CN105367624A - 一种LLVV-Hemorphin-6肽的制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种LLVV-Hemorphin-6肽、制备方法和用途。所述的LLVV-Hemorphin-6肽具有如下结构：

Description

一种LLVV-Hemorphin-6肽的制备方法和用途
技术领域
本发明属于医药化学领域，具体涉及一种LLVV-Hemorphin-6肽及制备方法及用途，特别是涉及通过具有底物专一性的蛋白酶特异性酶解血红蛋白的方法制备一种LLVV-Hemorphin-6肽，以及此多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
生物活性肽(Biologicalactivepeptides)是源于蛋白质的多功能化合物，由蛋白质中25个天然氨基酸以不同组成和排列方式构成的从二肽到复杂的线性、环形结构的多肽的不同肽类。生物活性肽具有涉及神经、激素以及免疫调节、抗高血压、抗细菌、抗癌、抗氧化、清除自由基和改善食品风味等功能，成为医药以及食品研究的一个热点。
动物血液是生物活性肽的来源之一，通过生物蛋白酶解技术可以将血红蛋白水解成小分子肽。研究表明血红蛋白源生物活性肽具有一系列重要的功能活性，如阿片样活性、ACE抑制活性、增强血管舒缓激肽活性、刺激细菌生长活性、镇痛活性、抗菌活性、以及抗氧化活性等。
阿片样活性肽(opioidpeptide)一般为含有X-Tyr-Phe、Tyr-X-X-Phe或Tyr-X-X-Tyr的氨基酸片段的小肽，其具有吗啡样活性，在镇痛、调节人体情绪、脉搏、呼吸和体温等方面具有明显功能。VadimT.Ivanov和VladimirZ.Pletnev等研究发现在牛下丘脑、小脑、海马体等部位发现了具有阿片活性小肽YPWTQ，这和血红蛋白β链33-40位的氨基酸序列一致，因此将具有YPWTQ片段的活性肽称为Hemorphin肽。近年来，从血红蛋白中提取出此种阿片活性样肽成为了科学家的研究热点。
Hemorphin是在血液中发现的一类天然产生的内源性阿片肽，来自于血红蛋白的β链。它通过阿片受体激活具有镇痛功能，通过对血管紧张素转换酶(ACE)的抑制作用具有血压调节功能，此外还可以提高脑啡肽的含量。J.M.Piot等利用胃蛋白酶和组织蛋白酶D处理血红蛋白，利用蛋白凝胶色谱从水解物中提取出两种具有阿片样活性的多肽，LVV-Hemorphin-7(LVVYPWTQRF)和VVHemorphin-7(VVYPWTQRF)。利用反向高效液相色谱检测了胃蛋白酶水解物中两种阿片样活性肽的酶解动力学曲线，发现酶解时间不同、体系内产生的活性多肽的结构不同，而且随着酶解时间的延长会导致已产生的活性肽被再次酶解，造成了酶解产物的不确定性，为了得到最终的产品，只能通过凝胶色谱分离产品，但是因为操作麻烦且产量低，无法规模化生产。
本发明选择具有高度底物专一性的蛋白酶，特异性酶解血红蛋白，再通过分离提纯等方法得到结构单一的LLVV-Hemorphin-6肽，并将此多肽联合5-氟尿嘧啶用于肿瘤类疾病的治疗取得了意想不到的效果，不仅抗肿瘤活性优于两种药物单独使用，而且优于两者的直接加合效果。本发明的LLVV-Hemorphin-6肽具有制备工艺稳定，纯度高，重现性好，与抗肿瘤5-氟尿嘧啶联合应用协同增效的特点，有望成为临床上治疗肿瘤类疾病的辅助用药。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种LLVV-Hemorphin-6肽。
本发明的第二个目的是提供一种LLVV-Hemorphin-6肽的制备方法，为此本发明选用具有高度底物专一性的蛋白酶，蛋白水解过程中只在肽链的精氨酸残基的羧基端断裂，特异性酶解血红蛋白，得到含有目标肽的蛋白水解液，通过分离提纯等方法得到结构单一的LLVV-Hemorphin-6肽。
本发明的第三个目的是提供一种LLVV-Hemorphin-6肽作为抗肿瘤辅助用药的用途。
本发明的目的主要通过以下技术方案实现：
一种LLVV-Hemorphin-6肽，具有肽链的氨基酸序列见下式：
LLVV-Hemorphin-6
Leu-Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg
