BRPI0819063A2 - método para tratamento de artrite, anticorpo, hibridoma, antagonista de 14-3-3, usos de um antagonista de 14-3-3, composições farmacêuticas, método para redução da expressão de mmp no sinóvio de um paciente e usos de uma composição farmacêutica - Google Patents

método para tratamento de artrite, anticorpo, hibridoma, antagonista de 14-3-3, usos de um antagonista de 14-3-3, composições farmacêuticas, método para redução da expressão de mmp no sinóvio de um paciente e usos de uma composição farmacêutica Download PDF

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Abstract

MÉTODO PARA TRATAMENTO DE ARTRITE, ANTICORPO, HIBRIDOMA, ANTAGONISTA DE 14-3-3, USOS DE UM ANTAGONISTA DE 14-3-3, COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS, MÉTODO PARA REDUÇÃO DA EXPRESSÃO DE MMP NO SINÓVIO DE UM PACIENTE E USOS DE UMA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA. A presente invenção fornece métodos para tratar artrite compreendendo antagonistas 14-3-3 que são capazes de se ligar especificamente a isoformas de proteína 14-3-3 eta e/ou 14-3-3 gama localizadas em local extracelular. Em realizações preferidas, o antagonista 14-3-3 é um peptídeo inibidor ou um anticorpo anti 14-3-3. Os antagonistas de 14-3-3 são formulados em composições farmacêuticas e utilizados em um método para redução expressão de metaloprotease (MMP) no fluido sinovial de um paciente, em que a MMP é MMP-1 ou MMP-3.

Description

.k. ú r ,¥, MÉTODO PARA TRATAMENTO DE ÃRTRITE, ANTICORPO, HIBRIDOMA, ·h ANTAGONISTA DE 14-3-3, ÍJSOS DE UM ANTAGONISTA DE 14-3-3, CQMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS, MÉTODO PARA REDUÇÃO DA EXPRESSÃO ._ DE mp NO SINÓVIO DE UM PACIENTE E USOS DE UMA COMPOSIÇÃO 5 FARMACÊUTICA O presente pedido reivindica o beneEício do E'edido Provisório Norte-Americano com número de série 60/990.520, . depositado erri 27_ de novembro " de 2007, e do Pedido Provisório Norte-Americano com número de série 61/077.123, 10 deposítado' em trinta de junho de 2008, que são expressa e integralmente incorporados ao presente coiro referência.
Campo da Inven£ão . .,- - ~~..-.m.. A presente--invenção & P' refere—se a" proteínas'..14—3-3 em "" " artríte e a cornposições e métodos de prevenção e tratamento 15 de aXtrite.
Arit,eçe,de,n.t.e.s _ d,a _ I.n,ve,nção Artrite, ou artralgia, designa, de forma geral, distúrbíos ínflamatórios das j untas do corpo e normalmente é acompanhada de dores, inchaço e rigidez. A artrite pode 20 resultar de qualquer uma dentre várias causas, que incluem infecções, traumas, distúrbios degeneratívos, distúrbios ou disfunções rnetabólicas ou outras etiologias desconhecidas- Osteoartrite (OA) é uma forma comum de artrite que pode ocorrer após um trauma de uma junta, após uma inf ecção de 25 uma junta ou simples'mente como resuítado do envelhecimento \kP . 0 A osteoartrite tamibém é conheeida como doença degenerativa das juntas . Artríte reumatóide (RA) é tipicamente considerada um distúrbio autoiInune ííiflamatório crônico que .
B +' s 8, faz com que o sistema ímunológico ataque as juntas. T'rata-- q ', se de uma condição inflamatória dolorosa e incapacitadorá que pode gerar perda siibstancial da mobilídade devido à dor e à destruição das juntas. Espondilite anqullosante (AS) é 5 uma artrite inflamatória degenerativa crônica dolorosa que afeta principal-mente a espinha e as juntas sacroílíacas, causando eventual fusão da espinha.
As juntas de articulação do corpo são denomínadas .. "" juntas sinoviais e cada junt-a sinovíal geralmente 10 compreende as extremídades opostas " de dois ossos adjacentes. As extremidades dos ossqs são encapsuladas ern tecido cartilaginoso, enquant-o toda a área da junta é - encapsu.lada-.em um,teci'do. mole,.protetor denominado síiíóvío, "'" ' que compreende a membrana sinovial. A membrana sinovial 15 produz e libera um fluido si-novial Iubrificante em cavidades no interior da junta. Em juntas normais, c) volurne de fl-uido sinoviaí é bastante pequeno. Além da sua função líibrificante, o fluido sinovíal taTdbéIn age como reservatório de solutos e algumas céluj-as sínovíais e 20 mononucleares erri repouso- O sinóvio pode ficar irritado e espesso em resposta a muitas lesões que se acredita promoverem a artrite, incluindo traurrta da junta e/ou mau funcionainento do sistema imunológico do corpo. As conseqüências dessas lesões 25 incluem a produção e Iíberação excessiva de fluido sínovial na junta, de forma a causar inchaço na área da junta e em .. volta dela. Os aum'entos de volume são tipicamente acompanhados por aumento das concentrações no fluido k &' g ,#., sinovíal de célul-as sin9víócítas s'ímílares 0 a fibroblastos t-. (células FLS), citoquinas pró-inflamatórias, taís como ., interleucina 1 (IL-I) e fator de necrose tumorosa (TNF- alfa), pepídeos e proteínas de histamina e enzimas " 5 degradantes tais como metaloproteases de matriz (MMPS). As células FLS compreendem cerca de dois terços das células sinoviais em fluido sinovial nornial, possuem sistemas secretores bem definidos .e, sob condições de trauma ou inflamação, comumente secretam grandes quantídades de MMPs io no fluído sinovíal, especificamente MMP-I, 3, 8, 9, 10, 11 e 13. Considera--se que MMP-I e MMP-3 desempenham papéis significativos na J-esão estrutural progressiva da -. .- --,-,-car'tilagem- e tecidos "ósseos . subjacentes ,que" c"omÊ)reend'em " " juntas. Fatores conheci-dos que atívam células FLS para 15 pr0duzir MMP-I e MMP-3 incluem IL-I e TNF-alfa.
Os agentes causadores de RA, SA e OA atualmente nào são bem definidos. Sào conhecidos, entretanto, os eventos
W fisiológicos associados ao progresso, da doença, a partir de períodos proíongados de inchaço e inflamações causadas pelo 20 acúmulo excessivo de fluido sinovial nas juntas, por meio de degradação e deterioração da cartilagem e dos tecidos ósseos subjacentes por meio de atívidades de enzímas degradantes e a conseqüente proliferação de células FLS no osso, que resulta em danos estruturais permanentes. Se 25 detectada de forma suficientemente precoce, os potenciais efeitos prejudiciais a Iongo prazo da doença podem ser revertidos, ou pelo menos minim.i-zados, com terapias físicas e médícas. apropriadas. Conseqüentemente, forãní realízados b -k
V a, esforços consideráveis sobre a identifícação de ', biomarcadores apropriados para a identificação precoce de artrite. Com este propósíto, Kílani et al (2007, J. Rheum.
34: 1650-1657; WO 2007/128132) relataram que dois menibros ~ 5 da família de proteínas 14-3-3, particularmente 14-3-3 eta . e 14-3-3 gama, estào presentes no fluido sinovial e no soro . de pacientes com artrite e essas isoformas estão diretament-e correj-acionadas com os niveis de. MMP-I e -3 no fluido sinov'ial e no soro.
10 Proteínas 14-3-3 são uma familia de" moléculas reguladoras intracelulares conservadas que são expressas de forma onipresente errt eucariotes. As proteín'as 14-3-3 ,r L -- po'ssuem a-capacidade,,de.,-ligar uma .série "de.. p:roteín'as de "" sinalização funcionalmente diferentes, incluindo quinases, 15 fosfatases e receptores transmembrana. De fato, mais de cem proteínas de sinalízação foram relatadas como ligantes 14- 3-3. As proteínas 14-3-3 podem ser consideradas mernbros evoluídos da superfamília de Repetição de Peptídeos Tetratrico. Elas geralmente contêm nove ou dez hélíces alfa 20 e normalinente forrtiam interações entre horrio e/ou heterodímeros ao longo das suas hélíees amínoterrninaís.
Essas proteínas contêm uma série de domínios conhecidos, incluindo regiões de interação de cátions divalerítes, fosforilação e acetílação e divisão proteolítica, entre 25 outros. Existem sete isoformas geneticamente codíficadas distintas das proteínas 14-3-3 que são conhecidamente expressas em mamíferos, em que cada isoforma compreende de 242 a 255 arninoácidos. As sete isoformas de proteínas 14-3-
bA ¢} CL 3 são denominadas 14-3-3 cxl B (alfa/beta) , 14-3-3 6/ g (delta/zeta) , 14-3-3 e (epsílon) , 14-3-3 y (gama) , 14-3-3 rj (eta) , 14-3- 3 ue (tau/teta) e 14-3-3 cj (sigma/estratifina) .
5 Resumo da Inven£ão A presente i-nvenção baseia-se, em parte, nas constatações de que (i) a proteína 14-3-3 está localizada de forma a'berrante no espaço sinovial extracelular em artrite, (ii) essa proteína 14-3-3 extracelul-ar pode 10 induzir efetores de artrite e (iií) antagonístas de 14-3-3 dirigidos a essas proteínas 14-3-3 extracelulares podem reduzir os efetores de artrite.
- Em uni aspecto,-a presente i,nvenção forn'e"ce métódos"de"" tratarnento de artrite. Em uma realização preferida, a 15 presente invençào fornece métodos de tratamento de doenças selecionadas a partir do grupo que consiste de espondilite anquilosante, Mal de Behcet, hiperostose esquelética idiopática difusa (DISH), Sindroine de Rh1ers-Dan1os (EDS), Síndrome de Felty, fibromialgia, gota, artríte infeccíosa, 20 artrite juvenil, lúpus, doença de tecido conectívQ misturado (MCTD), osteoartrite, Mal de Paget, poIimialgia reumática, polimiosite e dermatomiosíte, pseudogota, artrite psoriática, Fenômeno de Raynaud, artrite reatíva, artrite re'umatõide, escleroderma, Síndrome de Sjõgren, Mal 25 de Still e granulomatose de Wegener.
Os métodos envolvem a administração de um antago'nista de 14-3-3 a um paciente afetado, etn que o antagonista de 14-3-3 é dirigido à prQteína 14-3-3 que está localizada de
O G* :' forma extracelular. Em uma realização preferida, a proteína ·b 14-3-3 é 14-3-3 eta ou 14-3-3 gama.
Os antagonistas de 14-3-3 utilizados podem ser coniposições do estado da técnica ou composições inovadoras 5 descritas no presente. São formuladas composíções terapêutícas e a adrninistração é tal qjue o antagonísta de ' 14-3-3 fornecido desta forma é disponível para dirigír-se à proteína 14-3-3 umaextracelular. realização, Em o . antagonista de 14-3-3 é um peptídeo ou um antícorpo anti- IO 14-3-3.
Em uma realízação preferida, o antagonista de 14-3-3 utilízado é capaz de inibir a indução de MMP por uma proteína -14-'3, 3. à -qual se une.",Preferencialmente,-' cj 'MMP-é" . . a selecíonado a partir do grupo que consíste de MMP-I, 3, 8, 15 9, 10, 11 e 13, em que MMP-I e MMP-3 são especialmente preferidos.
Ein urna realízação, o método envoivé um tratamento de combinação, em que pelo menos um outro agente terapêutíco é administrado aléin de um ou mais antagonistas de 14-3-3. Em 20 uma realização preferida, o agente terapêutíco é selecionado a partír do grupo que consiste de drogaS antirréumáticas niodifícadoras de doença (DMARDs) e drogas de osteoartrite modificadoras de doenças (DMOADS; vide, por exerrtplo, Loeser, Reumatología, 21: 104-106, 2005). Em uma 25 realízação especíalmente preferida, um ou rrtais antagonistas . anti-1'i-3-3 são achninistrados em combinação corrr pelo menos um agente selecionado a partir do grupo que consíste de anticorpo antí-TNFcx, anticorpo anti-IL-l, anticorpo anti-
» .&" § a CD4, anticorpo antí-CTLA4, antícorpo anti-IL-6, anticorpo ', antí-CD20, leflunomida, sulfassalazina e metotrexato.
Em uma realização, um antagonista de 14-3-3 é administrado na forma de iun ácído nucléíco codificador que 5 é expresso para fornecer o arltagoni3ta de 14-3-3.
Em uma realização, o método envol-ve a adminístração a um paciente de uma célula que fornece um antagonísta de 14- 3-3. Em uma realização preferída, o antagonísta de 14-3-3 fornecido desta forma é um peptídeo ou um anticorpo anti- lO 14-3-3. Em uma realização preferida, a célula é um fibroblasto ou uma célula FLS.
Errt um aspecto, a presente invençào fornece métodos . - .r pr?filáticos·de-prevenção-do desenvolvimento de"artríte""em" ' um paciente com risco de desenvolver artrite. Os métodos 15 compreendeI!! a administração ao paciente de um ou maís antagonistas de 14-3-3.
Em u-n aspecto, a presente invenção fornece métodos de redução da lesão de uma junta lesionada por trauma. Os métodos compreendem a admínistração de um ou mais 20 antagonistas de 14-3-3 a um pacíente que possui uma junta lesionada por trauma. Em uma realização, um antagonista de 14-3-3 é administrado como um componente de uma terapia de combinação descrita no presente.
Em um aspecto, a p.resente invenção fornece métodos de 25 redução da expressão de MMP. Em uma realização, a expressào de MMP a ser reduzida encontra-se no sinóvio. Os métodos " " compreendem o fornecimento de um ou mais antagonistas de 14-3-3 a Lúll tecido ou compartirnento no qual estão presentes
— — : ~ ·— 8/124 B±
S a célul-as produtoras de MMP, em que as células produtoras de ", MMP reagem a proteínas 14-3-3 às quais se ligam. os antagonistas de 14-3-3. C) fornecimento pode ser direto para o tecido ou compartimento afetado ou índíreto. Em urna 5 realização preferida, as células que reagem são fibroblastos ou células FLS. e Eiíi uma realização preferida, a expressão de MMP que de-ve ser reduzida é a expressão de MMP que é associadà a artrite.
10 Em uma realização preferída, a expressão de MMP que deve ser reduzida é a de um MMP selecionado a partir do . grupo que consiste de MMP-I, 3, 8, 9, 10, 11 e 13. Em uma .. ..-..-realízação-especia-lmente preferida;"+a' expressão "de" MMp""qu"e ¥ " r ' . .
deve ser reduzida é a de MMP-I ou MMP-3.
15 Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos de inibição da indução de MMP por uma proteína 14-3-3. A ínibição pode ser parcial ou completa. Os métodos compreendem o fornecirnento de urn ou mais antagonistas de 14-3-3 a um tecído ou compartimento no qual estão presentes 20 células produtoras de MMP, em que as células produtoras de MMP reagerri a proteínas 14-3-3 às quais se Iigam especifícamente os antagonistas de 14-3—3. O fornecimento pode ser direto para o tecído ou cornpartimento afetado ou índireto. Em uma realização preferida, o um ou rnaís 25 antagonistas de 14-3-3 são acbninistrados ao sínóvio. Eiti uma realização preferida, as células que reagem são fibroblastos ou células FLS.
Em uma realização preferida, a indução de MMP que deve
¥ 9/124 4»
G ,á, ser inijbida é a de um MMP que é regulado para cima em ". artrite. Em uma realização preferída, a indução de MMP que deve ser inibida é a de urn MMP selecionado a partir do grupo que ¶ 5 consiste de.MMP-1, 3, 8, 9, 10, 11 e 13. Em uma realização .
especialmente preferída, a índução de MMP que deve ser inibida é a de MMP-I ou FMP-3.
Em um aspecto, a presente- invenção fornece métodos de redução do inchaço de juntas em pacientes. Os métodos 10 coínpreendem a administração de um ou rnais antagonístas de 14-3-3 a um paciente afetado.
Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos de ,-,,-redução da -degradação.. de' carti-lagem 'em pacient-es".-".'.OS" -· rnétodos compreendem a aclminístração de um ou mais 15 antagonistas de 14-3-3 a um paciente afetado.
Em um aspecto, a presente invenção fornece ínétodos de redução da degradação óssea em pacientes. Os métodos compreendem a administração de um ou mais antagonistas de 14-3-3 a um paciente afetado.
20 Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos de redução do acúmulo de cítoquina pró-ínflamatória em fluido sinovial. Os métodos compreendem a admínistração de um ou rnais antagonistas de 14-3-3 a um pacíente afetado.
Para mêtodos que envolvam a adminístração de um 25 antagonista de 14-3-3 a um paciente afetado, em uma realização preferida, é utíl-izado fornecímento intracapsular de antagonÍsta. Em uma outra realização, utiliza-se o fornecimento sistêmíco de antagonista. São
4m : formuladas composições terapéuticas e a administração é tal ". que c) antagonista de 14-3-3 fornecido desta forma é disponível para. dirigir-se à proteína 14-3-3 em local extracelular. q 5 Em uma realízação, o antagonista de 14-3-3 é um peptídeo ou um anticorpo. Em urrta realização preferida, o peptídeo compreende a seqüência de aminoácído denomínada "R-18". Eín uma -outra realização preferi-da, o peptídeÕ _ consiste essencíal-mente da seqüência R-18. Em uma 10 realização, o peptídeo compreende díversas "iterações da seqüêncía R-I8. E:m uma outra realízação preferída, o peptídeo liga-se a uma região de prpteina 14-3-3 que é k . . .-. -capaz-- de 'ligar-se- " a R-18. Em""" uma"""-'outra "-reãlíZ'ação' ' " preferida, o peptídeo líga-se a uma região de proteína 14- 15 3-3 que é capaz de ligar-se a um parceiro de ligação 14-3-3 intracelular, preferencíalmente Raf. Em uma realização, o peptídeo liga-se a urna proteína 14-3-3 sem romper a ligação da proteína 14-3-3 a um parceiro de Iigação 14-3-3 intracelular.
20 Em uma realização, o antagonísta de 14-3-3 é um fosfopeptídeo.
Erü uma realízação, o antagonista de 14-3-3 é um fosfopeptí'deo modo I, de acordo com o conhecido na técnica.
Em uma reaj-ização, o antagonista de 14-3-3 é uin 25 fosfopeptídeo modo TI, de acordo com o conhecido na técnicm Em uma realização, o antagonista de 14-3-3 é um - antícorpo anti-14-3-3. Em uma realização, o anticorpo antí-
bm -A' ,ài 14-3-3 é um antícerpo pan 14-3-3. Em uma outra realização, ', c) antícorpo antí-14-3-3 é capaz de díferenciar entre isoformas de 14-3-3. Ern uma realização preferída, o anticorpo anti-14-3-3 liga-se especificamente a um peptídeo · 5 selecíonado a partir do grupo que consiste de peptídeos 14- 3-3 de circuito, peptídeos 14-3-3 de hélice e peptídeos 14- 3-3 não-hélice.
Em uma realização, o anticorpo anti-14-3-3 é um " anticorpo anti-14-3-3 gama. Em uma realízação preferida, o P 10 anticorpo anti-14-3-3 gama líga-se a um peptídeo 14-3-3 que compreende um segmento da seqüência de arninoácido descrita em SEQ ID N° 64. Em uma realização preferida, o segmento possui comprimento de pelo uienos"seis,·de. maior-È)refe"rênti'a" pelo mênos sete, de preferência ainda maíor pelo menos oito 15 aminoácidos de compriinento.
Em uma realização preferida, um anticorpo anti-14-3-3 gama Iiga-se a urri peptídeo 14-3-3 que é um peptídeo de circuito 14-3-3 gama. Em uma realizaçào preferida, q peptídeo de circuito 14-3-3 gama compreende uma seqüência 20 de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID N° 44 a 49. Ern uma outra realização, o peptídeo de circuito 14-3-3 gaina consiste essencialmente de umq seqüência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID N° 44 a 49. Em uma outra realização, um 25 anticorpo anti-14-3-3 gama liga-se a uma, região de 14-3-3 gama que se sobrepõe a uma seqüência de a.minoácído correspondente a uma se@ência selecionada a partir do grupo que consíste de SEQ ID N° 44 a 49.
j>'% -"?;: Em uma outra realização preferída, um anticorpo .anti— 'y 14-3-3 gama liga-se a um peptídeo 14-3-3 què é um peptídeo ' de hélice 14-3-3 gama. Em uma realízação preferida, o peptídeo de hélice 14-3-3 gama compreende uma.seqüência de 5 aminoácido selecionada a partir do grupo que consíste de SEQ ID N° 33 a 43. Em uma outra realização, o peptídeo de hélice 14-3-3 garna consiste essencialmente de uma seqüência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID N° 33 a 43. Em uma outra realizacão, um anticorpo - 10 anti-14-3-3 gama lka-se a urna região de 14-3-3 gama que se sobrepõe a uma seqüência de aminoácido correspondente a uma seqüência selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ . ID N° 33 a 43. - P . . - Em uma outra realização preferída, um anticorpo antí- 15 14-3-3 gama J-iga-se a um peptídeo 14-3-3 que é um peptídeo 14-3-3 garrta não-hélice. Erri uma realizaçM preferida, o peptídeo 14-3-3 gama não-hélice compreende uma seqüência de aminoácido selecionada-a partír do grupo que consiste de SEQ ID N° 50 a 62. Em uma outra realização, o peptídeo não- 20 hélice 14-3-3 gama consiste essencíalmente de uma seqüêncía de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID N° 50 a 62. Em uma outra realização, um antícorpo anti-14-3-3 gama liga-se a uma região de 14-3-3 gama que se sobrepõe a uma seqüência de aminoácido correspondente a uma 25 seqüêncía selecionada a partir do grupo que consíste de SEQ ID N° 50 a 62.
Em urüa realização, o anticorpo anti-14-3-3 é um anticorpo anti-14-3-3 eta. Em uma realização preferida, o
C rR, antícorpo anti-14-3-3 eta Iiga-se a um peptídeo 14-3-3 que ?, compreende um segmento da seqüência de aminoácido descríta em SEQ ID N° 63. Em uma realização preferida, o segmento possuí comprimento de pelo menos seis, de maior preferência 5 pelo menos sete, de preferência ainda maior pelo rrtenos oito aminoácídos de cornprimento.
Ern uma realização, um anticorpo antí-14-3-3 eta de acordo com a presente invenção não se liga a um epítopo localizado no terminal N da proteína 14-3-3 eta humana.
10 Em uma realízação preferida, um anti-corpo anti-l4-3-3 eta liga-se a um peptídeo 14-3-3 que é um peptídeo de circuito 14-3-3 eta. Em uma realização preferída, o . - -- peptídêo—de·c-írcuito l4-3-3"eta compreende'-uma·seqüência de ' aminoácido selecíonada a partir do grupo que consiste de 15 SEQ ID N° 11 a 16. Em uma outra realização, o peptídeo de circuito 14-3-3 eta consiste essencialmente de uma seqüência de aminoácído selecionada a partir do grupo que , consiste de SEQ ID N° ll a 16. Em uma outra realização, um anticorpo anti-14-3-3 eta Iiga-se a uma regi-ão de 14-3-3 20 gama que se sobrepõe a uma seqüência de aminoácido correspondente a uma seqüência selecíonada a partir do grupo que consiste de SEQ ID N° 11 a 16.
Em uma outra realização preferida, um anticorpo anti- . 14-3-3 eta liga-se a um peptídeo 14-3-3 que é um peptídeo 25 de hél-ice 14-3-3 eta. Em uma realização preferida, o peptídeo de hélice 14-3-3 eta compreende uma seqüência de aminoácido selecionada a partír do grupo que consiste de SEQ ID N° 1 a 10. Em uma outra realização, o peptídeo de
N +4.
0 * hélic.e 14-3-3 eta consiste essencialmente de uma seqüência ". de aminoácido selecionada a partir do grupo que consíste de SEQ ID N° 1 a 10. Em uma outra realização, um anticorpo anti-14-3-3 eta liga-se a uma região de 14-3-3 gama que se 5 sobrepõe a uma seqü-ência de amínoácido correspondente a uma seqüência selecionada a par'tír do grupo que consíste de SEQ ID N° 1 a"1O.
.. . Em uma outra realízação preferida, um anticorpo anti- 14-3-3 eta liga-se a um peptídeo 14-3-3 que é um peptídeo 10 nào-hélice 14-3-3 eta. Ein uma realízação preferida, o peptídeo não-hélice 14-3-3 eta compreende urna seqüência de aminoácído selecionada a partir grupo que consiste do de . --..SEQ ID-N° 17 a 32.--Em·uma outra.'realização, o'peptídeo não'"".
hétice 14-3-3 eta consiste essencialmente de urna seqüência 15 de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID N° 17 a 32. Em uma outra realização, um anticorpo anti-14-3-3 eta liga-se a uma região de 14-3-3 gama que se 4 sobrepõe a uma seqüência de aininoácido correspondente a uma seqüência selecionada a partir do grupo que consíste de SEQ 20 ID N° 17 a 32.
Ein uma real-ização especialmente preferida, um anticorpo anti-14-3-3 eta de acordo com a presente invenção liga-se a uma seqüência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste de LDKFLIKNSNDF (SEQ ID N° 30), m 25 KKLEKVKAYR (SEQ ID N° 31) e KNSVVEASEAAYKEA (SEQ ID N° 32·). Exemplos de peptídeos 14-3-3 eta de cirCuítor 4é1ice e nâo-héíice são descritos na Tabela I do preSente.
Notadamente, SEQ ID n° 30 varía da seqüência 14-3-3 eta
«. Z) t ·u* correspondente pelo fato de que uma cisteína que ocorre na ', seqüência 14-3-3 eta foi substituída por serina para evitar ·0 a formação de Iigações de dissulfeto. Em uma realização, a presente invenção fornece anticorpos que também se ligam à 4 5 seqüência 14-3-3 natu-ral relativa a SEQ ID N° 30 que compreende uma cisteína. Em uma realízação, a presente invençào fornece anticorpos capazes de J-ígar-se a seqüência de peptídeos que variam.das relacionadas nas tabelas de epitopQs do presente pela substituição de serina por 10 cisteína.
Em uma realização preferida, um antícorpo antí-14-3-3 é capaz de discriminar entre isoformas de proteínas 14-3-3.
. - -.r... Em uma reali-zação.preferida, uIn.anticorpo'"anti-I4=3"3 ""' -- Ê é um anticorpo monoclonal.
1-5 Em uma realízação preferida, um anticorpo anti-14-3-3 é um anticorpo humanizado.
Eiii um aspecto, ,a presente ínvenção fornece antagonistas de 14-3-3 ínovadores. Em uma realização, a presente invenção fornece peptídeos antagonistas de 14-3-3 20 inovadores. Erri uma outra realízação, a prese-nte ínvenção fornece anticorpos anti-14-3-3 inovadores. Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos de eláboração de . antagonistas de 14-3-3. Em um aspecto, a presente invenção fornece áci.dos 25 nucléicos .que codifícam antagonistas de 14-3-3 que são peptídeos ou anticorpos. São também fornecidos vetores, que incluem vetores de expressão, que compreendem esses ácidos nucléicos. Também são fornecidas células hospedeiras que b. G i u, compreendeni esses ácídos nucléicos e células hospedeiras ', que compreendem esses vetores. São também fornecidos métodos de elaboração de um antagonista de 14-3-3, que compreendem o uso dessas células hospedeiras.
5 Ern urri aspecto, a presente invenção fornece células capazes de produzir antagÔnístas de 14-3-3.
Em uma realização, a célula é um hibridoma e o antagonisjta de 14-3-3 é um-anticorpo antí-14-3-3.
