 dias. As células T serão re-estimuladas uma vez com PBMCs com redução de célula T CD4+/CD8+ autóloga pulsadas com peptídeo sintético a 10 pg/ml e 1,5 pg/ml de β2microglobulina humana em meio completo contendo 5 ng/ml de IL-7 e 10 U/ml de IL-2 por 5 dias. A re-estimulação será repetida três vezes antes do uso nos ensaios de CTL. Os ensaios de CTL serão realizados com o uso de células T2 carregadas com peptídeo e células-alvo infectadas com diferentes cepas de

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56/77 influenza como descrito na publicação (34). Para a ativação de célula T de memória, as PBMCs serão ativadas uma vez com as APCs pulsadas de peptídeo como acima, antes dos ensaios de CTL (Fig. 11).

[0148] A liberação de interferon-γ (IFN-γ) e granzima B estimulados com antígeno como uma medida de ativação de CTL será ensaiada nos respectivos ensaios de ELISPOT (58, 59). As células T2 pulsadas com peptídeo, junto com células T2 pulsadas com peptídeo de HLA-A2 irrelevante (1 microg/ml de peptídeo por 2 h a 37 °C) serão usadas como controles junto com as células infectadas com influenza e não infectadas como alvos. Além disso, a secreção de várias citocinas (IFN-gama, TNF-alfa, Granzima B) será avaliada por tecnologia de MagPix Luminex (Millipore). Os controles adequados, incluindo T2s e PHAs não pulsadas com peptídeo, para estimular indução de IFN-gama não específica pelos CTLs como controles negativos e positivos serão incluídos em todos os ensaios.

Resposta de anticorpo específico de M2e [0149] As amostras de soro de indivíduos saudáveis que receberam a vacinação de gripe sazonal serão usadas para analisar a presença de epítopo de anticorpos específicos de M2e conservado usando técnicas de ELISA padrão (Fig. 9). Adicionalmente, as amostras de soro serão usadas para medir o reconhecimento do epítopo de anticorpo de M2e na superfície de células infectadas. As células de HepG2 serão infectadas com vírus PR8, X31 e JAP como descrito anteriormente (34). Após a incubação durante a noite, as células serão coradas com amostras de soro a uma diluição de 1:50 seguida por anticorpo secundário de IgG anticamundongo identificado com FITO (Invitrogen). As amostras serão analisadas com o uso de um software de citometria de fluxo de Guava e GuavaSoft InCyte.

Formular NPs com peptídeo mais longo aninhado ao epítopo CD8 e caracterizar ambas as respostas de CD4 e CD8 in vitro e in vivo [0150] A imunidade mediada por célula (CMI), como gerada por linfócitos T citotóxicos CD8+ (CTLs) restritos a classe I de complexo

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57/77 de histocompatibilidade maior (MHC), desempenha uma função central no controle da infecção por vírus influenza (60-63) (6). O CMI gerado por infecção por influenza primária fornece proteção substancial contra vírus sorologicamente distintos devido ao reconhecimento de epítopos de reação cruzada, frequentemente de proteínas virais internas conservadas entre subtipos virais (64-66). Sobretudo, além da função de CTLs na mediação de folga viral (67, 68), as células T CD8+ em seres humanos mostraram ter respostas de reação cruzada e memória (15-17) agudas (25) a diferentes subtipos de vírus influenza A. Os estudos de infecção de Influenza em camundongos revelaram que a folga viral é mediada por células T efetoras de CD8+ específicas ao antígeno, enquanto as células T CD4+ de memória são importantes na manutenção de respostas de memória de célula T e B CD8+ (69). Recentemente, tanto as células T CD4+ e CD8+ efetoras foram implicadas no controle de inflamação pulmonar e limitam os danos excessivos ao tecido através da produção de interleucina-10 (70). Uma função protetora potencial para células T CD4+ foi sugerida por estudos in vitro demonstrando a reatividade contra cepas não encontradas anteriormente, por exemplo, contra H5N1 aviária por células T CD4+ preparadas com cepas sazonais (71-74). No contexto de pandemias em que não há anticorpos protetores pré-existentes, as células T podem mediar a proteção ou limitar a gravidade de doença associada à influenza em seres humanos (75). As respostas de célula T pré-existentes mostraram modular a gravidade de influenza no contexto de anticorpos existentes (15). Recentemente, Wilkinson et al. investigou a função de CMI na limitação de influenza com o uso de peptídeos de ativação de CD4 estendidos derivados das regiões conservadas de genoma de influenza em um modelo de estímulo humano em voluntários saudáveis desprovidos de imunidade humoral detectável para as cepas de estímulo e demonstraram amplo espectro de proteção (28). Curiosamente, em alguns casos, esses peptídeos estendidos aninhados anteriormente relataram epítopos de classe I de MHC que ativam respostas de célula T CD8+(28, 34). À luz da função significativa das respostas de célula T positivas de CD4 e CD8 na

