KR20170116184A

KR20170116184A - 관절염의 예방과 치료를 위한 14-3-3 길항제

Info

Publication number: KR20170116184A
Application number: KR1020177027282A
Authority: KR
Inventors: 안토니 마로타; 애즈아이즈 게하리; 월터 월로디마이어 피터 맥시모와이치; 루핸기즈 킬라니
Original assignee: 더 유니버시티 오브 브리티쉬 콜롬비아
Priority date: 2007-11-27
Filing date: 2008-11-26
Publication date: 2017-10-18
Also published as: KR20180102215A; CA2706479C; IL254157B; KR20100100912A; IL205907A0; EP3192807A1; US20160185842A1; US20160039918A1; IL254157A0; CN101925364A; WO2009067820A1; JP5615181B2; EP2222704A1; JP2011504876A; IL205948A0; JP2014221758A; HK1253516A1; CN107880122A; US10995136B2; BRPI0819066A2

Abstract

본 발명은 세포외에서 국소화된 14-3-3 에타 및/또는 14-3-3 감마 단백질 아이소형에 특이적으로 결합할 수 있는 14-3-3 길항제들을 포함하는 관절염 치료 방법이 제공된다. 바람직한 실시예들에서, 14-3-3 길항제는 억제성 펩타이드 또는 안티-14-3-3 항체이다. 14-3-3 길항제들은 약학적 조성물에 제제화되며 환자의 활액에서 기질 메탈로프로테아제(MMP) 발현을 감소시키는 방법에 사용되며, MMP는 MMP-1 또는 MMP-3이다.

Description

관절염의 예방과 치료를 위한 14-3-3 길항제{14-3-3 Antagonists for the prevention and treatment of arthritis}

본 발명은 관절염에서 14-3-3 단백질들의 관여 및 관절염의 예방과 치료를 위한 조성물과 방법에 관한 것이다.

관절염 또는 관절통은 일반적으로 신체의 관절들의 염증성 질환을 의미하며 주로 통증, 붓기 및 뻣뻣함을 동반한다. 관절염은 감염, 외상, 퇴행성 질환, 대사이상, 또는 불안 또는 다른 공지되지 않은 병인들을 포함하는 여러 원인들 중 임의의 것으로 발생할 수 있다. 골관절염(OA)은 관절에 대한 외상 후, 관절의 감염 후 또는 단순히 노화의 결과로 발생할 수 있는 관절염의 일반적인 형태이다. 골관절염은 퇴행성 관절 질병으로 알려져 있다. 류마티스성 관절염(RA)은 면역시스템이 관절들을 공격하게 하는 만성 염증성 자가면역 질환으로 전통적으로 생각된다. 이것은 통증과 관절 파괴에 의해 이동의 상당한 손실을 일으킬 수 있는 무기력하고 고통스런 염증성 질환이다. 강직성 척추염(AS)은 척주와 천장관절에 주로 영향을 주어 궁극적으로 척주의 융합을 일으키는 만성, 통증성, 퇴행성 염증 관절염이다.

신체의 관절들은 윤활관절로 불리며 각각의 윤활관절은 일반적으로 두 개의 인접 뼈들의 대향하는 말단을 포함한다. 뼈들의 말단은 연골조직에 둘러싸인 반면 전체 관절 영역은 활액막을 포함하는 활막으로 불리는 보호 연조직이다. 활액막은윤활 활액을 생산하여 관절 내의 공간 속에 방출한다. 정상 관절에서, 활액의 부피는 매우 작다. 기능을 윤활하는 것 이외에, 활액은 용질들 및 몇몇 휴면 단핵 및 활액 세포들의 저장소로 작용한다.

활막은 관절에 대한 외상을 포함하는 관절염을 촉진하는 것으로 생각되는 여러 외상 및/또는 신체 면역 시스템의 이상에 반응하여 염증을 일으키고 두꺼워질 수 있다. 이런 외상들의 결과는 활액의 과다 생산과 관절 속으로의 방출을 포함하여, 관절 영역 내 및 주위에 팽창을 일으킨다. 증가된 부피는 섬유아세포 유사 활막세포(FLS 세포), 인터루킨-1(IL-1)과 같은 친염증성 사이토카인 및 종양 괴사 인자(TNF-알파), 히스타민 단백질들 및 펩타이드들, 및 기질메탈로프로테아제(MMPs)와 같은 퇴행성 효소의 활액에서 증가된 농도를 통상적으로 동반한다. FLS 세포들은 정상 활액에 활액세포들의 약 2/3를 포함하고 잘 형성된 분비성 시스템을 가지며, 외상 또는 염증의 질환하에서 일반적으로 다량의 MMPs, 특이적으로 MMP-1, 3, 8, 9, 10, 11 및 13을 활액 속에 분비한다. MMP-1 및 MMP-3은 연골과 관절을 포함하는 기본 골조직들의 진행성 구조적 손상에 중요한 역학을 갖는 것으로 생각된다. MMP-1 및 MMP-3를 생산하는 FLS 세포들을 활성화하는 공지된 인자들은 IL-1 및 TNF-알파를 포함한다.

RA, SA 및 OA의 원인 물질들은 현재 잘 정의되지 않았다. 그러나, 퇴행성 효소 작용들에 의한 연골과 기본 골 조직들의 열화 및 악화를 통해, 관절들에 과량의 활액 축적에 의해 발생한 장기간의 팽창과 염증에 의한 질병의 진행과 관련된 생리학적 사건들 및 영구적인 구조적 손상을 일으키는 동반하는 FLS 세포들의 뼈 속으로의 확산이 공지되어 있다. 충분히 초기에 탐지되면, 질병의 잠재적인 장기간 유해한 효과들은 적절한 물리적 및 의료적 치료에 의해 역전될 수 있거나 적어도 감소될 수 있다. 이를 위해서, 키라니 등(2007, J. Rheum. 34: 1650-1657; WO 2007/128132)은 14-3-3 단백질 집단의 두 일원, 특히 14-3-3 에타와 14-3-3 감마는 관절염을 가진 환자들의 활액과 혈청 내에 존재하며 이런 아이소형들은 활액과 혈청에서 MMP-1 및 MMP-3의 수준들과 직접 관련이 있다는 것을 보고하였다.

14-3-3 단백질들은 진핵생물에서 어디에서나 발현되는 보존된 세포내 조절 분자들의 집단이다. 14-3-3 단백질들은 키나아제, 포스파타아제 및 막투과 수용체들을 포함하는 여러 기능적으로 다양한 시그널링 단백질들과 결합하는 능력을 가진다. 또한, 100개 이상의 시그널링 단백질들은 14-3-3 리간드들로 보고되었다. 14-3-3 단백질들은 테트라트리코 펩타이드 반복 슈퍼패밀리(tetratrico peptide repeat superfamily)의 진화된 일원들로 생각될 수 있다. 이들은 일반적으로 9 또는 10개 알파 나선을 가지며 주로 이들의 아미노-말단 나선을 따라 호모- 및/또는 헤테로-다이머 상호작용을 형성한다. 이런 단백질들은 2가 양이온 상호작용, 포스포릴화 및 아세틸화, 및 단백질 분해 등을 위한 영역들을 포함하는 여러 공지된 도메인들을 함유한다. 포유류들에서 발현될 것으로 알려진 14-3-3 단백질들의 7개 뚜렷한 유전적으로 암호화된 아이소형들이 있고, 각각의 아이소형은 242-255개 아미노산을 포함한다. 7개 14-3-3 단백질 아이소형들은 14-3-3 α/β(알파/베타), 14-3-3 δ/ξ(델타/제타), 14-3-3ε(입실론), 14-3-3γ(감마), 14-3-3η(에타), 14-3-3τ/θ(타우/쎄타) 및 14-3-3σ(시그마/스트라핀)로 지정된다.

본 발명은 (i) 14-3-3 단백질은 관절염에서 세포외 관절 공극에 비정상적으로 국소화되고, (ii) 이런 세포외 14-3-3 단백질은 관절염의 작동자를 유도할 수 있고 (iii) 이런 세포외 14-3-3 단백질들에 대한 14-3-3 길항제들은 관절염의 작동자를 감소시킬 수 있다는 발견으로부터 부분적으로 기원한다.

한 태양에서, 본 발명은 관절염을 치료하는 방법들을 제공한다. 한 바람직한 실시예에서, 본 발명은 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 베체트병(Behcet's Disease), 특발성 골격성 과골화증(Diffuse idiopathic skeletal hyperostosis)(DISH), 엘러스-단로스 증후(Ehlers-Danlos syndrome)(EDS), 펠티증후군(Felty's syndrome), 섬유근통(fibromyalgia), 통풍(gout), 감염성 관절염(infectious arthritis), 소아 관절염(juvenile arthritis), 낭창(lupus), 혼합결합조직병(mixed connective tissue disease)(MCTD), 골관절염(osteoarthritis), 파제트병(Paget's Disease), 류마티스성 다발성근육통(polymyalgia rheumatica), 다발성근염(polymyositis) 및 피부근염(dermatomyositis), 가성통풍(pseudogout), 건선성 관절염(psoriatic arthritis), 레이노 현상(Raynaud's Phenomenon), 반응성 관절염(reactive arthritis), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 경피증(scleroderma), 쇼그렌증후군(Sjogren's syndrome), 스틸병(Still’s Disease) 및 베게너 육아종(Wegener’s granulomatosis)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 질병을 치료하기 위한 방법들이 포함된다.

이 방법은 병에 걸린 환자에게 14-3-3 길항제를 투여하는 단계를 포함하며, 14-3-3 길항제는 세포외에서 국소화된 14-3-3 단백질을 표적화한다. 한 바람직한 실시예에서, 14-3-3 단백질은 14-3-3 에타 또는 14-3-3 감마이다.

사용된 14-3-3 길항제들은 종래의 조성물 또는 본 명세서에서 개시된 신규한 조성물일 수 있다. 치료 조성물들은 전달된 14-3-3 길항제가 세포외 14-3-3 단백질과 결합하는데 이용할 수 있도록 제제화되고 투여된다. 한 실시예에서, 14-3-3 길항제 펩타이드 또는 안티-14-3-3 항체이다.

한 바람직한 실시예에서, 14-3-3 길항제는 이것이 결합하는 14-3-3 단백질에 의해 MMP의 유도를 억제할 수 있다. 바람직하게는, MMP는 MMP-1, 3, 8, 9, 10, 11 및 13으로 이루어진 그룹으로부터 선택되며, MMP-1과 MMP-3가 특히 바람직하다.

한 실시예에서, 이 방법은 병합 치료를 포함하며, 여기서 적어도 하나의 다른 치료제가 하나 이상의 14-3-3 길항제들에 더하여 투여된다. 한 바람직한 실시예에서, 치료제는 한 바람직한 실시예에서, 치료제는 질병-변형 항류마티스성 약물(DMARDs), 질병-변형 골관절염 약물(DMOADs; 예를 들어, Loeser, Reumatologia, 21:104-106, 2005 참조), 안티-TNFα 항체, 안티-IL-1 항체, 안티-CD4 항체, 안티-CTLA4 항체, 안티-CD20 항체, 안티-IL6 항체, 레플루노미드, 설파살라진 및 메토트렉세이트로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

한 실시예에서, 14-3-3 길항제는 14-3-3 길항제를 전달하도록 발현된 암호화된 핵산의 형태로 투여된다.

한 실시예에서, 이 방법은 환자에게 14-3-3 길항제를 전달하는 세포를 투여하는 단계를 포함한다. 한 바람직한 실시예에서, 이렇게 전달된 14-3-3 길항제는 펩타이드 또는 안티-14-3-3 항체이다. 한 바람직한 실시예에서, 세포는 섬유아세포 또는 FLS 세포이다.

한 태양에서, 본 발명은 관절염이 발생할 위험이 있는 피험자에서 관절염의 발생을 예방하기 위한 예방법들을 제공한다. 이 방법들은 피험자에게 하나 이상의 14-3-3 길항제를 투여하는 단계를 포함한다.

한 태양에서, 본 발명은 외상에 의해 손상된 관절에 대한 피해를 감소시키는 방법들을 제공한다. 이 방법들은 외상에 의해 손상된 관절을 가진 피험자에게 하나 이상의 14-3-3 길항제를 투여하는 단계를 포함한다. 한 실시예에서, 14-3-3 길항제는 본 명세서에 개시된 병합 치료의 구성요소로서 투여된다.

한 태양에서, 본 발명은 MMP 발현을 감소시키는 방법들을 제공한다. 한 실시예에서, 감소될 MMP 발현은 활막이다. 이 방법들은 MMP를 생산하는 세포들이 존재하는 조직 또는 격실에 하나 이상의 14-3-3 길항제를 전달하는 단계를 포함하며, MMP를 생산하는 세포들은 14-3-3 길항제들이 결합하는 14-3-3 단백질에 반응성이 있다. 전달은 손상된 조직 또는 격실에 직접적일 수 있거나 간접적일 수 있다. 한 바람직한 실시예에서, 반응성 세포들은 섬유아세포 또는 FLS 세포들이다.

한 바람직한 실시예에서, 감소될 MMP 발현은 관절염과 관련이 있는 MMP 발현이다.

한 바람직한 실시예에서, 감소될 MMP 발현은 MMP-1, 3, 8, 9, 10, 11 및 13으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 MMP의 발현이다. 특히 바람직한 실시예에서, 감소될 MMP 발현은 MMP-1 또는 MMP-3의 수준이다.

한 태양에서, 본 발명은 14-3-3 단백질에 의한 MMP 유도를 억제하는 방법들을 제공한다. 억제는 부분적이거나 완전할 수 있다. 이 방법들은 MMP를 생산하는 세포들이 존재하는 조직 또는 격실에 하나 이상의 14-3-3 길항제들을 전달하는 단계를 포함하며, MMP를 생산하는 세포들은 14-3-3 길항제들이 특이적으로 결합하는 14-3-3 단백질에 반응성이 있다. 전달은 손상된 조직 또는 격실에 직접적일 수 있거나 간접적일 수 있다. 한 바람직한 실시예에서, 하나 이상의 14-3-3 길항제들은 활막에 투여된다. 한 바람직한 실시예에서, 반응성 세포들은 섬유아세포 또는 FLS 세포들이다.

한 바람직한 실시예에서, 억제될 MMP 유도는 관절염에서 상승조절되는 MMP의 유도이다.

한 바람직한 실시예에서, 억제될 MMP 발현은 MMP-1, 3, 8, 9, 10, 11 및 13으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 MMP의 발현이다. 특히 바람직한 실시예에서, 억제될 MMP 발현은 MMP-1 또는 MMP-3의 수준이다.

한 태양에서, 본 발명은 피험자에서 관절 붓기를 감소시키는 방법들을 제공한다. 이 방법들은 병에 걸린 피험자에게 하나 이상의 14-3-3 길항제들을 투여하는 단계를 포함한다.

한 태양에서, 본 발명은 피험자에서 연골 퇴화를 감소시키는 방법들을 제공한다. 이 방법들은 병에 걸린 피험자에게 하나 이상의 14-3-3 길항제들을 투여하는 단계를 포함한다.

한 태양에서, 본 발명은 피험자에서 뼈 퇴화를 감소시키는 방법들을 제공한다. 이 방법들은 병에 걸린 피험자에게 하나 이상의 14-3-3 길항제들을 투여하는 단계를 포함한다.

한 태양에서, 본 발명은 활액에서 친-염증성 사이토카인 축적을 감소시키는 방법들을 제공한다. 이 방법들은 병에 걸린 피험자에게 하나 이상의 14-3-3 길항제들을 투여하는 단계를 포함한다.

병에 걸린 피험자에게 하나 이상의 14-3-3 길항제들의 투여를 포함하는 방법들의 경우, 한 바람직한 실시예에서, 관절낭내 전달이 사용된다. 다른 실시예에서, 전신 전달이 사용된다. 치료 조성물들은 전달된 14-3-3 길항제가 세포외에서 국소화된 14-3-3 단백질과 결합하는데 사용될 수 있도록 제제화되고 투여된다.

한 실시예에서, 14-3-3 길항제는 펩타이드이다. 한 바람직한 실시예에서, 펩타이드는 "R-18"로 지정된 아미노산 서열을 포함한다. 다른 바람직한 실시예에서, 펩타이드는 필수적으로 R-18 서열로 이루어진다. 다른 바람직한 실시예에서, 펩타이드는 R-18 서열의 여러 반복을 포함한다. 다른 바람직한 실시예에서, 펩타이드는 R-18에 결합할 수 있는 14-3-3 단백질의 영역에 결합한다. 다른 바람직한 실시예에서, 펩타이드는 세포내 14-3-3 결합 파트너, 바람직하게는 Raf에 결합할 수 있는 14-3-3 단백질의 영역에 결합한다. 한 실시예에서, 펩타이드는 세포내 14-3-3 결합 파트너에 대한 14-3-3 단백질의 파괴된 결합 없이 14-3-3 단백질에 결합한다.

한 실시예에서, 14-3-3 길항제는 포스포펩타이드이다.

한 실시예에서, 14-3-3 길항제는 당업계에 공지된 I형 포스포펩타이드이다.

다른 실시예에서, 14-3-3 길항제는 당업계에 공지된 II형 포스포펩타이드이다.

한 실시예에서, 14-3-3 길항제는 안티-14-3-3 항체이다. 한 실시예에서, 안티-14-3-3 항체는 pan 14-3-3 항체이다. 다른 실시예에서, 안티-14-3-3 항체는 14--3-3 아이소형들 사이를 구별할 수 있다. 한 바람직한 실시예에서, 안티-14-3-3 항체는 14-3-3 루프 펩타이드, 14-3-3 나선 펩타이드, 및 14-3-3 비-나선 펩타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택된 펩타이드에 특이적으로 결합한다.

한 실시예에서, 안티-14-3-3 항체는 안티-14-3-3 감마 항체이다. 한 바람직한 실시예에서, 안티-14-3-3 감마 항체는 SEQ ID NO:64에 나타낸 아미노산 서열의 부분을 포함하는 14-3-3 펩타이드에 결합한다. 한 바람직한 실시예에서, 부분은 적어도 6개, 더욱 바람직하게는 적어도 7개, 더욱 바람직하게는 적어도 8개 아미노산 길이이다.

한 바람직한 실시예에서, 안티-14-3-3 감마 항체는 14-3-3 감마 루프 펩타이드인 14-3-3 펩타이드에 결합한다. 한 바람직한 실시예에서, 14-3-3 감마 루프 펩타이드는 SEQ ID NOs:44-49로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시예에서, 14-3-3 감마 루프 펩타이드는 SEQ ID NOs:44-49로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열로 필수적으로 이루어진다. 다른 실시예에서, 안티-14-3-3 감마 항체는 SEQ ID NOs:44-49로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열에 상응하는 아미노산 서열과 겹치는 14-3-3 감마의 영역에 결합한다.

다른 바람직한 실시예에서, 안티-14-3-3 감마 항체는 14-3-3 감마 나선 펩타이드인 14-3-3 펩타이드에 결합한다. 한 바람직한 실시예에서, 14-3-3 감마 나선 펩타이드는 SEQ ID NOs:33-43으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시예에서, 14-3-3 감마 나선 펩타이드는 SEQ ID NOs:33-43으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열로 필수적으로 이루어진다. 다른 실시예에서, 안티-14-3-3 감마 항체는 SEQ ID NOs:33-43으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열에 상응하는 아미노산 서열과 겹치는 14-3-3 감마의 영역에 결합한다.

다른 바람직한 실시예에서, 안티-14-3-3 감마 항체는 14-3-3 감마 비-나선 펩타이드인 14-3-3 펩타이드에 결합한다. 한 바람직한 실시예에서, 14-3-3 감마 비-나선 펩타이드는 SEQ ID NOs:50-62로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시예에서, 14-3-3 감마 비-나선 펩타이드는 SEQ ID NOs:50-62로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열로 필수적으로 이루어진다. 다른 실시예에서, 안티-14-3-3 감마 항체는 SEQ ID NOs:50-62로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열에 상응하는 아미노산 서열과 겹치는 14-3-3 감마의 영역에 결합한다.

한 실시예에서, 안티-14-3-3 항체는 안티-14-3-3 에타 항체이다. 한 바람직한 실시예에서, 안티-14-3-3 에타 항체는 SEQ ID NO:63에 나타낸 아미노산 서열의 부분을 포함하는 14-3-3 펩타이드에 결합한다. 한 바람직한 실시예에서, 부분은 적어도 6개, 더욱 바람직하게는 적어도 7개, 더욱 바람직하게는 적어도 8개 아미노산 길이이다.

한 실시예에서, 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체는 인간 14-3-3 에타 단백질의 N-말단에 위치한 에피토프에 결합하지 않는다.

한 바람직한 실시예에서, 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체는 14-3-3 에타 루프 펩타이드인 14-3-3 펩타이드에 결합한다. 한 바람직한 실시예에서, 14-3-3 에타 루프 펩타이드는 SEQ ID NOs:11-16으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시예에서, 14-3-3 에타 루프 펩타이드는 SEQ ID NOs:11-16으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열로 필수적으로 이루어진다. 다른 실시예에서, 안티-14-3-3 에타 항체는 SEQ ID NOs:11-16으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열에 상응하는 아미노산 서열과 겹치는 14-3-3 에타의 영역에 결합한다.

다른 바람직한 실시예에서, 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체는 14-3-3 에타 나선 펩타이드인 14-3-3 펩타이드에 결합한다. 한 바람직한 실시예에서, 14-3-3 에타 나선 펩타이드는 SEQ ID NOs:1-10으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시예에서, 14-3-3 에타 나선 펩타이드는 SEQ ID NOs:1-10으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열로 필수적으로 이루어진다. 다른 실시예에서, 안티-14-3-3 에타 항체는 SEQ ID NOs:1-10으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열에 상응하는 아미노산 서열과 겹치는 14-3-3 에타의 영역에 결합한다.

다른 바람직한 실시예에서, 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체는 14-3-3 에타 비-나선 펩타이드인 14-3-3 펩타이드에 결합한다. 한 바람직한 실시예에서, 14-3-3 에타 비-나선 펩타이드는 SEQ ID NOs:17-32로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시예에서, 14-3-3 에타 비-나선 펩타이드는 SEQ ID NOs:17-32로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열로 필수적으로 이루어진다. 다른 실시예에서, 안티-14-3-3 에타 항체는 SEQ ID NOs:17-32로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열에 상응하는 아미노산 서열과 겹치는 14-3-3 에타의 영역에 결합한다.

특히 바람직한 실시예에서, 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체는 LDKFLIKNSNDF(SEQ ID NO:30), KKLEKVKAYR (SEQ ID NO:31), 및 KNSVVEASEAAYKEA (SEQ ID NO:32)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열에 결합된다.

예시적 14-3-3 에타 루프, 나선 및 비-나선 펩타이드들은 표 1에 개시된다. 주목할 것은, SEQ ID NO:30은 14-3-3 에타 서열에서 발생하는 시스테인이 이황화 결합의 형성을 피하기 위해 세린에 의해 대체되었다는 점에서 상응하는 14-3-3 에타 서열과 다르다. 한 실시예에서, 본 발명은 시스테인을 포함하는 SEQ ID NO:30의 고유 14-3-3 서열 상관물에 결합하는 항체들을 제공한다. 한 실시예에서, 본 발명은 시스테인을 세린으로 치환함으로써 표 1에 나열된 것들과 다른 펩타이드 서열에 결합할 수 있는 항체들을 제공한다.

한 바람직한 실시예에서, 안티-14-3-3 항체는 14-3-3 단백질 아이소형들을 구별할 수 있다.

한 바람직한 실시예에서, 안티-14-3-3 항체는 단클론 항체이다.

한 바람직한 실시예에서, 안티-14-3-3 항체는 인간화된 항체이다.

한 태양에서, 본 발명은 신규한 14-3-3 길항제들을 제공한다. 한 실시예에서, 본 발명은 신규한 14-3-3 길항제 펩타이들을 제공한다. 다른 실시예에서, 본 발명은 신규한 안티-14-3-3 항체들을 제공한다. 한 태양에서, 본 발명은 14-3-3 길항제들을 제조하는 방법을 제공한다.

한 태양에서, 본 발명은 펩타이드들 또는 항체들인 14-3-3 길항제들을 암호화하는 핵산들을 제공한다. 또한, 이런 핵산들을 포함하는 발현 벡터들을 포함하는 벡터들을 제공한다. 또한 이런 핵산들을 포함하는 숙주 세포들 및 이런 벡터들을 포함하는 숙주 세포들을 제공한다. 또한, 이런 숙주 세포들의 사용을 포함하는 14-3-3 길항제를 제조하는 방법을 제공한다.

한 태양에서, 본 발명은 14-3-3 길항제들을 생산할 수 있는 세포들을 제공한다.

한 실시예에서, 세포는 하이브리도마이고, 14-3-3 길항제는 안티-14-3-3 항체이다.

다른 실시예에서, 세포는 유전학적으로 변형된 섬유아세포 또는 FLS 세포이며 14-3-3 길항제는 펩타이드 또는 안티-14-3-3 항체이다.

한 태양에서, 본 발명은 14-3-3 길항제를 스크리닝하는 방법들을 제공한다. 한 실시예에서, 이 방법들은 14-3-3 에타 단백질 또는 14-3-3 감마 단백질의 14-3-3 에타 리간드 또는 14-3-3 감마 리간드에 대한 결합을 억제하는 능력에 대해 후보 물질들을 스크리닝하는 단계를 포함한다. 한 실시예에서, 리간드는 14-3-3 길항제 펩타이드이다. 한 실시예에서, 리간드는 안티-14-3-3 항체이다. 한 실시예에서, 리간드는 세포내 14-3-3 결합 파트너이다. 한 실시예에서, 이 방법들은 14-3-3 단백질에 의한 MMP의 유도를 억제하는 후보 물질의 능력을 분석하는 단계를 포함한다.

한 실시예에서, 14-3-3 길항제는 본 명세서에 개시된 14-3-3 에타 단백질 또는 14-3-3 감마 단백질의 14-3-3 에타 리간드 또는 14-3-3 감마 리간드에 대한 결합을 경쟁적으로 억제한다. 한 실시예에서, 14-3-3 길항제는 소형 분자 화학 조성물이다.

한 바람직한 실시예에서, 14-3-3 길항제는 R-18에 결합할 수 있는 14-3-3 단백질의 영역에 결합한다. 한 바람직한 실시예에서, 14-3-3 길항제는 세포내 14-3-3 결합 파트너, 바람직하게는 Raf에 결합할 수 있는 14-3-3 단백질의 영역에 결합한다. 한 실시예에서, 14-3-3 길항제는 세포내 14-3-3 결합 파트너의 결합을 억제하지 않으며 14-3-3 단백질에 결합한다.

