CN103060360A - 黑大豆14-3-3j蛋白基因的原核表达载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种黑大豆14-3-3j蛋白基因的原核表达载体pGEX-4T-1-14-3-3j，该载体是含有黑大豆14-3-3j蛋白基因的原核表达载体，是从黑大豆中克隆出14-3-3j基因，用T7启动子、lac(乳糖操纵子)在IPTG诱导下控制它在EcoliBL21中过量表达，合成14-3-3j蛋白并分泌到细胞质，通过SDS-PAGE检测其表达水平，实验结果表明在28℃、1mMIPTG诱导4h时14-3-3j蛋白表达量达到最大；本发明提供的原核表达载体能应用在制备多克隆抗体中，制作的多克隆抗体可以用于检测14-3-3j蛋白表达量和蛋白相互作用的体外验证，为研究14-3-3j蛋白的结构和功能提供可行性基础。

Description

黑大豆14-3-3j蛋白基因的原核表达载体及其应用

技术领域

本发明涉及黑大豆14-3-3j蛋白基因的原核表达载体及其应用，属于基因工程领域。

背景技术

14-3-3最先在人脑中发现，其蛋白家族广泛存在于真核生物中，序列高度保守，单体分子量27-32kD，通过与靶蛋白上的ser/thr残基结合来发挥调控功能。

在植物中的14-3-3蛋白主要分为ε组和非ε组两组。不同的同工型在核心区域显示出高度保守的氨基酸序列。

14-3-3蛋白能够以多种机制与靶蛋白相互作用，对各种不同细胞功能和生理过程起调控作用。Testerink C等在大麦胚芽中发现14-3-3蛋白的各种同工型在大麦萌发过程中表达调控机制不同，其功能也明显不同。在之后的研究中，许多研究表明，14-3-3蛋白还与信号转导、碳氮代谢的调控、叶绿体前前体蛋白的调节、SPS以及PM H+-ATPase活性调节有关。14-3-3蛋白还参与植物病害和胁迫反应应答，Finnie等发现大麦抵御灰霉病的过程中积累14-3-3蛋白；Roberts M R和Bowles D J发现番茄中14-3-3蛋白在对受伤和病原菌侵染的应答中起作用；拟南芥14-3-3蛋白的GF14λ同工型可与APX3和AKR2等相互作用，在植株抗氧化和抗干旱中起重要作用。

许多研究表明，在植物中其对代谢活动的主要酶类如NR、SPS、PM H+-ATPase活性有调控作用。最新研究表明，由14-3-3蛋白调控的植物细胞功能涉及生物合成代谢酶、囊泡穿梭、细胞周期、细胞凋亡以及细胞信号转导等多个方面。

大豆有17种14-3-3蛋白，14-3-3j在叶片中累积量多，且与叶片的气孔开闭、H+-ATPase磷酸化及活性等相关性强。

综述，14-3-3j与GST标签的融合蛋白的报道较少，且这个融合蛋白表达鉴定简单的特性给研究14-3-3j的功能能促进植物抗性研究，进一步深入研究植物环境胁迫应答提供可行性基础。

发明内容

本发明的目的在于提供黑大豆14-3-3j的原核表达载体，一种能产生14-3-3j蛋白的含黑大豆14-3-3j蛋白基因的原核表达载体，14-3-3j蛋白基因来源于黑大豆，其GenBank登录号为AK285891，14-3-3j基因的上游是诱导型lac启动子。

本发明的另一目的是提供14-3-3j蛋白基因原核表达载体的构建表达方法，具体步骤如下：

（1）根据GenBank上发表的大豆14-3-3j基因EST全长基因序列，设计如下特异性引物：

14-3-3j 5’： GAATTCATGGCAGGAGCAGAGGGGCTAAAC

14-3-3j 3’： CTCGAGTCAGGGCTCATCTAGCTGGTC

引物14-3-3j5’含有限制性内切酶EcoRI识别位点，14-3-3j3’ 含有限制性内切酶XhoI识别位点；

（2）从黑大豆叶片中提取RNA，并以RNA为模板用反转录酶合成cDNA，再以黑大豆叶片cDNA为模板，采用步骤（1）中设计的特异引物，在PCR扩增体系中对14-3-3j基因的cDNA进行扩增，回收纯化14-3-3j基因片段，并将其连接到pMD18-T载体上，通过PCR检测和酶切检测获得重组载体pMD18-14-3-3j；