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58/77 proteção contra a infecção por influenza, é proposta a formulação da vacina com os epítopos identificados de célula T CD8 aninhados nos peptídeos estendidos que tem o potencial para ativar células T CD4+. Nesse objetivo, sintetizam-se peptídeos estendidos através da inclusão de três resíduos de aa flanqueantes endógenos tanto na terminação N quanto na terminação C dos epítopos de A2 e A24. Esses peptídeos estendidos serão formulados em nanopartículas de ouro e testados quanto às respostas de célula T positivas para CD4 e CD8 in vitro com PBMCs humanas e in vivo em camundongos transgênicos de A2 quanto às respostas de CTL.

Preparação de nanopartículas com epítopos [0151] Tanto os peptídeos de CD8 quanto CD4 estendido (Tabela 4) serão derivados no estágio de síntese para conter um ligante alifático/polietileno misturado acoplado a um dipeptídeo clivável por catepsina B que é contíguo aos epítopos de peptídeo selecionados. Os conjugados de peptídeo são incorporados nas nanopartículas por uma única etapa, reação química por autoassociação, que resulta em nanopartículas com núcleos de metal de ouro de ~1,6 nm e uma corona de aglutinante misturada decorada com glicose e dois-cinco espaçadores de carbono como descrito anteriormente (35). As misturas de peptídeo (0,94 mg cada, 0,35 micromol) serão dissolvidas em TFA (20 microL) e a solução será concentrada sob uma corrente de argônio até a formação de um óleo. MeOH será adicionado (1250 microL) e a reação será submetida a vórtice por 20 segundos. Glc-aglutinante (1,34 mg, 5,60 micromol) e GlcNHAc-aglutinante (1,23 mg, 4,37 micromol), então, serão adicionados à solução de metanol e o pH será ajustado a 2 com TFA (2 microL). Uma solução aquosa de HAuC14 (300 microL, 7,5 micromol) será adicionada e a solução submetida a vórtice por 20 segundos. Uma alíquota de 50 microL será tomada para análise adicional do teor de ouro. Uma solução aquosa de IN de NaBH4 (165 microL, 165 micromol) será adicionada à solução restante em várias porções com agitação rápida. A suspensão preta que se forma será agitada e peletizada por centrifugação. O pélete, então, será

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59/77 dissolvido em água e dialisado. A razão dos diferentes aglutinantes na superfície de nanoaglomerado será avaliada comparando os espectros de 1H RMN das misturas iniciais, as NPs formadas e os licores-mãe recuperados após o processo de automontagem como descrito anteriormente (35).

epítopo CD8	Epítopo estendido (epítopo CD4 potencial	Proteína	Motivo de HLA
YINTALLNA	kgvYINTALLNAsca	polimerase PA	A2
PVAGGTSSIYI	rflPVAGGTSSIYIevI	polimerase PB2	A2
TVIKTNMI	igvTVIKTNMInnd	polimerase PB1	A2/A24
AIMDKNIIL	mdqAIMDKNIILkan	Proteína não estrutural 1	A2/A24
ITFHGAKEI	krelTFHGAKEIsIs	Proteína de matriz 1	A2/A24
AINGITNKV	tqnAINGITNKVnsv	Hemaglutinina	A2/A24

Tabela 4: Os epítopos CD8 e os epítopos CD4 potenciais estendidos. É mostrada uma restrição de HLA para o epítopo CD8.

