KR20180102215A - 관절염의 진단과 치료를 위한 14-3-3 에타 항체 및 이의 용도 - Google Patents
관절염의 진단과 치료를 위한 14-3-3 에타 항체 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 자연 형태의 인간 14-3-3 에타 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 다른 인간 14-3-3 단백질 아이소형에 비해 상기 인간 14-3-3 에타 단백질에 특이성을 나타내는 안티-14-3-3 에타 항체들을 제공한다. 관절염의 진단과 치료를 위한 방법, 키트 및 상기 특이적 안티-14-3-3 에타 항체들을 포함하는 약학적 조성물을 추가로 제공한다.
Description
본 발명은 14-3-3 단백질의 에타 아이소형과 특이적으로 결합하고 에타 아이소형과 다른 14-3-3 단백질 아이소형들을 구별할 수 있는 항체들에 관한 것이다.
14-3-3 단백질들은 진핵생물에서 어디에서나 발현되는 보존된 세포내 조절 분자들의 집단이다. 14-3-3 단백질들은 키나아제, 포스파타아제 및 막투과 수용체들을 포함하는 여러 기능적으로 다양한 시그널링 단백질들과 결합하는 능력을 가진다. 또한, 100개 이상의 시그널링 단백질들은 14-3-3 리간드들로 보고되었다. 14-3-3 단백질들은 테트라트리코 펩타이드 반복 슈퍼패밀리(tetratrico peptide repeat superfamily)의 진화된 일원들로 생각될 수 있다. 이들은 일반적으로 9 또는 10개 알파 나선을 가지며 주로 이들의 아미노-말단 나선을 따라 호모- 및/또는 헤테로-다이머 상호작용을 형성한다. 이런 단백질들은 2가 양이온 상호작용, 포스포릴화 및 아세틸화, 및 단백질 분해 등을 위한 영역들을 포함하는 여러 공지된 도메인들을 함유한다. 포유류들에서 발현될 것으로 알려진 14-3-3 단백질들의 7개 뚜렷한 유전적으로 암호화된 아이소형들이 있고, 각각의 아이소형은 242-255개 아미노산을 포함한다. 7개 14-3-3 단백질 아이소형들은 14-3-3 α/β(알파/베타), 14-3-3 δ/ξ(델타/제타), 14-3-3ε(입실론), 14-3-3γ(감마), 14-3-3η(에타), 14-3-3τ/θ(타우/쎄타) 및 14-3-3σ(시그마/스트라핀)로 지정된다.
14-3-3 단백질들은 높은 등급의 서열 유사성을 가진다. 결과적으로, 14-3-3 항체들은 하나 이상의 14-3-3 단백질 아이소형을 통상적으로 인식한다. 특징화되어진 여러 안티-14-3-3 항체 제제들은 구입할 수 있다. 예를 들어, 14-3-3 단백질을 인식하는 토끼 다클론 항체들은 바이오몰, 산타크루즈 바이오테크놀러지, 업스테이트 바이오테크놀러지 및 어세이 디자인들로부터 구입할 수 있다. 이런 다클론 항체 제제들은 일부 형태의 14-3-3 에타를 인식한다; 그러나 어떤 것도 다른 14-3-3 단백질 아이소형에 비해 에타 아이소형에 대한 선택성이 없다. Martin, H. et al., (1993) Antibodies against the major brain isoforms of 14-3-3 protein. FEBS 331:296-303 참조. 또한 2007년 5월9일에 출원된 WO 2007/128132 참조. 아이소형 선택성의 결여 이외에, 자연 형태의 14-3-3 단백질을 인식하는 것으로 나타난 14-3-3 항체들이 거의 없다.
14-3-3 단백질들은 다양한 질환들과 관련이 있다. 그러나, 14-3-3 단백질들의 편재성과 기능의 다양성은 여러 14-3-3 단백질 아이소형("pan 14-3-3 항체들")과 결합 및/또는 자연 형태의 14-3-3 단백질을 인식할 수 없는 항체들의 치료적 사용을 크게 가로막는다. 또한, 특정 14-3-3 아이소형들은 pan 14-3-3 항체들이 진단 분석법에서 확실하게 탐지되지 않을 수 있고 pan 14-3-3 항체들과 같은 표적화된 방식으로 처리될 수 없는 특정 질환들과 관련이 있다. 예를 들어, 14-3-3 에타 및 14-3-3 감마는 관절염과 관련이 있다. 2007년 5월9일에 출원된 WO 2007/128132 참조. 14-3-3 단백질 집단 중 두 일원, 특히 14-3-3 에타 및 14-3-3 감마가 관절염 환자들의 활액과 혈청 내에 존재하고 이런 아이소형들은 활액과 혈청에서 MMP-1 및 MMP-3의 수준들과 직접 관련이 있다는 것을 보고한 키라니 등(2007, J. Rheum. 34: 1650-1657; WO 2007/128132) 참조.
본 발명은 자연 형태의 14-3-3 단백질의 에타 아이소형에 대해 선택적인 항체들은 14-3-3 아이소형들 사이의 높은 등급의 서열 동일성에도 불구하고, 14-3-3 에타의 에피토프들을 선택하는데 사용될 수 있다는 놀라운 발견으로부터 부분적으로 기원한다. 특히, 본 발명은 면역침전에 의해 증명된 대로, 자연 형태의 인간 14-3-3 에타 단백질과 특이적으로 결합(i)하고 다른 인간 14-3-3 단백질 아이소형들에 비해 인간 14-3-3 에타 단백질과 선택적으로 결합(ii)하는 안티-14-3-3 단백질 항체들을 제공한다. 품질들의 이런 조합은 본 발명의 항체들을 종래기술과 구별하며 14-3-3 에타가 관련된 질환들에 대한 진단 및 치료 방법에서 선택적 안티-14-3-3 항체들의 용도를 제공한다.
따라서, 한 태양에서, 본 발명은 안티-14-3-3 에타 항체들을 제공한다. 본 발명의 안티-14-3-3 항체들은, 예를 들어, 고유 14-3-3 에타의 면역침전에 의해 증명된 대로, 자연 형태의 인간 14-3-3 에타 단백질과 특이적으로 결합(i)하고 다른 인간 14-3-3 단백질 아이소형들에 비해 인간 14-3-3 에타 단백질과 선택적으로 결합(ii)할 수 있다.
한 바람직한 실시예에서, 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체는 관절염에서 세포외 관절 공극에 비정상적으로 국소화된 14-3-3 eta 단백질에 결합할 수 있다.
한 바람직한 실시예에서, 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체는 인간 14-3-3 에타 단백질의 N-말단에 위치한 에피토프에 결합하지 않는다.
한 바람직한 실시예에서, 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체는 14-3-3 에타 루프 펩타이드, 14-3-3 에타 나선 펩타이드 및 14-3-3 에타 비-나선 펩타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택된 펩타이드를 포함하는 에피토프에 결합할 수 있으며, 에타 루프 펩타이드가 특히 바람직하다.
한 바람직한 실시예에서, 14-3-3 에타 루프 펩타이드는 SEQ ID NOs:11-16으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시예에서, 안티-14-3-3 에타 항체는 SEQ ID NOs:11-16으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열에 상응하는 아미노산 서열과 겹치는 14-3-3 에타의 영역에 결합된다.
한 바람직한 실시예에서, 14-3-3 에타 나선 펩타이드는 SEQ ID NOs:1-10으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시예에서, 안티-14-3-3 에타 항체는 SEQ ID NOs:1-10으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열에 상응하는 아미노산 서열과 겹치는 14-3-3 에타의 영역에 결합된다.
한 바람직한 실시예에서, 14-3-3 에타 비-나선 펩타이드는 SEQ ID NOs:17-32로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시예에서, 안티-14-3-3 에타 항체는 SEQ ID NOs:17-32로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열에 상응하는 아미노산 서열과 겹치는 14-3-3 에타의 영역에 결합된다.
특히 바람직한 실시예에서, 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체는 LDKFLIKNSNDF(SEQ ID NO:30), KKLEKVKAYR (SEQ ID NO:31), 및 KNSVVEASEAAYKEA (SEQ ID NO:32)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열에 결합된다.
예시적 14-3-3 에타 루프, 나선 및 비-나선 펩타이드들은 표 1에 개시된다. 주목할 것은, SEQ ID NO:30은 14-3-3 에타 서열에서 발생하는 시스테인이 이황화 결합의 형성을 피하기 위해 세린에 의해 대체되었다는 점에서 상응하는 14-3-3 에타 서열과 다르다. 한 실시예에서, 본 발명은 시스테인을 포함하는 SEQ ID NO:30의 고유 14-3-3 서열 상관물에 결합하는 항체들을 제공한다. 한 실시예에서, 본 발명은 시스테인을 세린으로 치환함으로써 표 1에 나열된 것들과 다른 펩타이드 서열에 결합할 수 있는 항체들을 제공한다.
한 실시예에서, 안티-14-3-3 에타 항체는 14-3-3 에타에 의해 MMP의 유도를 억제할 수 있다. 바람직하게는, MMP는 MMP-1, 3, 8, 9, 10, 11 및 13으로 이루어진 그룹으로부터 선택되며, MMP-1과 MMP-3가 특히 바람직하다.
한 태양에서, 본 발명은 14-3-3 에타를 포함하는 질병 및 질환을 진단하기 위한 방법들을 제공한다. 이 방법들은 14-3-3 에타 단백질의 변형, 예를 들어, 발현, 국소화, 기능 등의 변화를 탐지하기 위해 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체를 사용하는 것을 포함한다. 한 실시예에서, 탐지는 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체에 의한 면역침전을 포함한다. 한 실시예에서, 탐지는 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체를 사용하는 ELISA의 사용을 포함한다. 한 실시예에서, 탐지는 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체를 사용하는 웨스턴 블로팅을 포함한다. 한 실시예에서, 탐지는 면역조직화학에서 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체의 사용을 포함한다. 한 실시예에서, 탐지는 면역형광에서 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체의 사용을 포함한다. 한 실시예에서, 탐지는 FACS 분석에서 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체의 사용을 포함한다. 한 실시예에서, 탐지는 방사능면역분석법에서 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체의 사용을 포함한다. 한 실시예에서, 탐지는 스트립 검사에서 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체의 사용을 포함한다. 한 실시예에서, 탐지는 현장 검사(point of care test)에서 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체의 사용을 포함한다. 한 실시예에서, 14-3-3 에타의 탐지는 질환의 다른 마커(예를 들어, 관절염에 대한 MMP)의 탐지와 결합된다.
한 실시예에서, 본 발명은 염증성 질환들의 진단을 위한 방법들을 제공한다. 한 바람직한 실시예에서, 관절염을 진단하기 위한 방법들이 제공된다. 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 베체트병(Behcet's Disease), 특발성 골격성 과골화증(Diffuse idiopathic skeletal hyperostosis)(DISH), 엘러스-단로스 증후(Ehlers-Danlos syndrome)(EDS), 펠티증후군(Felty's syndrome), 섬유근통(fibromyalgia), 통풍(gout), 감염성 관절염(infectious arthritis), 소아 관절염(juvenile arthritis), 낭창(lupus), 혼합결합조직병(mixed connective tissue disease)(MCTD), 골관절염(osteoarthritis), 파제트병(Paget's Disease), 류마티스성 다발성근육통(polymyalgia rheumatica), 다발성근염(polymyositis) 및 피부근염(dermatomyositis), 가성통풍(pseudogout), 건선성 관절염(psoriatic arthritis), 레이노 현상(Raynaud's Phenomenon), 반응성 관절염(reactive arthritis), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 경피증(scleroderma), 쇼그렌증후군(Sjogren's syndrome), 스틸병(Still’s Disease) 및 베게너 육아종(Wegener’s granulomatosis)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 질병을 진단하기 위한 방법들이 포함된다.
한 실시예에서, 이 방법들은 환자의 활액, 혈장 또는 혈청에서 14-3-3 에타 단백질을 탐지하는 것을 포함한다. 한 실시예에서, 탐지는 본 발명의 14-3-3 에타 항체를 사용하여 활액, 혈장 또는 혈청으로부터 14-3-3 에타 단백질의 면역침전에 의해 이루어진다. 한 실시예에서, 탐지는 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체를 사용하는 ELISA의 사용을 포함한다. 한 실시예에서, 탐지는 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체를 사용하여 환자로부터의 활액, 혈장 또는 혈청을 포함하는 샘플의 웨스턴 블로팅을 포함한다. 한 실시예에서, 탐지는 방사능면역분석법의 사용을 포함한다. 한 실시예에서, 탐지는 스트립 검사의 사용을 포함한다. 한 실시예에서, 탐지는 현장 검사(point of care test)의 사용을 포함한다. 한 실시예에서, 14-3-3 에타의 탐지는 질환의 다른 마커(예를 들어, MMP, 안티-CCP, 안티-RF 및/또는 CRP)의 탐지와 결합된다.
한 실시예에서 본 발명은 신경 질병들을 진단하기 위한 방법들을 제공한다. 한 바람직한 실시예에서, 뇌수막염(bacterial meningitis) 및 크로이펠트 야콥병(Creutzfeldt Jakob disease)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 질병을 치료하기 위한 방법들이 제공된다.
한 태양에서, 본 발명은 14-3-3 에타를 포함하는 질병들을 치료하기 위한 방법들을 제공한다. 이 방법들은 환자에게 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시예들에서, 이 방법들은 병합 치료들을 포함한다.
한 실시예에서, 본 발명은 염증성 질환들의 진단을 위한 방법들을 제공한다. 한 바람직한 실시예에서, 관절염을 진단하기 위한 방법들이 제공된다. 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 베체트병(Behcet's Disease), 특발성 골격성 과골화증(Diffuse idiopathic skeletal hyperostosis)(DISH), 엘러스-단로스 증후(Ehlers-Danlos syndrome)(EDS), 펠티증후군(Felty's syndrome), 섬유근통(fibromyalgia), 통풍(gout), 감염성 관절염(infectious arthritis), 소아 관절염(juvenile arthritis), 낭창(lupus), 혼합결합조직병(mixed connective tissue disease)(MCTD), 골관절염(osteoarthritis), 파제트병(Paget's Disease), 류마티스성 다발성근육통(polymyalgia rheumatica), 다발성근염(polymyositis) 및 피부근염(dermatomyositis), 가성통풍(pseudogout), 건선성 관절염(psoriatic arthritis), 레이노 현상(Raynaud's Phenomenon), 반응성 관절염(reactive arthritis), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 경피증(scleroderma), 쇼그렌증후군(Sjogren's syndrome), 스틸병(Still’s Disease) 및 베게너 육아종(Wegener’s granulomatosis)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 질병을 진단하기 위한 방법들이 포함된다.
한 실시예에서, 이 방법은 병합 치료를 포함하며, 적어도 하나의 다른 치료제는 본 발명의 하나 이상의 안티-14-3-3 에타 항체들에 더하여 투여된다. 한 바람직한 실시예에서, 치료제는 질병-변형 항류마티스성 약물(DMARDs), 질병-변형 골관절염 약물(DMOADs; 예를 들어, Loeser, Reumatologia, 21:104-106, 2005 참조), 안티-TNFα 항체, 안티-IL-1 항체, 안티-CD4 항체, 안티-CTLA4 항체, 안티-CD20 항체, 안티-IL6 항체, 레플루노미드, 설파살라진 및 메토트렉세이트로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
한 태양에서, 본 발명은 14-3-3 에타를 포함하는 질환들의 발생을 예방하기 위한 예방법들을 제공한다.
한 실시예에서, 본 발명은 염증 질환이 발생할 위험이 있는 피험자에서 염증 질환의 발생을 예방하기 위한 예방법들을 제공한다. 한 바람직한 실시예에서, 관절염이 발생할 위험이 있는 피험자에서 관절염을 예방하기 위한 예방법들이 제공된다. 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 베체트병(Behcet's Disease), 특발성 골격성 과골화증(Diffuse idiopathic skeletal hyperostosis)(DISH), 엘러스-단로스 증후(Ehlers-Danlos syndrome)(EDS), 펠티증후군(Felty's syndrome), 섬유근통(fibromyalgia), 통풍(gout), 감염성 관절염(infectious arthritis), 소아 관절염(juvenile arthritis), 낭창(lupus), 혼합결합조직병(mixed connective tissue disease)(MCTD), 골관절염(osteoarthritis), 파제트병(Paget's Disease), 류마티스성 다발성근육통(polymyalgia rheumatica), 다발성근염(polymyositis) 및 피부근염(dermatomyositis), 가성통풍(pseudogout), 건선성 관절염(psoriatic arthritis), 레이노 현상(Raynaud's Phenomenon), 반응성 관절염(reactive arthritis), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 경피증(scleroderma), 쇼그렌증후군(Sjogren's syndrome), 스틸병(Still’s Disease) 및 베게너 육아종(Wegener’s granulomatosis)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 질병을 예방하기 위한 예방법들이 포함된다. 이 방법은 피험자에게 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체를 투여하는 단계를 포함한다. 한 실시예에서, 안티-14-3-3 에타 항체는 본 발명에 기술된 병합 치료의 구성요소로 투여된다.
한 태양에서, 본 발명은 14-3-3 에타를 포함하는 질병의 치료를 관찰하기 위한 방법들을 제공한다. 이 방법은 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체를 사용하여 환자 샘플들에서 14-3-3 에타의 수준을 측정하고 치료가 진행중인 환자에서 14-3-3 에타의 수준을 관찰하는 단계를 포함한다.
한 실시예에서, 본 발명은 염증성 질환의 치료를 관찰하기 위한 방법들을 제공한다. 한 바람직한 실시예에서, 관절염의 치료를 관찰하기 위한 방법들이 제공된다. 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 베체트병(Behcet's Disease), 특발성 골격성 과골화증(Diffuse idiopathic skeletal hyperostosis)(DISH), 엘러스-단로스 증후(Ehlers-Danlos syndrome)(EDS), 펠티증후군(Felty's syndrome), 섬유근통(fibromyalgia), 통풍(gout), 감염성 관절염(infectious arthritis), 소아 관절염(juvenile arthritis), 낭창(lupus), 혼합결합조직병(mixed connective tissue disease)(MCTD), 골관절염(osteoarthritis), 파제트병(Paget's Disease), 류마티스성 다발성근육통(polymyalgia rheumatica), 다발성근염(polymyositis) 및 피부근염(dermatomyositis), 가성통풍(pseudogout), 건선성 관절염(psoriatic arthritis), 레이노 현상(Raynaud's Phenomenon), 반응성 관절염(reactive arthritis), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 경피증(scleroderma), 쇼그렌증후군(Sjogren's syndrome), 스틸병(Still’s Disease) 및 베게너 육아종(Wegener’s granulomatosis)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 질병의 치료를 관찰하기 위한 방법들이 포함된다.
한 태양에서, 본 발명은 14-3-3 에타를 포함하는 질병을 위한 치료에 대한 환자의 반응력을 측정하기 위한 방법들이 제공된다. 한 실시예에서, 이 방법들은 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체를 사용하는 환자 샘플에서 14-3-3 에타의 수준을 측정하는 단계를 포함한다. 한 바람직한 실시예에서, 환자 샘플에서 14-3-3 에타의 수준은 치료에 반응할 수 있는 능력이 공지된 피험자들의 샘플의 수준과 비교된다.
한 실시예에서, 본 발명은 염증성 질환을 위한 치료에 대한 환자의 반응력을 측정하기 위한 방법들을 제공한다. 한 바람직한 실시예에서, 염증성 질환을 위한 치료에 대한 환자의 반응력을 측정하기 위한 방법들이 제공된다. 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 베체트병(Behcet's Disease), 특발성 골격성 과골화증(Diffuse idiopathic skeletal hyperostosis)(DISH), 엘러스-단로스 증후(Ehlers-Danlos syndrome)(EDS), 펠티증후군(Felty's syndrome), 섬유근통(fibromyalgia), 통풍(gout), 감염성 관절염(infectious arthritis), 소아 관절염(juvenile arthritis), 낭창(lupus), 혼합결합조직병(mixed connective tissue disease)(MCTD), 골관절염(osteoarthritis), 파제트병(Paget's Disease), 류마티스성 다발성근육통(polymyalgia rheumatica), 다발성근염(polymyositis) 및 피부근염(dermatomyositis), 가성통풍(pseudogout), 건선성 관절염(psoriatic arthritis), 레이노 현상(Raynaud's Phenomenon), 반응성 관절염(reactive arthritis), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 경피증(scleroderma), 쇼그렌증후군(Sjogren's syndrome), 스틸병(Still’s Disease) 및 베게너 육아종(Wegener’s granulomatosis)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 질병에 대한 반응력을 측정하기 위한 방법들이 포함된다.
한 태양에서, 본 발명은 14-3-3 에타를 포함하는 질병들의 아형들을 구별하기 위한 방법들을 제공한다.
한 실시예에서, 염증성 질환들의 아형들을 구별하기 위한 방법들이 제공된다. 한 바람직한 실시예에서 관절염의 아형들을 구별하기 위한 방법들이 제공된다. 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 베체트병(Behcet's Disease), 특발성 골격성 과골화증(Diffuse idiopathic skeletal hyperostosis)(DISH), 엘러스-단로스 증후(Ehlers-Danlos syndrome)(EDS), 펠티증후군(Felty's syndrome), 섬유근통(fibromyalgia), 통풍(gout), 감염성 관절염(infectious arthritis), 소아 관절염(juvenile arthritis), 낭창(lupus), 혼합결합조직병(mixed connective tissue disease)(MCTD), 골관절염(osteoarthritis), 파제트병(Paget's Disease), 류마티스성 다발성근육통(polymyalgia rheumatica), 다발성근염(polymyositis) 및 피부근염(dermatomyositis), 가성통풍(pseudogout), 건선성 관절염(psoriatic arthritis), 레이노 현상(Raynaud's Phenomenon), 반응성 관절염(reactive arthritis), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 경피증(scleroderma), 쇼그렌증후군(Sjogren's syndrome), 스틸병(Still’s Disease) 및 베게너 육아종(Wegener’s granulomatosis)으로 이루어진 그룹들을 구별하기 위한 방법들이 포함된다. 한 실시예에서, 이 방법들은 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체를 사용하여 환자 샘플에서 14-3-3 에타의 수준을 측정하는 단계를 포함한다. 한 바람직한 실시예에서, 환자에서 14-3-3 에타의 수준은 염증성 질환 또는 예후의 아형이 공지된 피험자들의 샘플들의 수준과 비교된다.
한 태양에서, 본 발명은 외상에 의해 손상된 관절에 대한 손상을 감소시키기 위한 방법들을 제공한다. 이 방법들은 외상에 의해 손상된 관절을 가진 피험자에게 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체를 투여하는 단계를 포함한다. 한 실시예에서 안티-14-3-3 에타 항체는 본 발명에서 기술된 병합 치료의 구성요소로서 투여된다.