（3）使用EcoRI和XhoI对质粒pMD18-14-3-3j进行双酶切获得14-3-3j基因，将14-3-3j基因与同样经过双酶切的原核表达载体相连接，转化、抽提质粒进行PCR检测和酶切检测，获得原核重组表达载体；

（4）将重组表达载体转入大肠杆菌BL21中，形成重组工程菌，重组工程菌经过发酵培养，IPTG诱导表达14-3-3j蛋白。

本发明方法中所述的起始原核表达载体为PGEX-4t-1。

本发明方法中所述的14-3-3j基因插入位点在起始原核表达载体的MCS位点。

本发明方法中所述的重组工程菌在28℃、1mM IPTG条件下诱导表达14-3-3j蛋白。

本发明所述原核表达载体在制备多克隆抗体中的应用，制作的多克隆抗体可以用于检测14-3-3j蛋白表达量和蛋白相互作用的体外验证。

本发明利用IPTG诱导型启动子lac构建14-3-3j基因的原核表达载体，有利于14-3-3j基因在大肠杆菌细胞中过量表达。本发明提供的上述基因序列是一种能结合多种蛋白调节代谢、适应抗性的基因，用该基因构建的原核表达载体，将上述载体通过热刺激方法导入细菌细胞中，得到表达14-3-3j蛋白的细菌。该融合蛋白用于研究14-3-3j蛋白的结构和功能、制作14-3-3j多克隆抗体和检测转基因植物，为进一步研究14-3-3j的功能和研究豆科植物相关实验奠定可行性基础。在蛋白实验中，Western blotting、Far-Western、Pull-down和免疫共沉淀等技术应用广泛，本发明表达的14-3-3j融合蛋白带有GST标签，在Far-Western实验中检测GST简单便捷，能更好提高实验效率和准确度；Pull-down技术中利用GST融合蛋白作为探针蛋白是目前该技术的点睛技术。免疫共沉淀能检测蛋白的相互作用，也是体外验证蛋白互作的重要手段之一。GST标签能在上述蛋白分析常用技术中提供简便，快速的定量定性分析。故通过表达的14-3-3融合蛋白，能够用于研究14-3-3j蛋白的结构和功能、制作14-3-3j多克隆抗体和检测转基因植物，为进一步研究14-3-3j的功能和研究植物相关实验奠定可行性基础。

附图说明

图 1是本发明中原核表达载体pGEX-4t-1-14-3-3j的构建流程示意图；

图 2是本发明中黑大豆总RNA电泳检测图，泳道均为2ul上样量的电泳图；

图 3 是本发明中14-3-3j基因扩增后电泳检测图，其中1为MarkerIII，泳道2、3和4均为14-3-3j基因扩增产物；

图 4是本发明中14-3-3j基因扩增产物胶回收电泳图，其中1为MarkerIII，泳道2、3、4、5和6均为14-3-3j基因扩增产物；

图 5是本发明中菌落PCR电泳检测图，其中Mark3为DNA MarkerIII，泳道1-6为菌落PCR产物；

图 6是本发明中质粒pMD18T-14-3-3j的 EcoRI和XhoI双酶切电泳检测图，其中1对照为质粒对照，2、3和4泳道是14-3-3j基因经过EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切的酶切产物；

图 7是本发明中4t-1质粒酶切电泳检测，其中Mar3为DNA MarkerIII；4t-1为质粒酶切产物；对照是为4t-1质粒。

图8是本发明中连接pMD18T后的片段内切酶单切检测电泳示意图，其中Mar3为DNA MarkerIII；SacⅠ泳道指经SacⅠ单酶切的酶切产物泳道；XhoⅠ泳道指经XhoⅠ单酶切的酶切产物泳道；