Avaliação de respostas de célula T CD4+ e CD8⁺específicas de epítopo in vitro [0152] É proposta a avaliação da capacidade das formulações de vacina de nanopartícula para ativar respostas de célula T CD4⁺e CD8⁺ específicas. As PBMCs serão isoladas dos doadores como descrito acima e pulsadas com a formulação de vacina de NP ou, como um controle, peptídeos sintéticos em separado. As células T específicas de epítopo serão purificadas por meio de seleção positiva com o uso de microesferas conjugadas a anticorpos de CD4 ou CD8 (Dynabeads, Invitrogen), separadas das microesferas (DetahABead, Invitrogen) e usadas em aplicações a jusante. As células T CD4⁺ ou CD8+ específicas de epítopo recém-purificadas serão cultivadas durante a noite com células apresentando antígeno que são pulsadas com peptídeos relevantes ou infectadas com diferentes cepas de vírus influenza

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60/77 (PR8, X31, JAP). A ativação de célula T será avaliada de três formas: 1) Ensaio de ELISpot de IFN-gama, 2) secreção de citocina como detectado por tecnologia de MagPix Luminex (IFN-gama, TNF-alfa, Granzima B, IL-2) e, para respostas de célula T CD8⁺, 3) citometria de fluxo detectando a expressão do marcador de desgranulação CD107a em células T CD8+. Em todos os experimentos, as APCs não infectadas e não pulsadas serão usadas como controles negativos.

[0153] Resultado esperado e desafios técnicos: É previsto que as formulações de NP induzam respostas de célula T CD4+ e CD8+ mais robustas do que o peptídeo em separado e que essas células T reconheçam células-alvo infectadas com cada uma das diferentes cepas de vírus influenza. Entretanto, é possível observar que os peptídeos estendidos não ativam células T CD4 de modo eficaz. Nesse caso, é possível expandir os comprimentos de peptídeo para incorporar mais resíduos ou adicionar epítopos de célula T CD4 validados diretamente na formulação. Não são previstos problemas com os experimentos em si, visto que há extensa experiência com as técnicas propostas, incluindo infecção por vírus influenza. Se qualquer uma das acima técnicas se tornar problemática, por exemplo, devido a um problema de número de células, é possível usar citometria de fluxo de múltiplos parâmetros para avaliar níveis internos de citocinas-chave (IFN-g, TNF-alfa, Granzima B) para identificar células T CD4 e CD8+ ativas em uma única cultura.

Avaliação de respostas de célula T CD8⁺ específicas de epítopo in vivo [0154] Os estudos de camundongo transgênico de HLA-A2 e A24 (Taconic, Hudson, NY) serão terceirizados para Lampire Biologies Laboratories (Pipersville, PA). Brevemente, os camundongos fêmeas entre 4-8 semanas de idade serão imunizados com 10 pg de cada formulação de vacina contendo os peptídeos estendidos em dois locais: i.d. na base da cauda e s.c. no flanco. Como controles, os camundongos serão imunizados com PBS ou peptídeo + adjuvante de montanídeo. Todos os camundongos serão imunizados três vezes, cada: nos dias 0,10 e 30. Sete dias após a imunização final, os baços

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61/77 serão coletados, esmagados entre lâminas de vidro congeladas estéreis e filtrados através de um filtro de malha de 0,45 μιτι para se obter suspensões de célula única. A suspensão de célula única será usada para purificar as células T CD8+ por meio de seleção negativa. As células serão usadas imediatamente nos mesmos ensaios durante a noite descritos acima na seção in vitro·. ELISpot, secreção de citocina, e citometria de fluxo para detectar a desgranulação. Além dos ensaios funcionais, as especificidades de célula T CD8+ serão avaliadas com o uso de tecnologia de tetrâmero de MHC-I como descrito no Objetivo 1.