한 태양에서, 본 발명은 관절염을 치료하기 위한 약학적 조성물들을 제공한다. 약학적 조성물들은 하나 이상의 14-3-3 길항제들을 포함한다. 약학적 조성물들은 14-3-3 길항제에 의해 세포외 14-3-3 단백질의 결합을 제공하도록 제제화된다.

한 태양에서, 본 발명은 관절염을 치료하는데 유용한 의약을 제조하는 방법들을 제공한다. 이런 의약은 하나 이상의 14-3-3 길항제들을 포함한다. 의약은 14-3-3 길항제에 의해 세포외 14-3-3 단백질의 결합을 제공하도록 제제화된다.

한 태양에서, 본 발명은 관절염을 치료하고 관절염을 치료하기 위한 의약을 제제화하기 위해 세포외에서 국소화된 14-3-3 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 14-3-3 단백질의 활성을 억제할 수 있는 14-3-3 길항제와 같은 14-3-3 길항제의 용도를 포함한다.

본 발명은 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 베체트병(Behcet's Disease), 특발성 골격성 과골화증(Diffuse idiopathic skeletal hyperostosis)(DISH), 엘러스-단로스 증후(Ehlers-Danlos syndrome)(EDS), 펠티증후군(Felty's syndrome), 섬유근통(fibromyalgia), 통풍(gout), 감염성 관절염(infectious arthritis), 소아 관절염(juvenile arthritis), 낭창(lupus), 혼합결합조직병(mixed connective tissue disease)(MCTD), 골관절염(osteoarthritis), 파제트병(Paget's Disease), 류마티스성 다발성근육통(polymyalgia rheumatica), 다발성근염(polymyositis) 및 피부근염(dermatomyositis), 가성통풍(pseudogout), 건선성 관절염(psoriatic arthritis), 레이노 현상(Raynaud's Phenomenon), 반응성 관절염(reactive arthritis), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 경피증(scleroderma), 쇼그렌증후군(Sjogren's syndrome), 스틸병(Still’s Disease) 및 베게너 육아종(Wegener’s granulomatosis)을 치료하는 방법들을 포함하여, 관절염을 치료하는 방법들을 제공한다.

본 명세서에서 사용된 대로, "관절염" 또는 "관절통"은 일반적으로 신체의 관절들의 염증성 질환을 의미하며 주로 통증, 붓기 및 뻣뻣함을 동반한다. 관절염은 감염, 외상, 퇴행성 질환, 대사이상, 또는 불안 또는 다른 공지되지 않은 병인들을 포함하는 여러 원인들 중 임의의 것으로 발생할 수 있다.

환자에서 관절염의 진행 또는 심각성은 당업계에 주지된 기술들을 사용하여 측정 또는 정량화될 수 있다. 예를 들어, "질병 활성 점수"(DAS)는 환자에서 관절염의 활성 또는 상태를 측정하는데 사용될 수 있다. DAS는 임상 실시에 사용된 여러 표준들 또는 점수들 중 하나이다. DAS의 계산은 다음 변수들을 포함할 수 있다: 만지면 아픈 관절들(TEN)의 수, 부은 관절들(SW)의 수, 적혈구 침강속도(ESR) 및 질병 활성의 환자 평가(VAS). 또한, DAS는 C-반응성 단백질 마커 평가(CRP)를 포함할 수 있다(Skogh T et al 2003. Ann Rheum Dis 62:681-682). 또한, 질병의 존재 또는 부존재를 측정하거나 질병 심각성을 판단하기 위해서 14-3-3 에타 및/또는 감마를 포함하는 진단 바이오마커들을 사용할 수 있다.

본 명세서에서, "치료" 또는 "치료하다"라는 용어는 질병에 걸릴 위험이 있거나 질병에 걸릴 것으로 의심되는 환자뿐만 아니라 아프거나 질병 또는 의료 질환을 앓고 있는 것으로 진단된 환자들의 치료를 포함하는 예방적 또는 방지적 치료뿐만 아니라 질병 변형 치료를 의미하고 병의 재발을 억제하는 것을 포함한다.

이 방법들은 하나 이상의 14-3-3 길항제들의 투여를 포함한다. 본 발명의 14-3-3 길항제는 14-3-3 단백질, 특히 14-3-3 에타 또는 감마에 결합하고 이의 활성에 길항작용을 미친다.

본 명세서에서 사용된 대로, "아이소형"은 유사하나 동일하지 않은 아미노산 서열을 가지며 다른 유전자들 또는 다른 RNA 전사체들에 의해 암호화되거나 동일한 유전자로부터 가공되는 둘 이상의 기능적으로 유사한 단백질들을 의미한다.

14-3-3 에타 단백질 또는 14-3-3 감마 단백질을 참조하면 이의 단편들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 한 실시예에서 본 발명은, 한 바람직한 실시예에서, 14-3-3 리간드가 14-3-3 단백질에 결합하는 능력에 대한 후보 물질들을 스크리닝하는 단계를 포함하는 14-3-3 길항제에 대해 스크리닝하는 방법들을 제공한다. 14-3-3 단백질의 적절한 단편이 분석법에 사용될 수 있다고 이해될 것이다.

14-3-3 길항제의 예는 R18 억제성 펩타이드(Wang et al. 1999 - REF 35))이다. 본 명세서에서 'R18'로 불리는 R18 펩타이드는 14-3-3 단백질들이 Raf-1에 결합하는 것을 막을 수 있는 작은 펩타이드이다. 14-3-3 단백질들에 결합하는 펩타이들의 다른 예들이 공지되어 있다(예를 들어, Wang et al. 1999 - REF 35, infra; Yaffe et al., Cell, 91:961-971, 1997; Shaw et al., U.S. 5,948,765; Petosa et al., JBC 273:16305-16310, 1998; Fu et al., US 2004/0152630 참조). 세포외 14-3-3 단백질과 비정상적으로 국소적으로 결합하도록 제제화될 때 이들 및 다른 것들은 관절염의 치료를 위한 치료제로서 본 발명에서 사용될 수 있다.

"항체"는 상응하는 항원에 특이적으로 결합하고, 면역글로불린들의 공통적이고 일반적인 구조를 가진 단백질을 포함하는 조성물을 의미한다. 항체라는 용어는 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 다클론 항체들, 단클론 항체들, 다이머들, 멀티머들, 다중 특이적 항체들(예를 들어, 이중 특이적 항체들) 및 항체 단편들을 구체적으로 포함한다. 항체들은 설치류, 인간, 인간화, 키메릭일 수 있고 또는 다른 종들로부터 유도될 수 있다. 통상적으로, 항체는 결합할 때 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 형성하는 이황화 결합에 의해 서로 연결된 적어도 2개의 중사슬과 2개의 경사슬을 포함할 것이다. 각각의 중사슬은 중사슬 가변 영역(VH) 및 중사슬 불변 영역(CH)으로 구성된다. 중사슬 불변 영역은 3개 도메인, CH1, CH2 및 CH3로 구성되며, 뮤, 델타, 감마, 알파 또는 입실론 아이소타이프일 수 있다. 유사하게, 경사슬은 경사슬 가변 영역(VL)과 경사슬 불변 영역(CL)으로 구성된다. 경사슬 불변 영역은 카파 또는 람다 아이소타이프일 수 있는 한 도메인, CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 더욱 보존되는 프레임워크 영역(FR)으로 불리는 영역들과 점점이 흩어진 상보성 결정 영역(CDR)으로 불리는 초가변성의 영역들로 더 나뉠 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 다음 순서로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 아미노 말단으로부터 카복시 말단으로 배열된 3개의 CDRs과 4개의 FRs로 구성된다. 중사슬들과 경사슬들의 가변 영역들은 항원과 상호작용하는 결합 도메인들을 포함한다. 항체들의 불변 영역들은 면역시스템의 다양한 세포들(예를 들어, 작용 세포들) 및 전형적인 보체 시스템의 제 1 구성요소(Clq)를 포함하는 숙주 조직들 또는 인자들에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다. 중사슬 불변 영역은, 특히 Fc 수용체들(예를 들어, FcγRI, FcγRII, FcγRIII 등)과 같은 세포 수용체들을 통해 숙주 조직 또는 숙주 인자들에 대한 면역글로불린의 결합을 매개한다. 본 명세서에서 사용된 대로, 항체는 항원과 결합하는 능력을 보유한 면역글로불린의 항원 결합 부분을 포함한다. 이들은, 예를 들어, F(ab), VL CL 및 VH CH 항체 도메인들의 1가 단편; 및 F(ab')₂ 단편, 힌지 영역에서 이황화 다리에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편을 포함한다. 항체라는 용어는 재조합 단일사슬 Fv 단편들(scFv) 및 다이아바디(diabodies), 트라이아바디(triabodes) 및 테트라바디(tetrabodies)와 같은 이중 특이적 분자들을 의미한다(미국특허 제 5,844,094호 참조).

항체들은 항체 착물들을 포함하는 여러 형태로 생산되고 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 대로, "항체 착물"이란 용어는 하나 이상의 항체들과 다른 항체 또는 항체 단편 또는 단편들의 착물 또는 둘 이상의 항체 단편들의 착물을 의미한다. 항체 착물들은 호모컨쥬케이트 및 헤테로컨쥬케이트뿐만 아니라 본 명세서에 기술된 다른 가교 항체들의 안티-14-3-3 항체들의 멀티머 형태들을 포함한다.

"항원"은 넓게 해석되며 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 분자, 조성물 또는 입자를 의미한다. 항원은, 비록 항체의 생산을 반드시 유도하지 않으나,항체와 반응하는 하나 이상의 에피토프를 가진다.

"가교된", "가교" 및 이의 문법적으로 동일한 용어는 항체 착물들을 형성하는 둘 이상의 항체들의 결합을 의미하고 멀티머화라고도 불릴 수 있다. 가교 또는 멀티머화는 둘 이상의 동일한 항체들의 결합(예를 들어, 호모다이머화)뿐만 아니라 둘 이상의 다른 항체들의 결합(예를 들어, 헤테로다이머화)을 포함한다. 당업자들은 가교 또는 멀티머화는 항체 호모컨쥬케이트 및 항체 헤테로컨쥬케이트를 형성하는 것을 의미한다는 것을 인식할 것이다. 이런 컨쥬케이트들은 동일한 클론 기원(호모컨쥬케이트)의 둘 이상의 단클론 항체들의 결합 또는 다른 클론 기원(헤테로컨쥬케이트 또는 이중특이성으로 불림)의 결합을 포함할 수 있다. 항체들은 비-공유 또는 공유 결합에 의해 가교될 수 있다. 가교에 적합한 여러 기술들은 당업자들이 알 수 있을 것이다. 비-공유 결합은 제 1 항체 종들에 특이적인 제 2 항체의 사용을 통해 성취될 수 있다. 예를 들어, 염소 안티-생쥐(GAM) 제 2 항체는 생쥐 단클론 항체를 가교하는데 사용될 수 있다. 공유 결합은 화학적 가교제들의 사용을 통해 성취될 수 있다.

"에피토프"는 항체에 특이적인 결합을 할 수 있는 결정자를 의미한다. 에피토프들은 분자들의 표면들 상에 일반적으로 존재하고 항체들과의 상호작용에 접근할 수 있는 화학적 구조들이다. 전형적인 화학적 구조들은 아미노산들과 당 모이어티들이며, 3차원 구조적 특징들뿐만 아니라 전하, 친수성 및 친유성을 포함하는 화학적 특성들을 가진다. 입체적 에피토프들은 항체와의 반응성이 손실되어 기본 화학적 구조에 어떠한 변화 없이 분자의 공간 원소들의 변화를 일으키는 비 입체적 에피토프들과 구별된다.

"인간화된 항체"는 비-인간 면역글로불린으로부터 유도된 최소 서열을 함유하는 면역글로불린 분자를 의미한다. 인간화된 항체들은 인간 면역글로불린들(수신자 항체)을 포함하며, 여기서 수신자의 상보성 결정 영역(CDR)으로부터의 잔기들이 원하는 특이성, 친화성 및 능력을 가진 생쥐, 쥐 또는 토끼와 같은 비-인간 종들(제공자 항체)의 CDR로부터의 잔기들에 의해 대체된다. 일부 경우들에, 인간 면역글로블린의 Fv 프레임워크 잔기들은 상응하는 비 인간 잔기들로 대체된다. 인간화된 항체들은 수신자 항체 또는 이입된 CDR 또는 프레임워크 서열들에서 발견되지 않는 잔기들을 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화된 항체는 적어도 하나 및 통상적으로 두 개인 가변 영역의 실질적으로 전부를 포함할 것이며, 전부 또는 실질적으로 전부의 CDR 영역들은 비 인간 면역글로불린의 것들에 상응하며 전부 또는 실질적으로 전부의 프레임워크(FR) 영역들은 인간 면역글로불린 일치 서열의 것들에 상응한다. 인간화된 항체는 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 일반적으로 인간 면역글로불린의 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린들을 포함할 것이다(Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Reichmann et al, Nature 332:323-329 (1988)).

"면역원"은 면역반응의 생산을 자극하는 물질, 화합물, 조성물을 의미한다.

"면역글로불린 좌위"라는 용어는 면역글로불린 폴리펩타이드를 발현하기 위해 B 세포 또는 B 세포 전구체에 의해 사용될 수 있는 정보를 포함하는 유전 원소 또는 연결된 유전 원소들의 세트를 의미한다. 이 폴리펩타이드는 중사슬 폴리펩타이드, 경사슬 폴리펩타이드 또는 중사슬 및 경사슬 폴리펩타이드의 융합일 수 있다. 재배열되지 않은 좌위의 경우에, 유전 원소들은 B 세포 전구체들에 의해 결합되어 면역글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자를 형성한다. 재배열된 좌위의 경우에, 면역글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자는 좌위 내에 포함된다.

"아이소타이프(isotype)"는 중사슬 불변 영역에 의해 형성된 항체 종류를 의미한다. 중사슬들은 일반적으로 감마, 뮤, 알파, 델타, 입실론으로 분류되고 IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE로 지정된다. 각 아이소타이프 내의 변형들은 서브타입으로 분류되며, 예를 들어, IgG의 서브타입들은 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4로 분류되는 반면 IgA는 IgA1 및 IgA2로 분류된다. IgY 아이소타이프는 새들에게 특이적이다.

"단클론 항체" 또는 "단클론 항체 조성물"은 단일 분자 조성물의 항체 분자들의 제제를 의미한다. 단클론 항체 조성물은 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성과 친화성을 나타낸다.

"인간 단클론 항체"라는 용어는 인간 면역글로불린 서열들로부터 유도된 가변 및/또는 불변 영역들(존재하는 경우)을 가진 단일 결합 특이성을 나타내는 항체들을 포함한다. 한 실시예에서, 인간 단클론 항체들은 형질전환 비-인간 동물, 예를 들어, 불멸화된 세포들에 융합된 인간 중사슬 형질전환 유전자 및 경사슬 형질전환 유전자를 가진 형질전환 생쥐로부터 얻은 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생산된다.

"단일사슬 Fv" 또는 "scFv"는 항체의 VH 및 VL 영역들을 포함하는 항체를 의미하고, 이런 도메인들은 단일 폴리펩타이드 사실에 존재한다. 일반적으로, scFv는 scFv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있는 VH 및 VL 도메인들 사이의 폴리펩타이드 링커를 더 포함한다.

"피험자" 및 "환자"는 서로 교환해서 사용되며 나타낸 경우를 제외하고, 인간 및 비-인간 영장류뿐만 아니라 토끼, 쥐, 생쥐, 염소, 돼지와 같은 포유류들 및 다른 포유류 종들을 의미한다.

"재조합 항체"는 재조합 기술들에 의해 생산되는 항체들을 의미한다. 이들은 면역글로불린 좌위에 대해 형질전환되는 동물로부터 얻은 항체들, 재조합 발현 벡터로부터 발현된 항체들 및 임의의 면역글로불린 유전자 서열을 임의의 다른 핵산 서열에 접합하여 형성, 제조 및 발현된 항체들을 포함한다.

안티 -14-3-3 항체들

한 태양에서, 본 발명은 14-3-3 에타 또는 14-3-3 감마 단백질에 특이적으로 결합하는 신규한 안티-14-3-3 항체들을 제공한다. 바람직하게는, 본 발명의 안티-14-3-3 항체는 자연 3-D 형태의 14-3-3 단백질과 특이적으로 결합할 수 있다. "자연 3-D 형태의" 14-3-3 단백질과 특이적으로 결합한다는 것은 인비보에서 만나는 14-3-3 단백질에 결합하는 능력을 의미한다. 이것은, 예를 들어, 생물학적 샘플의 14-3-3 에타 단백질을 면역침전하는 항체의 능력에 의해 증명될 수 있다.

한 바람직한 실시예에서, 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체는 관절염에서 세포외 관절 공간에 비정상적으로 국소화되는 14-3-3 단백질과 결합할 수 있다. 이것은, 예를 들어, 관절염을 가진 환자의 활액 샘플에 존재하는 14-3-3 단백질의 면역침전에 의해 증명될 수 있다.

한 바람직한 실시예에서, 본 발명의 안티-14-3-3 항체는 14-3-3 단백질 아이소형들을 구별할 수 있다. 이런 항체들은 특정 14-3-3 단백질 아이소형에 특이적으로 결합하고 동일한 조건하에서 다른 14-3-3 단백질 아이소형들과 비교하여 이 아이소형에 특이적으로 결합한다. 이것은, 예를 들어, 하이브리도마 클론들로부터의 상청액을 사용하여 이루어질 수 있는 ELISA 분석법을 사용하여 증명될 수 있다. 대조군(예를 들어, 면역전 혈청)이 사용되는 것이 바람직하다. "선택적" 항체는 특정 14-3-3 아이소형을 인식할 수 있고 다른 아이소형들과 비교해서 이 아이소형에 대해 더 높은 신호, 바람직하게는 다른 아이소형들과 비교해서 적어도 1.5배, 더욱 바람직하게는 적어도 2배 더 높은 신호를 발생시킬 수 있다. 한 바람직한 실시예에서, 선택적 항체는 다른 14-3-3 아이소형들과 비교해서 특정 14-3-3 에타를 선택적으로 면역침전하는 능력을 가진다.

한 바람직한 실시예에서, 안티-14-3-3 항체는 인간 14-3-3 알파, 베타, 델타, 입실론, 감마, 타우 및 제타 단백질들에 비해 14-3-3 에타 단백질에 대해 선택성을 나타낸다. 이것은, 예를 들어, ELISA에 의해 증명될 수 있다.

한 바람직한 실시예에서, 안티-14-3-3 항체는 인간 14-3-3 알파, 베타, 델타, 입실론, 에타, 타우 및 제타 단백질들에 비해 14-3-3 감마 단백질에 대해 선택성을 나타낸다. 이것은, 예를 들어, ELISA에 의해 증명될 수 있다.

한 바람직한 실시예에서, 본 발명의 안티-14-3-3 항체는 14-3-3 길항제이고, 다른 안티-14-3-3 항체들도 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 생각된다.

한 바람직한 실시예에서, 안티-14-3-3 항체는 14-3-3 단백질, 특히 14-3-3 감마 또는 14-3-3 에타에 의한 MMP의 유도를 억제할 수 있다. 바람직하게는, MMP는 MMP-1, 3, 8, 9, 10, 11 및 13으로 이루어진 그룹으로부터 선택되며, MMP-1과 MMP-3가 특히 바람직하다. 이런 능력은 인비트로 분석법 또는 인비보 분석법에 의해 측정될 수 있다. 당업자가 알 수 있듯이, 분석법들은 안티-14-3-3 항체의 부존재하에서, 14-3-3 단백질의 존재가 MMP의 유도를 일으킬 수 있도록 설계될 것이다. 14-3-3 단백질 의한 MMP의 이런 유도를 감소시키는 능력은 안티-14-3-3 항체에 대한 기능-억제 능력을 증명할 수 있다.

한 태양에서, 본 발명은 안티-14-3-3 에타 항체들을 제공한다. 한 바람직한 실시예에서, 안티-14-3-3 에타 항체는 SEQ ID NO:63에 나타낸 아미노산 서열의 부분을 포함하는 14-3-3 펩타이드에 결합한다. 한 바람직한 실시예에서, 부분은 적어도 6개, 더욱 바람직하게는 적어도 7개, 더욱 바람직하게는 적어도 8개 아미노산 길이이다.

한 태양에서, 안티-14-3-3 항체는 안티-14-3-3 감마 항체이다. 한 바람직한 실시예에서, 안티-14-3-3 감마 항체는 SEQ ID NO:64에 나타낸 아미노산 서열의 부분을 포함하는 14-3-3 펩타이드에 결합한다. 한 바람직한 실시예에서, 부분은 적어도 6개, 더욱 바람직하게는 적어도 7개, 더욱 바람직하게는 적어도 8개 아미노산 길이이다.

단클론 항체들, 하이브리도마 , 및 이를 제조하는 방법

본 발명은 14-3-3 에타 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론 항체들뿐만 아니라 14-3-3 감마 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론 항체들을 제공한다. 또한 이런 항체들을 생산할 수 있는 하이브리도마 세포주들이 제공된다.

한 태양에서, 본 발명은 14-3-3 에타 루프, 나선 또는 비-나선 펩타이드에 결합하는 단클론 안티-14-3-3 에타 항체들을 제공한다. 한 바람직한 실시예에서, 펩타이드는 SEQ ID NOs:1-32로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 특히 바람직한 실시예에서, 본 발명은 LDKFLIKNSNDF(SEQ ID NO:30), KKLEKVKAYR (SEQ ID NO:31), 및 KNSVVEASEAAYKEA (SEQ ID NO:32)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열에 특이적으로 결합하는 안티-14-3-3 에타 단클론 항체들을 제공한다. 또한 이런 항체들을 생산할 수 있는 하이브리도마 세포주들이 제공된다.

한 태양에서, 본 발명은 14-3-3 에타 루프, 나선 또는 비-나선 펩타이드를 포함하는 면역원으로 면역화된 생쥐로부터 유도된 비장 세포의 융합에 의해 생산된 하이브리도마를 제공한다. 한 바람직한 실시예에서, 펩타이드는 SEQ ID NOs:1-32로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 특히 바람직한 실시예에서, 본 발명은 LDKFLIKNSNDF(SEQ ID NO:30), KKLEKVKAYR (SEQ ID NO:31), 또는 KNSVVEASEAAYKEA (SEQ ID NO:32)를 포함하는 면역원으로 면역화된 생쥐로부터 유도된 비장 세포의 융합에 의해 생산된 하이브리도마를 제공한다. 또한 이런 하이브리도마에 의해 생산된 단클론 항체들이 제공된다.

한 바람직한 실시예에서, 본 발명은 14-3-3 감마 루프, 나선 또는 비-나선 펩타이드에 결합하는 단클론 안티-14-3-3 감마 항체들을 제공한다. 한 바람직한 실시예에서, 펩타이드는 SEQ ID NOs:33-62로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 또한 이런 항체들을 생산할 수 있는 하이브리도마 세포주들이 제공된다.

한 태양에서, 본 발명은 14-3-3 감마 루프, 나선 또는 비-나선 펩타이드를 포함하는 면역원으로 면역화된 생쥐로부터 유도된 비장 세포의 융합에 의해 생산된 하이브리도마를 제공한다. 한 바람직한 실시예에서, 펩타이드는 SEQ ID NOs:33-62로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 또한 이런 하이브리도마에 의해 생산된 단클론 항체들이 제공된다.

본 발명은 이런 단클론 항체들 또는 이의 유도체들을 생산하는 방법들을 더 제공하며, 단클론 항체가 생산되는 적절한 조건하에서 본 발명의 하이브리도마를 생산하는 단계와 세포 및/또는 세포 배지로부터 항체 및/또는 이의 유도체를 얻는 단계를 포함한다.

항체들은 당업자에 의해 쉽게 생산될 수 있다. 하이브리도마에 의해 단클론 항체들을 제조하기 위한 일반적인 방법은 당업계에 주지되어 있다. 예를 들어, M. Schreier et al., Hybridoma Techniques (Cold Spring Harbor Laboratory) 1980; Hammerling et al., Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas (Elsevier Biomedical Press) 1981. 참조.

일부 실시예들에서, 이런 방법들은 단클론 항체가 생산되는 적절한 조건하에서 하이브리도마 세포를 배양하는 단계와 세포 및/또는 세포 배지로부터 항체 및/또는 이의 유도체를 얻는 단계를 포함한다.

본 발명은 또한 본 명세서에서 기술된 관심 14-3-3 펩타이드들에 결합할 수 있는 항체들에 대한 pan에 파아지 라이브러리를 사용하는 것을 고려한다. 예를 들어, Konthur et al., Targets, 1: 30-36, 2002. 참조.

임의의 수단에 의해 생산된 항체들은 당업자에 의해 공지된 방법들에 의해 정제될 수 있다. 정제 방법들은, 다른 것들 중에서, 선택적 침전, 액체 크로마토그래피, HPLC, 전기영동, 크로마토포커싱(chromatofocusing) 및 다양한 친화성 기술들을 포함한다. 선택적 침전은 황산 암모늄, 에탄올(콘 침전), 폴리에틸렌 글리콜 또는 당업계에서 구입할 수 있는 다른 물질들을 사용할 수 있다. 액체 크로마토그래피 매질들은, 다른 것들 중에서, 이온 교환 매질 DEAE, 폴리아스파르테이트, 하이드록실아파타이트, 크기 배제(예를 들어, 가교 아가로스, 아크릴아마이드, 덱스트란 등을 기초로 한 것들), 소수성 기질들(예를 들어, 블루 세파로스)을 포함한다. 친화성 기술들은 통상적으로 면역글로불린 Fc 도메인과 상호작용하는 단백질들에 의존한다. 황색 포도상구균의 단백질 A는 인간 γ1, γ2 또는 γ4 중사슬들을 기초로 한 항체들을 정제하는데 사용될 수 있다(Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). C 및 G 연쇄상구균의 단백질 G는 모든 생쥐 아이소타입과 인간 γ3에 대해 유용하다(Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). k 경사슬 상호작용을 통해 면역글로불린들(Ig)에 결합하는 단백질 L, 펩토연쇄상구균(Peptostreptococcus magnus) 세포벽 단백질은 Ig 하부종류인 IgM, IgA, IgD, IgG, IgE 및 IgY의 친화성 정제에 유용하다. 이런 단백질들의 재조합 형태들은 상업적으로 구입할 수 있다. 항체가 히스티딘 태그들을 함유하도록 제조된 파이지 디스플레이 항체들과 같은 금속 결합 잔기들을 포함하는 경우, 금속 친화성 크로마토그래피가 사용될 수 있다. 충분한 양의 특이적 세포 인구들이 사용되는 경우, 항원 친화성 기질들은 항체들을 정제하기 위한 친화성 방법을 제공하기 위해 세포들로 제조될 수 있다.