Em uma outra realização, a célula é um fibroblasto 10 geneticamente modificado ou célula FLS e o antagonista de 14-3-3 é um peptídeo ou um anticorpo anti-14-3-3.
± Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos de .sel,eção de antagonistas de' 14-3-3. Em uma' realização," os'"' " " métodos corapreendem a seleção de possíveis agentes pela 15 capacidade de inibir a ligação de uma proteína 14-3-3 eta ou proteína 14-3-3 gama a ligante 14-3-3 eta ou ligante 14- 3-3 gama, respectivamente. Em uma realização, o lígante é urn peptídeo antagonista de 14-3-3. Em uma realizaçã'o, o Iigante é um anticorpo anti-14-3-3. Em uma realização, o e " 20 ligante é um parceiro de ligação 14-3-3 intracelular. Em uma realização, os métodos compreendem a análise da capacidade do possível agente de iníbír a ind'ução de MMP por uma proteína 14-3-3. . Em uma realização, 1jiil antagonista de 14-3-3 inibe
Ç 25 gompetitivalnente a ligação de uma proteína 14-3-3 eta ou uma proteína 14-3-3 gama a um anticorpo anti-14-3-3 ou um peptídeo antagonista de 14-3-3 descríto no presente. Em uma realização, o antagonista de 14-3-3 é uma composição
% ») ? %, química de moléculas pequenas.
F ; , Em uma real-ização preferida, um antagontsta de 14-3-3 liga-se a uma região de proteína 14-3-3 que é capaz de Iígar-se a R-18. Em uma realização preferída, um 5 antagonista de 14-3-3 liga-se a uma regíão de proteína 14- 3-3 que é capaz de ligar-se a um parceíro de ligação 14-3-3 íntracelular, preferencialrnente Raf. Em uma realização, um antagonista de 14-3-3 liga-se a uma proteína 14-3-3 sem inibir a ligação de um parceiro de ligação 14-3-3 10 intracelular.
Em iiiii aspecto, a presente ínvenção fornece composições farmacêutícas para o tratamento de artrite." As composições . farmacêut.ícas compreendem um ou mai"s".,antagonistas' de .14-3-" b'
3. As cornposições farmacêutícas são formuladas para 15 fornecer o encaixe de proteína 14-3-3 extraceluj-ar pelo antagonista de 14-3-3.
Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos de preparação de medicamentos úteís para o tratamento de artrite. Esse medicarrtento compreende um ou mais 20 antagonistas de 14-3-3. O rnedicamento é formulado para fornecer o encaixe de prot-eína 14-3-3 extracelular pelo antagonista de 14-3-3.
Ekl um aspecto, a presente invenção envolve conseqüentemente o uso de um antagonista de 14-3-3, tal 25 como um antagonista de 14-3-3 que é capaz de ligar-se especificamente a uma proteína 14-3-3 em localização extracelular e inibir a ativídade da proteína 14-3-3 para o tratamento de artrite ou para formular um medícamento para
* "4 É. LW o tratamento de artrite.
F Breve Descrígão das FíAuras Figura 1. ELISA: Teste de titulação de sangramento de soro imunológico anti-AUG1-CLDK de camundongo (após 5 segunda amplifícação) sobre o antígeno AUGI-CLDK-BSA (apenas reação de IgG).
Figura 2. ELISA: Teste de titulação de sangramento de soro ímunológico antí-AUG2-KKLE de camundongo (após segunda amplíficação) sobre antigeno AUG2-KKLE-BSA (apenas 10 reação de IgG).
Figura 3. ELISA: Teste de titulação de sangramento de soro imunológico ant i -AUG3 -CKNS de camundongo (após s!2gunda- amplificação) sobre antí geno "-AUG3-CKNS-BSA (apenas "'" reação de IgG).
15 Fígura 4. Alínharnento de seqüêncía para díversas isoformas de proteinas 14-3-3.
Fígura 5. R-18 interage com proteína 14-3-3 extracelular e inibe a i-ndução da expressão de MMP-I induzida por proteína 14-3-3 extracelular.
20 Figura 6. Western Blot que exibe proteína 14-3-3 eta derivada de lisato celular e 14-3-3 eta recombinante humana ímunoprecípitada por antícorpo monoclonal Ievantado contra 14-3-3 eta recombinante humano com comprimento total.
Fígura 7. Western Blot que exibe proteína 14-3-3 eta 25 derivada de Iisato celular e 14-3-3 eta recombinante humana imunoprecipitada por anticorpo monoclonal levahtado contra um fragmento de peptídeo 14-3-3 eta humano 142-158 SRQ ID N°.24 a partir de uma região não helicoidal da proteína. 0
B
HNg 4: N9 Figura g. ELISA: Teste de titulação de sangramerito de , soro imunológico anti-14-3-3 eta de camundongo (após segunda amp1i.t"icação) sÒbre antígeno 14-3-3 et.a (apenas reação de IgG).
5 Descrígão Detaíhada da Inven£ão A presente invenção fornece métodos de tratamento de artrite, incluindo métodos de tratarnento de espondilite ,-anquilosante, Ma1· de Behcet, hiperostose esquelética ídiopática difusa (DTSH), Sindrome de Eh1ers-Dan1os (EDS), 10 Síndrome de Felty, fibromialgia, gota, artrite infecciosa, artrite juvenil, lúpus, doença de tecido conecti-vo misturado (MCTD), osteoartrite, Mal de Paget, po1imia1gia reumática, .polimiosite e dermatomiosíte,. pseudogota'," -
P artrite psoriática, Fenômeno de Raynaud, artrite reativa, 15 artrite reumatóide, escleroderma, Síndrome de sjògren, Mal de Still e granulomatose de Wegener.
Da forma uti-lizada no presente, "artríte" ou "artralgia" designa um dístúrbio inflamatório das juntas do 'corpo. Dores, inchaços, rigidez e dificuldade de movirnento 20 são freqüentemente associados a doenças da artrite. A artrite pode resultar de qualquer uma dentre várias causas, / que ineluem infecções, traumas, distúrbios degenerativos, distúrbios ou disfunções metabólicas ou outras etiologias desconhecidas".
25 - O progresso ou a severidade da artrite em pacientes pode ser medida ou quantíficada utilizando métodos conhecidos na técnica. Como. exemplo, "Avaliação da Atívidade de Doença" (DAS) pode ser utilizada para medir a
·> « C, ativídade ou o estado de artrite em um pacíente. DAS é uin . dentre diversos padrões ou avaliações utílízadas ha prática clínica. Um cálculo de DAS pode incluír os parâmetros a seguir: Número de jüntas macias ao toque (TEM), número de 5 juntas inchadas (SW), taxa de sedimentação de erítrócitos '.
, (ESR) e determínação pelo paciente da ativídade da doença (VAS). Alternativamente, DAS pode incluir a determinação de : marcadores de proteínas C-reativas (CRP) (Skogh, T. et al, 2003, An-n Rheum Dís 62: 681-682). Alternativamente, pode-se 10 utilízar biomarcadores de diagnóstico, incluíndo 14-3-3" eta e/ou gama, para medir a pre"'ença ou ausência de doença ou determinar a severidade da doença.
í --·. No prespnte " relatório' descritivo,, ."...os :"' termos "tratamento" ou "tratar" designam o tratamento profilático 15 ou preventivo, bem como tratamento curativo ou modificador da doença, irjc1uindo o tratarnento de pacientes em risco de contrair a doença ou suspeitos de havereín contraído a doença, bê]h corrto pacientes que estão doentes ou que foram diagnosticados como sofrendo de uma doença OLl condíção 20 médíca, e incluem a supressão de reincidência clíníca.
Qs métodos envolvem a adínínístraç'ão de um ou mais antagonistas de 14-3-3. Um antagonista de 14-3-3 de acor'do com a presente invenção liga-se a uma proteína 14-3-3, particularmente 14—3-3 eta ou gama, e antagoníza a sua 25 atividade. Da forma utilizada no presente, uma "ísoforma"' desígna duas ou mais proteínas funcíonalmente similares que contêm urria seqüência de aminoácido similar mas não idêntíca e são
21,/124 k P u codificadas por genes diferentes ou por díferentes transcritos de RNA, primários ou processados, do mesmo gene .
Referência a uma proteína 14-3-3 eta ou uma proteína 5 14-3-3 gaina pode incluir seus fragmentos. Em uma realízação, por exemplo, a presente invençào fornece métodos de seleção de um antagonista.de 14-3-3 que, em, uma realização preferida, cornpreendem a seleção àe possíveis ' agentes pela capacidade de inibiçào da ligação de um 10 ligante 14-3-3 a uma proteína 14-3-3. Compreender-se-á que urn fragmento apropriado de uma proteína 14-3-3 pode ser utilizado no teste.
¶ " " ' Uni'exempío".de"" üm "antdgonista de 14-3-3 é"o É)éFít"ídèo" " inibidor de Rl8 (Wang et al, 1999 - REE'. 35). O peptídeo 15 R18, também denominado no presente "RÍL8", é um peptídeo pequeno.que é capaz de bl-oquear a assocíação de proteínas 14-3-3 a Raf-l. Outros exemplos de peptídeos que se ligam a proteínas 14-3-3 são conhecidos (vide, por exemplo, Wang et al, 1999 - REF. 35, abaixo; Yaffe et al, Cell, 91: 961-971, 20 1997; Shaw et al, US 5.948.765; Petosa .et al, cjBC 273: 16305-16310, 1998; Fu et al, US 2004/0152630). Estes e outros, quando Èorniulados para encaixar proteína 14-3-3 extracelular localízada de forma aberrante, podem encontrar utili-dade na presente invenção COIllO produtos terapêutícos 25 para cj tratamento de artrite.
"Anticorpo" desígna uma composição que compreende uma proteína que se liga especificamente a um antígeno correspondente e possui uma estrutura geral comum ' de eüY « iKlunQg1obuIinas. O termo "anticorpo'" inclui especificamente . anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais, dímeros, multímeros, anticorpos, multiespecíficos (tais como anticorpos biespecíficos) e fragmentos de anticorpos, desde 5 que exibam a atividade biológíca desejada. Os anticorpos podein ser murínos, humanos, hurrianizados, quimérícos ou derivados de outras espécies. Tipicamente, um anticorpo compreenderá pelo menos duas cadeías pesadas-e duas cadeias leves interconectadas por ligações de dissulfeto que, 10 quando combinadas, formam um domínio de Iigação que interage com um antígeno. Cada cadeia pesada é ccmposta de uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região F· --constante de-- cadeia pesada (CH). A região. corlstante-"der"""- cadeia pesada é composta de três domínios, CHl, CH2 e CH3 e
1.5 pode ser do isotipo um, delta, gama, alfa ou épsílon. De forma similar, a cadeia leve é composta de uma regíão variável de cadeia Leve (VL) e uma região constante de cadeia leve (CIJ). A região constante de cadeia leve .é composta de um domínio, CL, que pode ser do isotipo capa ou 20 lambda. As regiões VH e VL podem ser adicionalmente subdivididas em regiões de hipervariabilídade, denominadas regiões de determinação de complernentaridade (CDR), ' intercaladas com regíões que são inais conservadas, denomínadas regíões de estrutura (FR). Cada VH e VL é 25 composta de três CDRS e quatro ERS, dispostas do terminal a-mino pa-ra o terminal- carbóxí na ordem a seguir: FRI, CDRI,
F FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveís das cadeías Ieve e pesada contêm um domínio de ligação que interage com
B, ·6 K um antígeno. As regiões constantes dos anticorpos podem V mediar a ligação da imunoglobulina a fatores ou tecidos hospedeiros, incluindo diversas célul-as do sistema imunológico (tais como células efetoras) e c) primeíro 5 componente (CIq) do sístema de complernento clássico. A regiã9 constante de cadeia pesada media a ligação da irriunoglobulina a tecido hospedeiro ou fatores hospedeiros, particularínente por meio de receptores celulares taís corno os receptores Fc (tais corno FcyRI, FcyRII, FCyRIII etc.).
10 Da forma utilizada no presente, o anticorpo também inclui uma parte de ligação de antígenos de u-ma imunogj-obulina que retém a capacidade de ligar antígeno. Estes incluem, por . . ""exemp1o",'"'F(ab), - um frãgmento"'ínonova1ente de"' doMínios de"' anticorpo VL CL e VH CH; e fragmento de F(ab')2, um 15 fragmento bivalente que compreende dois fragmentos de Fab ligados por uma ponte de dissWfeto na região de articulação. O teríno antícorpo tanbém designa fragmentos de Fv de cadeia úníca recombinantes (scFv) e molécuías biespecíficas, tais como diacorpos, triacorpos e 20 tetracorpos (vide, por exemplo, a Patente Norte-Americana n° 5.844.094).
Os antícorpos podem ser produzidos e utílizados de diversas forrnas, incluindo complexos de antícorpos. Dq forma utilizada no presente, a expressào "coinplexo de 25 anticorpos" designa um compl-exo de um ou mais anticorpos com um outro antícorpo ou com um ou mais fragmentos de antícarpos ou um complexo de dois ou mais fragmentos de anticorpos. Os complexos de anticorpos incluem formas
·?
G m múltiméricas de antícorpos anti-14-3-3, tais como b homoconjugados e heteroconjugados, bem como outros anticorpos reticulados conforrne descrito no presente.
"'Antígeno"' deve ser interpretado amplamente e designa ' 5 qualquer rnolécula, composi-ção ou partícula que pode lígar- se especifícarnente a um anticorpo. Um antígeno "contém um ou mais epitopos que interagem com o anticorpo, ernbora não induzam necessariamente a produção daquele anticorpo.
Os termos "reticulado"', "reticulação" seus 10 equivalentes grarnaticais designam a ligação de dois ou mais anticorpos para formar complexos de antícorpos e podem também ser denominados multimerização. Reticulação ou . .- . multimeri-zação' incluí a ligação"de 'dois. ou-mais"dos'"mesmos- antícorpos (tais coitlo honiodímerização), bem como a ligação 15 de dois ou mais anticorpos diferentes (tais como heterodimerização). Os técnicos no assunto tambéw reconhecerão que reticulação ou multirnerização também é indicada corno formação de homoconjugados de antícorpos e * heteroconjugados de anticorpos. Esses conjugados podem 20 envolver a ligação de dois ou mais antícorpos monoclonais da riiesma orígem clonal (homoconjugados) ou a ligação de dois ou rnais anticorpos corn origem clonal diferente (também denominados heteroconjugados ou bíespecíficos). Os anticorpos podem ser retícül-ados por meio de Iigação 25 covalente ou não covalente. Diversos métodos apropriados para reticulação serão apreciados pelos técnicos no assunto. A lígação não covalente pode ser atingida utílizando um anticorpo secundário que é específico para as b Y
E 7G substâncias de antic-orpos primários. Um anticorpo . s-ecundário anticamundongo de cabra (GAM) pode ser utilizado, por exemplo, para reticular um antícorpo monoclonal de camundongo. A ligação covalente pode ser 5 atingída utilízando reticulantes quíinicos.
"Epítopo'" designa um determinante capaz de ligação · específica a um anticorpo. Epítopos são características . quimicas geralmente presentes sobre superfícies de moléculas e acessíveis para interação com antícorpos.
10 Características químicas típicas são aminoácidos e porções de açúcar, que possuem característícas estruturais tridimensionaís bern como propriedades quírnicas que incluem - . -' cügã', -hidi:ofilicidade · e '- lipofiíícidade." Epí-topos ""-de"" "_ conformação são diferenciados de epítopos não de 15 conformação pela perda de reatividade com um anticorpo após uma alteração nos elementos espacíais da mo1écu1a seIrL nenhuma alteração na estrutura químíca subjacente.
"Anticorpo humanizado" designa uma molécula de imunoglobulina que contérrt "uma seqüêncía mínírna derivada de 20 imunoglobulina não humana. O" antícorpos humanízado" incluem imunog1obu1inas humanas (anticorpo receptor), nas quais os resíduos de uma região de determinação complementar (CDR) do paciente. são substituídos por residuos de CDR de uma espécíe nào humana (anticorpo 25 doador), tal como camundongo, rato ou coelho que possuí a especificidade, afinidade e capacídade desejadas. Erri alguns casos, os resíduos da região de estrutu-ra Fv da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não bt 'v W' humano.s correspondentes . Os anticorpos humani zados podem · taníbém compreender residuos que não são encontrados no anticorpo recep tor nem nas seqüência de estrutura ou CDR . importadas . Geralmente, um antícorpo human i z ado . 5 cornpreenderá substancialmente todos dentre pelo menos um, tipicainente dois domínios variáveis, nos quai s todas ou substancialinente todas as regiões CDR correspondem às de urna imuno globul ina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões de estrutura ( FR) são as de uma seqüência 10 de consenso de imunoglobulína humana . Uni antícorpo humani zado tambéín englobará imunoglobul inas que corrípreendern pelo menos uma parte de uma região constante de ,. — imunogl-obulina (Fc) ," geralmente a . 'de .uma ímunoglobulina humana (Jones et al, Nature 321: 522-525 (1986) ; Reichmann 15 et, al, Nature 332: 323-329 (1988) ) .
"Imunogene" designa uma substância, composto ou compo$-ição que estirnula a produção de uma reação imunoj.ógica .
A expressão "'local de imunog1obu1ina"' desígna um 20 elemento genético ou um conjunto de elementos genétícos ligados que compreende informações que podem ser utilizadas por uma célula B ou precursor de célula B para expressar um polipeptídeo de imunoglobulina. Esse polipeptídeo pode ser um polipeptídeo de cadeia pesada, um poIipeptídeo de cadeia 25 leve ou a fusão de um poIipeptídeo de cadeia Ieve e um de cadeia pesada. N,o caso de um local não redisposto, os 1 elementos genéticoS são montados por um precursor de células B para formar o gene que codifica um polipeptídeo e? % .
·s de imunoglobulína. Nç) caso de um Iocal redísposto, um gene · que codifica um polipeptideo de iínunoglobulina está contido no local.
'"Isotipo" designa uma classe de anti-corpos definida 5 pela sua região constante de cadeia pesada. Cadeias pesadas são geralmente cjassificadas como gama, mu, alfa, &ltm épsilorí e denominadas IgG, IgM, IGA, IgD e IgE. variações em cada isotipo são classifícadas em subtípos; subtipòs de IgG, por exemplo, são dívididos em IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4, 10 enquanto IGA é dividido em IgA1 e Igi?t2. O ísotípo IgY é específico de aves.
. "Anticorpo rnonoclonal" ou "composição de' antícorpo "" monoclonal" ""désigna" uma prepáração- de mo1écu1asi."'de"" . , . anticorpos com composição molecular única. Uma composição 15 de anticorpo monoclonal exibe uma única especificidade de ligação e afinidade para um epítopo específico.
A expressão "anticorpo monoclonal humano"' inclui anticorpos que exibem uma única especifícidade de Iigação que contêm regíões varíáveis e/ou constantes (quando 20 presentes) derivadas de seqüência de irnunog1obuIj-na humana.
Em uína realização, Oa antícorpos monoclonais humanos são produzidos por um hibridoma que inclui uma célula B obtída de um aniinal rião huntano transgênico, tal como um camundongo transgênico, que possui um genoma que compreende um 25 transgene de cadeia pesada humana e um transgene de cadeia leve fundidos a uma célula imortalízada. . "Fv de cadeia úníca"' ou "s.cFv" de8igrlam um anticorpo que compreende os dotnínios VH e VL de um anticorpo, em que
6) 'k' esses domíníos estão presentes em uma única cadeía de 8 polipeptídeo. Geralmente, um SCFv compreende adicionalmente urri ligante de polípeptídeo entre os domíníos VH e VL, o que perniite que o scFV forme a estrutura desejada para li-gação 5 de antígenos.
P "Paciente" é utilízado para desígnar, exceto quando indicado, mamíferos taís como seres humanos ou primatas não humanos, bem como coelhos, - ratos, ' camundongos, cabras, porcos e outras espécies de mamíferos.
10 "Anticorpo recombinante" designa todos qs anticorpos produzidos por meio de métodos recombinantes. Estes ínçluem anticorpos obtidos de um animal que é transgênico para o - -".local de irnunoglobulina,- anti"corpos"expreSsos?'a--p'artir 'de"'.' · " ' '* um vetor de expressão recoinbínante ou antícorpos criados, 15 preparados e expressos por meio da divisão de qualquer seqüência genética de imunoglobulina em qualquer outra 0 seqüência de ácídos nucléicos.
Antícorpos anti-14-3-3 Em uin aspecto, a presente invenção fornece anticorpos 20 anti-14-3-3 inovadores que se ligarn específicamente a proteína 14-3-3 eta ou 14-3-3 gama. Preferencialinente, um antícorpo anti-14-3-3 de acordo com a presente invenção é capaz de ligar-se especificamente a proteína 14-3"3 na sua configuração 3-D natural. Por ligação específica a uma 25 proteina 14-3-3 na sua "confíguração natural", indica-se urna capacidade de Iigação a proteína 14-3-3 encontrada ín vivo. Isso pode ser evidencíado, por exemplo, pela capacidade do anticorpo de iinunoprecipitar proteína 14-3-3 pí PY 4à eta a partir de uma amostra bíológica.
· Em uma realização preferida, um anticorpo anti-14-3-3 eta de acordo com a presente invenção é capaz de ligar-se a uma proteína 14-3-3 que está localizada de forma aberrante 5 no espaço sinovial extracelular em artrite. Isso pode ser evidencíado, por exemplo, por rneío de imunoprecipitação de proteína 14-3-3 presente em uma amostra de fluido sinovial de um paciente portador de artrite.
Em uma realização preferida, urn anticorpo antí-14—3-3 10 de acordo com a presente invenção é capaz de díscriminar entre isoformas de proteínas 14-3-3. Esses anticorpos possuem a capacídade de Iíga-r-se especificamente a urna " : iso"fÓrina ' de'.· -proteína 14-3-3 específica è Iigar-se preferencialmente àquela isoforma com relação a outras 15 isoformas de proteina 14-3-3 sob as mesmas condíções. Isso pode ser evidenciado, por exemplo, utílizando um teste ELISA, que pode ser realízado utilizando, por exemplo, sobrenadante de cIones de hibridoma. É preferencialmente utilízado um controle (tal corno soro pré-ímunológico). Um 20 anticorpo "seletivo" é capaz de reconhecer uma isoforma 14- 3-3 específica e gerar um sinal- mais alto contra aquel-a ísoforma eui coníparação coin outras ísoformas, preferenciálmente um sínal pelo rrienos uma vez e meia, de maior preferência pel-o menos duas vezes mais alto ern 25 comparação com outras isoformas. Em uma realização preferida, .um anticorpo seletívo possui uma" capacidade de imunoprecipitar seletívamente o 14-3-3 eta específico em c'omparação com outras isoformas de 14-3-3.
á. ¥ 6 eb Eirí uma realização preferída, o antícorpo anti-14-3-3 k exibe essa seletividade para proteína 14-3-3 eta sobre proteínas 14-3-3 alfa, beta, delta, épsilon, gama, tau e zeta, Isso pode ser evideneíado, por exemplo, por meio de . 5 ELISA. ' Em uma outra realização preferida, o anticorpo anti- 14-3-3 exibe essa seletividade para proteína 14-3-3 gama sobre proteinas 14-3-3 alfa, bet,a, delta, épsilon, eta, tau e zeta. Isso pode ser evídencíado, por exemplo, por meío de 10 ELISA.
Em uma realização preferida, um antícorpo anti-14-3-3 de acordo com a presente invenção é um antagon.ista 14-3-3, "embora outros.. " antícorpos ..antir14"3-3 ""também' üs'ej.am "' contemplados dentro do escopo da presente invençãó.
15 Em uma realização preferida, um antícorpo antí-14-3—3 é capaz de inibir a indução de MMP por proteína 14-3-3, particularmente 14-3-3 gama ou 14-3-3 '.eta. " Preferencialmente, o NMP é selecionado a partir do grupo que consiste de MMP-I, 3, 8, 9, 10, 11 e 13, eni que MMP-I e 20 MMP-3 são especialniente preferidos. Essa capacidade pode ser determinada por meio de um teste ín vít-ro ou um teste in vívo. Como apreciarão os técnicos no assunto, os testes serão projetados de taL forma que, na ausência de anticorpo anti-14-3-3, a presença de proteína 14-3-3 resultará na 25 indução de MMP. Uma capacidade de reduzir esta indução de MMP por proteína 14-3-3 pode evidencíar essa capacidade de inibição de função para um anticorpo antí-14-3-3.
Erri um aspecto, a presente invençào fornece antícorpos
¥' Ü bEl anti-14-3-3 eta. Em uma realízação preferída, o antícorpo . anti-14-3-3 eta liga-se a um peptídeo 14-3-3 que compreende j um segrnento da seqüência de aminoácido descrita ern SEQ ID :( ' N° 63. Ein uma realização preferida, o seginento posmíi 5 comprintento de pelo"rnenos seis, de maior preferência pelo menos sete, de preferência ainda maior pelo menos oito arninoácidos de compri-mento.
Em uma rea'lizaçâo, uin antícorpo anti-14-3-3 eta de acordo com a presente invenção não se liga a um epitopo 1-0 localízado no terminal N da proteína 14-3-3 eta humana.
Em uma realização preferída, um anticorpo a-nti-14-3-3 eta Iiga-se a urn peptídeo 14-3-3 que é um peptídeo de r -' 'cirç"ui"to '14-3-3 eta. Em uma """realízação preferida," 0,_ peptídeo de circuito 14-3-3 eta compreende uma seqüência de 15 aminoácido selecíonada a parti-r do grupo que consiste de SEQ ID N° 11 a 16. Ein uma outra realização, o peptídeo de circuito 14-3-3 eta consiste essencialmente de uma seqüência de aminoácido selecionada a partir do grupo que .. . -. consiste de SEQ ID N° 11 a 16. Em uma outra realização, um 20 anticorpo anti-14-3-3 eta liga-se a uma região de 14-3-3 gama que se sobrepõe a uma seqüência de aminoácido correspondente a uma seqüência selecíonada a partir do grupo que consiste de SEQ ID N° 11 a 16.
Em uma outra realização preferida, um antícorpo anti- 25 14-3-3 eta liga-se a um peptídeo 14-3-3 que é urrí peptideo de hélice 14-3-3 eta. Em uma realização preferida, o peptídeo de hélice 14-3-3 eta compreende uma seqüência de arriinoácido selecíonada a partír do grupo que consiste de
ÉS' $ F 4k:¢2 j ,b µ + SEQ ID N" 1 a 10. Em uma outra realização, o peptídeo de g hélice 14-3-3 eta conSiste essencíalmente de uma seqüência :1 de aminoácído selecionada a partir do grupo que consiste de ': SEQ ID N° 1 a 10. Em urna outra reaíízação, Lllü anticorpo 5 anti-14-3-3 e'ta liga-se a uma região de 14-3-3 gama que se sobrepõe a uma seqüêncía de arninoácído correspondente a uma seqüência selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID N° 1 a 10.
Em uma outra realização preferida, um anticorpo anti- IO 14-3-3 eta liga-se a um peptídeo 14-3-3 que é um peptídeo nã.o-hélice 14-3-3 eta. Em uma realízação preferida, o peptídeo não-hélíce 14-3-3 eta compreende uma seqüêncía de "' ãininoácido 'selecionada a partir do grupo. que consiste de SEQ ID N° 17 a 32. Em uma outra realização, o peptídeo não- 15 hélice 14-3-3 eta consiste essencíalmente de uma seqüência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID N° 17 a 32. Eikl uma outra realização, um anticorpo anti-14-3-3 eta liga-se a uma região de 14-3-3 gama que se sobrepõe a uma seqüência de aminoãcido correspondente a uma 20 seqüência selecionada a partir do grupo que consíste de SEQ , ID N° 17 a 32.