[0155] Resultado esperado e desafios técnicos: Espera-se que se observe a ativação de células T específicas ao antígeno de peptídeo in vivo nos camundongos imunizados. Ademais, é previsto que os camundongos imunizados com as formulações de NP tenham uma resposta de célula T mais robusta em resposta às APCs pulsadas com peptídeo ou infectadas em comparação com grupos de PBS ou peptídeo + montanídeo. Se for observado que alguns dos peptídeos não induzem uma resposta nesses camundongos é possível emendar as formulações de vacina com epítopos conservados adicionais de uma maneira direta. Há extensa experiência com os modelos transgênicos de HLA-A2 e HLA-A24, portanto, não são previstos quaisquer problemas no uso desses sistemas de modelo de camundongo transgênico.

Avalição de proteção in vivo das formulações de vacina de NP em modelo de estímulo de vírus usando camundongos transgênicos de HLAA2 e A24 [0156] Fundamentação: Para que uma vacina seja considerada eficaz, a mesma deve reduzir significativamente tanto a duração quanto a gravidade de uma doença, se não prevenir completamente que um patógeno estabeleça uma infecção. As vacinas contra patógenos de múltiplas cepas, como o vírus influenza, serão significativamente aprimoradas se uma ampla proteção contra a maioria das cepas puder ser induzida. Nesse objetivo, é testada diretamente a formulação de vacina de NP contendo epítopos de célula

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T e B em um modelo de estímulo de vírus e determinado se essa vacina pode reduzir a morbidez e a mortalidade contra duas cepas de influenza diferentes. Será realizado um estudo completo com o modelo de camundongo transgênico de HLA-A2 e, se for bem-sucedido, serão repetidos os estudos de estímulo de perda de peso e letal no modelo de camundongo transgênico de HLA-A24.

[0157] Métodos: Para avaliar a proteção in vivo após a imunização de vacina de NP, será usado um modelo de estímulo de influenza estabelecido pelo colaborador Dr. Peter Katsikis, Drexel University (76). As cepas de camundongo transgênico de HLA-A2 (Taconic, Hudson, NY) serão usadas para avaliar a proteção induzida pelas vacinas formuladas de NP contendo epítopos de célula T e B específicos de vírus influenza. Brevemente, é planejado o uso de camundongos fêmeas e o teste da programação de vacinação proposta de 3 imunizações (dias 0, 10 e 30). Os camundongos serão imunizados com 10 pg de cada formulação de vacina de NP de peptídeo em dois locais: i.d. na base da cauda ou s.c. no flanco. Como controles, os peptídeos com e sem adjuvante (Montanide ISA 51) também serão administrados.

[0158] Após a vacinação, serão abordadas inúmeras questões importantes. A vacinação de NP 1) induz uma resposta de CTL secundária robusta mediante o estímulo de vírus influenza, 2) reduz cargas virais ou acelera a folga viral, 3) protege da morbidez induzida por uma infecção por vírus influenza subletal e 4) protege contra um estímulo letal com uma cepa virulenta de vírus influenza? Para os estudos de morbidez, serão estimulados animais vacinados 45 dias após a imunização, com uma dose subletal do vírus influenza A PR8 infeccioso (H1N1, A/Puerto Rico/8/34). Os camundongos serão infectados i.n. e a morbidez será avaliada por dois meios, peso corporal e patologia pulmonar induzida por vírus. As alterações no peso corporal serão monitoradas através da pesagem de camundongos diariamente ao longo do curso de 14 dias a partir do dia do estímulo de vírus (76, 77). Serão usados n=9 animais por grupo (consultar seção de animal vertebrado de proposta para análise de potência). Esses números serão realizados em três experimentos