한 바람직한 실시예에서, 분리는 14-3-3 에타 또는 이의 단편을 사용하는 친화성 크로마토그래피를 포함한다.

본 발명은 본 명세서에 기술된 항체들뿐만 아니라 항체 단편들과 항원 결합 부분들을 제공한다. 전부 안티-14-3-3 에타 항체라는 용어에 포함된다. 본 발명의 항체의 "항체 단편" 또는 "항체 결합 부분"(또는 간단히 "항체 부분")은 항원과 특이적으로 결합하는 능력을 보유한 항체들의 하나 이상의 단편을 의미한다. 항체의 항원 결합 기능은 전장 항체의 단편들에 의해 수행될 수 있다는 것이 나타났다. 항체의 "항체 단편" 또는 "항체 결합 부분"이란 용어 내에 포함된 결합 단편들의 예들은 (i) Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인들로 이루어진 1가 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화 다리에 의해 연결된 두 Fab 단편들을 포함하는 2가 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인들로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 암의 VL 및 VH 도메인들로 이루어진 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편(예를 들어, Ward et al., (1989) Nature 341:544-546) 및 (vi) 분리된 상보성 결정 영역(CDR) 및 (vii) 이중특이성 단일사슬 Fv 다이머들(예를 들어, PCT/US92/09965)을 포함한다. 또한, 비록 Fv 단편의 두 도메인들, VL 및 VH가 개별 유전자들에 대해 암호화되지만, 이들은 이들이 VL 및 VH 영역들이 쌍을 이뤄 1가 분자들을 형성하는 단일 단백질 사슬(단일 사슬 Fv(scFv); 예를 들어, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 참조)로 만들어지도록 할 수 있는 합성 링커에 의해 재조합 방법들을 사용하여 결합될 수 있다. 이런 단일 사슬 항체들은 항체의 "항원-결합 부분"이란 용어 내에 포함된다. 이런 항체 단편들은 당업자에게 공지된 통상적인 기술들을 사용하여 얻으며, 단편들은 손상되지 않은 항체들과 같은 동일한 방식으로 용도를 위해 스크리닝된다. 항체 단편들은 변형될 수 있다. 예를 들어, 분자들은 VH 및 VL 도메인들을 연결하는 이황화 다리들의 포함에 의해 안정화될 수 있다(Reiter et al., 1996, Nature Biotech. 14:1239-1245).

면역글로불린 분자들은 단편들로 분해될 수 있다. 분자의 항원 결합 영역은 F(뮤)2 또는 Fab 단편들로 나뉠 수 있다. F(ab')2 단편은 2가이고 Fc 영역이 바람직하지 않거나 필요한 구조가 아닌 경우 유용하다. Fab 단편은 1가이고 항체가 이의 항원에 대해 매우 높은 탐욕을 가질 때 유용하다. Fc 영역을 항체로부터 제거하면 Fc 영역과 Fc 수용체 보유 세포들 사이의 비-특이적 결합을 감소시킨다. Fab 또는 F(ab')2 단편들을 형성하기 위해서, 항체들은 효소에 의해 소화된다. 면역글로불린 분자의 힌지 영역에서 절단되는 프로테아제들은 Fab 도메인들을 연결하는 이황화 결합(들)을 보존하여 절단 이후에 함께 존재한다. 이를 위한 적절한 프로테아제는 펩신이다. Fab 단편들을 생산하기 위해서, 프로테아제들은 절단이 중사슬들을 결합하나 중사슬과 경사슬을 연결하는 이황화 결합을 손상시키지 않는 이황화 결합들을 포함하는 힌지 영역 이상에서 일어나도록 선택된다. Fab 단편들을 제조하기 위한 적절한 프로테아제는 파파인이다. 단편들은, 손상되지 않은 Fc 영역을 필요로 하는 친화성 기술들을 제외하고(예를 들어, 단백질 A 친화성 크로마토그래피), 상기한 방법들에 의해 정제된다.

항체 단편들은 항체들의 제한된 단백질 가수분해에 의해 생산될 수 있고 단백질 가수분해성 항체 단편들로 불린다. 이들은 다음: F(ab')2 단편들, Fab' 단편들, Fab'-SH 단편들 및 Fab 단편들을 포함하나 이에 제한되지 않는다. "F(ab')2 단편들"은 단백질 가수분해성 효소, 예를 들어, 펩신 또는 피신에 대한 항체의 제한된 노출에 의해 항체로부터 방출된다. 한 F(ab')2 단편은 2개의 "암"을 포함하며, 각각은 공통 항원을 향하고 이와 특이적으로 결합하는 가변 영역을 포함한다. 2개의 Fab' 분자들은 중사슬들의 힌지 영역들에서 측쇄 이황화 결합들(interchain disulfide bonds)에 의해 결합되며; Fab' 분자들은 동일(2가) 또는 다른(이중특이성) 에피토프들을 향할 수 있다. "Fab' 단편들"은 Fab 및 힌지 영역을 통과하는 중사슬의 다른 부분을 포함하는 단일 항원 결합 도메인을 포함한다. "Fab'-SH 단편들"은 통상적으로 F(ab')2 단편들로부터 생산되며, F(ab')2 단편에서 H 사슬들 사이의 이황화 결합(들)에 의해 함께 결합된다. 비 제한적인 예인, 베타-머캡토에틸아민과 같은 온화한 환원제에 의한 처리는 이황화 결합(들)을 파괴하고 2개의 Fab' 단편들은 한 F(ab')2 단편으로부터 방출된다. Fab'-SH 단편들은 1가이고 단일특이성이다. "Fab 단편들"(즉, 항원 결합 도메인을 포함하고 경사슬과 이황화 결합에 의해 연결된 중사슬의 일부를 포함하는 항체 단편)은 손상되지 않는 항체들의 파파인 소화에 의해 생산될 수 있다. 편리한 방법은 효소가 쉽게 제거되고 소화가 종료되도록 수지 위에 고정된 파파인을 사용하는 것이다. Fab 단편들은 F(ab')2 단편에 존재하는 H 사슬들 사이에 이황화 결합(들)을 갖지 않는다.

"단일 사슬 항체들"은 한 형태의 항체 단편이다. 단일 사슬 항체라는 용어는 주로 "scFv" 또는 "sFv"로 약칭된다. 이런 항체 단편들은 재조합 DNA 기술을 사용하여 생산된다. 단일 사슬 항체는 항원 결합 위치를 형성하기 위해 상호작용하는 V_H 및 V_L 도메인들을 포함하는 폴리펩타이드 사슬로 구성된다. V_H 및 V_L 도메인들은 주로 10 내지 25개 아미노산 잔기들에 의해 연결된다.

"단일 사슬 항체"라는 용어는 2개의 단일 사슬 항체들(각각은 다른 에피토프를 향할 수 있다)이 이황화 결합에 의해 서로 연결되는 이황화-연결 Fv(dsFv); 다른 특이성의 2개의 구별된 scFvs가 펩타이드 링커에 의해 연결되는 이중특이성 sFv; 다이아바디(제 1 sFv의 VH 도메인이 제 2 sFv의 VL 도메인과 결합하고 제 1 sFv의 VL 도메인이 제 2 sFv의 VH 도메인과 결합할 때 형성된 다이머화된 sFv; 다이아바디의 2개의 항원 결합 영역은 동일하거나 다른 에피토프들을 향할 수 있다); 및 트라이아바디(다이아바디와 동일한 방식으로 형성되나 3개의 항원 결합 도메인들이 단일 착물에 형성된 트라이머화된 sFv; 3개의 항원 결합 도메인들은 동일하거나 다른 에피토프들을 향할 수 있다)를 더 포함하나 이에 제한되지 않는다.

"상보적 결정 영역 펩타이드" 또는 "CDR 펩타이드들"은 항체 단편의 다른 형태이다. 한 실시예에서, 본 발명은 이런 CDR 펩타이드들을 제공한다. 한 바람직한 실시예에서, 이런 CDR 펩타이드들은 14-3-3 에타 길항제들로 작용한다. CDR 펩타이드("최소 인식 단위"로 알려짐)는 단일 상보성-결정 영역(CDR)에 상응하는 펩타이드이고 관심 항체의 CDR를 암호화하는 구조 유전자들에 의해 제조될 수 있다. 이런 유전자들은, 예를 들어, 항체-생산 세포들의 RNA의 가변 영역을 합성하기 위해 폴리머라제 사슬 반응을 사용하여 제조된다. 예를 들어, Larrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106, 1991. 참조.

"시스테인-변형 항체들", "시스테인 아미노산은 유전자 조작에 의해 항체의 표면상에 삽입되거나 치환되며, 예를 들어, 이황화 다리에 의해 다른 분자에 항체를 접합하는데 사용된다. 항체들에 대한 시스테인 치환들 또는 삽입들이 기술된다(미국특허 제 5,219,996호 참조). 항체들의 위치-특이적 컨쥬케이션에 사용하기 위해 Cys 잔기들을 IgG 항체들의 불변 영역 속으로 주입하기 위한 방법들은 스티멜 등에 의해 기술된다(J. Biol. Chem 275:330445-30450, 2000).

본 발명은 인간화된 항체 및 비-인간화된 항체들을 추가로 제공한다. 비-인간(예를 들어, 생쥐)의 항체들의 인간화된 형태들은 비-인간 면역글로불린으로부터 유도된 최소 서열을 함유하는 키메릭 항체들이다. 일반적으로, 인간화된 항체들은 인간 항체들에서 발견된 서열들과 교환된 가변-도메인 프레임워크 영역을 갖는 비-인간 항체들이다. 인간화된 항체들은 인간 면역글로불린들(수신자 항체)일 수 있고 수신자의 초가변 영역으로부터의 잔기들은 원하는 특이성, 친화성 및 능력을 가진 생쥐, 쥐, 토끼 또는 비인간 영장류와 같은 비-인간 종들(제공자 항체)의 초가변 영역으로부터의 잔기들에 의해 대체된다. 일부 경우들에, 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역(FR) 잔기들은 상응하는 비-인간 잔기들에 의해 대체된다. 또한, 인간화된 항체들은 수신자 항체 또는 제공자 항체에서 발견되지 않는 잔기들을 포함할 수 있다. 이런 변형들은 항체 성능을 추가로 개량하게 만들어진다. 일반적으로, 인간화된 항체는 적어도 하나, 통상적으로 2개의 가변 도메인의 실질적으로 전부를 포함할 것이며, 초가변 루프들의 전부 또는 실질적으로 전부는 비-인간 면역글로불린의 초가변 루프들과 상응하며 FRs의 전부 또는 실질적으로 전부는 인간 면역글로불린 서열의 초가변 루프들이다. 인간화된 항체는 선택적으로 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 통상적으로 인간 면역글로불린의 적어도 일부를 포함할 것이다.

일반적으로, 인간화된 항체에서, CDRs를 제외한 전체 항체는 인간 기원의 폴리펩타이드에 의해 암호화되거나 이의 CDRs 내를 제외하고 이런 항체들과 동일하다. CDRs, 이의 일부 또는 전부는 비-인간 유기체에서 기원하는 핵산들에 의해 암호화되고 항체를 형성하기 위해 인간 항체 가변 영역의 베타-시트 프레임워크 속에 이식되고, 이의 특이성은 접붙여진 CDRs에 의해 측정된다. 이런 항체들의 형성은, 예를 들어, WO 92/11018, Jones, 1986, Nature 321:522-525, Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536에 기술된다. 인간화된 항체들은 유전학적으로 가공된 면역 시스템을 가진 생쥐를 사용하여 형성될 수 있다. 예를 들어, Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog. 20:639-654.

작동자 기능에 대한 본 발명의 항체들을 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기(들)는 Fc 영역 속에 주입될 수 있어서, 이 영역에서 측쇄 이황화 결합을 형성시킨다. 호모다이머 항체들은 이형이중기능성 가교제들을 사용하여 제조될 수 있다, 예를 들어, Wolff et al. Cancer Research, 53:2560-2565 (1993). 또한, 항체는 이중 Fc 영역을 갖도록 가공될 수 있다. 예를 들어, Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3:219-230 (1989) 참조.

변형 항체들

한 실시예에서, 본 발명은 변형 항체들인 안티-14-3-3 에타 항체들을 제공한다. 변형 항체들은 본 명세서에서 기술된 대로 재조합 항체들을 포함한다.

변형 또는 재조합 항체들의 여러 형태는 당업자가 알 것이다. 변형 또는 재조합 항체들의 적절한 형태는, 제한 없이, 본 명세서에 기술된 가공된 단클론 항체들(예를 들어, 키메릭 단클론 항체들, 인간화된 단클론 항체들), 도메인 항체들(예를 들어, Fab, Fv, VH, scFV, 및 dsFv 단편들), 다가 또는 다중특이성 항체들(예를 들어, 다이아바디, 미니바디, 미니안티바디, (scFV)2, 트라이바디 및 테트라바디), 및 항체 컨쥬케이트를 포함한다.

한 태양에서, 본 발명은 도메인 항체들인 안티-14-3-3 에타 항체들을 제공한다. "도메인 항체들"은 인간 항체들의 중사슬(VH) 또는 경사슬(VL)의 가변 영역들에 상응하는 항체들의 기능성 결합 도메인들이다. 도메인 항체들은 대략 13kDa의 분자량 또는 전체 항체의 1/10 미만의 크기를 가질 수 있다. 이들은 박테리아, 효모 및 포유류 세포 시스템을 포함하는 다양한 숙주들에서 잘 발현된다. 또한, 도메인 항체들은 동결 건조 또는 열 변성과 같은 가혹한 조건들에 놓인 후에도 매우 안정하고 활성을 가진다. 예를 들어, 미국특허 6,291,158; 6,582,915; 6,593,081; 6,172,197; 미국연속번호. 2004/0110941; 유럽특허 0368684; 미국특허 6,696,245, WO04/058821, WO04/003019 및 WO03/002609 참조. 한 실시예에서, 본 발명의 도메인 항체는 단일 도메인이다. 단일 도메인 항체들은, 예를 들어, 미국특허 6,248,516에 개시된 대로 제조될 수 있다.

다른 태양에서, 본 발명은 다중 특이성 항체들을 포함한다. 다중 특이성 항체들은 이중특이성, 삼중특이성 등의 항체들을 포함한다. 이중특이성 항체들은, 예를 들어, 루신 지퍼 모이어티들(즉, 헤테로다이머들을 우선적으로 형성하는 Fos 및 Jun 단백질들로부터; Kostelny et al., 1992, J. Immnol. 148:1547) 또는 예를 들어, 미국특허 5,582,996에 기술된 다른 락 및 키 상호작용 도메인 구조들을 사용함으로써 재조합 수단을 통해 생산될 수 있다. 다른 유용한 기술들은 미국특허 5,959,083 및 미국특허 5,807,706에 개시된 것들을 포함한다.

이중특이성 항체들은 "다이아바디"로 때때로 불린다. 이들은 2개(또는 이상)의 다른 항원들에 결합하는 항체들이다. 또한 트라이아바디(다이아바디와 동일한 방식으로 형성되나 3개의 항원 결합 도메인들이 단일 착물에 형성된 트라이머화된 sFv; 3개의 항원 결합 도메인들은 동일하거나 다른 에피토프들을 향할 수 있다) 또는 테트라바디(4개의 항원 결합 도메인들이 동일하거나 다른 에피토프들을 향할 수 있는 단일 착물에 형성된 4개의 항원 결합 도메인들)가 당업계에 공지된다. 다이아-, 트라이아- 및 테트라바디는 당업계에 공지된 여러 방법(예를 들어, Holliger and Winter, 1993, Current Opinion Biotechnol. 4:446-449)으로 제조될 수 있으며, 예를 들어, 화학적으로 또는 혼성 하이브리도마로부터 제조될 수 있다. 또한, 이런 항체들과 이의 단편들은 유전자 융합에 의해 제조될 수 있다(예를 들어, Tomlinson et. al., 2000, Methods Enzymol. 326:461-479; WO94/13804; Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448).

다른 태양에서, 본 발명은 미니바디들을 제공하며, CH3 도메인에 결합된 scFV를 포함하는 최소화된 항체 유사 단백질들이며, 안티-14-3-3 에타 항체로부터 유도된다. 미니바디는 당업계에 개시된 대로 제조될 수 있다(예를 들어, Hu et al., 1996, Cancer Res. 56:3055-3061).

다른 실시예에서, 본 발명은 14-3-3 에타 결합 도메인 면역글로불린 융합 단백질들을 제공한다. 한 실시예에서, 융합 단백질은 면역글로불린 중사슬 CH3 불변 영역 폴리펩타이드에 융합된 면역글로불린 중사슬 CH2 불변 영역 폴리펩타이드에 융합된 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩타이드에 융합된 14-3-3 에타 결합 도메인 펩타이드를 포함할 수 있다. 본 발명하에서, 14-3-3 항체 융합 단백질들은 당업자가 아는 방법들에 의해 제조될 수 있다(예를 들어, 공개된 US 특허출원 20050238646, 20050202534, 20050202028, 2005020023, 2005020212, 200501866216, 20050180970, 및 20050175614 참조).

다른 실시예에서, 본 발명은 안티-14-3-3 에타 항체로부터 유도된 중사슬 단백질을 제공한다. 자연적으로 발생하는 중사슬 항체들(예를 들어, 경사슬들이 없는 카멜다 항체들)은 자연적으로 발생하는 중사슬 항체들의 구조와 기능적 특성들을 통상적으로 보유하는 항체-유도 치료 단백질들을 개발하는데 사용되었다. 이들은 당업계에 나노바디로 공지되어 있다. 안티-14-3-3 에타 중사슬 항체로부터 유도된 중사슬 단백질들은 당업자가 아는 방법들에 의해 제조될 수 있다(예를 들어, 공개된 US 특허출원 20060246477, 20060211088, 20060149041, 20060115470, 및 20050214857). 또한, 경사슬 결핍 생쥐에서 단지 중사슬 항체들의 생산에 관해서는, 예를 들어, Zou et al., JEM, 204:3271-3283, 2007 참조.

한 태양에서, 본 발명은 인간 항체들인 변형 항체들을 제공한다. 한 실시예에서, 완전한 인간 14-3-3 항체들이 제공된다. "완전한 인간 항체(fully human body)" 또는 "완전 인간 항체(complete human antibody)"는 인간 염색체로부터 유도된 항체의 유전자 서열만을 가진 인간 항체를 의미한다. 안티-14-3-3 완전 인간 항체는 인간 항체의 중사슬과 경사슬에 대한 유전자들을 함유하는 인간 염색체 단편을 가진 인간 항체-생산 생쥐를 사용하는 방법(예를 들어, Tomizuka, K. et al., Nature Genetics, 16, p.133-143, 1997; Kuroiwa, Y. et al., Nuc. Acids Res., 26, p.3447-3448, 1998; Yoshida, H. et al., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects vol. 10, p.69-73 (Kitagawa, Y., Matuda, T. and Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999; Tomizuka, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 722-727, 2000 참조) 또는 인간 항체 라이브러리로부터 선택된 파이지 디스플레이로부터 유도된 인간 항체를 얻기 위한 방법(예를 들어, Wormstone, I. M. et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43(7), p.2301-8, 2002; Carmen, S. et al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics, 1 (2), p.189-203, 2002; Siriwardena, D. et al., Ophthalmology, 109(3), p.427-431, 2002)에 의해 얻어질 수 있다.

한 태양에서, 본 발명은 때때로 "합성 항체들"로 불리는 항체 유사체인 14-3-3 항체가 제공된다. 예를 들어, 컨쥬케이트된 CDRs를 가진 다른 단백질 스캐폴드 또는 인공 스캐폴드가 사용될 수 있다. 이런 스캐폴드는 생분해성 폴리머들로 이루어진 합성 스캐폴드를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, Korndorfer et al., 2003, Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, Volume 53, Issue 1:121-129. Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog. 20:639-654 참조. 또한, 펩타이드 항체 모방체들("PAMs")뿐만 아니라 스캐폴드로서 피브로넥틴 구성요소를 사용하는 항체 모방체들이 사용될 수 있다.

한 태양에서, 본 발명은 항체 착물들을 형성하기 위해 서로 결합된 둘 이상의 항체들을 포함하는 가교 항체들을 제공한다. 가교 항체들은 항체 멀티머, 호모컨쥬케이트 및 헤테로컨쥬케이트로 불린다.

일부 실시예들에서, 본 명세서에 제공된 항체 착물들은 안티-14-3-3 항체들의 멀티머 형태를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 항체 착물들은 모노머 면역글로불린 분자들의 항체 다이머들, 트라이머들 또는 더 높은 등급의 멀티머들의 형태를 가질 수 있다. 항체들의 가교는 당업계에 공지된 다양한 방법들을 통해 이루어질 수 있다. 예를 들어, 항체들의 가교는 항체들의 자연적 응집, 화학적 또는 재조합 연결 기술들 또는 당업계에 공지된 다른 방법들을 통해 수행될 수 있다. 예를 들어, 정제된 항체 제제들은 항체 호모다이머들을 함유하는 단백질 응집체들 또는 다른 높은 등급의 멀티머들을 동시에 형성할 수 있다.

한 실시예에서, 본 발명은 14-3-3 에타에 특이적으로 결합하는 호모다이머화된 항체들을 제공한다.

항체들은 당업계에 공지된 연결 기술들을 통해 가교되거나 다이머화될 수 있다. 부착의 비-공유 방법들이 사용될 수 있다. 구체적인 한 실시예에서, 항체들의 가교는 제 2 가교제 항체의 사용을 통해 이루어질 수 있다. 가교제 항체는 관심 항체와 비교해서 다른 동물로부터 유도될 수 있다. 예를 들어, 염소 안티-생쥐 항체(Fab 특이적)는 생쥐 단클론 항체에 첨가되어 헤테로다이머를 형성할 수 있다. 이 2가 가교제 항체는 호모다이머를 형성하는 2개의 관심 항체들의 Fab 또는 Fc 영역을 인식한다.

본 발명의 한 실시예에서, 14-3-3 항원과 특이적으로 결합하는 항체는 염소 안티-생쥐 항체(GAM)를 사용하여 가교된다. 다른 실시예에서, GAM 가교제는 2개의 항체들의 Fab 또는 Fc 영역을 인식하며, 이의 각각은 14-3-3 에타와 특이적으로 결합한다.

항체들의 공유 또는 화학적 부착에 대한 방법들이 사용될 수 있다. 화학적 가교제들은 호모 또는 헤테로이중기능성일 수 있고 호모다이머를 형성하는 2개의 항체들과 공유결합적으로 결합될 것이다. 가교제들은 당업계에 주지되어 있다; 예를 들어, 호모- 또는 헤테로-이중기능성 링커들이 주지되어 있다(the 2006 Pierce Chemical Company Crosslinking Reagents Technical Handbook; Hermanson, G.T., Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, CA (1996); Aslam M. and Dent AH., Bioconjugation: protein coupling techniques for the biomedical sciences, Houndsmills, England: Macmillan Publishers (1999); Pierce: Applications Handbook & Catalog, Perbio Science, Ermbodegem, Belgium (2003-2004); Haughland, R.P., Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals Eugene, 9th Ed., Molecular Probes, OR (2003); 및 미국특허 5,747,641 참조). 당업자들은 가교를 포함하는 변형을 위한 항체의 아미노산(들)에 대한 여러 작용기들의 적응성을 알 것이다. 항체 가교를 위해 사용된 화학적 가교제들의 적절한 예들은 SMCC[succinimidyl 4-(maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate], SATA[N-succinimidyl S-acethylthio-acetate], N-하이드록시숙신이미드의 헤미-숙시네이트 에스터; 설포-N-하이드록시-숙신이미드; 하이드록시벤조트라이아졸 및 p-나이트로페놀; 다이사이클로헥실카보다이이미드(DCC), 1-(3-다이메틸아미노프로필)-3-에틸카보다이이미드(ECD) 및 1-(3-다이메틸아미노프로필)-3-에틸카보다이이미드 메티오다이드(EDCI)을 포함하나 이에 제한되지 않는다(예를 들어, 미국특허 4,526,714, 이의 명세서는 본 발명에 참조로 완전히 포함된다). 다른 연결 시약들은 구아티온, 3-(다이에톡시포스포릴옥시)-1,2,3-벤조트라이아진-4(3H)-온(DEPBT), 오늄 염-계 결합 시약들, 폴리옥시에틸렌계 헤테로이중기능성 가교 시약들, 및 다른 시약을 포함한다(Haitao, et al., Organ Lett 1:91-94 (1999); Albericio et al., J Organic Chemistry 63:9678-9683 (1998); Arpicco et al., Bioconjugate Chem. 8:327-337 (1997); Frisch et al., Bioconjugate Chem. 7:180-186 (1996); Deguchi et al., Bioconjugate Chem. 10:32-37 (1998); Beyer et al., J. Med. Chem. 41:2701-2708 (1998); Drouillat et al., J. Pharm. Sci. 87:25-30 (1998); Trimble et al., Bioconjugate Chem. 8:416-423 (1997)). 항체 호모다이머들의 형성을 위한 예시적 프로토콜들은 미국특허공보 20060062786에 제공된다. 치료 화합물들을 항체들에 접합하기 위한 기술들은 Arnon et al., "Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy," in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld et al., ed., pp243-256, Alan R. Liss, Inc.(1985); Thorpe, et al. "The Preparation and Cytotoxic Properties of Antibody Toxin Conjugates," Immuno. Rev.62:119-58(1982); and Pietersz, G.A., "The linkage of cytotoxic drugs to monoclonal antibodies for the treatment of cancer," Bioconjuages Chemistry 1(2):89-95(1990)에 기술되며, 모든 참조문헌들은 참조로 본 발명에 포함된다.

또한, 본 발명의 항체-항체 컨쥬케이트들은 헤테로이중기능성 가교 시약들, GMBS(말레이미도뷰트릴옥시 숙신이미드) 및 SPDP(N-숙신이미딜 3-(2-파이리딜다이티오)프로피오네이트)의 사용과 같은 당업계에 공지된 기술들에 의해 서로 공유결합적으로 결합될 수 있다[예를 들어, Hardy, "Purification And Coupling Of Fluorescent Proteins For Use In Flow Cytometry", Handbook Of Experimental Immunology, Volume 1, Immunochemistry, Weir et al. (eds.), pp. 31.4-31.12 4th Ed., (1986), and Ledbetter et al. U.S. Patent No. 6,010,902 참조]

또한, 항체들은 미국특허공보 20060216284, 미국특허 6,368,596에 기술된 티오에터 가교를 통해 연결될 수 있다. 당업자들이 알 수 있듯이, 항체들은 Fab 영역에서 가교될 수 있다. 일부 실시예들에서, 화학적 가교제는 항체 기능에 영향을 줄수 있듯이 항체의 항원 결합 영역과 상호작용하지 않는 것이 바람직하다.