图 9是本发明中连接pGEX-4t-1后的PCR产物电泳检测示意图，其中泳道2、4、9和10分别为PCR产物。

图 10是本发明中蛋白表达位置确定电泳示意图，箭头所指为目的蛋白，约为55kD，1Mark是蛋白Mark；2泳道上清和3泳道沉淀是指经超声破碎后蛋白；

图 11是本发明中原核表达载体Pgex-4t-1-14-3-3j诱导表达后SDS-PAGE电泳检测图，其中Mark是蛋白marker-0431；0为 IPTG未诱导的总蛋白；其后为1mM IPTG分别诱导2h、4h、6h、8h和10h后的总蛋白； 箭头所指为目的蛋白14-3-3j；

图12是本发明中抗体制备后检测的SDS图，箭头所指为抗体条带；

图13是本发明中以14-3-3j蛋白做抗体免疫共沉淀后检测14-3-3与H+-ATPase互作SDS-PAGE示意图，上面箭头所指为H+-ATPase蛋白条带；中间箭头所指为抗体带；线面箭头所指为14-3-3j蛋白带；

图14是本发明中SDS-PAGE后转膜Western blotting示意图，上面箭头所指为H+-ATPase条带；中间箭头所指为抗体带；下面箭头所指为14-3-3j蛋白带；

图15是本发明中检测植物体14-3-3蛋白表达图，图中箭头所指是14-3-3蛋白。

 

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，这些实施例仅用于举例说明本发明，而不对本发明的范围构成任何限制。

实施例中所涉及的试剂主要分为分子生物学实验试剂、植物遗传转化所需的培养基以及转基因植物鉴定和检测所需的各种试剂。各种限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、反转录酶、RNA酶抑制剂、dNTP等为日本宝生物工程有限公司(大连)产品，质粒提取试剂盒购自博大泰克生物技术有限公司，TRIzoL Reagent RNA提取试剂购自invitrogen公司，其余试剂均为国产分析纯；仪器均为分子生物学以及基因工程实验室常用仪器。

所有引物序列均在大连宝生物公司合成。本发明实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1：原核表达载体pGEX-4t-1-14-3-3j的构建

原核表达载体pGEX-4t-1-14-3-3j的构建流程如图1所示，首先根据GenBank中大豆叶片14-3-3j的EST的全长基因序列，设计一对引物，并以黑大豆叶片第一链cDNA为模板扩增，得到14-3-3j的全长cDNA序列，回收并纯化14-3-3j全长基因片段后，将其连接到pMD18-T载体上获得pMD18-14-3-3j；用EcoRI和XhoI双酶切pMD18-14-3-3j、pGEX-4t-1，回收纯化14-3-3j基因片段以及载体大片段pGEX-4t-1，然后连接、获得重组质粒pGEX-4t-1-14-3-3j，它含有启动子lac，其后紧接14-3-3j基因。具体构建过程如下：

一、黑大豆叶片14-3-3j的cDNA扩增及TA克隆

1、RNA粗提

根据14-3-3j（登录号：AK285891）全长序列，设计如下一对引物：

14-3-3j5’： GAATTCatggcaggagcagaggggctaaac大写处为酶切位点EcoRI

14-3-3j3’： CTCGAGtcagggctcatctagctggtc，大写处为酶切位点XhoI

并以黑大豆叶片为材料，使用异TRNrol法提取叶片总RNA，具体操作如下：用液氮将0.1g黑大豆叶片研磨成粉末以后，加入1ml RNA的TRNzol提取液，再研磨后；将匀浆样品在室温放置5min，使核酸蛋白复合物完全分离。转入2ml离心管中，再加入0.2ml的氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15s，室温放置3min； 4 ℃、12000rpm离心15 min；样品分为3层，取上清于新离心管中，加入等体积的氯仿，盖紧离心管盖，剧烈摇动2min，冰上静置5 min后，4 ℃、12000rpm离心15 min；取上清于新的EP管，加入等体积异丙醇在-20℃沉淀RNA 30 min，4 ℃、12000rpm离心15 min，让RNA沉淀在管底；DEPC水配制的75％乙醇清洗RNA沉淀两次；4 ℃、13000rpm离心5 min；用移液枪尽量吸去75％乙醇；真空干燥2min后，加入30μl DEPC处理水使RNA完全溶解；使用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA（如图2）。

