ES2911460T3 - Variantes con Fc inactivado de anticuerpos anti-CD40 - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo aislado dirigido contra un polipéptido CD40 diana (SEQ ID NO: 28), caracterizado por que dicho anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 11 y la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 12, para su uso en el tratamiento de trastornos autoinmunitarios y/o trastornos inflamatorios, donde el anticuerpo se administra combinado con fármacos inmunosupresores o fármacos antiinflamatorios.

Description

DESCRIPCIÓN

Variantes con Fc inactivado de anticuerpos anti-CD40

Campo de la invención

La presente divulgación se refiere a variantes de fragmentos constantes (Fc) inactivados (silent) de anticuerpos anti-CD40 y composiciones y métodos de uso de dichos anticuerpos para tratar trastornos patológicos tales como trastornos inmunitarios e inflamatorios y/o para prevenir o reducir el riesgo de rechazo del injerto en el trasplante.

A pesar de la disponibilidad de varios tratamientos inmunosupresores para enfermedades autoinmunitarias, sigue habiendo una gran necesidad no cubierta de fármacos más eficaces y más seguros en una gran fracción de la población de pacientes. Por ejemplo, a pesar de la eficacia publicada de las terapias de reducción/inhibición de linfocitos B como Rituximab y Belimumab en artritis reumatoide, lupus eritematoso diseminado, síndrome de Sjogren y esclerosis múltiple, estos tratamientos son solamente eficaces en una parte de los individuos enfermos, y con Rituximab, con un riesgo concomitante de leucoencefalopatía multifocal progresiva. Además, otros múltiples tipos celulares leucocíticos a menudo están involucrados en la patología de estas enfermedades autoinmunitarias tales como los macrófagos, las células dendríticas y los linfocitos T, por lo tanto, la intervención terapéutica dirigida a tipos celulares adicionales o rutas inmunológicas clave que inhiban su función podrían proporcionar un beneficio. Dadas las múltiples funciones inmunológicamente relevantes de CD40-CD154 en la activación y función de estos tipos celulares, es probable que un anticuerpo anti-CD40 confiera beneficio terapéutico a pacientes que padecen enfermedades autoinmunitarias presentadas anteriormente más allá del proporcionado actualmente por los tratamientos actuales. Además, la función central de las interacciones de CD40-CD154 en trastornos inflamatorios intestinales tales como la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa, y las vinculaciones mecánicas de la ruta de CD40 con la patología en trastornos más infrecuentes tales como vasculitis autoinmunitaria, pénfigo vulgar e ITP también resalta el potencial de los anticuerpos anti-CD40 en estas indicaciones.

Los inmunosupresores disponibles en la actualidad utilizados después del trasplante de un órgano sólido proporcionan una eficacia a corto plazo excelente. Se observan rechazos agudos dentro del periodo de novo en un 5 % - 20 % de los receptores (dependiendo del órgano, población de pacientes y pauta) y la proporción de injertos perdidos debido a los rechazos agudos dentro del periodo de novo está por debajo de un 5 % en cualquier situación. Actualmente, la necesidad no cubierta clave es la tolerabilidad de la inmunosupresión con el paciente y la supervivencia del injerto a largo plazo. Después de un trasplante renal, un 33 % de los pacientes muere y/o pierde su injerto en un plazo de 5 años; el promedio de edad de muerte del receptor de trasplante es de 58 años. Los inhibidores de calcineurina (CNI, por sus siglas en inglés) siguen siendo el componente principal de la terapia inmunosupresora para la inmensa mayoría de los pacientes trasplantados. Aunque la nefrotoxicidad y la morbilidad cardiovascular asociadas con CNI son uno de los factores de nefropatía crónica de aloinjertos, así como de muerte de los pacientes con un injerto funcional, la inmunosupresión primaria alternativa no ha podido remplazar los CNI. Globalmente, todavía hay margen de mejora en la inmunosupresión de trasplantes a largo plazo. El daño inmunológico mediado por linfocitos B de riñones trasplantados puede contribuir a malos resultados a largo plazo y la comunidad médica cada vez es más consciente de la necesidad de nuevos agentes para abordar el rechazo de los linfocitos B.

Chir12.12 es un anticuerpo no agonista completamente humanizado anti-CD40 (IgG1, kappa) que bloquea la activación de leucocitos mediada por CD154 (también conocido como ligando de CD40; CD40L) y puede mediar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) de los linfomas humanos de leucocitos y linfocitos B in vitro (véase el documento WO2006/073443). El documento WO2005/044306 también describe anticuerpos antagonistas anti-CD40, incluido Chir12.12 para su uso en particular en el tratamiento de trastornos autoinmunitarios e inflamatorios. Además, Chir12.12 es eficaz para retrasar el rechazo de aloinjerto de riñón cuando se administra como monoterapia en Macaca fascicularis (monos cinomolgos) [Li et al. (2008) Transplantation; 86 (1):10-15]. Sin embargo, Chir12.12 también puede mediar la reducción de linfocitos B periféricos en primates no humanos (NHP, por sus siglas en inglés).

Se prevé que los mAb anti-CD40 con actividad ADCC inactivada tendrán un perfil de seguridad mejorado con respecto a los anticuerpos anti-CD40 originales y, en particular, pueden ser más adecuados para indicaciones no oncológicas, tales como enfermedades autoinmunitarias y uso en un contexto de trasplante.