컨쥬케이트된 항체들

본 발명에 개시된 안티-14-3-3 에타 항체들은 예를 들어, 다른 단백질들, 핵산들, 탄수화물들, 스테로이드들 및 지질들을 포함하나 이에 제한되지 않는 무기 또는 유기 화합물들에 컨쥬케이트된 항체들을 포함한다(예를 들어, Green, et al., Cancer Treatment Reviews, 26:269-286 (2000) 참조). 화합물은 생체활성일 수 있다. 생체활성은 화합물에 노출되지 않은 세포와 비교할 때 세포에 대한 생리학적 효과를 가진 화합물을 의미한다. 생리학적 효과는 DNA 복제 및 회복, 재조합, 전사, 번역, 분비, 막 전환, 세포 접착, 신호 변환, 세포 사망 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 생물학적 공정에서의 변화이다. 생체활성 화합물은 약학적 화합물들을 포함한다. 한 실시예에서, 안티-14-3-3 에타 항체는 바람직하게는 R-18, 바람직하게는 링커를 통해 14-3-3 길항제 펩타이드에 컨쥬케이트된다.

펩타이드들

한 태양에서, 본 발명은 펩타이드들인 14-3-3 길항제들을 제공한다. 이런 펩타이드들은 CDR 펩타이들을 포함한다.

한 태양에서, 펩타이드는 안티-14-3-3 항체 또는 다른 14-3-3 길항제 펩타이드에 결합할 수 있는 14-3-3 단백질의 영역에 결합한다. 본 명세서에서 사용된 "펩타이드" 또는 "올리고펩타이드"라는 용어는 펩타이드 유사체, 유도체, 융합 단백질 등뿐만 아니라 본 명세서에서 예시한 것들을 포함하는 펩타이드 조성물들을 포함하는 것을 의미한다.

한 바람직한 실시예에서, 펩타이드는 "R-18"로 지정된 아미노산 서열을 포함한다. 다른 바람직한 실시예에서, 펩타이드는 필수적으로 R-18 서열로 이루어진다. 다른 바람직한 실시예에서, 펩타이드는 R-18 서열의 부분을 포함한다. 다른 바람직한 실시예에서, 펩타이드는 바람직하게는 링커에 의해 분리된 R-18 서열의 여러 반복을 포함한다.

다른 바람직한 실시예에서, 펩타이드는 R-18에 결합할 수 있는 14-3-3 단백질의 영역에 결합된다. 다른 바람직한 실시예에서, 펩타이드는 세포내 14-3-3 결합 파트너, 바람직하게는 Raf에 결합할 수 있는 14-3-3 단백질의 영역에 결합한다.

한 실시예에서, 펩타이드는 세포내 14-3-3 결합 파트너에 대한 14-3-3 단백질의 파괴된 결합 없이 14-3-3 단백질에 결합한다.

한 실시예에서, 14-3-3 길항제는 포스포펩타이드이다.

펩타이드 변형

주제 펩타이드들은 당업자에게 주지된 여러 통상적인 방법으로 변형될 수 있다. 임의의 수의 변형들은 원하는 특성들을 가진 펩타이드를 얻기 위해 수행될 수 있다. 본 발명의 펩타이드가 필요한 것은 14-3-3 길항제로 작용하는 능력을 보유하는 것이다.

변형들의 예는 다음을 포함한다. 펩타이드의 말단 아미노기 및/또는 카복실기 및/또는 아미노산 측쇄들은 에스터, 아마이드 또는 치환된 아미노기들을 제공하는 알킬화, 아미드화 또는 아실화에 의해 변형될 수 있다. 이형원자들은 지방족 변형 그룹들에 포함될 수 있다. 이것은 통상적인 화학 합성법들을 사용하여 이루어진다. 다른 변형들은 각각 글루타밀 및 아스파르틸 잔기들에 상응하는 글루타밀 및 아스파라진일 잔기들의 탈아민화; 프롤린과 리신의 수산화; 세린 또는 트레오닌의 하이드록실기의 인산화; 및 리신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄들의 아미노기들의 메틸화를 포함한다(예를 들어, T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co. San Francisco, Calif., 1983 참조).

다른 태양에서, 하나 또는 둘, 주로 펩타이드의 한 말단은 친유성기, 이형원자들을 포함할 수 있는 주로 지방족 또는 아르알킬기로 치환될 수 있다. 사슬들은 포화되거나 불포화될 수 있다. 통상적으로, 카프릴산, 카프리산, 라우리산, 미리스티산 및 미리스틸 알콜, 팔미트산, 팔미톨레산, 스테아르산 및 스테아릴 아민, 올레산, 리놀레산, 도코사헥세노산 등과 같은 구입할 수 있는 지방족 지방산, 알콜 및 아민이 사용될 수 있다(예를 들어, 미국특허 6,225,444 참조). 14-22 탄소 원자 길이의 가지가 없는 자연적으로 발생하는 지방산들이 바람직하다. 다른 친유성 분자들은 그리세릴 지질 및 콜레스테롤과 같은 스테롤을 포함한다. 친유성 그룹들은, 지지체에 대한 올리고뉴클레오티드의 결합 위치에 따라, 주로 지지체 상에서 합성하는 동안, 통상적인 방법들에 따라 올리고펩타이드 상의 적절한 작용기들과 반응할 수 있다. 지질 결합은 펩타이드들과 물질들을 숙주 속에 투여하기 위한 다른 치료제들과 함께 리포솜의 루멘 속으로 주입될 수 있을 때 유용하다.

다른 실시예들에서, 각각 또는 둘 다의 펩타이드의 N- 및 C-말단은 많아야 전체 약 100개, 주로 많아야 전체 약 30개, 더욱 일반적으로 많아야 약 20개 아미노산, 종종 많아야 약 9개 아미노산에 의해 연장될 수 있고, 아미노산들은 25%보다 적은, 더욱 일반적으로 20% 보다 적은 극성 아미노산, 더욱 특히 하전된 아미노산들인 20%보다 적은 극성 아미노산을 가질 것이다. 따라서, 각 방향에서 상기 서열들의 연장은 주로 친유성인 하전되지 않은 아미노산, 특히 비극성 지방족 아미노산 및 방향족 아미노산으로 주로 수행된다. 펩타이드들은 L-아미노산, D-아미노산, 또는 D- 및 L-아미노산을 포함할 수 있다. 아미노산 연장의 수에 대한 예외는 올리고뉴클레오티드들이 아래 기술된 대로 융합 또는 키메릭 단백질들로 발현되는 경우 고려된다.

펩타이들은 헤드 투 헤드, 테일 투 테일 또는 헤드 투 테일일 수 있고, 바람직하게는 펩타이드의 많아야 6개 반복체를 가진 올리고머들, 특히 펩타이들의 다이머들의 형태일 수 있다. 올리고머는 모든 아미노산까지, 하나 이상의 D-입체이성질체 아미노산들 함유할 수 있다. 올리고머들은 펩타이들 사이에 링커 서열들을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 적절한 링커들은 하전되지 않은 아미노산들 및 (Gly)n, 여기서 n은 1-7, Gly-Ser (예를 들어, (GS)_n, (GSGGS)_n 및 (GGGS)_n,여기서 n은 적어도 1), Gly-Ala, Ala-Ser 또는 당업계에 공지된 다른 유연한 링커들을 포함하는 것들을 포함하나 이에 제한되지 않는다. Gly 또는 Gly-Ser의 링커들이 사용될 수 있는데 이는 이들 아미노산들이 비교적 구조를 갖지 않아서, 개별 펩타이드들과 세포 표적 분자들의 상호작용을 허용하고 올리고머의 펩타이들 사이의 구조적 불안을 제한한다. 아미노산들 이외의 링커들은 올리고머 펩타이드들을 제조하는데 사용될 수 있다는 것을 이해해야 한다.

펩타이드들은 바람직하게는 약 9-50, 주로 12 내지 36개 아미노산들의 사이클릭 펩타이드들과 같은 구조적으로 제한된 형태일 수 있고, 특정 아미노산들 이외의 아미노산들은 다리로 존재할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 말단 시스테인들의 첨가는 고리 펩타이드를 형성하는 이황화 다리들이 생기게 한다. 일부 경우에서, 펩타이드를 고리화하기 위해 아미노산들 이외의 것을 사용할 수 있다. 이중기능성 가교제들은 펩타이드의 둘 이상의 아미노산들을 연결하는데 유용하다. 고리를 형성하는 다른 방법들은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, Chen, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5872-5876 (1992); Wu, T. P. et al., Protein Engineering 6:471478 (1993); Anwer, M. K. et al., Int. J. Pep. Protein Res. 36:392-399 (1990); and Rivera-Baeza, C. et al. Neuropeptides 30: 327-333 (1996) 참조. 또한, 구조적으로 제한된 펩타이드들은 펩타이드의 N- 및 C-말단에 다이머화 서열들의 첨가에 의해 이루어지며, 다이머화 서열들 사이의 상호작용이 고리형 구조의 형성을 유도한다(예를 들어, WO/0166565 참조). 다른 경우에, 주제 펩타이드들은 휘감긴 코일의 루프 또는 β-턴 구조와 같은 표면 노출 구조상에 제한된 표시를 위한 스캐폴드를 제공하는 다른 단백질들에 대한 융합으로 발현된다.

의도한 용도에 따라, 특히 포유류 숙주들에 투여하기 위해서, 주제 펩타이드들은 담체 분자들 속에 포함되고, 펩타이드 생체활성을 변화시키고, 반감기를 연장 또는 감소하고, 다양한 조직들 또는 혈류에 대한 방해를 제어하고, 혈액 성분들에 대한 결합을 감소 또는 강화하는 것 등을 위해 다른 구성요소들에 결합되어 변형될 수 있다. 피험자 펩타이드들은 생리학적 환경에서 절단되거나 절단되지 않는 링커들, 예를 들어, 활막에 있는 MMPs에 의해 이런 다른 구성요소들에 결합될 수 있다. 펩타이드들은 하이드록실, 티올, 카복실, 아미노 등과 같은 작용기가 존재하는 펩타이드의 임의의 점에서 결합될 수 있다. 바람직하게는, 변형은 N-말단 또는 C-말단에서 일어날 것이다. 예를 들어, 주제 펩타이드들은 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 카복시메틸 셀룰로오스, 덱스트란, 폴리바이닐 알콜, 폴리바이닐파이롤리딘, 폴리프롤린, 폴리(다이바이닐-에터-코-말레 무수물), 폴리(스타이렌-코-말레 무수물) 등과 같은 공유 결합 폴리머들에 의해 변형될 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리바이닐파이롤리딘과 같은 수용성 폴리머들은 변형되지 않은 화합물들과 비교해서 혈액으로부터 부착된 화합물들을 제거를 감소시키는 것으로 알려져 있다. 변형들은 수성 매질에서 용해도를 증가시킬 수 있고 펩타이드들의 응집을 감소시킬 수 있다. 필요한 것은, 전달 및/또는 방출될 때 펩타이드가 14-3-3 길항제 기능을 보유하는 것이다.

펩타이드 컨쥬케이트 및 융합 단백질

한 실시예에서, 펩타이드는 펩타이드를 탐지하고 분리하기 위해 또는 올리고펩타이드를 특정 세포, 조직 또는 기관에 표적화하거나 수송하기 위해 위한 소형 분자들에 컨쥬케이트된다. 소형 분자 컨쥬케이트들은 이들이 동물 속에 주입될 때 면역 반응을 개시하지 않는 물질들인 합텐(haptens)을 포함한다. 일반적으로, 합텐들은 약 2kD 미만, 더욱 바람직하게는 약 1kD 미만의 분자량의 소형 분자들이다. 합텐들은 소형 유기 분자들(예를 들어, p-나이트로페놀, 다이곡신, 헤로인, 코카인, 모르핀, 메스칼린, 리세르기산, 테트라하이드로칸나비놀, 칸나비놀, 스테로이드, 펜타아미딘, 바이오틴 등)을 포함한다. 예를 들어, 탐지 또는 정제를 위해 합텐에 결합하는 것은 바이오틴과 결합하는 아비딘과 같은 합텐 특이적 항체들 또는 특이적 결합 파트너들에 의해 이루어진다.

특이적 세포들 또는 조직들에 컨쥬케이트들을 표적화하는 소형 분자들이 사용될 수 있다.

당업계에 주지된 레이블들은 진단 방법들에서 이런 컨쥬케이트들의 사용을 위해 본 발명의 펩타이드들에 결합할 수 있다는 것이 이해될 것이다.

한 실시예에서, 펩타이드들은 다양한 목적을 위해서 매우 다양한 다른 펩타이들 또는 단백질들 중 임의의 것에 결합한다. 펩타이드들은, 아미드 또는 치환된 아민 형성, 예를 들어, 환원성 아미드화를 위한 아미노기들; 티오에터 또는 이황화 형성을 위한 티올 기들; 아미드 형성을 위한 카복실기 등과 같은 결합을 위한 편리한 기능성들을 제공하기 위해 펩타이드들 또는 단백질들에 연결될 수 있다. 특히 관심이 있는 것은 적어도 2, 더욱 일반적으로 3개, 많아야 약 60개 리신 기들, 특히 약 4 내지 20개, 주로 6 내지 18개 리신 단위의 폴리리신들의 펩타이드이며, 다중 항원성 펩타이드 시스템(MAPS)로 불리고, 주제 펩타이드들은 리신 아미노기들, 일반적으로 적어도 약 20%, 더욱 일반적으로 적어도 약 50%의 이용가능한 아미노기들에 결합되어, 멀티펩타이드 생성물을 제공한다(Butz, S. et al., Pept. Res. 7: 20-23 (1994)). 이런 방식으로, 복수의 주제 펩타이들을 가진 분자들이 얻어지며 주제 펩타이드들의 배향은 동일한 방향이어서, 사실상, 이 연결 그룹은 테일 투 테일 다이 또는 올리고머화를 위해 제공된다.

한 실시예에서, 펩타이드들은 올리고펩타이드를 세포들과 조직들에 표적화하고 또는 추가의 기능성들을 펩타이드들에 제공하기 위해 다른 펩타이드 또는 단백질에 컨쥬케이트된다. 표적화를 위해서, 컨쥬케이션에 사용된 단백질 또는 펩타이드는 치료를 위해 세포 또는 조직을 기초로 하여 선택될 것이다(Lee, R. et al., Arthritis. Rheum. 46: 2109-2120 (2002); Pasqualini, R., Q. J. Nucl. Med. 43: 159-62 (1999); Pasgualinl, R., Nature 380: 364-366 (1996)). 단백질들은 컨쥬케이트 펩타이드들을 함유하는 소포 또는 입자들의 제조를 위한 폴리에틸렌 글리콜과 같은 다른폴리머들 속에 포함될 수 있는 폴리아르기닌; 및 폴리리신, 폴리아스파르트산 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 폴리 아미노산들을 포함할 수 있다.

한 실시예에서, 주제 펩타이드들은 다른 펩타이드들 또는 단백질들과 결합하도록 발현되거나 합성될 수 있고, 키메릭 단백질 또는 융합 단백질들을 형성하기 위해, 내부 또는 N-말단 또는 C-말단에 있는 폴리펩타이드 사슬의 일부일 수 있다. 본 명세서에서 사용된 "융합 폴리펩타이드" 또는 "융합 단백질" 또는 "키메릭 단백질"은 고유 상태로 통상적으로 결합되며, 연속된 폴리펩타이드를 형성하기 위해 펩타이드 연결을 통해 개개의 아미노 및 카복시 말단에 의해 결합되는 복수의 단백질 구성요소로 구성된 단백질을 의미한다. 단백질 구성요소들은 직접 결합되거나 펩타이드 링커/스페이서를 통해 결합될 수 있다.

융합 폴리펩타이드들은 세포들과 조직들을 표적화하고, 세포내 격실들에 대해 표적화하고, 세포 또는 유기체 속 융합 단백질을 추적하고, 올리고펩타이드들과 결합하는 다른 분자들에 대해 스크리닝하기 위해, 구조상으로 제한된 형태의 주제 폴리펩타이드들을 전시하는 다양한 펩타이드들 또는 단백질들로 만들어질 수 있다. 융합 단백질들을 생성하는데 유용한 단백질들은 다양한 리포터 단백질들, 구조 단백질들, 세포 표면 수용체들, 수용체 리간드들, 독소들 및 효소들을 포함한다. 예시적 단백질들은 형광 단백질(예를 들어, 아에쿠오디아 빅토리아 GFP, 레닐라 레니포니스 GFP, 레닐라 무엘레디 GFP, 루시페라제 등 및 이의 변형체); β-갈락토시다아제; 알칼리 포스파타아제; 대장균 말토즈 결합 단백질; 필라멘트성 박테리아파아지의 코팅 단백질; T 세포 수용체; 카리브도톡신 등을 포함한다.

융합 단백질들은 단독 또는 더 큰 단백질 서열의 일부로서, 단백질들 또는 다른 펩타이드들의 단편들과의 융합을 포함한다. 따라서, 융합 폴리펩타이드들은 융합 파트너들을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 "융합 파트너들"은 그 종류의 단백질들의 모든 구성원들에 공통적인 기능 또는 활성을 제공하는 펩타이드와 관련된 서열을 의미한다. 융합 파트너들은 이형적(즉, 숙주 세포에 대해 고유하지 않음) 또는 합성적(즉, 임의의 세포에 대해 고유하지 않음)일 수 있다. 융합 파트너들은 a) 구조적으로 제한되거나 안정한 형태로 올리고펩타이드들을 제공하는 제공 구조들(presentation structures); b) 세포 아래 또는 세포외 격실에 대한 펩타이드의 국소화를 일으키는 표적화 서열들; c) 펩타이드 또는 이를 암호화하는 핵산에 대한 열화에 의한 안정성 또는 보호에 영향을 주는 안정성 서열; d) 융합 파트너로부터 올리고펩타이드를 구조적으로 분리하는 링커 서열들 및 e) 상기의 임의의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

한 태양에서, 융합 파트너는 제공 구조이다. 본 명세서에서 사용된 대로 "제공 구조"는 구조적으로 주제 펩타이드들에 융합될 때 제한된 형태의 펩타이드들을 제공하는 서열을 의미한다. 바람직한 제공 구조들은 용매 노출된 외부 표면상에 펩타이드를 제공함으로써 다른 결합 파트너들과의 상호작용을 강화한다. 일반적으로, 이런 제공 구조들은 올리고펩타이드의 N-말단에 결합된 제 1 부분 및 올리고펩타이드의 C-말단에 결합된 제 2 부분을 포함한다. 즉, 본 발명의 펩타이드는 제공 구조들 속에 삽입된다. 바람직하게는, 제공 구조들은 표적 세포들에서 발현될 때 최소 생물학적 활성을 갖도록 선택되거나 설계된다.

바람직하게는, 제공 구조들은 펩타이드 또는 외부 루프를 전시하거나 제공함으로써 펩타이드들에 대한 접근성을 최대화한다. 적절한 제공 구조들은 감긴 코일 뿌리 구조들, 미니바디 구조들, β턴 상의 루프들, 다이머화 서열들, 시스테인 연결 구조들, 트랜스글루타미나제 연결 구조들, 고리 펩타이드들, 나선 원통들, 루신 지퍼 모티프 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

한 실시예에서, 제공 구조는 외부 루프 상에 주제 펩타이드를 제공하게 하는 휘감긴 코일 구조(예를 들어, Myszka, D. G. et al., Biochemistry 33: 2363-2373 (1994)), 예를 들어, 휘감긴 코일 루신 지퍼 도메인이다(Martin, F. et al., EMBO J. 13: 5303-5309 (1994)). 제공 구조는 최소 항체 상보 영역으로 필수적으로 이루어진 미니바디 구조들을 포함할 수 있다. 미니바디 구조는 일반적으로 접힌 단백질에서 3차 구조의 단일 면을 따라 제공되는 2개의 펩타이드 영역을 제공한다(예를 들어, Bianchi, E. et al., J. Mol. Biol. 236: 649-659 (1994); Tramontano, A. et al., J. Mol. Recognit. 7: 9-24 (1994)). 당업계에 공지된 단백질-단백질 상호작용 서열들의 임의의 수도 본 목적을 위해 유용하다.

다른 태양에서, 제공 구조는 2개의 다이머화 서열을 포함한다. 동일하거나 다를 수 있는 다이머화 서열들은 전시된 펩타이드를 구조적으로 제한하기 위해 생리학적 조건하에서 충분한 친화력으로 비 공유적으로 결합한다. 따라서, 다이머화 서열이 주제 올리고펩타이드의 각 말단에 사용되는 경우, 최종 구조는 구조적으로 제한되거나 제한된 형태로 주제 펩타이드를 전시할 수 있다. 여러 서열들이 다이머화 서열들로서 적합하다(예를 들어, 참조로 포함된 WO 99/51625 참조). 당업계에 공지된 어떤 수의 단백질-단백질 상호작용 서열들도 이 목적을 위해 유용하다.

다른 태양에서, 제공 서열은 구조적으로 제한된 제 2 구조를 형성하도록 금속 이온들과 결합하는 능력을 제공한다. 따라서, 예를 들어, C2H2 아연 핑거 서열들이 사용된다. C2H2 서열들은 아연 이온이 킬레이트화되도록 위치한 2개의 시스테인과 2개의 히스티딘을 가진다. 아연 핑거 도메인들은 구조적으로 독립적이고, 유연하게 연결된 도메인들을 형성하기 위해 여러 아연 핑거 펩타이드들에서 독립적으로 발생하는 것으로 알려져 있다(예를 들어, Nakaseko, Y. et al., J. Mol. Biol. 228: 619-636 (1992)). 일반적인 일치 서열은 (5 아미노산)-C-(2 내지 3 아미노산)-C-(4 내지 12 아미노산)-H-(3 아미노산)-H-(5 아미노산)이다. 바람직한 예는 3 내지 20개 아미노산-HIRSHTG의 FQCEEC-랜덤 펩타이드일 수 있다. 유사하게, -C-(2 아미노산)-C-(4 내지 20 랜덤 펩타이드)-H-(4 아미노산)-C-(SEQ ID NO:68)을 가진 CCHC 박스들이 사용될 수 있다(Bavoso, A. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 242: 385389 (1998)). 다른 예들은 (1) 뉴클레오캡시드 단백질 P2를 기초로 한 -VKCFNC4 내지 20개 랜덤 아미노산들 - HTARNCR-; (2) Lasp-1 LIM 도메인의 자연적으로 발생하는 아연-결합 펩타이드로부터 변형된 서열(Hammarstrom, A. et al., Biochemistry 35: 12723-32 (1996)); 및 (3) NMR 구조 앙상블 IZFP를 기초로 한 -MNPNCARCG4 내지 20개 랜덤 아미노산 - HKACF -(Hammarstrom et al., 이하)를 포함한다.

또 다른 태양에서, 제공 구조는 둘 이상의 시스테인 잔기들을 포함하는 서열이며, 이황화 결합이 형성되어, 구조적으로 제한된 구조를 형성한다. 즉, 주제 올리고뉴클레오티드들의 각 말단에 있는 펩타이드 서열들을 포함하는 시스테인을 사용하면 상기한 대로, 고리 펩타이드 구조들을 형성한다. 고리 구조는 단백질 가수분해에 대한 제공된 펩타이드의 민감성을 감소시키고 이의 표적 분자들에 대한 접근성을 증가시킨다. 당업자가 알게 되듯이, 이런 특정 실시예는 분비 표적화 서열들이 세포외 공간으로 펩타이드가 향하게 하는데 사용될 때 특히 적합하다. 또한, 기질 메탈로프로테아제(예를 들어, MMP-1, MMP-3)와 같은 프로테아제들에 의해 인식되고 절단되는 서열들이 사용될 수 있다. 이런 잔기들은 펩타이드 반감기 또는 막 투과성을 증가시키기 위해 원형 펩타이드들을 형성하는데 사용된다. 적절한 프로테아제로 원형 펩타이드를 절단하면 원하는 위치에 있는 활성인 직선 형태 펩타이드를 방출한다.

다른 실시예에서, 융합 파트너는 표적화 서열이다. 표적화 서열들은 발현 생성물의 생체활성을 보유하면서 발현된 생성물일 소정의 분자 또는 분자들의 종류에 결합할 수 있는 결합 서열들; 융합 단백질 또는 결합 파트너들의 선택적 열화를 시그널링하는 서열들; 및 소정의 세포 장소에 펩타이드들을 구조적으로 국소화할 수 있는 서열들을 포함한다. 전형적인 세포 위치들은 세포 아래 위치(예를 들어, 골지, 소포체, 핵, 인, 핵막, 미토콘드리아, 분비 소포, 리소좀) 및 분비 신호들의 사용에 의한 세포외 위치를 포함한다.

막-고정 서열들을 포함하는 다양한 표적화 서열들이 당업계에 공지되어 있다. 펩타이드들은 신호 서열들을 통해 막으로 향하고 소수성 막투과 도메인(TM으로 지정)을 통해 안정적으로 막에 포함된다. TM 부분은 당업계에 공지된 대로 세포내 또는 세포외로 주제 펩타이드를 전시하기 위해 발현된 융합 단백질 상에 적절하게 위치한다. 세포외 제공이 특히 바람직하다. 막 고정 서열들과 신호 서열들은 (a) IL-2 수용체 β-사슬(Hatakeyama, M. et al., Science 244: 551-556 (1989)) 및 인슐린 수용체 β-사슬(Hetakeyama et al, 상기)과 같은 I 형 통합 막 단백질; (b) 중성 엔토펩티다아제(Malfroy, B. et al Biochem. Biophys. Res. Commun. 144: 59-66 (1987))와 같은 II 형 통합 막 단백질들; 및 (c) 사이토크롬 P450 NF25(Hetakeyama et al, 상기)와 같은 III 형 단백질로부터 유도된 것들 및 CD8, ICAM-2, IL-8R 및 LFA-1로부터 유도된 것들을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

막 고정 서열들은 글리코실 포스파티딜리노시톨을 통해 GPI 고정 서열 및 지질 이중층 사이에 공유 결합을 형성하는 GPI 앵커를 포함한다. GPI 앵커 서열들은 Thy-1 및 DAF를 포함하는 다양한 단백질들에서 발견된다(Homans, S. W. et al., Nature 333: 269-272 (1988)). 유사하게는, 아실화 서열들은, 예를 들어, 아이소프레닐화(즉, 파메실 및 제라닐-제라닐; Farnsworth, C. C. et al., Proc. Natl. Aced. Sci. USA 91: 11963-11967 (1994) and Aronheim, A. et al., Cell 78: 949-61 (1994) 참조), 미리스토일화(Stickney, J. T. Methods Enzymol. 332: 64-77 (2001)) 또는 팔미토일화와 같은 지질 모이어티들의 결합을 허용한다. 한 태양에서, 주제 펩타이드는 말단에 있는 지질 기에 결합할 것이고, 리포솜과 같은 지질 막에 결합할 수 있다.