2、除去粗提液中DNA基因组及RNA的纯化

在1.5 ml离心管中依次加入：总RNA 20μg，10*DNaseI缓冲液5μl，DNase I(5U/μl) 2μl，RNase抑制剂（40U/μl）0.5μl，使用DEPC水处理补足50μl；37 ℃反应30 min；加入250μl DEPC水处理后，加入等量苯酚、氯仿和异戊醇混合液（苯酚：氯仿：异戊醇=25：24：1），充分混匀；4℃、13000 rpm离心10 min；取上清于新的离心管，加入等体积氯仿和异戊醇混合液(氯仿：异戊醇=24：1），充分混匀；4℃、13000 rpm离心10 min；取上清于新的离心管，加入1/10 体积的3 M醋酸钠（pH 5.2），混匀，再加入等量的异丙醇，-20℃沉淀30 min；4℃、13000 rpm离心15 min 回收沉淀，用70% 乙醇清洗两次；真空干燥；用适量DEPC水处理充分溶解后，取2μl进行琼脂糖凝胶电泳检测是否除去基因组，其余的-20℃保存。

3、cDNA的合成

以RNA为模板，用M-MLV反转录酶合成cDNA，具体步骤为：取1.5ml洁净离心管，分别加入总RNA 5μl（约5μg）、Oligo（dT）₁₈1μl、10mM dNTP 1μl、DEPC处理水补足总体积10μl；65℃ 处理5min后，转至冰上10min；向EP管中加入5*RT缓冲液4μl、25mM MgCl₂ 4μl、0.1M DTT 2μl、RNase抑制剂1μl，25℃处理2min；然后向EP中加入1μl 反转录酶（BioDev）；25℃处理20min，42℃反应70min后；70℃ 5min使反转录酶失活，得到cDNA。

4、扩增14-3-3j的cDNA序列

以cDNA为模板、使用引物14-3-3j5′和14-3-3j3′进行PCR扩增14-3-3j。 PCR的25μl体系为：Ex-Taq 缓冲液（10*）2.5μl、Ex-Taq 0.3μl、cDNA模板2μl、10mM dNTP 0.4μl、10μM 14-3-3j5′引物 1μl、10μM 14-3-3j3′引物 1μl、使用ddH2O补足25μl。

反应条件为：94℃ 2min，30个循环，94℃变性45s，55℃退火45s，72℃有延伸1min，72℃反应5min。将PCR产物在1%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测（如图3）。

电泳后，若发现目的条带很微弱而非目的条带亮度却很强，使用液氮法重新处理回收14-3-3j基因片段，具体步骤为：切下包含目的基因的凝胶，并放入2 ml 离心管中；向离心管中加入1ml脱色液（0.3M醋酸钠和1mM EDTA），放在脱色摇床上进行20min脱色；取出凝胶于保鲜膜上，用滤纸吸干胶周围的水分，并用手术刀将其切成小块，移入用注射器针头穿孔、底部放少许石英棉的0.5ml离心管中；用镊子夹着离心管浸入液氮中，直至小管中无气泡产生，然后将其放入1.5ml离心管中；室温1000rpm 离心10min；回收1.5ml离心管底部的溶胶液，扔掉0.5ml EP；向离心管中加入1/50体积的混合液（0.5M MgCl₂ + 5% 乙酸），然后加入等体积的异丙醇；-20℃沉淀30min后，4℃、12000 rpm离心25min；真空干燥2 min；加入适量8μl的1*TE（pH8.0）溶解DNA；取1μl用于琼脂糖凝胶电泳检测（如图4）。

5、14-3-3j基因的TA克隆

采用pMD18-T vector kit(TaKaRa)将回收片段连接到pMD18-T载体上，其具体步骤为：向1.5 ml离心管中分别加入：14-3-3j的cDNA 2.5μl（约250ng）、pMD18T载体0.5μl（50 ng/μl）、Ligation SolutionⅠ（连接液I）3μl，用封口膜封好；置于金属浴中16℃过夜连接。

使用热刺激转化方法转化大肠杆菌，具体步骤为：将感受态大肠杆菌E.coli DH5α100μl加入6μl质粒体系中，混合，混合液冰浴20min，42℃热刺激45s，再冰浴2min，加入900μl LB液体培养基，37℃、200rpm摇床培养60min；然后10000 rpm离心1min；在超净台上吸去上清，剩余约100μl时，用枪吸打混匀，转入带有Amp抗性、IPTG、X-Gal的LB平板上，用无菌三角玻璃棒涂布均匀；37℃过夜培养。