한 태양에서, 본 발명은 MMP 발현을 감소시키는 방법들을 제공한다. 한 실시예에서, 감소될 MMP 발현은 활막이다. 이 방법들은 MMP를 생산하는 세포들이 존재하는 조직 또는 격실에 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체를 전달하는 단계를 포함하며, MMP를 생산하는 세포들은 14-3-3 에타 단백질에 반응성이 있다. 전달은 손상된 조직 또는 격실에 직접적일 수 있거나 간접적일 수 있다. 한 바람직한 실시예에서, 반응성 세포들은 섬유아세포 또는 FLS 세포들이다.
한 바람직한 실시예에서, 감소될 MMP 발현은 관절염과 관련이 있는 MMP 발현이다.
한 바람직한 실시예에서, 감소될 MMP 발현은 MMP-1, 3, 8, 9, 10, 11 및 13으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 MMP의 발현이다. 특히 바람직한 실시예에서, 감소될 MMP 발현은 MMP-1 또는 MMP-3의 수준이다.
한 태양에서, 본 발명은 14-3-3 에타 단백질에 의한 MMP 유도를 억제하는 방법들을 제공한다. 억제는 부분적이거나 완전할 수 있다. 이 방법들은 MMP를 생산하는 세포들이 존재하는 조직 또는 격실에 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체를 전달하는 단계를 포함하며, MMP를 생산하는 세포들은 14-3-3 에타 단백질에 반응성이 있다. 전달은 손상된 조직 또는 격실에 직접적일 수 있거나 간접적일 수 있다. 한 바람직한 실시예에서, 안티-14-3-3 에타 항체는 활막에 투여된다. 한 바람직한 실시예에서, 반응성 세포들은 섬유아세포 또는 FLS 세포들이다.
한 바람직한 실시예에서, 억제될 MMP 유도는 관절염에서 상승조절되는 MMP의 유도이다.
한 바람직한 실시예에서, 억제될 MMP 발현은 MMP-1, 3, 8, 9, 10, 11 및 13으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 MMP의 발현이다. 특히 바람직한 실시예에서, 억제될 MMP 발현은 MMP-1 또는 MMP-3의 수준이다.
한 태양에서, 본 발명은 피험자에서 관절 붓기를 감소시키는 방법들을 제공한다. 이 방법들은 병에 걸린 피험자에게 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체를 투여하는 단계를 포함한다.
한 태양에서, 본 발명은 피험자에서 연골 퇴화를 감소시키는 방법들을 제공한다. 이 방법들은 병에 걸린 피험자에게 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체를 투여하는 단계를 포함한다.
한 태양에서, 본 발명은 피험자에서 뼈 퇴화를 감소시키는 방법들을 제공한다. 이 방법들은 병에 걸린 피험자에게 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체를 투여하는 단계를 포함한다.
한 태양에서, 본 발명은 활액에서 친-염증성 사이토카인 축적을 감소시키는 방법들을 제공한다. 이 방법들은 병에 걸린 피험자에게 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체를 투여하는 단계를 포함한다.
병에 걸린 피험자에게 안티-14-3-3 에타 항체의 투여를 포함하는 방법들의 경우, 한 바람직한 실시예에서, 관절낭내 전달이 사용된다. 다른 실시예에서, 전신 전달이 사용된다. 치료 조성물들은 전달된 안티-14-3-3 에타 항체가 세포외에서 국소화된 14-3-3 에타 단백질과 결합하는데 사용될 수 있도록 제제화되고 투여된다.
한 태양에서, 본 발명은 14-3-3 에타를 포함하는 질환을 진단하거나 14-3-3 에타를 포함하는 질환에 의해 영향을 받은 환자들의 예후를 측정하는데 유용한 키트를 제공한다.
한 태양에서, 본 발명은 14-3-3 에타를 포함하는 질병들의 치료에 유용한 약학적 조성물들을 제공한다. 약학적 조성물들은 본 발명의 14-3-3 에타 항체를 포함한다. 한 바람직한 실시예에서, 관절염의 치료에 유용한 약학적 조성물들이 제공된다.
한 태양에서, 본 발명은 14-3-3 에타를 포함하는 질병들의 치료에 유용한 약물을 생산하는 방법을 제공한다.
항체 또는 이의 항원-결합 단편은 탐지가능한 수준에서(예를 들어, ELISA 분석법 내에서) 리간드와 반응하며 유사한 조건하에서 관련없는 리간드들과 탐지가능하게 반응하지 않는 경우 "특이적으로 결합한다", "면역학적으로 결합한다" 및/또는 "면역학적으로 반응성 있다"라고 말한다.
본 명세서에서 사용된 대로, 면역학적 결합은 일반적으로 면역글로불린 분자와 면역글로불린에 특이적인 항원 사이에 일어나는 형태의 비-공유 상호작용을 의미한다. 면역학적 결합 상호작용의 강도 또는 친화성은 상호작용의 분해 상수(Kd)로 표현될 수 있고, 더 작은 Kd는 더 큰 친화성을 나타낸다. 면역학적 결합 특성들은 당업계에 주지된 방법들을 사용하여 정량화될 수 있다. 예를 들어, Davies et al. (1990) Annual Rev. Biochem. 59:439-473 참조.
"항체"는 상응하는 항원에 특이적으로 결합하고, 면역글로불린들의 공통적이고 일반적인 구조를 가진 단백질을 포함하는 조성물을 의미한다. 항체라는 용어는 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 다클론 항체들, 단클론 항체들, 다이머들, 멀티머들, 다중 특이적 항체들(예를 들어, 이중 특이적 항체들) 및 항체 단편들을 구체적으로 포함한다. 항체들은 설치류, 인간, 인간화, 키메릭일 수 있고 또는 다른 종들로부터 유도될 수 있다. 통상적으로, 항체는 결합할 때 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 형성하는 이황화 결합에 의해 서로 연결된 적어도 2개의 중사슬과 2개의 경사슬을 포함할 것이다. 각각의 중사슬은 중사슬 가변 영역(VH) 및 중사슬 불변 영역(CH)으로 구성된다. 중사슬 불변 영역은 3개 도메인, CH1, CH2 및 CH3로 구성되며, 뮤, 델타, 감마, 알파 또는 입실론 아이소타이프일 수 있다. 유사하게, 경사슬은 경사슬 가변 영역(VL)과 경사슬 불변 영역(CL)으로 구성된다. 경사슬 불변 영역은 카파 또는 람다 아이소타이프일 수 있는 한 도메인, CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 더욱 보존되는 프레임워크 영역(FR)으로 불리는 영역들과 점점이 흩어진 상보성 결정 영역(CDR)으로 불리는 초가변성의 영역들로 더 나뉠 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 다음 순서로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 아미노 말단으로부터 카복시 말단으로 배열된 3개의 CDRs과 4개의 FRs로 구성된다. 중사슬들과 경사슬들의 가변 영역들은 항원과 상호작용하는 결합 도메인들을 포함한다. 항체들의 불변 영역들은 면역시스템의 다양한 세포들(예를 들어, 작용 세포들) 및 전형적인 보체 시스템의 제 1 구성요소(Clq)를 포함하는 숙주 조직들 또는 인자들에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다. 중사슬 불변 영역은, 특히 Fc 수용체들(예를 들어, FcγRI, FcγRII, FcγRIII 등)과 같은 세포 수용체들을 통해 숙주 조직 또는 숙주 인자들에 대한 면역글로불린의 결합을 매개한다. 본 명세서에서 사용된 대로, 항체는 항원과 결합하는 능력을 보유한 면역글로불린의 항원 결합 부분을 포함한다. 이들은, 예를 들어, F(ab), VL CL 및 VH CH 항체 도메인들의 1가 단편; 및 F(ab')2 단편, 힌지 영역에서 이황화 다리에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편을 포함한다. 항체라는 용어는 재조합 단일사슬 Fv 단편들(scFv) 및 다이아바디(diabodies), 트라이아바디(triabodes) 및 테트라바디(tetrabodies)와 같은 이중 특이적 분자들을 의미한다(미국특허 제 5,844,094호 참조).
항체들은 항체 착물들을 포함하는 여러 형태로 생산되고 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 대로, "항체 착물"이란 용어는 하나 이상의 항체들과 다른 항체 또는 항체 단편 또는 단편들의 착물 또는 둘 이상의 항체 단편들의 착물을 의미한다. 항체 착물들은 호모컨쥬케이트 및 헤테로컨쥬케이트뿐만 아니라 본 명세서에 기술된 다른 가교 항체들의 안티-14-3-3 항체들의 멀티머 형태들을 포함한다.
"항원"은 넓게 해석되며 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 분자, 조성물 또는 입자를 의미한다. 항원은, 비록 항체의 생산을 반드시 유도하지 않으나,항체와 반응하는 하나 이상의 에피토프를 가진다.
"가교된", "가교" 및 이의 문법적으로 동일한 용어는 항체 착물들을 형성하는 둘 이상의 항체들의 결합을 의미하고 멀티머화라고도 불릴 수 있다. 가교 또는 멀티머화는 둘 이상의 동일한 항체들의 결합(예를 들어, 호모다이머화)뿐만 아니라 둘 이상의 다른 항체들의 결합(예를 들어, 헤테로다이머화)을 포함한다. 당업자들은 가교 또는 멀티머화는 항체 호모컨쥬케이트 및 항체 헤테로컨쥬케이트를 형성하는 것을 의미한다는 것을 인식할 것이다. 이런 컨쥬케이트들은 동일한 클론 기원(호모컨쥬케이트)의 둘 이상의 단클론 항체들의 결합 또는 다른 클론 기원(헤테로컨쥬케이트 또는 이중특이성으로 불림)의 결합을 포함할 수 있다. 항체들은 비-공유 또는 공유 결합에 의해 가교될 수 있다. 가교에 적합한 여러 기술들은 당업자들이 알 수 있을 것이다. 비-공유 결합은 제 1 항체 종들에 특이적인 제 2 항체의 사용을 통해 성취될 수 있다. 예를 들어, 염소 안티-생쥐(GAM) 제 2 항체는 생쥐 단클론 항체를 가교하는데 사용될 수 있다. 공유 결합은 화학적 가교제들의 사용을 통해 성취될 수 있다.
"에피토프"는 항체에 특이적인 결합을 할 수 있는 결정자를 의미한다. 에피토프들은 분자들의 표면들 상에 일반적으로 존재하고 항체들과의 상호작용에 접근할 수 있는 화학적 구조들이다. 전형적인 화학적 구조들은 아미노산들과 당 모이어티들이며, 3차원 구조적 특징들뿐만 아니라 전하, 친수성 및 친유성을 포함하는 화학적 특성들을 가진다. 입체적 에피토프들은 항체와의 반응성이 손실되어 기본 화학적 구조에 어떠한 변화 없이 분자의 공간 원소들의 변화를 일으키는 비 입체적 에피토프들과 구별된다.
"인간화된 항체"는 비-인간 면역글로불린으로부터 유도된 최소 서열을 함유하는 면역글로불린 분자를 의미한다. 인간화된 항체들은 인간 면역글로불린들(수신자 항체)을 포함하며, 여기서 수신자의 상보성 결정 영역(CDR)으로부터의 잔기들이 원하는 특이성, 친화성 및 능력을 가진 생쥐, 쥐 또는 토끼와 같은 비-인간 종들(제공자 항체)의 CDR로부터의 잔기들에 의해 대체된다. 일부 경우들에, 인간 면역글로블린의 Fv 프레임워크 잔기들은 상응하는 비 인간 잔기들로 대체된다. 인간화된 항체들은 수신자 항체 또는 이입된 CDR 또는 프레임워크 서열들에서 발견되지 않는 잔기들을 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화된 항체는 적어도 하나 및 통상적으로 두 개인 가변 영역의 실질적으로 전부를 포함할 것이며, 전부 또는 실질적으로 전부의 CDR 영역들은 비 인간 면역글로불린의 것들에 상응하며 전부 또는 실질적으로 전부의 프레임워크(FR) 영역들은 인간 면역글로불린 일치 서열의 것들에 상응한다. 인간화된 항체는 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 일반적으로 인간 면역글로불린의 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린들을 포함할 것이다(Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Reichmann et al, Nature 332:323-329 (1988)).
"면역원"은 면역반응의 생산을 자극하는 물질, 화합물, 조성물을 의미한다.
"면역글로불린 좌위"라는 용어는 면역글로불린 폴리펩타이드를 발현하기 위해 B 세포 또는 B 세포 전구체에 의해 사용될 수 있는 정보를 포함하는 유전 원소 또는 연결된 유전 원소들의 세트를 의미한다. 이 폴리펩타이드는 중사슬 폴리펩타이드, 경사슬 폴리펩타이드 또는 중사슬 및 경사슬 폴리펩타이드의 융합일 수 있다. 재배열되지 않은 좌위의 경우에, 유전 원소들은 B 세포 전구체들에 의해 결합되어 면역글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자를 형성한다. 재배열된 좌위의 경우에, 면역글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자는 좌위 내에 포함된다.
"아이소타이프(isotype)"는 중사슬 불변 영역에 의해 형성된 항체 종류를 의미한다. 중사슬들은 일반적으로 감마, 뮤, 알파, 델타, 입실론으로 분류되고 IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE로 지정된다. 각 아이소타이프 내의 변형들은 서브타입으로 분류되며, 예를 들어, IgG의 서브타입들은 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4로 분류되는 반면 IgA는 IgA1 및 IgA2로 분류된다. IgY 아이소타이프는 새들에게 특이적이다.
"단클론 항체" 또는 "단클론 항체 조성물"은 단일 분자 조성물의 항체 분자들의 제제를 의미한다. 단클론 항체 조성물은 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성과 친화성을 나타낸다.
"인간 단클론 항체"라는 용어는 인간 면역글로불린 서열들로부터 유도된 가변 및/또는 불변 영역들(존재하는 경우)을 가진 단일 결합 특이성을 나타내는 항체들을 포함한다. 한 실시예에서, 인간 단클론 항체들은 형질전환 비-인간 동물, 예를 들어, 불멸화된 세포들에 융합된 인간 중사슬 형질전환 유전자 및 경사슬 형질전환 유전자를 가진 형질전환 생쥐로부터 얻은 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생산된다.
"단일사슬 Fv" 또는 "scFv"는 항체의 VH 및 VL 영역들을 포함하는 항체를 의미하고, 이런 도메인들은 단일 폴리펩타이드 사실에 존재한다. 일반적으로, scFv는 scFv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있는 VH 및 VL 도메인들 사이의 폴리펩타이드 링커를 더 포함한다.
"피험자" 및 "환자"는 서로 교환해서 사용되며 나타낸 경우를 제외하고, 인간 및 비-인간 영장류뿐만 아니라 토끼, 쥐, 생쥐, 염소, 돼지와 같은 포유류들 및 다른 포유류 종들을 의미한다.
"재조합 항체"는 재조합 기술들에 의해 생산되는 항체들을 의미한다. 이들은 면역글로불린 좌위에 대해 형질전환되는 동물로부터 얻은 항체들, 재조합 발현 벡터로부터 발현된 항체들 및 임의의 면역글로불린 유전자 서열을 임의의 다른 핵산 서열에 접합하여 형성, 제조 및 발현된 항체들을 포함한다.
안티-14-3-3 항체들
한 태양에서, 본 발명은 안티-14-3-3 에타 항체들을 제공한다. 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체들은 면역침전에 의해 증명된 대로, 자연 형태의 인간 14-3-3 에타 단백질과 특이적으로 결합(i)하고 다른 인간 14-3-3 단백질 아이소형들에 비해 인간 14-3-3 에타 단백질과 선택적으로 결합(ii)할 수 있다.
"자연 형태"의 인간 14-3-3 에타 단백질에 특이적으로 결합하는 것은 인비보에서 만나게 되는 14-3-3 단백질과 결합하는 능력을 의미한다. 이것은, 예를 들어, 생물학적 샘플로부터 14-3-3 에타 단백질을 면역침전하는 항체의 능력에 의해 증명될 수 있다.
"다른 인간 14-3-3 단백질 아이소형에 비해 상기 인간 14-3-3 에타 단백질에 대한 선택성"은 동일 조건하에서 다른 인간 14-3-3 단백질 아이소형들과 비교하여 인간 14-3-3 에타 단백질에 특이적으로 결합하고 우선적으로 14-3-3 에타와 특이적으로 결합하는 능력을 의미한다. 선택성은, 예를 들어, 하이브리도마 클론들로부터의 상청액을 사용하여 이루어질 수 있는 ELISA 분석법을 사용하여 증명될 수 있다. 대조군(예를 들어, 면역전 혈청)이 사용되는 것이 바람직하다. "선택적" 항체는 14-3-3 에타를 인식할 수 있고 다른 14-3-3 아이소형들과 비교해서 14-3-3 에타에 대해 더 높은 신호, 바람직하게는 다른 아이소형들과 비교해서 적어도 1.5배, 더욱 바람직하게는 적어도 2배 더 높은 신호를 발생시킬 수 있다. 한 바람직한 실시예에서, 선택적 항체는 다른 14-3-3 아이소형들과 비교해서 14-3-3 에타를 선택적으로 면역침전하는 능력을 가진다.
한 바람직한 실시예에서, 안티-14-3-3 에타 항체는 인간 14-3-3 알파, 베타, 델타, 입실론, 감마, 타우 및 제타 단백질들에 비해 상기 인간 14-3-3 에타 단백질에 대해 선택성을 나타낸다. 이것은, 예를 들어, ELISA에 의해 증명될 수 있다.
한 바람직한 실시예에서, 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체는 관절염에서 세포외 관절 공극에서 비정상적으로 국소화된 14-3-3 에타 단백질에 결합할 수 있다. 이것은, 예를 들어, 관절염을 가진 환자의 활액 샘플에 존재하는 14-3-3 에타 단백질의 면역침전에 의해 증명될 수 있다.
한 바람직한 실시예에서, 안티-14-3-3 에타 항체는 14-3-3 에타에 의한 MMP의 유도를 억제할 수 있다. 바람직하게는, MMP는 MMP-1, 3, 8, 9, 10, 11 및 13으로 이루어진 그룹으로부터 선택되며, MMP-1과 MMP-3가 특히 바람직하다. 이런 능력은 인비트로 분석법 또는 인비보 분석법에 의해 측정될 수 있다. 당업자가 알 수 있듯이, 분석법들은 안티-14-3-3 에타 항체의 부존재하에서, 14-3-3 에타의 존재가 MMP의 유도를 일으킬 수 있도록 설계될 것이다. 14-3-3 에타에 의한 MMP의 이런 유도를 감소시키는 능력은 안티-14-3-3 항체에 대한 기능-억제 능력을 증명할 수 있다.
14-3-3 에타 에피토프들
한 바람직한 실시예에서, 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체는 14-3-3 에타의 N-말단에서 에피토프와 결합하지 않는다. 14-3-3 에타 "N-말단"은 아미노산 1-12(즉, DREQLLQRARLA (SEQ ID NO:33))를 의미한다.
한 바람직한 실시예에서, 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체는 14-3-3 에타 루프 펩타이드, 14-3-3 에타 나선 펩타이드 및 14-3-3 에타 비-나선 펩타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택된 펩타이드를 포함하는 에피토프에 결합할 수 있고, 에타 루프 펩타이드가 특히 바람직하다. 표 1 참조. 예시적 14-3-3 에타 루프, 나선 및 비-나선 펩타이드들은 표 1에 개시된다. 주목할 것은, SEQ ID NO:30은 14-3-3 에타 서열에서 발생하는 시스테인이 이황화 결합의 형성을 피하기 위해 세린에 의해 대체되었다는 점에서 상응하는 14-3-3 에타 서열과 다르다. 한 실시예에서, 본 발명은 시스테인을 포함하는 SEQ ID NO:30의 고유 14-3-3 서열 상관물에 결합하는 항체들을 제공한다. 한 실시예에서, 본 발명은 시스테인을 세린으로 치환함으로써 표 1에 나열된 것들과 다른 펩타이드 서열에 결합할 수 있는 항체들을 제공한다.
(i) 루프 펩타이드들
한 바람직한 실시예에서, 14-3-3 에타 루프 펩타이드는 SEQ ID NOs:11-16으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시예에서, 안티-14-3-3 에타 항체는 SEQ ID NOs:11-16으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열에 상응하는 아미노산 서열과 겹치는 14-3-3 에타의 영역에 결합된다.
특히 바람직한 실시예에서, 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체는 LDKFLIKNSNDF(SEQ ID NO:30), KKLEKVKAYR (SEQ ID NO:31), and KNSVVEASEAAYKEA (SEQ ID NO:32)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열에 결합한다.
(ii) 나선 펩타이드들
한 바람직한 실시예에서, 14-3-3 에타 나선 펩타이드는 SEQ ID NOs:1-10으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시예에서, 안티-14-3-3 에타 항체는 SEQ ID NOs:1-10으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열에 상응하는 아미노산 서열과 겹치는 14-3-3 에타의 영역에 결합된다.
(iii) 비-나선 펩타이드들
한 바람직한 실시예에서, 14-3-3 에타 비-나선 펩타이드는 SEQ ID NOs:17-32로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시예에서, 안티-14-3-3 에타 항체는 SEQ ID NOs:17-32로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열에 상응하는 아미노산 서열과 겹치는 14-3-3 에타의 영역에 결합된다.
단클론 항체들, 하이브리도마, 및 이를 제조하는 방법
한 실시예에서, 본 발명은 단클론 안티-14-3-3 에타 항체들인 안티-14-3-3 에타 항체들을 제공한다. 또한 이런 항체들을 생산할 수 있는 하이브리도마 세포주들이 제공된다. 또한 이런 하이브리도마를 생산할 수 있는 방법들 및 이런 항체들을 생산할 수 있는 방법들이 제공된다.
제공된 단클론 안티-14-3-3 에타 항체들은 본 명세서에 기술된 14-3-3 에타 루프, 나선 및 비-나선 펩타이드들에 결합하는 항체들을 포함한다.
한 태양에서, 본 발명은 14-3-3 에타 루프, 나선 및 비-나선 펩타이드들을 포함하는 면역원으로 면역화된 생쥐로부터 유도된 비장 세포의 융합에 의해 생산된 하이브리도마를 제공한다. 또한 이런 하이브리도마에 의해 생산된 단클론 항체들이 제공된다.
본 발명은 이런 단클론 항체들 또는 이의 유도체들을 생산하는 방법들을 더 제공하며, 단클론 항체가 생산되는 적절한 조건하에서 본 발명의 하이브리도마를 생산하는 단계와 세포 및/또는 세포 배지로부터 항체 및/또는 이의 유도체를 얻는 단계를 포함한다.