다른 태양에서, 표적화 서열은 펩타이드의 분비에 영향을 주는 분비성 신호 서열이다. 여러 개의 분비성 서열들은 관심 펩타이드에 대해 아미노산 말단에 위치할 때 세포외 공간 속에 펩타이드를 직접 분비하는 것으로 알려져 있고, 특히 이식 세포들을 포함하는 세포들에 의해 펩타이드를 분비하는 것으로 알려져 있다. 적절한 분비성 신호들은 IL-2(Villinger, F. et al., J. Immuno. 155: 3946-3954 (1995)), 성장 호르몬(Roskam, W. G. et al., Nucleic Acids Res. 7: 305-320 (1979)), 프레프로인슐린 및 인플루엔자 HA 단백질에서 발견된 것들을 포함하였다.

융합 파트너는 융합 단백질 또는 이를 암호화하는 핵산에 대한 안정성을 제공하는 안정성 서열을 더 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 메티오닌(예를 들어, MG 또는 MGG)을 개시한 후 글리신들의 포함은 바르샤브스키의 N-말단 규칙대로 편재화를 통해 열화로부터 융합된 펩타이드를 안정화하거나 보호할 수 있어서, 세포의 증가된 반감기를 제공한다.

다른 아미노산들은 탐지 또는 정제 목적으로 펩타이드를 태깅하도록 첨가될 수 있다. 이런 서열들은 금속 이온들과 같은 리간드들과 결합하는 항체들 또는 서열들에 의해 인식된 에피토프들을 포함할 수 있다. 다양한 태그 서열들과 리간드 결합 서열들이 당업계에 주지되어 있다. 이런 것들은 폴리-히스티딘(예를 들어, 항체들에 의해 인식되나 2가 금속 이온들과 결합하는 6xHis); 폴리-히스티딘-글리신(poly-his-gly) 태그들; flu HA 태그 폴리펩타이드; c-myc 태그; 플래그 펩타이드(예를 들어, Hopp et al., BioTechnology 6: 1204-1210 (1988)); KT3 에피토프 펩타이드(예를 들어, Skinner et al., J. Biol. Chem. 266: 15163-12166 (1991)); 및 T7 유전자 10 단백질 펩타이드 태그(예를 들어, Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6363-6397 (1990))를 포함하나 이에 제한되지 않는다.

융합 파트너들은 펩타이드들을 연결하고 방해되지 않은 구조로 펩타이드들을 제공하기 위해, 본 명세서에서 기술한 대로, 링커 또는 테터링 서열들(tethering sequence)을 포함한다.

본 발명에서, 융합 파트너들의 조합이 사용될 수 있다. 제공 구조들, 표적화 서열들, 태그 서열들 및 안정성 서열들의 임의의 수의 조합이 링커 서열들과 사용될 수 있거나 링커 서열들 없이 사용될 수 있다.

펩타이드 제조 및 염들

본 발명의 펩타이드들은 여러 방식으로 제조될 수 있다. 펩타이드들의 화학적 합성은 당업계에 주지되어 있다. 고체상 합성이 통상적으로 사용되고, 예를 들들어, Applied Biosystems Inc., Foster City, Calif.; Beckman 등의 자동 합성기들과 같은 다양한 상업적 합성 장치들이 사용된다. 용액 상 합성 방법들은 특히 대량 생산에 사용될 수 있다. 이런 표준 기술들을 사용함으로써, 자연적으로 발생하는 아미노산들은 비 자연적인 아미노산들, 특히 D-입체이성질체 및 다른 길이 또는 기능성들을 가진 아미노산들로 치환될 수 있다. 소형 분자들, 라벨 모이어티들, 펩타이드들 또는 단백질들에 접합하기 위한 작용기들 또는 고리 펩타이드들을 형성하기 위한 작용기들은 화학적 합성 동안 분자 속에 유도될 수 있다. 바람직하게는, 작용기들의 유도와 다른 분자들에 대한 컨쥬케이션은 주제 펩타이드의 구조와 기능에 최소의 영향을 미친다.

본 발명의 펩타이드들은 염 형태, 일반적으로 약학적으로 허용가능한 염 형태로 존재할 수 있다. 이들은 나트륨, 칼륨, 리튬, 암모늄, 칼슘, 마그네슘, 철, 아연, 구리, 망간 등의 무기 염들을 포함한다. 펩타이드의 다양한 유기 염들은 아세트산, 프로피온산, 피루브산, 말레산, 숙신산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 시남산, 살리실산 등에 의해 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

올리고펩타이드 및 이의 유도체들의 합성은 재조합 기술들을 사용하여 수행될 수 있다. 재조합 생산의 경우, 단일 올리고펩타이드 또는 바람직하게는 단일 펩타이드 또는 헤드 투 테일 다이머들로 절단되게 하는 비암호 아미노산 또는 서열(intervening amino acid 또는 sequence)과 연결되어 복수의 주제 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열이 제조될 수 있다. 메티오닌 또는 트립토판이 존재하는 경우, 비암호 메티오닌 또는 트립토판이 포함될 수 있어서, 각각 CNBr 또는 BNPS-Skatole(2-(2-나이트로페닐설펜일)-3-메틸-3-브로모인돌닌)을 사용하여 단일 아미노산 절단을 일으킨다. 또한, 절단은 효소 절단을 위한 특정 프로테아제에 의해 인식되는 서열들 또는 자가 절단 위치들로 작용하는 서열들(2A sequences of apthoviruses and cardioviruses; Donnelly, M. L., J. Gen. Virol. 78:13-21 (1997); Donnelly, M. L., J. Gen. Virol. 82:1027-41 (2001))의 사용에 의해 완성된다. 주제 펩타이드는 분리될 수 있는 더 큰 펩타이드의 일부로 제조될 수 있고 올리고펩타이드는 단백질분해성 절단 또는 화학적 절단에 의해 얻을 수 있다. 특정 서열들과 제조 방식은 편리함, 경제성, 필요한 순도 등에 의해 측정될 것이다. 이런 조성물들을 제조하기 위해서, 특정 펩타이드, 단백질 또는 융합 단백질을 암호화하는 유전자는 발현 벡터 속으로 주입되는 융합 핵산을 형성하기 위해 본 발명의 올리고펩타이드들을 암호화하는 DNA 서열에 결합된다. 융합 핵산의 발현은, 특정 숙주 세포 또는 유기체에서의 발현의 경우, 하기한 대로, 적절한 프로모터 및 다른 대조군 서열들의 제어하에 있다(Sambrook et al., Molecular Biology: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (3rd ed. 2001); Ausubel, F. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y., (updates up to 2002) (1988)).

본 발명의 펩타이드들에 다양한 분자들을 접합하기 위해, 올리고펩타이드 및 다른 분자 상의 작용기들이 적절한 컨쥬케이트제(예를 들어, 가교제)의 존재하에서 반응한다. 사용된 컨쥬케이팅제 또는 가교제의 형태는 작용기들에 의존할 것이고, 1차 아민, 설피히드릴, 카본일, 탄수화물 및 카복실산이 사용된다. 바람직하게는, 변형을 위해 선택되지 않은 올리고뉴클레오티드 상의 반응성 작용기들은 원치않는 부작용들을 제한하기 위해 다른 반응성 분자들에 펩타이드가 결합하기 전에 보호된다. 본 명세서에서 사용된 대로 "보호기"는 작용기를 재노출하기 위해 선택적으로 이동할 수 있는 특이적 작용기에 결합된 분자이다(Greene, T. W. and Wuts, P. G. M. Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, Inc., New York (3^ed. 1999)). 펩타이드들은 보호된 아미노산 전구체들에 의해 합성될 수 있거나 가교제와 반응하기 전에 합성 이후 보호기들과 반응할 수 있다. 켄쥬케이션은 스트렙타비딘 또는 아비딘과 결합하는 화합물 또는 분자와 접촉할 수 있는 바이오틴 모이어티를 부착함으로써 간접일 수 있다.

컨쥬케이트된 형태로 감소된 활성을 가진 올리고펩타이드들의 경우, 한 바람직한 실시예에서, 올리고펩타이드들과 컨쥬케이트된 화합물 사이의 연결은, 예를 들어, 원하는 세포들 또는 조직들에 수송한 후 원하는 조건하에서 절단을 일으키기 위해 충분히 불안정하도록 선택된다. 생물학적으로 불안정한 공유 결합들, 예를 들어, 이미노 결합 및 에스터는 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 미국특허 5,108,921 참조). 이런 변형들은 효과적으로 덜 활성인 형태의 올리고펩타이드들의 투여를 허용하여, 불안정한 결합의 절단에 의해 활성화된다.

핵산, 발현 벡터 및 주입 방법

펩타이드 및 항체들을 포함하는 단백질들인 14-3-3 길항제들은 이를 암호화하는 핵산들을 사용하여 합성될 수 있다. 이것은 사용을 위해 뒤이어 분리되는 14-3-3 길항제들을 생산하기 위해 이루어질 수 있다. 또한, 이런 핵산들은 치료적으로 사용될 수 있다.

한 실시예에서, 핵산들은 발현 벡터들 속에 복제되고 세포들 또는 숙주 속에 주입된다. 발현 벡터들은 자가 복제 염색체 외부 벡터들 또는 숙주 염색체 속에 통합되는 벡터들, 예를 들어, 레트로바이러스들을 기초로 한 벡터들, 위치 특이적 재조합 서열들을 가진 벡터들이다. 일반적으로, 이런 벡터들은 올리고펩타이드들을 암호화하는 핵산들에 작동가능하게 연결된 대조군 서열들을 포함한다. "대조군 서열들은" 특정 숙주 유기체에서 주제 펩타이들의 발현에 필수적인 핵산 서열들을 의미한다. 따라서, 대조군 서열들은 프로모터 서열들, 인핸서들 또는 전사 활성자 서열들, 리보소멀 결합 위치들, 전사 개시 및 정지 서열들; 폴리아데닐화 신호 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 핵산들의 전사 및 번역에 필요한 서열들을 포함한다.

한 바람직한 실시예에서, 세포는 섬유아세포 또는 FLS 세포이다. 바람직하게는, 세포들은 활액 세포이다. 바람직하게는, 세포는 14-3-3 길항제를 발현하도록 가공된다. 세포는 인비트로로 조작될 수 있고 수신자에게 주입된다. 또한, 세포는 인비보로 조작될 수 있다.

다양한 프로모터들은 본 발명의 펩타이들을 발현하는데 유용하다. 프로모터들은 구조성, 유도성 및/또는 세포 특이성일 수 있고 자연 프로모터들, 합성 프로모터들(예를 들어, tTA 테트라사이클린 유도성 프로모터들) 또는 다야한 프로모터들의 하이브리드를 포함할 수 있다. 프로모터들은 다른 고려사항 중에서, 단백질들이 발현되어질 세포 또는 유기체, 원하는 발현의 수준 및 발현의 임의의 원하는 조절을 기초로 하여 선택된다. 적절한 프로모터들은 박테리아 프로모터들(예를 들어, pL1 파이지 프로모터, tac 프로모터, lac 프로모터 등); 효모 기초 프로모터들(예를 들어, GAL4 프로모터, 알콜 탈수소 프로모터, 트립토판 합성 프로모터, 구리 유도 CUPI 프로모터 등), 식물 프로모터들(예를 들어, CaMV S35, 노폴린 합성 프로모터, 담배 모자이크 바이러스 프로모터 등), 곤충 프로모터들(예를 들어, 나방 핵다각체병 바이러스, 아데스 DNV 바이러스 p& and p61, hsp 70 등) 및 발현 포유류 세포들을 위한 프로모터들(예를 들어, 유비규틴 유전자 프로모터, 리보소말 유전자 프로모터, 등) 및 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 시미안 바이러스(SV40) 프로모터 및 레트로바이러스 프로모터들이다.

본 명세서에서 "작동가능하게 연결된"은 핵산은 다른 핵산과 기능성 관계 속에 놓인다. 본 내용에서, 작동가능하게 연결된은 대조 서열들이 주제 14-3-3 길항제들을 암호화하는 핵산 서열에 대해 위치되며 이런 방식으로 암호화된 길항제의 발현이 일어난다. 벡터들은 플라스미드를 포함하거나 바이러스 벡터들, 예를 들어, 세포들이 분할하는 세포들인 경우 유용한 전달 시스템들인 레트로바이러스 벡터들 도는 세포들이 분할하지 않는 세포들인 경우 렌티바이러스 및 아데노바이러스 벡터들을 포함한다. 특히 바람직한 것은 3'-LTR에 불활성화된 바이러스 프로모터들을 가진 자가 불활성화 레트로바이러스 벡터들(SIN 벡터들)이고, 바이러스 벡터 속에 삽입된 비 바이러스 프로모터들의 사용에 의해 이형 유전자들의 발현의 제어를 허용한다(예를 들어, Hofmann, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 5185-5190 (1996) 참조). 당업자가 알 수 있듯이, 위형화(pseudotyping)에 의한 시스템의 변형들은 특히 더 높은 진핵생물들에 대한 모든 진핵세포들에 대한 레트로바이러스 벡터들의 사용을 허용한다(Morgan, R. A. et al., J. Virol. 67: 4712-4721 (1993); Yang, Y. et al., Hum. Gene Ther. 6:1203-1213 (1995)).

또한, 발현 벡터들은 변형된 숙주 세포들의 선택을 허용하는 선택가능한 마터 유전자를 포함한다. 일반적으로, 선택은 발현 벡터를 포함하는 세포들에 대해 풍부하고 선택 유전자를 발현하고 발현하지 못하는 세포들 사이의 분화를 더 허용하는 탐지가능한 표현형을 제공할 것이다. 선택 유전자들은 당업계에 주지되어 있고 사용된 숙주 세포에 따라 변할 것이다. 적절한 선택 유전자들은 세포가 약물에 저항력이 있게 하는 유전자들, 영양적으로 부족한 매질에서 성장을 허용하는 유전자들 및 리포터 유전자들(예를 들어, β-갈락토시다제, 형광 단백질들, 글루코우로니다제 등)을 포함하며, 이들의 전부는 당업계에 주지되어 있고 당업자가 사용할 수 있다.

핵산들을 생존가능한 세포들에 주입하기 위해 사용될 수 있는 여러 기술이 있다. 본 명세서에서 "주입된"은 핵산이 핵산의 후속 발현에 적합한 방식으로 세포들에 들어가는 것을 의미한다. 핵산들은 주입하기 위한 기술들은 핵산이 배양된 세포들 속에 인비트로 또는 의도한 숙주 유기체의 세포들 속에 인비보로 전달되는 지에 의존할 것이고 숙주 유기체의 형태에 의존할 것이다. 핵산들을 인비트로로 주입하기 위한 방법들은 리포솜들, 리포펙틴^TM, 전기영동, 미세주사, 세포 융합, DEAE 덱스트란, 인산칼슘 침전 및 바이오리스틱 입자 충돌의 사용을 포함한다. 인비보 전달을 위한 기술들은 핵산의 직접 주입, 통상적으로 레트로바이러스 벡터들인 바이러스 벡터들의 사용 및 바이러스 코팅 리포솜 매개 트랜스펙션을 포함하는 리포솜 매개 트랜스펙션을 포함한다. 본 발명의 14-3-3 길항제들을 발현하는 핵산들은 세포에서 일시적으로 또는 안정하게 존재할 수 있거나 숙주의 염색체 속에 안정하게 통합될 수 있다.

일부 경우에, 예를 들어, 세포 표면 단백질에 특이적인 항체와 같은 표적 세포들 또는 조직 또는 섬유아세포 또는 FLS 세포, 표적 세포 상에 수용체에 대한 리간드, 세포막 상의 지질 구성요소 또는 세포 표면상의 탄수화물과 같은 표적 세포를 표적화하는 물질을 포함하는 것이 바람직하다. 리포솜들이 사용되는 경우, 세포 이물을 흡수하는 세포 표면 단백질에 결합하는 단백질들이 섭취를 표적화 및/또는 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 이들은 비 제한적인 예로서, 특정 세포 형태들에 특유한 캡시드 단백질들 또는 이의 단편들, 내재화를 진행하는(Wu, G. Y. et al., J. Biol. Chem. 262: 4429-4432 (1987); Wagner, E. et al., Proc. Natl. Aced. Sci. USA 87: 3410-3414 (1990)) 또는 인비보 반감기를 증가시키는 단백질들에 대한 항체들을 포함한다.

발현은 박테리아, 효모, 식물, 곤충 및 동물을 포함하는 원핵생물들 및 진핵생물들에 미치는 다양한 범위의 숙주 세포들에서 이루어진다. 본 발명의 올리고펩타이드들은 다른 것들 중에서, 대장균, 효모(Saccharomyces cerevislae), 효모(Saccharomyces pombe), 담배 또는 애기장대, COS, CHO, HeLa 등과 같은 곤충 쉬네이더 세포들 및 포유류 세포들에서, 세포내적으로 발현되거나 적절한 신호 펩타이드에 펩타이드들을 융합함으로써 분비된 형태로 발현될 수 있다. 숙주 세포부터의 분비는 올리고펩타이드를 암호화하는 DNA와 신호 펩타이드를 암호화하는 DNA를 융합함으로써 이루어질 수 있다. 분비성 신호들은 박테리아, 효모, 곤충, 식물 및 포유류 시스템에 대한 당업계에 주지되어 있다. 올리고펩타이들을 발현하는 핵산들은 조직 발현을 위한 줄기 세포들 또는 장 발현을 위한 박테리아와 같은 세포 속에 삽입될 수 있고 세포들은 올리고펩타이드들의 인비보 소스를 제공하기 위해 숙주에 이식될 수 있다.

정제된 펩타이드들

한 바람직한 실시예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드들은 합성 또는 발현 이후 정제되거나 분리될 수 있다. "정제되거나 분리된"은 펩타이드가 합성되거나 발현되고 실질적으로 사용될 수 있는 형태의 환경으로부터 제거되는 것을 의미한다. 따라서, 정제된 또는 분리된은 펩타이드 또는 이의 유도체가 실질적으로 순수, 즉, 90% 이상 순수, 바람직하게는 95% 순수, 및 바람직하게는 99% 순수한 것을 의미한다. 올리고뉴클레오티드 및 이의 유도체는 샘플에 존재하는 다른 구성요소들에 따라, 당업자에게 공지된 방법들에 의해 정제되고 분리될 수 있다. 표준 정제 방법들은 전기영동, 면역학 기술 및 이온 교환, 친유성, 친화력, 크기 배제, 역상 HPLC 및 크로마토포커싱과 같은 크로마토그래피 기술을 포함한다. 단백질들은 염들 또는 유기 용매들의 존재하에서, 선택적 용해도에 의해 정제될 수 있다. 정제의 등급은 주제 올리고뉴클레오티드들의 사용에 따라 변할 것이다. 따라서, 일부 경우에 정제는 필요 없을 수 있다.

대부분의 응용분야의 경우에, 사용된 조성물들은 생성물 제조, 정제 절차 및 치료 목적의 약학적 담체에 의한 이의 의도된 용도의 방법과 관련된 오염물들에 대해 원하는 생성물의 적어도 20중량%, 더욱 일반적으로 적어도 75중량%, 바람직하게는 적어도 약 95중량% 및 일반적으로 적어도 약 99.5중량% 를 포함할 것이다. 보통, 백분율들은 전체 단백질을 기초로 할 것이다.

약학적 조성물, 투여 및 복용량

본 발명의 14-3-3 길항제들은 피험자에게 투여하는데 적절한 약학적 조성물들 속에 포함될 수 있다. 통상적으로, 약학적 조성물은 본 발명의 14-3-3 길항제 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 대로, "약학적으로 허용가능한 담체"는 임의의 및 모든 용매들, 분산제, 코팅제, 항생제 및 항균제, 등장액 및 흡수 지연제 및 생리학적으로 적합할 수 있는 것을 포함한다. 약학적으로 허용가능한 담체들의 예는 하나 이상의 물, 함염물, 인산염 버퍼 함염물, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등뿐만 아니라 이의 조합을 포함한다. 많은 경우들에서, 예를 들어, 당, 만니톨, 소르비톨과 같은 폴리알콜 또는 조성물 속의 염화나트륨의 등장제들을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 습윤제 또는 유화제, 방부제 또는 버퍼와 같은 소량의 보조 물질들과 같은 약학적으로 허용가능한 물질들은 14-3-3 길항제의 저장기간 또는 효과를 향상시킨다.

14-3-3 길항제들은 세포외에서 국소화된 14-3-3 단백질을 표적으로 한다. 따라서, 이런 치료 조성물들은 전달된 14-3-3 길항제가 세포외에서 국소화된 14-3-3 단백질과 결합하는데 사용될 수 있도록 제제화되고 투여된다.

본 발명의 조성물들은 다양한 형태일 수 있다. 이들은, 액체 용액(예를 들어, 주사 및 불용해성 용액), 분산액 또는 현탁액, 정제, 알약, 분말, 리포솜 및 좌약과 같은 액체, 반고체 및 고체 제형을 포함한다. 바람직한 형태는 의도된 형태의 투여와 치료 분야에 의존한다. 전형적인 바람직한 조성물들은 다른 항체들에 의한 인간들의 패시브 면역화를 위해 사용된 것들과 유사한 조성물들과 같은 주사 또는 불용해 용액의 형태이다. 투여의 바람직한 형태는 비경구(예를 들어, 정맥, 피하, 복강, 근육내, 관절내가 특히 바람직하다)이다. 한 실시예에서, 14-3-3 길항제는 정맥 주입 또는 주사에 의해 투여된다. 다른 바람직한 실시예에서, 14-3-3 길항제는 근육내 또는 피하 주사에 의해 투여된다. 한 바람직한 실시예에서, 활막 속으로의 직접 주사가 이루어진다.

치료 조성물들은 통상적으로 살균되어야 하고 제조 및 저장의 상태하에서 안정해야 한다. 조성물은 용액, 미세에멀젼, 분산액, 리포좀 또는 고 약물 농도에 적합한 다른 정연한 구조로 제제화될 수 있다. 살균 주사 용액들은 상기한 성분들의 하나 또는 조합을 가진 적절한 용매에 필요한 양으로 활성 화합물을 포함시킴으로써 제조될 수 있고, 필요한 경우 여과 살균이 이어진다. 일반적으로, 분산액들은 기본 분산액 매질과 상기한 것들로부터의 필요한 다른 성분들을 포함하는 살균 부형제 속에 활성 화합물을 포함시킴으로써 제조된다. 살균 주사 용액들의 제조를 위한 살균 분말들의 경우에, 바람직한 제조 방법들은 이전의 살균-여과 용액으로부터의 활성 성분과 임의의 추가의 바람직한 성분의 분말을 생산하는 진공 건조와 동결 건조이다. 용액의 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅제를 사용하고, 분산액의 경우에 원하는 입자 크기를 유지하고 계면활성제를 사용함으로써 유지될 수 있다. 주사 조성물들의 연장된 흡수는 조성물에 흡수를 지연하는 물질, 예를 들어, 모노스테아레이트 염들과 젤라틴을 포함시킴으로써 일어날 수 있다.

본 발명의 14-3-3 길항제들은, 정맥 주사 또는 주입을 포함하는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 투여될 수 있다. 활막에 대한 직접 투여는 하나의 바람직한 투여 경로이다. 당업자가 알 수 있듯이, 투여의 경로 및/또는 형태는 원하는 결과들에 따라 변할 것이다. 특정 실시예들에서, 활성 화합물은 임플란트, 피하 패치들 및 미세캡슐 전달 시스템들을 포함하는 제어된 방출 제제와 같은 빠른 방출에 대해 화합물을 보호할 담체로 제조될 수 있다. 에틸렌 바이닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르쏘에스터 및 폴리락트산과 같은 생분해성, 생체 적합성 폴리머들이 사용될 수 있다. 이런 제제들의 여러 제조 방법들이 특허받았고 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978. Representative formulation technology is taught in, inter alia, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1995) and Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd Ed, Kibbe, A.H. ed., Washington DC, American Pharmaceutical Association (2000) 참조.

특정 실시예들에서, 본 발명의 14-3-3 길항제는 경구로, 예를 들어, 불활성 희석제 또는 흡수할 수 있는 식용 담체와 함께 투여될 수 있다. 화합물(및 바람직한 경우, 다른 성분들)은 정제들 속에 압축되거나 피험자의 음식 속에 직접 포함된 경질 또는 연질 껍질 젤라틴 캡슐에 둘러싸일 수 있다. 경구 치료 투여의 경우, 화합물들은 부형제들과 함께 포함될 수 있고 섭취할 수 있는 정제들, 점막 정제들, 트로키, 캡슐, 엘릭서제, 현탁액, 시럽, 와퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 비경구 투여 이외에 본 발명의 화합물을 투여하기 위해서, 화합물을 불활성화를 예방하는 물질로 코팅하거나 화합물을 이 물질과 동시에 투여하는 것이 필요할 수 있다.

보조 활성 화합물들은 조성물들 속에 포함될 수 있다. 특정 실시예들에서, 본 발명의 14-3-3 길항제는 하나 이상의 추가 치료제들과 동시 제제화 및/또는 동시 투여된다. 예를 들어, DMARD 또는 DMODA 또는 다른 항체. 이런 병합 치료들은 더 낮은 양의 투여된 치료제들을 유리하게 사용할 수 있어서, 다양한 단일치료들과 관련된 가능한 독성문제들 또는 합병증들을 피할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물들은 본 발명의 항체의 "치료적 유효량" 또는 "예방적 유효량"을 포함할 수 있다. "치료적 유효량"은 원하는 치료 결과를 얻기 위해 필요한 복용량과 시간 동안 효과적인 양을 의미한다. 14-3-3 길항제의 치료적 유효량은 개인의 질병 상태, 나이, 성별 및 체중과 같은 인자들과 개인에서 원하는 반응을 일으키는 14-3-3 길항제의 능력에 따라 변할 수 있다. 치료적 유효량은 항체의 임의의 독성 또는 유해한 효과들이 치료적으로 유익한 효과들에 의해 압도되는 양이다. "예방적 유효량"은 원하는 예방 결과를 얻기 위해 필요한 복용량과 시간 동안 효과적인 양을 의미한다. 통상적으로, 예방적 복용량은 질병의 초기 단계 또는 그 이전에 피험자들에게 사용되기 때문에, 예방적 유효량은 치료적 유효량보다 적을 것이다.