Eiii uma realização especialmente preferída, um anticorpo anti-14-3-3 eta de acordo coín a presente invenção liga-se a uma seqüência de aminoácído selecionada a partir 25 do grupÕ que consíste de LDKFLIKNSNDF (SEQ ID N° 30), KKLEKVKAYR (SEQ ID N° 31) e KNSVVEASEAAYKE'A (SEQ ID N° 32).
Exeinplos de peptídeos 14-3-3 de circuito, hélice e não-hélice são descritos na Tabela 1 do presente.
¥, m; Notadamente, SEQ ID N° 30 varía da seqüência 14-3-3 eta 'F correspondente pelo fato de que uma cisteína que ocorre na seqüência 14-3-3 eta foi substituída por serína para evitar ,,L ' a formação de ligações de dissulfeto. Em uma reali'zação, a
P 5 presente invenção fornece anticorpos que também se ligam à seqüência 14-3-3 natural relativa a SEQ ID N" 30 que compreende urna cisteína. Em uma realização, a presente invenção fornece anticorpos capàzes de ligar-se a seqüência de peptídeos que varíam das relacionadas nas tabelas de 10 epítÕpos do presente pela substituição de serína por cisteína.
Em um aspecto,,a presente ínvenção fornece anticorpos . . -" anti-14-3-3 'gâma. Eiii uiiia-·realização preferida, .-o "antícorpo"'" anti-14-3-3 gama liga-se a um peptídeo 14-3-3 que 15 compreende uríi segmento da seqüência de aminoácido descríta em SEQ ID N° 64. . Em uma reaiizaçào preferida, o seginento possui coinprimento de pelo rrtenos seis, de inaior preferência pelo menos sete, de preferência ainda maior pelo menos oito aminoácídos de comprimento.
20 Em uma realização preferida, um antieorpo anti-14-3-3 gama liga-se a um peptídeo 14-3-3 que é um peptídeo de circuito 14-3-3 gama. Em uma realização preferida, o peptídeo de circuito 14-3-3 gama cornpreende uma seq}lência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste de 25 SEQ IÍD N° 44 a 49. Em uma outra realização, o peptídeo de circuito 14-3-3 gama consiste essencialmente de uma seqüência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID N° 44 a 49. Em uma outra realização, um y bNr '
K G *, anticorpo .anti-14-3-3 gama liga-se a uma regíão de 14-3-3 · Z' gama que se sobrepõe a uma seqüência de' aminoácido correspondente a uma seqüência selecionada a partír do ¥V grupo que consíste de SEQ ID N° 44 a 49.
5 Em uma outra realização preferida, um anticorpo antí- 14-3-3 gama liga-se a um peptídeo 14-3-3 que é um peptídeo de hélice 14-3-3 gama. Em urna realização preferida, c) peptideo de hélice 14-3-3 gama compreende uma seqüêncía de ' aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste de 10 SEQ ID N° 33 a 43. Em uma outra realização, o peptídeo. de hélice 14-3-3 garna consiste essencialmente de uma seqüência de aminoãcido selecionada a partir do grupo que consiste de " "SEQ"ID-N° 33 a"""43.. Eiii úma 'õutra"-"reali-zação,:',=."àntico'rpQ--,-- anti-14-3-3 gama liga-se a uma região de 14-3-3 gama que se 15 sobrepõe a uina seqüência de aminoácido correspondente a uma seqüência selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID N° 33 a 43.
Em "uma outra realização preferi-da, um antícoÉpo anti- 14-3-3 gama liga-se a urn peptídeo 14-3-3 que é um peptídeo 20 não-hé1i-ce 14-3-3 gama. Eul uma realízação preferida, o peptídeo não-héZíce 14-3-3 gama compreende uma seqüência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID N° 50 a 62. Em uma outra realização, o peptídeo não- hélice 14-3-3 gama consiste essencialmente de uma seqüêncía 25 de aminoácído selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID N° 50 a 62. Ern uma outra realízação, um anticorpo r anti-l4-3-3 gama liga-se a uma região de 14-3-3 gama que se sobrepõe a uma seqüêncía de aminoácído correspondente a uma
¥l b V b seqüência selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ · ID N° 50 a 62. Antico-rpos monoclonais, hibridomas e métodos de fabricação dos mesmos 5 O presente relatório descritivo fornece anticorpos monoclonais que se ligam específicamente a proteína 14-3-3 eta, bem coino anticorpos monoclonais que se lígam especificamente a proteína 14-3-3 gama. Também são fornecídas línhagens de células de híbridoma capazes de 10 produzir esses anticorpos.
Em um aspecto, a presente invenção fornece antícorpos anti-14-3-3 eta monoclonais que se I-igam a um peptídeo 14- ·° -- 3-3 eta-"'-.de --ci'rcuito, hé'lice ·ou. não-hélice. Em uma" realizaçào preferida, o peptídeo compreende uma seqüência 15 de aminoácido selecíonada a partir do grupo que consiste de SEQ ID N° 1 a 32. Em uma realização especialmente preferida, a presente irrvenção fornece anticorpos monoclonais anti-Z4-3-3 eta que se ligam especificarnente a uma seqüência de aminoácido selecionada a partir do grupo 20 que consiste de LDKFLIKNSNDF (SEQ ID N° 30), KKLEKVKAYR (SEQ ID N° 31) e KNSVVEASEAAYKEA (SEQ ID N° 32). Também são fornecidas linhagens de células de híbridoma capazes de produzir esses anticorpos- Em um aspecto, a presente invenção fornece híbrídomas 25 produzidos por meío de fusão de uma célula do baço derivada de um camundongo imunízado com um ímunogene que compreende um peptí'deo 14-3-3 eta de circuito, hélice ou não-hélice.
Em uma realízação preferida, o peptídeo corripreende uma
€"' G.
¥ seqüência de aminoácído selecionada a partír do grupo que ')'· consiste de especialmente SEQ ID preferida,N° a1 a 32 . presente Em invençào uma realização fornece híbridom.as produzidos por meio de fusão de células de baço 5 derivadas de camundongos imunizados com yim imunogene que compreende LDKFLIKNSNDF (SEQ ID N° 30) , KK.LEKVKAYR (SEQ ID N° 31) ou KNSVVEASEAAYKEA (SEQ ID N° 32) . Também são fornecidos anticorpos monoclonais produzidos por esses hibridomas.
10 Em uma real-ização preferída, a presente invenção fornece anticorpos anti -14 - 3- 3 gama rnonoclonais que se Iigain a um peptídeo 14-3-3 gama de circuito, hélíce ou não- ,; ^ " '"' ' hÉÊlÍce " Em uma"-'rèai'iZação p"rèfèrid"à; ' o - peptídeo compreende .' uma seqüência de amínoácido selecionada a partír do grupo 15 que consiste de SEQ ID N° 33 a 62. Também são fornecidas linhagens de células de hibri-doma capazes de produzir esses anticorpos.
Em um aspecto, a presente invenção fornece hibridomas produzidos por meio de fusão de uma célula do baço derivada 20 de um camundongo ímunízado com um imunogene que compreende um 14-3-3 gama de circuito, hélice ou não-hélice. Em uma realização preferida, o peptídeo corrtpreende uma seqüêncía de aminoácido selecionada a partir do grupo que consíste de SEQ ID N° 33 a 62. Tambéuí são forn.ecídos anticorpcis 25 monoclonais produzídos por esses híbrídomas.
O presente relatório descritivo fornece adicionalmente método;s de produção desses anticorpos monoclonaís ou seus derivados, que cornpreendem o cultivo de um hibrídoma de
BZ k. ac.ordo cqitl a presente invenção sob condíções apropríadas, b por meio do quê é produzido um anticorpo monoclonal, e b
Y obtenção do anticorpo e/ou seu derivado da célula é/oü do ( t meio de cultivo celular.
5 Os anticorpos podem ser produzidos facilmente pelos técnicos no assunto . A metodologia geral de elaboração de anticorpos monoclonais por meío de híbridomas é agora bem " conhecída na técnica . Vide, por exemplo, M. Schreíer et al, . Hybridoma Techniques (Cold Spring Harbor Laboratory) 1980; 10 Hamnerling et al, Monoclonal An tíbodi es and T-Ce-Zl Hybridomas (Elsevier Biomedical Press) , 1981.
Em algumás realizações, estes mé todos corripreendem o ·' çul"ti"üo ·" dè" uina ' .célula de ' hibridoma sob :condíções" -j" . . apr.opriadas ein que o anticorpo é produzído e a obtenção do 15 anticorpo e/ou seu derivado da célula e/ou do meio de cultivo celular.
A presente invenção tarnbém contempla o uso de bibliotecas de fagos para elaborar a'ntícorpos capazes de Iigação aos peptídeos 14-3-3 de ínteresse descrítos no 20 presente. Vide, por exemplo, Konthur et al, Targets, 1: 30- 36, 2002.
Os antícorpos produzidos por qualquer meio podem ser purificados por rneio de métodos conhecidos dos técnicos no assunto. Os métodos de puríficação incluem, entre outros, 25 preparação seletiva, cromatografía de líquidos, HPLC, eletroforese, cromatoconcentração e váríos métodos de afinidade. A precipitação seletiva pode utilízar sulfato de amônio, etanol (precípitação de Cohn), polietileno glicol
È} g ou outr-os agentes disponíveis na técníca. Meios de 6 · cromatografia de líquidos incluem, entre outros, meio de 4 r troca de íons DEAE, políaspartato, hidroxilapatita, ! exclusão de tamanho (tal como os baseados em agarose 5 reticulada, acrilamida, dextran etc.), matrizes . hidrofóbicas (tais como Blue Sepharose). Métodos de
F afinidade d.ependem típicamente de proteínas que interagem corn o domínio Fc de imuhog1obulina. A proteína A de Staphylococcus aureas pode ser utilizada para purificar lO anticorpos que se baseiem em cadeías pesadas Yi, y2 ou y4 humanas (Lindmark et al, j. Iinmunol. Meth. 62: 1-13 (1983)). Proteína G de C e G streptococcí é útíí para todos F ..
"ÒS isotipós de'.camundongos e-"para" yú3 humano' (Guss et"-al, . "" "' EMBO j. 5: 156"7-1575 (1986)). Proteína L, uma proteína de 15 parede celular de Peptostreptococcus magnus que liga imunoglobulinas Ig por meio de interações de cadeia leve k (BD Bioscience/ClonTech, Palo Alto CA), é útil para purificação de afinídade de subclasses de Ig IgM, IgA, IgD, IgG, IgE e IgY. Formas recombinantes dessas proteínas 20 também são disponíveis comercialmente. Caso o anticorpo contenha resíduos de lígaçães metálícas, tais como anticorpos de exibição de fagos construídos para conter marcas de histídina, pode-se utilizar cromatografía de afinidade metálica. Quando foreín disponíveís quantídades 25 suficíentes de popul-ações celulares e3pecíficas, podem ser elaboradas matrízes de afínidade de antígenos com as células para fornecer um método de afinidade para purifícar os anticorpos.
hg Em uma realização preferida, o ísolamento envolve
L 6 cromatografia de afinidade utilizando uma proteína 14-3-3
L
F l apropriada ou seu fragmento. Et A presente invenção fornece os antícorpos descritos no 5 presente, bem como fragmentos de ant ícorpos correspondentes e partes de líaação de antígenos . Todos são englobados pela expressão antieorpo anti-14-3- 3 . As expressões " f ragmento de anticorpo'" ou "parte de Iigação de antígeno" de um ant i corpo (ou simplesmente "parte de anticorpo") de acordo 10 com a presente invenção, da forma utílízada no presente, r indica um ou mais f ragmentos de urri ant icorpo que retêm a capacídade de ligação específíca a um antígeno . Demonstrou- ' " " se +que' a .;"função. de lígaçào de antígenos de ·um - ant"ícõrpo" """t " pode ser realizada por meio de fragrnentos de um anticorpo 15 de comprimento total . Exemplos de fragmentos de ligação englobados na expressào " fragrnento de anticorpo" ou "parte , de ligação de antígeno"' de um anticorpo incluem (í) um fragmento de Fab, um fragmento monovalente que consiste dos domínios VL, VH, CL e CHl; (ii) um f ragmento de F ( ab' ) 2, um 20 f ragmento bivalente que compreende dois Eragmentos de FAB Iigados por uma ponte de dissulfeto na regíão de ' artículação; (iii) um f ragmento de Fd que consiste dos domínios VH e CHl; (iv) um fragmento de Fv que consiste dos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo; (v) um 25 f ragmento de dAb (tal coíno Ward et al (1989) , Natu-re 341: 544-546) , que consiste de um domínio VH; e (ví) urna região de determinação da complementarídade i solada (CDR) ; e (vií) dímeros de Fv de cadeia única biespecí fícos ( por exemplo , , P
Ô 0 PC"T/ÜS92/09965). Aléni disso, embora os dois dowínios do #¥ · fragmento de Fv, VL e vh, sejam codíficados por genes separados, eles podem ser ligados, utilízando rriétodos b
E recombinantes, por um ligante sintético que permite a sua 1 5 elaboração como uina única cadeia de proteína na qual as regiões VL e VH se eniparelham para formar moléculas monovalentes (conhecídas como Fv de cadeia úníca (SCFv); vide, por exemplo, Bird et al (1988), Science 242: 423-426; " e Huston et al (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 85: 10 5879-5883). Esses anticorpos de fita única tambéin se destinam a ser englobados na expressão "parte de ligação de antígenos" de um anticorpo. Estes fragmentos de anticorpos são" òbtidos utilízando métodos convencionais-conhecidos dos.
técnicos no assunto e os fragmentos sào selecionados para 15 utilidade da mesrna forma que anticorpos íntactos. Os fragmentos de anticorpos podem ser modificados. As moléculas podem ser estabiZizadas, por exemplo, por meio da incorporação de pontes de dissulfeto que Iígam os domínios VH e vl (Reiter et al, 1996, Nature Biotech. 14:1239-1245).
20 As ínoléculas de imunoglobulina podem ser cIívadas em fragmentos. A região de Iigação de antígenos da molécula pode ser dividida em fragmentos de F(ab')2 ou Fab. O fragmento de F(ab')2 é divalente e é útil quando a região Fc for indesejável ou não for uma característica 25 necessária. O fragmento de Fab é univalente e é útil quando um anticorpo possui uma avídez muito alta para o seu , antígeno. A elimínação da região Fc do anticorpo reduz a l-igação não específica entre a região Fc e as células que . q
%' o; contêm receptor Fc. Para gerar fragmentos de Fab ou 0 €' F(ab')2, os anticorpos são digeridos com uma enzima. As proteases que cIivam na região de articulação de uma .È molécula de imunoglobulina preservam a(s) 1igação(ões) de 5 dissulfeto que líga(m) os domínios de Fab de tal forma que perwaneçam juntas após a clívagem. Uma protease apropriada corn este propásíto é pepsína. Para a produção de fragmentos
V de Fab, são selecionadas proteases de tal forma que a divísão ocorra acima da regíão de artícúlação que contém as 10 ligações de dissulfeto que Iigam as cadeías pesadas mas deixa íntacta a ligação de dissulfeto que Iiga a cadeia pesada e a leve. Urria protease apropriada para elaboraçào de .---. -fr?gInentos-de Fab é- papaína. -Os fragmentos.-são purificados. por meio dos métodos descrítos acíma, com exceção de 15 métodos de afinidade que necessítam da região Fc intacta (tal corno croinatografia de afinídade de Prateína A).
Fragmentos de anticorpos podem ser produzidos por mwúj de proteólise limitada de antícorpos e são denominados fragmentos de anticorpos proteolíticos. E,stes incluem, mas 20 sem limitações, os seguintes: fragmentos de F(ab')2, fragmentos de Fab', fragmentos de Fab'-SH e fragmentos de Faíb. "Fragmentos de F(ab')2" são liberados de um antícorpo por meio de exposição Iimitada do antícorpo a uma enzíma proteolítica, tal coino pepsina ou ficina. Um fragmento de 25 F(ab')2 compreende doís '"braços", cada um dos quaís compreende uma região variável que é dirigida e liga-se especificamente a uní antígeno comum. As duas moléculas de . Fab' sào ligadas por meio de ligações de dissulfeto b intercadeias nas regiões de articulação das cadeias k' y pesadas; as ínoléculas de Fab' .podem ser dírigidas ao mesmo epítopo (bivalente) ou diferentes (biespecíficos') . e " Fragmentos de Fab' " contêm um único domíní'o de Iigação de 5 antígeno que compreende um Fab e uma parte adicional da cadeia pesada por meio da região de articulação.
"'Fragmentos de Fab' -SH" são tipicamente produz idos a partir de ' fragmento s "de F(ab')2, que são mantidos j untos . por ligação (ões) de dissulfeto entre as cadeias H em unt lO fragmento de F(ab')2. Tratamento com um agente redutor suave tal como , como exernplo não limitador, be tamercaptoetíl-amína rompe a ( s ) Iigaçào (ões) de díssulfeto . ,, e' doís fragmentos "de. Fab' são liberados de urri" f ragmento de" t F(ab')2. Fragmentos de Fab' -SH são monovalentes e 15 monoespecíficos . " Fragmentos de Fab" (ou seja, um fragmento de antícorpo que contém o domínio de ligação de antígenos e contpreende uma cadeia Ieve e parte de uma cadeia pesada em ponte com uma lígação de dissulfeto) podem ser produzidos por meio de digestão de papaína de anticorpos intactos . Um 20 método conveniente é o uso de papaína ímobilizada sobre uma resina, de tal forma que a enz ima pos sa ser faci-lmente removida e a digestão encerrada . Os f ragmentos de Fab não possuem a (S) ligação (ões) de dissulfeto entre as cadeias H presentes em um fragmento de F (ab' ) 2.
25 "Anticorpos de fita úníca" são um tipo de fragmento de anticorpo. A expressão anticorpo de f íta única é . " f reqüentemente abrevíada " SCFV" ou " s E"v'° . E-stes fragmentos de anticorpos são produzidos utílízando tecnología de DNA " a';
·; reconibínante. Um antícorpo de fita única consiste de uma b # cadeia de polipeptideo que compreende os domínios Vjj e Vl que interagem para formar um local de ligação de antígenos. c Os domínios Vp[ e Vl são normalrnente Iigados por um peptídeo 5 coín dez a 25 resíduos de aminoácidos.
A expressão "anticorpo de fita única" inclui aínda, mas sem limitações, um Fv ligado por dissulfeto (dsFv) no " qual dois anticorpos'de fita única (cada um dos quais pode ' referir-se a um epítopo diferente) são ligados entre si por 10 tm lígação de dissulfeto; um sfv biespecífico no qual dois SCFVS discretos com especificidade diferente são conectados com um ligante de peptídeo; um diacorpo (um SFV dimerizado " + -· ,-formado quando o doInínio"VH. de.um primeiro SFv reúne'com o. domínio Vl de um segundo sfv e c) domínio Vl do primeiro SFv 15 reúne com o domínio Vh do segundo sfv; as duas regiões de ligação de antígenos do diacorpo podem ser dirigidas a epítopos idênticos ou díferentes); e um tríacorpo (um SFV trirrterizado, formado de maneira simílar a um diacorpo, mas no qual três domínios de ligação de antígenos são criados 20 em um único complexo; os três domínios de Iígação de antígenos podem ser dirigidos a epítopos idênticos ou diferentes).
"Peptídeos de região de determinação completar" ou "peptídeos de CDR" são uma outra forma de fragmento de 25 anticorpo. Em 'uma realização, a presente ínvenção fornece peptídeos- de CDR que são antagonistas de 14-3-3. Um peptídeo de CDR (também conhecido como "unídade de reconhecimento mínimo") é um peptídeo correspondente a uma e b" t única região de determínação de cornplementarídade (CDR) e ;i pode ser preparado por meio de construção de genes que . codificam a CDR de um anticorpo de interesse. Esses genes k são preparados, por exern.plo, utílizando a reação em cadeia 5 de polimerase para sintetízar a região variável de RNA de células produtoras de anticorpos. Víde, por exeinplo, Larrick et al, Methods: A Companíon to Methods in Enzymology, 2: 106, 1991. - - · . Em "anticorpos modificados por cisteína", um 10 aminoácido de cisteína é ínseri-do ou substítuído sobre a superfície de anticorpo por rneio de manipulação genética e utilizado para conjugar o anticorpo a uma outra molécula, " "lpor .exemplo, por-mei"o"de uma" ponte 'de dís'sulfeto. Foram .F descritas substituições ou inserções de cistúna para 15 anticorpos (vide a Patente Norte-Amerícana n° 5.219.996).
Métodos de introduçào de resíduos de Cys na região constante dos anticorpos IgG para uso na conjugação específica de local de anticorpos são descritos por Stimmel et al (J. Biol. Chem., 275: 330445-30450, 2000).
20 O presente relatórío descritívo fornece adicionalmente anticorpos humanizados e não humanizados. As formas humanízadas de anticorpos não humanos (por exemplo, de camundongoq) são anticorpos quiméricos que contêm seqüência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Geralmente, 25 anticorpos humanizados sào anticorpos não humanos que apresentaram as regiões de estrutura de domínio variável comutadas por seqüências encontradas em antícorpos humanos. # Os anticorpos humanízados podem ser ímunoglobulinas humanas b ·/ (anticorpo receptQr), nas quaís os resíduos de uma região b" t hipervaríável do paciente são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uina espécíe não humana ,$ (anticorpo doador) tal como camundongo, rato, coelho ou 5 priuíata não humano que possui a especificídade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, os resídúos de região de estrutura (FR) da humana imunogl-obulina são . substituídos por re-síduos não humanos correspondentes. Além " disso, os anticorpos hurnanizados podem compreender resíduos 10 que não são encontrados no anticorpo receptor nem no anticorpo doador. Essas modíficações são feitas" para refinar ainda mais o desempenho do anticorpo. Geralment'e, o q ' "."'.'"-antícorpo humanízado compreenderá subs.tancialmente.. todos "".q dentre pelo rnenos urn, tipicamente dois domínios variáveis, 15 ein que todos ou substancialrnente todos os laços hipervariáveis correspondem aos de uma ímunoglobulína não humana e todas ou substancialmente todas as FRS são as de tma seqüêncía de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado também compreenderá opcionalmente pelo menos uma 20 parte de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulina humana.
Geralmente, em um antícorpo humanizado, todo o anticorpo, exceto as CDRS, é codífícado por um polínuc1eotídeo de origem humana ou é idêntieo a esse 25 anticorpo, exceto nas suas CDRS. As CDRS, das quais algumas ou todas são codifícadas por ácidos ,nucléicos oríginários em uín organisíno não humano, são en9ertadas na estrutura de folha beta de uma região variável de anticorpo humano para e ' criar um anticorpo, cuja específicidade é determinada pelas "' «X CDRS enxertadas. a criação desses anticorpos é descrita, por exemplo, em WO 92/11018, jones, 1986, Nature 321: .522-
C . 525, Verhoeyen et al, 1988, Science 239: 1534-1536. · 5 Ariticorpos humanizados podem também ser gerados utilizando camundongos com um sisteina imunológico genetícamente elaborado, tal como em Roque et al, 2004, Biotechnol. Prog.
20: 639-654.
Pode ser desejável modificar os anticorpos de acordo 10 com a presente invenção corn relação à função efetora.
Resíduo(s) de cisteína pode(m) ser introduzídols), por exemplo, na região Fc, de fQrma a permitir a formação de " un"i"ões de dissulfeto intercadeias---nessa---Uegiao. jAnticorpos.- homodiInéricos podem também ser preparados utílízando 15 reticulantes heterobifuncionais, tal como ern vQolff et al, Cancer Resea-rch, 53: 2560-2565 (1993). Alternativarnente, pode ser elaborado um anticorpo que contém regíões Fc duplas. Vide, por exemplo, Stevenson et al, Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989).
20 Anticorpos modífícados Em um aspecto, a presente invenção fornece antícorpos 14-3-3 que são anticorpos modifícados derívados de um anticorpo que Iiga específicamente uma proteína 14-3-3. Os anticorpos modificados também íncluein anticorpos 25 recorribinantes conforme descrito no presente.
Nuinerosos típos de anticorpos modifi-cados ou recombinantes serão aprecíados pelos técnicos no assunto.
Tipos apropriados de . anticorpos modíficados ou
A. recombinantes incluem, sem Iimitaçães, antícQrpos Y · monoclonais elaborados (tais COIilO anticorpos monoclonais quiméricos, anticorpos monoclonaís humanízados), antícorpos ! de domínio (tais como fragmentos de Fab, Fv, VH, scFV e 5 dsW), anticorpos multivalentes ou rnultiespecíficos (tais como diacorpos, minicorpos, minianticorpos, (scFV)2, tricorpos e tetracorpos) e conjugados de antícorpos # conforme descrito no presente.
Em um aspecto, a presente invençào fornece anticorpos 10 antí-14-3-3 que sào anticorpos de domínío. "Antícorpos de domínio" são domínios de ligaçào funcionais de anticorpos, correspondentes às regiões variáveis da's cadeias pesada 4 (HV) ou leve (VL) de anticorpos,.humanos." Anti'corpos de '-.
domínio podem possuir um peso molecular de cerca de 13 kDa 15 Qü menos de um décirno do tamanho de uni anticorpo completo.
Eles são bem expressos em uma série de hospedeiros que incluem sístemas de células bacterianas, de Ieveduras e de mamiferos. Além dísso, anticorpos de domínío são altamente estáveis e retêrn a atividade uiesmo após serem submetidos a 20 condições difíceis, tais como secagem por congelamento ou desnaturação por calor. Vide, por exemplo, a Patente Norte- Americana n° 6.291.158, 6.582.915, 6.593.081, 6.172.197; Número de Série Norte-Americano n" 2004/0110941; Patente Européia n° 0368684; patente Norte-Americana n° 6.696.245, 25 WO 04/058821, WO 04/003019 e WO 03/002609. Em uma realização, o anticorpo de domínio de acordo com a presente invenção é um único domínío. Ariticorpos de doniínio único podem ser preparados, por exernplo, conforme descrito na k [" Patente Norte-A-mericana n° 6.248.516.
E' Y Eiii um outro aspecto, a presente invenção inclui antícorpos multíespecíficos. Anticorpos multíespecífícos " íncluem anticorpos biespecíficos, triespecíficos etc.
5 Anticorpos bíespecíficos podein ser produzidos por meíos recombinantes, utilizando, por exemplo, porções de fecho de Ieucína (ou seja, das proteínas Fos e jun, que formam preferencialmente heterodimeros; tais como Kostelny et al, 1992, j. Tmmunol. 148: 1547) ou outras estruturas de 10 domínio ínterativo de trava e fechadura, tal como conforme descrito na Patente Norte-Z\mericana n° 5.582.996. Os métodos úteis adicionais incluem os descrítos na Patente "'NortÉ Amer"icana-'n°' 5.959.·083;- e Patente Norte-Arnerícana n°.
5.807.706.
15 Os anticorpos biespecíficos às vezes são também denominados "diacorpos". Estes são anticorpos que se ligam a dois (ou rnais) antígenos díferentes. Também são conhecídos na técníca triacorpos (um sFv trimerizado, formado de maneira similar a um diacorpo, rrías no qual três 20 domínios de ligação de antígenos são criados ein um único complexo; os três domínios de ligação de antígenos podem ser dírigidos a epítopos idênticos ou díferentes) ou tetracorpos (quatro domínios de Iigação de antígenos criados errt um único complexo em que os quatro domíníos de 25 ligação de antígenos podem ser dírigidos a epítopos idênticos ou diferentes). Dia, tría e tetracorpos podem ser fabricados em uma série de formas conhecídas na técníca (tais como Holliger e Winter, 1993, Current Opinion ,¥ ê f' Biotechnol. 4: 446-449), tal como preparados quimicameritè ·3 E' ou a partir de hibridomas híbrídos. Além d'isso, esses antícorpos e seus fragmentos podem ser construídos por meio 'F de fusào genética (tal como Tomlinson et al, 2000, MethQds 5 Enzymol. 326: 461-479; WO 94/13804; Holliger et al, 1993, Proc. Natl. Acad. sci. U. S. A. 90: 6444-6448).