挑取白色菌落，接种到带有Amp抗性的LB液体培养基中培养12h，采用碱裂解法提取质粒，其具体步骤为：收集3ml菌液于1.5ml离心管中，常温12000 rpm离心1min，加入100μl溶液Ⅰ，振荡至彻底悬浮菌体；加入150μl溶液Ⅱ，立即轻柔颠倒离心管数次，使菌体充分裂解，随后将离心管置于冰上1-2min；加入150μl溶液Ⅲ，立即温和颠倒离心管数次，室温放置5min；12000 rpm离心12min；向吸附柱中加入420μl的结合缓冲液，将上步的上清加入吸附柱中，盖上收集管的盖子，混匀；常温12000 rpm离心15 s；倒掉收集管中的废液，向吸附柱中加入750μl的漂洗液，常温12000 rpm离心30 s；倒掉收集管中的废液，向吸附柱中加入750μl的漂洗液，常温12000 rpm离心30 s；倒掉收集管中的废液，常温12000 rpm离心2 min；将吸附柱转入新的1.5ml离心管中，向吸附柱中央加入50μl的洗脱缓冲液，常温静置5min；常温12000rpm离心1 min后收集到纯化的质粒，使用1% 琼脂糖凝胶电泳检测（图5）。

通过酶切检测获得的重组质粒pMD18-14-3-3j，具体方法为：向0.5 ml的离心管中分别加入：质粒DNA（50ng/μl）2μl、EcoRI（Takara）0.5μl、XhoI 0.5μl、10×buffer（H）2μl，使用ddH₂O补足15μl；37℃反应8h；使用1.2% 琼脂糖凝胶电泳检测（图6）。

对菌液进行14-3-3j的测序和在NCBI中进行核苷酸比对。

二、构建原核表达载体

测序和比对验证所扩增基因的正确性后，使用EcoRI和XhoI对质粒pMD18-14-3-3j和pGEX-4t-1进行双酶切分别获得14-3-3j基因和pGEX-4t-1载体，电泳回收纯化后，分别在16 ℃连接16h，即获得原核表达载体pGEX-4t-1-14-3-3j。

具体操作如下：向0.5 ml的离心管中分别加入质粒DNA（50ng/μl）2μl、EcoRI（Takara）0.5μl、XhoI 0.5μl、10×buffer（H）2μl，使用ddH2O补足15μl；37℃反应8h；使用1.2% 琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收14-3-3j和pGEX-4t-1载体，将回收片段进行连接，其具体步骤为：向1.5 ml离心管中分别加入：14-3-3j DNA 3μl（约300ng）、pGEX-4t-1载体1 μl（100ng/μl）、Ligation SolutionⅠ3μl，用封口膜封好；置于金属浴中16℃过夜连接。

使用热刺激法将pGEX-4t-1-14-3-3j转入大肠杆菌BL21中，具体步骤为：将感受态大肠杆菌E.coli BL21 100μl加入6μl质粒体系中；混合液冰浴20 min，42℃热刺激45 s，冰浴2 min；加入900μl LB液体培养基，37 ℃、200 rpm摇床培养60 min；然后10000 rpm离心1min；在超净台上吸去上清，剩余约100μl时，用枪吸打混匀，转入带有Amp抗性、IPTG、X-Gal的LB平板上，用无菌三角玻璃棒涂布均匀；37 ℃过夜培养；挑取白斑于加有Amp抗性液体LB培养基中37 ℃、180 rpm摇床培养12 h；提取质粒，进行电泳检测。通过酶切检测获得重组质粒pGEX-4t-1-14-3-3j，具体方法为：向0.5 ml的离心管中分别加入：质粒DNA（50ng/μl）2μl、EcoRI（Takara）0.5μl、XhoI 0.5μl、10×buffer（H）2μl，使用ddH₂O补足15μl；37℃反应8h；使用1.2% 琼脂糖凝胶电泳检测（如图7-9）。