복용 요법들은 최적의 바람직한 반응(예를 들어, 치료적 또는 예방적 반응)을 제공하도록 조절될 수 있다. 예를 들어, 1회 주사량이 투여될 수 있고, 여러 번 나뉜 복용량이 시간을 두고 투여될 수 있거나 복용량은 치료 상황의 긴박함이 나타내는 대로 비율적으로 감소 또는 증가될 수 있다. 쉬운 투여와 복용량의 균일함을 위해서 단위 제형으로 비경구 조성물들을 제제화하는 것이 특히 유리하다. 단위 제형은 치료될 포유류 피험자들을 위한 하나의 복용량으로 적합한 물리적으로 구별된 단위들을 의미한다; 각각의 단위는 원하는 약학적 담체와 관련된 원하는 치료 효과를 일으키도록 계산된 활성 화합물의 소정량을 함유한다. 본 발명의 단위 제형들에 대한 상세내용은 (a) 활성 화합물의 독특한 특성들 및 얻어지는 특정한 치료 또는 예방 효과 및 (b) 개개인들의 민감성을 치료하기 위한 활성 화합물과 같은 혼합 기술의 고유한 한계들에 의해 지시되고 직접 의존한다.

본 발명의 항체의 치료적 또는 예방적 유효량에 대한 예시적이고, 비제한적인 범위는 0.1-20mg/kg, 더욱 바람직하게는 1-10mg/kg이다. 복용량 수치들은 완화될 질환의 형태와 심각성에 따라 변할 수 있다는 것을 주목해야 한다. 임의의 특정한 피험자의 경우, 특이적 복용 요법은 개인의 요구와 조성물들을 투여하거나 투여를 감독하는 사람의 전문적 판단에 따라 시간을 두고 조절되어야 하며 본 명세서에서 정한 복용량 범위는 단지 예시적이고 청구된 조성물의 범위 또는 실시를 제한하려는 것이 아니라는 것을 이해해야 한다.

본 명세서에 기술된 약학적 조성물들은 밀봉된 앰퓰 또는 바이알과 같은 1회 복용 또는 수회 복용 용기들에 존재할 수 있다. 이런 용기들은 통상적으로 사용 때까지 제제의 무균 상태와 안정성을 보존하는 방식으로 밀봉된다. 일반적으로, 제제들은 상기한 대로 유성 또는 수성 부형제들에서 현탁액, 용액 또는 에멀젼으로 저장될 수 있다. 선택적으로, 약학적 조성물은 사용 직전에 살균 액체 담체의 첨가만을 요구하는 동결 건조 상태로 저장될 수 있다.

14-3-3 길항제들의 치료적 용도

"치료"는 치료적 또는 예방적 치료 또는 질병, 이상 또는 바람직하지 않은 질환에 대한 억제적 조치를 의미한다. 치료는 질병 심각성을 줄이고, 질병 진행을 멈추고 또는 질병을 제거하기 위해 질병 증상들의 개시 이전 및/또는 임상적 예후 또는 다른 예후 이후 적절한 형태의 14-3-3 길항제들을 피험자에게 투여하는 것을 포함한다. 질병의 예방은, 바람직하게는 질병에 대한 민감성이 증가된 피험자에서 이상 또는 질병의 증상들의 개시를 연장 또는 지연하는 것을 포함한다.

한 실시예에서, 본 발명은 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 베체트병(Behcet's Disease), 특발성 골격성 과골화증(Diffuse idiopathic skeletal hyperostosis)(DISH), 엘러스-단로스 증후(Ehlers-Danlos syndrome)(EDS), 펠티증후군(Felty's syndrome), 섬유근통(fibromyalgia), 통풍(gout), 감염성 관절염(infectious arthritis), 소아 관절염(juvenile arthritis), 낭창(lupus), 혼합결합조직병(mixed connective tissue disease)(MCTD), 골관절염(osteoarthritis), 파제트병(Paget's Disease), 류마티스성 다발성근육통(polymyalgia rheumatica), 다발성근염(polymyositis) 및 피부근염(dermatomyositis), 가성통풍(pseudogout), 건선성 관절염(psoriatic arthritis), 레이노 현상(Raynaud's Phenomenon), 반응성 관절염(reactive arthritis), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 경피증(scleroderma), 쇼그렌증후군(Sjogren's syndrome), 스틸병(Still’s Disease) 및 베게너 육아종(Wegener’s granulomatosis)을 치료하는 방법들을 포함하는 관절염의 치료 방법들을 제공한다.

일반적으로, 이 방법들은 환자에게 14-3-3 길항제를, 단독으로 또는 치료 효과를 증가시키기 위해 다른 치료제들과 병합하여 투여하는 것을 포함한다.

14-3-3 길항제를 스크리닝하는 방법들

한 태양에서, 본 발명은 14-3-3 길항제를 스크리닝하는 방법들을 제공한다. 스크린된 화합물들은 소형 유기 분자들 내지 큰 폴리머들 및 바이오폴리머들일 수 있고, 제한되지 않는 예로, 소형 유기 화합물들, 사카라이드들, 탄수화물들, 폴리사카라이드들, 렉틴들, 펩타이들 및 이의 유사체들, 폴리펩타이드들, 단백질들, 항체들, 올리고뉴클레오티드들, 폴리뉴클레오티드들, 핵산 등을 포함할 수 있다.

한 실시예에서, 스크린된 후보 화합물들은 비록 다른 분자들이 사용될 수 있으나, 바람직하게는 약 100-2500 달톤의 분자량을 가진 소형 유기 분자들이다. 이런 후보 분자들은 탄소 원자들 또는 원자 원자들의 혼합물로 구성된 고리 구조들 및 하나 이상의 이형원자들 및/또는 방향족, 폴리방향족, 헤테로방향족 및/또는 폴리방향족 구조들을 주로 포함할 것이다. 후보 물질들은 매우 다양한 작용기 치환체들을 포함할 수 있다. 한 실시예에서, 치환체(들)는, 예를 들어, 아민, 카본일, 하이드록실 및 카복실기와 같은 단백질들과 상호작용하는 것으로 알려진 치환체들의 그룹으로부터 독립적으로 선택된다.

후보 화합물들은 화합물-대-화합물 기초로 또는 당업계에서 통상적으로 사용된 많은 라이브러리 기술들 중 하나를 사용하여 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, 합성 재조합 화합물 라이브러리들, 자연 생성물 라이브러리들, 및/또는 펩타이드 라이브러리들은 14-3-3 단백질과 결합하기 위한 14-3-3 리간드와 경쟁하는 화합물들을 동정하기 위해 본 발명의 분석법들을 사용하여 스크리닝될 수 있다. 이런 경쟁적인 결합 분석법들은 14-3-3 리간드로서 대략 동일한 위치에 14-3-3 단백질과 결합하는 화합물들을 동정할 수 있다. 경쟁적인 결합 분석법들을 수행하기 위한 많은 기술들이 당업계에 공지되어 있다. 이런 기술들 중 어느 것도 본 발명에 사용될 수 있다.

이런 결합 실험들은 시약들을 고정화하기 위해서, 완전히 용액에서 또는 선택적으로, 예를 들어, 유리 또는 다른 비드와 같은 고체 지지체, 또는 페트리 접시의 바닥과 같은 고체 표면을 사용하여 수행될 수 있다. 고정화는 비공유 상호작용에 의해 또는 공유 상호작용에 의해 매개될 수 있다. 여러 형태의 화합물들과 단백질들을 고체 지지체 상에 고정하는 방법들은 주지되어 있다. 이런 방법들 중 어느 것도 사용될 수 있다.

용액에서 또는 고정화된 14-3-3 단백질 또는 후보 화합물로 수행되던지, 14-3-3 단백질 및 후보 화합물은 결합에 도움이 되는 조건들 하에서 서로 통상적으로 접촉된다. 비록 실제 조건들은 변할 수 있으나, 통상적으로 결합 분석법들은 생리학적 조건하에서 수행된다. 특정 분석법에 적절한 실제 농도들은 당업자에게 명백할 것이다.

한 실시예에서, 분석법들은 14-3-3 단백질 활성을 길항작용하기 위해 후보 물질의 능력에 대한 기능적 분석법을 더 포함한다. 한 실시예에서, 분석법들은 14-3-3 단백질에 의한 MMP의 유도를 감소시키는 후보 물질의 능력을 측정하는 단계를 포함한다. 한 실시예에서, 후보 물질은 14-3-3 단백질과 혼합되고 혼합물은 14-3-3 단백질에 반응하여 MMP를 유도할 수 있는 세포들에 첨가될 수 있다. 다른 실시예에서, 후보 물질에 14-3-3 단백질에 반응하여 MMP를 유도할 수 있는 14-3-3 단백질이 첨가된다. 세포들, 바람직하게는 섬유아세포 또는 FLS 세포들에서 측정가능한 변화를 유도하여 후보 물질을 14-3-3 길항제로 특징짓기 위해 14-3-3 단백질의 능력을 억제하는 후보 물질의 능력을 측정하는 다른 기능성 분석법이 수행될 수 있다.

아래 나열한 것들을 포함하는 모든 인용문헌들은 전문이 참조로 본 명세서에 참조로 명백하게 포함된다.

본 발명의 내용 중에 포함되어 있음

도 1. ELISA: AUG1-CLDK-BSA 항원(IgG만 반응)에 대한 생쥐 안티-AUG1-CLDK 면역 혈청(2차 부스트 이후)의 검사 혈액 적정.
도 2. ELISA: AUG2-KKLE-BSA 항원(IgG만 반응)에 대한 생쥐 안티-AUG2-KKLE 면역 혈청(2차 부스트 이후)의 검사 혈액 적정.
도 3. ELISA: AUG3-CKNS-BSA 항원(IgG만 반응)에 대한 생쥐 안티-AUG3-CKNS 면역 혈청(2차 부스트 이후)의 검사 혈액 적정.
도 4. 다양한 14-3-3 단백질 아이소형들에 대한 서열 배열.
도 5. R18은 세포외 14-3-3 단백질과 상호작용하고 세포외 14-3-3 단백질에 의해 유도된 MMP-1 발현의 유도를 억제한다.
도 6. 전장 인간 재조합 14-3-3 에타에 대해 상승된 단클론 항체에 의해 면역침전된 세포 용해물-유도 14-3-3 에타 단백질 및 인간 재조합 14-3-3 에타를 나타내는 웨스턴 블럿.
도 7. 단백질의 비-나선 영역으로부터의 인간 14-3-3 에타 펩타이드 단편 142-158 SEQ ID NO:24에 대해 상승된 단클론 항체에 의해 면역침전된 세포 용해물-유도 14-3-3 에타 단백질 및 인간 재조합 14-3-3 에타를 나타내는 웨스턴 블럿.
도 8. ELISA: 14-3-3 에타 항원(단지 IgG 반응)에 대한 생쥐 안티-14-3-3 에타 면역 혈청(2차 부스트 이후)의 검사 혈액 적정.

실험

14-3-3 에타 에피토프들

SEQ ID NO:1	93-107	나선	LETVCNDVLSLLDKF
SEQ ID NO:2	191-199	나선	EQACLLAKQ
SEQ ID NO:3	144-155	나선	NSVVEASEAAYK
SEQ ID NO:4	144-152	나선	NSVVEASEA
SEQ ID NO:5	147-155	나선	VEASEAAYK
SEQ ID NO:6	163-170	나선	EQMQPTHP
SEQ ID NO:7	168-177	나선	THPIRLGLAL
SEQ ID NO:8	82-92	나선	VKAYTEKIEKE
SEQ ID NO:9	68-79	나선	QKTMADGNEKKL
SEQ ID NO:10	138-146	나선	ASGEKKNSV
SEQ ID NO:11	69-77	루프	KTMADGNEK
SEQ ID NO:12	32-40	루프	ELNEPLSNE
SEQ ID NO:13	103-117	루프	LLDKFLIKNCNDFQY
SEQ ID NO:14	130-143	루프	YYRYLAEVASGEKK
SEQ ID NO:15	184-194	루프	YEIQNAPEQAC
SEQ ID NO:16	206-218	루프	AELDTLNEDSYKD
SEQ ID NO:17	44-57	비-나선	LLSVAYKNVVGARR
SEQ ID NO:18	15-23	비-나선	EQAERYDDM
SEQ ID NO:19	130-138	비-나선	YYRYLAEVA
SEQ ID NO:20	118-125	비-나선	ESKVFYLK
SEQ ID NO:21	210-218	비-나선	TLNEDSYKD
SEQ ID NO:22	77-84	비-나선	KKLEKVKA
SEQ ID NO:23	76-86	비-나선	EKKLRKVKAYR
SEQ ID NO:24	142-158	비-나선	KKNSVVEASEAAYKEAF
SEQ ID NO:25	105-120	비-나선	DKFLIKNCNDFQYESK
SEQ ID NO:26	237-246	비-나선	QQDEEAGEGN
SEQ ID NO:27	75-82	비-나선	NEKKLEKVK
SEQ ID NO:28	104-116	비-나선	LDKFLIKNCNDFQ
SEQ ID NO:29	141-146	비-나선	EKKNSV
SEQ ID NO:30	104-115	비-나선	LDKFLIKNS*NDF
SEQ ID NO:31	77-86	비-나선	KKLEKVKAYR
SEQ ID NO:32	143-157	비-나선	KNSVVEASEAAYKEA
SEQ ID NO:65	1-12	비-나선	DREQLLQRARLA

^*내부 시스테인 아미노산은 이황화 결합들의 형성을 예방하기 위해 아미노산 세린에 의해 대체되었다.

14-3-3 감마 에피토프들

SEQ ID NO:33	93-107	나선	LEAVCQDVLSLLDNY
SEQ ID NO:34	191-199	나선	EQACHLAKT
SEQ ID NO:35	144-155	나선	ATVVESSEKAYS
SEQ ID NO:36	144-152	나선	ATVVESSEK
SEQ ID NO:37	147-155	나선	VESSEKAYS
SEQ ID NO:38	168-177	나선	THPIRLGLAL
SEQ ID NO:39	82-97	나선	VRAYREKIEKE
SEQ ID NO:40	68-79	나선	QKTSADGNEKKI
SEQ ID NO:41	138-146	나선	ATGEKRATV
SEQ ID NO:42	163-170	나선	EHMQPTHP
SEQ ID NO:43	141-146	나선	EKRATV
SEQ ID NO:44	69-77	루프	KTSADGNEK
SEQ ID NO:45	32-40	루프	ELNEPLSNE
SEQ ID NO:46	103-117	루프	LLDNYLIKNCSETQY
SEQ ID NO:47	130-143	루프	YYRYLAEVATGEKR
SEQ ID NO:48	184-194	루프	YEIQNAPEQAC
SEQ ID NO:49	206-218	루프	AELDTLNEDSYKD
SEQ ID NO:50	44-57	비-나선	LLSVAYKNVVGARR
SEQ ID NO:51	75-83	비-나선	NEKKIEMVR
SEQ ID NO:52	15-23	비-나선	EQAERYDDM
SEQ ID NO:52	130-138	비-나선	YYRYLAEVA
SEQ ID NO:54	118-125	비-나선	ESKVFYLK
SEQ ID NO:55	210-218	비-나선	TLNEDSYKD
SEQ ID NO:56	77-84	비-나선	KKIEMVRA
SEQ ID NO:57	76-86	비-나선	EKKIEMVRAYR
SEQ ID NO:58	142-158	비-나선	KRATVVESSEKAYSEAH
SEQ ID NO:59	105-120	비-나선	DNYLIKNCSETQYESK
SEQ ID NO:60	237-246	비-나선	QQDDDGGEGN
SEQ ID NO:61	75-82	비-나선	NEKKIEMV
SEQ ID NO:62	104-116	비-나선	LDNYLIKNCSETQ

재조합 인간 14-3-3 에타(SEQ ID NO:63) 및 재조합 인간 14-3-3 감마(SEQ ID NO:64)의 단백질 서열

SEQ ID NO:63	MGDREQLLQR ARLAEQAERY DDMASAMKAV TELNEPLSNE 40 DRNLLSVAYK NVVGARRSSW RVISSIEQKT MADGNEKKLE 80 KVKAYREKIE KELETVCNDV LSLLDKFLIK NCNDFQYESK 120 VFYLKMKGDY YRYLAEVASG EKKNSVVEAS EAAYKEAFEI 160 SKEQMQPTHP IRLGLALNFS VFYYEIQNAP EQACLLAKQA 200 FDDAIAELDT LNEDSYKDST LIMQLLRDNL TLWTSDQQDE 240 EAGEGN
SEQ ID NO:64	MVDREQLVQK ARLAEQAERY DDMAAAMKNV TELNEPLSNE 40 ERNLLSVAYK NVVGARRSSW RVISSIEQKT SADGNEKKIE 80 MVRAYREKIE KELEAVCQDV LSLLDNYLIK NCSETQYESK 120 VFYLKMKGDY YRYLAEVATG EKRATVVESS EKAYSEAHEI 160 SKEHMQPTHP IRLGLALNYS VFYYEIQNAP EQACHLAKTA 200 FDDAIAELDT LNEDSYKDST LIMQLLRDNL TLWTSDQQDD 240 DGGEGNN

시스테인 잔기를 포함하는 서열들에서, 한 실시예서, 시스테인 잔기는 이황화 결합들이 형성을 피하기 위해 세린 잔기로 대체된다. 시스테인은 내부 시스테인 잔기 또는 말단 시스테인 잔기일 수 있다.

펩타이드 에피토프들은 추가 모이어티에 대한 컨쥬케이션, 예를 들어, 에피토프를 포함하는 면역원을 생산하기 위한 모이어티에 대한 컨쥬케이션을 포함하는 다양한 목적들을 위해 변형될 수 있다. 알 수 있듯이, 시스테인은 담체와 컨쥬케이션을 위해 적절하게 놓일 수 있고 항체를 제조하기 위해 노출되는 것이 바람직한 면적의 노출을 위해 제공되도록 놓일 수 있다. KKLE의 경우 시스테인은 다른 쪽을 노출하기 위해 C-터미널 말단 상에 첨가될 수 있다. 사용된 담체는 매우 클 수 잇고 제 1의 몇몇 아미노산들을 가릴 수 있다.

실시예 1: 14 -3-3 에타 면역원 서열들 및 안티 -14-3-3 에타 항체들

단일특이성 안티-14-3-3 에타 항체들을 제조하기 위해서, 8 내지 15개 아미노산 길이의 다양한 펩타이드들을 우리 자신의 기준을 기초로 선택하였다. 이런 펩타이드들뿐만 아니라 전장 재조합 고유(언태크드) 14-3-3 에타를 단클론 항체들의 생산에서 면역원들로 사용될 수 있다. 14-3-3의 7개 아이소형들을 위한 단백질 서열 배열은 도 4(14-3-3 감마(SEQ ID NO:64), 14-3-3 에타(SEQ ID NO:63), 14-3-3 알파/베타(SEQ ID NO:71), 14-3-3 제타(SEQ ID NO:72), 14-3-3 쎄타(SEQ ID NO:73), 14-3-3 시그마(SEQ ID NO:74) 및 14-3-3 입실론(SEQ ID NO:75))에 도시된다.

면역원 #1: C-LDKFLIKNSNDF(SEQ ID NO:76)(아미노산 서열 104 - 115; "AUG1-CLDK"). 인간 14-3-3 에타 잔기들 105-115의 부분에 상응하는 펩타이드를 담체와의 컨쥬케이션을 위해 N-말단 시스테인 모이어티를 첨가하고 내부 이황화 결합들의 형성을 피하기 위해 내부 시스테인-112 모이어티를 대체함으로써 변형하였다.

면역원 #2: KKLEKVKAYR-C(SEQ ID NO:77)(아미노산 서열 77 - 86; "AUG2-KKLE"). 인간 14-3-3 에타 잔기들 77-86의 부분에 상응하는 펩타이드를 담체와의 컨쥬케이션을 위해 C-말단 시스테인 모이어티를 첨가하여 변형하였다.

면역원 #3: C-KNSVVEASEAAYKEA(SEQ ID NO:78)(아미노산 서열 143 - 157; "AUG3-CKNS"). 인간 14-3-3 에타 잔기들 143-157의 부분에 상응하는 펩타이드를 담체와의 컨쥬케이션을 위해 N-말단 시스테인 모이어티를 첨가하여 변형하였다.

면역원 #4: 전장 인간 재조합 14-3-3 에타(SEQ ID NO:63), 단백질 접근번호 #: NP_003396.

면역화

4마리 BALB/c 생쥐의 그룹을 CFA(complete freund's adjuvant)에서 생쥐 당 50㎍의 항원(면역원 #1., #2, #3 또는 #4)을 사용하여 복강내 주사에 의해 최초로 면역화하였다. 4개의 후속 부스트들에 상기와 같이 3주 간격을 두고, CFA에서 항원을 투여하였다. 혈청 역가가 ELISA에 의해 측정된 대로, 면역전 혈청 샘플보다 10배 이상 증가한 경우, 각 그룹에서 2개의 최고 반응자들을 100㎕의 살균 PBS pH 7.4에서 10㎍의 항원을 각각 정맥으로 제공하였다. 2차 부스트 후 얻은 면역화된 생쥐의 혈청 샘플들의 적정은 도 1(면역원 #1; CLDK), 도 2(면역원 #2; KKLE), 도 3(면역원 #3; CKNS), 및 도 8(면역원#4)에 도시된다.

융합 방법

최초 부스트 후 3일에, 도너 생쥐를 희생시켰고 비장 세포들을 채취하고 혼합하였다(pooled). SP2/0 BALB/c 비경구 흑색종 세포들을 가진 비장 세포들의 융합은 하이브르도마의 한 단계 선택과 클로닝을 수행하는 것을 제외하고 이미 기술한 대로 수행하였다(Kohler 이하). 클론들을 융합 후 11일에 채취하였고 1% 하이포잔틴/티미딘, 20% 태아 소 혈청, 2mM GlutaMax I, 1mM 피브루산 나트륨, 50㎍/ml 젠타마이신, 1% OPI 및 0.6ng/ml IL-6을 함유하는 200㎕의 D-MEM 매질에서 96웰 조직 배양판의 웰들에서 재현탁하였다. 4일 후, 상청액들을 1㎍/웰의 정제된 항원으로 코팅된 판들 위의 항원 활성에 대해 ELISA에 의해 스크리닝하였다.

느리게 성장하는 하이브리도마 클론들의 재생을 위한 절차

느리게 성장했거나 건강하지 않게 보인 하이브리도마 세포주들은 1% 하이포잔틴/티미딘, 20% 태아 소 혈청, 2mM GlutaMax I, 1mM 피브루산 나트륨, 50㎍/ml 젠타마이신, 1% OPI, 20% 조절된 EL-4 조직 배양 상청액 및 0.6ng/ml IL-6을 함유하는 풍부한 성장 매질을 첨가하여 주로 구할 수 있다. EL-4는 포발 12-미리스테이트 12-아세테이트(PMA, 시그마, cat# P-8139)에 의해 자극될 때 세포들이 인터루킨 2(IL-2), B 세포 분화 인자(EL-BCDF-nak) 및 2개의 B 세포 성장 인자들(BSF-p1 및 EL-BCGF-swa) 및 림프구 성장과 분화를 크게 향상시키는 다른 추가 림포카인을 분비시키는 설치류 흉선종 세포주이다. G. Kohler, and C. Milstein, Preparation of monoclonal antibodies, Nature 25 (1975) 256-259; Ma, M., S. Wu, M. Howard and A. Borkovec.1984. Enhanced production of mouse hybridomas to picomoles of antigen using EL-4 conditioned media with an in vitro immunization protocol. In Vitro 20:739 참조.

안정성 검사 30일 후, 재조합 14-3-3 에타를 인식할 수 있는 IgG를 분비한 전체 100개 생존가능한 클론들을 얻었다. 추적할 리드 클론들을 동정하기 위해서, 100개의 생존가능한 클론들은 면역블로팅(도트 블롯), 트래핑 분석법 및 커스텀 캡쳐(custom caputre)(샌드위치) ELISA를 포함하는 일련의 방법을 사용하여 스크리닝하였다. 전체 100개 클론들을 다른 6개 14-3-3 아이소형을 가진 커스텀 캡쳐(샌드위치) ELISA를 사용하여 가교 반응성에 대해 검사하였다.

실시예 2: 캡쳐 ELISA에서 미끼로 바이오티닐화된 14-3-3 아이소형을 사용하여 하이브리도마 클론들로부터 조직 배양(TC) 상청액의 가교 반응성 검사

생산한 하이브리도마 클론들의 어떤 것이 14-3-3 에타(η) 이외의 6개 아이소형 중 임의의 것과 가교 반응하거나 이를 인식하는 지를 측정하기 위해 "미끼"로서 7개 14-3-3 아이소형을 사용하는 커스텀 캡쳐 ELISA를 이용하였다. 표 4 및 5에 제공된 대표적 데이터에 의해 증명된 대로, 선택된 하이브리도마 클론들의 4개(AUG3-CKNS-2D5, AUG3-CKNS-7F8, AUG3-CKNS-7H8, AUG4-ETA-8F10)는 2회 연속 희석에서 14-3-3 에타와 결합하고 이를 인식하나 검사된 더 낮은 희석에서도, 다른 14-3-3 아이소형들의 임의의 것과 결합하거나 가교 반응하지 않는다. 이런 데이터는 이런 클론들이 14-3-3 에타(η)에 매우 특이적이라는 것을 분명하게 입증한다. 반대로, 한 클론 AUG3-CKNS-4F10은 3개의 다른 14-3-3 아이소형, 주로 14-3-3 감마, 베타 및 제타와 결합하거나 가교 반응한다. 데이터를 합쳐보면, 이런 데이터는 캡쳐 ELISA는 14-3-3 에타(η) 아이소형에 매우 특이적인 하이브리도마 클론들을 동정하기 위한 효과적인 방법을 나타낸다.

표 4 및 5의 커스텀 캡쳐 ELISA 실험은 다음과 같이 수행하였다. ELISA 판들을 100μL/웰에 순수한 과다성장된 TC 상청액으로 코팅하였고 4℃에서 밤새 배양하였다. 바이오틴-표지화된 14-3-3(전부 7개 아이소형에 상응)을 1/500로부터 1/16000으로 적정하였고 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 그런 후에 판들을 100μL/웰에 PBS(pH.4) 속 3% 탈지유 분말로 차단하고 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 1/8000 스트렙타비딘-HRPO를 PBS-트윈에 희석하였고, 100μL/웰에 첨가하고 교반하면서 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. TMB 버퍼를 웰 당 50μL로 첨가하였고 실온에서 어둠에서 배양하였다. 반응들을 10분 후 웰 당 50μL 1M HCl로 멈추었고 OD450nm에서 읽었다.