Em uma outra realização, a presente invenção fornece m-inicorpos, que são proteínas- similares a anticorpos + minimízados que íncluem um SCFV ligado a um domínio CH3 e 10 são derivados de um anticorpo que liga especifícamente proteína 14-3-3. Minicorpos podem ser elaborados conforme descrito na técnica (vide, por exemplo, Hu et al, 1996, : . Cancer Res. 56: 3055-3061).
Em uma outra realização, a presente invenção fornece 15 pr'oteínas de fusão de imunogloblina de domínio de ligação de 14-3-3. Em uma realização, a proteína de fusão pode incluir um polípeptídeo de domínio de ligação de 14-3-3 fundido a um poIipeptídeo de região de articulação de imunoglobulina, que é fundido a um poIipeptídeo de região 20 constante de CH2 de cadeia pesada de imunoglobulina Íiundido a um polipeptídeo de região constante de CH3 de cadeia pesada de immoglobulina. Cora base na presente invenção, proteínas de fusão de anticorpo 14-3-3 podem ser elaboradas por meio de rnétodos corihecidos dos técnícos no assunto 25 (vide, por exemplo, os pedidos de Patente Norte-Amerícanos n° 20050238646, 20050202534, 20050202028, 2005020023, 2005020212, 200501866216, 20050180970 e 20050175614).
Em uina outra realizaçào, a presente invenção fornece
'> ' uma p;roteína de cadeia pesada derívada de um anticorpo 14- : 3-3. Anticorpos de cadeia Èesada de ocorrência natural (tais como anticorpos de camelídeos que não contêm cadeias
B Ieves) vêm sendo utilízados para desenvolver proteínas 5 terapêuticas derivadas de anticorpos que tipicamente retêm as propriedades estruturais e funcionais de anticorpos de . cadeia pesada de ocorrência natural. Eles são conhecidos na técnica como nanocorpos. Proteínas de cadeia pesada derivadas de um anticorpo de cadeia pesada 14-3-3 podem ser 10 elaboradas por rrieio de métodos conhecídos dos técnicos no assunto (vide, por exemplo, os Pedidos de Patente Norte- Americanos publicados n° 200602464"77, 20060211088, . ' 2006"0149041: 20060115"470 e 20050214857)." Além .disso; '"com '" "' relação à produção de anticorpos apenas de cadeia pesada em 15 camundongos com defi-ciência de cadeias leve, vide, por exemplo, Zou et al, JEM, 204: 3271-3283, 2007.
Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo modificado que é um anticorpo humano. Em uma realizaçào, são fornecidos antícorpos 14-3-3 totalmente 20 humanos. "Anticorpo totalmente humano" ou "'anticorpo humano completo" designa uin anticorpo humano que contém apenas a seqüência genética de um anticorpo derívado de um cromossomo humano. O anticorpo humano completo anti-14-3-3 pode ser obtido por meio de um método que ut'.liza um 25 camundongo produtor de anticorpos que contém urrt fragmento de cromossomo humano que contém os genes para uma cadeia pesada e uma cadeia Ieve de um anticorpo humano (vide, por exeinplo, Toinizuka, K. et al, Nature genetics, 16, págs.
&. e" 133'-14'3', 1997; Kuroiwa, Y. et al, Nuc. Ac:ids RèS. , 2·6, e € r e í págs . 3447-3448, 1998; Yoshida, H. et al. , AnimaI C'eljZ Technology: Basic and Applied Aspects, voI. 10, págs. 69-73 b (Kitagawa, Y. , Matuda, T. e Iij ima, S., eds . ) , Kluwer 5 Academic Fublishers, 1999; Tomi zuka, K. et al. , P-roc. Natl.
Acad. Sci. U. S. A., 97, 722-727, 2000) ou obtido por meio de um método de obtenção de um anticorpQ humano derivado de uma exibição de fago selecionada a partír de uma bíblioteca de anticorpos humanos (vide, por exemplo, Wormstone, I . M.
10 et al, Tnvestigative Ophthalmology & Visual Sci ence, 43 (7), págs . 2301-8, 2002; Carrrien, S. et al. , Bri efings in Functional Genomi cs and P-roteomi cs, 1 (2), págs . 189-203, . ". " "2002';" Siriwardena", D. et ,al..", "Ophthalmology, 109 -(3) , págs..'. "' 427-431, 2002) .
15 Eni um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo 14-3-3 que é um análogo de anticorpo, denominado às vezes "anticorpos síntéticos". pode-se utilizar, por exemplo, suportes de proteína alternativos ou suportes artificiais com CDRs enxertadas . Esses suportes incluem, 20 mas sem limitações, suportes sintéticos que consistem, por exemplo, de polímeros biocompatíveis. Vide, por exewplo, Korndorfer et al, 2003, Proteins: Structure, Function and Bicinformatics, Volurne 53, edição 1: 121-129. Roque et al, b 2004, Biotechnol. Prog. 20: 639-654. Alérn disso, podem ser 25 utilizadas imítações de anticorpos de peptídeos ("PAMs") , bem como imitações de anticorpos que ut i lí zam componentes de f ibronectína como suporte .
Em um aspecto, a presente invenção fornece a-nticorpos k
T tj · reticulados que incluem dois ou mais anticorpos descritos tgÇ,. no presente ligados entre si para formar complexos de 'íg' anticorpos. Os anticorpos reticulados também são % denominados mul-tímeros de anticorpos, homoconjugados e 5 heteroconjugados.
Em algumas realizações, os coinp1exos de anticorpos fornecidos no presente incluem forrnas multiinéricas de
A anticorpos anti-14-3-3. Os complexos de" anticorpos de acordo com a presente invenção podern, por exemplo, assumir 10 a forma de dírneros de anticorpos, trimeros ou multírneros de ordem superior de moléculas de imunoglobulina monoméricas.
A reticulação de anticorpos pode ser realizada por meio de . . díúefscis 'métodos conhecidos" na técnica." A retículação de' "" " anticorpos pode ser real-izada, por exemplo, por meio de 15 agregação natural de anticorpos, por meio de métodos de ligaçào quíínica ou recombínante ou outros métodos conhecidos no assunto. As preparações de anticorpos purificados podeín formar espontaneamente, por exemplo, agregados de proteína que contênt homodímeros de anticorpos 20 e outros multímeros de anticorpos de ordem superior.
Em uma realização, a presente invenção fornece anticorpos homodimerízados que se Iigam especificamente a antígeno 14-3-3.
Os anticorpos podem ser reticulados ou dimerízados por 25 meio de métodos de lígação conhecidos no assunto. Podem ser utilizados métodos de lígação não covalentes. Em uma realização especifíca, a retículação de anticorpos pode ser atingida utilizando um anticorpo reticulante secundário. O rk ,. $ anticQrpo re t j cuj-ante pode ser derívado' de um aníínal d bt difere.nte em c'omparâção coín o anticorpo de interéssé. Um 'Q anticorpo anticarnundongo de cabra (específíco de Fab) pode & ser adícíona-do, por exemplo, a um anticorpo monoclonal de 5 camundongo para formar um heterodimero . Este antícorpo reticulante bivalente reconhece a regiào de Fab ou Fc dos dois anticorpos de interesse que forinain um homodímero .
Erri un.a realização da presente ·invenção, um anticorpo que se liga especi ficamente a antígeno 14-3-3 é reticulado 10 utilizando um anticorpo anticamundongo de cabra (GAM) . Em uma outra reali zação, o reticulante GAM reconhece a região Fab ou Fc de dois anticorpos, cada um dos quais liga ¶ .-- '" especif icaíuente."um "antígeno 14-3-3 .- -- .
Podem tambérn ser utilizados métodos de Iigação químíca í5 ou covalente de anticorpos . Os re tículantes quírnicos poderri ser homo ou heterobifuncionais e se Iígarão covalentemente a dois antícorpos, formando um homodíme ro . Agentes reticulantes são bem conhecidos na técnica; por exemplo, ligantes homo ou heterobifuncionais são bem conhecidos 20 (vide 2006 Píerce Chemi cal Company C-rossli nkíng Reagen ts Techni cal Handbook; Hermanson, G. T., Bíocon jugate Techníques, Academic Presss, San Diego CA (1996) ; Aslam, M.
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$' s OR (2003) ; e Patente Norte-Amerícana n° 5.747.641) . Os . V " t" técnícos no assunto apreciarão a adequação de diversos .f. grup.os funcionais sobre o (5) aminoácido (S) de um antícorpo b para modificação, incluind.o a reticulação. Exemplos 5 apropriados de reticulantes químícos utilizados para a reticulação de anticorpos incluerrt, mas sem Iímitações, SMCC (4- (maleimidometil) ciclo-hexano-l-carboxilato de succinirnídila) , SATA " (S-acetíltioacetato ' de N- succinimídila) , ésteres de semissuccinato de N- lO hidroxissuccinimida.; su1fo-N-hidroxissuccíniíuida ; hidroxibenzotriazol e p-nitrofenol; dicíclo-hexilcarbodi- imida (DCC) , 1- (3-dimetilaminopropil) - 3-et ilcarbodí- imida ~ 0 " ('Ecjj)"" ' " "e " mètiodeto '" " de" ..P 1"- ('3"dimetilami-nopropi I) - 3- ' etilcarbodí-ímida (vide, por exemplo, a Patente Norte- 15 Americana n° 4.526.714, cuj o relatório descritivo é integralmente incorporado ao presente coino referência) . r Outros reagentes de ligação incluem glutationa, 3- (dietoxifosforilõxi) -1, 2, 3-benzotriazin-4 (3H) -ona (DEPBT) , reagentes de acoplamento com base em saís de Ônío , 20 reagentes retículantes heterobifuncionais com base ern polioxietileno e outros reagentes (Haítao et aj-, Organ Lett. 1: 91-94 (1999) ; Albericio et al, LT. Organi c Chenzistry 63: 9678-9683 (1998) ; Arpicco et al, Bíoconjugate Chem. 8: 327-337 (1997) ; Frisch et al, Biocon j ugate Chem.
25 7: 180-186 (1996) ; Frisch et al, Bioconjugate Chem. 10: 32- 37 (1998) ; Beyer et al, J. Med. Chem. 41: 2701-2708 (1998) ; Drouillat et al, j. ph arm. Sci . 87 : 25-30 (1998); Trímble et al, Bioconjugate Chem. 8: 416-423 (1997) ) . Urri exemplo de
$: -, 5" ' protocolo de f ormação de homodíme ro s de anticorpos . é '" 6í fornecído na Patente Norte-Amerícana publicada n°
20060062786. Os métodos de conj ugação de compostos e terapêuticos de anticorpos tarnbém sào descritos em Arnon et 5 al, Monoclonal Antíbodi es for Tmmunotargeting of Drugs in Cancers Therapy em Monoclonal Antibodies and Ca ncer Therapy, Reisfeld et al, Rd., págs. 243-256, Alan R. Liss, Inc . (1985); Thorpe et al, The Prepara ti on and Cyt otoxi c Prope-rtíes oF Antibody" Toxin Con j uga tes, Tmmuno-Z . Rev. 62 : ' 10 119-58 (1982); e Pietersz, G. A., The .T,inkage of Cytotoxic Drugs to Monoclonal Antibodies for the Treatment oÍ" Cancer, Biocon jugate Chemistry 1 (2) : 89-95 (1990) , errí que todas as " " réfeFêiícias sãô íncMporadas ao' presente como referêncíát' Alêm disso, os conjugados de anticorpos de acordo com 15 a presente invenção podem ser Iigados covalentemente entre si por meio de métodos conhecidos na técnica, tais como o uso dos reagentes reticulantes heterobífuncionais , GMBS (maleimidobutrilóxi succínimida) e SPDP ( 3- (2- piridiltio) propionato de N-succínimidila) (vide, por 20 exemplo, Hardy, Puri fícation and Coupling of Fluorescent Proteins for Use in FI ow Cytometry, Handbook OF Experimental línmunology, Volume 1, Iínmunochemi srtry, Weir et al, (Eds. ) , págs . 31.4-31.2, quarta edição (1986) e Ledbetter et al, Patente Norte-Americana n° 6. 010 .902) - 25 Além disso, anticorpos podem ser Iígados por meio de uma reticulação de tioéter conforme descríto na Patente Norte-Americana Publícada n° 20060216284, E'atente Norte- Americana n° 6.368 .596. Como apreciarão os técnicos no
$' · "S assunto, o's antícorpos podem ser reticulados na região Fab.
'" 'jlk Ein algumas realizações, é desejável que o reticulante quiínico não interaja com a região de lígaçào de antigenos
F do anticorpo, poís isso pode afetar a função de arrtícorpos. g 5 Anticorpos conjugados Os antagonistas de 14-3-3 descritos no presente incluem anticorpos conjugados a compostos orgânicos ou inorgânicos, incluindo, por exemplo e sem límítação, outras - proteínas, ácidos nucléicos, carboidratos, esteróídes e 10 lipídios (vide, por exeniplo, Green et al, Cancer Treatment Reviews, 26: 269-286 (2000). O composto pode ser bioativo.
Bioativo designa um composto que possui um efeito " ' 'fiisiológico sobre"--à- cíéiulà em Comparação" com uma célu1aL"não" " exposta ao composto. Um efeito fisiológico é uma alteração 15 em um processo biológico, que inclui, por exemplo e sem limitações, reprodução e reparo de DNA, recombinação, transcrição, tradução, secreção, rendimento de membrana, adesão celular, transdução de sínal, inorte celular e similares. Urri composto bioativo ínclui compostos 20 farmacêuticos. Em uma realízação, um anticorpo 14-3-3 é conjugado a um peptídeo antagonista 14-3—3, preferencíalmente R-18, preferencialmente por meio de um ligante.
Peptídeos 25 Em um aspecto, a presente invenção fornece antagonistas de 14-3-3 que são peptídeos. Esses peptídeos inclüem peptideos de CDR.
Em uma realizaçào, o peptídeo Iiga-se a uma região da
5"7/124 L'T7
H é'l proteína 14-3-3 qu'e é capaz de Iigar-se a üm antícorpo 6 í' anti-14-3-3 ou outro peptídeo antagonista 14—3-3. O termo
G "peptídeo" ou "'oligopeptídeo", da forma utilizada no í presente, destina-se a englobar análogos de peptídeos, 5 derívados, proteínas de fusão e simílares, bem como composições de peptídeos, que incluem os exeinplificados no presente relatório descritivo. 0 Em uma realizaçào preferída," o. peptídeo compreende a seqüência de arninoácido denominada "R-18". Em urna outra 10 realização preferida, o peptídeo consiste essencíalmente da seqüência R-18. Em uma outra realização preferida, o peptídeo compreende um segmento da seqüêncía R-18. Ern uma ' outra realizaçào"preferida, "o peptídeo.'compreende 'diversas" iterações da seqüência de R-I-8, preferencialmente separadas 15 por um ligante.
Em uma outra realização preferida, o peptídeo liga-se a uma região de proteína 14-3-3 que é capaz de ligar-se a R-18. Em uma outra realízação preferida, o peptídeo liga-se a uma região de proteína 14-3-3 que é capaz de ligar-se a 20 um parceiro de ligação 14-3-3 intracelular, preferencialmente Raf.
Em uma realização, o peptídeo Iíga-se a uma proteína 14-3-3 sem romper a ligação da proteína 14-3-3 a um parceíro de Iigaçào 14-3-3 íntracelular.
25 Em uma realização, o antagonista 14-3-3 é um fosfopeptideo.
Modificações de pept-ídeos Os peptídeos do presente podem ser modificados em uma
!4/ 'd série de formas convencíonaís bem conhecídas dos têcni-cos
K e no assunto. Qualquer número de modifícações pode ser realizado para atingir um peptídeo que possui b" características desejadas. o que é necessário de um 5 peptídeo de acordo com a presente ínvenção é que ele retenha a capacidad.e de funcionar como um antagonista 14-3-
3.
Exemplos de modifícações íncluem os seguintes- O grupo amino terminal e/ou grupo carboxila do peptídeo e/ou 10 cadeias lateraís de amínoácidos podem ser modificados por íneio de alquilação, amidação ou acilação para fornecer ésteres, amidas ou grupos amino substituídos. Os heteroátcmos podem'"ser"-incluídos "em grupos' modiEica"dores" "" alifâticos. Isso é realizado utij-izando métodos sintéticos 15 químicos convencionais. Outras modificações incluem a desamínação de resíduos glutamíla e asparaginila nos resíduos de glutarnila e aspartila correspondentes, respectivamente; hidroxilaçào de prolina e Iisina; fosforilação de grupos hidroxíl-a de seríla ou treonína; e 20 metilação de grupos amíno de cadeias laterais de lísína, arginina e histidina (vide, por exemplo, T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co. San Francisco, Califórnía, 1983).
Eni um outro aspecto, uin ou ambos, normalmente um 25 termínal do peptídeo, podem ser súbstituídos por um grupo Lipofílico, normalmente grupo alífático ou aralquila, que pode incluir heteroátomos. As cadeías podem ser saturadas ou insaturadas. Podern ser convenientemente utílizados
;,í' ácídos graxos, alcoóts e aminas alifáticas disponíveís t-à comercialmente, tais corno ácído caprííi.co, ãcido . cápríco, ¥ ãcido Iáurico, ácido mirístíco e álcool mírístílico, ácido b palmítico, ácido palmitoleico, ácido esteárico e estearil 5 amina, ácido oleico, ácido Iinoleico, ácído docosa- hexaenoico etc. (vide a Patente Norte-Amerícana n°
6.225.444). São preferidos ácidos graxos de ocorrência natural não ramificados com 14 a 22- átomos de carbono de comprimento. Outras moléculas lipofílicas íncluem gliceril 10 lipídios e esteróis, tais como colesterol. Os grupos Iipofílicos podem reagir coín o grupo funcional apropríado sobre o oligopeptídeo de acordo com métodos convencíonaís, - --freqüentemente durante a síntese -"sobre .um suporte, : dependendo do local de fixação do oligopeptídeo ao suporte.
15 A ligação de lipídios é útíl quando os olígopeptídeos puderem ser introduzidos no lúmen do lipossomo, junto com outros agentes terapêuticos para admínistrar os peptídeos e agentes em um hospedeiro.
Em realizações adicíonaís, qualquer um ou ainbos os 20 terminais N e C do peptídeo podem ser estendidos por não mais que um total de cerca de cerri, norma.lmente não mais que um total de cerca de trinta, rnais normalrriente não mais de cerca de vinte aminoácidos, freqüentemente não mais de cerca de nove aminoácidos, em que os arninoácíd'os conterão 25 menos de 25%, mais normalmente menos de 20% de aminoácidos polares, maís especificamente menos de 20% que são amínoácídos carregados. Desta forma, extensões das seqüências acima em qualquer direção são principalmente
E) ij' efetuadas com aminoácidos não carregados Iipofílícos, j'q particularmente aminoácidDs alífáticos não polares e 6 aminoácidos aromátícos. Os peptídeos podem compreender L- , aminoácidos, D-aminoácídos ou ínisturas de D e L- 5 aminoácidos. São contempladas exceções ao número de extensões de aminoácidos quando os oligopeptídeos forem expressos na forma de proteinas de fusão ou quiméricas, conforme descrito abaixo.
Qs peptídeos podem também apresentar—se na forma de 10 oligômeros, especialmente dímeros dos peptídeos, que podem ser de cabeça a cabeça, cauda a cauda ou cabeça a cauda, preferencialrnente com não mais de cerca de seís repetíções .do. peptídeo.-O oligôinero pode conter um ou mais aminoácídos de D-estereoisômeros, até todos os aminoácídos. Os 15 oligômeros podem ou não incluír seqüências ligantes entre os peptideos. Os ligantes apropriados íncluem, mas sem limitações, os que compreendem aminoácídos não carregados e (Gly)n, em qjue n é 1 a 7, Gly-Ser (tal como (GS)n, (GSGGS),, e (GGGS)n, em que n é pelo menos 1), Gly-Ala, Ala-Ser ou 20 outros ligantes flexíveis, conforme conhecído na técnica. Os Iigantes de Gly ou gly-Ser poderri ser utílizados, pois esses aminoácidos sào relativamente não estruturados, o que permite a interação de peptídeos individuaís COIll moléculas alvo celulares e limita perturbações estruturaís entre os 25 peptídeos do oligômero. Deve-se compreender que ligantes diferentes de ami-noácidos podem ser utilizados para construir os peptídeos oIigoméricos.
Os peptídeos podem também encontrar-se em uma forrna b7 m6" b'b È' " estruturalmente restrita, taís como peptídeos cíclicos, preferenci-almente cerca de 9 a 50, no rmalmen te 12 a 36 6 aminoác i-dos, em que aminoácidos dif erentes dos amínoãcidos
P especif icados pociem estar presentes na forma de uma ponte .
5 Desta forrna, a adição de cisteínas terminais permíte, por exemplo, a forinação de pontes de dissulfeto para formar uiil peptídeo de anel. Em alguns casos, pode-se utilizar outras substâncias além de' aminoácidos para ciclizar o peptídeo .
Agentes reticulantes bifuncionais são úteís na Iigação de lO dois ou mais aminoácidos do peptídeo. Outros métodos de f ormação de anéis são conhecidos na técníca; vide, por exemplo, Chen, S. et al, P-roc. Na tl. Acad. Scí . U. S. A. , . .k -- 89:.-. 5872-5876 (1992) , Wu', -- T. P. et- al,. Protein Engineering " 6: 471-478 (1993) ; Ariwer, M. K. et al. , Tnt. j. Pep.
15 Protein Res. 36: 392-399 (1990) ; e Rivera-Baeza, C. et al, Neuropeptides 30 : 327-333 (1996) . Alternativamente, peptídeos estruturalmente restritos são elaborados por nieio da adíção de seqüências de diineri zação às extremídades N e C-terminais do peptídeo, em que a interação entre 20 seqüências de di-merização gera a formação de uma estrutura do tipo cíclico (vide, por exemplo , WO 01/066565) . Em outros casos, qs peptí deos do presente são expressos na forma de fusões a outras proteínas, que fornecem uma estrutura para exibição restríta sobre uma estrutura 25 exposta na superfície, tal como um circuito de uma bobina ou estrutura de volta B.
Dependendo do seu uso pretendido, particularmente para administração a hospedeiros mamíferos, os peptídeos
62/1-24 b· :·'| ,ç pretendídos podem também ser modificados por meio de , ligação a outros compostos para fins de incorporação em moléculas veículo, alteração da bíodisponibilídade de h peptídeos, extensão ou redução da meia vida, controle da 5 distribuição a vários tecidos ou ao fluxo sanguíneo, redução ou aurnento da ligação a componentes do sangue e similares. Os peptídeos desejados podem ser ligados a esses . outros componentes por -ligantes que são dívisíveís ou não' divísíveis no ambiente fisíológico, tal como por MMPS no 10 sinóvio. Os peptídeos podem ser Iigados em qualquer ponto do peptídeo em que u-n grupo funcíonal esteja presente, tal como hidroxila, tiol, carboxil, amino ou similares.
Desejavelmente,- a modificação' ocorrerá.no-termina1'"N ou""nci·"""" terminal C. Os peptídeos desejados podem, por exemplo, ser 15 modificados por meío de ligação covalente de políInerQs, tais COIllO políetileno glicol, polipropileno glicol, d carboxirríetil celulose, dextran, álcool poli-vinílíco, polivinilpirrolidona, políprolina, anidrído (poli)divinilétercomaleico, anidrido (poIi)estireno-c- 20 maleico etc. Polímeros hídrossolúveís, tais como poIietileno glicol e polivínilpirrolidína, conhecidamente reduzem a liberação de ccmpostos ligados do fl-uxo sanguíneo em comparação coin compostos não modifícados. As modificações podem também aumentar a solubilidade em meios 25 aquosos e reduzir a agregação dos peptídeos. O que é necessário é que o peptídeo, quando fornecido e/ou liberado, retenha a função antagonista de 14-3-3.
Conjugados de peptídeos e p-roteínas de fusão i Em uma realização, o peptídeo é conjúgado a mo'l'éculas pequenas para detecção e isolamento dos peptídeos, dirigír k ou transportar o o-Ligopeptideo"a células, tecidos ou órgãos
K específicos. Os conjugados de moléculas pequenas incluem 5 heptenos, que são substâncias que não iniciam uma reação imunológica quando introduzídas por si próprías em um ani.mal. Geralmente, heptenos são moléculas pequenas corn peso ínolecular de menos de cerca de 2 kD e, de maior preferência, menos de cerca de 1 kD. Os heptenos incluem 10 molécuías orgânicas pequenas (tais como' p-nítrofenol, digoxina, heroína, cocaína, morfina, mesealina, ácido, lisérgico, tetra-hidrocanabinol, canabínol, esteróides, -. pentamidina, biotina. etc.). A lígação-"ao"hepteno," .tal como ' para fins de detecção ou puríficação, é realizada com 15 anticorpos específicos de hepteno ou parceíros de Iigação específicos, taís como avidina que líga biotina.
Podem também ser utilizadas moléculas pequenas que . dirigem o conjugado a células ou tecidos específicos.
Compreender-se-á que marcas bem conhecidas na técnica 20 podem tamibém ser fixadas aos peptídeos de acordo COIll a presente ínvenção para uso desses conjugados ern métodos de diagnóstico.
Em uma realização, os peptídeos são lígados a qualquer uma dentre uma arnpla série de outros peptídeos ou proteínas 25 para unia série de propósitos. Os peptídeos podem ser Iígados a peptídeos ou proteínas para fornecer funcionalidades convenientes para li-gação, tais como grupos amino para amida ou forInação de amína substituída, tal como
K: gj" aminação redutiva; grupos tíol para a f'orIaaçãQ de tíoéter 't ou dissulfeto: grupos carboxíla para a formação de amida; e b similares . São de interesse específico peptídeos coir pelo
T menos dois, mais norrnalmente três e não mais de cerca de '5 sessenta grupos lisina, partícularmente polílísinas com cerca de quatro a vinte, norrnalmente seis a dezoito unidades de Iisina, indicadas como si stema de peptídeos .' antigênico múltiplo (MAPS) , em que os peptídeos desejados são ligados aos grupos amino de lisina, geralmente pelo 10 menos cerca de 20%, mais normalmente pelo menos cerca de 50%, de grupos amino disponíveis, para fornecer um produto multípeptideo (Butz, S. et al, Pept. Res. 7: 20-23 (1994) ) .
- Desta forma, são obtídas'· moléculas " qu« contêm uma'"- séri"e, de' " peptídeos dese j ados em que a orientação dos peptídeos 15 desej ados encontra-se na mesma direção; de fato, este grupo de ligação proporciona di ou oIigomerização de cauda a cauda.