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63/77 independentes. Com base em dados preliminares, quando a perda de peso de animais tipo selvagem do dia 8-10 pós-infecção for comparada com o dia 0, ο tamanho de efeito é 20,4 %. O tamanho de efeito para a suposição de uma redução de 50 % de perda de peso de camundongos vacinados, o tamanho de efeito é de 10,2 %. Tal diferença no tamanho de efeito (□) com um desvio padrão (□) de ~5,2 % exigiría 6 animais por grupo, para alfa=0,05 a 80 % de potência e teste de duas caudas. Visto que uma infecção pode nem sempre ser gerada ou animais podem ser perdidos devido à anestesia ou infecção, são usados 9 camundongos por grupo experimental para assegurar que haverá números adequados de animais.

[0159] Após a infecção de PR8, a patologia e inflamação pulmonar induzidas por vírus serão avaliadas. Nos dias 6 e 10 pósinfecção, os camundongos serão sacrificados e os pulmões coletados. Os pulmões serão usados para patologia e alguns lóbulos serão usados para preparar as suspensões de célula única digeridas por colagenase + DNAse. As suspensões de célula única serão usadas para quantificar números absolutos de células T CD4+, células T CD8+, células NK, células B, DC, macrófagos e granulócito infiltrando os pulmões. Adicionalmente, o perfil de ativação dessas células será examinado com citometria de fluxo manchando-se suspensões celulares para CD25, CD69, CD80/86 e MHC-classe II. Além disso, será avaliada a patologia pulmonar. Ambas as alterações patológicas brutas baseadas em tamanho, aparência e cor dos pulmões e alterações histopatológicas avaliadas por coloração de hematoxilina e eosina serão avaliadas (78, 79). A patologia pulmonar irá permitir a avaliação da possibilidade de a vacinação ter protegido contra danos ao pulmão. A patologia pulmonar será avaliada histologicamente por mancha de H&E e pela equipe do Departamento de Patologia. Além das medições de morbidez, a carga viral nos pulmões será avaliada por PCR em tempo real ampliando o gene de matriz do vírus (76) nos dias 3, 6 e 10 pósinfecção.

[0160] É importante na avaliação de eficácia de

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64/77 vacina a determinação da possibilidade de respostas secundárias potentes são geradas pelo regime de vacina. Para avaliar se a vacinação de NP de múltiplos epítopos resulta em respostas secundárias robustas, será medida a resposta de célula T CD8+ e a resposta de anticorpo anti-M2e após a infecção por vírus influenza. Os pulmões e os baços serão coletados nos dias 3, 6 e 10 pósinfecção e as respostas de célula T CD8+ serão analisadas por tetrâmeros de MHC-classe I carregados de peptídeo e manchas de IFNy intracelulares estimuladas por peptídeo. O sangue será coletado no momento da coleta e os anticorpos de M2e de soro serão medidos por ELISA. A neutralização de anticorpos anti-influenza em soros será ensaiada com o uso de um ensaio de inibição de hemaglutinação.

[0161 ] Por fim, para assegurar que as formulações de vacina de NP podem proteger contra uma gama de vírus influenza e contra estímulo letal, será realizado um estímulo letal com IOxLDso de vírus influenza A Eq/lon (H7N7 A/Equine/london/1416/73), uma cepa que é altamente patogênica em camundongos (80, 81). Como ocorre com as infecções de PR8, s morbidez de peso corporal será monitorada como uma leitura de proteção. Em ambos os modelos virais, as respostas de célula B e T serão analisadas após o estímulo

i.n.. Para os estudos de estímulo letal com infecções de Eq/lon, são incluindo n=15 por grupo (consultar a seção de animal vertebrado da proposta para análise de potência). A análise de potência para uma probabilidade de sobrevivência de 0,6 (60 %) no grupo vacinado e 0,1 (10 %) no grupo de controle para um alfa de 0,05 a uma potência de 0,8 e uma razão de grupo de 1, exige um tamanho de amostra total de 30 animais (15 por grupo). Após o estímulo, os animais serão monitorados duas vezes diariamente por inspeção visual por sinais clínicos. Os animais serão sacrificados quando satisfizerem os seguintes critérios: 1) não responsivos à estimulação externa, 2) prostração por > 1 h, 3) respiração ofegante 4) tremores persistentes ou 5) curvatura persistente. Todas as observações serão registradas. Os animais que perderem > 25 % do peso serão removidos e serão contados como não sobreviventes na análise de

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65/77 sobrevivência. A morte não será um ponto final para esse estudo. (IACUC não permite como um ponto final).