实施例2：原核表达载体pGEX-4t-1-14-3-3j的原核表达

取500μl融合表达工程菌菌液加入50ml LB液体培养基中，37℃、180 rpm摇床培养2 h；培养结束后，取出1 ml，测定菌液OD600值，OD600达到0.6-0.8即可，取出2管（2ml/管）菌液，作为未诱导的样品，在锥形瓶中剩余的菌液加入0.1M的IPTG（终浓度为1mM）进行诱导，28℃、110rpm摇床培养2h，取出2管（2ml/管）菌液，为诱导2h的样品；同样在诱导4h、6h、8h时分别取2管样品。

取样完成后，诱导0、2、4、6、8h和10h的样品各取一管，用于总蛋白分析。具体步骤为：4℃、12000 rpm离心2 min；弃上清，加入100μl细菌蛋白抽提缓冲液，再加入25μl 5*蛋白上样缓冲液（Loading Buffer）；然后煮沸5 min，-20 ℃保存。

对样品进行SDS-PAGE电泳检测分析。具体步骤为：制备分离胶、浓缩胶，每种样品上样10μl，电泳后，取出分离胶，置于固定液中，摇床固定30min；弃固定液，加入染色液染色30 min；弃染色液，加入脱色液，脱色60 min；弃脱色液，加入ddH₂O，摇床45 rpm过夜；取出胶体，置于胶板上进行拍照（图10和11）。

取诱导0、2、4、6、8h和10h的样品中的另一管，用于蛋白分析。具体步骤为：4℃、12000 rpm离心2 min；弃上清，加入100 μl ddH₂O，悬菌，进行超声破碎（工作3s，暂停5s，反复处理，直到菌液变为澄清）。使用Bradford法测定蛋白浓度，具体方法为：

使用Bradford Solution（BIO-RAD）测定蛋白含量，使用标样0.1μg/μl BSA（Takara）配制反应体系：

Protein content（μg）   0       2       4       6      8       10

BSA（μl）               0       20      40      60     80      100

ddH₂O（μl）             800     778     756     734    712      690

每管中加入200 μl Bradford Solution，室温放置2min；使用分光光度计测定OD₅₉₅，

获得标准曲线Y=32.549X-0.224。

样品的反应体系为：798μl ddH₂O + 200μl Bradford Solution + 2μl 蛋白样品；对照为800μl ddH₂O + 200μl Bradford Solution，测定OD₅₉₅，代入标准曲线计算样品的蛋白浓度。

此案例能够得到经转化的细菌表达的蛋白，经过蛋白纯化，能高产量表达14-3-3j蛋白。

实施例3：14-3-3j蛋白兔抗的制备

1、抗原制备：将纯化好的14-3-3j蛋白1ml（约含有蛋白5mg）与弗氏佐剂1ml乳化。先在研钵里加入1ml弗氏佐剂，在缓慢加入蛋白液，迅速研磨。反复乳化3-4次。将乳化剂滴入冷水中，若保持完整不分散，成滴状浮于水面，即乳化完全，为合格的油包水剂。

2、兔免疫：1）、家兔捉拿方法：一只手抓住兔的颈部皮毛，将兔提起，用另一只手托其臀，或用手抓住背；2）、初次免疫：在家兔足掌、腋窝淋巴结周围、背部两侧、颌下、耳后等处选择 6-10 处免疫接种点，采用肌内、皮下或皮内注射，每点注射上述乳化人IgG 抗原0.2mL ；3）、二次免疫：第一次免疫后间隔 2 周再以lmg/mL人IgG 抗原加等体积IFA 乳化后于后腿肌肉或背部皮下多点加强免疫；4）、三次免疫：第二次免疫后间隔 1 周再以lmg/mL 人IgG 抗原加等体积IFA 乳化后于后腿肌肉或背部皮下多点加强免疫。 

5）、终末免疫：第三次免疫后间隔 1 周再以lmg/mL 人IgG 抗原加等体积IFA 乳化后于后腿肌肉或背部皮下多点加强免疫。

3、试血：末次免疫7 天后经兔耳缘静脉采血2mL，分离血清，用琼脂双向扩散实验测定抗体效价达1:16以上（稀释抗体），即可放血，如效价不高，继续加大剂量，加强 l-2 次后，再行检测。