Em uma realização, os peptídeos são conjugados a outros peptideos ou proteínas para dirigír o olígopeptídeo 20 a células e tecídos ou agregar funcionalidades adicionais aos peptídeos. Para direcionamento, a proteína ou o peptídeo utilizado para conjugação será selecionado com base na célula ou tecido que é direcionado para terapia (Lee, R. et al, Arth-ritis Rheum. 46: 2109-2120 (2002); 25 Pasqualini, R., Q. j. Nucl. Med. 43: 159-62 (1999); Pasgualínl, R., Natu-re 380: 364-366 (1996)). As proteínas podem taníbém compreender políaminoácidos que incluem, mas sem jimitações, poliarginina e polílisína, ácido
6' 6)' poIiaspártico etc., que podem ser íncorporados a outros 'k ' polímeros, taís como polietíleno glicol, para a preparação
W de bolhas ou partículas que contêm os peptídeos conjugados. b, Em uma realízação, os peptídeos desejados podem ser 5 expressos ou sintetizados em conjunto com outros peptídeos ou proteínas, para que sejam uma parte da cadeia de polipeptídeos, seja interno ou no terminal N ou C para fortnar proteínas quiméricas ou proteínas de fusão. Por "poIipe'ptídeo de fusão", "proteína d'e fusão" ou "proteína 10 quimérica", índica-se no presente uma proteina composta de uma série de componentes de proteína que, embora tipicamente unídos no estado nativo, são ligados pelos terminais amino-e .carbóxi correspondentes"-por meio,""de" -uma "". . t ligação de peptídeo para formar um polipeptídeo contínuo.
15 Apreciar-se-á que os componentes de proteína podew ser Iigados diretamente ou ligados por meio de um ligante/espaçador de peptídeo.
Polipeptídeos de fusão podem ser elaborados para uma série de peptídeos ou proteínas para exibir os 20 oligopeptídeos desejad.os em uma forrrta com conformação restrita, para direção a células e tecidos, para di-reção para compartimentos intracelulares, rastreamento da proteina de fusão ent uma célula ou organísmo e seleção em busca de outras moléeulas que ligam os oligopeptídeos. As 25 proteínas úteis para a geração de prQteínas de fusào incluem diversas proteínas relatoras, proteínas estruturais, receptores da superfície celular, Iigantes de receptores, toxinas e enzímas. ExemplQs de proteínas à jk" incluem proteínas fluorescentes (tais como GFP de Aequodía 't victoria, gfp de Renilla -renifòrmis, GFP de Renilla
E inuel-Zedi, luciferases etc. e suas variantes); j3" h galactosidase; fosfatase alcalina, proteína de ligação de 5 maltose de E. coIi; proteínas de revestimento de bacteriófago filamentoso; receptor de células T; charibdotoxina; e similares.
- As proteínas de fusão tainbém englobam fusões com fragmentos de proteínas ou outros peptídeos, isoladamente 10 ou como parte de uma seqüência de proteína maior. Desta forma, qs polipeptídeos de fusão podem compreender parceiros de fusão. Por "parceiros de fusão"", índíca-se no -presente, uma -seqüência- que é associada ao peptídeo que confere a todos os membros das proteínas naquela classe uma 15 função ou capacidade comum. Os parceiros de fusão podem ser heteról-ogos (ou seja, n.ão nativas para a célula hospedeira) OLl sintéticos (o seja, não nativas de nenhuma célula). As parceiras de fusão incluem, mas não se límitam a: a) estruturas de apresentação, que fornecem os oIigopeptídeos 20 em uma forma estável ou com conformação restrita; b) seqüências de dírecionamento, que permitem a Iocalização do peptídeo para um compartimento subcelular ou extracelular; C) seqüências de estabilidade, que afetam a estabilidade ou a proteção contra a degradação do peptídeo ou do áci-do 25 nucléico que o codífica; d) seqüências lígantes, que ' desacoplam por conformação o olígopeptídeo do parceiro de fusão; e e) qualquer combi-nação dos acima.
Em um aspecto, o parceiro de fusão é uma estrutura de
N gà '\' apresentação. Por "estrutura de apresentação", da forma \ utílizada no presente, índica-se uma seqüência que, quando b fundida aos peptídeos desejados, apresenta os peptídeos em b uma forma restríta por conformação- As estruturas de 5 apresentação preferidas aumentam as ínterações de lígação com outros parceiros de lígação apresentando um peptídeo sobre uma superfície externa exposta ao soIvente.
Geralmente, essas estruturas de apresentação compreendem uma primeira parte Iigada ao termínal N do oligopeptídeo e 10 uma segunda parte ligada à extremidade C-terminal- do oligopeptídeo. Isso significa que o peptídeo de acordo com a presente invenção é inserido nas estruturas de apresentação.- - 'Preferencialmente, ' '"as ' "estiruturas- "'-de""""""·' . . apresentação são selecionadas ou projetadas para que 15 possuam atividade biológica mínima quando expressas nas célul-as alvo.
Preferencíalmente, as estruturas de apresentação maximizam a acessibilidade aos peptídeos por meio da exibição ou apresentação da peptídeo ou um círcuito 20 externo. Est.ruturas de apresentação apropríadas incluem, mas sem limitaçães, estruturas de haste de bobina enrolada, estruturas de mínícorpos, circuítos sobre voltas Bf seqüências de dimerização, estruturas ligadas por cisteína, estruturas lígadas por transglutaminase, peptídeos 25 cíclicos, cilindros helicoidaís, motivos de fecho de leucina etc.
Em uma reali-zação, a estrutura de apresentação é uma estrutura de bobina enrolada, que permíte a apresentação do
,» çj; peptídeo desejado sobre um círcuito externo (por exemplo, t Myszka, D. G. et al, Biochemistry 33: 2363-2373 (1994)), b tal como um doniínio de fecho de leucina de bobina enrolada b (Martin, F. et al, EMBO lÀ 13: 5303-5309 (1994)). A 5 estrutura de apresentação pode também compreender estruturas de inínicorpos, que são essencialmente compostas de uma região complementar de anticorpo mínima. A estrutura de minicorpo fornece geralmente duas- regíões de peptídeos . que são apresentadas ao Iongo de uma úníca face da . 10 estrutura terciária na proteína dobrada (por exemplo, Bianchi, E. et al, j. Mol. Biol. 236: 649-659 (1994); Tramontano, A. et al., j. Mol. Recognit. 7: 9-24 (1994)).
. -. Eiii um outro aspecto",:" a-" estrutura" de. apresentação""" compreende duas seqüências de dímerização. As seqüêncías de 15 dimerização, que podem ser idênticas ou diferentes, associam-se de forma não covalente com afinidade suficiente sob condições fisiológícas para restringir estruturalmente o peptídeo exibido. Desta forma, caso uma seqüência de dirnerização seja utilízada eríí cada terminal do 20 oligopeptídeo desejado, a estrutura resultante pode exíbir o peptídeo desejado em uma forma estruturalínente limitada ou restríta. Diversas seqüências são apropriadas como seqüências de di.nerização (vide, por exemplo, WO 99/51625, incorporada como referência). Qualquer núraero de seqüências 25 de interação entre protei.nas conhecídas na técnica é útil para os propósitos do presente.
Eín um aspecto adicional, a seqüência de apresentação confere a capacidade de lígar íons metálicos para gerar uma b.' 'Hb q Ü,l estrutura secundária coiii conformação res tríta . Desta forma, \'.
:° por exemplo, são utilizadas seqüências de dedos de zinco C2H2 . Seqüências C2H2 contêm duas cisteínas e duas 6 histidinas colocadas de forma a quelar um íon de z ínco .
5 Domíni o s de dedo de zinco conhecidamente ocorrem independentemen"te em diversos peptídeos de dedo de z inco para formar domín io s ligados de forma flexív.el e struturalmente índependent e s (por exemplo, Nakase'ko, Y.· et al, j. MOI . Bi ol . 228: 619-636 (1992) ) . Uma seqüência de 10 consenso geral é (5 aminoácidos) -C- (2 a 3 aminoácidos) -C- (4 a 12 aminoácídos) -H- (3 aminoácidos) -H- (5 amínoácídôs) (SEQ ID N° 66) . Um exemplo preferido seri-a -FQCEEC-peptídeo aleatório -com três a ,vi-nte -aminoácídos-HIRSHTG (SEQ ID '"'N" . 67) . De forma similar, podem ser utilizadas caixas CCHC que 15 contêm uma seqüêncía de consenso -C- (2 aminoácídos) -C- (Ll a 20 peptideos aleatórios) -H- (4 amínoácidos) -C- (SEQ ID N° 68) (Bavoso, A. et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 242: 385-389 (1998) ) . Qutros exemplos incluem (1)-VKCFNC-4 a 20 aminoácidos aleatórios-HTARNCR- (SEQ ID N° 69) , com base na 20 proteína de nucleocapsídeo P2; (2) uma seqüêncía modif icada do peptídeo de ligação de zinco de ocorrência natural do domínio Lasp-l LIM (Hammarstrom, A. et al, .Bíochemistry 35: 12723-32 (1996)); e (3) -MNPNCARCC- 4 a 20 amínoácidos aleatórios-HKACF- (SEQ ID N° 70), com base no conj unto 25 estrutural de NMR IZFP (Hammarstrorri et al, acima) .
Em ainda outro aspecto, a estrutura de apresentação é . uma seqüêncía que cornpreendè dois ou mais resíduos de cisteína, de tal forma que possa ser formada uma Iígação de
H'
S K dissülfeto que resulta errí uma estrutura com conformação í restrita. Isso signifíca que o uso de seqüências de a . peptídeos que contêm cisteína em cada terminal dos b 'C oligopeptídeos desejados resulta em estrutu-ras de peptídeos 5 cíclicos, conforme descrito acima. Uma estrutura cíclica reduz a susceptibilídade do peptídeo apresentado a proteólise e aumenta a acessibilidade às suas rnoléculas _ alvo. Como apreciarão os técnicos no assunto, esta realização específica é particularmente apropriada ao 10 utilizar-se seqüências de direcionamento secretórías para dirigir o peptídeo ao espaço extracelular. Além disso, podem ser utílizadas seqüências que são reconhecídas e . ~ div.ididas . N por proteases, --taís -como'-"'"as. metaloproteases: 'de"" matriz (por exemplo, MMP-I, MMP-3). Estes resíduos são 15 utilizados para formar peptídeos circulares para aumentar a meia vida do peptídeo ou a permeabílidade da mernbrana. A divisão subseqüente do peptídeo circular com a protease apropriada libera a forma Iinear ativa do peptídeo no local desejado.
20 Em uma outra realização, o parceiro de fusão é uma seqüência de direcíonamento. As seqüências de alvo compreendem seqüêncías de ligação capazes de causar a ligação do produto expresso a uma molécula previarnente deteríninada ou classe de moléculas, retendo ao mesmo ternpo 25 a bíoatividade do produto de expressão; seqüências de sinalização da degradaçáo seletiva da proteína de fusão ou parceiros de ligação; e seqüêncías capazes de Iocalízaçào constitutiva de peptídeos para um local celular previamente
·'1 determi-nado. Locais celulares típicos incluem locais 'i s subcelulares (por exeinplo, GoIgi, retículo endoplasmático, » núcleo, nucléolos, membrana nuclear, mítocôndria, bolhas de & secreção, lisosscmos) e Iocais extracelulares utilizando 5 sinais de secreção.
Várias seqüências de direcionamento são conhecidas na técnica, incluindo seqüências de ancoramento de membranas.
Os peptídeos sã.o dirigidos à menibrana por meio de seqüências de sinal e incorporados de forma estável na 10 membrana através de um domínio de transmembrana hidrofóbico (denominado TM). O segmento de TM é posícionado adequadamente sobre a proteína de fusão expressa para - exibir .o peptídeo.- desejjado.· de-·'--forma, 'íntracelular "ou extracelular, conforme conhecido na técnica. É 15 especialmente preferida a apresentação extracelular.
Seqüências de ancoramento de membranas e seqüências de sinal incluem, mas sern limitar-se aos derivados de (a) proteínas de rrtembrana integral classe I tai.s com cadeia [3 receptor de IL-2; Hatakeyama, M. et al, Science 244: 551- 20 556 (1989)) e cadeia B receptor de insulína (Hetakeyama et al, acima); (b) proteínas de inembrana íntegral cIasse II tais como endopeptidase neutra (Malfroy, B. et al, Biochem.
Biophys. Res. Commun. 144: 59-66 (1987)); e (c) proteínas do tipo III tais como citocromo humano P450 NF25 25 (Hetakeyama et al, acima); e as de CD8, ICAM-2, IL-8R e LFA-I. S eqüênc i as de ancoramento de membrana s t ambém inclu ení o GPI âncora, que resulta em uma formação de ligação
'·jl ';t covalente entre a seqüência GPI âncora e a bícamada de "'\% 'lipídio por meiá de um g1ícosilfosfatidi1inositol. 6 Seqüências ãncora de GPI são encontradas em diversa,s 6 proteínas, incluindo Thy-l e DAF (Homans, S. W. et al, 5 Nature 333: 269-272 (1988)). De forma similar, seqüências de acílação permitern a ligação de porções de lipídio, taís como ísoprenilação (ou seja, famesil e geranil-geranil; vide Farnsworth, C. C. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.
A., 91: 11963-11967 (1994); e Aronheim, A. et al-, Cell 78: 10 949-61 (1994)), miristoilação (Stickney, j. T. Methods Enzymol. 332: 64-"77 (2001)) ou pa.lmitoilação. Em um aspecto, o peptídeo desejado será ligado a um grupo de lipídio em um-terminal, de forma que'possa-ser.íigado- a- uma rnembrana de lipídio, tal como um Iipossomo.
15 Em um outro aspecto, a seqüêncía de direcionamento é uma seqüência de sinal de secreção que efetua secreção do peptídeo. Sabe-se que um grande número de seqüêncías de secreção dirige a secreção de um peptídeo no espaço extracelular quando colocado na extremidade amino relatív"a 20 ao peptídeo de interesse, particula.rmente para secreção de um peptídeo por céluZas, incluindo células transplantadas.
Sínais de secreçào apropriados incluíram os encontrados em -G IL-2 (Villinger, F. et al, j. Immuno. 155: 3946-3954 (1995)), hormônio do crescímento (Roskam, W. G. et al, 25 Nucleic Acids Res. J: 305-320 (1979)), pré-proínsulina e proteína influenza HA.
O parceiro de fusào pode compreender ainda uma seqüência de estabilídade, que confere estabílidade à
€ Fa yja ·· proteína de fusão ou ao ácído .nucléico que a codifica. (t '·4 Desta forma, a incorporação de glicinas após a metionina -?) inicial (tal como mg ou MGG), por exemplo, pode estabílizar Ç'* o proteger o peptídeo fundido contra a degradação por ineío 5 de ubiquitinação de acordo com a regra N-termínal de Varshavsky, de forma a conferir q aumento da meia vida em uma célula.
Os aminoácídos adicionais podew ser agregados para marcar o peptídeo para fins de detecção ou puríÊLcação.
ilO Es'tas seqüênci.as podem cornpreender epítopos reconhecidos por anticorpos ou seqüências que ligam Iigantes, tais como ions inetálicos. Várias seqüências de marca e seqüências de . l,igação de ligantes -são bem -conhecidas- na ,- técnica.. - Estas.-, incluem, mas sem Iimitações, póli-histidina (pcm exewplo, 15 rnarcas 6xHis, que são reconhecídas por anticorpos, mas também ligam íons rrietálicos divalentes); marcas póIi- histidina-glícina (póli-his-gly); polipeptídeo de marca flu HA; inarca c-myc; peptídeo de marca (por exernplo, Hopp et al, BioTechnology 6: 1204-1210 (1988)); peptídeo de epítopo 20 KT3; peptídeo de epítopo de tubulina (por exemplo, Skinner et al, j. Biol. Chem. 266: 15163-12166 (1991)); e marca de peptídeo de proteína 10 de gene TJ (por exeínplo, Lutz- Freyerrnuth et al, Proc. Natl. Acad. Sgi. U. S. A. 87: 6363- 6397 (1990)).
25 Os parceiros de fusào ineluem seqüências de ligação e teterização, conforme discutido no presente, para Iigação dos peptídeos e para apresentação dos peptideos erri uma estrutura não obstruída.
-.
"Jb.
# Na presente invenção, podem ser utilizadas combinações "i de parceiros de fusão. Qualquer número de combinações de $' . estruturas de apresentação, seqüências de dírecionamento, )« seqüências de marca e seqüências de estabílidade pode ser 5 utilizado coiil ou sem seqüências de ligação. , Preparação de peptídeos e sais Os peptídeos de acordo com a presente invenção podem ser preparados em uma séríe de formas. A síntese quimíca de peptideos é bem conhecida na técnica. A síntese de fases 10 sólidas é coinumente utilizada e diversos aparel-hos sintéticos comerciais são disponíveis, taís como sintetízadores autornatizados pela Applied Bíosystems In-c., . --- Foster Ci-ty, . Cali-fórnia; Beckman-,etc. - Podem também- ser - . utilizados ínétodos sintétícos de fase de solução, 15 particularmente para produções em larga escala. Utílizando estes métodos sintéticos, os aminoácidos de ocorrência natural podern ser substituídos por aminoácidos não naturais, particularmente D-estereoisômeros, e com aminoácidos com cadeias Iaterais que contêm díferentes 20 comprímentos ou funcionalidades. Os grupos funcionais para conjugação a moléculas pequenas, partes de marcas, peptídeos ou proteínas, ou para fins de formação de peptídeos ciclizados, podem ser introduzidos na molécula durante a síntese química. Além disso, moléculas pequenas e 25 partes de rótulos podem ser ligadas durante o processo síntético. preferencialmente, a introdução dos grupos
V funcionais e conjugação a outras moléculas afetam mínimamente a estrutura e a fu-nção do peptídeo desejado.
¶ + k Os peptídeos de acordo com a presente invenção podem 't; também estar presentes na forma de sal, geralmente na forma Kt ç- de sal que é farrnaceuticamente aceítável. Estes incluem '6' sais inQrgânicos de sódio, potássio, lítio, amônio, cáj-cio, 5 magnésio, ferro, zínco, cobre, rnanganês e similares. Vários sais orgânicos do peptídeo podem também ser elaborados com, incluindo, inas sem limitações, ácido acético, ácido propiônico, ácido pirúvico, ácido maléíco, ácido succíníco, ácido tartárico, ácido cítrico, ácid.o benzóico, ácido 10 cinâmico, ácido salícílico etc.
A síntese dos olígopeptídeos e seus derivad.os pode tanibém ser conduzida utilizando métodos recombinantes. Para
W p'rodüçãQ recombinante, pode ser' el-aborada uma" seqüência.:de'""'"" , t ácidos nucléicos que codifica um único oligopeptídeo ou, 15 preferencialmente, uma série dos peptídeos desejados eíri conjunto com um amínoácido ou seqüência interveniente, o que permite a divisão no peptídeo isolado ou dímeros cabeça a cauda. Quando meticmína ou triptofano estiver ausente, pode ser íncorporada uma metíonina ou t.riptofano 20 interveniente, o que perínite a clivagem de aminoácídos ísolados utílizando CNBr ou BNPS-Skato1e (2-(2- nitrofenilsulfeni1)-3-metil-3-bromoindolenina), respectivamente. Alternativamente, a clívagem é realizada utíLizando seqüências que são reconhecidas por proteases 25 específicas para divisão enzimática ou seqüências que agem coiro loeais de autodivisão (taís como seqüências 2A de aftovírus e cardiovírus: Donnelly, M. L., lj. Gen. Vírol.
78: 13-21 (1997); Don-nelly, M. L., J. Gen. Virol. 82: 1027-
£' X, E¶ ·41 (2001)). O peptídeo desejado pode também "&er parte de tnn '% pePtídeo maior, que pode ser isolado, é o oligopept'ídeo 6 .
obtido por meio de clivagem proteolítica ou divisão
Q quími-ca. A seqüência específica e a forma de preparação 5 serão determinadas por meio de convení'ência, economía, pureza necessária e sirniíares. Para preparar essas -' composições, um gene que codifica um peptídeo específico, È pro"teína ou proteína de fusão é ligado a uma seqüência de DNA que codifíca os oIigopeptídeos de acordo com a preéerlte lO ínvenção para formar um ácído nucléico de fusão, que é introduzido ern um vetor de expressão. A expressão do ácido nucléico de fusão encontra-se sob o controle de um promotor '."apropriado' " e outras"" seqüêncías' de.."contro-1e,""""""conforme'-:" defínído abaixo, para expressão em um organisrno ou célula 15 hospedeíra especifica (Sambrook et al, Molecular Biology: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY. (terceíra edíção, 2001); Ausubel, F. et al, Current Protocols in Molecula-r Biology, John Wíley & Sons, Nova Iorque NY (atualizações até 2002) (1988)).
20 Para a conjugação de várias moléculas aos peptídeos de acordo com a presente invenção, grupos funcíonaís sobre os , oligopeptídeos e a outra molécula reagem na presença de um . agente de conjugação (tal como de reticulação) apropriado.
O tipo de agente retículante ou de conjugação utilizado 25 dependerá dos grupos funcionais, tais corrto aminas primárias, sulfidrilas, carbonílas, carboidratos e ácidos carboxílicos sendo utilizados. Prefereneialmente, grupos funcionais reativos sobre o oligopeptídeo não selecionado A ' )
&g s7 para modificação são protegidos antes do acoplamento do 'r. peptíde.o ou outras moléculas relativas para limitar reações £? . colaterais índesejadas. Por "grupo protetor",, da forma @ ' utilizada no presente, entende-se uma molécula Iígada a um 5 grupo funcíonal específico que é seletivamente rentovível pa-ra expor novamente o grupo funcional (Greene, T. W. e Wuts, P. G. M. P-rotective Groups in Organic Synthesís, john Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque (terceira edição, 1999))- Os peptídeos podem ser sintetizados cqiq precursores de 10 arrtinoácidos protegidos ou reagem COIll grupos protetores após a síntese, mas antes da reação com agente reticulante. As conjugações podem também ser indiretas, ligando, por ' . ,, ."exemplo, umá'""'parte 'de"'bíotina,' que"pode ent·rar em contato """ " corn um composto ou molécula que é acoplado a estreptavidína 15 ou avidina.
Para oligopeptídeos que possuem ativídade reduzida na forma conjugada, errí uma realização preferída, a ligação entre os oligopeptídeos e o composto conjugado é seleci-onada para que seja suficientemente instávej- para 20 resultar erri divisão sob condições desejadas, taís corao após o transporte para células ou tecidos desejados. Ligações covalentes biologícamente instáveis, tais como Iigações imino e ésteres, são bem conhecidas na técnica (vide, por exemplo, a Patente Norte-Americana n° 5.108.921). Estas 25' modifícações permitem a administração dos oligopeptídeos em uma forma potencialmente menos ativa, que é ativada em seguida por meio de clivagem da Iigação instável.
Ácidos nucléicos, vetores de expressão e métodos de
% "b · introdução %. G, Antagonistas de 14-3-3 que são proteínas, incluind'o peptideos e anticorpos, podem ser sintetizados uti1izanM 0 ácidos nucléi-cos que as c.odificam. Isso pode ser realizado 5 para produzir antagonístas de 14-3-3 que são isolados eni seguida para uso. Alternativamente, esses ácidos nucléícos podem ser utilizados terapeuticamente. r Eiu uma realização, os ácidos nucléicos são cIanados em vetores de expressão e introduzidos em células ou um 10 hospedeíro. Os vetores de expressão são vetores extracromossômicos autorreprodutores ou vetores que se integram ao crornossomo hospedeiro, tais corno vetores corri '" ' " Base'"em'retroCírus, 'v"étÒres""'com séqüências dé reccünbínaçãc' específicas de Iocal ou por meío de recornbinação homóloga.
15 Geralmente, esses vetores íncluem seqüências de controle ligadas operativarnente aos ácidos nucléícos que codificam os oligopeptídeos. Por "seqüêncías de controle", indíca-se seqüências de ácido nucléi-co necessárias para expressão dos peptídeos desejados eni urrt organismo hospedeiro específico.
20 Desta forrria, as seqüências controZe incluem seqüências necessárias para a transcrição e tradução dos ácidos nucléicos, que incluem, rnas sem lirnitações, seqüências promotoras, seqüências ativadoras de transcríção ou amplificadoras, locaís de Iigação robossômíca, seqüêncías 25 de inícío e parada de transcrição, sinais de poliadenilação etc . Em uma realização preferída, a céluía é um fibrobl-asto ou uma célula FLS. preferenciajmente, a célula é uma célula
6) sinovial. Preferencialmente, a célula é elaborada para 0"·' jn expressar um antagonista de 14-3-3. A célula pode ser manípulada in vitro e introduzida em um recipiente. 0 Alternativamente, a célula pode ser manipulada ín vivo.
5 Diversos promotores são úteis na expressão dos peptídeos de acordo com a presente invenção. Os promotores podem ser constitutivos, índutíveis e/ou específicos de células e podem compreender promotores naturaís, promotores siritéticos (tais como promotores indutívei-s de tetracíclina 10 tTA) ou híbridos de vários promotores. Os promotores são selecionados com base, entre outras considerações, na célula ou organismo em que as proteínas devem ser
P expreSsaS, nò ní'vel de expressão desejado e .em qua.lquer -- -.
regulagein de expressão desejada. Os promotores apropríados 15 são promotores bacterianos (tais como promotor de fago pLl, promotor TAC, promotor lac etc.); promotores coín base em leveduras (tais coiilo promotor de GAL4, promotor de álcool desidrogenase, prornotor de triptofano síntase, promotor de CUPI i-ndutível por cobre etc.), promotores de plantas (tais 20 como CàMV S35, promotor nopaííno sintase, promotor de vírus mosaíco do fumo etc.), promotores de ínsetos (taís como vírus da póli-hedrose nuciear Autographa, DNV Aedes viral p7 e p'61, hsp70 etc.) e promotores da expressão de células de niamiferos (tais como promotor do gene ubiquitina, 25 promotor do gene ribossômico, prornotor de j3-globina, promotor de timídino quinase, promotores de proteínas de choque de calor e promotores de genes ribossômícos etC.)r particularmente promotores virais, tais como promotor de z citomegalôv'írus (CMV), prcmotor de Simian vírus (SV40) e "l promotores retrovirais. . 6 Por "lígado operativamente'" no presente indíca-se que
6. um ãcido nucléico é colocado em rel-ação funcional com urna 5 outra seqüência de ácido nucléíco. No contexto do presente, J-igado operativamente indica que as seqüências de controle são posicionadas corn relação à seqüência de ácídos nucléicos que codifica os antagonístas de 14-3-3 do presente de forma a ocorrer a expressão do antagonista 10 codificado. Os vetores podeín coinpreender plasmídeos ou compreender vetores virais, tais como vetores retrovirais, que são sistemas de fornecimento úteis caso as células + 'µ.
sej'am células' ""em diCisão" "cíú' fvetores'" lentívirais ".e e adenovirais caso as células sejam células sem divisão. São 15 particularmente preferidos os vetores retrovirais autodesativadores (vetores SIN), que contêm promotores virais desatívados ein 3'-LTR, de forma a permitír o controle da expressão de genes heterólogos utilizando promotores não viraís no vetor viral (vide, por exemplo, 20 Hofmann, A. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. s. a., 93: 5185-5190 (1996)). Como apreciarão os técnícos no assunto, ' modificações do sistema por meio de pseudotipíficação permitem o uso de vetores retrovirais para todas as células eucaríóticas, partícularmente para eucariotes superiores 25 (Morgan, R. A. et al, j. Vi-rol. 67: 4712-4721 (1993); Yang, Y. et al, Hum. Gene Ther. 6: 1203-1213 (1995)).