항체들은 당업자에 의해 쉽게 생산될 수 있다. 하이브리도마에 의해 단클론 항체들을 제조하기 위한 일반적인 방법은 당업계에 주지되어 있다. 예를 들어, M. Schreier et al., Hybridoma Techniques (Cold Spring Harbor Laboratory) 1980; Hammerling et al., Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas (Elsevier Biomedical Press) 1981. 참조.
일부 실시예들에서, 이런 방법들은 단클론 항체가 생산되는 적절한 조건하에서 하이브리도마 세포를 배양하는 단계와 세포 및/또는 세포 배지로부터 항체 및/또는 이의 유도체를 얻는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 본 명세서에서 기술된 관심 14-3-3 펩타이드들에 결합할 수 있는 항체들에 대한 pan에 파아지 라이브러리를 사용하는 것을 고려한다. 예를 들어, Konthur et al., Targets, 1: 30-36, 2002. 참조.
임의의 수단에 의해 생산된 항체들은 당업자에 의해 공지된 방법들에 의해 정제될 수 있다. 정제 방법들은, 다른 것들 중에서, 선택적 침전, 액체 크로마토그래피, HPLC, 전기영동, 크로마토포커싱(chromatofocusing) 및 다양한 친화성 기술들을 포함한다. 선택적 침전은 황산 암모늄, 에탄올(콘 침전), 폴리에틸렌 글리콜 또는 당업계에서 구입할 수 있는 다른 물질들을 사용할 수 있다. 액체 크로마토그래피 매질들은, 다른 것들 중에서, 이온 교환 매질 DEAE, 폴리아스파르테이트, 하이드록실아파타이트, 크기 배제(예를 들어, 가교 아가로스, 아크릴아마이드, 덱스트란 등을 기초로 한 것들), 소수성 기질들(예를 들어, 블루 세파로스)을 포함한다. 친화성 기술들은 통상적으로 면역글로불린 Fc 도메인과 상호작용하는 단백질들에 의존한다. 황색 포도상구균의 단백질 A는 인간 γ1, γ2 또는 γ4 중사슬들을 기초로 한 항체들을 정제하는데 사용될 수 있다(Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). C 및 G 연쇄상구균의 단백질 G는 모든 생쥐 아이소타입과 인간 γ3에 대해 유용하다(Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). k 경사슬 상호작용을 통해 면역글로불린들(Ig)에 결합하는 단백질 L, 펩토연쇄상구균(Peptostreptococcus magnus) 세포벽 단백질은 Ig 하부종류인 IgM, IgA, IgD, IgG, IgE 및 IgY의 친화성 정제에 유용하다. 이런 단백질들의 재조합 형태들은 상업적으로 구입할 수 있다. 항체가 히스티딘 태그들을 함유하도록 제조된 파이지 디스플레이 항체들과 같은 금속 결합 잔기들을 포함하는 경우, 금속 친화성 크로마토그래피가 사용될 수 있다. 충분한 양의 특이적 세포 인구들이 사용되는 경우, 항원 친화성 기질들은 항체들을 정제하기 위한 친화성 방법을 제공하기 위해 세포들로 제조될 수 있다.
한 바람직한 실시예에서, 분리는 14-3-3 에타 또는 이의 단편을 사용하는 친화성 크로마토그래피를 포함한다.
본 발명은 본 명세서에 기술된 항체들뿐만 아니라 항체 단편들과 항원 결합 부분들을 제공한다. 전부 안티-14-3-3 에타 항체라는 용어에 포함된다. 본 발명의 항체의 "항체 단편" 또는 "항체 결합 부분"(또는 간단히 "항체 부분")은 항원과 특이적으로 결합하는 능력을 보유한 항체들의 하나 이상의 단편을 의미한다. 항체의 항원 결합 기능은 전장 항체의 단편들에 의해 수행될 수 있다는 것이 나타났다. 항체의 "항체 단편" 또는 "항체 결합 부분"이란 용어 내에 포함된 결합 단편들의 예들은 (i) Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인들로 이루어진 1가 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화 다리에 의해 연결된 두 Fab 단편들을 포함하는 2가 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인들로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 암의 VL 및 VH 도메인들로 이루어진 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편(예를 들어, Ward et al., (1989) Nature 341:544-546) 및 (vi) 분리된 상보성 결정 영역(CDR) 및 (vii) 이중특이성 단일사슬 Fv 다이머들(예를 들어, PCT/US92/09965)을 포함한다. 또한, 비록 Fv 단편의 두 도메인들, VL 및 VH가 개별 유전자들에 대해 암호화되지만, 이들은 이들이 VL 및 VH 영역들이 쌍을 이뤄 1가 분자들을 형성하는 단일 단백질 사슬(단일 사슬 Fv(scFv); 예를 들어, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 참조)로 만들어지도록 할 수 있는 합성 링커에 의해 재조합 방법들을 사용하여 결합될 수 있다. 이런 단일 사슬 항체들은 항체의 "항원-결합 부분"이란 용어 내에 포함된다. 이런 항체 단편들은 당업자에게 공지된 통상적인 기술들을 사용하여 얻으며, 단편들은 손상되지 않은 항체들과 같은 동일한 방식으로 용도를 위해 스크리닝된다. 항체 단편들은 변형될 수 있다. 예를 들어, 분자들은 VH 및 VL 도메인들을 연결하는 이황화 다리들의 포함에 의해 안정화될 수 있다(Reiter et al., 1996, Nature Biotech. 14:1239-1245).
면역글로불린 분자들은 단편들로 분해될 수 있다. 분자의 항원 결합 영역은 F(뮤)2 또는 Fab 단편들로 나뉠 수 있다. F(ab')2 단편은 2가이고 Fc 영역이 바람직하지 않거나 필요한 구조가 아닌 경우 유용하다. Fab 단편은 1가이고 항체가 이의 항원에 대해 매우 높은 탐욕을 가질 때 유용하다. Fc 영역을 항체로부터 제거하면 Fc 영역과 Fc 수용체 보유 세포들 사이의 비-특이적 결합을 감소시킨다. Fab 또는 F(ab')2 단편들을 형성하기 위해서, 항체들은 효소에 의해 소화된다. 면역글로불린 분자의 힌지 영역에서 절단되는 프로테아제들은 Fab 도메인들을 연결하는 이황화 결합(들)을 보존하여 절단 이후에 함께 존재한다. 이를 위한 적절한 프로테아제는 펩신이다. Fab 단편들을 생산하기 위해서, 프로테아제들은 절단이 중사슬들을 결합하나 중사슬과 경사슬을 연결하는 이황화 결합을 손상시키지 않는 이황화 결합들을 포함하는 힌지 영역 이상에서 일어나도록 선택된다. Fab 단편들을 제조하기 위한 적절한 프로테아제는 파파인이다. 단편들은, 손상되지 않은 Fc 영역을 필요로 하는 친화성 기술들을 제외하고(예를 들어, 단백질 A 친화성 크로마토그래피), 상기한 방법들에 의해 정제된다.
항체 단편들은 항체들의 제한된 단백질 가수분해에 의해 생산될 수 있고 단백질 가수분해성 항체 단편들로 불린다. 이들은 다음: F(ab')2 단편들, Fab' 단편들, Fab'-SH 단편들 및 Fab 단편들을 포함하나 이에 제한되지 않는다. "F(ab')2 단편들"은 단백질 가수분해성 효소, 예를 들어, 펩신 또는 피신에 대한 항체의 제한된 노출에 의해 항체로부터 방출된다. 한 F(ab')2 단편은 2개의 "암"을 포함하며, 각각은 공통 항원을 향하고 이와 특이적으로 결합하는 가변 영역을 포함한다. 2개의 Fab' 분자들은 중사슬들의 힌지 영역들에서 측쇄 이황화 결합들(interchain disulfide bonds)에 의해 결합되며; Fab' 분자들은 동일(2가) 또는 다른(이중특이성) 에피토프들을 향할 수 있다. "Fab' 단편들"은 Fab 및 힌지 영역을 통과하는 중사슬의 다른 부분을 포함하는 단일 항원 결합 도메인을 포함한다. "Fab'-SH 단편들"은 통상적으로 F(ab')2 단편들로부터 생산되며, F(ab')2 단편에서 H 사슬들 사이의 이황화 결합(들)에 의해 함께 결합된다. 비 제한적인 예인, 베타-머캡토에틸아민과 같은 온화한 환원제에 의한 처리는 이황화 결합(들)을 파괴하고 2개의 Fab' 단편들은 한 F(ab')2 단편으로부터 방출된다. Fab'-SH 단편들은 1가이고 단일특이성이다. "Fab 단편들"(즉, 항원 결합 도메인을 포함하고 경사슬과 이황화 결합에 의해 연결된 중사슬의 일부를 포함하는 항체 단편)은 손상되지 않는 항체들의 파파인 소화에 의해 생산될 수 있다. 편리한 방법은 효소가 쉽게 제거되고 소화가 종료되도록 수지 위에 고정된 파파인을 사용하는 것이다. Fab 단편들은 F(ab')2 단편에 존재하는 H 사슬들 사이에 이황화 결합(들)을 갖지 않는다.
"단일 사슬 항체들"은 한 형태의 항체 단편이다. 단일 사슬 항체라는 용어는 주로 "scFv" 또는 "sFv"로 약칭된다. 이런 항체 단편들은 재조합 DNA 기술을 사용하여 생산된다. 단일 사슬 항체는 항원 결합 위치를 형성하기 위해 상호작용하는 VH 및 VL 도메인들을 포함하는 폴리펩타이드 사슬로 구성된다. VH 및 VL 도메인들은 주로 10 내지 25개 아미노산 잔기들에 의해 연결된다.
"단일 사슬 항체"라는 용어는 2개의 단일 사슬 항체들(각각은 다른 에피토프를 향할 수 있다)이 이황화 결합에 의해 서로 연결되는 이황화-연결 Fv(dsFv); 다른 특이성의 2개의 구별된 scFvs가 펩타이드 링커에 의해 연결되는 이중특이성 sFv; 다이아바디(제 1 sFv의 VH 도메인이 제 2 sFv의 VL 도메인과 결합하고 제 1 sFv의 VL 도메인이 제 2 sFv의 VH 도메인과 결합할 때 형성된 다이머화된 sFv; 다이아바디의 2개의 항원 결합 영역은 동일하거나 다른 에피토프들을 향할 수 있다); 및 트라이아바디(다이아바디와 동일한 방식으로 형성되나 3개의 항원 결합 도메인들이 단일 착물에 형성된 트라이머화된 sFv; 3개의 항원 결합 도메인들은 동일하거나 다른 에피토프들을 향할 수 있다)를 더 포함하나 이에 제한되지 않는다.
"상보적 결정 영역 펩타이드" 또는 "CDR 펩타이드들"은 항체 단편의 다른 형태이다. 한 실시예에서, 본 발명은 이런 CDR 펩타이드들을 제공한다. 한 바람직한 실시예에서, 이런 CDR 펩타이드들은 14-3-3 에타 길항제들로 작용한다. CDR 펩타이드("최소 인식 단위"로 알려짐)는 단일 상보성-결정 영역(CDR)에 상응하는 펩타이드이고 관심 항체의 CDR를 암호화하는 구조 유전자들에 의해 제조될 수 있다. 이런 유전자들은, 예를 들어, 항체-생산 세포들의 RNA의 가변 영역을 합성하기 위해 폴리머라제 사슬 반응을 사용하여 제조된다. 예를 들어, Larrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106, 1991. 참조.
"시스테인-변형 항체들"에서, "시스테인 아미노산은 유전자 조작에 의해 항체의 표면상에 삽입되거나 치환되며, 예를 들어, 이황화 다리에 의해 다른 분자에 항체를 접합하는데 사용된다. 항체들에 대한 시스테인 치환들 또는 삽입들이 기술된다(미국특허 제 5,219,996호 참조). 항체들의 위치-특이적 컨쥬케이션에 사용하기 위해 Cys 잔기들을 IgG 항체들의 불변 영역 속으로 주입하기 위한 방법들은 스티멜 등에 의해 기술된다(J. Biol. Chem 275:330445-30450, 2000).
본 발명은 인간화된 항체 및 비-인간화된 항체들을 추가로 제공한다. 비-인간(예를 들어, 생쥐)의 항체들의 인간화된 형태들은 비-인간 면역글로불린으로부터 유도된 최소 서열을 함유하는 키메릭 항체들이다. 일반적으로, 인간화된 항체들은 인간 항체들에서 발견된 서열들과 교환된 가변-도메인 프레임워크 영역을 갖는 비-인간 항체들이다. 인간화된 항체들은 인간 면역글로불린들(수신자 항체)일 수 있고 수신자의 초가변 영역으로부터의 잔기들은 원하는 특이성, 친화성 및 능력을 가진 생쥐, 쥐, 토끼 또는 비인간 영장류와 같은 비-인간 종들(제공자 항체)의 초가변 영역으로부터의 잔기들에 의해 대체된다. 일부 경우들에, 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역(FR) 잔기들은 상응하는 비-인간 잔기들에 의해 대체된다. 또한, 인간화된 항체들은 수신자 항체 또는 제공자 항체에서 발견되지 않는 잔기들을 포함할 수 있다. 이런 변형들은 항체 성능을 추가로 개량하게 만들어진다. 일반적으로, 인간화된 항체는 적어도 하나, 통상적으로 2개의 가변 도메인의 실질적으로 전부를 포함할 것이며, 초가변 루프들의 전부 또는 실질적으로 전부는 비-인간 면역글로불린의 초가변 루프들과 상응하며 FRs의 전부 또는 실질적으로 전부는 인간 면역글로불린 서열의 초가변 루프들이다. 인간화된 항체는 선택적으로 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 통상적으로 인간 면역글로불린의 적어도 일부를 포함할 것이다.
일반적으로, 인간화된 항체에서, CDRs를 제외한 전체 항체는 인간 기원의 폴리펩타이드에 의해 암호화되거나 이의 CDRs 내를 제외하고 이런 항체들과 동일하다. CDRs, 이의 일부 또는 전부는 비-인간 유기체에서 기원하는 핵산들에 의해 암호화되고 항체를 형성하기 위해 인간 항체 가변 영역의 베타-시트 프레임워크 속에 이식되고, 이의 특이성은 접붙여진 CDRs에 의해 측정된다. 이런 항체들의 형성은, 예를 들어, WO 92/11018, Jones, 1986, Nature 321:522-525, Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536에 기술된다. 인간화된 항체들은 유전학적으로 가공된 면역 시스템을 가진 생쥐를 사용하여 형성될 수 있다. 예를 들어, Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog. 20:639-654.
작동자 기능에 대한 본 발명의 항체들을 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기(들)는 Fc 영역 속에 주입될 수 있어서, 이 영역에서 측쇄 이황화 결합을 형성시킨다. 호모다이머 항체들은 이형이중기능성 가교제들을 사용하여 제조될 수 있다, 예를 들어, Wolff et al. Cancer Research, 53:2560-2565 (1993). 또한, 항체는 이중 Fc 영역을 갖도록 가공될 수 있다. 예를 들어, Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3:219-230 (1989) 참조.
변형 항체들
한 실시예에서, 본 발명은 변형 항체들인 안티-14-3-3 에타 항체들을 제공한다. 변형 항체들은 본 명세서에서 기술된 대로 재조합 항체들을 포함한다.
변형 또는 재조합 항체들의 여러 형태는 당업자가 알 것이다. 변형 또는 재조합 항체들의 적절한 형태는, 제한 없이, 본 명세서에 기술된 가공된 단클론 항체들(예를 들어, 키메릭 단클론 항체들, 인간화된 단클론 항체들), 도메인 항체들(예를 들어, Fab, Fv, VH, scFV, 및 dsFv 단편들), 다가 또는 다중특이성 항체들(예를 들어, 다이아바디, 미니바디, 미니안티바디, (scFV)2, 트라이바디 및 테트라바디), 및 항체 컨쥬케이트를 포함한다.
한 태양에서, 본 발명은 도메인 항체들인 안티-14-3-3 에타 항체들을 제공한다. "도메인 항체들"은 인간 항체들의 중사슬(VH) 또는 경사슬(VL)의 가변 영역들에 상응하는 항체들의 기능성 결합 도메인들이다. 도메인 항체들은 대략 13kDa의 분자량 또는 전체 항체의 1/10 미만의 크기를 가질 수 있다. 이들은 박테리아, 효모 및 포유류 세포 시스템을 포함하는 다양한 숙주들에서 잘 발현된다. 또한, 도메인 항체들은 동결 건조 또는 열 변성과 같은 가혹한 조건들에 놓인 후에도 매우 안정하고 활성을 가진다. 예를 들어, 미국특허 6,291,158; 6,582,915; 6,593,081; 6,172,197; 미국연속번호. 2004/0110941; 유럽특허 0368684; 미국특허 6,696,245, WO04/058821, WO04/003019 및 WO03/002609 참조. 한 실시예에서, 본 발명의 도메인 항체는 단일 도메인이다. 단일 도메인 항체들은, 예를 들어, 미국특허 6,248,516에 개시된 대로 제조될 수 있다.
다른 태양에서, 본 발명은 다중 특이성 항체들을 포함한다. 다중 특이성 항체들은 이중특이성, 삼중특이성 등의 항체들을 포함한다. 이중특이성 항체들은, 예를 들어, 루신 지퍼 모이어티들(즉, 헤테로다이머들을 우선적으로 형성하는 Fos 및 Jun 단백질들로부터; Kostelny et al., 1992, J. Immnol. 148:1547) 또는 예를 들어, 미국특허 5,582,996에 기술된 다른 락 및 키 상호작용 도메인 구조들을 사용함으로써 재조합 수단을 통해 생산될 수 있다. 다른 유용한 기술들은 미국특허 5,959,083 및 미국특허 5,807,706에 개시된 것들을 포함한다.
이중특이성 항체들은 "다이아바디"로 때때로 불린다. 이들은 2개(또는 이상)의 다른 항원들에 결합하는 항체들이다. 또한 트라이아바디(다이아바디와 동일한 방식으로 형성되나 3개의 항원 결합 도메인들이 단일 착물에 형성된 트라이머화된 sFv; 3개의 항원 결합 도메인들은 동일하거나 다른 에피토프들을 향할 수 있다) 또는 테트라바디(4개의 항원 결합 도메인들이 동일하거나 다른 에피토프들을 향할 수 있는 단일 착물에 형성된 4개의 항원 결합 도메인들)가 당업계에 공지된다. 다이아-, 트라이아- 및 테트라바디는 당업계에 공지된 여러 방법(예를 들어, Holliger and Winter, 1993, Current Opinion Biotechnol. 4:446-449)으로 제조될 수 있으며, 예를 들어, 화학적으로 또는 혼성 하이브리도마로부터 제조될 수 있다. 또한, 이런 항체들과 이의 단편들은 유전자 융합에 의해 제조될 수 있다(예를 들어, Tomlinson et. al., 2000, Methods Enzymol. 326:461-479; WO94/13804; Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448).
다른 태양에서, 본 발명은 미니바디들을 제공하며, CH3 도메인에 결합된 scFV를 포함하는 최소화된 항체 유사 단백질들이며, 안티-14-3-3 에타 항체로부터 유도된다. 미니바디는 당업계에 개시된 대로 제조될 수 있다(예를 들어, Hu et al., 1996, Cancer Res. 56:3055-3061).
다른 실시예에서, 본 발명은 14-3-3 에타 결합 도메인 면역글로불린 융합 단백질들을 제공한다. 한 실시예에서, 융합 단백질은 면역글로불린 중사슬 CH3 불변 영역 폴리펩타이드에 융합된 면역글로불린 중사슬 CH2 불변 영역 폴리펩타이드에 융합된 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩타이드에 융합된 14-3-3 에타 결합 도메인 펩타이드를 포함할 수 있다. 본 발명하에서, 14-3-3 항체 융합 단백질들은 당업자가 아는 방법들에 의해 제조될 수 있다(예를 들어, 공개된 US 특허출원 20050238646, 20050202534, 20050202028, 2005020023, 2005020212, 200501866216, 20050180970, 및 20050175614 참조).
다른 실시예에서, 본 발명은 안티-14-3-3 에타 항체로부터 유도된 중사슬 단백질을 제공한다. 자연적으로 발생하는 중사슬 항체들(예를 들어, 경사슬들이 없는 카멜다 항체들)은 자연적으로 발생하는 중사슬 항체들의 구조와 기능적 특성들을 통상적으로 보유하는 항체-유도 치료 단백질들을 개발하는데 사용되었다. 이들은 당업계에 나노바디로 공지되어 있다. 안티-14-3-3 에타 중사슬 항체로부터 유도된 중사슬 단백질들은 당업자가 아는 방법들에 의해 제조될 수 있다(예를 들어, 공개된 US 특허출원 20060246477, 20060211088, 20060149041, 20060115470, 및 20050214857). 또한, 경사슬 결핍 생쥐에서 단지 중사슬 항체들의 생산에 관해서는, 예를 들어, Zou et al., JEM, 204:3271-3283, 2007 참조.
한 실시예에서, 본 발명은 인간 항체들인 변형 안티-14-3-3 에타 항체들을 제공한다. 한 실시예에서, 완전한 인간 14-3-3 항체들이 제공된다. "완전한 인간 항체(fully human body)" 또는 "완전 인간 항체(complete human antibody)"는 인간 염색체로부터 유도된 항체의 유전자 서열만을 가진 인간 항체를 의미한다. 안티-14-3-3 완전 인간 항체는 인간 항체의 중사슬과 경사슬에 대한 유전자들을 함유하는 인간 염색체 단편을 가진 인간 항체-생산 생쥐를 사용하는 방법(예를 들어, Tomizuka, K. et al., Nature Genetics, 16, p.133-143, 1997; Kuroiwa, Y. et al., Nuc. Acids Res., 26, p.3447-3448, 1998; Yoshida, H. et al., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects vol. 10, p.69-73 (Kitagawa, Y., Matuda, T. and Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999; Tomizuka, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 722-727, 2000 참조) 또는 인간 항체 라이브러리로부터 선택된 파이지 디스플레이로부터 유도된 인간 항체를 얻기 위한 방법(예를 들어, Wormstone, I. M. et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43(7), p.2301-8, 2002; Carmen, S. et al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics, 1 (2), p.189-203, 2002; Siriwardena, D. et al., Ophthalmology, 109(3), p.427-431, 2002)에 의해 얻어질 수 있다.
한 태양에서, 본 발명은 때때로 "합성 항체들"로 불리는 항체 유사체인 14-3-3 항체가 제공된다. 예를 들어, 접합된 CDRs를 가진 다른 단백질 스캐폴드 또는 인공 스캐폴드가 사용될 수 있다. 이런 스캐폴드는, 예를 들어, 생분해성 폴리머들로 이루어진 합성 스캐폴드를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, Korndorfer et al., 2003, Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, Volume 53, Issue 1:121-129. Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog. 20:639-654 참조. 또한, 펩타이드 항체 모방체들("PAMs")뿐만 아니라 스캐폴드로서 피브로넥틴 구성요소를 사용하는 항체 모방체들이 사용될 수 있다.