4、心脏采血：将兔仰面，四肢缚于动物固定架上(或由助手抓住四肢固定)；剪去左胸部兔毛，消毒皮肤；用左姆指摸到胸骨剑突处，食指及中指放在右胸处轻轻向左推心脏，并使心脏固定于左胸侧位置。然后，以左拇指触摸心脏搏动最强的部位（一般在第三和第四肋骨之间）；用50ml注射器(连接16号针头)，倾针45°角度，对准心搏最强处刺入心脏抽血；将抽取的血液立即注入无菌三角烧瓶中，待凝固后分离血清。

5、分离血清：将三角烧瓶的血置37℃温箱1小时，再置4℃冰箱内3～4小时。待血液凝固血块收缩后，用毛细滴管吸取血清。于3000rpm离心15分钟，取上清加入防腐剂(0.01％硫柳汞或0.02％叠氮钠，最终浓度)，分装后置4℃冰箱中保存备用。

6、抗血清检测：如图12，Western blotting分析检测制备的抗体

此案例是制备兔抗的基本过程，能够得到粗14-3-3j抗体，经过离心，加入抗凝剂能够长时间保存制备的兔抗。

实施例4：利用上述14-3-3j兔抗免疫共沉淀检测互作

样品处理：1）采用PEG(聚乙二醇)模拟干旱处理：黑大豆25℃下黑暗催芽。选取幼芽大小相一致的黑大豆豆苗用霍氏营养液水培2周，用5%(w/v)PEG处理黑豆，时间分别是0h、2h、5h和12h。取0.5g PEG(聚乙二醇)模拟干旱处理的黑大豆叶片样品，在研钵中用液氮速冻，快速研磨。用1.5ml 1M的Tris-HCl(pH7.4)提取总蛋白，12000rpm，4℃下离心10min，取上清液备用，沉淀弃去，按照蛋白原核表达实施案例中的蛋白测量方法测定Tris-HCl(pH7.4)研磨提取后提取液中蛋白含量。

免疫共沉淀需要总蛋白量为200μg，液体总体系为500μl。测定蛋白含量后，按照提取液中蛋白含量，补足免疫共沉淀的蛋白需求量200μg，若液体体系不够500μl的加入PBS补足500μl，补足500μl后，加入10μl一抗（即14-3-3j制备的抗体），4℃、40rpm转速下孵育2h，接着加入蛋白protein A-Agarose柱20μl，4℃、40rpm转速孵育过夜。过夜后，4℃、3500rpm离心5min，弃上清，接着用PBS清洗3次，每次条件为4℃，2500rpm，5min。最后加入32μl PBS和8μl 5×loading。沸水浴5min后立即冰浴。取20μl煮好的样品进行SDS-PAGE检测，结果如图13所示；经过SDS-PAGE检测后，可通过Western- blotting检测，结果如图14所示。重复上述步骤，然后用半干式转膜，具体操作为：1）剪8张大小一致的滤纸和1张PVDF膜，接着将转膜仪用纯酒精擦洗干净；2）取4张滤纸，先用转膜缓冲液浸润滤纸，其过程中应避免产生气泡，然后平整的铺在转膜仪上；3）PVDF膜先在甲醇中侵润5s后，再转入转膜缓冲液中浸润1min，将其垫在滤纸上方；4）把SDS-PAGE后的凝胶转移到PVDF膜上方；5）将剩下的4张滤纸重复步骤2），浸润后，将滤纸平铺在DS-PAGE凝胶上方；擦干周围的溶液，赶滤纸、膜和凝胶之间的气泡；6）转膜，条件为40V，100mA。转膜完毕后，以5%脱脂奶粉封闭1h，接着用PBS洗3次，每次1min；7）加入一抗(上述14-3-3j兔抗)（1:2000,20ml PBT(10mM PBS中加入吐温-100，终浓度0.1%)），4℃孵育过夜。用PBS清洗3次，每次10min；8）加入二抗(商业羊抗兔二抗)（1:2000，20ml PBT(10mM PBS中加入吐温-100，终浓度0.1%)）常温孵育1h后用PBS清洗3次，每次10min；9）显影（0.5ml增强剂+0.5ml稳定剂+0.1ml背景抑制剂，上述试剂均为康为世纪公司生产商业试剂）。实验结果显示：提取液总蛋白中，经过14-3-3j抗体的共沉淀，能够分离出H+-ATPase和14-3-3j蛋白，图上有三条条带，箭头所指为目的蛋白，能够证明黑大豆植物体内14-3-3j与H+-ATPase的互作。