Além dísso, os vetores de expressão também contêm um gene marcador selecionável para permitir a seleção de é« ' células hospedeiras transformadas. Geralmente, a seleção "g
P conferirá um fenótipo detectável que enriquece as células que contêm o vetor de expressão e permite ainda a
G diferenciação entre células que expressam e que não 5 expressam o gene de seleçáo. Os genes de seleção são bem conhecidos na técnica e variarão com a célula hospedeíra utilizada. Genes de seleção apropriados incluem genes que tornam a célula resistente' a uma droga, genes que permitem " o crescimento em rneios com deficiência de nutrientes e 10 genes relatores (taís como [3-ga1actosídase, proteínas fluorescentes, glucouronidase etc.), todos os quaís são bem conhecidos na técníca e disponíveis para' os técnícos no u" - ..—-- e assunto. t " d - · '"-'· -- Existe urna série de rnétodos disponíveis para a 15 introdução de ácidos nuclêicos em célul-as viáveis- "Introduzido"' indica no presente que o ácido nucléíco entra na célula de forma apropríada para expressão subseqüente do ácido nucléico. Métodos de introdução dos ácídos nucléícos variarão dependendo se o ácido nucléíco é transferido ín 20 vitro em células cultivadas ou in vivo para as células do organismo hospedeiro pretertdido e também dependerão do típo de organismo hospedeiro. Métodos de introdução dos ácídos nucléicos in v-it_ro incluem o uso de lipossomos, Lipofectin®, eletroporação, microínjeção, fusão celular, 25 DEAE dextrano, precipitação de fosfato de cálcio e bombardeío de partículas bíolísticas. Os métodos de transferência in vivo ínclueni a íntrodução direta do ácido mucléico, uso de vetores virais, tipicamente vetores
Y',? q retrovirais, e transfecção mediada por lipossomo's, ke 2' incluíndo transfecção mediada por lípossomos re'vestidos virais. Os ácidos nucléicos que expressam os antagonistas e de 14-3-3 de acordo com a presente invenção podem existir 5 de forma transitória ou estável na célula ou íntegrar-se de fo'rma e'stável ao cromossomo do hospedeiro.
Em algtnnas sítuações, é desejável- incluir um agente que se direcione às células ou tecidos alvo, tal como um anticorpo específico para uma proteína da superfície 10 celular ou célula alvo, tal como um fíbroblasto ou célula de FLS, um ligante para um receptor sobre a célula alvo, um componente de Iipídío sobre a menbrana celular ou um '_m':' carboidr"ato ' sobre a superfícíe celular. Caso sejam empregados lipossomos, proteínas que ligam uma proteína da 15 superfície celular que sofre endocitose podem ser utilizadas para dirigir e/ou facilitar a absorção. Estas incluern, como exemplos não limitadores, proteínas de capsídeos ou seus fragmentos trópicos par'a tipos de células específicos, anticorpos para proteínas que sofrem 20 internalízação (Wu, G. Y. et al, j. Bíol. Chem. 262: 4429- 4432 (1987); Wagner, E. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.
A. 87: 3410-3414 (1990)) ou aumentam a meía vida in vivo.
A expressão é realizada em uma ampla variedade de células hospedeiras que cobre procariotes e eucariotes, 25 incluindo bactérías, leveduras, plantas, insetos e animais.
Os oIigopeptídeos de acordo com a presente ínvenção podem ser expressos, entre outros, em E. coIi, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pombe, plantas de fumo ou
4' Arabidopsis, células Schneider de insetos e células de , a' Òk mamíferos, tais como COS, CHO, HeLa e sirnilares, seja de forma intracelular ou secretada por meio de fusão dos g, peptídeos a um peptídeo de sinal apropriado. A secreção da 5 célula hospedeira pode ser realizada fundindo-se o DNA que codifica o oligopeptídeo e um DNA que codifíca um peptídeo de sinal. Sinais de secreção são bem conhecidos na técnica para bactérias, Ieveduras, ínsetos, plantas e sistemas de Inamíferc)s. Os ácidos nucléícos que expressam os 10 oligopeptideos podem ser inseridos em células, tais ccmo células haste para expressão em tecidos ou bactérias para expressão no intestino e as células, .transplantadas no hospe"deiÍ!io" -"""paía forríecer uma"" fonte in .""v-i.vo dos oligopeptídeos.
15 Peptídeos purificados Em uina realização preferida, os oIigopeptídeos de acordo com a presente invenção podem ser purificados ou isolados após a síntese ou expressão. "Purificado" ou "isolado" indicam Iivre do ambíente no qual o peptídeo é 20 sintetizado ou expresso e em uma forma onde possa ser utilizado de forma prática. Desta forma, por purificado ou isolado, indica-se que c) peptídeo ou seu derívado é substancialmente puro, ou seja, maís de 90% puro, preferencialmente rriais de 95% puro e, preferencialmente, 25 rnais de 99% puro. Os olígopeptídeos e seus derivados podem ser purificados e isoíados por meio de niétodos ccmhecidos dos técnicos no assunto, dependendo de outros componentes " presentes na amostra. Os rriétodos de purificação padrão
¶.4, incluem métodos el-etroforéticos,
G imunológícos e K! cromatográficos, incluindo troca de íons, hidrofóbicos, ,> }, afínídade, exclusão de tamanho, HPLC de fase reversa e + cromatoconcentraçào. As proteinas podem também ser 5 purificadas por meio de solubilidade seletiva, tal como·na presença de sais ou solventes orgânícos. O grau de purificação necessário variará, dependendo do uso dos oligopeptídeos desejados. Desta forma, em a1guns casos, a puri-ficação não será necessáría.
10 Para a maior parte das aplicações, as composições utilizadas compreenderão pelo menos 20% em peso do produto desejado, mais comumente pelo menos cerca de 75% em peso, preferencialmente" '"p"elo menoS"cerca de 95% em peso' e, . - normalmente, pej-o menos cerca de 99,5% em peso, com relação í5 aos contawinantes relacionados ao método de preparação de produto, procedimento de purificação e seu uso pretendido, tal como com um veículo farmacêutíco para os propósitos de tratamento terapêutico. Normalrnente, os percentuais serão baseados no total de proteína.
20 Composições farmacêuticas, administração e dosagens Os antagonistas de 14-3-3 de acordo ccnn a presente invenção podem ser incorporados em composições . farmacêuticas apropriadas para administração a um paciente. TipÍcamente, a composição farmacêutíca compreende um 25 antagonista de 14-3-3 de acordo com a presente ínvenção e um veiculo farmaceuticamente aceitável. Da forma utilizada no presente, "veículo farmaceuticamente aceitável"' inclui todo e qualquer solvente, rneío de dispersão, revestimento,
Cl m age-ntes antibacterianos e antífúngícos, agentes de
4. B, retardamento da absorção, isotônícos e símilares que sejam fisiologicamente compativeis. Exemplos de veículos € farmaceuticamente aceítáveis íncluem um ou ínais dentre 5 água, solução salina, solução salina tamponada com fosfato,
L dextrose, glicerol, etanol e similares, bem como suas combinações. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, tais como açúcares, poIiálcoois tais como Inanitol, sorbitol ou cloreto de sódío na composíção.
lO Exemplos de siibstâncias farmaceuticamente aceítáveis são agentes umectantes ou quantidades pequenas de substâncias auxiliares, tais como agentes umectantes ou emulsificantes, conservantés" "ou tarnpões,' que "aumentem- a·vida' útil ou a" eficácia do antagonista de 14-3-3.
15 Os antagonistas de 14-3-3 são dirigidos à proteína 14- 3-3 que se encontra em Iocalização extracelular.
Conseqüentemente, são formuladas composições terapêutícas e a adruínistraçáo é tal qjue o antagonista 14-3-3 fornecído desta forma é disponível para dírígír-se à proteína 14-3-3 20 extracelular.
As composições de acordo com a presente ínvenção podem apresentar-se ern uma série de forrnas. Estas íncluem, por exemplo, forinas de dosagem líquídas, semi-sólidas e sóIidas, tais como soluções líquídas (por exemplo, soluções 25 injetáveis e em infusão), dispersões ou suspensões, pastilhas, pílulas, pós, lipossomos e supositórios. A forma preferida depende do modo pretendido de administração e aplicação terapêutica. As composíções preferidas típicas . T b '"b.
encontram-se na forma de soIuções injetáveis ou em infusão, ·1' &, " tais como composições síMIares às utilizadas para a imunização passiva de seres humanos com outros anticorpos. .k' O modo de administração preferido é parenteral (tal como 5 intravenoso, subcutâneo, intraperitoneal, intramuscular, em que intracapsular é de preferêncía especial). Em uma realização, o antagonista de 14-3-3 é admínist.rado por meio de infusão ou injeção intravenosa. Em uma outra realização preferida, o antagonista de 14-3-3 é admínistrado por mei-o 10 de injeção intrarnuscular ou subcutânea. Em uma realização preferida, é realizada injeção direta no sinóvio. . As coruposições terapêuticas devem tipicamente ser -"T «" - " ' eStéreis" e "estãveis" "èo6""'â"s cohdições " de fabrícação e" arrtiazenagem. A composição pode ser formulada na forma de 15 solução, microemulsão, dispersão, lipossomo ou outra estrutura ordenada apropriada para alta concentração de droga. Soluções injetáveis estéreís podem ser preparadas por meio da incorporação do comoosto ativo na quanti-dade necessária em urri soIvente apropríado com um ou uma 20 coWinação de ingredientes enumerados acirna, seguida por esterílízação filtrada. Geralmente, dispersões são preparadas por meio da incorporação do composto ativo etn um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os dernaís ingredíentes necessários dentre os enumerados acima.
25 No caso de pós estéreís para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são secageni a vácuo e secagem por congelamento, que gera u-m pó do ingrediente atívo mais qualquer íngrediente desejado g, adicíonal de uma soLução filtrada estéril antèri'ormehte. a b b, fluidez adequada de uma solução pode ser mântida, pór exempl-o, utilizando um revestimento tal como Ieci-tina, pel-a
E manutenção do tamanho de particula necessário no caso de , 5 dispersão e utiíizando tensoativos. A absorção prolongada de composições injetáveis pode ser causada pej-a inclusão na composição de um agente que retarda a absorção, tal como sais de monoestearato e gelatina.
Os antagonistas de 14-3-3 de acordo com a presente 10 invenção podem ser adminístrados por meío de uma série de métodos conhecidos na técnica, q'ue incluem infusão ou injeção intravenosa. A"administração direta ao s1Mvio é "uma' vi"a 'prefeuda'""déjadIniniStraçãot" 'Como apreciarão .os " técnicos no assunto, a via e/ou o modo de adininistração 15 variarão dependendo dos resultados desejados. Em certas realizações, o composto ativo pode ser preparado com um veicuj-o que protegerá o composto contra liberação rápida, tal como uma formulação de liberação controlada, incluíndo implantes, emplastros transdérmicos e sístema de 20 fornecímento microencapsulado. Podem ser utílizados polímeros biocompatíveis biodegradáveís, taís coiro etil-eno vinil acetato, polianidridos, ácido poIiglícólico, colágeno, poliortoésteres e ácido po1i1áctíco. Muitos métodos de preparação dessas formulações são patenteados ou 25 geralmente conhecidos dos técnícos no assunto. Vide, por exemplo, Sustained" and Controlled Release Drug Delivery Systems, j. R. Robinson, Ed., Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, 1978. A tecnologia de formulação representativa é ensinada, entre outros, em Remington: The Scíence and ü: Practice of Pharmacy, 19" edição, Mack Publishing Co., b Easton, PA (1995) e Handbook of Pharmaceutical Excipients,
E terceíra edição, Kibbe, A.H. ed., Washíngton DC, American 5 Fharmaceutical Association (2000).
Em certas realízações, um antagonísta de 14-3-3 de acordo com a presente invenção pode ser admínistrado oralmente, por exemplo, coin um díluente ínerte' ou um veículo comestível assimilável+ O composto (e outros 10 ingredientes, se desejado) pode também ser incluído em urna cápsuia de gelatina corn cobertura inole ou dura, comprimido eni pastilhas ou incorporado diretamente à alirnentação do paciente. Para"adIníni'stráçáo ter@êíiticabral, os" Compostos" podem ser incorporados a excipientes e utilizados na forma 15 de pastilhas ingeríveís, pastilhas bucais, expectorantes, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, wafers e similares. Para administrar um composto de acordo com a presente invenção de outra forina além da adininístraçào parenteral, pode ser necessário revestir ou coadministrar o 20 composto COIll um materíal que evite a sua desativação.
Compostos ativos suplernentares podem tanibém ser 'incorporados às composições. Em certas realizações, um antagonista de 14-3-3 de acordo com a presente invenção é coforinulado e/ou codministrado com um ou mais agentes 25 terapêuticos adicíonais, taís como DMARD ou DMOAD. Essas terapias de conibinação podem utilizar convenientemente dosagens mais baixas dos agentes terapêuticos administrados, de forma a evitar possíveís toxicidades ou
K compliCações associadas às díversas monoterapias.
4. AS composições farmacêuticas de acordo corn a presente h invenção podem incluir un.a "quantidade terapeuticamente . b eficaz'" ou uma "'quantidade profilaticamente efícaz'" de um 5 anticorpo de acordo com a presente ínvenção. "Quantidade terapeuticamente eficaz" designa uma quantidade efícaz, ern dosagens e por periodos de tempo necessários, para atingir o resultado terapêutico desejado. Uma quantidade terapeuticamente eficaz do antagonista de 14-3-3 pode 10 variar de acordo com fatores tais como o estado da doença, idade, sexo e peso do indiv"duo, bem como a capacidade do antagonista de 14-3-3 de permitir uma reação desejada no indivíduo. . Quantidade terapeuticamente"' .efí'caz"" também é"'- aquela em que qualquer efeito tóxico ou prejudicial do 15 anticorpo é superado pelos efeitos terapeuticamente benéficos. "Quantidade profiíatícamente eficaz'" designa u-ma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para atingir o resultado profilático desejado.
Tipicamente, como a dose profilátíca é utilízada em 20 pacientes antes ou em estado ínicial da doença, a qµantidade profilatícamente efícaz será menor que a quantidade terapeuticamente efi-caz.
Os regimes de dosagem podem ser ajustados para fornecer a reação desejada ideal (tal como uma reação 25 terapêutica ou profílática). Uma úníca mistura pode ser administrada, por exemplo, diversas doses divididas podem ser administradas ao Iongo do tempo OLl a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada conforme indícado
Gn pelas' exigêncías da sítuação terapêutica. É especialmente ÇB vantajoso formular composições parenteraís em forma de b dosagem unitária por facílidade de administração e ê uniformidade de dosagem. Forrna de dosagem unítária da forma ¶ 5 utilizada no presente designa unidades fisicamente discretas apropriadas como dQsagens unitárias p.ara os paciehtes marrtíferos a serem tratados; em que cada unidad'e contém uma quantídade previamente de"termínada de compost-o ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado 10 em associação com o veiculo farmacêutico necessário. A especificação das formas de dosagem unitária de acordo com a presente invenção é ditada (a) pelas características ""'" e"xclusivàs do composto ativo·"e pe1o""efeito terapêutico ou profilático específico a ser atingido; e (b) pelas 15 li-mitações inerentes na técnica de corríposição desse composto ativo para o tratamento de sensibilidade em indivíduos, e é díretamente dependente deles.
Um exemplo de faíxa não límitadora para uma quantidade terapêuti-ca ou profilaticament-e eficaz de um anticorpo de 20 acordo com a presente ínvenção é de 0,1 a 20 mg/kg, de maior preferência de 1 a 10 mg/kg. Deve-se observar que cjs valores de dosagem podezn variar com o tipo e a severídade da condição a ser alíviada. Deve-se compreender adicionalmente que, para qualquer paciente específico, os 25 regimes de dosagem específicos deverão ser ajustados ao longo do teínpo de acordo com a necessidade individual e o julgamento profissional da pessoa que administra ou supervisiona a administração das composições e que as
5+: faíxa's de dosagem descritas no presente são apenas exemplos "í e não se destínam a Iimitar o escopo ou a prátíca da b coinposição reivindicada.
L As colnposições farmacêuticas descrítas no presente 5 podem ser apresentadas em recipíentes com dose unitáría ou múltiplas dosagens, tais como ampolas vedadas. Esses recípientes são típicamente vedados de forma a preservar a esterilidade e a estabilidade da formulação até o uso- Em geral, formulações podem ser armazenadas na forma de 10 suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos, conforme indicado acima. Alternativamente, urría composição farrrtacêutica pode ser armazenada em uma condíção . " seca por congelamento"que necessita apenas da ,adíção_de'um :' " veículo liquido estéríl- iniediatamente antes do uso.
15 Uso terapêutico de antagonistas de 14-3-3 Por "tratamento"' no presente, indica-se tratamento terapêutico ou profilático, ou uma medida supressi-va para a doença, distúrbio ou condição indesejável. o tratamento engloba a adininístração dos antagonístas de 14-3-3 do 20 paciente de forma apropriada antes do início dos sintomas da doença e/ou após manifestações clínicãs, ou outras manifestações, da doença para reduzír a severidade da doença, suspender c) progresso da doença ou eliminar a doença. A prevenção da doença inclui c) prolongamento ou o 25 retardamento do ínício dos sintomas do distúrbio ou doença, preferencialmente em pacíentes corri maior susceptibilidade à doença. .
Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos de
Y% tE'atame-nto de artrite, incluíndo mêtodos de trátàmento de S espondilite anquilosante, Mal de Behcet, hiperostose b esquelética idiopática dífusa (DISH), Síndrome de Ehlers- b Danlos (EDS), Síndrome de Felty, fibromialgia, gota, 5 artrite infecciosa, artrite juvenil, lúpus, doença de tecido conectivo rnisturado (MCT'D), osteoartrite, Mal de Paget, polimialgia reumática, polimiosite e dermatomiosite, pseudogota, artrite psoriática, Fenômeno de Raynaud, artrite reativa, artríte reumatóíde, escleroderma, Síndrome 10 de Sjàgren, Mal de Still e granulomatose de Wegener.
Geralmente, os métodos compreendem a adminístração de um antagonista de 14-3-3 a um paciente, seja isoladamente r' " ü Ôu em combinaçãÒ" cÕin outíjos "agentes- terapêutícos . para' . -' auínentar a eficácia do tratamento.
15 Métodos de seleção de antagonístas de 14-3-3 Em um aspecto, a présente invenção fornece rnétodos de seleção de antagonistas de 14-3-3. Os compostos selecionados podem variar de pequenas moléculas orgânícas até polímeros e biopolímeros grandes, podendo incluír, como 20 forma de exemplo e não de limitação, pequenos compostos orgânicos, sacarídeos, carboidratos, poIíssaçarídeos, lecitinas, peptídeos e seus análogos, poIipeptídeos, proteínas, anticorpos, oIigonucleotídeos, poIinucleotideos, ácidos nucléicos etc.
25 Em uma realização, os possíveis compostos selecionados são moléculas orgânicas pequenas, preferencialmente que possuam um peso molecular na faixa de cerca de 100 a 2500 daltons, embora possam ser utílizadas outras rnoléculas.
* % Essas possíveis moléculas freqüentemente compreenderão 4 estruturas ciclicas compostas de átomos de carbono ou ¥ misturas de átomos de carbono e u-m ou mais heteroátomos e e/ou estruturas aromáticas, poliaromáticas, 5 heteroaromáticas e/ou poliaromáticas. Os possíveis agentes podern incluir uma ampla variedade de substítuintes de grupos funcíonais. Em uma realízação, Cj(S) substítuínte(s) é(são)" selecionado(s) independentemente a partir do grupo de substituintes que conhecidamente ínteragem com 10 proteínas, tais como grupos amina, carboni1a, hidroxila e carboxila.
Os possíveis compostos podem ser selecionados com base -. " "em"'"cada" composto ou, "alternat-ivamente, 'utilizando uin" dos ' diversos métodos de biblioteca comumente empregados na 15 técnica. Bíbliotecas de compostos combinatórios sintéticos, bibliotecas de produtos naturais e/ou bibliotecas de peptídeos podem ser selecionadas, por exemplo, utílizando os testes de acordo coín a presente inverição para identificar compostos que competem com um ligante 14-3-3 20 para ligação a uma proteína 14-3-3. Estes testes de ligação competitivos podem identificar Compostos que ligam a proteína 14r-3-3 aproximadamente no mesmo Iocal do ligante 14-3-3. Diversos métodos de condução de testes de lígação competitiva são conhecidos na técnica. Qualquer desses 25 métodos pode ser empregado na presente ínvenção.
Esses experimentos de Iigação podem ser conduzidos integralmente em solução ou, alternativamente, utilízando urn suporte sólido, tal coiro uma esfera de vidro ou outra,
ou uma superfície sólída, tal como o fundo de uma placa de 'í Petri, para irnobilizar um reagente. A imobilização pode ser
F mediada por meio de interações nào covalentes ou de
G interações covalentes. São bem conhecidos os métodos de 5 irnobilização. de diversos tipos de compostos e proteínas sobre suportes sóLidos. E'ode-se utilizar qualquer desses Mtodos.
sejam eles conduzidos em soIução ou com uma proteína 14-3-3 imobilizada ou possível coinposto, a proteína 14-3-3 10 e o possível coinposto são tipícamente colocados em contato entre si sob condições que conduzem à ligação. Einbora as condíções reais utílizadas possam variar, os testes de 1Íga"ção '"são °tipiCamente conduzidos.". sob ;condíções",.
fisiológicas. As concentrações reais apropriadas para um 15 teste específico serão evídentes para os técnicos no assunto.
Em uma realização, os testes comp'reendem adicionalmente testes funcionais da capacidade de um possÍvel agente de antagonizar a atividade de proteína 14- 20 3-3. Em uina realização, os testes compreendern a determinação da capacidade de um possível agente de reduzir a indução de MMP por uma proteína 14-3-3. Em uma realização, o possível agente é misturado com proteína 14- 3-3 e a Mstura pode ser adícionada a células capazes de 25 induzír MMP ein resposta à proteína 14-3-3. Em uma outra realização, o possível agente é adicionad'o com proteína 14- 3-3 a células capazes de índuzirem MMP em resposta à proteína 14-3-3. podem ser real.izados outros testes
"4 funcionais que medem a capacidade de um possível agente de q inibir a capacidade de urna proteína 14-3-3 de induzir uma » alteração mensurável em células, preferencialmente r- fibroblastos ou células FLS e, desta forma, caracterizar o 5 candidato como u-u antagonísta 14-3-3.
M Todas as citações do presente, incluíndo as relacionadas abaíxo, são expressamente incorporadas integralInente ao presente corno referêncía.
PARTE EXPERIMENTAL 10 Tabela 1 WítoEos 14-3-3 Eta ' SEQ ID N° 1 93-107 hélice LE'TVCNDVLSLLDKF ' - ".: .-' · SEQ ID N° 2 191-199 hélíce " EQACLLAKQ" " """ - SEQ ID N° 3 144-155 hél-ice NSVVEASEAAYK SEQ ID N° 4 144-152 hélíce NSVVEASEA SEQ ID N° 5 147-155 hélice VEASEAAYK SEQ ID N° 6 163-170 hélice EQMQPTHP SEQ ID N° 7 168-177 hélice THPIRLGLAL SEQ ID N° 8 I 82-92 hélice VKAYTEKIEKE SEQ ID N° 9 ) 68-79 hélice QKTMADGNEKKL SEQ ID N° 10 j138-146 hélice ASGEKKNSV SEQ ID N° llj 69-77 circuito KTMADGNEK SEQ ID N° 12 I 32-40 circuito ELNEPLSNE SEQ ID N° 13 )103-117 circuito LLDKFLIKNCNDFQY SEQ ID N° 14 |130-143 circuíto YYRYLAEVASGEKK SEQ ID N° 15 I 184-194 círcuito YEIQNAPEQAC SEQ ID N" 16 j206-218 círcuito AELDTLNEDSYKD .
bj SEQ ID N° 17 44-57 não-hélíce LLSVAYKNVVGARR 9 SEQ ID N° 18 15-23 não-hélice EQAERYDDM 4 SEQ ID N" 19 130-138 não-héíice YYRYLAEVA SEQ ID N° 20 118-125 não-hélice ESKVFYLK SEQ ID N° 21 210-218 não-hélíce igMNL3bxq°ò"4E SEQ ID N° 22 '77-84 não-hélice KKLEKVKA SEQ ID N° 23 76-8 6 não-hélice EKKLRKVKAYR SEQ ID N° 24 142-158 não-hélice KKNSVVRASEAAYKEAF SEQ ID N° 25 105-120 não-hélice DKFT,IKNCNDFQYESK SEQ ID N° 26 237-246 não-hêlice QQDEEAGEGN SEQ ID N° 27 | 75-82 não-hélice Inekklekvk SEQ ID N° 28 104-116 não-hélice LDKFLIKNCNDFQ SE.Q .LLN° 29' ! 14'1J46 - . —- ... não-hélice .^-- Iekknsv' SEQ ID N° 30 I 104-115 não-hélice LDKFLIKNS*NDF SEQ ID N° 31 77-86 não-hélíce KKLEKVKAYR SEQ ID N° 32 I 143-157 não-hélice KNSVVEASEAAYKEA SEQ ID N" 65 1-12 )não-hé1ice jDREQLLQfARLA * O aminoácído de cisteína interno fcji substituído pelo aminoácido serina para evitar a formação de ligações de dissulfeto.
Tabela 2 5 EEítoEos 14-3-3 gama SEQ ID N° 33 93-107 hélice LEAVCQDVLSLLDNY SEQ ID N° 34 I 191-199 hélice EQACHLAKT SEQ ID N° 35 j144-155 hélice aTvvessekays SEQ ID N° 36 I 144-152 hélíce ATVVESSEK SEQ ID N° 37 I 147-155 hélice VESSEKAYS
W
$1 Lsq id n° 38 168-177 hélíce THPI.RLGLAL %
P i seq id n° 39 82-92 jhélice VRAYREKIEKE jhélice seq id n° 40 68-79 QKTSADGNEKKI seq id n" 41 138-146 hélice ATGEKRATV I seq id n° 42 163-170 hélice EHMQPTHP seq id n° 43 141-146 . hélíce EKRATV seq id n° 44 69-77 I circuito KTSADGNEK seq id n° 45 32-40 I circuíto ELNEPLSNE seq id n° 46 103-11"7 jcircuito LLDNYLIKNCSETQY seq id n° 47 130-143 jcircuito YYRYLAEVATGEKR l seq ip n° 48 184-194 ! circuito YEIQNAPEQAC ' seq id"n°'49 206-218 I círcuíto AELDTLNÉDSYKD -"' " seq id n° 50 44-57 jnão-hélice LLSVAYKNVVGARR |seq id n° 51 75-83 não-hélice NEKKIEMVR seq id n" 52 15-23 |não-hélice EQAERYDDM |seq id n° 53 130-138 jnão-hélice YYRYLAEVA seq id n° 54 118-125 não-hélice ESKVFYLK I seq id n° 55 210-218 |não-hé1ice TLNEDSYKD seq id n° 56 77-84 |não-hé1íce KKIEMVRA |seq id n" 57 76-86 |não-hé1ice EKKIEMVRAYR seq id n° 58 142-158 jnão-hélíce KRATVVESSEKAYSEAH seq id n° 59 105-120 jnão-hélice DNYLIKNCSETQYESK seq ijd n" 60 237-246' não-hélíce QQDDDGGEGN seq id n° 61 75—82 não-héli-ce NEKKIEMV Iseq id n° 62 104-116 não-hélice LDNYLIKNCSETQ k. Tabela 3 4 Seqiiêncía de proteínas de 14 -3-3 eta humano recombínante b (SEQ ID N° 63) e 14-3-3 gama humano recombínante (SEQ ID N° ¥ 64)
C SEQ ID N° i MGDRF,QLLQR ARLAEQAERY DDMASAMKAV TELNEPLSNE 4 0 63 I DRNLLSVAYK NVVGARRSSW RVISSIEQKT MADGNEKKLE 8 0 I KVKAYREKIE KELETVCNDV LSLLDKFLIK NCNDFQYESK 12 0 I VFYLKMKGDY YRYLAEVASG EKKNSVVEAS EAAYKEAFEI 160 ) SKEQMQPTHP IRLGLALNFS VFYYEIQNAP EQACLLAKQA 20 0 I FDDAIAELDT LNEDSYKDST LIMQLLRDNL TLWTSDQQDE 2 4 0
I EAGEGN SEQ ID N° MVDREQLVQK ARLAEQAERY DDMAAAMKNV TELNEPLSNE 40 " .'"64 ' """ERNLLSVAYK NVVGARRSSW RVISSIEQKT SADGNEKKIE- 80^ " MVRAYREKIE KELEAVCQDV LSLLDNYLIK NCSETQYESK 120 VFYLKMKGDY YRYLAEVATG EKRATVVESS EKAYSEAHEI 160 SKEHMQPTHP IRLGLALNYS VFYYEIQNAP EQACHLAKTA 200 FDDAIAELDT LNEDSYKDST LIMQLLRDNL TLWTSDQQDD 240
DGGEGNN 5 Em seqüêncías que compreendem um resíduo de cisteína, êm uma real-ização, o resíduo de cisteína é substituído por um. resíduo de serina para evítar a formação de ligações de .dissulfeto. A cisteína pode ser um resíduo de cisteína interno ou um resíduo de cisteína terminal.