Objetivo 4: Estudos de toxicologia e segurança [0162] Fundamentação: Embora as nanopartículas vazias e nanopartículas com peptídeo de insulina tenham sido avaliadas quanto à segurança em estudos clínicos humanos (os estudos preliminares), as NPs com quaisquer epítopos antigênicos não foram testadas quanto à segurança em seres humanos. Visto que esses epítopos são específicos para moléculas HLAA2 e A24 humanas e têm funções biológicas específicas associadas às respostas imunes humanas, é crítico avaliar, também, a segurança da formulação de vacina em um modelo de animal relevante. Como descrito acima, o modelo de camundongo transgênico de HLA é amplamente usado para avaliar a eficácia in vivo de formulações de vacina à base de epítopo. Nesse objetivo, será avaliada a segurança das nanopartículas usando esses modelos de camundongo transgênicos.

[0163] Métodos: A formulação de vacina de nanopartícula será administrada em várias doses (até 10X da dose de vacina do objetivo 3) por 5 dias cecutivos de modo intradérmico, subcutâneo ou intravenoso. O volume administrado será de 100 μΙ/animal. Os pesos corporais e o consumo de alimento serão monitorados ao longo de períodos de 48 horas. As amostras de urina e de fezes serão coletadas ao longo de períodos de 24 horas em diferentes pontos no tempo durante o estudo e a urine e as fezes totais para cada animal serão coletadas e pesadas em temperatura ambiente e armazenadas a -80 ± 10 °C. As amostras de sangue serão obtidas em momentos pré-estabelecidos e coletadas em tubos de K3 de EDTA e mantidas em um banho gelado até a centrifugação (3500 rpm, 10 minutos, 4 °C). O plasma obtido, então, será congelado a - 80 ± 10 °C. Após a extração sanguínea, os animais serão sacrificados para obter as seguintes amostras de tecido: cérebro, fígado, rim, coração, baço e pulmão. As amostras de tecido serão pesadas e congeladas instantaneamente em nitrogênio líquido e, então, armazenadas em -80 ± 10 °C.

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A análise toxicológica das amostras de sangue e tecido será realizada e todos os dados serão analisados quanto à significância estatística. A análise química sanguínea será realizada com as amostras sanguíneas coletadas. Os marcadores para função do fígado (alanina transaminase, aspartato aminotransferase, albumina, fosfatase alcalina, bilirrubina total e direta e lactato desidrogenase), função renal (nitrogênio de ureia sanguínea, creatinina, ácido úrico e proteína total) e função cardíaca (aspartato aminotransferase e lactato desidrogenase) serão avaliados. Além disso, os painéis de marcadores para alergia (contagens de eosinófilos, globulina, linfócito e monócito) e transtornos de hematologia (contagens de hemoglobina, hematócrito, RBC e WBC) também serão incluídos no teste. As amostras de tecido também serão investigadas quanto ao acúmulo de partícula de ouro por microscopia de elétron de transmissão (TEM) (82, 83).