ELISA에 의한 가교 반응성 검사

캡쳐 ELISA에서 미끼로 바이오티닐화된 14-3-3 아이소형을 사용하여 하이브리도마 클론들의 조직 배양( TC ) 상청액들의 가교 반응성 검사(OD450 nm에서 측정)

14-3-3 아이소형:

감마
(γ)

베타(β)

시그마
(σ)

쎄타 / 타우 (θ)

제타(ξ)

입실론 (ε)

에타 (η)

희석:

1:1500

1:3000

1:1500

1:3000

1:1500

1:3000

1:1500

1:3000

1:1500

1:3000

1:1500

1:3000

1:1500

1:3000

TC 상청액:

AUG3 - CKNS -2D5

0.076

0.073

0.085

0.075

0.084

0.076

0.101

0.082

0.097

0.076

0.074

0.064

0.351

0.263

^* AUG3 - CKNS -4F10

0.084

0.076

0.096

0.085

0.125

0.102

0.185

0.153

0.167

0.122

0.139

0.101

0.114

0.09

AUG3 - CKNS -7F8

0.072

0.067

0.078

0.076

0.083

0.076

0.116

0.104

0.093

0.084

0.089

0.076

0.946

0.741

AUG3 - CKNS -7H8

0.07

0.066

0.072

0.063

0.087

0.078

0.098

0.083

0.089

0.08

0.074

0.064

0.774

0.608

AUG4 -ETA-8F10

0.072

0.069

0.073

0.069

0.092

0.084

0.109

0.097

0.099

0.082

0.099

0.09

0.169

0.131

면역전 혈청(1:250)

0.097

0.074

0.093

0.081

0.136

0.113

0.193

0.158

0.152

0.119

0.144

0.115

0.152

0.11

^* 대조군 항체

ELIA(배경(면역전 혈청) 값들 제거)에 의한 가교 반응성 검사

	캡쳐 ELISA에서 미끼로 바이오티닐화된 14-3-3 아이소형을 사용하여 하이브리도마 클론들의 조직 배양( TC ) 상청액들의 가교 반응성 검사(OD450 nm에서 측정)
14-3-3 아이소형:	감마 (γ)		베타(β)		시그마 (σ)		쎄타 / 타우 (θ)		제타(ξ)		입실론 (ε)		에타 (η)
희석:	1:1500	1:3000	1:1500	1:3000	1:1500	1:3000	1:1500	1:3000	1:1500	1:3000	1:1500	1:3000	1:1500	1:3000
TC 상청액:	1:1500	1:3000	1:1500	1:3000	1:1500	1:3000	1:1500	1:3000	1:1500	1:3000	1:1500	1:3000	1:1500	1:3000
AUG3 - CKNS -2D5	-0.021	-0.001	-0.008	-0.006	-0.052	-0.037	-0.092	-0.076	-0.055	-0.043	-0.070	-0.051	0.199	0.153
^* AUG3 - CKNS -4F10	-0.013	0.002	0.003	0.004	-0.011	-0.011	-0.008	-0.005	0.015	0.003	-0.005	-0.014	-0.038	-0.020
AUG3 - CKNS -7F8	-0.025	-0.007	-0.015	-0.005	-0.053	-0.037	-0.077	-0.054	-0.059	-0.035	-0.055	-0.039	0.794	0.631
AUG3 - CKNS -7H8	-0.027	-0.008	-0.021	-0.018	-0.049	-0.035	-0.095	-0.075	-0.063	-0.039	-0.070	-0.051	0.622	0.498
AUG4 -ETA-8F10	-0.025	-0.005	-0.020	-0.012	-0.044	-0.029	-0.084	-0.061	-0.053	-0.037	-0.045	-0.025	0.017	0.021

^* 대조군 항체

실시예 3: RA 걸린 환자들의 활액 및 혈청에서 14-3-3 발현

혼합된 환자 활액(SF) 및 혈청(PS) 샘플들에서 14-3-3 단백질들의 다른 아이소형들 -β, γ,ε,η,τ,σ 및 ξ의 수준들을 양성 대조군으로 케라티노사이트 세포 용해물(K)을 사용하여 웨스턴 분석에 의해 분석하였다. 단지 η 및 γ 아이소형이 SF 샘플들에서 탐지되었고 PS와 비교해서 더 큰 강도로 염색되었다. 활동성 활액막염을 있으나 안티-TNF 치료들을 아직 받지 못한 17명 RA 환자의 활액 샘플들은 14-3-3의 η 아이소형의 일치하는 발현을 나타내었다(데이터 도시되지 않음). 모든 환자들은 6.0보다 큰 질병 활성 점수(DAS)를 가졌다.

실시예 4: 환자 활액 혈청에서 MMP 발현

이런 변형들이 동일한 활액 샘플들에서 MMP-1 및 MMP-3의 변형들과 상관이 있는 지를 측정하기 위해서, 전체 12 RA 활액 샘플들과 이들의 일치된 혈청 샘플들을 14-3-3η 및 γ뿐만 아니라 MMP-1와 MMP-3 단백질들에 대해 동시에 평가하였다. 14-3-3η은 모든 샘플들에서 탐지되었다. MMP-1은 모든 샘플들, SF 및 PS에서 탐지된 반면, MMP-3는 탐지된 수준들에서 더욱 변하였다. 14-3-3γ 아이소형은 환자 활액과 혈청 샘플들에서 탐지되었다(데이터는 도시되지 않음).

MMP-1 및 MMP-3의 발현은 활액과 혈청 샘플에서 14-3-3η 및 γ 아이소형의 발현과 상당한 상관관계를 나타낸다(표 6).

혈청과 활액에서 MMP 및 14-3-3 단백질 수준의 상관관계

	14-3-3η 헐청	14-3-3η 활막	14-3-3γ 혈청	14-3-3γ 활막
MMP-1	r=0.62; p=0.02	r=0.83; p=0.03	r=0.77; p=0.02	r=0.65; p=0.03
MMP-3	r=0.68; p=0.01	r=0.77; p=0.003	r=0.80; p0.03	r=0.76; p=0.04

실시예 5: 환자 혈청과 활액 샘플들에서 14-3-3 단백질의 웨스턴 블롯의 민감성

활액과 혈청 샘플들에서 14-3-3η의 탐지 수준을 측정하기 위해서, 12 명의 RA-걸린 환자 또는 정상 환자들의 샘플들을 혼합하였고, 혼합된 샘플들(pooled samples)을 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 14-3-3η은 0.1㎕ 유효 부피의 활액과 1.0㎕ 유효 부피의 혈청의 낮은 희석 범위에서 탐지되었다(데이터 도시되지 않음).

2㎕의 혼합된 정상 혈청(NS) 또는 환자 혈청(PS)을 0.05-2.0㎍ 범위로 재조합 14-3-3η의 공지된 농도를 따라 실시하였다. 2㎕ 부피의 NS 및 PS 샘플들은 각각 대략 1-1.5 및 15-20㎍의 14-3-3η을 갖도록 측정되었다(데이터 도시되지 않음). 이것은 정상 환자들과 비교해서 RA 걸린 환자들의 혈청에서 약 10배 초과로 일어난다는 것을 나타낸다.

더욱 상세한 내용과 결과는, Kilani et al., J. Rheumatology, 34:1650-1657, 2007 참조.

실시예 6: R-18 펩타이드는 세포외 14-3-3 단백질과 반응하고 세포외 14-3-3 단백질에 의해 유도된 MMP-1 발현의 유도를 억제한다

바이오티닐화된 R18의 서열은 다음과 같다: 바이오틴-Pro-His-Cys-Val-Pro-Arg-Asp-Leu-Ser-Trp-Leu-Asp-Leu-Glu-Ala-Asn-Met-Cys-Leu-Pro-OH(SEQ ID NO:79).

14-3-3 단백질들의 MMP-유도 효과를 차단 또는 억제하는 R-18의 능력을 증명하기 위해서, 질량 스펙트럼에 의해 여러 14-3-3 아이소형(미발행 데이터)을 함유하는 것으로 증명된 케라티노사이트형 세포 제어 매질(KLCCM)으로 피부 섬유아세포들의 미혼탁 배양액들을 처리하였다. 이런 실험들에서 사용된 KLCCM은 피부 섬유아세포들에서 MMP-1 발현을 유도하는 이들의 높은 능력 때문에 세포 교차분화의 28일에 채취하였다(데이터 도시되지 않음). 제어 매질(KLCCM)의 일부 샘플들은 KLCCM 내에 존재하는 14-3-3 단백질들을 제거하거나 "풀 다운"하기 위해 바이오티닐화된 R-18 및 아비딘 세파로스에 노출되었다.

결과들은 KLCCM으로 처리한 후, 피부 섬유아세포는 MMP-1을 발현하였고 MMP-1의 발현은 바이오티닐화된 R-18 및 아비딘 세파로스에 의한 KLCCM의 선처리에 의해 부분적으로 억제(68.8% 감소)될 수 있어서, 14-3-3 단백질들의 KLCCM을 선택적으로 결실시킬 수 있다(도 5, 패널 A "풀 다운).

MMP-1로 공지된 재조합 14-3-3 시그마(스트라티핀)는 5㎍/ml("풀다운"-)에서 또는 노출 후("풀다운"+) 양성 대조군으로 사용되었다. 음성 대조군으로서, 제어되지 않은 매질(DMEM(49%), KSFM(49%) + 2% FBS)로 처리된 피부 섬유아세포를 사용하였다("풀다운"-). 도 5의 패널 B는 MMP-1/β-액틴 비율의 정량적 분석을 도시한다. 이런 독립적인 실험들로부터의 발견들은 통계적 의미(statistical significance)를 나타내었다(P 값: 0.02).

실시예 7: HeLa 세포들로부터의 인간 재조합 14-3-3 에타 및 내인성 14-3-3 에타의 면역침전

실시예 1로부터의 단클론 안티-14-3-3 항체들은 재조합 및 내인성 세포 14-3-3 에타를 면역침전 또는 "캡쳐"하는 이들의 능력에 대해 검사하였다. 본 명세서에 기술된 치료 방법들의 경우, 자연 3-D 형태로 14-3-3 에타를 면역침전하거나 인식할 수 있는 능력을 가진 항체들을 사용하는 것이 바람직하다. 안티-14-3-3 에타 하이브리도마 클론들의 배양 상청액들은 용해된 HeLa 세포들의 100ng 인간 재조합 14-3-3 에타를 함유하는 버퍼 또는 상청액(200㎍ 단백질)을 함유하는 버퍼로 2시간 동안 4℃에 배양하였다. 면역침전물을 표준 방법을 사용하여 단백질 A/G 아가로스로 수집하였다. 면역침전물들을 SDS-PAGE와 웨스턴 블로팅으로 분석하였다. 도 6은 면역원 #4(전장 재조합 14-3-3 에타)를 사용하여 제조한 하이브리도마 클론 7B11을 사용하여 얻은 웨스턴 블롯을 도시한다. 레인 1: 단백질 A/G 아가로스 비드 단독; 레인 2: 단백질 A/G 아가로스 비드들을 세포 용해물과 혼합하였다; 레인 3: 단백질 A/G 아가로스 비드들을 재조합 인간 14-3-3 에타와 혼합하였다; 레인 4: 단백질 A/G 아가로스 비드들을 하이브리도마 상청액과 혼합하였다; 레인 5: 단백질 A/G 아가로스 비드들을 하이브리도마 상청액 및 세포 용해물과 혼합하였다; 레인 6: 단백질 A/G 아가로스 비드들을 하이브리도마 상청액 및 재조합 14-3-3 에타와 혼합하였다. 데이터는 클론 7B11은 HeLa 세포 유도 14-3-3 에타(레인 5)와 인간 재조합 14-3-3 에타(레인 6) 모두를 면역침전하였다는 것을 나타낸다.

도 7은 면역원 #3(CKNS)에 대해 제조된 하이브리도마 클론 2D5를 사용하여 얻은 웨스터 블롯을 도시한다. 레인 1: 단백질 A/G 아가로스 비드 단독; 레인 2: 단백질 A/G 아가로스 비드들을 세포 용해물과 혼합하였다; 레인 3: 단백질 A/G 아가로스 비드들을 재조합 인간 14-3-3 에타와 혼합하였다; 레인 4: 단백질 A/G 아가로스 비드들을 하이브리도마 상청액과 혼합하였다; 레인 5: 단백질 A/G 아가로스 비드들을 하이브리도마 상청액 및 세포 용해물과 혼합하였다; 레인 6: 단백질 A/G 아가로스 비드들을 하이브리도마 상청액 및 재조합 14-3-3 에타와 혼합하였다. 데이터는 클론 2D5는 HeLa 세포 용해물-유도 14-3-3 에타(레인 5)와 인간 재조합 14-3-3 에타(레인 6) 모두를 면역침전하였다는 것을 나타낸다.

유사한 분석들이 여러 다른 하이브리도마 클론들에 대해 수행하였다(데이터는 도시되지 않음). 이런 실험들은 실시예 1에서 생산된 단클론 항체들은, HeLa 세포 용해물들로부터의 단백질의 면역침전에 의해 증명된 대로, 자연 행태의 14-3-3과 결합하고 이를 면역침전하거나 "캡쳐링"할 수 있다는 것을 증명한다.

실시예 8: 안티 -14-3-3 항체는 생쥐 RA 모델에서 MMP 발현을 감소시킨다; 14-3-3 길항제 펩타이드는 생쥐 RA 모델에서 MMP 발현을 감소시킨다.

콜라겐-유도 관절염은 Williams et al., PNAS, 89:9784-9788, 1992에 기술된 대로 꼬리의 기부에 CFA에 유화된 100㎍의 정제된 형태 II 콜라겐의 주입에 의해 수컷 DBA 생쥐에서 유도된다. 생쥐들은 이후 매일 관찰되며 하나 이상의 팔에서 홍반 및/또는 붓기를 나타내는 생쥐를 본 명세서에서 기술된 하나 이상의 길항제 14-3-3 에타에 의한 치료 요법 또는 플라시보 치료에 무작위로 지정한다. 또한, 치료 요법은 II 형 콜라겐에 의한 면역화 이전 일에 시작한다. 10마리 생쥐의 그룹을 사용하여 다음과 같이 다양한 치료 요법들이 수행된다:

(1) R-18 펩타이드는 0.1 내지 20mg/kg의 다양한 복용량으로 (a) 복강내 또는 (b) 활막 속에 주 2회 투여된다.

(2) 실시예 1의 하이브리도마 상청액들로부터 얻고 정제된 선택된 안티-14-3-3 에타 항체들은 0.10 내지 20mg/kg의 다양한 복용량으로 (a) 복강내 또는 (b) 활막 속에 주 2회 투여된다.

(3) 플라시보 치료

관절염은 20일 치료기간 동안 관찰되며 다음 질병 지수들을 평가한다.

임상 점수. 생쥐 팔들을 붓기, 홍반, 관절 단단함 및 발 붓기에 대해 평가한다. 관절염의 임상 기준은 치료 요법이 플라시보 대조군들에 비해 효과적인 동물들에서 감소된다.

활막에서 14-3-3, MMP-1 및/또는 MMP-3 발현. 활액 샘플들을 다양한 시간 점들에서 채취하고 14-3-3, 바람직하게는 14-3-3 감마 및/또는 14-3-3 에타 및 MMP-1 및/또는 MMP-3 수준을 측정한다. MMP-1 및 MMP-3의 수준들은 치료 요법이 플라시보 대조군들에 비해 효과적인 동물들에서 감소된다.

조직병리학적 평가. 관절염 발을 고정하고, 파라핀에 삽입하고, 절단하고 현미경 평가를 위해 헤마톡실린과 에오신으로 염색한다. 각각의 조인트에서 관절염의 심각함은 다음 기준에 따라 등급이 나뉜다: 온화 = 최소 활액막염, 연골 손실, 및 분리된 병소에 제한된 골 부식; 중간 = 활액막염과 부식 존재하나 정상 관절 구조 손상되지 않음; 심각 = 활액막염, 광범위한 부식 및 관절 구조 파괴. 조직병리학에 의해 탐지된 관절염의 심각성은 치료 요법이 플라시보 대조군들에 비해 효과적인 동물들에서 감소된다.

실시예 9: 안티 -14-3-3 항체는 토끼 RA 모델에서 MMP 발현을 감소시킨다; 14-3-3 길항제 펩타이드는 IL-1을 분비하는 세포들의 이식에 의해 유도된 토끼 RA 모델에서 MMP 발현을 감소시킨다

본 발명의 14-3-3 에타 항체들은 토끼 모델에서 평가되며 여기서 관절염은 온라인 http://arthritis-research.com/content/8/1/R16에서 구입할 수 있는 Yao et al., Arthritis Research & Therapy 2006, 8:R16에 기술된 뉴질랜드 흰색 토끼의 무릎 관절 속에 5x10⁵ IL-1 생산 세포를 이식함으로써 유도된다. 검사 및 평가는 실시예 8에서 기술된 대로 필수적으로 수행된다.

실시예 10: 안티 -14-3-3 항체는 RA 모델에서 MMP 발현을 감소시킨다; 14-3-3 길항제는 RA에서 MMP 발현을 감소시킨다.

실험 관절염은 재조합 14-3-3 에타 단백질을 다리 관절의 활막 속에 주입함으로써 갈색 노르웨이 쥐들 또는 뉴질랜드 흰색 토끼들에서 유도된다. 검사와 평가는 실시예 8에서 기술된 대로 필수적으로 수행된다.

류마티스성 관절염(콜라겐-유도 관절염, "CIA")의 다른 모델들 및 본 발명의 방법들에 유용한 실험 디자인들은, 예를 들어, 다음 참조문헌들에서 발견될 수 있다: Williams, Methods Mol Med. 2004;98:207-16. Collagen-induced arthritis as a model for rheumatoid arthritis; Brand, Com. Med., 55:114-122, 2005; Vierboom et al., Drug Discovery Today, 12:327-335, 2007; Sakaguchi et al., Curr. Opin. Immunol., 17:589-594, 2005.

특정 동물 모델에서 최초 치료 요법을 개시하기 이전에, 먼저 모델을 14-3-3 에타를 가진 염증성 이상 모델로 확증하는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 14-3-3 에타 및 MMP, 바람직하게는 MMP-1 및/또는 MMP-3의 수준은 모델에서 실험 관절염의 유도 이후 증가를 나타내게 된다.

일반적인 방법들

웨스턴 블로팅

샘플들(활액 또는 혈청(각각 2㎕)), 재조합 인간 14-3-3 에타, 세포 용해물 또는 세포-용해 면역침전물)을 12-15%(wt/vol) 아크릴아미드 겔로 SDS-PAGE 분석하였고 PVDF 막들 상에 전기이동하였다. 막들 상의 비-특이적 단백질들을 PBS-0.1% Tween-20에서 5% 탈지유 분말에서 밤새 차단하였다. 실시예 3에 대한 면역블로팅은 2㎍/ml의 7개 아이소형 특이적 토끼 안티-인간 14-3-3 다클론 항체들을 사용하여 수행하였다(Martin H, Patel Y, Jones D, Howell S, Robinson K and Aitken A 1993. Antibodies against the major brain isoforms of 14-3-3 protein. An antibody specific for the N-acetylated amino-terminus of a protein. FEBS Letters. 331:296-303). 일부 실험들에서, 주로 실시예 7에서, 실시예 1의 하이브리도마 클론들의 항체들은 면역침전 또는 "캡쳐" 실험들에 사용되었다. 면역침전물들을 SDS-PAGE로 용해하고 막들을 탈지유 차단한 후 1차 14-3-3 에타(1:1000, BioMol International SE-486)로 배양한 후 적절한 2차 호오스래디쉬 퍼옥사이드 컨쥬케이트된 안티-토끼 IgG 또는 안티-생쥐 IgG 항체들(1:2500 희석)로 배양하였다. 면역반응성 단백질들은 ECL과 웨스턴 블러팅 탐지 시스템을 사용하여 가시화되었다. 케라티노사이트 세포 용해물(K), 재조합 단백질 및/또는 HeLa 세포 용해물은 양성 대조군으로 사용하였다. SF: 활액; PS: 환자 혈청.

환자 샘플들

활액은 안티-TNF 치료제의 제조 이전에 능동성 활액막염을 가진 무릎 관절들로부터 얻었다. 모든 환자들은 DAS 점수 > 6.0을 가졌다. 일치된 혈액 샘플들을 표준 정맥 천자 방법들에 의해 얻었다. 덩어리는 원심분리에 의해 제거하였다.

재조합 14-3-3 에타

케로티노사이트-유도 14-3-3 에타에 대한 cDNA는 대장균에서 복제되고 발현된 인간 케로티노사이트로부터 추출된 전체 RNA로부터 제조되었고 에 기술된 방법들에 따라 Ghahary et al 2004 J Invest Dermatol 122:1188-1197 (REF 36, 이하) 친화성 정제되었다. 14-3-3 에타 cDNA의 PCR 증폭을 위해 사용된 프라이머들은 (GCGAATTCCTGCAGCGGGCGCGGCTGGCCGA)(SEQ ID NO:80) 및 (GCTCGAGCCTGAAGGATCTTCAGTTGCCTTC)(SEQ ID NO:81)이다.

언태그드 재조합 14-3-3 단백질들

cDNA는 대장균에서 복제되고 발현된 인간 소스로부터 유도되었고 친화성 정제되었다. 14-3-3 에타 cDNA의 PCR 증폭을 위해 사용된 프라이머들은 (agaattcagttgccttctcctgctt)(SEQ ID NO:82) 및 (acatatgggggaccggga)(SEQ ID NO:83); 14-3-3 감마의 경우 (agaattcttaattgttgccttcgccg)(SEQ ID NO:84) 및 (acatatggtggaccgcgagc)(SEQ ID NO:85); 14-3-3 베타의 경우 (acatatgacaatggataaaagtgagctg)(SEQ ID NO:86) 및 (agaattcttagttctctccctccccagc)(SEQ ID NO:87); 14-3-3 입실론의 경우 (acatatggatgatcgagaggatctg)(SEQ ID NO:88) 및 (agaattctcactgattttcgtcttccac)(SEQ ID NO:89); 14-3-3 시그마의 경우 (acatatggagagagccagtctgatcc)(SEQ ID NO:90) 및 (agaattcagctctggggctcctg)(SEQ ID NO:91); 14-3-3 쎄타의 경우 (acatatggagaagactgagctgatcc)(SEQ ID NO:92) 및 (agaattcttagttttcagccccttctgc)(SEQ ID NO:93); 14-3-3 제타의 경우 (acatatggataaaaatgagctggttc)(SEQ ID NO:94) 및 (agaattcttaattttcccctccttctcct)(SEQ ID NO:95)이다.

ELISA 분석법 조건

스크리닝 및 검사의 경우 : 스크리닝 및 검사의 경우, 1.0㎍/웰의 안티-AUG1-CLDK, 안티-AUG2-KKLE, 안티-AUG3-CKNS 또는 안티-14-3-3 에타 항원을 50μL/웰에 dH₂O에서 ELISA 판들 상에 코팅하였고 37℃에서 밤새 건조하였다. 14-3-3 ETA 항원 0.25㎍/웰에 대한 검사는 탄산염 코팅 버퍼에서 코팅하고 4℃ 밤새 배양하였다.

항체 트래핑 분석법의 경우: 1/1000 염소 안티-생쥐 IgG/IgM 트래핑 항체(Pierce cat# 31182)를 4℃에서 배양된 100μL/웰에 탄산염 코팅 버퍼(pH 9.6)에서 ELISA 판 상에 코팅하였다.

음성 대조군 항원에 대한 검사의 경우 : 0.5㎍/웰 HT(인간 트랜스페린) 항원을 50μL/웰에 dH₂O에서 ELISA 판들 상에 코팅하였고 37℃에서 밤새 건조하였다.

캡쳐 ELISA에 의한 검사의 경우 : ELISA 판을 4℃에서 배양된 100μL/웰에 순수한 과다성장된 TC 상청액으로 코팅하였다. 바이오틴 표지화된 14-3-3 ETA(6개의 다른 14-3-3 집단 구성원들 중 하나)를 1/500부터 1/16000으로 적정하였고 실온에서 1시간 동안 배양하였다.

차단(Blocking): 판들을 100μL/웰에 PBS(pH 7,4)에서 3% 탈지유 분말로 차단하였고 실온에서 1시간 동안 배양하였다.

1°항체 : 생쥐 안티-AUG1-CLDK, 안티-AUG2-KKLE, 안티-AUG3-CKNS 또는 안티-14-3-3 에타 하이브리도마 조직 배양 상청액과 생쥐 단클론 대조군을 스크리닝과 검사를 위해 웰당 100μL 니트(neat)를 첨가하였다. 생쥐 안티-AUG1-CLDK, 안티-AUG2-KKLE, 안티-AUG3-CKNS 또는 안티-14-3-3 에타 면역 혈청 및 생쥐 면역전 혈청을 스크리닝과 검사를 위해 100μL/웰에 첨가된 SP2/0 조직 배양 상청액에서 1/500 희석하였다. 스크리닝과 검사를 위해 흔들면서 37℃에서 1시간 배양하였다.

스크리닝과 검사를 위해 사용된 2°항체 : 컨쥬케이트된 1/25000 염소 안티-생쥐 IgG Fc HRP(Jackson cat#115-035-164)를 스크리닝과 검사를 위해 사용하였다. PBS-Tween에 희석된 2차 항체를 100μL/웰에 첨가하고 흔들면서 37℃에서 1시간 배양하였다.

캡쳐 ELISA를 위해 사용된 스트렙타비딘 : 100μL/웰의 스트렙타비딘 HRPO(1:8000, CedarLane cat#CLCSA 1007)을 첨가하고 흔들면서 실온에서 1시간 동안 배양하였다.

기질: TMB 버퍼(BioFx cat# TMBW-1000-01)를 웰 당 50μL에 첨가하고 실온에서 어두운 곳에서 배양하였다. 스크리닝과 검사를 위한 반응들을 10분 후 웰 당 50μL 1M HCl로 멈추었고 0D₄₅₀nm에서 읽었다.

도트 블롯 조건:

스크리닝의 경우 : 밀리포어, 임모빌론 전이 막 cat#IPVH304F0을 사용하였다. 14-3-3 ETA 항원을 샘플 버퍼에서 5분 동안 끓이고 냉각시켰다. 항원을 피펫으로 6㎍ 도트의 전체량에 대해 점을 찍었다. 항원을 15분 동안 건조한 후, 블롯을 PBS-Tween pH7.4의 여러 변화량으로 세척하였다. 블롯들을 전체 스크리닝 공정 동안 개별 페트리 접시들에 보관하였다.

차단: PVDF 막을 실온에서 1시간 동안 PBS(pH 7.4)에서 5% 밀크 분말로 차단하였다. 블롯을 차단 후 PBS-Tween pH7.4의 여러 변화량으로 세척하였다. 블롯들을 1차 항체 도포 이전에 10분 동안 종이 타월 면상에 건조시켰다.