10 Epitopos de peptídeos podem ser rrtodifícados com vários propósitos, que incl-uem a conjugação a uma porção adicional, tal como a conjugação a uma porção para produzír um írnunogene que compreende o epítopo. Como se aprecíará, a cisteína pode ser colocada adequadamente para conjuqação ao
1{·, v'eíc'ulo e fornecer exposição da área que se dese-ja expor g para fins de fabrícação de ant-icorpos. No caso de KKLE, a 01 cisteína foi adicionada à ex'tremidade C-terminal, a fim de
F expor o outro lado. O veícul-o utilízado pode ser muito 5 grande e pode masCarar os prímeíros aminoácídos.
ExeIn21o 1 semncía de Imunogenes 14-3-3eta e Antícorpos Antí-14-3-3 eta Para preparar anticorpos anti-14-3-3 eta 10 InorLDespecíficos, diversos peptídeos, com oito a qui-nze aminoácidos de cornprimento, foram selecionados com base em nossos próprios critérios. Esses peptídeos, bem corno 14-3-3 â e"tà '"nátivo recombinante ' com comprímento total"'"-(não" "' marcado), foram utilizados como imunogenes na produção de 15 anticorpos monoclonais. Um alinhamento de seqüências de proteínas para as sete isoformas de 14-3-3 é exibido na Figura 4. 14-3-3 gama (SEQ ID N°: 64, 14-3-3 eta (SEQ ID N°:63), 14-3 3 alfa/beta (SEQ ID N°: 71), 14-3-3 zeta (SEQ ID N°:j2), 14-3-3 teta (SEQ ID N°:73), 14-3-3 sigma (SEQ ID 20 N°:74), e 14-3-3 epsilon (SEQ ID N":75))- Irnunogene n° 1: C-LDKFLIKNSNDF (SEQ ID N°:76) (seqüência de arninoácido 104 - 115; "'AUGI-CLDK"). Um peptídeo correspondente a um segmento de resíduos de 14-3-3 eta humanos 104-115 foi modificado por rueío da adíção de 25 uma porção de cisteína N-termínal para conjugação ao veículo e substituíção de porção cisteína 112 interna para evitar a formaçâo de Iigações de dissulfeto ínternas.
Imunogene n° 2: KKLEKVKAYR-C (SEQ ID N°:77)
:u (sèqüê.ncia de aminoácido 7'7 — 86; "AUG2-KKLE") . ,Um peptíde.o 2 corre spondente a um s egmento de resíduos de 14-3- 3 eta 0 humanos 7 7-8 6 f oi modifiCado por meío da adíção de uma 4l porção de cisteína N-terrninal para conjugação ao veículo .
5 Iniunogene n° 3: C-KNSVVEASEAAYKEA (SEQ ID N°:78) (seqüência de aminoácido 143 - 157; "AUG3-CKNS ") . Um peptídeo correspondente a um segmento de resíduos de 14-3-3 ' eta humanos 143-157 foi modificado por meio da adição de uma porção de cisteína N-terminal para conjugação ao 10 veículo .
Imunogene n° 4: 14-3-3 eta recombinante humano com ccmprímen to total (SEQ ID N° 63) , número de acesso de . . ' pr'oteíiía"NP 003396.- """ "" ' ''_" . .
Imunização 15 Grupos de quatro fêmeas de camundongo s BALB/ c f oram irnuni zado 5 inicíalmente por meio de inj eções intraperítoneais utilizando 50 µg de antígeno ( Imunogene n ° 1, n° 2, n° 3 ou n° 4) por camundongo em Adj uvante Compíeto de Freund. Quatro amplificações subseqüentes foram 20 admínistradas conforme acima , espaçadas em intervalos de três s emanas , com um antígeno em Adj uvant e de Freund Incompleto. Quando o título do so ro houve r auinentado maís de dez vezes com relação ao da amostra de soro pré- imunológico, conf orrne deterrninado por ELISA, os doi s 25 reagentes mais altos em cada grupo foram ampli ficados por via int ravenos a com 10 µg de antígeno em 100 µ1 de PBS estéril, pH 7, 4, cada um. As títulações de amostras de soro dos camundongos imunizados tomadas após a segunda k amplificação são exibídas na Figura 1 (Imunogene n° 1, ' m CLDK), Figura 2 (Imunogene n" 2, KKLE), Figura 3 (Imunogene µ0 n° 3, CKNS) e Figura 8 (Imunogene n° 4). k Método de fusão 5 Três dias após a amplificação final, os camundongos doadores foram sacrificados e as células do baço foram colhídas e reunidas. A fusão dos espl-enócítos coir células de mieloma parental SP2/0 BALB/C foi realizada conforme descrito anteriormente (Kohler et al, abaixo), exceto pela 10 realização de seleção e clonagem ern uma etapa dos hibridomas. Os clones foram tornados erti onze dias após a fusão e novamente suspensos em cavidades de placas de " ""- cultivo-"de tecidos-,com 96, cavidade,s-.em:.20.0. µ1 de uleío-D 4 ' mem que contém 1% hipoxantina/timidina, 20°ó de soro de feto 15 bovino, 2 mM de GlutaMax I, 1 mM de piruvato de sódío, 50 µg/ml de gentarriicina, 1% OPI e 0,6 ng/ml de IL-6. Após quatro dias, os sobrenadantes foram selecionados por meio de ELISA para determinar a atividade de antícorpos sobre pIacas revestidas com 1 µg/cavídade de antígeno puríficado.
20 Procedimento de reativação de cIones de hibridoma ezn crescimento lento As linhagens de cél-ulas de hibrídoma em Iento crescimento ou aparentemente não saudáveis poderão normalmente ser resgatadas por meio da adição de um rneío de 25 crescimento ríco contendo: meio D-MEM COIll 1°5 hipoxantina/timidina, 20% de soro de feto bovino, 2 rtiM de GlutaMax I, 1 mM de piruvato de sódio, 50 µg/m1 de gentamicina, 1% OPI, 20% de sobrenadante de cultivo de b tçcidos EL-4 condicionados e 0, 6 ng/ml de IL-6. EL-4 é urna £ línhagem de células de timoma murino que, quando estimulada W· com 12-miristato 12-acetato forbal (PMA, da Sigma, cat . N° 1" P-8I39) , f az com que as células secretein ínterleucina 2 5 (IL-2) , um fator de díferenciação de células B (EL-BCDF- nak) , dois fa"tores de crescimento de células B (BSF-pI e EL-BCGE'-swa) e outras linfoquinas adicionais, que aumentam muito o cresciinento e a diferenciação de linfócitos . Vide G. Kohler e C. Milstein, Prepara tíon ClÉ monoclonal 10 antibodies, Nature 25 (1975) 256-259; Ma, M. , S. Wu, M.
Howard e A. Borkovec, 1984, Enhanced p-roductí on oií mouse hybridomas to picomoles of antigen using EL-4 condi tioned · media : wi-th' an in vi tro immuníza ti on protoco-Z, In Vit-ro 20:";"
739.
15 Após trinta dias de testes de estabili-dade, foí obtido um total de cein clones víáveis que secretaram IgG capaz de reconhecer 14-3-3 eta recombinante. Para ds propósitos de identificação de clones Iíderes a serem buscados, os cem clones viáveis foram selecionados utilizando uma série de 20 métodos, que incluem: imunomanchas (d.ot blot), um teste de captura e um ELISA de captura específico (sanduíche). Todos os cem clones tainbém foram testados para determinar a reatividade cruzada utílizando o ELISA de captura específico (sanduíche) com as outras seis isoformas de 14- 25 3-3. Exemplo 2 · Teste da Reatívídade Cruzada de Sobrenadantes de Tecído de Cultívo (TC) de Clones de Hi-brídoma Utílízando Isoformas de t 14-3-3 Bíotiniladas como Isca em um ELISA de CaEtura ° Utilizamos um ELTSA de captura específico empregando
X as sete isoformas de 14-3-3 corrto "isca"' para determinar se 4 algurn dos clones de hibridoina que produzimos gerou reaçáo 5 cruzada ou reconhece qualquer das seis isoformas díferentes de 14-3-3 Eta (rj). Coíno é evidenciado pelos dados representativos apresentados na Tabela 4, quatro dos clones de hibridoma selecionados- (AUG3-CKNS-2D5, AUG3-CKNS-7F8, , AUG3-CKNS-7H8, AUG4-ETA-8FIO) ligam-se a 14-3-3 Eta e o 10 reconhecern em duas díluições em séríe, mas não se ligarn nem apresentam reação cruzada corn nenhuina das outras isoformas de 14-3-3, mesmo na diluição mais baixa testada. Estes -- · dâdcis demonstram claramente que esses clones.·são altamente especificos para 14-3-3 Eta (rj). Por outro lado, um clone, . 15' AUG3-CKNS-4F1O, líga-se ou apresenta reação cruzada com três outras isoforrnas de. 14-3-3, princípalmente 14-3-3 gama, beta e zeta, respectivamente. Tomados em conjunto, estes dados indicam que o nosso ELISA de captura específico representa um método efícaz de seleção e ídentifi-cação de 2'0 clones de hibridoma que são altamente específicos para a isoforma 14 3-3 Eta (rj)- O experimento de, ELISA de captura específico da Tabela
U 4 fo'i conduzido conforme segue. PIacas de ELISA foram revestidas com sobrenadante TC sobrecultivado puro a I00 µ1 25 por cavidade e incubadas por uma noite a 4 °C. 14-3-3 marcado com bíotina (correspondente a todas as sete isoformas) foi títulado de 1/500 para 1/16000 no topo e incubado por urrta hora à temperatura ambiente. As pIacas
· i x4 104/124 'í foram bloqueadas em seguida coiii leite em pó desnatado a 3°) " em PBS (pH 7,4) a 100 µ1 por cavídade e incúbadas por uma b hora à temperatura ambiente. 1/8000 Estreptavídina-HRPO foi r
G diluída em PBS-Tween, adicionada a 100 µ1 por cavidade e 5 incubada por uma hora a 37 °C com agítação. Tampão TMB foí adicíonado a 50 µ1 por cavidade e incubado no escuro à temperatura arríbiente. As reações foram suspensas COIll 50 µ1 de 1 M HCI por cavidade aoós dez minutos e lidas a OD 450 nm .
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W Q) ÇJ :4 .. r¶ CJ C» CJ O O O~ µ cn ·R U) U) 0 CIS a V? C» OJ W C» m T$ SL D + cn m r· C» ·m ¶C$ tn CJ ~ D O r—l « r-( M r4 .. W % 2 'I =
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"¥ Exelnp1o 3 mressão de 14-3q_ em F,1.u.í.do Sínovíal e So,r,o_de Pacíen,t,e.s, Afetados eom ra Os níveis das diferentes isoformas de proteínas 14-3-3 5 (B, y, e[ rj, t, (j e <) em amostras de fluido sinovial (SF) e soro (PS) de pacientes foram analísados por meio de análise Western utílizando lisato de células de queratinócitos, (K) como . control-e positivo. Apenas' as " isoformas rj e y foram detectadas em amostras de SF e r 10 manchadas com maior intensidade em comparaçáo com PS.
Amostras de fl-uido sinovial das juntas articulares de dezessete pacientes com RA que apresentaram sínovite ativa, rrtas--.ainda não-. haviam- recebido terapias anti-T.NF,- .taihbém exibiram expressào consistente da isoforma rj de 14-3-3 15 (dados não exibidos). Todos os pacientes apresentaram uma avaliação da ativídade de doença (DAS) de mais de 6,0.
ExemE!1o 4 ExEressão de MMP em Soro de Fluído Sínovial de Pacíentes Para determinar se essas varíações forarn 20 correlacionadas às de MMP-I e FQ4P-3 nas mesmas amostras sínoviais, um total de doze amostras de fluido sínovíal RA e suas amostras de soro correspondentes foram avaliadas simultaneamente para determinar 14-3-3 rj e y bem como " proteínas MMP-I e MMP-3. 14-3-3 rj foí detectado em todas as 25 aínostras. MMP-I foi detectado ein todas as amostras, tanto SF quanto PS, enquanto MMP-3 era mais variável nos níveis ' detectados. A isoforma 14-3—3 y também foi detectada em amostras de soro e fluido sínovial de pacientes (dados não &
" "" " " """T"" ' $/ \:!-/, , 108/124 ü 'y exibidos) . .à &, A expressão de MMP-I e MMP- 3 demonstra correlação signi-ficativa com a expressão das isoííormas de 14-3-3 rj e y
E em fluido sinovial e soro (Tabela 5) .
5 Tabela 5 Corre1a£ão entre MMP _ e _ o.s _ N,í,ve,í.s _ de _ P,r,o,t,e,í.n,a _ 1.4 =zm em _ S,o,r,o e Fluido Sínovial 14-3-3 rj ) 14-3-3 rj "'I 14-3-3 Y I 14-3-3 Y soro sínóvio sora sinóvío MMP-I r = 0, 62; |r = 0,83; r = 0, 77 ; |r = 0,65; p = 0, 02 Ip = 0,03 p = 0, 02 I P = 0, 03 MMP-3 r = 0, 68; |r = 0,77; r = 0, 80; jr = 0,76; 0 · "p " o)cn '" I P"= 0, 003 p = 0, 03 " I P = 0, 04 ExempIo 5 Sensíbílídade de Detee£ão Western _ B,i.o,t _ de _ P,r,o.t,e,í.n,a _ 1.4 àm, 10 em Aníostras de Soro e Fluido Sínovíal de Pacíentes Para determinar o nível de detecção de 14- 3-3 rj em amostras de soro e fluido sinovial, amostras de doze pacientes normais ou afetados por RA foram reunidas e as diluições Iimitadoras das amostras reduzídas foram 15 analisadas por meio de Western Blot . 14 -3-3 rj foi detectável ao -Longo de uma séri-e de díZuíções, desde 0, I µ1 de volume efetivo de fluido sinovial até 1, 0 µ1 de volume efetivo de soro (dados não exibidos) .
2 µ1 de soro normal reunido (NS) ou soro de paciente 20 (PS) foram conduzídos ao Longo de concentrações conhecídas de 14- 3-3 rj recombinante, que varia de 0,05 a 2,0 µg- O volume de 2 µ1 de amostras de NS e PS foi estimado como possuindo 1 a 1,5 e 15 a 20 µg de 14-3-3 rj, respectivamente (dados não exibidos). Issq sugere que o nível de 14-3-3 rj . ocorre em urn excesso de cerca de dez vezes no soro de pacientes afetados por RA, em comparação coni pacientes 5 normais.
Para mais detalhes e resultados, vide Kílaní et al, j.
Rheumatology, 34: 1650-1657, 2007.
Exemplo 6 PeEtídeo R-IB interage eorn proteína 14-3^ e,x,t,r,a.c,e.1,u.1.a,r_e lO iníbe a indu£ão da exEressão de MMP-I índuzída ^or ^roteína 14-3-3 extracelular A seqüência de R18 biotínílado é a seguínte: Biotína- " ""pro-Iqis-Cys-val"pro-Arg-Asp-Leu"Sêr-Trp-Léu-Asp"Leu"Glü"- ""'" Ala-Asn-Met-Cys-Leu-Pro-OH (SEQ ID N°:j9).
A fim de demonstrar a capacídade de R-18 de bloquear ou suprirnir o efeito indutor de mmp de proteínas 14-3-3, tratamos cultivos subconfiuentes de fíbroblastos dérmícas com meio condícionado por células símilares a qüeratinócitos (KLCCM) que foi demonstrado por meio de espectrometría de massa para que contenha diversas ísoformas de 14-3-3 (dados não publicados)- O KLCCM utilízado nesses experimentos foi retírado do día 28 da transdiferenciação celular devido à sua alta capacídade de indução da expressão de MMP-I em fíbrobíastos dérmícos (dados não exibidos). Alguns exentplos dos meios condicionados (KLCCM) foram expostos a R-18 biotinílado e avidino sefarose para remover ou "'puxar'" as proteínas 14-3- 3 presentes no KLCCM.
m Y 110/124 'b Os resultados demonstraram que fibroblastos dérmicos Úí Dl expressaram MMP-I, após tratamento com o KLCCM, e que a expressão de MMP-r1 poderá ser parcialmente inibida (68,8%
U de redução) por rneio de tratarnento prévio do KLCCM com R-18 ?
L 4 5 biotinilado e avidino sefarose, que esgotará seletivamente b o KLCCM de proteínas 14-3-3 (Fígura 5, Quadro A, retirada).
L 14-3-3 sigma. recombinante (estratifina), que r i conhecidairtente induzir MMPm1, |foi ut-ilizado. como controle positivo a 5 µg/m1 (retirada -) ou após a exposição 10 (retírada ,+). Como controle negatívo, Eoram utilizados fíbroblastos dérmícos tratados com meio que não foi coridicionado (DMEM (49%), KSFM (49%) mais 2% FBS) (retirada ^). O quadro· B da Fígura 5 exibe a'anál-itse densitométrica da razão entre MMP-I e j3-actína. Descobertas de três 15 experimentos independentes exibiram significado estatístico (valor P: 0,02). 0 Exemp1o 7: 4 , .
Imunopreeípítação de 14-Ç e,t,a _ r,e,c,ombµnan,t,e _ hµuna,n,o _ e _ 1.4m- 3 eta de células HeLa endógeno 20 Anticorpos anti-14-3-3 monoclonais do Exemplo 1 foram testados para determinar a sua capacidade de imunoprecipitação. ou "captura"" de 14-3-3 eta celular endõgeno e recoinbinante. .Para os métodos terapêuticos de acordo com a presente invenção descritos no presente, é 25 preferível utilízar anticorpos que possuam a capacidade de imunoprecipitar ou reconhecer 14-3-3 eta na sua configuração 3-D natíva. Sobrenadantes de culti_"vo de clones de hibridoma antí-14-3-3 eta foram incubados a 4 °C por \%
«
W e duas horas com cada tarapão contendo 100 ng de 14-3-3 eta b
V
V reconíbinante hurnano ou tampão que contérrt sobrenadante (200 a µg de proteína) de células HeLa lisadas. Imunoprecipitados forain recolhidos com proteína A/G agarose utilizando 5 metodologia padrão. Os imunoprecipitados foram analisados por meio de SDS-PAGE e Western Blot. A Figura 6 exibe um Western Blot obtido utilizando o clone de hibridoma 7B1l, 0 que foi elaborado utilizando Imunogene n° 4 (14-3-3 eta recombinante com compriraento total). Banda 1: esferas de 10 proteína A/G agarose isoladamente; banda2: esferas de proteína A/G agarose foram misturadas coiii lisato celular; banda3: esferas de proteína A/G agarose foram misturadas coin 14-3-3 eta humano recombinante; banda4: esferas de proteína A/G agarose foram misturadas com sobrenadante de 15 hibridoma; banda5: esferas de proteína A/G agarose foram misturadas coin sobrenadante de hibridoma e lisato celular; banda6: esferas de proteína A/G agarose foram misturadas 0 com sobrenadante de hibridoma e 14-3-3 eta recombinante. Os dados dewonstran que o clone Í7B11 imunoprecipitou 14-3-3 20 eta derivado de células HeLa (banda 5) e 14-3-3 eta recombinante humano (banda 6).
A Figura 7 exibe unt Western Blot obtido utilizando o clone de hibridorna 2D5 elaborado contra c) Imunogene n° 3 (CKNS). Banda 1: esferas de pr'oteína A/G agarose 25 isoladamente; banda 2: esferas de proteína A/G agarose forain rnisturadas COIll lisato celular; banda 3: esferas de proteína A/G agarose forani misturadas com 14-3-3 eta humano recohbinante; banda 4: esferas de proteína A/G agarose
F".
W foram misturadas com sobrenadante de hibridoma; banda 5: = k esferas de proteína A/G agarose foram rnisturadas com sobrenadante de hibridoma e lisato celular; banda 6: esferas de proteína A/G agarose forarn rrtisturadas COKl 5 sobrenadante de hibridoma e 14-3-3 eta recombinante. Os dados demonstram que o clone 2D5 iniunoprecipitou 14-3-3 eta derivado de lisato de células Helja (banda 5) e 14-3-3 eta recombinante huinano (banda 6). 0 Análises similares foran realizadas para vários outros 10 clones de hibridcma (dados não exibidos). Estes experimentos demonstrarn que os anticorpos monoclonais produzidos no Exeinplo 1 são capazes de ligar, imunoprecipitar ou "capturar" 14-3-3 eta na sua configuração nativa, conforme evidenciado pela 15 imunoprecipitação da proteína a partir de lisatos de células heLa.
Exemp1o 8 0 Anticorpo anti-14-4-3 reduz a expressão de MMP em modelo_d,e, RA de camundongos; peptídeo antagonísta de 14-3-3 reduz a 20 exEressão de MMP erri modelo de RA de camundongos Artrite induzida por colágeno é induzida em carnundongos DBA machos por nteio da injeção de 100 µg de colágeno tipo II purificado ernulsificado em adjuvante completo de Freund na base da cauda, confornie descrito ern 25 Williams et al, PNAS, 89: 9784-9788, 1992. Os camundongos são inspecionados diretarriente a seguir e os camundongos que exibent eritenia e/ou inchaço em urn ou mais membros são atribuídos aleatoriamente a um regime de trataniento com um
.
4 " ou mais antagonistas de 14-3-3 eta descritos no presente ou
P -
Ú a uin tratamento com placebo. Alternativamente, um regirne de - tratamento conieça no dia antes da imunização com colágeno - tipo II. São implementados diversos regimes de tratamento, 5 utilizando grupos de dez camundongos, conforme segue: (1) Peptídeo R-18 é administrado em diversas dosagens que variam de 0,1 a 20 ing/kg (a) por via intraperitoneal ou (b) no sinóvio, duas vezes por semana. 0 (2) Anticorpos anti-14-3-3 eta selecionados obtidos e 10 purificados a partir dos sobrenadantes de hibridoma do Exeinplo 1 são administrados eín várias dosagens que variarrt de 0,10 a 20 ng/kg (a) por via intraperitoneal ou (b) no sinóvio, duas vezes por semana.
(3) Tratamento com placebo.
15 A artrite é monitorada ao longo de um periodo de tratamento de vinte dias e são avaliados os índices de doenças a seguir. 0 Avaliação clínica. Membros de camundongos são avaliados para determinação de inchaço, eritema, rigidez 20 das juntas e inchaço das patas. Os indícios clínicos de artrite são reduzidos em animais nos quais o regime de tratamento foi eficaz, em cornparação com controles placebo .
Expressão de 14-3-3, MMP-I e/ou MÊÍP-3 no sinóvio.
25 Amostras sinoviais são tomadas ertt diversos momentos e são determinados os níveis de 14-3-3, preferencialmente 14-3-3 gama e/ou 14-3-3 eta, e de MMP-I e/ou MMP-3. Os níveis de mp-1 e MMP-3 são reduzidos em animais nos quais o regime
K 114/124 d .T W de tratarnento foi eficaz, eni comparação com controles ! - &, placebo. ~ Determinação histopatológica As patas artríticas são a fixas, eníbutidas em parafina, seccionadas e manchadas com 5 hematoxilina e eosina para avaliação microscópica. A severidade da artrite em cada junta é graduada de acordo com os critérios a seguir: suave = sinovite mínirrta, perda de cartilagerrt e erosões ósseas lirnitadas a focos discretos; 0 moderada = sinovite e erosões presentes, mas arquitetura 10 das juntas norniais intacta; severa = sinovite, erosões extensas e arquitetura das juntas rompida. A severidade da artrite detectada por meio de histopatologia é reduzida eni aniinais nos quais o regime de tratamento foi eficaz, em comparação coir controles placebo.
15 ExeInElo 9 Ar1tícorpo antí-14-4-3 reduz a eRressão de MMP em modelo de RA.em_c,o,e,1hos; peptídeo antaqonísta de 14-3-3 reduz a 0 ex2ressão de MMP em um modelo de RA em coelhos induzido =1o im2lante de células =e seeretam IL-I 20 Os antagonistas de 14-3-3 eta de acordo corn a presente invenção são avaliados ern um rrtodelo de coelhos, no qual a artrite é induzida por meio do irriplante de 5 x 105 células produtoras de IL-I nas juntas dos joelhos de coelhos brancos da Nova Zelândia conforme descrito ern Yao et al, 25 Arthritis Research and Therapy 2006, 8: R16, disponível online em http://arthritis-research.com/content/8/1/R16.
Testes e avaliações são realizados essencialntente conforrne descrito no Exentplo 8.
J t Exemplo 10 ! y Arlticorpo antí-14-4-3 reduz a ex2ressão de MMP em modelo de
K RA; _jEeEtídeo antaqonista de 14-3-3 reduz a exEressão de MMP @ em RA 5 Artrite experiraental é induzida em ratos marrons da Noruega ou errt coelhos brancos da Nova Zelândia por rrteio da injeção de proteína 14-3-3 eta recombinante no sinóvio de juntas de pernas. Testes e avaliações são realizados 0 essencialmente conforme descrito no Exemplo 8.
10 Outros rnodelos de artrite reumatóide (artrite induzida por colágeno, "CIA") e projetos experiínentais úteis para os métodos de acordo coín a presente invenção podern ser encontrados, por exemplo, nas referências a seguir: Williams, Methods Mol Med. 2004; 98: 207-16. Collagen- 15 induced arthritis as a model for rheumatoid arthritis; Brand, Com. Med., 55: 114-122, 2005; Vierboom et al, Drug Discovery Today, 12: 327-335, 2007; Sakaguchi et al, Curr.
0 Opin. ljmmunol., 17: 589-594, 2005.
Antes de começar um regime terapêutico inicial ern um 20 niodelo animal específico, é preferível validar em prirneiro lugar o modelo como um modelo de distúrbio inflamatório que envolve 14-3-3. Preferencialraente, os níveis de 14-3-3 e MMP, preferencialmente 14-3-3 eta e/ou 14-3-3 garna e, preferencialmente, MMP-I e/ou MMP-3 são determinados 25 exibindo elevação após a indução de artrite experimental no inodelo .
Métodos Gerais Western Blot
) N/ Ainostras (fluido sinovial ou soro (2 µ1 de cada), 14-
W 3-3 eta humano recombinante, lisatos celulares ou e imunoprecipitados de lisatos celulares) forarn submetidas a análise SDS-PAGE COKl 12 a 15% (peso/volume) gel de 5 acrilarnida e eletrotransferidas sobre membranas de PVDF.