一种LLVV-Hemorphin-6肽的制备方法是将蛋白酶溶于含有小分子巯基化合物以及氯化钙的缓冲溶液中活化；血红蛋白溶于缓冲溶液中，浓度为1～50mg/mL；将血红蛋白和经过活化的蛋白酶溶液以一定比例混合，4～55℃下酶解反应4～30小时，得到蛋白酶解液；经过一系列分离方法，从蛋白酶解液中分离出目标肽。
本发明中所用的蛋白酶为具有底物专一性特性的蛋白酶，酶解时肽键断裂部位为肽链上精氨酸残基的羧基端，如clostripain、Falcipain、GingipainR或树脂固定化的clostripain酶等。本发明中蛋白酶的活化是在包含有小分子巯基化合物和氯化钙的缓冲溶液中进行；酶活化时，浓度为0.2～10mg/mL；4～37℃活化一段时间。本发明中蛋白酶解时底物蛋白浓度为1～50mg/mL，以2～25mg/mL为最佳。本发明中蛋白酶解时温度为4～55℃，以37～50℃为最佳。经过检测，本发明得到的LLVV-Hemorphin-6肽纯度在82～95wt％之间，得到的多肽产品分子量为1274Da。
一种LLVV-Hemorphin-6肽在制备抗肿瘤辅助用药中的应用，特别是与5-氟尿嘧啶联用用于治疗临床上的各种肿瘤，如：肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌等。
本发明和现有技术相比具有如下突出的技术优势：
(1)本发明得到了一种生物活性肽LLVV-Hemorphin-6肽，具有重要的医用价值。
(2)本发明采用蛋白酶酶解血红蛋白制备生物活性肽，充分开发和利用了目前利用度低的血红蛋白样品，具有尤为重要的经济效益和社会效益
(3)与传统酶解血红蛋白方法相比，本发明得到的酶解小肽的分子结构确定，不会因操作条件的变化而导致肽结构的差异，增强了产物活性肽结构的可控性。
(4)本发明目标肽的提取和纯化工艺简单，定向收集LLVV-Hemorphin-6肽片段，多肽纯度高达95％，工艺稳定、重现性好。
附图说明
图1为本发明实施例1蛋白水解液的高效液相色谱。
图2为本发明5-氟尿嘧啶的抗肿瘤实验结果。
图3为本发明实施例1-8制备的LLVV-Hemorphin6肽的抗肿瘤实验结果。
图4为本发明实施例1-8制备的LLVV-Hemorphin6肽和5-氟尿嘧啶联用的抗肿瘤实验结果。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步说明，其目的仅在于更好的理解本发明的内容而非限制本发明的保护范围：
实施例1
(1)蛋白酶的活化：蛋白酶clostripain3mg/mL溶于含有二硫苏糖醇和氯化钙的三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲溶液，4℃活化；
(2)血红蛋白溶于Tris缓冲溶液中，浓度为20mg/mL，将血红蛋白和经过活化的蛋白酶溶液混合，55℃酶解4小时；HPLC分析酶解液中组分及分子量，确定目标肽的出峰时间，结果见图1。
(3)从水解液中提取出LLVV-Hemorphin-6肽样品，冷冻干燥得到产品，高效液相色谱HPLC分析，体系中LLVV-Hemorphin-6含量为82％。
实施例2
(1)蛋白酶的活化：蛋白酶clostripain8mg/mL溶于含有二硫苏糖醇和氯化钙的Tris缓冲溶液，25℃活化；
(2)血红蛋白溶于Tris缓冲溶液中，浓度为1mg/mL，将血红蛋白和经过活化的蛋白酶溶液混合，4℃酶解30小时。
(3)从水解液中提取出LLVV-Hemorphin-6肽样品，冷冻干燥得到产品，HPLC分析，体系中LLVV-Hemorphin-6含量为85％。
实施例3
(1)蛋白酶的活化：蛋白酶clostripain0.5mg/mL溶于含有二硫苏糖醇和氯化钙的Tris缓冲溶液，30℃活化；
(2)血红蛋白溶于Tris缓冲溶液中，浓度为40mg/mL，将血红蛋白和经过活化的蛋白酶溶液混合，37℃酶解15小时。
(3)水解液中提取出LLVV-Hemorphin-6肽样品，冷冻干燥得到产品，HPLC分析，体系中LLVV-Hemorphin6含量为87％。
实施例4GingipainR蛋白酶水解血红蛋白
(1)GingipainR蛋白酶1mg/mL溶于Pga缓冲溶液中。
(2)血红蛋白5mg/mL溶于缓冲溶液中，将血红蛋白和蛋白酶溶液混合，保持温度为37℃，酶解10小时。
(3)从水解液中提取出LLVV-Hemorphin-6肽样品，冷冻干燥得到产品，HPLC分析，体系中LLVV-Hemorphin-6含量为82％。
实施例5Falcipain-2蛋白酶水解血红蛋白