1°항체 : 생쥐 안티-AUG1-CLDK, 안티-AUG2-KKLE, 안티-AUG3-CKNS 또는 안티-14-3-3 에타 하이브리도마 조직 배양 상청액과 생쥐 단클론 대조군을 개별 패트리 접시에서 블롯들로 배양하였다. 생쥐 안티-AUG1-CLDK, 안티-AUG2-KKLE, 안티-AUG3-CKNS 또는 안티-14-3-3 에타 면역 혈청 및 생쥐 면역전 혈청을 대조군들로 사용된 SP2/0 조직 배양 상청액에 1/500 희석하였다. 블롯들을 실온에서 1시간 동안 흔들면서 배양하였다. 블롯들을 1차 항체 배양 후 PBS-Tween pH7.4의 5개 변화량으로 세척하였다.

2°항체 : PBS-Tween pH 7.4에 희석된 1/5000 염소 안티-생쥐 IgG/IgM, (H+L), 알칼리 포스파타아제 컨쥬케이트(Rockland 610-4502)를 블롯들에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 페트리 접시들에서 흔들면서 배양하였다. 블롯들을 2차 항체 배양 후 PBS-Tween pH7.4의 5개 변화량으로 세척하였다. 블롯들을 실온에서 10분 동안 트리스 O.1M pH 9 버퍼에서 평형화한 후 떨어뜨리고 기질의 첨가 이전에 건조시켰다.

기질: BCIP/NBT 현상액 1 구성요소 AP 막 기질(BioFX 제품# BCID-1000-01)을 실온에서 블롯 니트(blot neat) 상에 떨어뜨렸다. 반응을 5분 후 찬물로 멈췄고 결과들을 눈과 강한 양성 +++, 중간 양성 ++, 약한 양성 +, 약간 양성 +/-, 음성 -의 소정의 점수로 정량적으로 측정하였다.

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모든 인용문헌들은 참조로 전문이 본 명세서에 포함된다.

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<213> Homo sapiens <400> 17 Leu Leu Ser Val Ala Tyr Lys Asn Val Val Gly Ala Arg Arg 1 5 10 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Glu Gln Ala Glu Arg Tyr Asp Asp Met 1 5 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Tyr Tyr Arg Tyr Leu Ala Glu Val Ala 1 5 <210> 20 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Glu Ser Lys Val Phe Tyr Leu Lys 1 5 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Thr Leu Asn Glu Asp Ser Tyr Lys Asp 1 5 <210> 22 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Lys Lys Leu Glu Lys Val Lys Ala 1 5 <210> 23 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Glu Lys Lys Leu Arg Lys Val Lys Ala Tyr Arg 1 5 10 <210> 24 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Lys Lys Asn Ser Val Val Glu Ala Ser Glu Ala Ala Tyr Lys Glu Ala 1 5 10 15 Phe <210> 25 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Asp Lys Phe Leu Ile Lys Asn Cys Asn Asp Phe Gln Tyr Glu Ser Lys 1 5 10 15 <210> 26 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Gln Gln Asp Glu Glu Ala Gly Glu Gly Asn 1 5 10 <210> 27 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Asn Glu Lys Lys Leu Glu Lys Val Lys 1 5 <210> 28 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Leu Asp Lys Phe Leu Ile Lys Asn Cys Asn Asp Phe Gln 1 5 10 <210> 29 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Glu Lys Lys Asn Ser Val 1 5 <210> 30 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide derived from human 14-3-3 eta residues 104-115 <400> 30 Leu Asp Lys Phe Leu Ile Lys Asn Ser Asn Asp Phe 1 5 10 <210> 31 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Lys Lys Leu Glu Lys Val Lys Ala Tyr Arg 1 5 10 <210> 32 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Lys Asn Ser Val Val Glu Ala Ser Glu Ala Ala Tyr Lys Glu Ala 1 5 10 15 <210> 33 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Leu Glu Ala Val Cys Gln Asp Val Leu Ser Leu Leu Asp Asn Tyr 1 5 10 15 <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Glu Gln Ala Cys His Leu Ala Lys Thr 1 5 <210> 35 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Ala Thr Val Val Glu Ser Ser Glu Lys Ala Tyr Ser 1 5 10 <210> 36 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Ala Thr Val Val Glu Ser Ser Glu Lys 1 5 <210> 37 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Val Glu Ser Ser Glu Lys Ala Tyr Ser 1 5 <210> 38 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Thr His Pro Ile Arg Leu Gly Leu Ala Leu 1 5 10 <210> 39 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Val Arg Ala Tyr Arg Glu Lys Ile Glu Lys Glu 1 5 10 <210> 40 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Gln Lys Thr Ser Ala Asp Gly Asn Glu Lys Lys Ile 1 5 10 <210> 41 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Ala Thr Gly Glu Lys Arg Ala Thr Val 1 5 <210> 42 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Glu His Met Gln Pro Thr His Pro 1 5 <210> 43 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Glu Lys Arg Ala Thr Val 1 5 <210> 44 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Lys Thr Ser Ala Asp Gly Asn Glu Lys 1 5 <210> 45 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 Glu Leu Asn Glu Pro Leu Ser Asn Glu 1 5 <210> 46 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Leu Leu Asp Asn Tyr Leu Ile Lys Asn Cys Ser Glu Thr Gln Tyr 1 5 10 15 <210> 47 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Tyr Tyr Arg Tyr Leu Ala Glu Val Ala Thr Gly Glu Lys Arg 1 5 10 <210> 48 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Tyr Glu Ile Gln Asn Ala Pro Glu Gln Ala Cys 1 5 10 <210> 49 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Ala Glu Leu Asp Thr Leu Asn Glu Asp Ser Tyr Lys Asp 1 5 10 <210> 50 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Leu Leu Ser Val Ala Tyr Lys Asn Val Val Gly Ala Arg Arg 1 5 10 <210> 51 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Asn Glu Lys Lys Ile Glu Met Val Arg 1 5 <210> 52 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52 Glu Gln Ala Glu Arg Tyr Asp Asp Met 1 5 <210> 53 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Tyr Tyr Arg Tyr Leu Ala Glu Val Ala 1 5 <210> 54 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54 Glu Ser Lys Val Phe Tyr Leu Lys 1 5 <210> 55 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Thr Leu Asn Glu Asp Ser Tyr Lys Asp 1 5 <210> 56 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56 Lys Lys Ile Glu Met Val Arg Ala 1 5 <210> 57 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 Glu Lys Lys Ile Glu Met Val Arg Ala Tyr Arg 1 5 10 <210> 58 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58 Lys Arg Ala Thr Val Val Glu Ser Ser Glu Lys Ala Tyr Ser Glu Ala 1 5 10 15 His <210> 59 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59 Asp Asn Tyr Leu Ile Lys Asn Cys Ser Glu Thr Gln Tyr Glu Ser Lys 1 5 10 15 <210> 60 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60 Gln Gln Asp Asp Asp Gly Gly Glu Gly Asn 1 5 10 <210> 61 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 Asn Glu Lys Lys Ile Glu Met Val 1 5 <210> 62 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 62 Leu Asp Asn Tyr Leu Ile Lys Asn Cys Ser Glu Thr Gln 1 5 10 <210> 63 <211> 246 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63 Met Gly Asp Arg Glu Gln Leu Leu Gln Arg Ala Arg Leu Ala Glu Gln 1 5 10 15 Ala Glu Arg Tyr Asp Asp Met Ala Ser Ala Met Lys Ala Val Thr Glu 20 25 30 Leu Asn Glu Pro Leu Ser Asn Glu Asp Arg Asn Leu Leu Ser Val Ala 35 40 45 Tyr Lys Asn Val Val Gly Ala Arg Arg Ser Ser Trp Arg Val Ile Ser 50 55 60 Ser Ile Glu Gln Lys Thr Met Ala Asp Gly Asn Glu Lys Lys Leu Glu 65 70 75 80 Lys Val Lys Ala Tyr Arg Glu Lys Ile Glu Lys Glu Leu Glu Thr Val 85 90 95 Cys Asn Asp Val Leu Ser Leu Leu Asp Lys Phe Leu Ile Lys Asn Cys 100 105 110 Asn Asp Phe Gln Tyr Glu Ser Lys Val Phe Tyr Leu Lys Met Lys Gly 115 120 125 Asp Tyr Tyr Arg Tyr Leu Ala Glu Val Ala Ser Gly Glu Lys Lys Asn 130 135 140 Ser Val Val Glu Ala Ser Glu Ala Ala Tyr Lys Glu Ala Phe Glu Ile 145 150 155 160 Ser Lys Glu Gln Met Gln Pro Thr His Pro Ile Arg Leu Gly Leu Ala 165 170 175 Leu Asn Phe Ser Val Phe Tyr Tyr Glu Ile Gln Asn Ala Pro Glu Gln 180 185 190 Ala Cys Leu Leu Ala Lys Gln Ala Phe Asp Asp Ala Ile Ala Glu Leu 195 200 205 Asp Thr Leu Asn Glu Asp Ser Tyr Lys Asp Ser Thr Leu Ile Met Gln 210 215 220 Leu Leu Arg Asp Asn Leu Thr Leu Trp Thr Ser Asp Gln Gln Asp Glu 225 230 235 240 Glu Ala Gly Glu Gly Asn 245 <210> 64 <211> 247 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64 Met Val Asp Arg Glu Gln Leu Val Gln Lys Ala Arg Leu Ala Glu Gln 1 5 10 15 Ala Glu Arg Tyr Asp Asp Met Ala Ala Ala Met Lys Asn Val Thr Glu 20 25 30 Leu Asn Glu Pro Leu Ser Asn Glu Glu Arg Asn Leu Leu Ser Val Ala 35 40 45 Tyr Lys Asn Val Val Gly Ala Arg Arg Ser Ser Trp Arg Val Ile Ser 50 55 60 Ser Ile Glu Gln Lys Thr Ser Ala Asp Gly Asn Glu Lys Lys Ile Glu 65 70 75 80 Met Val Arg Ala Tyr Arg Glu Lys Ile Glu Lys Glu Leu Glu Ala Val 85 90 95 Cys Gln Asp Val Leu Ser Leu Leu Asp Asn Tyr Leu Ile Lys Asn Cys 100 105 110 Ser Glu Thr Gln Tyr Glu Ser Lys Val Phe Tyr Leu Lys Met Lys Gly 115 120 125 Asp Tyr Tyr Arg Tyr Leu Ala Glu Val Ala Thr Gly Glu Lys Arg Ala 130 135 140 Thr Val Val Glu Ser Ser Glu Lys Ala Tyr Ser Glu Ala His Glu Ile 145 150 155 160 Ser Lys Glu His Met Gln Pro Thr His Pro Ile Arg Leu Gly Leu Ala 165 170 175 Leu Asn Tyr Ser Val Phe Tyr Tyr Glu Ile Gln Asn Ala Pro Glu Gln 180 185 190 Ala Cys His Leu Ala Lys Thr Ala Phe Asp Asp Ala Ile Ala Glu Leu 195 200 205 Asp Thr Leu Asn Glu Asp Ser Tyr Lys Asp Ser Thr Leu Ile Met Gln 210 215 220 Leu Leu Arg Asp Asn Leu Thr Leu Trp Thr Ser Asp Gln Gln Asp Asp 225 230 235 240 Asp Gly Gly Glu Gly Asn Asn 245 <210> 65 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 65 Asp Arg Glu Gln Leu Leu Gln Arg Ala Arg Leu Ala 1 5 10 <210> 66 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> General consensus sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> Xaa = any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (7)..(8) <223> Xaa = any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa = any naturally occurring amino acid, Xaa at position 9 may be present or absent <220> <221> misc_feature <222> (11)..(14) <223> Xaa = any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (15)..(22) <223> Xaa = any naturally occurring amino acid, Xaa at positions 15-22 may be present or absent <220> <221> misc_feature <222> (24)..(26) <223> Xaa = any naturally occurring amino acid, Xaa at positions 24-26 may be present or absent <220> <221> misc_feature <222> (28)..(32) <223> Xaa = any naturally occurring amino acid, Xaa at positions 28-32 may be present or absent <400> 66 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa His Xaa Xaa Xaa His Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 <210> 67 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Preferred example of a general consensus sequence <220> <221> misc_feature <222> (7)..(9) <223> Xaa = any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (10)..(26) <223> Xaa = any naturally occurring amino acid, Xaa at positions 10-26 may be present or absent <400> 67 Phe Gln Cys Glu Glu Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa His Ile Arg Ser His Thr 20 25 30 Gly <210> 68 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence of CCHC boxes <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> Xaa = any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (5)..(8) <223> Xaa = any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (9)..(24) <223> Xaa = any naturally occurring amino acid, Xaa at positions 9-24 may be present or absent <220> <221> misc_feature <222> (26)..(29) <223> Xaa = any naturally occurring amino acid <400> 68 Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa His Xaa Xaa Xaa Xaa Cys 20 25 30 <210> 69 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence based on the nucleocapsid protein P2 <220> <221> misc_feature <222> (7)..(10) <223> Xaa = any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (11)..(26) <223> Xaa = any naturally occurring amino acid, Xaa at positions 11-26 may be present or absent <400> 69 Val Lys Cys Phe Asn Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa His Thr Ala Arg Asn Cys 20 25 30 Arg <210> 70 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence based on the NMR structural ensemble IZFP <220> <221> misc_feature <222> (10)..(13) <223> Xaa = any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (14)..(29) <223> Xaa = any naturally occurring amino acid, Xaa at positions 14-29 may be present or absent <400> 70 Met Asn Pro Asn Cys Ala Arg Cys Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa His Lys Ala 20 25 30 Cys Phe <210> 71 <211> 246 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 71 Met Thr Met Asp Lys Ser Glu Leu Val Gln Lys Ala Lys Leu Ala Glu 1 5 10 15 Gln Ala Glu Arg Tyr Asp Asp Met Ala Ala Ala Met Lys Ala Val Thr 20 25 30 Glu Gln Gly His Glu Leu Ser Asn Glu Glu Arg Asn Leu Leu Ser Val 35 40 45 Ala Tyr Lys Asn Val Val Gly Ala Arg Arg Ser Ser Trp Arg Val Ile 50 55 60 Ser Ser Ile Glu Gln Lys Thr Glu Arg Asn Glu Lys Lys Gln Gln Met 65 70 75 80 Gly Lys Glu Tyr Arg Glu Lys Ile Glu Ala Glu Leu Gln Asp Ile Cys 85 90 95 Asn Asp Val Leu Glu Leu Leu Asp Lys Tyr Leu Ile Pro Asn Ala Thr 100 105 110 Gln Pro Glu Ser Lys Val Phe Tyr Leu Lys Met Lys Gly Asp Tyr Phe 115 120 125 Arg Tyr Leu Ser Glu Val Ala Ser Gly Asp Asn Lys Gln Thr Thr Val 130 135 140 Ser Asn Ser Gln Gln Ala Tyr Gln Glu Ala Phe Glu Ile Ser Lys Lys 145 150 155 160 Glu Met Gln Pro Thr His Pro Ile Arg Leu Gly Leu Ala Leu Asn Phe 165 170 175 Ser Val Phe Tyr Tyr Glu Ile Leu Asn Ser Pro Glu Lys Ala Cys Ser 180 185 190 Leu Ala Lys Thr Ala Phe Asp Glu Ala Ile Ala Glu Leu Asp Thr Leu 195 200 205 Asn Glu Glu Ser Tyr Lys Asp Ser Thr Leu Ile Met Gln Leu Leu Arg 210 215 220 Asp Asn Leu Thr Leu Trp Thr Ser Glu Asn Gln Gly Asp Glu Gly Asp 225 230 235 240 Ala Gly Glu Gly Glu Asn 245 <210> 72 <211> 245 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 72 Met Asp Lys Asn Glu Leu Val Gln Lys Ala Lys Leu Ala Glu Gln Ala 1 5 10 15 Glu Arg Tyr Asp Asp Met Ala Ala Cys Met Lys Ser Val Thr Glu Gln 20 25 30 Gly Ala Glu Leu Ser Asn Glu Glu Arg Asn Leu Leu Ser Val Ala Tyr 35 40 45 Lys Asn Val Val Gly Ala Arg Arg Ser Ser Trp Arg Val Val Ser Ser 50 55 60 Ile Glu Gln Lys Thr Glu Gly Ala Glu Lys Lys Gln Gln Met Ala Arg 65 70 75 80 Glu Tyr Arg Glu Lys Ile Glu Thr Glu Leu Arg Asp Ile Cys Asn Asp 85 90 95 Val Leu Ser Leu Leu Glu Lys Phe Leu Ile Pro Asn Ala Ser Gln Ala 100 105 110 Glu Ser Lys Val Phe Tyr Leu Lys Met Lys Gly Asp Tyr Tyr Arg Tyr 115 120 125 Leu Ala Glu Val Ala Ala Gly Asp Asp Lys Lys Gly Ile Val Asp Gln 130 135 140 Ser Gln Gln Ala Tyr Gln Glu Ala Phe Glu Ile Ser Lys Lys Glu Met 145 150 155 160 Gln Pro Thr His Pro Ile Arg Leu Gly Leu Ala Leu Asn Phe Ser Val 165 170 175 Phe Tyr Tyr Glu Ile Leu Asn Ser Pro Glu Lys Ala Cys Ser Leu Ala 180 185 190 Lys Thr Ala Phe Asp Glu Ala Ile Ala Glu Leu Asp Thr Leu Ser Glu 195 200 205 Glu Ser Tyr Lys Asp Ser Thr Leu Ile Met Gln Leu Leu Arg Asp Asn 210 215 220 Leu Thr Leu Trp Thr Ser Asp Thr Gln Gly Asp Glu Ala Glu Ala Gly 225 230 235 240 Glu Gly Gly Glu Asn 245 <210> 73 <211> 245 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 73 Met Glu Lys Thr Glu Leu Ile Gln Lys Ala Lys Leu Ala Glu Gln Ala 1 5 10 15 Glu Arg Tyr Asp Asp Met Ala Thr Cys Met Lys Ala Val Thr Glu Gln 20 25 30 Gly Ala Glu Leu Ser Asn Glu Glu Arg Asn Leu Leu Ser Val Ala Tyr 35 40 45 Lys Asn Val Val Gly Gly Arg Arg Ser Ala Trp Arg Val Ile Ser Ser 50 55 60 Ile Glu Gln Lys Thr Asp Thr Ser Asp Lys Lys Leu Gln Leu Ile Lys 65 70 75 80 Asp Tyr Arg Glu Lys Val Glu Ser Glu Leu Arg Ser Ile Cys Thr Thr 85 90 95 Val Leu Glu Leu Leu Asp Lys Tyr Leu Ile Ala Asn Ala Thr Asn Pro 100 105 110 Glu Ser Lys Val Phe Tyr Leu Lys Met Lys Gly Asp Tyr Phe Arg Tyr 115 120 125 Leu Ala Glu Val Ala Cys Gly Asp Asp Arg Lys Gln Thr Ile Asp Asn 130 135 140 Ser Gln Gly Ala Tyr Gln Glu Ala Phe Asp Ile Ser Lys Lys Glu Met 145 150 155 160 Gln Pro Thr His Pro Ile Arg Leu Gly Leu Ala Leu Asn Phe Ser Val 165 170 175 Phe Tyr Tyr Glu Ile Leu Asn Asn Pro Glu Leu Ala Cys Thr Leu Ala 180 185 190 Lys Thr Ala Phe Asp Glu Ala Ile Ala Glu Leu Asp Thr Leu Asn Glu 195 200 205 Asp Ser Tyr Lys Asp Ser Thr Leu Ile Met Gln Leu Leu Arg Asp Asn 210 215 220 Leu Thr Leu Trp Thr Ser Asp Ser Ala Gly Glu Glu Cys Asp Ala Ala 225 230 235 240 Glu Gly Ala Glu Asn 245 <210> 74 <211> 248 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 74 Met Glu Arg Ala Ser Leu Ile Gln Lys Ala Lys Leu Ala Glu Gln Ala 1 5 10 15 Glu Arg Tyr Glu Asp Met Ala Ala Phe Met Lys Gly Ala Val Glu Lys 20 25 30 Gly Glu Glu Leu Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Leu Ser Val Ala Tyr 35 40 45 Lys Asn Val Val Gly Gly Gln Arg Ala Ala Trp Arg Val Leu Ser Ser 50 55 60 Ile Glu Gln Lys Ser Asn Glu Glu Gly Ser Glu Glu Lys Gly Pro Glu 65 70 75 80 Val Arg Glu Tyr Arg Glu Lys Val Glu Thr Glu Leu Gln Gly Val Cys 85 90 95 Asp Thr Val Leu Gly Leu Leu Asp Ser His Leu Ile Lys Glu Ala Gly 100 105 110 Asp Ala Glu Ser Arg Val Phe Tyr Leu Lys Met Lys Gly Asp Tyr Tyr 115 120 125 Arg Tyr Leu Ala Glu Val Ala Thr Gly Asp Asp Lys Lys Arg Ile Ile 130 135 140 Asp Ser Ala Arg Ser Ala Tyr Gln Glu Ala Met Asp Ile Ser Lys Lys 145 150 155 160 Glu Met Pro Pro Thr Asn Pro Ile Arg Leu Gly Leu Ala Leu Asn Phe 165 170 175 Ser Val Phe His Tyr Glu Ile Ala Asn Ser Pro Glu Glu Ala Ile Ser 180 185 190 Leu Ala Lys Thr Thr Phe Asp Glu Ala Met Ala Asp Leu His Thr Leu 195 200 205 Ser Glu Asp Ser Tyr Lys Asp Ser Thr Leu Ile Met Gln Leu Leu Arg 210 215 220 Asp Asn Leu Thr Leu Trp Thr Ala Asp Asn Ala Gly Glu Glu Gly Gly 225 230 235 240 Glu Ala Pro Gln Glu Pro Gln Ser 245 <210> 75 <211> 255 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 75 Met Asp Asp Arg Glu Asp Leu Val Tyr Gln Ala Lys Leu Ala Glu Gln 1 5 10 15 Ala Glu Arg Tyr Asp Glu Met Val Glu Ser Met Lys Lys Val Ala Gly 20 25 30 Met Asp Val Glu Leu Thr Val Glu Glu Arg Asn Leu Leu Ser Val Ala 35 40 45 Tyr Lys Asn Val Ile Gly Ala Arg Arg Ala Ser Trp Arg Ile Ile Ser 50 55 60 Ser Ile Glu Gln Lys Glu Glu Asn Lys Gly Gly Glu Asp Lys Leu Lys 65 70 75 80 Met Ile Arg Glu Tyr Arg Gln Met Val Glu Thr Glu Leu Lys Leu Ile 85 90 95 Cys Cys Asp Ile Leu Asp Val Leu Asp Lys His Leu Ile Pro Ala Ala 100 105 110 Asn Thr Gly Glu Ser Lys Val Phe Tyr Tyr Lys Met Lys Gly Asp Tyr 115 120 125 His Arg Tyr Leu Ala Glu Phe Ala Thr Gly Asn Asp Arg Lys Glu Ala 130 135 140 Ala Glu Asn Ser Leu Val Ala Tyr Lys Ala Ala Ser Asp Ile Ala Met 145 150 155 160 Thr Glu Leu Pro Pro Thr His Pro Ile Arg Leu Gly Leu Ala Leu Asn 165 170 175 Phe Ser Val Phe Tyr Tyr Glu Ile Leu Asn Ser Pro Asp Arg Ala Cys 180 185 190 Arg Leu Ala Lys Ala Ala Phe Asp Asp Ala Ile Ala Glu Leu Asp Thr 195 200 205 Leu Ser Glu Glu Ser Tyr Lys Asp Ser Thr Leu Ile Met Gln Leu Leu 210 215 220 Arg Asp Asn Leu Thr Leu Trp Thr Ser Asp Met Gln Gly Asp Gly Glu 225 230 235 240 Glu Gln Asn Lys Glu Ala Leu Gln Asp Val Glu Asp Glu Asn Gln 245 250 255 <210> 76 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified segment of human 14-3-3 eta residues 104-115 <400> 76 Cys Leu Asp Lys Phe Leu Ile Lys Asn Ser Asn Asp Phe 1 5 10 <210> 77 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified segment of human 14-3-3 eta residues 77-86 <400> 77 Lys Lys Leu Glu Lys Val Lys Ala Tyr Arg Cys 1 5 10 <210> 78 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified segment of human 14-3-3 eta residues 143-157 <400> 78 Cys Lys Asn Ser Val Val Glu Ala Ser Glu Ala Ala Tyr Lys Glu Ala 1 5 10 15 <210> 79 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Biotinylated R18 <220> <221> BINDING <222> (1)..(1) <223> Biotin <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> Xaa = 3Hyp or 4Hyp <400> 79 Pro His Cys Val Pro Arg Asp Leu Ser Trp Leu Asp Leu Glu Ala Asn 1 5 10 15 Met Cys Leu Xaa 20 <210> 80 <211> 31 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 80 gcgaattcct gcagcgggcg cggctggccg a 31 <210> 81 <211> 31 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 81 gctcgagcct gaaggatctt cagttgcctt c 31 <210> 82 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 82 agaattcagt tgccttctcc tgctt 25 <210> 83 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 83 acatatgggg gaccggga 18 <210> 84 <211> 26 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 84 agaattctta attgttgcct tcgccg 26 <210> 85 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 85 acatatggtg gaccgcgagc 20 <210> 86 <211> 28 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 86 acatatgaca atggataaaa gtgagctg 28 <210> 87 <211> 28 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 87 agaattctta gttctctccc tccccagc 28 <210> 88 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 88 acatatggat gatcgagagg atctg 25 <210> 89 <211> 28 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 89 agaattctca ctgattttcg tcttccac 28 <210> 90 <211> 26 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 90 acatatggag agagccagtc tgatcc 26 <210> 91 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 91 agaattcagc tctggggctc ctg 23 <210> 92 <211> 26 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 92 acatatggag aagactgagc tgatcc 26 <210> 93 <211> 28 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 93 agaattctta gttttcagcc ccttctgc 28 <210> 94 <211> 26 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 94 acatatggat aaaaatgagc tggttc 26 <210> 95 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Claims

(본 분할출원은 거절결정불복심판이 청구된 한국 특허출원번호 제10-2010-7014288호 '관절염의 예방과 치료를 위한 14-3-3 길항제'의 권리를 보전하기 위해 예비적으로 출원된 건으로써, 상기 원출원건의 결과를 받을 때까지 본건의 심사를 보류하여 주시기를 심사관님께 부탁드리는 바입니다.)
14-3-3 길항제를 포함하는 관절염을 치료 또는 예방하기 위한 약학적 조성물로, 상기 14-3-3 길항제는 세포외에서 국소화된 14-3-3 에타 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 안티-14-3-3 항체인 관절염을 치료 또는 예방하기 위한 약학적 조성물.