Proteínas não específicas sobre rnerribranas foram bloqueadas em leite desnatado em pó a 5% em PBS-O,1°o Tween 20 por urna noite. As intunomanchas do Exemplo 3 foram realizadas 0 utilizando 2 µg/inl de sete isoformas de anticorpos 10 policlonais 14-3-3 anti-humanos de coelhos específicos (Martin, H., Patel, Y., Jones, D., Howell, S., Robinson, K.
e Aitken, A., 1993, Antibodies against the major brain isoforms of 14-3-3 protein. An antibody specific for the N- acetylated amino-terminus of a protein. FEBS Letters, 331: 15 296-303). Ern alguns experimentos, principalmente no Exemplo 7, os anticorpos dos clones de hibridoma no Exerrtplo 1 foram utilizados para os experimentos de imunoprecipitação ou 0 "captura". Os imunoprecipitados forant resolvidos por rrteio de SDS-PAGE e as membranas foram bloqueadas ein leite 20 desnatado e incubadas com 14-3-3 eta prirnário (1:1000, B1OMOI International SE-486) a peroxidase de rabanete silvestre secundário apropriada conjugou anticorpos IgG anticamundongos ou IgG anticoelhos era seguida (diluição de 1:2500). Proteínas irrtunorreativas forarrt visualizadas 25 utilizando o sistema de detecção ECL mais Western Blot.
Lisato de células de queratinócitos (K), proteína recombinante e/ou lisato de células HeLa foi utilizado como controle positivo. SF: fluido sinovial; PS: soro de paciente .
Amostras de pacientes Fluido sinovial foi obtido das juntas de joelhos de pacientes com sinovite ativa antes da instituição de 5 produtos terapêuticos anti-TNF. Todos os pacientes apresentaram avaliação DAS > 6,0: Amostras de sangue coincidentes forarn obtidas por meio de procedimentos de venipunção padrão. O coágulo foi removido por meio de 0 centrifugação.
10 14-3-3 eta recombinante CDNA para 14-3-3 eta derivado de queratinócitos foi preparado a partir de RNA total extraído de queratinócitos humanos, clonados e expressos em E. coli e purificados por afinidade, seguindo os rnétodos descritos em Ghahary et al, 15 2004, j. lnvest. Dermatol. 122: 1188-1197 (REF 36, abaixo).
Os primers utilizados para amplificação por PCR do cDNA de 14-3-3 eta forani (GCGAATTCCTGCAGCGGGCGCGGCTGGCCGA) (SEQ ID 0 N°:80) e (GCTCGAGCCTGAAGGATCTTCAGTTGCCTTC) (SEQ ID N°:81).
Proteínas 14-3-3 recombinantes não marcadas 20 CDNA foi derivado de urna fonte hurnana, clonado e expresso em E. coli e purificado por afinidade. Os prirners utilizados para amplificação por PCR do CDNA de 14-3-3 eta forarrt: (agaattcagttgccttctcctgctt) (SEQ ID N°:82) e (acatatgggggaccggga) (SEQ ID N°:83); para 14-3-3 gama 25 (agaattcttaattgttgccttcgccg) (SEQ ID N°:84} e (acatatggtggaccgcgagc) (SEQ ID N°:85); para 14-3-3 beta (acatatgacaatggataaaagtgagctg) (SEQ ID N°:86) e (agaattcttagttctctccctccccagc) (SEQ ID N°:87); para 14-3-3
« 118/124 ·d a a " epsilon {acatatggatgatcgagaggatctg) (SEQ ID N°:88) e
D © (agaattctcactgattttcgtcttccac) (SEQ ID N°:89); para 14-3-3 e sigraa (acatatggagagagccagtctgatcc) (SEQ ID N°:90) e V' (agaattcagctctggggctcctg) (SEQ ID N°:91); para 14-3-3 teta , 5 (acatatggagaagactgagctgatcc) (SEQ ID N°:92} e (agaattcttagttttcagccccttctgc) (SEQ ID N°:93); para 14-3-3 zeta (acatatggataaaaatgagctggttc) (SEQ ID N°:94) e (agaattcttaattttcccctccttctcct) (SEQ ID N°:95). 0 Condições de teste ELISA 10 Para seleção e teste: para seleção e teste, 1,0 µg/cavidade de antígeno anti-AUG1-CLDK, anti-AUG2-KKLE, anti-AUG3-CKNS ou anti-14-3-3 eta foi revestido sobre placas ELISA em dH2o a 50 µl/cavidade e seco por uma noite a 37 °C. Testes sobre 0,25 µg de antígeno 14 3 3 eta por 15 cavidade foram revestidos ein tampão de revestimento de carbonato e incubados a 4 °C por uma noite.
Para testes por ensaio de captura de anticorpos: 0 1/10000 anticorpo de captura de IgG/lgM anticamundongos de cabra (Pierce cat. N° 31182) foi revestido sobre placa 20 ELISA em tampão de revestimento de carbonato (pH 9,6) a 100 µl/cavidade incubados por uma noite a 4 °C. ' Para teste sobre antígeno controle negativo: 0,5 µg/cavidade de antígeno HT (transferrina humana) foram revestidos sobre placa ELISA ein dH2O a 50 µl/cavidade e 25 secos por uma noite a 317 °C.
Para testes por ELIJSA de captura: placas de ELISA foram revestidas coin sobrenadante TC sobrecultivado puro a 100 µ1 por cavidade e incubadas por uma noite a 4 °C. 14-3-
'" 3 eta marcado com biotina (ou um dos seis outros membros de » família 14-3-3) foi titulado a partir de sobreposição 1/500
W a 1/16000 por urrta hora à temperatura ambiente.
Bloqueio: as placas foram bloqueadas com leite ern pó 5 desnatado a 3°5 em PBS (pH 7,4) a 100 µ1 por cavidade e incubadas por uma hora à temperatura ambiente.
Primeiro anticorpo: sobrenadante de cultivo de tecidos de hibridoma anti-AUG1-CLDK, anti-AUG2-KKLE, anti-AUG3-CKNS 0 ou anti-14-3-3 eta de cawundongos e controles monoclonais 10 de camundongos foram adicionados a 100 µ1 puros por cavidade para seleção e teste. Soro pré-imunológico de cainundongo e soro iniunológico anti-AUG1-CLDK, anti-AUG2- KKLE, anti-AUG3-CKNS e anti-14-3-3 eta de camundongos forarn diluídos 1/500 em sobrenadante de cultivo de tecido SP2/0 15 adicionado a 100 µl/cavidade para seleção e teste. Incubado por uma hora a 37 °C corri agitação para a seleção e teste.
Segundo anticorpo utilizado para seleção e teste: IgG 0 Fc anticanundongo de cabra 1/25000 HRP conjugado (jackson cat. N° 115-035-164) foi utilizado ern seleção e teste.
20 Anticorpo secundário diluído ern P13S-Tween foi adicionado a 100 µ1/cavidade e incubado por uma hora a 37 °C com agitação.
Estreptavidina utilizada paira ELISA de captura: adicionar 100 µl/cavidade de estreptavidina HRPO (1:8000, 25 CedarLane cat. n° CLCSA1007) e incubar por uina hora à temperatura ambiente rrtediante agitação.
Substrato: tainpão TMB (B1OFX cat. N° TMBW-10OO-O1) foi adicionado a 50 µ1 por cavidade e incubado no escuro à
[ m 120/124
W - 4 & temperatura ambiente. As reações de seleção e teste foram m suspensas COIll 50 µ1 de 1 M HCl por cavidade após dez « + minutos e lidas a OD450nIrl.
Condições de manchas de pontos: 5 Para seleção: Utilizou-se Milipore, nembrana de
W transferência da Immobilon cat. N° IPVH304FO. Antígeno 14- 3-3 eta foi fervido em tarnpão de arnostra por cinco íninutos e rrtantido eni resfriamento. Antígeno foi rnanchado por urrt 0 total de 6 µg de quantidades de pontos COIll urna pipeta. Após 10 perrnitir a secagem do antígeno por quinze rninutos, as manchas foram lavadas COIll diversas alterações de PBS-Tween pH 7,4. As rrtanchas forani niantidas eni placas de Petri separadas por todo o processo de seleção.
Bloqueio: a memibrana de PVDF foi bloqueada com leite 15 em pó a 5°0 em PBS (pH 7,4) por uma hora à temperatura ambiente. A mancha foi lavada após bloqueio por quinze minutos com diversas alterações de PBS-Tween, pH 7,4. As 0 manchas foram mantidas para secar sobre papel-toalha coni a face para cinía por dez minutos antes da aplicação de 20 anticorpo primário.
Primeiro anticorpo: Sobrenadante de cultivo de tecido de hibridoma AUGI-CLDK, anti-AUG2-KKLE, anti-AUG3-CKNS ou anti-14-3-3 eta de camundongo e controles monoclonais de carnundongos forarrt incubados coin manchas ein placas de Petri 25 separadas. Soro pré-irnunológico de camundongo e soro imunológico anti-AUG1-CLDK, anti-AUG2-KKLE, anti-AUG3-CKNS e anti-14-3-3 eta de camundongos foram diluídos 1/500 erri sobrenadante de cultivo de tecido SP2/0 utilizado como controle. As rrtanchas Pram incubadas com agitação por yma hora à temperatura ambiente. As manchas foraín lavadas após a incubação de anticorpo primáric por trinta minutos corn í cinco alterações de PBS-Tween, pH 7,4.
5 Segundo anticorpo: Igg/lgM,anticamundongos de cabra 1/500 (H+L), Fosfatase Alcalina conjugada (Rockland 610- 4502), diluído em PBS-Tween, pH 7,4, foi adicionado às manchas e incubado coin agitação em placas de Petri por uina 6 \ j hora à teraperatura arnbiente. As rnanchas foram lavadas após 10 a incubação de anticorpo secundário por trinta minutos com cinco alterações de P13S-Tween, pH 7,4. As manchas forain equilibradas em tarnpão Tris 0,1 M, pH 9, por dez minutos à temperatura ambiente e, ent seguida, secas por perfusão antes da adição de substrato.
15 Substrato: Substrato de memb.rana AP de urn componente reveladora BCIP/NBT (B1OFX produto n° BCID-1OOO-O1) foi gotejado sobre a niancha pura à temperatura ambiente. A € reação foi suspensa após cinco minutos com água fria da torneira, os resultados . foram deterrninados 20 quantitativamente de forma visual e receberarn uma avaliação de forte positivo +++, positivo moderado ++, positivo fraco +, positivo leve +/- ou negativo .
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Todas as citações são expressamente incorporadas 25 integralmente ao presente conto referência.

Claims (1)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Método para tratamento de artrite caracterizado pelo fato de que compreende a admínistração a pacientes de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista de 5 14-3-3, em que c) mencionado antagonista de 14-3-3 é capaz de ligar-se especificarnente a uma proteína 14-3-3 em local extracelular, em que a rnencionada proteína 14-3-3 é selecionada a partir de ísoformas y e rj-
    2. Método de acordo com a reívindicação 1, 10 caracterizado pelo fato de que o mencionado antagonísta de 14-3-3 é um peptídeo.
    3. Método de acordo COIll a reivindicaçáo 2, '""""'.""caracterizado "pelo""fato " de.. que o" mencionado '"peptídeo " compreende a seqüência de aminoácido de R-18.
    15 4. Método de acordo corn a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o mencionado peptídeo consiste essencia1mente da seqüência de aminoácido de R-18.
    5. Método de acordo com a reívíndicação 2, caracterizado pelo fato de que o mencíonado peptídeo 20 compreende um segmento da seqüência de aminoácído de R-18.
    6. Método de acordo co:m a reivíndicação 1, caracterizado pelo fato de que o mencionado aritagonista de 14-3-3 é um anticorpo anti-14-3-3.
    7. Método de acordo com a reivíndícaçâo 6, 25 caracterizado pelo fato de que o mencionado anticorpo é um anticorpo monoclonal.
    8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o mencíonado anticorpo bb} 2/11 t¥ caracterizado pelo fato de que o mencíonado anticorpo z , monoclonal é um anticorpo monoclonal humanizado.
    9. Método de acordo com a reivindicação 6,
    W
    W caracterizado pelo fato de que o mencionado anticorpo antí- 5 14-3-3 é um antícorpo anti-14-3-3 eta.
    10. Método de acordo corn a reivindicação 9, caracterizado pelo fato clje me c) mencionado anticorpo antí- 14-3-3 eta é um anticorpo pan 14-3-3. "
    11. Método de acordo com a reivindícação 9, 10 caracterizado pelo fato de que o mencionad'o antícorpo anti- 14-3-3 eta é capaz de discrimínar entre isoformas de proteinas 14-3-3.
    " '" ' "-12. MéÚido ""àe"" acordo"'" com a " reivindicáção 9," caracterizado pelo fato de que o mencionado anticorpo anti- 15 14-3-3 eta é capaz de Iigar-se especificamente a um peptídeo 14-3-3 eta de circuíto, hélice ou nãQ-hé1íce.
    13. Método de acordo com a reivindícação 9, caracterizado pelo fato de que o mencionado anticorpo anti- 14-3-3 eta é capaz de lígar-se a uma seqüência de 20 amínoácido selecionada a partír do grupo que consiste de SpQ ID' N° 1-32.
    14. Método de acordo com a reivi-ndicação 9, caracterizado pelo fato de que o mencíonado anticorpo anti- 14-3-3 eta é capaz de ligar-se específicamente à seqüência 25 de aminoácido LDKFLIKNSNDF (SEQ ID N° 30).
    15. Método de acordo com a reivíndicação 9, Caracterizado pelo fato de que o mencionado anticorpo antí- 14-3-3 eta é capaz de Iigar-se especificamente à seqüência
    _' F) 3/11 ©J , de aminòácido KKLEKVKAYR (SEQ ID N° 31). & k 16. Método de acordo com a reivíndícação 9, caracterizado pelo fato de que o mencionado anticorpo anti- % 14-3-3 eta é capaz de ligar-se especificamente à seqüência 5 de aminoácido KNSVVEASEAAYKF,A (SEQ ID N° 32).
    17. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o uiencionado anticorpo anti- l4-3-3 é urn anticorpo anti-14-3-3 gama.
    18. Método de acordo cQm a reivíndicação 17, lO caracterizado pelo fato de que o mencionado antícorpo anti- 14-3-3 gama é um anticorpo pan 14-3-3.
    19. Método de acordo com a 'reivindicação 17, - T r '— ' caracteri-Zaáo pelo fato de que o' Inencíonàdo anticorpo anti- 14-3-3 gama é capaz de díferenciar entre ísoformas de 15 proteínas 14-3-3.
    20. Método de acordo com a ' reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o mencionado anticorpo anti- l4-3-3 gama é capaz de ligar-se especificaínente a um peptídeo 14-3-3 gama de circu.íto, hélice ou não-hélice.
    20 21. Método de acordo coiii a reívindícação 17, caracterizado pel.o fato de que o mencíonado anticorpo anti— 14-3-3 gama é capaz de Iigar-se a uma seqüêncía de aniinoácído selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID N° 33-62.
    25 22. Anticorpo caracterizado pelo fato de ser para uso 6 no Mtodo de acordo corn uma qualquer das reivíndicações 6 a 21 H
    23. Hibridoma caracterizado pelo fato de ser capaz de
    -
    P y} \ 4/11 Sf) l 4 ;6jg, produzir o antícorpo conforme descrito na reivindicação 22. 4 P 24. Antagonista de 14-3-3 caracterizado pelo fato de . ser para uso no tratamento de artríte, em que o mencionado & antagonista de 14-3-3 é capaz de Ligar-se especifícamente a 5 uma proteína 14-3-3 em local extraceluíar, em que a mencionada proteína 14-3-3 é selecionada a partir de isoformas y e rj.
    25. Antagonista de 14-3-3 de acordo com a reivindicação 24, caracterízado pelo fato de que c) 10 niencionado antagonista de 14-3-3 é um peptídeo.
    26. Antagonista de 14-3-3 de acordo com a reívindicação 25, caracterizado pelo fato de que o —. 0 . .
    " KenciÔnaào pepÈídêo cómpre"inde a seqüência de aminoácido de R_l8.
    15 27. Antagonista de 14-3-3 de acordo coin a reívindicaçào 25, caracterízado pelo fato de que o ínencíonado peptídeo consiste essencialmente da seqüência de aminoácido de R-18.
    28. Antagonísta de 14-3-3 de acordo com a 20 reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o mencionado peptídeo compreende um segmento da seqüência de aminoácido de R-18.
    29. Antagonista de 14-3-3 de acordo com a reivindicação 24, caracterízado pelo fato de que o 25 mencionado antagonista de 14-3-3 é um anticorpo anti-14-3—
    3.
    30. Antagonista de 14-3-3 de acordo COIll a reivi-ndicação 29, caracterízado pelo fato de que o
    % $j mencionado antícorpo é um anticorpo monoc1ona1. . m2 & 31. Antagonista de 14-3-3 de acordo com a reivíndicação 30, caracterizado pelo fato de que o E' inencionado anticorpo wonocj-onal é um anticorpo rnonoclonal
    Õ 5 humanizado.
    32. Antagonísta de 14-3-3 de acordo com a reívindicação 29, caracterízado pelo fato de que o l mencionado anticorpo antí-14-3-3 é um antieorpo anti-14-3-3 " eta.
    10 33. Aritagonista de 14-3-3 de acordo com a reivíndicação 32, caracterizado pelo fato de que o . mencionado anticorpo anti-14-3-3 eta é um anticorpo pan 14- '" UG3. .· " - . ., - ! :. " " . . -. . ....— . ..-
    34. Arltagonista de 14-3-3 de acordo com a 15 reivindicação" 32, caracterizado pelo fato de que o mencíonado anticorpo antí-14-3-3 eta é capaz de discriminação entre isoformas de proteína 14-3-3.
    35. Antagonísta 14-3-3 de acordo COIll a reivíndicação 32, caracterizado pelo fato de que o mencionado anticorpo 20 anti—14-3-3 eta é capaz de ligar-se especificamente a um peptídeo 14-3-3 eta de circuito, hélice ou não—hélice.
    36. Antagonista de 14-3-3 de acordo com a reivindicação 32, caracterízado pelo fato de que o mencionado anticorpo antí-14-3-3 eta é capaz de ligar-se a 25 unía seqüência de amínoácido selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID N° 1-32.
    37. Antagonista de 14-3-3 de aeordo corn a reivindicação 32, caracterízado pelo fato de que o
    ¥1 6/11 y .Y ,4
    L ej 0 ' mencíonado anticorpo anti-14-3-3 eta é capaz de ligar-se à ? h seqüência de aminoácído LDKFLIKNSNDF (SEQ ID N° 30).
    38. Antagonista de 14-3-3 de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o 5 mencionado anticorpo anti-14-3-3 eta é capaz de ligar-se especíÈicamente à seqüência de aminoácido KKLEKVKAYR (SEQ ID N° 31).
    39. Ant-agonista de 14-3-3 de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o 10 mencionado anticorpo anti-14-3-3 eta é capaz de ligar-se especificamente à seqüência de aminoácido KNSVVEASEAAYKEA (SEQ ID N° 32).
    ""'"""'"'"""40'"...'·"=tãg"ónista' dé "'14-3-3 -"de ·acordo " Com - .- a - .
    reivíndícação 29, caracterízado pelo fato de que o 15 mencionado anticorpo anti-14-3-3 é um anticorpo anti-14-3-3 gama .
    41. Antagonísta de 14-3-3 de acordo com a reivindicaçào 40, caracterizado pelo fato de que o mencionado anticorpo anti-14-3-3 gama é um anticorpo pan 20 14-3-3.
    42. Antagonista de 14-3-3 de acordo com a reivindicação 40, caracterízado pelo fato de que o mencionado anticorpo antí-14-3-3 gama é capaz de diferencíar entre isoformas de proteína 14-3-3.
    25 43. Antagonista 14-3-3 de acordo com a reivindícação 40, caracterizado pelo fato de que o mencíonado anticorpo anti-14-3-3 gaina é capaz de ligar-se específícamente a um peptídeo 14-3-3 gama de circuito, hélíce ou não-hélice.
    B 7/11 C,| h
    44. Ãntagonista de 14-3-3 de acordo com a j m 0 reívíndicação 40, caracterizado pelo fato de que o mencíonado anticorpo anti-14-3-3 gama é capaz de ligar-se a e uma seqüência de arninoácido selecíonada a par"tir do grupo - 5 que consiste de SEQ ID N° 33-62.
    45. Antagonísta de 14-3-3 de acordo cow uma qualquer das rei-vindicações 29 a 44, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é produzido por um hibridoma.
    46- Uso de uma quantídade eficaz de um antagonista de 10 14-3-3 caracterizado pelo falo de ser no tratamento de artrite, em que o mencionado antagonista de 14-3-3 é capaz de ligar-se especificamente a uma proteína 14-3-3 em I-ocal ' j"""" 'extracelular, em que a· meri'cíonada ptioteína'""14-3-3 "é selecíonada a partir de isoforinas y e rj- 15 47. Uso de uma antagonista de 14-3—3 caracterízado pelo falo de ser formulação de um medicamento para o tratamento de artrite, em que o mencionado an-tagonista de 14-3-3 é capaz de ligar-se especificarnente a uma proteína 14-3—3 em local extracelular, em que a mencíonada proteína 20 14-3-3 é selecionada a partir de isoformas y e 4-
    48. Uso de acordo com uma qjualquer das reívindicações 46 ou 47, caracterizado pelo fato de que o mencíonado antagonista de 47-14-3 é um peptídeo.
    49. Uso de acardo com a reivindicação 48, 25 caracterizado pelo fato de que o rnencionado peptídeo compreende a seqüêncía de aminoácido de R-18.
    50. Uso de acordo com a reivtijndicação 48, caracterizado pelo fato de que o mencionado peptídeo
    Hr 8/11 4 ti consiste essencialmente da seqüência de aminoácido de R-18. a ?
    51. Método de acordo coin a reívindicação 48, caracterizado pelo fato de que o mencionado peptídeo k compreende um segmento da seqüência de aminoácido de R-18.
    5 52. Uso de acordo com uma qualquer das reivíndícações 46 ou 47, caracterízado pelo fato de que o mencionado antagonista de 14-3-3 é um anticorpo anti-14-3-3.
    ' 53. Uso de acordo com a reívindicação 52, caracterizado pelo fato de que o mencionado anticorpo é um 10 antícorpo monoclonal.
    54. Uso de acordo com a reivindícação 53, caracterizado pelo fato de que o mencionado anticorpo "W : _ "" monoclonal 'é' ún a1itiCorÉ)o monoclonal humanizado.
    55. Uso de acordo com a reivindicação 52, 15 cara'cterizado pelo fato de que o mencionado antícorpo anti- 14-3-3 é um anticorpo anti-14-3-3 eta.
    56. Uso de acordo com a reivi-ndicação 55, caracterizado pelo fato de que o mencionado anticorpo antí- 14-3-3 eta é um anticorpo pan 14-3-3.
    20 57. Usq de acordo com a reivíndícação 55, caracterizado pelo fato de que o mencíonado anticorpo antí- 14-3-3 eta é capaz de discriminar entre isoforruas de proteínas 14-3-3.
    58. Uso de acordo com a reivindicação 55, 25 caracterizado pelo fato de que o mencíonado antícorpo anti- 14-3-3 eta é capaz de I-igar—se especifícamente a um peptídeo 14-3-3 eta de circuito, hélice ou não-héííce.
    59. Uso de acordo com a reivindicação 55,
    .
    _ 6 b 9/11 b .$ caracterizado pelo fato de que o mencíonado anticorpo anti- ? b 14-3-3 eta é capaz de lígar-se a uma seqüência de amínoácido selecionada a partir do grupo que consiste de e SEQ ID N° 1-32.
    5 60. Uso de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que o rnencionado anticorpo anti- 14-3-3 eta é capaz de ligar-se e3pecificamente à seqüência de aminoácido LDKFLIKNSNDF (SEQ ID N° 30).
    61. Uso de acordo com a reívindícação 55, 10 caracterizado pelo fato de que o mencionado a-nticorpo anti- 14-3-3 eta é capaz de ligar-se especifícamente à seqüência de aminoácido KKLEKVKAYR (SEQ ID N° 31).
    — .. - .- ' "' 62". "Uso de aCordo""""" com'" " a" "rè/vinàicaçãi 55, caracterizado pelo fato de que o mencionado anticorpo anti- 15 14-3-3 eta é capaz de ligar-se especificamente à seqüêncía de aminoácido KNSVVEASEAAYKEA (SEQ ID N°' 32).
    63. Uso de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que o mencionado anticorpo anti- 14-3-3 ê um a-nticorpo anti-14-3-3" gama.
    20 64. Uso de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que o mencionado anticorpo anti- l4-3—3 gama é um anticorpo pan 14-3-3.
    65. Uso de acordo com a reivindicação 63, caracteri-zado pelo fato de que o mencíonado anticorpo anti- 25 14-3-3 gama é capaz de se diferenciar entre isoformas de proteínas 14-3-3.
    66. Uso de acordo coin a reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que o mencionado anticorpo anti-
    à "*' 1'0/11 k 3 14-3-3 gama é capaz de lígar-se especifica.mente a íun .g , peptídeo 14-3-3 gama de circuito, hélice ou não-hélice. -
    67. Uso de acordo com a reivindicação 63, 9 caracterizado pelo fato de que o mencionado anticorpo anti- " 5 14-3-3 garna é capaz de ligar-se a uma seqüência de arriinoácído selecionada a partir do grupo que consíste de SEQ ID N° 33-62.
    , 68. Uso de aco'rdo com uma qualquer das reivindicações 5'2 a 67, caracterizado pelo fato de que o .anticorpo é 10' ptQduzido por um hibridoma.
    6.9. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de 'que compreende um antagonista de 14-3-3 em uma ;. ". '"" . Eormuíação que" fo"rriéce" c)' encaixe 'de "proteína 14-3-3 em localização extracelular pelo mencíonado antagonista de 14- 15 3-3 após a adminístração.
    70. Cornposição farmacêutica de acordo coiil a reivíndicação 69, caracterizada pelo fato de que o rnencionado antagonista de 14-3-3 é um antícorpo anti-14-3-
    3.
    20 71. Composição farmacêutíca de acordo com a reivindicação 69, caracterizada pelo fato de que o mencionado antagonista de 14-3-3 é um peptídeo.
    72. Método para redução da expressão de MMP no sinóvio de um paciente caracterizado pelo fato de que 25 compreende a administração ao paciente de uma composição farmacêutica conforme definido na reívindicação 69.
    73. Método conforme a reivindicação 72, caracterizado pelo fato de que o mencíonado MMP é sel-ecíonado a partir do
    — ' a "« 11/11 y á t 'N grupo que consiste de MMP-I, 3, 8, 9, 10, 11 e 13. ? L 74. Método de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pelo fato de que o mencionado MMP é MMP-I ou MMP-3.
    5 75. Composição farínacêutica de acordo com a reivindicação 69, caracterizada pelo fato de que se destina a uso na redução da expressão de MMP no sínóvio de um paciente.
    76. Composição farmacêutica de acordo coin a 10 reivindicação 75, caracterizada pelo fato de que o mencionado rn4p é selecíonado a partir do grupo que consiste de MMP-I, 3, 8, 9, 10, 1I e 13.
    "' ""' TiC .- . - ..- conposiçãó'"farmacêütj-ca dé aCÒrdo coin "a ' reivíndicação 76, caracterízada pelo fato de que o 15 mencionado MMP é MMP-I ou MMP-3.
    78. Uso de uma composi-ção farmacêutica de acordo corn a reivindicação 69, caracterízado pelo fato de que se ' destina à redução da expressão de MMP no sinóvío de um paciente.
    ZO 79. Uso de acordo com a reivíndícação 78, caracterizado pelo fato de que c) mencíonado MMP é selecíonado a partir do grupo que consiste de MMP-I, 3, 8, 9, 10, 11 e 13.
    80. Uso de acordo com a reivíndicação 79, 25 caracterízado pelo fato de que o mencionado MMP é MMP-I ou MMP-3.
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