한 실시예에서, 본 발명은 항체 착물들을 형성하기 위해 서로 결합된 둘 이상의 항체들을 포함하는 가교 항체들을 제공한다. 가교 항체들은 항체 멀티머, 호모컨쥬케이트 및 헤테로컨쥬케이트로 불린다.
일부 실시예들에서, 본 명세서에 제공된 항체 착물들은 안티-14-3-3 항체들의 멀티머 형태를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 항체 착물들은 모노머 면역글로불린 분자들의 항체 다이머들, 트라이머들 또는 더 높은 등급의 멀티머들의 형태를 가질 수 있다. 항체들의 가교는 당업계에 공지된 다양한 방법들을 통해 이루어질 수 있다. 예를 들어, 항체들의 가교는 항체들의 자연적 응집, 화학적 또는 재조합 연결 기술들 또는 당업계에 공지된 다른 방법들을 통해 수행될 수 있다. 예를 들어, 정제된 항체 제제들은 항체 호모다이머들을 함유하는 단백질 응집체들 또는 다른 높은 등급의 멀티머들을 동시에 형성할 수 있다.
한 실시예에서, 본 발명은 14-3-3 에타에 특이적으로 결합하는 호모다이머화된 항체들을 제공한다.
항체들은 당업계에 공지된 연결 기술들을 통해 가교되거나 다이머화될 수 있다. 부착의 비-공유 방법들이 사용될 수 있다. 구체적인 한 실시예에서, 항체들의 가교는 제 2 가교제 항체의 사용을 통해 이루어질 수 있다. 가교제 항체는 관심 항체와 비교해서 다른 동물로부터 유도될 수 있다. 예를 들어, 염소 안티-생쥐 항체(Fab 특이적)는 생쥐 단클론 항체에 첨가되어 헤테로다이머를 형성할 수 있다. 이 2가 가교제 항체는 호모다이머를 형성하는 2개의 관심 항체들의 Fab 또는 Fc 영역을 인식한다.
본 발명의 한 실시예에서, 14-3-3 항원과 특이적으로 결합하는 항체는 염소 안티-생쥐 항체(GAM)를 사용하여 가교된다. 다른 실시예에서, GAM 가교제는 2개의 항체들의 Fab 또는 Fc 영역을 인식하며, 이의 각각은 14-3-3 에타와 특이적으로 결합한다.
항체들의 공유 또는 화학적 부착에 대한 방법들이 사용될 수 있다. 화학적 가교제들은 호모 또는 헤테로이중기능성일 수 있고 호모다이머를 형성하는 2개의 항체들과 공유결합적으로 결합될 것이다. 가교제들은 당업계에 주지되어 있다; 예를 들어, 호모- 또는 헤테로-이중기능성 링커들이 주지되어 있다(the 2006 Pierce Chemical Company Crosslinking Reagents Technical Handbook; Hermanson, G.T., Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, CA (1996); Aslam M. and Dent AH., Bioconjugation: protein coupling techniques for the biomedical sciences, Houndsmills, England: Macmillan Publishers (1999); Pierce: Applications Handbook & Catalog, Perbio Science, Ermbodegem, Belgium (2003-2004); Haughland, R.P., Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals Eugene, 9th Ed., Molecular Probes, OR (2003); 및 미국특허 5,747,641 참조). 당업자들은 가교를 포함하는 변형을 위한 항체의 아미노산(들)에 대한 여러 작용기들의 적응성을 알 것이다. 항체 가교를 위해 사용된 화학적 가교제들의 적절한 예들은 SMCC[succinimidyl 4-(maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate], SATA[N-succinimidyl S-acethylthio-acetate], N-하이드록시숙신이미드의 헤미-숙시네이트 에스터; 설포-N-하이드록시-숙신이미드; 하이드록시벤조트라이아졸 및 p-나이트로페놀; 다이사이클로헥실카보다이이미드(DCC), 1-(3-다이메틸아미노프로필)-3-에틸카보다이이미드(ECD) 및 1-(3-다이메틸아미노프로필)-3-에틸카보다이이미드 메티오다이드(EDCI)을 포함하나 이에 제한되지 않는다(예를 들어, 미국특허 4,526,714, 이의 명세서는 본 발명에 참조로 완전히 포함된다). 다른 연결 시약들은 구아티온, 3-(다이에톡시포스포릴옥시)-1,2,3-벤조트라이아진-4(3H)-온(DEPBT), 오늄 염-계 결합 시약들, 폴리옥시에틸렌계 헤테로이중기능성 가교 시약들, 및 다른 시약을 포함한다(Haitao, et al., Organ Lett 1:91-94 (1999); Albericio et al., J Organic Chemistry 63:9678-9683 (1998); Arpicco et al., Bioconjugate Chem. 8:327-337 (1997); Frisch et al., Bioconjugate Chem. 7:180-186 (1996); Deguchi et al., Bioconjugate Chem. 10:32-37 (1998); Beyer et al., J. Med. Chem. 41:2701-2708 (1998); Drouillat et al., J. Pharm. Sci. 87:25-30 (1998); Trimble et al., Bioconjugate Chem. 8:416-423 (1997)). 항체 호모다이머들의 형성을 위한 예시적 프로토콜들은 미국특허공보 20060062786에 제공된다. 치료 화합물들을 항체들에 접합하기 위한 기술들은 Arnon et al., "Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy," in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld et al., ed., pp243-256, Alan R. Liss, Inc.(1985); Thorpe, et al. "The Preparation and Cytotoxic Properties of Antibody Toxin Conjugates," Immuno. Rev.62:119-58(1982); and Pietersz, G.A., "The linkage of cytotoxic drugs to monoclonal antibodies for the treatment of cancer," Bioconjuages Chemistry 1(2):89-95(1990)에 기술되며, 모든 참조문헌들은 참조로 본 발명에 포함된다.
또한, 본 발명의 항체-항체 컨쥬케이트들은 헤테로이중기능성 가교 시약들, GMBS(말레이미도뷰트릴옥시 숙신이미드) 및 SPDP(N-숙신이미딜 3-(2-파이리딜다이티오)프로피오네이트)의 사용과 같은 당업계에 공지된 기술들에 의해 서로 공유결합적으로 결합될 수 있다[예를 들어, Hardy, "Purification And Coupling Of Fluorescent Proteins For Use In Flow Cytometry", Handbook Of Experimental Immunology, Volume 1, Immunochemistry, Weir et al. (eds.), pp. 31.4-31.12 4th Ed., (1986), and Ledbetter et al. U.S. Patent No. 6,010,902 참조]
또한, 항체들은 미국특허공보 20060216284, 미국특허 6,368,596에 기술된 티오에터 가교를 통해 연결될 수 있다. 당업자들이 알 수 있듯이, 항체들은 Fab 영역에서 가교될 수 있다. 일부 실시예들에서, 화학적 가교제는 항체 기능에 영향을 줄수 있듯이 항체의 항원 결합 영역과 상호작용하지 않는 것이 바람직하다.
접합된 항체들
본 발명에 개시된 안티-14-3-3 에타 항체들은 예를 들어, 다른 단백질들, 핵산들, 탄수화물들, 스테로이드들 및 지질들을 포함하나 이에 제한되지 않는 무기 또는 유기 화합물들에 접합된 항체들을 포함한다(예를 들어, Green, et al., Cancer Treatment Reviews, 26:269-286 (2000) 참조). 화합물은 생체활성일 수 있다. 생체활성은 화합물에 노출되지 않은 세포와 비교할 때 세포에 대한 생리학적 효과를 가진 화합물을 의미한다. 생리학적 효과는 DNA 복제 및 회복, 재조합, 전사, 번역, 분비, 막 전환, 세포 접착, 신호 변환, 세포 사망 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 생물학적 공정에서의 변화이다. 생체활성 화합물은 약학적 화합물들을 포함한다. 한 실시예에서, 안티-14-3-3 에타 항체는 바람직하게는 R-18, 바람직하게는 링커를 통해 14-3-3 길항제 펩타이드에 접합된다. R18에 관해서는 예를 들어, (Wang et al. 1999 - REF 35) 참조.
약학적 조성물, 투여 및 복용량
본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체들은 피험자에게 투여하는데 적절한 약학적 조성물들 속에 포함될 수 있다. 통상적으로, 약학적 조성물은 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 대로, "약학적으로 허용가능한 담체"는 임의의 및 모든 용매들, 분산제, 코팅제, 항생제 및 항균제, 등장액 및 흡수 지연제 및 생리학적으로 적합할 수 있는 것을 포함한다. 약학적으로 허용가능한 담체들의 예는 하나 이상의 물, 함염물, 인산염 버퍼 함염물, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등뿐만 아니라 이의 조합을 포함한다. 많은 경우들에서, 예를 들어, 당, 만니톨, 소르비톨과 같은 폴리알콜 또는 조성물 속의 염화나트륨의 등장제들을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 습윤제 또는 유화제, 방부제 또는 버퍼와 같은 소량의 보조 물질들과 같은 약학적으로 허용가능한 물질들은 안티-14-3-3 에타 항체의 저장기간 또는 효과를 향상시킨다.
한 바람직한 실시예에서, 안티-14-3-3 에타 항체들은 세포외에서 국소화된 14-3-3 에타 단백질을 표적으로 한다. 따라서, 이런 치료 조성물들은 전달된 안티-14-3-3 에타 항체가 세포외에서 국소화된 14-3-3 에타 단백질과 결합하는데 사용될 수 있도록 제제화되고 투여된다.
본 발명의 조성물들은 다양한 형태일 수 있다. 이들은, 액체 용액(예를 들어, 주사 및 불용해성 용액), 분산액 또는 현탁액, 정제, 알약, 분말, 리포솜 및 좌약과 같은 액체, 반고체 및 고체 제형을 포함한다. 바람직한 형태는 의도된 형태의 투여와 치료 분야에 의존한다. 전형적인 바람직한 조성물들은 다른 항체들에 의한 인간들의 패시브 면역화를 위해 사용된 것들과 유사한 조성물들과 같은 주사 또는 불용해 용액의 형태이다. 투여의 바람직한 형태는 비경구(예를 들어, 정맥, 피하, 복강, 근육내, 관절내가 특히 바람직하다)이다. 한 실시예에서, 안티-14-3-3 에타 항체는 정맥 주입 또는 주사에 의해 투여된다. 다른 바람직한 실시예에서, 안티-14-3-3 에타 항체는 근육내 또는 피하 주사에 의해 투여된다. 한 바람직한 실시예에서, 활막 속으로의 직접 주사가 이루어진다.
치료 조성물들은 통상적으로 살균되어야 하고 제조 및 저장의 상태하에서 안정해야 한다. 조성물은 용액, 미세에멀젼, 분산액, 리포좀 또는 고 약물 농도에 적합한 다른 정연한 구조로 제제화될 수 있다. 살균 주사 용액들은 상기한 성분들의 하나 또는 조합을 가진 적절한 용매에 필요한 양으로 활성 화합물을 포함시킴으로써 제조될 수 있고, 필요한 경우 여과 살균이 이어진다. 일반적으로, 분산액들은 기본 분산액 매질과 상기한 것들로부터의 필요한 다른 성분들을 포함하는 살균 부형제 속에 활성 화합물을 포함시킴으로써 제조된다. 살균 주사 용액들의 제조를 위한 살균 분말들의 경우에, 바람직한 제조 방법들은 이전의 살균-여과 용액으로부터의 활성 성분과 임의의 추가의 바람직한 성분의 분말을 생산하는 진공 건조와 동결 건조이다. 용액의 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅제를 사용하고, 분산액의 경우에 원하는 입자 크기를 유지하고 계면활성제를 사용함으로써 유지될 수 있다. 주사 조성물들의 연장된 흡수는 조성물에 흡수를 지연하는 물질, 예를 들어, 모노스테아레이트 염들과 젤라틴을 포함시킴으로써 일어날 수 있다.
본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체들은, 정맥 주사 또는 주입을 포함하는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 투여될 수 있다. 활막에 대한 직접 투여는 하나의 바람직한 투여 경로이다. 당업자가 알 수 있듯이, 투여의 경로 및/또는 형태는 원하는 결과들에 따라 변할 것이다. 특정 실시예들에서, 활성 화합물은 임플란트, 피하 패치들 및 미세캡슐 전달 시스템들을 포함하는 제어된 방출 제제와 같은 빠른 방출에 대해 화합물을 보호할 담체로 제조될 수 있다. 에틸렌 바이닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르쏘에스터 및 폴리락트산과 같은 생분해성, 생체 적합성 폴리머들이 사용될 수 있다. 이런 제제들의 여러 제조 방법들이 특허받았고 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978. Representative formulation technology is taught in, inter alia, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1995) and Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd Ed, Kibbe, A.H. ed., Washington DC, American Pharmaceutical Association (2000) 참조.
특정 실시예들에서, 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체는 경구로, 예를 들어, 불활성 희석제 또는 흡수할 수 있는 식용 담체와 함께 투여될 수 있다. 화합물(및 바람직한 경우, 다른 성분들)은 정제들 속에 압축되거나 피험자의 음식 속에 직접 포함된 경질 또는 연질 껍질 젤라틴 캡슐에 둘러싸일 수 있다. 경구 치료 투여의 경우, 화합물들은 부형제들과 함께 포함될 수 있고 섭취할 수 있는 정제들, 점막 정제들, 트로키, 캡슐, 엘릭서제, 현탁액, 시럽, 와퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 비경구 투여 이외에 본 발명의 화합물을 투여하기 위해서, 화합물을 불활성화를 예방하는 물질로 코팅하거나 화합물을 이 물질과 동시에 투여하는 것이 필요할 수 있다.
보조 활성 화합물들은 조성물들 속에 포함될 수 있다. 특정 실시예들에서, 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체는 하나 이상의 추가 치료제들과 동시 제제화 및/또는 동시 투여된다. 예를 들어, DMARD 또는 DMODA 또는 다른 항체. 이런 병합 치료들은 더 낮은 양의 투여된 치료제들을 유리하게 사용할 수 있어서, 다양한 단일치료들과 관련된 가능한 독성문제들 또는 합병증들을 피할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물들은 본 발명의 항체의 "치료적 유효량" 또는 "예방적 유효량"을 포함할 수 있다. "치료적 유효량"은 원하는 치료 결과를 얻기 위해 필요한 복용량과 시간 동안 효과적인 양을 의미한다. 안티-14-3-3 에타 항체의 치료적 유효량은 개인의 질병 상태, 나이, 성별 및 체중과 같은 인자들과 개인에서 원하는 반응을 일으키는 안티-14-3-3 에타 항체의 능력에 따라 변할 수 있다. 치료적 유효량은 항체의 임의의 독성 또는 유해한 효과들이 치료적으로 유익한 효과들에 의해 압도되는 양이다. "예방적 유효량"은 원하는 예방 결과를 얻기 위해 필요한 복용량과 시간 동안 효과적인 양을 의미한다. 통상적으로, 예방적 복용량은 질병의 초기 단계 또는 그 이전에 피험자들에게 사용되기 때문에, 예방적 유효량은 치료적 유효량보다 적을 것이다.
복용 요법들은 최적의 바람직한 반응(예를 들어, 치료적 또는 예방적 반응)을 제공하도록 조절될 수 있다. 예를 들어, 1회 주사량이 투여될 수 있고, 여러 번 나뉜 복용량이 시간을 두고 투여될 수 있거나 복용량은 치료 상황의 긴박함이 나타내는 대로 비율적으로 감소 또는 증가될 수 있다. 쉬운 투여와 복용량의 균일함을 위해서 단위 제형으로 비경구 조성물들을 제제화하는 것이 특히 유리하다. 단위 제형은 치료될 포유류 피험자들을 위한 하나의 복용량으로 적합한 물리적으로 구별된 단위들을 의미한다; 각각의 단위는 원하는 약학적 담체와 관련된 원하는 치료 효과를 일으키도록 계산된 활성 화합물의 소정량을 함유한다. 본 발명의 단위 제형들에 대한 상세내용은 (a) 활성 화합물의 독특한 특성들 및 얻어지는 특정한 치료 또는 예방 효과 및 (b) 개개인들의 민감성을 치료하기 위한 활성 화합물과 같은 혼합 기술의 고유한 한계들에 의해 지시되고 직접 의존한다.
본 발명의 항체의 치료적 또는 예방적 유효량에 대한 예시적이고, 비제한적인 범위는 0.1-20mg/kg, 더욱 바람직하게는 1-10mg/kg이다. 복용량 수치들은 완화될 질환의 형태와 심각성에 따라 변할 수 있다는 것을 주목해야 한다. 임의의 특정한 피험자의 경우, 특이적 복용 요법은 개인의 요구와 조성물들을 투여하거나 투여를 감독하는 사람의 전문적 판단에 따라 시간을 두고 조절되어야 하며 본 명세서에서 정한 복용량 범위는 단지 예시적이고 청구된 조성물의 범위 또는 실시를 제한하려는 것이 아니라는 것을 이해해야 한다.
본 명세서에 기술된 약학적 조성물들은 밀봉된 앰퓰 또는 바이알과 같은 1회 복용 또는 수회 복용 용기들에 존재할 수 있다. 이런 용기들은 통상적으로 사용 때까지 제제의 무균 상태와 안정성을 보존하는 방식으로 밀봉된다. 일반적으로, 제제들은 상기한 대로 유성 또는 수성 부형제들에서 현탁액, 용액 또는 에멀젼으로 저장될 수 있다. 선택적으로, 약학적 조성물은 사용 직전에 살균 액체 담체의 첨가만을 요구하는 동결 건조 상태로 저장될 수 있다.
안티-14-3-3 에타 항체들의 치료적 용도
"치료"는 치료적 또는 예방적 치료 또는 질병, 이상 또는 바람직하지 않은 질환에 대한 억제적 조치를 의미한다. 치료는 질병 심각성을 줄이고, 질병 진행을 멈추고 또는 질병을 제거하기 위해 질병 증상들의 개시 이전 및/또는 임상적 예후 또는 다른 예후 이후 적절한 형태의 안티-14-3-3 에타 항체들을 피험자에게 투여하는 것을 포함한다. 질병의 예방은, 바람직하게는 질병에 대한 민감성이 증가된 피험자에서 이상 또는 질병의 증상들의 개시를 연장 또는 지연하는 것을 포함한다.
한 태양에서, 본 발명은 14-3-3 에타를 포함하는 질병들을 치료하기 위한 방법들을 제공한다. 이 방법들은 환자에게 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시예들에서, 이 방법들은 병합 치료들을 포함한다.
한 실시예에서, 본 발명은 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 베체트병(Behcet's Disease), 특발성 골격성 과골화증(Diffuse idiopathic skeletal hyperostosis)(DISH), 엘러스-단로스 증후(Ehlers-Danlos syndrome)(EDS), 펠티증후군(Felty's syndrome), 섬유근통(fibromyalgia), 통풍(gout), 감염성 관절염(infectious arthritis), 소아 관절염(juvenile arthritis), 낭창(lupus), 혼합결합조직병(mixed connective tissue disease)(MCTD), 골관절염(osteoarthritis), 파제트병(Paget's Disease), 류마티스성 다발성근육통(polymyalgia rheumatica), 다발성근염(polymyositis) 및 피부근염(dermatomyositis), 가성통풍(pseudogout), 건선성 관절염(psoriatic arthritis), 레이노 현상(Raynaud's Phenomenon), 반응성 관절염(reactive arthritis), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 경피증(scleroderma), 쇼그렌증후군(Sjogren's syndrome), 스틸병(Still’s Disease) 및 베게너 육아종(Wegener’s granulomatosis)을 치료하는 방법들을 포함하는 관절염의 치료 방법들을 제공한다.
한 실시예에서, 이 방법은 병합 치료를 포함하며, 적어도 하나의 다른 치료제는 본 발명의 하나 이상의 안티-14-3-3 에타 항체들에 더하여 투여된다. 한 바람직한 실시예에서, 치료제는 질병-변형 항류마티스성 약물(DMARDs), 질병-변형 골관절염 약물(DMOADs; 예를 들어, Loeser, Reumatologia, 21:104-106, 2005 참조), 안티-TNFα 항체, 안티-IL-1 항체, 안티-CD4 항체, 안티-CTLA4 항체, 안티-CD20 항체, 안티-IL6 항체, 레플루노미드, 설파살라진 및 메토트렉세이트로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
진단, 예방 및 조영 방법 및 치료 관찰
한 태양에서, 본 발명은 14-3-3 에타를 포함하는 질병 및 질환을 진단하기 위한 방법들을 제공한다. 이 방법들은 14-3-3 에타 단백질의 변형, 예를 들어, 발현, 국소화, 기능 등의 변화를 탐지하기 위해 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체를 사용하는 것을 포함한다. 한 실시예에서, 탐지는 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체에 의한 면역침전을 포함한다. 한 실시예에서, 탐지는 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체를 사용하는 ELISA의 사용을 포함한다. 한 실시예에서, 탐지는 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체를 사용하는 웨스턴 브로팅을 포함한다. 한 실시예에서, 탐지는 면역조직화학에서 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체의 사용을 포함한다. 한 실시예에서, 탐지는 면역형광에서 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체의 사용을 포함한다. 한 실시예에서, 탐지는 FACS 분석에서 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체의 사용을 포함한다. 한 실시예에서, 탐지는 방사능면역분석법에서 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체의 사용을 포함한다. 한 실시예에서, 탐지는 스트립 검사에서 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체의 사용을 포함한다. 한 실시예에서, 탐지는 현장 검사(point of care test)에서 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체의 사용을 포함한다. 한 실시예에서, 14-3-3 에타의 탐지는 질환의 다른 마커(예를 들어, 관절염에 대한 MMP, 안티-CCP, 안티-RF 및/또는 CRP)의 탐지와 결합된다.
한 실시예에서, 본 발명은 염증성 질환들의 진단을 위한 방법들을 제공한다. 한 바람직한 실시예에서, 관절염을 진단하기 위한 방법들이 제공된다. 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 베체트병(Behcet's Disease), 특발성 골격성 과골화증(Diffuse idiopathic skeletal hyperostosis)(DISH), 엘러스-단로스 증후(Ehlers-Danlos syndrome)(EDS), 펠티증후군(Felty's syndrome), 섬유근통(fibromyalgia), 통풍(gout), 감염성 관절염(infectious arthritis), 소아 관절염(juvenile arthritis), 낭창(lupus), 혼합결합조직병(mixed connective tissue disease)(MCTD), 골관절염(osteoarthritis), 파제트병(Paget's Disease), 류마티스성 다발성근육통(polymyalgia rheumatica), 다발성근염(polymyositis) 및 피부근염(dermatomyositis), 가성통풍(pseudogout), 건선성 관절염(psoriatic arthritis), 레이노 현상(Raynaud's Phenomenon), 반응성 관절염(reactive arthritis), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 경피증(scleroderma), 쇼그렌증후군(Sjogren's syndrome), 스틸병(Still’s Disease) 및 베게너 육아종(Wegener’s granulomatosis)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 질병을 진단하기 위한 방법들이 포함된다.