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composição de vacina caracterizada por compreender um peptídeo de vírus influenza que compreende um epítopo de célula T CD8+ e um peptídeo de vírus influenza que compreende um epítopo de célula B, em que cada peptídeo é unido a uma nanopartícula.
2. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a nanopartícula é uma nanopartícula de ouro, uma nanopartícula de fosfato de cálcio ou uma nanopartícula de silício.
3. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o peptídeo de vírus influenza que compreende um epítopo de célula T CD8+ e o peptídeo de vírus influenza que compreende um epítopo de célula B são unidos à mesma nanopartícula.
4. Composição de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que o peptídeo de vírus influenza que compreende um epítopo de célula T CD8+ é unido à nanopartícula por meio de um ligante e/ou o peptídeo de vírus influenza que compreende um epítopo de célula B é unido à nanopartícula por meio de um ligante.
5. Composição de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que o peptídeo de vírus influenza que compreende um epítopo de célula T CD8+ compreende um ou mais dentre os peptídeos apresentados em SEQ ID NOs: 1 a 21.
6. Composição de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que o epítopo de célula B é um epítopo de proteína de matriz 2 (M2e) de influenza.
7. Composição de vacina caracterizada por compreender um peptídeo de vírus influenza que compreende um ou mais dos epítopos de célula T CD8+ apresentados em SEQ ID NOs: 1 a 21, em que o peptídeo é unido a uma nanopartícula.
8. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação

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7, caracterizada pelo fato de que a nanopartícula é uma nanopartícula de ouro, uma nanopartícula de fosfato de cálcio ou uma nanopartícula de silício.
9. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação

8, caracterizada pelo fato de que o peptídeo de vírus influenza que compreende um epítopo de célula T CD8+ é unido à nanopartícula por meio de um ligante.
10. Composição de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada por compreender dois ou mais peptídeos de vírus influenza, cada um compreendendo um epítopo de célula T CD8+ diferente.
11. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que os dois ou mais peptídeos de vírus influenza são dois ou mais dos peptídeos apresentados em SEQ ID NOs: 1 a 21.
12. Composição de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada por compreender adicionalmente um peptídeo de vírus influenza que compreende um epítopo de célula T CD4+.
13. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação

12, caracterizada pelo fato de que o peptídeo de vírus influenza que compreende um epítopo de célula T CD4+ é unido a uma nanopartícula.
14. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação

13, caracterizada pelo fato de que a nanopartícula à qual o peptídeo de vírus influenza que compreende um epítopo de célula T CD4+ é unido é uma nanopartícula de ouro, uma nanopartícula de fosfato de cálcio ou uma nanopartícula de silício.
15. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizada pelo fato de que o peptídeo de vírus influenza que compreende um epítopo de célula T CD4+ é unido à nanopartícula por meio de um ligante.
16. Composição de vacina, de acordo com qualquer uma

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3/4 das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que o peptídeo de vírus influenza que compreende um epítopo de célula T CD8+ compreende adicionalmente um epítopo de célula T CD4+.
17. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que o peptídeo de vírus influenza que compreende um epítopo de célula T CD8+ e um epítopo de célula T CD4+ compreende um ou mais dentre os peptídeos apresentados em SEQ ID NOs: 22 a 27.
18. Composição de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada por compreender pelo menos dois peptídeos de vírus influenza que compreendem um epítopo de célula T CD8+ que, cada um, interage com um supertipo de HLA diferente.
19. Composição de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada por compreender pelo menos um peptídeo imunogênico que interage com pelo menos dois supertipos de HLA diferentes.
20. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizada pelo fato de que os pelo menos dois supertipos de HLA diferentes são selecionados a partir de HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLAA24, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B27, HLA-B44, HLA-B58 e HLA-B62.
21. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que os pelo menos dois supertipos de HLA diferentes são HLA-A2 e HLA-A24.
22. Método de prevenção ou tratamento de uma infecção por vírus influenza caracterizado por compreender administrar a composição de vacina, conforme definido em qualquer uma das reivindicações anteriores, a um indivíduo infectado com ou em risco de ser infectado com um vírus influenza.
23. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o vírus influenza é um vírus influenza

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4/4 pandêmico.
24. Composição de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizada por ser para uso em um método de prevenção ou tratamento de uma infecção por vírus influenza em um indivíduo.
25. Composição de vacina para uso, de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que o vírus influenza é um vírus influenza pandêmico.