实施例5：采用上述制备的14-3-3j兔抗检测黑大豆中14-3-3蛋白的表达量

植物蛋白样品的提取：称取黑大豆植物叶片0.5g，在研钵中液氮冷冻后，迅速研磨成粉末状。用1.5ml pH7.4 1M的Tris-HCl提取，4℃下，12000rpm/min离心20min。取上清待用，用上述测定蛋白含量的方法测定提取液中的总蛋白含量。测定蛋白表达量需要含有总蛋白60ug，根据测定OD595下的蛋白含量，折算需要的蛋白提取液体积补足60ug；加入10ul 蛋白5×loading(蛋白上样缓冲液)，沸水浴5min。煮好后的蛋白样品经过SDS-PAGE后，用上述半干式转膜方法，把SDS-PAGE上蛋白转到PVDF膜上。具体操作为：1）剪8张大小一致的滤纸和1张PVDF膜，接着将转膜仪用纯酒精擦洗干净；2）取4张滤纸，先用转膜缓冲液浸润滤纸，其过程中应避免产生气泡，然后平整的铺在转膜仪上；3）PVDF膜先在甲醇中侵润5s后，再转入转膜缓冲液中浸润1min，将其垫在滤纸上方；4）把SDS-PAGE后的凝胶转移到PVDF膜上方；5）将剩下的4张滤纸重复步骤2），浸润后，将滤纸平铺在DS-PAGE凝胶上方；擦干周围的溶液，赶滤纸、膜和凝胶之间的气泡；6）转膜，条件为40V，100mA。转膜完毕后，以5%脱脂奶粉封闭1h，接着用PBS洗3次，每次1min；7）加入一抗(上述14-3-3j兔抗)（1:2000,20ml PBT(10mM PBS中加入吐温-100，终浓度0.1%)），4℃孵育过夜。用PBS清洗3次，每次10min；8）加入二抗(商业羊抗兔抗体)（1:2000，20ml PBT(10mM PBS中加入吐温-100，终浓度0.1%)）常温孵育1h后用PBS清洗3次，每次10min；9）显影（0.5ml增强剂+0.5ml稳定剂+0.1ml背景抑制剂，上述试剂均为康为世纪生产商业试剂）。经过Western blotting分析黑大豆植物14-3-3蛋白表达量的变化。如图15所示，在Western blotting之后，pvdf膜上能有清晰的蛋白带显示出来，能够证明植物体内某些蛋白(比如上述H+-ATPase和硝酸还原酶(NR)等代谢酶类)与14-3-3互作，此条带是蛋白互作的体外验证。可根据14-3-3蛋白表达的变化量，从相关代谢途径入手，例如H+-ATPase能调节气孔开度，而气孔开度能直接影响植物抗旱性，可根据14-3-3蛋白表达量变化，分析H+-ATPase表达变化，继而分析植物抗旱能力。即根据植物体内的14-3-3蛋白的靶蛋白与14-3-3相互作用后，分析植物环境适应性的变化。

序列表

<110>  昆明理工大学

<120>  黑大豆14-3-3j蛋白基因的原核表达载体及其应用

<160>  2   

<170>  PatentIn version 3.5

<210>  1

<211>  30

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

gaattcatgg caggagcaga ggggctaaac                                     30

 

<210>  2

<211>  27

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

ctcgagtcag ggctcatcta gctggtc                                         27

 

Claims (4)

1.黑大豆14-3-3j蛋白基因的原核表达载体，其特征在于：其含有14-3-3j蛋白基因。

2.根据权利要求1所述的黑大豆14-3-3j蛋白基因的原核表达载体，其特征在于：14-3-3j蛋白基因来源于黑大豆，其GenBank登录号为AK285891。

3.权利要求1所述的黑大豆14-3-3j蛋白基因的原核表达载体在制备多克隆抗体中的应用。

4.根据权利要求3所述的黑大豆14-3-3j蛋白基因的原核表达载体在制备多克隆抗体中的应用，其特征在于：多克隆抗体可用于蛋白表达检测和14-3-3j与体内代谢酶类相互作用的体外验证实验中。

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