일반적으로, 관절염은 환자의 활액, 혈장 또는 혈청에 14-3-3 에타의 존재를 기초로 환자에서 탐지될 수 있다. 다시 말하면, 세포외 14-3-3 에타 단백질은 관절염을 나타내기 위해 마커로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체 및 다른 안티-14-3-3 항체들의 사용을 통해 측정된 14-3-3 에타의 존재 또는 14-3-3 에타를 포함하는 14-3-3 단백질들의 아이소형들의 상대 수준은 관절염이 약화된 형태로 진행하기 전, 초기 단계 관절염의 예후적 징후일 수 있다. 초기 예후 또는 진단의 장점은 치료 요법의 초기 실행이다.
14-3-3 에타의 존재 또는 상대 수준은 환자 샘플에서 다른 단백질들, 예를 들어, MMP-1 또는 MMP-3와 같은 매트릭스 매탈로프로티나아제(MMPs)의 존재 또는 상대 수준과 상관이 있을 수 있다. 적어도 25개의 다른 MMPs가 동정되었다. 환자 샘플에서 적어도 하나의 MMP와 조합된 14-3-3 에타의 탐지는 관절염을 진단하는데 사용될 수 있다. 또한, 환자 샘플에서 적어도 하나의 MMP와 조합된 14-3-3 에타의 존재 또는 상대 수준은 관절염이 약화된 형태로 진행하기 전, 초기 단계 관절염의 예후적 징후로 사용될 수 있다.
한 실시예에서, 이 방법들은 환자의 활액, 혈장 또는 혈청에서 14-3-3 에타 단백질을 탐지하는 것을 포함한다. 한 실시예에서, 탐지는 본 발명의 14-3-3 에타 항체를 사용하여 활액, 혈장 또는 혈청으로부터 14-3-3 에타 단백질의 면역침전에 의해 이루어진다. 한 실시예에서, 탐지는 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체를 사용하는 ELISA의 사용을 포함한다. 한 실시예에서, 탐지는 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체를 사용하여 환자로부터의 활액, 혈장 또는 혈청을 포함하는 샘플의 웨스턴 브로팅을 포함한다. 한 실시예에서, 탐지는 방사능면역분석법의 사용을 포함한다. 한 실시예에서, 탐지는 스트립 검사의 사용을 포함한다. 한 실시예에서, 탐지는 현장 검사(point of care test)의 사용을 포함한다. 한 실시예에서, 14-3-3 에타의 탐지는 질환의 다른 마커(예를 들어, MMP, 안티-CCP, 안티-RF 및/또는 CRP)의 탐지와 결합된다.
한 실시예에서 본 발명은 신경 질병들을 진단하기 위한 방법들을 제공한다. 한 바람직한 실시예에서, 뇌수막염(bacterial meningitis) 및 크로이펠트 야콥병(Creutzfeldt Jakob disease)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 질병을 치료하기 위한 방법들이 제공된다. 한 실시예에서, 뇌척수액에서 14-3-3 에타의 존재가 탐지된다.
한 태양에서, 본 발명은 염증성 질환을 위한 치료에 대한 환자의 반응력을 측정하기 위한 방법들을 제공한다. 한 바람직한 실시예에서, 염증성 질환을 위한 치료에 대한 환자의 반응력을 측정하기 위한 방법들이 제공된다. 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 베체트병(Behcet's Disease), 특발성 골격성 과골화증(Diffuse idiopathic skeletal hyperostosis)(DISH), 엘러스-단로스 증후(Ehlers-Danlos syndrome)(EDS), 펠티증후군(Felty's syndrome), 섬유근통(fibromyalgia), 통풍(gout), 감염성 관절염(infectious arthritis), 소아 관절염(juvenile arthritis), 낭창(lupus), 혼합결합조직병(mixed connective tissue disease)(MCTD), 골관절염(osteoarthritis), 파제트병(Paget's Disease), 류마티스성 다발성근육통(polymyalgia rheumatica), 다발성근염(polymyositis) 및 피부근염(dermatomyositis), 가성통풍(pseudogout), 건선성 관절염(psoriatic arthritis), 레이노 현상(Raynaud's Phenomenon), 반응성 관절염(reactive arthritis), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 경피증(scleroderma), 쇼그렌증후군(Sjogren's syndrome), 스틸병(Still’s Disease) 및 베게너 육아종(Wegener’s granulomatosis)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 질병에 대한 반응력을 측정하기 위한 방법들이 포함된다.
한 실시예에서, 이 방법들은 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체를 사용하는 환자 샘플에서 14-3-3 에타의 수준을 측정하는 단계를 포함한다. 한 바람직한 실시예에서, 환자 샘플에서 14-3-3 에타의 수준은 치료에 반응할 수 있는 능력이 공지된 피험자들의 샘플의 수준과 비교된다. 비 염증성 피험자의 샘플 및/또는 다른 염증 환자의 샘플과 비교된 제 1 환자 샘플에서 14-3-3 에타의 상대적으로 높은 수준은 제 1 환자가 안티-14-3-3 에타 항체에 의한 치료 또는 안티-TNF와 같은 다른 DMARD 치료에 대한 바람직한 후보라는 것을 나타낼 수 있다. 반대로, 비 염증성 피험자의 샘플 및/또는 다른 염증 환자의 샘플과 비교된 제 1 환자 샘플에서 14-3-3 에타의 상대적으로 낮은 수준은 제 1 환자가 안티-14-3-3 에타 항체에 의한 치료 또는 안티-TNF와 같은 다른 DMARD 치료에 대한 바람직하지 않은 후보라는 것을 나타낼 수 있으며, 특히 수준이 비 염증성 피험자의 샘플의 수준과 유사한 경우 그렇다.
한 태양에서, 본 발명은 14-3-3 에타를 포함하는 염증성 질환들의 아형들을 구별하기 위한 방법들을 제공한다. 한 바람직한 실시예에서, 관절염의 아형들을 구별하기 위한 방법들이 제공된다. 한 실시예에서, 이 방법들은 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체를 사용하는 환자의 샘플에서 14-3-3 에타의 수준을 측정하는 단계를 포함한다. 한 바람직한 실시예에서, 환자에서 14-3-3 에타의 수준은 염증성 질환 또는 예후의 아형이 공지된 피험자들의 샘플들의 수준과 비교된다.
한 태양에서, 본 발명은 14-3-3 에타를 포함하는 질환들의 발생을 예방하기 위한 예방법들을 제공한다.
한 태양에서, 본 발명은 염증 질환이 발생할 위험이 있는 피험자에서 염증 질환의 발생을 예방하기 위한 예방법들을 제공한다. 한 바람직한 실시예에서, 관절염이 발생할 위험이 있는 피험자에서 관절염을 예방하기 위한 예방법들이 제공된다. 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 베체트병(Behcet's Disease), 특발성 골격성 과골화증(Diffuse idiopathic skeletal hyperostosis)(DISH), 엘러스-단로스 증후(Ehlers-Danlos syndrome)(EDS), 펠티증후군(Felty's syndrome), 섬유근통(fibromyalgia), 통풍(gout), 감염성 관절염(infectious arthritis), 소아 관절염(juvenile arthritis), 낭창(lupus), 혼합결합조직병(mixed connective tissue disease)(MCTD), 골관절염(osteoarthritis), 파제트병(Paget's Disease), 류마티스성 다발성근육통(polymyalgia rheumatica), 다발성근염(polymyositis) 및 피부근염(dermatomyositis), 가성통풍(pseudogout), 건선성 관절염(psoriatic arthritis), 레이노 현상(Raynaud's Phenomenon), 반응성 관절염(reactive arthritis), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 경피증(scleroderma), 쇼그렌증후군(Sjogren's syndrome), 스틸병(Still’s Disease) 및 베게너 육아종(Wegener’s granulomatosis)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 질병을 예방하기 위한 예방법들이 포함된다. 이 방법은 피험자에게 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체를 투여하는 단계를 포함한다. 한 실시예에서, 안티-14-3-3 에타 항체는 본 발명에 기술된 병합 치료의 구성요소로 투여된다
한 태양에서, 본 발명은 염증성 질환의 치료를 관찰하기 위한 방법들을 제공한다. 한 바람직한 실시예에서, 관절염의 치료를 관찰하기 위한 방법들이 제공된다. 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 베체트병(Behcet's Disease), 특발성 골격성 과골화증(Diffuse idiopathic skeletal hyperostosis)(DISH), 엘러스-단로스 증후(Ehlers-Danlos syndrome)(EDS), 펠티증후군(Felty's syndrome), 섬유근통(fibromyalgia), 통풍(gout), 감염성 관절염(infectious arthritis), 소아 관절염(juvenile arthritis), 낭창(lupus), 혼합결합조직병(mixed connective tissue disease)(MCTD), 골관절염(osteoarthritis), 파제트병(Paget's Disease), 류마티스성 다발성근육통(polymyalgia rheumatica), 다발성근염(polymyositis) 및 피부근염(dermatomyositis), 가성통풍(pseudogout), 건선성 관절염(psoriatic arthritis), 레이노 현상(Raynaud's Phenomenon), 반응성 관절염(reactive arthritis), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 경피증(scleroderma), 쇼그렌증후군(Sjogren's syndrome), 스틸병(Still’s Disease) 및 베게너 육아종(Wegener’s granulomatosis)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 질병의 치료를 관찰하기 위한 방법들이 포함된다.
한 실시예에서, 이 방법들은 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체를 사용하여 환자 샘플들에서 14-3-3 에타의 수준을 측정하고 치료가 진행중인 환자에서 14-3-3 에타의 수준을 관찰하는 단계를 포함한다.
한 태양에서 본 발명은 환자 샘플에서 14-3-3 에타 및 선택적으로 다른 마커, 예를 들어, MMPs를 탐지하기 위한 키트들 제공하며, 키트는 14-3-3 에타를 포함하는 다양한 형태의 질환들을 진단하거나 분화하는데 적절한 진단 또는 예후 결과를 제공하는데 유용하다. 키트는 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체를 포함한다. 이런 키트는 관절염의 마커들인 특정 MMPs에 특이적인 탐지 시약들을 더 포함할 수 있다. 키트는 표지화된 제 2 항체들, 색원체성 또는 형광 시약들, 중합제들과 같은 14-3-3 에타를 면역학적으로 탐지하는데 필수적인 다른 시약들 및/또는 진단 또는 예후 목적을 위한 키트를 사용하기 위한 지시들을 더 포함할 수 있다.
진단 방법들에 관해서는, 2007년 5월9일에 출원된 WO 2007/128132 참조.
샘플에서 단백질 마커들을 탐지하기 위해 항체를 사용하기 위해 당업자에게 공지된 다양한 분석 형식들이 존재한다. 예를 들어, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 참조. 일반적으로 14-3-3 에타를 포함하는 관절염 또는 다른 질환의 존재 또는 부존재 또는 환자 예후는 (a) 환자로부터 얻은 생물학적 샘플을 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체와 접촉하는 단계; (b) 샘플에서 항체에 결합하는 14-3-3 에타의 수준을 탐지하는 단계; 및 (c) 폴리펩타이드의 수준과 소정의 컷오프 값(즉, 대조군)을 비교하는 단계에 의해 측정될 수 있다.
한 바람직한 실시예에서, 분석법은 14-3-3 에타 단백질에 결합하여 샘플의 잔기로부터 14-3-3 에타 단백질을 제거하기 위해 고체 지지체 상에 고정된 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체의 사용을 포함한다. 결합된 14-3-3 에타 단백질은 리포터 그룹을 함유하고 항체/단백질 착물에 특이적으로 결합하는 탐지 시약을 사용하여 탐지될 수 있다. 이런 탐지 시약들은, 예를 들어, 14-3-3 단백질에 특이적으로 결합하는 결합제를 포함할 수 있다. 또한, 경쟁적인 분석법이 사용될 수 있으며, 여기서 14-3-3 에타 단백질은 리포터 그룹으로 표지화되고 샘플을 가진 항체들의 배양 후 고정된 항체들에 결합하게 된다. 샘플의 구성요소들이 표지화된 14-3-3 에타 단백질이 항체에 결합하는 것을 막는 정도는 샘플과 고정된 항체의 반응성을 나타낸다. 이런 분석법들에서 사용하기 위한 적절한 단백질들은 전장 14-3-3 에타 단백질 및 항체가 결합하는 이의 폴리펩타이드 부분들을 포함한다.
고체 지지체는 당업자에게 공지된 임의의 물질일 수 있다. 예를 들어, 고체 지지체는 미세적정판 또는 나이트로셀룰로오스 또는 다른 적절한 막에서의 검사 웰일 수 있다. 또한, 지지체는 비드 또는 유리와 같은 디스크, 섬유유리, 라텍스 또는 폴리스타이렌 또는 폴리바이닐클로라이드와 같은 플라스틱 물질일 수 있다. 지지체는, 예를 들어, 미국특허 5,359,681에 개시된 것들과 같은 자성 입자 또는 섬유 광센서일 수 있다. 항체는 특허와 과학 문헌에 상세히 기술된 당업자에게 공지된 다양한 기술들을 사용하여 고체 지지체 상에 고정될 수 있다. 본 발명의 내용에서, "고정화"는 흡착과 같은 비공유 및 (항체와 지지체 상의 작용기 사이의 직접 연결일 수 있거나 가교제에 의한 연결일 수 있는) 공유결합을 의미한다. 미세적정판 속의 웰 또는 막에 대한 흡착에 의한 고정화가 바람직하다. 이런 경우에, 흡착은 적절한 버퍼에서, 항체를 적절한 양의 사간 동안 고체 지지와 접촉함으로써 성취될 수 있다. 접촉 시간은 온도에 따라 변하나, 약 1 시간 내지 약 1일 사이가 통상적이다. 한 실시예에서, 스트렙타비딘과 코팅된 미세적정판은 바이오티닐화된 항체와 결합하는데 사용된다.
고체 지지체에 대한 항체의 공유결합은 일반적으로 먼저 지지체를 지지체와 항체 모두와 반응할 이중기능성 시약과 반응시킴으로써 성취될 수 있다.
특정 실시예들에서, 분석법은 2-항체 샌드위치 분석법이다. 이 분석법은 먼저 통상 미세적정판의 웰인 고체 지지체 상에 고정화된 항체와 샘플을 접촉하여 수행될 수 있고, 샘플 내의 14-3-3 에타 단백질들은 고정화된 항체에 결합하게 된다. 결합되지 않은 샘플은 고정화된 단백질-항체 착물들로부터 제거되고 리포터 그룹을 포함하는 탐지 시약(바람직하게는 폴리펩타이드 상의 다른 위치에 결합할 수 있는 제 2 항체)이 첨가된다. 고체 지지체에 결합되는 탐지 시약의 양은 특이적 리포터 그룹에 적절한 방법을 사용하여 측정된다.
고정화된 항체 및 탐지 항체들은 다른 것이 바람직하다. 한 바람직한 실시예에서, 고정화된 항체는 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체이며 탐지 항체는 본 발명의 다른 안티-14-3-3 에타 항체 또는 14-3-3 에타에 결합할 수 있는 다른 안티-14-3-3 항체이다. 한 실시예에서, 탐지 항체는 pan 14-3-3 항체이다.
다른 실시예에서, 탐지 항체는 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체이며, 고정화된 항체는 본 발명의 다른 안티-14-3-3 에타 항체 또는 14-3-3 에타에 결합할 수 있는 다른 안티-14-3-3 항체이다. 한 실시예에서, 고정화된 항체는 pan 14-3-3 항체이다.
이 방법들은 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체의 사용을 포함한다. 제 2 항체에 대한 대안으로서, 14-3-3 에타에 결합하는 다른 리간드는 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체와 결합하는데 사용될 수 있다. 이런 리간드의 한 예는 R18이다(Wang et al. 1999 - REF 35).
일단 항체가 상기한 대로 지지체 상에 고정화되면, 지지체 상의 잔존하는 단백질 결합 위치들은 통상적으로 차단된다. 당업자에게 공지된 임의의 적절한 차단제는 소 혈청 알부민 또는 탈지유 분말이다. 고정화된 항체는 샘플로 배양되고, 14-3-3 에타 단백질이 항체에 결합된다. 샘플은 배양 이전에 인산염-버퍼 함염물(PBS)과 같은 적절한 희석제로 희석될 수 있다. 일반적으로, 적절한 접촉 시간(즉, 배양 시간)은 관절염 또는 14-3-3 에타를 포함하는 다른 질환을 가진 개인들로부터 얻은 샘플 내에서 14-3-3 에타 단백질의 존재를 탐지하는데 충분한 시간이다. 바람직하게는, 접촉 시간은 결합된 및 결합되지 않은 14-3-3 에타 단백질 사이에 평형을 이룰 수 있는 적어도 약 95%인 결합의 수준을 얻는데 충분한 시간이다. 당업자는 평형을 이루는데 필수적인 시간은 시간의 기간 동안 발생하는 결합의 수준을 분석함으로써 쉽게 측정될 수 있다. 실온에서, 약 30분의 배양 시간이 일반적으로 충분하다.
결합되지 않은 샘플은 0.1% Tween 20TM를 포함하는 PBS와 같은 적절한 버퍼로 고체 지지체를 세척함으로써 제거될 수 있다. 리포터 그룹을 포함하는 제 2 항체는 고체 지지체에 첨가될 수 있다. 본 방법들에 적절한 리포터 그룹들은 당업계에 주지되어 있다.
탐지 시약은 결합된 14-3-3 에타 단백질을 탐지하는데 충분한 시간 동안 고정화된 항체-단백질 착물로 배양된다. 적절한 시간은 시간의 기간 동안 발생하는 결합의 수준을 분석함으로써 일반적으로 측정될 수 있다. 결합되지 않은 탐지 시약은 제거되고 결합된 탐지 시약은 리포터 그룹을 사용하여 탐지된다. 리포터 그룹을 탐지하는데 사용된 방법은 리포터 그룹의 특성에 의존한다. 방사능활성 그룹들의 경우, 섬광 계수 또는 방사능 사진 촬영 방법들이 일반적으로 적절하다. 분광기 방법들은 염료들, 발광 그룹들 및 형광 그룹들을 탐지하는데 사용될 수 있다. 바이오틴은 다른 리포터 그룹(일반적으로 방사능활성 또는 형광 그룹 또는 효소)에 결합된 아비딘을 사용하여 탐지될 수 있다. 효소 리포터 그룹들은 일반적으로 기질을 첨가하고(일반적으로 특정 시간 동안), 반응 생성물들의 분광기 분석 또는 다른 분석에 의해 탐지될 수 있다.
관절염 또는 14-3-3 에타를 포함하는 다른 질환의 존재 또는 부존재를 측정하기 위해서, 고체 지지체에 결합된 리포터 그룹으로부터 탐지된 신호는 일반적으로 소정의 컷오프 값(대조군)에 상응하는 신호와 비교된다. 한 바람직한 실시예에서, 컷오프 값은 고정화된 항체가 관절염 또는 14-3-3 에타를 포함하는 다른 질환이 없는 환자들의 샘플들로 배양될 때 얻은 평균 신호이다. 일반적으로, 상기 소정의 컷오프 값 이상의 3개 표준 편차들이 신호를 발생시키는 신호는 관절염 또는 14-3-3 에타를 포함하는 다른 질환에 대해 양인 것으로 생각된다. 다른 바람직한 실시예에서, 컷오프 값은 리시버 오퍼레이터 커브(Receiver Operator Curve)를 사용하여 측정될 수 있고, 예를 들어, the method of Sackett et al., Clinical Epidemiology: A Basic Science for Clinical Medicine, Little Brown and Co., 1985, p. 106-7 참조. 간단하게, 이 실시예에서, 컷오프 값은 진단 검사 결과에 대한 각각의 가능한 컷오프 값에 상응하는 진양성 비율(예를 들어, 민감성) 및 위양성 비율(100%-특이성)의 쌍들의 도포로 측정될 수 있다. 상부 왼쪽 코너에 가장 근접한 도표상의 컷오프 값(즉, 최대 면적을 둘러싸는 값)은 가장 정확한 컷오프 값이고 이 방법에 의해 측정된 컷오프 값보다 높은 신호를 발생하는 샘플이 양성으로 생각될 수 있다. 또한, 컷오프 값은 위양성 비율을 최소화하기 위해, 도표를 따라 이동할 수 있거나 위음성 비율을 최소화하기 위해 오른쪽으로 이동할 수 있다. 일반적으로, 이 방법에 의해 측정된 컷오프 값보다 높은 신호를 발생하는 샘플이 관절염 또는 14-3-3 에타를 포함하는 다른 질환에 대해 양성으로 생각된다.
한 실시예에서, 분석법은 현장 분석법으로 제공된다. 예를 들어, 관련 실시예에서, 분석법은 플로우-스루 또는 스트립 검사 형식으로 수행되며, 여기서 항체는 나이트로셀룰로오스와 같은 막 상에 고정화된다. 플로우-스루 검사에서, 샘플 내에서 14-3-3 단백질들은 샘플이 막과 접촉함에 따라 고정화된 항체에 결합한다. 제 2, 표지화된 결합제는 제 2 결합제를 함유하는 용액이 막과 접촉함에 따라 결합제-폴리펩타이드 착물에 결합한다. 결합된 제 2 결합제의 탐지는 상기한 대로 수행될 수 있다. 스트립 검사 형식에서, 항체가 결합되는 막의 한 말단은 샘플을 함유하는 용액에 침지된다. 샘플은 막을 따라 제 2 14-3-3 에타 결합제를 함유하는 영역을 통과해 고정화된 항체의 지역으로 이동한다. 고정화된 항체의 면적에서 제 2 결합제의 농도는 관절염 또는 14-3-3 에타를 포함하는 다른 질환 또는 환자 예후 등의 존재를 나타낸다. 통상적으로, 그 위치에서 제 2 결합제의 농도는 쉽게 볼 수 있는 라인과 같은 패턴을 형성한다. 이런 패턴의 부존재는 음성 결과를 나타낸다. 일반적으로, 막 상에 고정화된 결합제의 양은 생물학적 샘플이 2개의 항체 샌드위치에서, 상기한 형식으로 양성 신호를 발생시키는데 충분할 수 있는 폴리펩타이드의 수준을 함유할 때 시각적으로 분간할 수 있는 패턴을 형성하도록 선택된다. 이런 분석법들에서 사용하기 위한 바람직한 결합제들은 항체들 및 이의 항원 결합 단편들이다. 이런 검사들은 통상적으로 매우 소량의 생물학적 샘플로 현장에서 수행될 수 있다.