(1)Falcipain-2蛋白酶溶于pH5.5、25mM的醋酸钠缓冲溶液中，溶液含有DTT、CaCl2以及EDTA。
(2)血红蛋白10mg/mL溶于缓冲溶液中，将血红蛋白和蛋白酶溶液混合，保持温度为37℃，酶解20小时。
(3)从水解液中提取出LLVV-Hemorphin-6肽样品，冷冻干燥得到产品，HPLC分析，体系中LLVV-Hemorphin-6含量为83％。
实施例6Clostripain酶固定化-交联剂交联法
称取1g活化的弱碱性氨基树脂于反应瓶中，加入pH为6.0的缓冲溶液，加入交联剂戊二醛或京尼平，使体系中交联剂的最终浓度为5％。40℃反应12小时，洗涤树脂，并重新分散在缓冲溶液中，加入酶溶液，4℃反应一段时间，洗涤树脂，检测酶的负载含量为60％。
实施例7Clostripain酶固定化-缩合法
称取1g活化的弱碱性氨基树脂于反应瓶中，加入pH为5.0的缓冲溶液，加入缩合剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，4℃放置30min。加入酶溶液，4℃反应，洗涤树脂，检测酶的负载含量为67.5％。
实施例8固定化酶水解血红蛋白
(1)称取负载酶的树脂0.5g，加入含有二硫苏糖醇和氯化钙的Tris缓冲溶液，4℃活化。
(2)血红蛋白溶于Tris缓冲溶液中，浓度为10mg/mL，将血红蛋白和树脂溶液混合，保持温度为37℃，酶解30小时。
(3)水解液中提取出LLVV-Hemorphin-6肽样品，冷冻干燥得到产品，HPLC分析，体系中LLVV-Hemorphin-6含量为85％。
实施例9LLVV-Hemorphin6肽的抗肿瘤活性的研究
由实施例1-8所得的LLVV-Hemorphin6肽的抗肿瘤的体外评价，包括如下步骤：
取对数生长的4T1细胞种96孔板，然后将孔板放入到细胞孵育箱中培养24小时。吸出孔中培养基，加入一系列的实验样本溶液。细胞培养48小时后，加入MTT检测试剂测试细胞存活率。
实验系列给药情况如下：
(1)加入1、8、15、40或100μM5-氟尿嘧啶，给药培养48小时
(2)加入0.0001、0.001、0.01、0.1、1或10μM肽溶液，给药培养48小时
(3)将1μM的肽溶液和1、15或40μM的5-氟尿嘧啶溶液同时加入96孔板，培养48小时。
实验结果见图2-4。从图中可知，肽溶液本身的细胞抑制率较低，在高浓度10μM时才存在一定的细胞抑制效果；当肽和5-氟尿嘧啶同时给药时，其细胞抑制效果优于单独的肽或者5-氟尿嘧啶给药时的细胞抑制效果，说明肽溶液和抗肿瘤药物同时给药时，肽和药物的协同作用能增强抗肿瘤药物的药效。

Claims (5)

1.一种LLVV-Hemorphin-6肽，其特征是具有肽链的氨基酸序列如下：
2.一种LLVV-Hemorphin-6肽的制备方法，其特征是将蛋白酶溶于含有小分子巯基化合物以及氯化钙的缓冲溶液中活化；血红蛋白溶于缓冲溶液中，浓度为1～50mg/mL；将血红蛋白和经过活化的蛋白酶溶液以一定比例混合，4～55℃下酶解反应4～30小时，得到蛋白酶解液；经过一系列分离方法，从蛋白酶解液中分离出LLVV-Hemorphin-6肽，所述LLVV-Hemorphin-6肽具有下述结构：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征是所述的蛋白酶为具有底物专一性特性的蛋白酶，酶解时肽键断裂部位为肽链上精氨酸残基的羧基端，如：clostripain、Falcipain、GingipainR或树脂固定化的clostripain酶等。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征是蛋白酶的活化是在包含有小分子巯基化合物和氯化钙的缓冲溶液中进行；酶活化时，浓度为0.2～10mg/mL，4～37℃活化一段时间；蛋白酶解时底物蛋白浓度为1～50mg/mL，以2～25mg/mL为最佳；蛋白酶解时温度为4～55℃，以37～50℃为最佳。
5.权利要求1所述的LLVV-Hemorphin-6肽在制备抗肿瘤辅助药物中的应用，特别是与5-氟尿嘧啶联用用于治疗临床上的各种肿瘤，如：肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌等。
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