한 바람직한 실시예에서, 고정화된 항체는 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체이다. 제 2 결합제는 14-3-3 에타 단백질과 선택적으로 결합하거나 결합하지 않을 수 있는 다른 14-3-3 에타 리간드이다.
다른 실시예에서, 제 2 결합제는 본 발명의 안티-14-3-3 에타 항체, 가장 바람직하게는 이의 항원 결합 단편이며 고정화된 항체는 14-3-3 에타 단백질과 결합할 수 있는 안티-14-3-3 항체이다. 항체는 14-3-3 에타 단백질과 선택적으로 결합하거나 결합하지 않을 수 있다.
물론, 본 발명의 안티-14-3-3 항체들로 사용하는데 적합한 여러 다른 분석 프로토콜들이 존재한다. 상기 상세한 설명은 단지 예시적이다.
민감성을 향상시키기 위해서, 여러 마커들이 소정의 샘플 내에서 분석될 수 있다. 특히, 관절염 또는 14-3-3 에타를 포함하는 다른 질환의 하나 이상의 마커들 또는 예후적 징후 등은 14-3-3 단백질과 조합해서 분석될 수 있다. 이런 다른 마커들은 단백질들 또는 핵산들일 수 있다. 한 바람직한 실시예에서, 질병은 관절염이고, 하나 이상의 다른 마커는 MMP 단백질들 또는 핵산들 또는 관절염에 대한 징후로 통상적으로 사용되는 다른 인자들, 예를 들어, 안티-CCP, 안티-RF, CRP 등이다. 기준 서열들을 기초로 한 핵산들을 분리하고 분석하는 방법들은 당업계에 주지되어 있다.
조합 분석법은 동시에 또는 연속적으로 수행될 수 있다. 마커들의 선택은 광민감성을 일으키는 조합들을 결정하기 위한 일상적인 실험들을 기초로 할 수 있다.
본 발명은 상기 진단 방법들 중 임의의 것 내에서 사용하기 위한 키트들을 더 제공한다. 이런 키트들은 통상적으로 진단 분석을 수행하기 위해 필수적인 둘 이상의 구성요소를 포함한다. 구성요소들은 화합물들, 시약들, 용기들 및/또는 장비일 수 있다. 예를 들어, 한 키트 내의 한 용기는 본 발명의 단클론 안티-14-3-3 에타 항체를 포함할 수 있다. 이런 항체들은 상기한 대로, 지지체 물질에 부착되게 제공될 수 있다. 하나 이상의 다른 용기들은 분석법에서 사용될 시약들 또는 버퍼들과 같은 원소들을 둘러쌀 수 있다. 이런 키트들은 항체 결합의 직접 또는 간접 탐지에 적합한 리포터 그룹을 포함하는 상기한 탐지 시약을 포함할 수 있다.
키트는 특정 MMPs를 암호화하는 특정 mRNAs를 포함하는, 관절염의 다른 마커들을 탐지하기 위한 시약들을 포함할 수 있다.
본 발명의 내용 중에 포함되어 있음
도 1. ELISA: AUG1-CLDK-BSA 항원(IgG만 반응)에 대한 생쥐 안티-AUG1-CLDK 면역 혈청(2차 부스트 이후)의 검사 혈액 적정('CLDK'는 SEQ ID NO: 44로 개시되어 있다).
도 2. ELISA: AUG2-KKLE-BSA 항원(IgG만 반응)에 대한 생쥐 안티-AUG2-KKLE 면역 혈청(2차 부스트 이후)의 검사 혈액 적정('KKLE'는 SEQ ID NO: 45로 개시되어 있다).
도 3. ELISA: AUG3-CKNS-BSA 항원(IgG만 반응)에 대한 생쥐 안티-AUG3-CKNS 면역 혈청(2차 부스트 이후)의 검사 혈액 적정('CKNS'는 SEQ ID NO: 46으로 개시되어 있다).
도 4. 다양한 14-3-3 단백질 아이소형들에 대한 서열 배열(나타난 순서대로 각각 SEQ ID NOS: 34-40).
도 5. 14-3-3 단백질들의 7개 아이소형들에 대한 상업적으로 구입할 수 있는 14-3-3 에타 다클론 항체의 교차 반응성을 나타내는 웨스턴 블럿.
도 6. 전장 인간 재조합 14-3-3 에타에 대해 상승된 단클론 항체에 의해 면역침전된 세포 용해물-유도 14-3-3 에타 단백질 및 인간 재조합 14-3-3 에타를 나타내는 웨스턴 블럿.
도 7. 단백질의 비-나선 영역으로부터의 인간 14-3-3 에타 펩타이드 단편에 대해 상승된 단클론 항체에 의해 면역침전된 세포 용해물-유도 14-3-3 에타 단백질 및 인간 재조합 14-3-3 에타를 나타내는 웨스턴 블럿.
도 8. ELISA: 14-3-3 에타 항원(IgG만 반응)에 대한 생쥐 안티-14-3-3 에타 면역 혈청(2차 부스트 이후)의 검사 혈액 적정.
도 2. ELISA: AUG2-KKLE-BSA 항원(IgG만 반응)에 대한 생쥐 안티-AUG2-KKLE 면역 혈청(2차 부스트 이후)의 검사 혈액 적정('KKLE'는 SEQ ID NO: 45로 개시되어 있다).
도 3. ELISA: AUG3-CKNS-BSA 항원(IgG만 반응)에 대한 생쥐 안티-AUG3-CKNS 면역 혈청(2차 부스트 이후)의 검사 혈액 적정('CKNS'는 SEQ ID NO: 46으로 개시되어 있다).
도 4. 다양한 14-3-3 단백질 아이소형들에 대한 서열 배열(나타난 순서대로 각각 SEQ ID NOS: 34-40).
도 5. 14-3-3 단백질들의 7개 아이소형들에 대한 상업적으로 구입할 수 있는 14-3-3 에타 다클론 항체의 교차 반응성을 나타내는 웨스턴 블럿.
도 6. 전장 인간 재조합 14-3-3 에타에 대해 상승된 단클론 항체에 의해 면역침전된 세포 용해물-유도 14-3-3 에타 단백질 및 인간 재조합 14-3-3 에타를 나타내는 웨스턴 블럿.
도 7. 단백질의 비-나선 영역으로부터의 인간 14-3-3 에타 펩타이드 단편에 대해 상승된 단클론 항체에 의해 면역침전된 세포 용해물-유도 14-3-3 에타 단백질 및 인간 재조합 14-3-3 에타를 나타내는 웨스턴 블럿.
도 8. ELISA: 14-3-3 에타 항원(IgG만 반응)에 대한 생쥐 안티-14-3-3 에타 면역 혈청(2차 부스트 이후)의 검사 혈액 적정.
실험
SEQ ID NO:1 | 93-107 | 나선 | LETVCNDVLSLLDKF |
SEQ ID NO:2 | 191-199 | 나선 | EQACLLAKQ |
SEQ ID NO:3 | 144-155 | 나선 | NSVVEASEAAYK |
SEQ ID NO:4 | 144-152 | 나선 | NSVVEASEA |
SEQ ID NO:5 | 147-155 | 나선 | VEASEAAYK |
SEQ ID NO:6 | 163-170 | 나선 | EQMQPTHP |
SEQ ID NO:7 | 168-177 | 나선 | THPIRLGLAL |
SEQ ID NO:8 | 82-92 | 나선 | VKAYTEKIEKE |
SEQ ID NO:9 | 68-79 | 나선 | QKTMADGNEKKL |
SEQ ID NO:10 | 138-146 | 나선 | ASGEKKNSV |
SEQ ID NO:11 | 69-77 | 루프 | KTMADGNEK |
SEQ ID NO:12 | 32-40 | 루프 | ELNEPLSNE |
SEQ ID NO:13 | 103-117 | 루프 | LLDKFLIKNCNDFQY |
SEQ ID NO:14 | 130-143 | 루프 | YYRYLAEVASGEKK |
SEQ ID NO:15 | 184-194 | 루프 | YEIQNAPEQAC |
SEQ ID NO:16 | 206-218 | 루프 | AELDTLNEDSYKD |
SEQ ID NO:17 | 44-57 | 비-나선 | LLSVAYKNVVGARR |
SEQ ID NO:18 | 15-23 | 비-나선 | EQAERYDDM |
SEQ ID NO:19 | 130-138 | 비-나선 | YYRYLAEVA |
SEQ ID NO:20 | 118-125 | 비-나선 | ESKVFYLK |
SEQ ID NO:21 | 210-218 | 비-나선 | TLNEDSYKD |
SEQ ID NO:22 | 77-84 | 비-나선 | KKLEKVKA |
SEQ ID NO:23 | 76-86 | 비-나선 | EKKLRKVKAYR |
SEQ ID NO:24 | 142-158 | 비-나선 | KKNSVVEASEAAYKEAF |
SEQ ID NO:25 | 105-120 | 비-나선 | DKFLIKNCNDFQYESK |
SEQ ID NO:26 | 237-246 | 비-나선 | QQDEEAGEGN |
SEQ ID NO:27 | 75-82 | 비-나선 | NEKKLEKVK |
SEQ ID NO:28 | 104-116 | 비-나선 | LDKFLIKNCNDFQ |
SEQ ID NO:29 | 141-146 | 비-나선 | EKKNSV |
SEQ ID NO:30 | 104-115 | 비-나선 | LDKFLIKNS*NDF |
SEQ ID NO:31 | 77-86 | 비-나선 | KKLEKVKAYR |
SEQ ID NO:32 | 143-157 | 비-나선 | KNSVVEASEAAYKEA |
SEQ ID NO:33 | 1-12 | 비-나선 | DREQLLQRARLA |
*내부 시스테인 아미노산은 이황화 결합들의 형성을 예방하기 위해 아미노산 세린에 의해 대체되었다.
SEQ ID NO:35 | MGDREQLLQR ARLAEQAERY DDMASAMKAV TELNEPLSNE 40 DRNLLSVAYK NVVGARRSSW RVISSIEQKT MADGNEKKLE 80 KVKAYREKIE KELETVCNDV LSLLDKFLIK NCNDFQYESK 120 VFYLKMKGDY YRYLAEVASG EKKNSVVEAS EAAYKEAFEI 160 SKEQMQPTHP IRLGLALNFS VFYYEIQNAP EQACLLAKQA 200 FDDAIAELDT LNEDSYKDST LIMQLLRDNL TLWTSDQQDE 240 EAGEGN |
시스테인 잔기를 포함하는 서열들에서, 한 실시예서, 시스테인 잔기는 이황화 결합들이 형성을 피하기 위해 세린 잔기로 대체된다. 시스테인은 내부 시스테인 잔기 또는 말단 시스테인 잔기일 수 있다. 펩타이드 에피토프들은 추가 모이어티에 대한 컨쥬케이션, 예를 들어, 에피토프를 포함하는 면역원을 생산하기 위한 모이어티에 대한 컨쥬케이션을 포함하는 다양한 목적들을 위해 변형될 수 있다. 알 수 있듯이, 시스테인은 담체와 컨쥬케이션을 위해 적절하게 놓일 수 있고 항체를 제조하기 위해 노출되는 것이 바람직한 면적의 노출을 위해 제공되도록 놓일 수 있다. KKLE(SEQ ID NO:45)의 경우 시스테인은 다른 쪽을 노출하기 위해 C-터미널 말단 상에 첨가될 수 있다. 사용된 담체는 매우 클 수 잇고 제 1의 몇몇 아미노산들을 가릴 수 있다.
실시예
1: 14
-3-3
에타
면역원 서열들 및
안티
-14-3-3
에타
항체들
단일특이성 안티-14-3-3 에타 항체들을 제조하기 위해서, 8 내지 15개 아미노산 길이의 다양한 펩타이드들을 우리 자신의 기준을 기초로 선택하였다. 이런 펩타이드들뿐만 아니라 전장 재조합 고유(언태크드) 14-3-3 에타를 단클론 항체들의 생산에서 면역원들로 사용될 수 있다. 14-3-3의 7개 아이소형들을 위한 단백질 서열 배열은 도 4에 도시된다.
면역원 #1: C-LDKFLIKNSNDF(SEQ ID NO: 41)(아미노산 서열 104 - 115; "AUG1-CLDK"('CLDK'는 SEQ ID NO: 44로 개시되어 있다)). 인간 14-3-3 에타 잔기들 105-115의 부분에 상응하는 펩타이드를 담체와의 컨쥬케이션을 위해 N-말단 시스테인 모이어티를 첨가하고 내부 이황화 결합들의 형성을 피하기 위해 내부 시스테인-112 모이어티를 대체함으로써 변형하였다.
면역원 #2: KKLEKVKAYR-C(SEQ ID NO: 42)(아미노산 서열 77 - 86; "AUG2-KKLE"('KKLE'는 SEQ ID NO: 45로 개시되어 있다)). 인간 14-3-3 에타 잔기들 77-86의 부분에 상응하는 펩타이드를 담체와의 컨쥬케이션을 위해 C-말단 시스테인 모이어티를 첨가하여 변형하였다.
면역원 #3: C-KNSVVEASEAAYKEA(SEQ ID NO: 43)(아미노산 서열 143 - 157; "AUG3-CKNS"('CKNS'는 SEQ ID NO: 46으로 개시되어 있다)). 인간 14-3-3 에타 잔기들 143-157의 부분에 상응하는 펩타이드를 담체와의 컨쥬케이션을 위해 N-말단 시스테인 모이어티를 첨가하여 변형하였다.
면역원 #4: 전장 인간 재조합 14-3-3 에타(SEQ ID NO:35), 단백질 접근번호 #: NP_003396.
면역화
4마리 BALB/c 생쥐의 그룹을 CFA(complete freund's adjuvant)에서 생쥐 당 50㎍의 항원(면역원 #1., #2, #3 또는 #4)을 사용하여 복강내 주사에 의해 최초로 면역화하였다. 4개의 후속 부스트들에 상기와 같이 3주 간격을 두고, CFA에서 항원을 투여하였다. 혈청 역가가 ELISA에 의해 측정된 대로, 면역전 혈청 샘플보다 10배 이상 증가한 경우, 각 그룹에서 2개의 최고 반응자들을 100㎕의 살균 PBS pH 7.4에서 10㎍의 항원을 각각 정맥으로 제공하였다. 2차 부스트 후 얻은 면역화된 생쥐의 혈청 샘플들의 적정은 도 1(면역원 #1; CLDK(SEQ ID NO: 44)), 도 2(면역원 #2; KKLE(SEQ ID NO: 45)), 도 3(면역원 #3; CKNS(SEQ ID NO: 46)), 및 도 8(면역원#4)에 도시된다.
융합 방법
최초 부스트 후 3일에, 도너 생쥐를 희생시켰고 비장 세포들을 채취하고 혼합하였다(pooled). SP2/0 BALB/c 비경구 흑색종 세포들을 가진 비장 세포들의 융합은 하이브르도마의 한 단계 선택과 클로닝을 수행하는 것을 제외하고 이미 기술한 대로 수행하였다(Kohler 이하). 클론들을 융합 후 11일에 채취하였고 1% 하이포잔틴/티미딘, 20% 태아 소 혈청, 2mM GlutaMax I, 1mM 피브루산 나트륨, 50㎍/ml 젠타마이신, 1% OPI 및 0.6ng/ml IL-6을 함유하는 200㎕의 D-MEM 매질에서 96웰 조직 배양판의 웰들에서 재현탁하였다. 4일 후, 상청액들을 1㎍/웰의 정제된 항원으로 코팅된 판들 위의 항원 활성에 대해 ELISA에 의해 스크리닝하였다.
느리게 성장하는
하이브리도마
클론들의 재생을 위한 절차
느리게 성장했거나 건강하지 않게 보인 하이브리도마 세포주들은 1% 하이포잔틴/티미딘, 20% 태아 소 혈청, 2mM GlutaMax I, 1mM 피브루산 나트륨, 50㎍/ml 젠타마이신, 1% OPI, 20% 조절된 EL-4 조직 배양 상청액 및 0.6ng/ml IL-6을 함유하는 풍부한 성장 매질을 첨가하여 주로 구할 수 있다. EL-4는 포발 12-미리스테이트 12-아세테이트(PMA, 시그마, cat# P-8139)에 의해 자극될 때 세포들이 인터루킨 2(IL-2), B 세포 분화 인자(EL-BCDF-nak) 및 2개의 B 세포 성장 인자들(BSF-p1 및 EL-BCGF-swa) 및 림프구 성장과 분화를 크게 향상시키는 다른 추가 림포카인을 분비시키는 설치류 흉선종 세포주이다. G. Kohler, and C. Milstein, Preparation of monoclonal antibodies, Nature 25 (1975) 256-259; Ma, M., S. Wu, M. Howard and A. Borkovec.1984. Enhanced production of mouse hybridomas to picomoles of antigen using EL-4 conditioned media with an in vitro immunization protocol. In Vitro 20:739 참조.
안정성 검사 30일 후, 재조합 14-3-3 에타를 인식할 수 있는 IgG를 분비한 전체 100개 생존가능한 클론들을 얻었다. 추적할 리드 클론들을 동정하기 위해서, 100개의 생존가능한 클론들은 면역블로팅(도트 블롯), 트래핑 분석법 및 커스텀 캡쳐(custom caputre)(샌드위치) ELISA를 포함하는 일련의 방법을 사용하여 스크리닝하였다. 전체 100개 클론들을 다른 6개 14-3-3 아이소형을 가진 커스텀 캡쳐(샌드위치) ELISA를 사용하여 가교 반응성에 대해 검사하였다.
실시예 2: 캡쳐 ELISA에서 미끼로 바이오티닐화된 14-3-3 아이소형을 사용하여 하이브리도마 클론들로부터 조직 배양(TC) 상청액의 가교 반응성 검사
생산한 하이브리도마 클론들의 어떤 것이 14-3-3 에타(η) 이외의 6개 아이소형 중 임의의 것과 가교 반응하거나 이를 인식하는 지를 측정하기 위해 "미끼"로서 7개 14-3-3 아이소형을 사용하는 커스텀 캡쳐 ELISA를 이용하였다. 표 4 및 5에 제공된 대표적 데이터에 의해 증명된 대로, 선택된 하이브리도마 클론들의 4개(AUG3-CKNS-2D5('CKNS'는 SEQ ID NO: 46으로 개시되어 있다), AUG3-CKNS-7F8('CKNS'는 SEQ ID NO: 46으로 개시되어 있다), AUG3-CKNS-7H8('CKNS'는 SEQ ID NO: 46으로 개시되어 있다), AUG4-ETA-8F10)는 2회 연속 희석에서 14-3-3 에타와 결합하고 이를 인식하나 검사된 더 낮은 희석에서도, 다른 14-3-3 아이소형들의 임의의 것과 결합하거나 가교 반응하지 않는다. 이런 데이터는 이런 클론들이 14-3-3 에타(η)에 매우 특이적이라는 것을 분명하게 입증한다. 반대로, 한 클론 AUG3-CKNS-4F10('CKNS'는 SEQ ID NO: 46으로 개시되어 있다)은 3개의 다른 14-3-3 아이소형, 주로 14-3-3 감마, 베타 및 제타와 결합하거나 가교 반응한다. 데이터를 합쳐보면, 이런 데이터는 캡쳐 ELISA는 14-3-3 에타(η) 아이소형에 매우 특이적인 하이브리도마 클론들을 동정하기 위한 효과적인 방법을 나타낸다.
표 4 및 5의 커스텀 캡쳐 ELISA 실험은 다음과 같이 수행하였다. ELISA 판들을 100μL/웰에 순수한 과다성장된 TC 상청액으로 코팅하였고 4℃에서 밤새 배양하였다. 바이오틴-표지화된 14-3-3(전부 7개 아이소형에 상응)을 1/500로부터 1/16000으로 적정하였고 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 그런 후에 판들을 100μL/웰에 PBS(pH.4) 속 3% 탈지유 분말로 차단하고 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 1/8000 스트렙타비딘-HRPO를 PBS-트윈에 희석하였고, 100μL/웰에 첨가하고 교반하면서 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. TMB 버퍼를 웰 당 50μL로 첨가하였고 실온에서 어둠에서 배양하였다. 반응들을 10분 후 웰 당 50μL 1M HCl로 멈추었고 OD450nm에서 읽었다.
캡쳐 ELISA에서 미끼로 바이오티닐화된 14-3-3 아이소형을 사용하여 하이브리도마 클론들의 조직 배양( TC ) 상청액들의 가교 반응성 검사(OD450 nm에서 측정) | ||||||||||||||
14-3-3 아이소형: |
감마
(γ) |
베타(β) |
시그마
(σ) |
쎄타 / 타우 (θ) | 제타(ξ) | 입실론 (ε) | 에타 (η) | |||||||
희석: | 1:1500 | 1:3000 | 1:1500 | 1:3000 | 1:1500 | 1:3000 | 1:1500 | 1:3000 | 1:1500 | 1:3000 | 1:1500 | 1:3000 | 1:1500 | 1:3000 |
TC 상청액: | ||||||||||||||
AUG3 - CKNS -2D5 | 0.076 | 0.073 | 0.085 | 0.075 | 0.084 | 0.076 | 0.101 | 0.082 | 0.097 | 0.076 | 0.074 | 0.064 | 0.351 | 0.263 |
* AUG3 - CKNS -4F10 | 0.084 | 0.076 | 0.096 | 0.085 | 0.125 | 0.102 | 0.185 | 0.153 | 0.167 | 0.122 | 0.139 | 0.101 | 0.114 | 0.09 |
AUG3 - CKNS -7F8 | 0.072 | 0.067 | 0.078 | 0.076 | 0.083 | 0.076 | 0.116 | 0.104 | 0.093 | 0.084 | 0.089 | 0.076 | 0.946 | 0.741 |
AUG3 - CKNS -7H8 | 0.07 | 0.066 | 0.072 | 0.063 | 0.087 | 0.078 | 0.098 | 0.083 | 0.089 | 0.08 | 0.074 | 0.064 | 0.774 | 0.608 |
AUG4 -ETA-8F10 | 0.072 | 0.069 | 0.073 | 0.069 | 0.092 | 0.084 | 0.109 | 0.097 | 0.099 | 0.082 | 0.099 | 0.09 | 0.169 | 0.131 |
면역전 혈청(1:250) | 0.097 | 0.074 | 0.093 | 0.081 | 0.136 | 0.113 | 0.193 | 0.158 | 0.152 | 0.119 | 0.144 | 0.115 | 0.152 | 0.11 |
* 대조군 항체
캡쳐 ELISA에서 미끼로 바이오티닐화된 14-3-3 아이소형을 사용하여 하이브리도마 클론들의 조직 배양( TC ) 상청액들의 가교 반응성 검사(OD450 nm에서 측정) | ||||||||||||||
14-3-3 아이소형: |
감마
(γ) |
베타(β) |
시그마
(σ) |
쎄타 / 타우 (θ) | 제타(ξ) |
입실론
(ε) |
에타 (η) | |||||||
희석: | 1:1500 | 1:3000 | 1:1500 | 1:3000 | 1:1500 | 1:3000 | 1:1500 | 1:3000 | 1:1500 | 1:3000 | 1:1500 | 1:3000 | 1:1500 | 1:3000 |
TC 상청액: | ||||||||||||||
AUG3 - CKNS -2D5 | -0.021 | -0.001 | -0.008 | -0.006 | -0.052 | -0.037 | -0.092 | -0.076 | -0.055 | -0.043 | -0.070 | -0.051 | 0.199 | 0.153 |
* AUG3 - CKNS -4F10 | -0.013 | 0.002 | 0.003 | 0.004 | -0.011 | -0.011 | -0.008 | -0.005 | 0.015 | 0.003 | -0.005 | -0.014 | -0.038 | -0.020 |
AUG3 - CKNS -7F8 | -0.025 | -0.007 | -0.015 | -0.005 | -0.053 | -0.037 | -0.077 | -0.054 | -0.059 | -0.035 | -0.055 | -0.039 | 0.794 | 0.631 |
AUG3 - CKNS -7H8 | -0.027 | -0.008 | -0.021 | -0.018 | -0.049 | -0.035 | -0.095 | -0.075 | -0.063 | -0.039 | -0.070 | -0.051 | 0.622 | 0.498 |
AUG4 -ETA-8F10 | -0.025 | -0.005 | -0.020 | -0.012 | -0.044 | -0.029 | -0.084 | -0.061 | -0.053 | -0.037 | -0.045 | -0.025 | 0.017 | 0.021 |
* 대조군 항체
실시예
3: 구입할 수 있는
안티
-14-3-3
에타
다클론
항체의 가교 반응성
14-3-3 에타(Biomol International LP, Cat. SA476-0100)의 N-말단으로부터의 12개 아미노산 펩타이드(Ac-DREQLLQRARLA-NH2(SEQ ID NO: 47)) 에피토프에 대해 성장시킨 구입할 수 있는 안티-14-3-3 토끼 다클론 항체를 사용하여 항체의 특이성을 평가하였다. 간단하게, 1㎍ 인간 재조합 14-3-3 에타, 감마, 시그마, 알파/베타, 입실론, 쎄타 또는 제타는 SDS-PAGE에 의해 용해되었고 안티-14-3-3 에타 항체로 조사하였다.
본 발명의 항체들로 얻은 결과들과 현저하게 반대로, 도 4의 결과들은 14-3-3 에타에 대한 이런 구입할 수 있는 항체는 주로 감마인 다른 14-3-3 아이소형과 반응하였다. 레인 1: 분자량 표준; 레인 2: 재조합 14-3-3 에타; 레인 3: 재조합 14-3-3 감마; 레인 4: 재조합 14-3-3 시그마; 레인 5: 재조합 14-3-3 알파/베타; 레인 6: 재조합 14-3-3 입실론; 레인 7: 재조합 14-3-3 쎄타; 레인 8: 재조합 14-3-3 제타.
실시예 4: HeLa 세포들로부터의 인간 재조합 14-3-3 에타 및 내인성 14-3-3 에타의 면역침전
실시예 1로부터의 단클론 안티-14-3-3 항체들은 재조합 및 내인성 세포 14-3-3 에타를 면역침전 또는 "캡쳐"하는 이들의 능력에 대해 검사하였다. 본 명세서에 기술된 치료 방법들의 경우, 자연 3-D 형태로 14-3-3 에타를 면역침전하거나 인식할 수 있는 능력을 가진 항체들을 사용하는 것이 바람직하다. 안티-14-3-3 에타 하이브리도마 클론들의 배양 상청액들은 용해된 HeLa 세포들의 100ng 인간 재조합 14-3-3 에타를 함유하는 버퍼 또는 상청액(200㎍ 단백질)을 함유하는 버퍼로 2시간 동안 4℃에 배양하였다. 면역침전물을 표준 방법을 사용하여 단백질 A/G 아가로스로 수집하였다. 면역침전물들을 SDS-PAGE와 웨스턴 블로팅으로 분석하였다. 도 6은 면역원 #4(전장 재조합 14-3-3 에타)를 사용하여 제조한 하이브리도마 클론 7B11을 사용하여 얻은 웨스턴 블롯을 도시한다. 레인 1: 단백질 A/G 아가로스 비드 단독; 레인 2: 단백질 A/G 아가로스 비드들을 세포 용해물과 혼합하였다; 레인 3: 단백질 A/G 아가로스 비드들을 재조합 인간 14-3-3 에타와 혼합하였다; 레인 4: 단백질 A/G 아가로스 비드들을 하이브리도마 상청액과 혼합하였다; 레인 5: 단백질 A/G 아가로스 비드들을 하이브리도마 상청액 및 세포 용해물과 혼합하였다; 레인 6: 단백질 A/G 아가로스 비드들을 하이브리도마 상청액 및 재조합 14-3-3 에타와 혼합하였다. 데이터는 클론 7B11은 HeLa 세포 유도 14-3-3 에타(레인 5)와 인간 재조합 14-3-3 에타(레인 6) 모두를 면역침전하였다는 것을 나타낸다.
도 7은 면역원 #3(CKNS(SEQ ID NO: 46))에 대해 제조된 하이브리도마 클론 2D5를 사용하여 얻은 웨스터 블롯을 도시한다. 레인 1: 단백질 A/G 아가로스 비드 단독; 레인 2: 단백질 A/G 아가로스 비드들을 세포 용해물과 혼합하였다; 레인 3: 단백질 A/G 아가로스 비드들을 재조합 인간 14-3-3 에타와 혼합하였다; 레인 4: 단백질 A/G 아가로스 비드들을 하이브리도마 상청액과 혼합하였다; 레인 5: 단백질 A/G 아가로스 비드들을 하이브리도마 상청액 및 세포 용해물과 혼합하였다; 레인 6: 단백질 A/G 아가로스 비드들을 하이브리도마 상청액 및 재조합 14-3-3 에타와 혼합하였다. 데이터는 클론 2D5는 HeLa 세포 용해물-유도 14-3-3 에타(레인 5)와 인간 재조합 14-3-3 에타(레인 6) 모두를 면역침전하였다는 것을 나타낸다.
유사한 분석들이 여러 다른 하이브리도마 클론들에 대해 수행하였다(데이터는 도시되지 않음). 이런 실험들은 실시예 1에서 생산된 단클론 항체들은, HeLa 세포 용해물들로부터의 단백질의 면역침전에 의해 증명된 대로, 자연 행태의 14-3-3과 결합하고 이를 면역침전하거나 "캡쳐링"할 수 있다는 것을 증명한다.
실시예
5: RA 걸린 환자들의
활액
및 혈청에서 14-3-3 발현
혼합된 환자 활액(SF) 및 혈청(PS) 샘플들에서 14-3-3 단백질들의 다른 아이소형들 -β, γ,ε,η,τ,σ 및 ξ의 수준들을 양성 대조군으로 케라티노사이트 세포 용해물(K)을 사용하여 웨스턴 분석에 의해 분석하였다. 단지 η 및 γ 아이소형이 SF 샘플들에서 탐지되었고 PS와 비교해서 더 큰 강도로 염색되었다. 활동성 활액막염을 있으나 안티-TNF 치료들을 아직 받지 못한 17명 RA 환자의 활액 샘플들은 14-3-3의 η 아이소형의 일치하는 발현을 나타내었다(데이터 도시되지 않음). 모든 환자들은 6.0보다 큰 질병 활성 점수(DAS)를 가졌다.
실시예
6: 환자
활액
혈청에서
MMP
발현
이런 변형들이 동일한 활액 샘플들에서 MMP-1 및 MMP-3의 변형들과 상관이 있는 지를 측정하기 위해서, 전체 12 RA 활액 샘플들과 이들의 일치된 혈청 샘플들을 14-3-3η 및 γ뿐만 아니라 MMP-1와 MMP-3 단백질들에 대해 동시에 평가하였다. 14-3-3η은 모든 샘플들에서 탐지되었다. MMP-1은 모든 샘플들, SF 및 PS에서 탐지된 반면, MMP-3는 탐지된 수준들에서 더욱 변하였다. 14-3-3γ 아이소형은 환자 활액과 혈청 샘플들에서 탐지되었다(데이터는 도시되지 않음).
MMP-1 및 MMP-3의 발현은 활액과 혈청 샘플에서 14-3-3η 및 γ 아이소형의 발현과 상당한 상관관계를 나타낸다(표 6).
14-3-3η 헐청 |
14-3-3η 활막 |
14-3-3γ 혈청 |
14-3-3γ 활막 |
|
MMP-1 | r=0.62; p=0.02 | r=0.83; p=0.03 | r=0.77; p=0.02 | r=0.65; p=0.03 |
MMP-3 | r=0.68; p=0.01 | r=0.77; p=0.003 | r=0.80; p0.03 | r=0.76; p=0.04 |
실시예 7: 환자 혈청과 활액 샘플들에서 14-3-3 단백질의 웨스턴 블롯의 민감성활액과 혈청 샘플들에서 14-3-3η의 탐지 수준을 측정하기 위해서, 12 명의 RA-걸린 환자 또는 정상 환자들의 샘플들을 혼합하였고, 혼합된 샘플들(pooled samples)을 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 14-3-3η은 0.1㎕ 유효 부피의 활액과 1.0㎕ 유효 부피의 혈청의 낮은 희석 범위에서 탐지되었다(데이터 도시되지 않음).
2㎕의 혼합된 정상 혈청(NS) 또는 환자 혈청(PS)을 0.05-2.0㎍ 범위로 재조합 14-3-3η의 공지된 농도를 따라 실시하였다. 2㎕ 부피의 NS 및 PS 샘플들은 각각 대략 1-1.5 및 15-20㎍의 14-3-3η을 갖도록 측정되었다(데이터 도시되지 않음). 이것은 정상 환자들과 비교해서 RA 걸린 환자들의 혈청에서 약 10배 초과로 일어난다는 것을 나타낸다.
더욱 상세한 내용과 결과는, Kilani et al., J. Rheumatology, 34:1650-1657, 2007 참조.
실시예
8:
안티
-14-3-3 항체는 생쥐 RA 모델에서
MMP
발현을 감소시킨다.
콜라겐-유도 관절염은 Williams et al., PNAS, 89:9784-9788, 1992에 기술된 대로 꼬리의 기부에 CFA에 유화된 100㎍의 정제된 형태 II 콜라겐의 주입에 의해 수컷 DBA 생쥐에서 유도된다. 생쥐들은 이후 매일 관찰되며 하나 이상의 팔에서 홍반 및/또는 붓기를 나타내는 생쥐를 본 명세서에서 기술된 안티-14-3-3 에타 항체에 의한 치료 요법 또는 플라시보 치료에 무작위로 지정한다. 또한, 치료 요법은 II 형 콜라겐에 의한 면역화 이전 일에 시작한다. 10마리 생쥐의 그룹을 사용하여 다음과 같이 다양한 치료 요법들이 수행된다:
(1) 실시예 1의 하이브리도마 상청액들로부터 얻고 정제된 선택된 안티-14-3-3 에타 항체들은 0.10 내지 20mg/kg의 다양한 복용량으로 (a) 복강내 또는 (b) 활막 속에 주 2회 투여된다.
(2) 플라시보 치료
관절염은 20일 치료기간 동안 관찰되며 다음 질병 지수들을 평가한다.
임상 점수. 생쥐 팔들을 붓기, 홍반, 관절 단단함 및 발 붓기에 대해 평가한다. 관절염의 임상 기준은 치료 요법이 플라시보 대조군들에 비해 효과적인 동물들에서 감소된다.
활막에서 14-3-3 에타, MMP-1 및/또는 MMP-3 발현. 활액 샘플들을 다양한 시간 점들에서 채취하고 14-3-3 에타, MMP-1 및/또는 MMP-3 수준을 측정한다. MMP-1 및 MMP-3의 수준들은 치료 요법이 플라시보 대조군들에 비해 효과적인 동물들에서 감소된다.
조직병리학적 평가. 관절염 발을 고정하고, 파라핀에 삽입하고, 절단하고 현미경 평가를 위해 헤마톡실린과 에오신으로 염색한다. 각각의 조인트에서 관절염의 심각함은 다음 기준에 따라 등급이 나뉜다: 온화 = 최소 활액막염, 연골 손실, 및 분리된 병소에 제한된 골 부식; 중간 = 활액막염과 부식 존재하나 정상 관절 구조 손상되지 않음; 심각 = 활액막염, 광범위한 부식 및 관절 구조 파괴. 조직병리학에 의해 탐지된 관절염의 심각성은 치료 요법이 플라시보 대조군들에 비해 효과적인 동물들에서 감소된다.
실시예 9: 안티 -14-3-3 항체는 IL-1을 분비하는 세포들의 이식에 의해 유도된 토끼 RA 모델에서 MMP 발현을 감소시킨다
본 발명의 14-3-3 에타 항체들은 토끼 모델에서 평가되며 여기서 관절염은 온라인 http://arthritis-research.com/content/8/1/R16에서 구입할 수 있는 Yao et al., Arthritis Research & Therapy 2006, 8:R16에 기술된 뉴질랜드 흰색 토끼의 무릎 관절 속에 5x105 IL-1 생산 세포를 이식함으로써 유도된다. 검사 및 평가는 실시예 8에서 기술된 대로 필수적으로 수행된다.
실시예
10:
안티
-14-3-3 항체는 RA 모델에서
MMP
발현을
감소시킨다
실험 관절염은 재조합 14-3-3 에타 단백질을 다리 관절의 활막 속에 주입함으로써 갈색 노르웨이 쥐들 또는 뉴질랜드 흰색 토끼들에서 유도된다. 검사와 평가는 실시예 8에서 기술된 대로 필수적으로 수행된다.
류마티스성 관절염(콜라겐-유도 관절염, "CIA")의 다른 모델들 및 본 발명의 방법들에 유용한 실험 디자인들은, 예를 들어, 다음 참조문헌들에서 발견될 수 있다: Williams, Methods Mol Med. 2004;98:207-16. Collagen-induced arthritis as a model for rheumatoid arthritis; Brand, Com. Med., 55:114-122, 2005; Vierboom et al., Drug Discovery Today, 12:327-335, 2007; Sakaguchi et al., Curr. Opin. Immunol., 17:589-594, 2005.
특정 동물 모델에서 최초 치료 요법을 개시하기 이전에, 먼저 모델을 14-3-3 에타를 가진 염증성 이상 모델로 확증하는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 14-3-3 에타 및 MMP, 바람직하게는 MMP-1 및/또는 MMP-3의 수준은 모델에서 실험 관절염의 유도 이후 증가를 나타내게 된다.
일반적인 방법들
웨스턴
블로팅
샘플들(활액 또는 혈청(각각 2㎕)), 재조합 인간 14-3-3 에타, 세포 용해물 또는 세포-용해 면역침전물)을 12-15%(wt/vol) 아크릴아미드 겔로 SDS-PAGE 분석하였고 PVDF 막들 상에 전기이동하였다. 막들 상의 비-특이적 단백질들을 PBS-0.1% Tween-20에서 5% 탈지유 분말에서 밤새 차단하였다. 실시예 3에 대한 면역블로팅은 2㎍/ml의 7개 아이소형 특이적 토끼 안티-인간 14-3-3 다클론 항체들을 사용하여 수행하였다(Martin H, Patel Y, Jones D, Howell S, Robinson K and Aitken A 1993. Antibodies against the major brain isoforms of 14-3-3 protein. An antibody specific for the N-acetylated amino-terminus of a protein. FEBS Letters. 331:296-303). 일부 실험들에서, 주로 실시예 7에서, 실시예 1의 하이브리도마 클론들의 항체들은 면역침전 또는 "캡쳐" 실험들에 사용되었다. 면역침전물들을 SDS-PAGE로 용해하고 막들을 탈지유 차단한 후 1차 14-3-3 에타(1:1000, BioMol International SE-486)로 배양한 후 적절한 2차 호오스래디쉬 퍼옥사이드 컨쥬케이트된 안티-토끼 IgG 또는 안티-생쥐 IgG 항체들(1:2500 희석)로 배양하였다. 면역반응성 단백질들은 ECL과 웨스턴 블러팅 탐지 시스템을 사용하여 가시화되었다. 케라티노사이트 세포 용해물(K), 재조합 단백질 및/또는 HeLa 세포 용해물은 양성 대조군으로 사용하였다. SF: 활액; PS: 환자 혈청.
환자 샘플들
활액은 안티-TNF 치료제의 제조 이전에 능동성 활액막염을 가진 무릎 관절들로부터 얻었다. 모든 환자들은 DAS 점수 > 6.0을 가졌다. 일치된 혈액 샘플들을 표준 정맥 천자 방법들에 의해 얻었다. 덩어리는 원심분리에 의해 제거하였다.
재조합 14-3-3
에타
케로티노사이트-유도 14-3-3 에타에 대한 cDNA는 대장균에서 복제되고 발현된 인간 케로티노사이트로부터 추출된 전체 RNA로부터 제조되었고 에 기술된 방법들에 따라 Ghahary et al 2004 J Invest Dermatol 122:1188-1197 (REF 36, 이하) 친화성 정제되었다. 14-3-3 에타 cDNA의 PCR 증폭을 위해 사용된 프라이머들은 (GCGAATTCCTGCAGCGGGCGCGGCTGGCCGA(SEQ ID NO: 48)) 및 (GCTCGAGCCTGAAGGATCTTCAGTTGCCTTC(SEQ ID NO: 49))이다.
언태그드
재조합 14-3-3 단백질들
cDNA는 대장균에서 복제되고 발현된 인간 소스로부터 유도되었고 친화성 정제되었다. 14-3-3 에타 cDNA의 PCR 증폭을 위해 사용된 프라이머들은 (agaattcagttgccttctcctgctt(SEQ ID NO: 50)) 및 (acatatgggggaccggga(SEQ ID NO: 51)); 14-3-3 감마의 경우 (agaattcttaattgttgccttcgccg(SEQ ID NO: 52)) 및 (acatatggtggaccgcgagc(SEQ ID NO: 53)); 14-3-3 베타의 경우 (acatatgacaatggataaaagtgagctg(SEQ ID NO: 54)) 및 (agaattcttagttctctccctccccagc(SEQ ID NO: 55)); 14-3-3 입실론의 경우 (acatatggatgatcgagaggatctg(SEQ ID NO: 56)) 및 (agaattctcactgattttcgtcttccac(SEQ ID NO: 57)); 14-3-3 시그마의 경우 (acatatggagagagccagtctgatcc(SEQ ID NO: 58)) 및 (agaattcagctctggggctcctg(SEQ ID NO: 59)); 14-3-3 쎄타의 경우 (acatatggagaagactgagctgatcc(SEQ ID NO: 60)) 및 (agaattcttagttttcagccccttctgc(SEQ ID NO: 61)); 14-3-3 제타의 경우 (acatatggataaaaatgagctggttc(SEQ ID NO: 62)) 및 (agaattcttaattttcccctccttctcct(SEQ ID NO: 63))이다.
ELISA 분석법 조건
스크리닝 및 검사의 경우, 스크리닝 및 검사의 경우, 1.0㎍/웰의 안티-AUG1-CLDK('CLDK'는 SEQ ID NO: 44로 개시된다), 안티-AUG2-KKLE('KKLE'는 SEQ ID NO: 45로 개시된다), 안티-AUG3-CKNS('CKNS'는 SEQ ID NO: 46으로 개시된다) 또는 안티-14-3-3 에타 항원을 50μL/웰에 dH2O에서 ELISA 판들 상에 코팅하였고 37℃에서 밤새 건조하였다. 14-3-3 ETA 항원 0.25㎍/웰에 대한 검사는 탄산염 코팅 버퍼에서 코팅하고 4℃ 밤새 배양하였다.
항체 트래핑 분석법의 경우: 1/1000 염소 안티-생쥐 IgG/IgM 트래핑 항체(Pierce cat# 31182)를 4℃에서 배양된 100μL/웰에 탄산염 코팅 버퍼(pH 9.6)에서 ELISA 판 상에 코팅하였다.
음성 대조군 항원에 대한 검사의 경우: 0.5㎍/웰 HT(인간 트랜스페린) 항원을 50μL/웰에 dH2O에서 ELISA 판들 상에 코팅하였고 37℃에서 밤새 건조하였다.
캡쳐 ELISA에 의한 검사의 경우: ELISA 판을 4℃에서 배양된 100μL/웰에 순수한 과다성장된 TC 상청액으로 코팅하였다. 바이오틴 표지화된 14-3-3 ETA(6개의 다른 14-3-3 집단 구성원들 중 하나)를 1/500부터 1/16000으로 적정하였고 실온에서 1시간 동안 배양하였다.
차단(Blocking): 판들을 100μL/웰에 PBS(pH 7,4)에서 3% 탈지유 분말로 차단하였고 실온에서 1시간 동안 배양하였다.
1°항체: 생쥐 안티-AUG1-CLDK('CLDK'는 SEQ ID NO: 44로 개시된다), 안티-AUG2-KKLE('KKLE'는 SEQ ID NO: 45로 개시된다), 안티-AUG3-CKNS('CKNS'는 SEQ ID NO: 46으로 개시된다) 또는 안티-14-3-3 에타 하이브리도마 조직 배양 상청액과 생쥐 단클론 대조군을 스크리닝과 검사를 위해 웰당 100μL 니트(neat)를 첨가하였다. 생쥐 안티-AUG1-CLDK('CLDK'는 SEQ ID NO: 44로 개시된다), 안티-AUG2-KKLE('KKLE'는 SEQ ID NO: 45로 개시된다), 안티-AUG3-CKNS('CKNS'는 SEQ ID NO: 46으로 개시된다) 또는 안티-14-3-3 에타 면역 혈청 및 생쥐 면역전 혈청을 스크리닝과 검사를 위해 100μL/웰에 첨가된 SP2/0 조직 배양 상청액에서 1/500 희석하였다. 스크리닝과 검사를 위해 흔들면서 37℃에서 1시간 배양하였다.
스크리닝과 검사를 위해 사용된 2°항체: 컨쥬케이트된 1/25000 염소 안티-생쥐 IgG Fc HRP(Jackson cat#115-035-164)를 스크리닝과 검사를 위해 사용하였다. PBS-Tween에 희석된 2차 항체를 100μL/웰에 첨가하고 흔들면서 37℃에서 1시간 배양하였다.
캡쳐 ELISA를 위해 사용된 스트렙타비딘 : 100μL/웰의 스트렙타비딘 HRPO(1:8000, CedarLane cat#CLCSA 1007)을 첨가하고 흔들면서 실온에서 1시간 동안 배양하였다.
기질: TMB 버퍼(BioFx cat# TMBW-1000-01)를 웰 당 50μL에 첨가하고 실온에서 어두운 곳에서 배양하였다. 스크리닝과 검사를 위한 반응들을 10분 후 웰 당 50μL 1M HCl로 멈추었고 0D450nm에서 읽었다.
도트 블롯 조건:
스크리닝의 경우: 밀리포어, 임모빌론 전이 막 cat#IPVH304F0을 사용하였다. 14-3-3 ETA 항원을 샘플 버퍼에서 5분 동안 끓이고 냉각시켰다. 항원을 피펫으로 6㎍ 도트의 전체량에 대해 점을 찍었다. 항원을 15분 동안 건조한 후, 블롯을 PBS-Tween pH7.4의 여러 변화량으로 세척하였다. 블롯들을 전체 스크리닝 공정 동안 개별 페트리 접시들에 보관하였다.
차단: PVDF 막을 실온에서 1시간 동안 PBS(pH 7.4)에서 5% 밀크 분말로 차단하였다. 블롯을 차단 후 PBS-Tween pH7.4의 여러 변화량으로 세척하였다. 블롯들을 1차 항체 도포 이전에 10분 동안 종이 타월 면상에 건조시켰다.
1°항체: 생쥐 안티-AUG1-CLDK('CLDK'는 SEQ ID NO: 44로 개시된다), 안티-AUG2-KKLE('KKLE'는 SEQ ID NO: 45로 개시된다), 안티-AUG3-CKNS('CKNS'는 SEQ ID NO: 46으로 개시된다) 또는 안티-14-3-3 에타 하이브리도마 조직 배양 상청액과 생쥐 단클론 대조군을 개별 패트리 접시에서 블롯들로 배양하였다. 생쥐 안티-AUG1-CLDK('CLDK'는 SEQ ID NO: 44로 개시된다), 안티-AUG2-KKLE('KKLE'는 SEQ ID NO: 45로 개시된다), 안티-AUG3-CKNS('CKNS'는 SEQ ID NO: 46으로 개시된다) 또는 안티-14-3-3 에타 면역 혈청 및 생쥐 면역전 혈청을 대조군들로 사용된 SP2/0 조직 배양 상청액에 1/500 희석하였다. 블롯들을 실온에서 1시간 동안 흔들면서 배양하였다. 블롯들을 1차 항체 배양 후 PBS-Tween pH7.4의 5개 변화량으로 세척하였다.
2°항체: PBS-Tween pH 7.4에 희석된 1/5000 염소 안티-생쥐 IgG/IgM, (H+L), 알칼리 포스파타아제 컨쥬케이트(Rockland 610-4502)를 블롯들에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 페트리 접시들에서 흔들면서 배양하였다. 블롯들을 2차 항체 배양 후 PBS-Tween pH7.4의 5개 변화량으로 세척하였다. 블롯들을 실온에서 10분 동안 트리스 O.1M pH 9 버퍼에서 평형화한 후 떨어뜨리고 기질의 첨가 이전에 건조시켰다.
기질: BCIP/NBT 현상액 1 구성요소 AP 막 기질(BioFX 제품# BCID-1000-01)을 실온에서 블롯 니트(blot neat) 상에 떨어뜨렸다. 반응을 5분 후 찬물로 멈췄고 결과들을 눈과 강한 양성 +++, 중간 양성 ++, 약한 양성 +, 약간 양성 +/-, 음성 -의 소정의 점수로 정량적으로 측정하였다.
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모든 인용문헌들은 참조로 전문이 본 명세서에 포함된다.
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<130> 80021-1052
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Asn Glu Glu Ser Tyr Lys Asp Ser Thr Leu Ile Met Gln Leu Leu Arg
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Asp Asn Leu Thr Leu Trp Thr Ser Glu Asn Gln Gly Asp Glu Gly Asp
225 230 235 240
Ala Gly Glu Gly Glu Asn
245
<210> 37
<211> 245
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 37
Met Asp Lys Asn Glu Leu Val Gln Lys Ala Lys Leu Ala Glu Gln Ala
1 5 10 15
Glu Arg Tyr Asp Asp Met Ala Ala Cys Met Lys Ser Val Thr Glu Gln
20 25 30
Gly Ala Glu Leu Ser Asn Glu Glu Arg Asn Leu Leu Ser Val Ala Tyr
35 40 45
Lys Asn Val Val Gly Ala Arg Arg Ser Ser Trp Arg Val Val Ser Ser
50 55 60
Ile Glu Gln Lys Thr Glu Gly Ala Glu Lys Lys Gln Gln Met Ala Arg
65 70 75 80
Glu Tyr Arg Glu Lys Ile Glu Thr Glu Leu Arg Asp Ile Cys Asn Asp
85 90 95
Val Leu Ser Leu Leu Glu Lys Phe Leu Ile Pro Asn Ala Ser Gln Ala
100 105 110
Glu Ser Lys Val Phe Tyr Leu Lys Met Lys Gly Asp Tyr Tyr Arg Tyr
115 120 125
Leu Ala Glu Val Ala Ala Gly Asp Asp Lys Lys Gly Ile Val Asp Gln
130 135 140
Ser Gln Gln Ala Tyr Gln Glu Ala Phe Glu Ile Ser Lys Lys Glu Met
145 150 155 160
Gln Pro Thr His Pro Ile Arg Leu Gly Leu Ala Leu Asn Phe Ser Val
165 170 175
Phe Tyr Tyr Glu Ile Leu Asn Ser Pro Glu Lys Ala Cys Ser Leu Ala
180 185 190
Lys Thr Ala Phe Asp Glu Ala Ile Ala Glu Leu Asp Thr Leu Ser Glu
195 200 205
Glu Ser Tyr Lys Asp Ser Thr Leu Ile Met Gln Leu Leu Arg Asp Asn
210 215 220
Leu Thr Leu Trp Thr Ser Asp Thr Gln Gly Asp Glu Ala Glu Ala Gly
225 230 235 240
Glu Gly Gly Glu Asn
245
<210> 38
<211> 245
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 38
Met Glu Lys Thr Glu Leu Ile Gln Lys Ala Lys Leu Ala Glu Gln Ala
1 5 10 15
Glu Arg Tyr Asp Asp Met Ala Thr Cys Met Lys Ala Val Thr Glu Gln
20 25 30
Gly Ala Glu Leu Ser Asn Glu Glu Arg Asn Leu Leu Ser Val Ala Tyr
35 40 45
Lys Asn Val Val Gly Gly Arg Arg Ser Ala Trp Arg Val Ile Ser Ser
50 55 60
Ile Glu Gln Lys Thr Asp Thr Ser Asp Lys Lys Leu Gln Leu Ile Lys
65 70 75 80
Asp Tyr Arg Glu Lys Val Glu Ser Glu Leu Arg Ser Ile Cys Thr Thr
85 90 95
Val Leu Glu Leu Leu Asp Lys Tyr Leu Ile Ala Asn Ala Thr Asn Pro
100 105 110
Glu Ser Lys Val Phe Tyr Leu Lys Met Lys Gly Asp Tyr Phe Arg Tyr
115 120 125
Leu Ala Glu Val Ala Cys Gly Asp Asp Arg Lys Gln Thr Ile Asp Asn
130 135 140
Ser Gln Gly Ala Tyr Gln Glu Ala Phe Asp Ile Ser Lys Lys Glu Met
145 150 155 160
Gln Pro Thr His Pro Ile Arg Leu Gly Leu Ala Leu Asn Phe Ser Val
165 170 175
Phe Tyr Tyr Glu Ile Leu Asn Asn Pro Glu Leu Ala Cys Thr Leu Ala
180 185 190
Lys Thr Ala Phe Asp Glu Ala Ile Ala Glu Leu Asp Thr Leu Asn Glu
195 200 205
Asp Ser Tyr Lys Asp Ser Thr Leu Ile Met Gln Leu Leu Arg Asp Asn
210 215 220
Leu Thr Leu Trp Thr Ser Asp Ser Ala Gly Glu Glu Cys Asp Ala Ala
225 230 235 240
Glu Gly Ala Glu Asn
245
<210> 39
<211> 248
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 39
Met Glu Arg Ala Ser Leu Ile Gln Lys Ala Lys Leu Ala Glu Gln Ala
1 5 10 15
Glu Arg Tyr Glu Asp Met Ala Ala Phe Met Lys Gly Ala Val Glu Lys
20 25 30
Gly Glu Glu Leu Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Leu Ser Val Ala Tyr
35 40 45
Lys Asn Val Val Gly Gly Gln Arg Ala Ala Trp Arg Val Leu Ser Ser
50 55 60
Ile Glu Gln Lys Ser Asn Glu Glu Gly Ser Glu Glu Lys Gly Pro Glu
65 70 75 80
Val Arg Glu Tyr Arg Glu Lys Val Glu Thr Glu Leu Gln Gly Val Cys
85 90 95
Asp Thr Val Leu Gly Leu Leu Asp Ser His Leu Ile Lys Glu Ala Gly
100 105 110
Asp Ala Glu Ser Arg Val Phe Tyr Leu Lys Met Lys Gly Asp Tyr Tyr
115 120 125
Arg Tyr Leu Ala Glu Val Ala Thr Gly Asp Asp Lys Lys Arg Ile Ile
130 135 140
Asp Ser Ala Arg Ser Ala Tyr Gln Glu Ala Met Asp Ile Ser Lys Lys
145 150 155 160
Glu Met Pro Pro Thr Asn Pro Ile Arg Leu Gly Leu Ala Leu Asn Phe
165 170 175
Ser Val Phe His Tyr Glu Ile Ala Asn Ser Pro Glu Glu Ala Ile Ser
180 185 190
Leu Ala Lys Thr Thr Phe Asp Glu Ala Met Ala Asp Leu His Thr Leu
195 200 205
Ser Glu Asp Ser Tyr Lys Asp Ser Thr Leu Ile Met Gln Leu Leu Arg
210 215 220
Asp Asn Leu Thr Leu Trp Thr Ala Asp Asn Ala Gly Glu Glu Gly Gly
225 230 235 240
Glu Ala Pro Gln Glu Pro Gln Ser
245
<210> 40
<211> 255
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 40
Met Asp Asp Arg Glu Asp Leu Val Tyr Gln Ala Lys Leu Ala Glu Gln
1 5 10 15
Ala Glu Arg Tyr Asp Glu Met Val Glu Ser Met Lys Lys Val Ala Gly
20 25 30
Met Asp Val Glu Leu Thr Val Glu Glu Arg Asn Leu Leu Ser Val Ala
35 40 45
Tyr Lys Asn Val Ile Gly Ala Arg Arg Ala Ser Trp Arg Ile Ile Ser
50 55 60
Ser Ile Glu Gln Lys Glu Glu Asn Lys Gly Gly Glu Asp Lys Leu Lys
65 70 75 80
Met Ile Arg Glu Tyr Arg Gln Met Val Glu Thr Glu Leu Lys Leu Ile
85 90 95
Cys Cys Asp Ile Leu Asp Val Leu Asp Lys His Leu Ile Pro Ala Ala
100 105 110
Asn Thr Gly Glu Ser Lys Val Phe Tyr Tyr Lys Met Lys Gly Asp Tyr
115 120 125
His Arg Tyr Leu Ala Glu Phe Ala Thr Gly Asn Asp Arg Lys Glu Ala
130 135 140
Ala Glu Asn Ser Leu Val Ala Tyr Lys Ala Ala Ser Asp Ile Ala Met
145 150 155 160
Thr Glu Leu Pro Pro Thr His Pro Ile Arg Leu Gly Leu Ala Leu Asn
165 170 175
Phe Ser Val Phe Tyr Tyr Glu Ile Leu Asn Ser Pro Asp Arg Ala Cys
180 185 190
Arg Leu Ala Lys Ala Ala Phe Asp Asp Ala Ile Ala Glu Leu Asp Thr
195 200 205
Leu Ser Glu Glu Ser Tyr Lys Asp Ser Thr Leu Ile Met Gln Leu Leu
210 215 220
Arg Asp Asn Leu Thr Leu Trp Thr Ser Asp Met Gln Gly Asp Gly Glu
225 230 235 240
Glu Gln Asn Lys Glu Ala Leu Gln Asp Val Glu Asp Glu Asn Gln
245 250 255
<210> 41
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> peptide derived from human 14-3-3 eta residues 104-115
<400> 41
Cys Leu Asp Lys Phe Leu Ile Lys Asn Ser Asn Asp Phe
1 5 10
<210> 42
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> peptide derived from human 14-3-3 eta residues 77-86
<400> 42
Lys Lys Leu Glu Lys Val Lys Ala Tyr Arg Cys
1 5 10
<210> 43
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> peptide derived from human 14-3-3 eta residues 143-157
<400> 43
Cys Lys Asn Ser Val Val Glu Ala Ser Glu Ala Ala Tyr Lys Glu Ala
1 5 10 15
<210> 44
<211> 4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 44
Cys Leu Asp Lys
1
<210> 45
<211> 4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 45
Lys Lys Leu Glu
1
<210> 46
<211> 4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 46
Cys Lys Asn Ser
1
<210> 47
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> peptide epitope derived from N-terminus of 14-3-3 eta
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> ACETYLATION
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> AMIDATION
<400> 47
Asp Arg Glu Gln Leu Leu Gln Arg Ala Arg Leu Ala
1 5 10
<210> 48
<211> 31
<212> DNA
<213> Homo sapien
<400> 48
gcgaattcct gcagcgggcg cggctggccg a 31
<210> 49
<211> 31
<212> DNA
<213> Homo sapien
<400> 49
gctcgagcct gaaggatctt cagttgcctt c 31
<210> 50
<211> 25
<212> DNA
<213> Homo sapien
<400> 50
agaattcagt tgccttctcc tgctt 25
<210> 51
<211> 18
<212> DNA
<213> Homo sapien
<400> 51
acatatgggg gaccggga 18
<210> 52
<211> 26
<212> DNA
<213> Homo sapien
<400> 52
agaattctta attgttgcct tcgccg 26
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapien
<400> 53
acatatggtg gaccgcgagc 20
<210> 54
<211> 28
<212> DNA
<213> Homo sapien
<400> 54
acatatgaca atggataaaa gtgagctg 28
<210> 55
<211> 28
<212> DNA
<213> Homo sapien
<400> 55
agaattctta gttctctccc tccccagc 28
<210> 56
<211> 25
<212> DNA
<213> Homo sapien
<400> 56
acatatggat gatcgagagg atctg 25
<210> 57
<211> 28
<212> DNA
<213> Homo sapien
<400> 57
agaattctca ctgattttcg tcttccac 28
<210> 58
<211> 26
<212> DNA
<213> Homo sapien
<400> 58
acatatggag agagccagtc tgatcc 26
<210> 59
<211> 23
<212> DNA
<213> Homo sapien
<400> 59
agaattcagc tctggggctc ctg 23
<210> 60
<211> 26
<212> DNA
<213> Homo sapien
<400> 60
acatatggag aagactgagc tgatcc 26
<210> 61
<211> 28
<212> DNA
<213> Homo sapien
<400> 61
agaattctta gttttcagcc ccttctgc 28
<210> 62
<211> 26
<212> DNA
<213> Homo sapien
<400> 62
acatatggat aaaaatgagc tggttc 26
<210> 63
<211> 29
<212> DNA
<213> Homo sapien
<400> 63
agaattctta attttcccct ccttctcct 29
Claims (29)
- 샘플에서 14-3-3 에타 단백질의 존재를 측정하는 방법으로, 상기 방법은 샘플을 제 1 항체와 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 제 1 항체는 고체 지지체 상에 고정화된 안티-14-3-3 에타 항체이며, 상기 항체는 자연 형태의 인간 14-3-3 에타 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고, 상기 항체는 인간 14-3-3 알파, 베타, 델타, 입실론, 감마, 시그마, 타우 및 제타 단백질들에 비해 상기 인간 14-3-3 에타 단백질에 대해 선택성을 나타내며, 상기 항체는 아미노산 서열이 SEQ ID NOs:1-32로 이루어진 그룹으로부터 선택된 에피토프에 결합할 수 있고 인간 14-3-3 에타 단백질의 N-말단에 위치한 에피토프에 결합하지 않으며, 상기 N-말단은 SEQ ID NO:33으로 나타내는 것인 샘플에서 14-3-3 에타 단백질의 존재를 측정하는 방법.
- 제 1 항에 있어서,
상기 제 1 항체는 단클론 항체인 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 제 1 항체는 아미노산 서열 KKNSVVEASEAAYKEAF (SEQ ID NO:24)에 결합할 수 있는 것인 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 제 1 항체는 아미노산 서열 KNSVVEASEAAYKEA(SEQ ID NO:32)에 결합할 수 있는 것인 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 제 1 항체는 아미노산 서열 NSVVEASEAAYK (SEQ ID NO:3)에 결합할 수 있는 것인 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 제 1 항체는 아미노산 서열 NSVVEASEA (SEQ ID NO:4)에 결합할 수 있는 것인 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 제 1 항체는 아미노산 서열 VEASEAAYK (SEQ ID NO:5)에 결합할 수 있는 것인 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 제 1 항체는 아미노산 서열 EKKNSV (SEQ ID NO: 29)에 결합할 수 있는 것인 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 샘플이 활액, 혈장, 또는 혈청의 샘플을 포함하는 것인 방법. - 제 9 항에 있어서,
샘플은 관절염을 가진 환자, 관절염이 발생할 위험이 있는 환자, 또는 14-3-3 에타를 수반하는 염증성 질환 치료가 진행중인 환자로부터 얻어지는 것인 방법. - 제 10 항에 있어서,
염증성 질환이 관절염인 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 지지체가 미세적정판, 나이트로셀룰로오스 막, 비드, 디스크, 자성 입자 및 섬유 광센서로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 방법. - 제 12 항에 있어서,
상기 비드 또는 디스크는 유리, 섬유유리, 라텍스 및 플라스틱으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 물질로 만들어지는 것인 방법. - 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
고정화된 제 1 항체에 결합된 샘플을 결합된 14-3-3 에타 단백질을 탐지할 수 있는 제 2 항체와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법. - 제 14 항에 있어서,
제 1 항체 및 제 2 항체는 다른 것인 방법. - 제 14 항에 있어서,
상기 제 2 항체는 pan 14-3-3 항체인 방법. - 제 14 항에 있어서,
제 2 항체는 제 1 항체가 14-3-3 에타 단백질에 결합하는 부분 이외의 14-3-3 에타 단백질의 부분에 결합하는 것인 방법. - 제 14 항에 있어서,
제 2 항체는 아미노산 서열 EQAERYDDM (SEQ ID NO:18)에 결합할 수 있는 것인 방법. - 제 14 항에 있어서,
제 2 항체는 아미노산 서열 DREQLLQRARLA (SEQ ID NO:33)에 결합할 수 있는 것인 방법. - 제 14 항에 있어서,
상기 제 2 항체는 표지로 표지화되는 것인 방법. - 제 20 항에 있어서,
상기 표지는 방사능활성 그룹들, 염료들, 발광 그룹들, 형광 그룹들, 바이오틴 및 효소 리포터 그룹들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 탐지 시약인 방법. - 제 20 항에 있어서,
표지의 탐지된 수준을 표준과 비교하여 상기 샘플에 존재하는 리간드의 양이 측정될 수 있는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법. - 샘플에서 14-3-3 에타 단백질의 존재를 측정하는 방법으로, 상기 방법은
(a) 샘플을 제 1 항체와 접촉시키는 단계로, 여기서 제 1 항체는 고체 지지체 상에 고정화된 안티-14-3-3 에타 항체이며, 상기 항체는 자연 형태의 인간 14-3-3 에타 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고, 상기 항체는 인간 14-3-3 알파, 베타, 델타, 입실론, 감마, 시그마, 타우 및 제타 단백질들에 비해 상기 인간 14-3-3 에타 단백질에 대해 선택성을 나타내며, 상기 항체는 아미노산 서열이 SEQ ID NOs:1-32로 이루어진 그룹으로부터 선택된 에피토프에 결합할 수 있고 인간 14-3-3 에타 단백질의 N-말단에 위치한 에피토프에 결합하지 않으며, 상기 N-말단은 SEQ ID NO:33으로 나타내는 것인 샘플을 제 1 항체와 접촉시키는 단계,
(b) 샘플 내의 14-3-3 에타 단백질이 고정화된 제 1 항체에 결합하도록 하는 조건 하에서 배양하는 단계,
(c) 세척하여 고정화된 단백질-항체 착물로부터 결합되지 않은 샘플을 제거하는 단계,
(d) 고정화된 제 1 항체에 결합된 샘플을 결합된 14-3-3 에타 단백질을 탐지할 수 있는 제 2 항체와 접촉시키는 단계,
(e) 제 2 항체가 고정화된 제 1 항체에 결합된 14-3-3 에타 단백질에 결합하도록 하는 조건 하에서 배양하는 단계로, 여기서 상기 제 2 항체는 탐지 시약으로 표지화된 것인 단계,
(f) 세척하여 결합되지 않은 제 2 항체를 제거하는 단계, 및
(g) 고체 지지체에 결합하여 남아있는 탐지 시약의 양을 측정하는 단계
를 포함하는 것인 샘플에서 14-3-3 에타 단백질의 존재를 측정하는 방법. - 제 23 항에 있어서,
정상 대조군 샘플과 비교하여 테스트 샘플에서의 14-3-3 에타 단백질의 증가된 수준의 존재는 관절염 질환 또는 질병 상태의 징후인 방법. - 제 24 항에 있어서,
상기 관절염 질환 또는 질병 상태는 류마티스성 관절염인 방법. - 고체 지지체 상에 고정화된 제 1 항체를 포함하는 키트로, 여기서 제 1 항체는 자연 형태의 인간 14-3-3 에타 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 안티-14-3-3 에타 항체이며, 상기 항체는 인간 14-3-3 알파, 베타, 델타, 입실론, 감마, 시그마, 타우 및 제타 단백질들에 비해 상기 인간 14-3-3 에타 단백질에 대해 선택성을 나타내며, 상기 항체는 아미노산 서열이 SEQ ID NOs:1-32로 이루어진 그룹으로부터 선택된 에피토프에 결합할 수 있고 인간 14-3-3 에타 단백질의 N-말단에 위치한 에피토프에 결합하지 않으며, 상기 N-말단은 SEQ ID NO:33으로 나타내는 것인 고체 지지체 상에 고정화된 제 1 항체를 포함하는 키트.
- 제 26 항에 있어서,
제 1 항체에 결합된 14-3-3 에타 단백질을 탐지할 수 있는 제 2 항체를 추가로 포함하는 것인 키트. - 제 27 항에 있어서,
관절염의 추가적인 마커들을 탐지하기 위한 시약을 추가로 포함하는 것인 키트. - 제 28 항에 있어서,
관절염의 추가적인 마커들은 특정 MMP들인 키트.
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