Por lo tanto, la presente divulgación proporciona anticuerpos monoclonales anti-CD40 con Fc inactivado que conservan los atributos de bloqueo de CD40L no agonistas del anticuerpo anti-CD40 original Chir12.12.

En particular, la divulgación proporciona un anticuerpo aislado o una proteína que comprenden una porción de unión al antígeno de un anticuerpo dirigido contra el polipéptido CD40 diana (SEQ ID NO:28), caracterizados por que dicho anticuerpo o proteína

a) se une al polipéptido CD40 con una K^d igual o inferior a 10 nM, y

b) comprende una región Fc de IgG inactivada.

En un aspecto de la divulgación, dicho anticuerpo o proteína inhibe la señalización inducida por CD40L con una CI⁵⁰ igual o inferior a 50 ng/mL.

En otro aspecto de la divulgación, en el anticuerpo aislado o proteína de acuerdo con la divulgación tiene una actividad agonista reducida o nula con respecto a la señalización de CD40.

En otro aspecto de la divulgación, el anticuerpo o proteína de acuerdo con la presente divulgación comprende una región de Fc de IgG inactivada seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18 o SEQ ID NO:19.

En otro aspecto de la divulgación, el anticuerpo aislado o proteína de la divulgación comprende regiones variables de la cadena pesada (V^h) y la cadena ligera (V^l) que tienen al menos un 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 por ciento de identidad secuencial con V^h del anticuerpo Chir12.12 (SEQ ID NO:9) y V^l del anticuerpo Chir12.12 (SEQ ID NO:10), respectivamente.

Son ejemplos específicos de anticuerpos de acuerdo con la invención

- mAb1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 11 y la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de la SEQ ID NO:12 para su uso en el tratamiento de trastornos autoinmunitarios y/o trastornos inflamatorios, donde el anticuerpo se administra combinado con fármacos inmunosupresores o fármacos antiinflamatorios.

Son ejemplos específicos de anticuerpos de acuerdo con la divulgación

- mAb2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 13 y la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de la SEQ ID NO:14, o,

- mAb3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 15 y la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de la SEQ ID NO:16.

El anticuerpo aislado de acuerdo con la invención se puede utilizar como un medicamento para su uso en el tratamiento de trastornos autoinmunitarios, trastornos inflamatorios combinado con fármacos inmunosupresores o fármacos antiinflamatorios.

El anticuerpo aislado de acuerdo con la invención se puede utilizar en particular en el tratamiento de la esclerosis múltiple, el lupus eritematoso diseminado, síndrome de Sjogren, artritis reumatoide y enfermedad del injerto contra el hospedador combinado con fármacos inmunosupresores o fármacos antiinflamatorios.

La divulgación también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos o proteínas de acuerdo con la divulgación anteriores, combinados con al menos un excipiente, diluyente o portador farmacéuticamente aceptable. Dichas composiciones farmacéuticas pueden comprender además otros principios activos.

La divulgación también se refiere a un liofilizado o una formulación líquida de un anticuerpo o proteína de acuerdo con la divulgación.

La divulgación se refiere además al ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo o proteína de acuerdo con la divulgación y el correspondiente vector de clonación o expresión que comprende al menos un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: de 22 a 27.

La divulgación también se refiere a una célula hospedadora que comprende uno o más vectores de clonación o expresión como se han definido anteriormente.

La divulgación proporciona además un proceso para la producción de un anticuerpo o una proteína de la divulgación, que comprende cultivar la célula hospedadora como se ha definido anteriormente, y purificar y recuperar dicho anticuerpo o proteína.

Con el fin de que la presente invención se entienda más fácilmente, primero se definen ciertos términos y expresiones. A lo largo de la descripción detallada se exponen definiciones adicionales.

La expresión «respuesta inmunitaria» se refiere a la acción de, por ejemplo, linfocitos, células presentadoras de antígeno, células fagocíticas, granulocitos y macromoléculas solubles producidas por las células anteriores o el hígado (incluidos anticuerpos, citocinas y el complemento) que provoca daño selectivo en, destrucción de o eliminación del organismo humano de los patógenos invasores, las células o tejidos infectados con patógenos, las células cancerosas o, en casos de autoinmunidad o inflamación patológica, células o tejidos humanos normales.

Una «ruta de transducción de señales» o «actividad de señalización» se refiere a una relación causal bioquímica generalmente iniciada mediante una interacción de proteína-proteína tal como la unión de un factor de crecimiento a un receptor, que provoca la transmisión de una señal desde una porción de una célula hasta otra porción de una célula. En general, la transmisión conlleva la fosforilación específica de uno o más residuos de tirosina, serina o treonina en una o más proteínas en la serie de reacciones que provoca la transducción de señales. Los penúltimos procesos incluyen generalmente eventos nucleares, que dan lugar a un cambio en la expresión génica.

El término CD40 se refiere a CD40 humano, por ejemplo como se define en la SEQ ID NO: 28 , salvo que se describa de otro modo.

El término «anticuerpo», como se menciona en la presente, incluye anticuerpos enteros y cualquier fragmento de unión al antígeno (es decir, "porción de unión al antígeno") o cadenas sencillas de este.

Un «anticuerpo» que se produce de forma natural es una glucoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada comprende una región variable de la cadena pesada (abreviada en la presente como V^h) y una región constante de la cadena pesada. La región constante de la cadena pesada comprende tres dominios: CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera comprende una región variable de la cadena ligera (abreviada en la presente como V^l) y una región constante de la cadena ligera. La región constante de la cadena ligera comprende un dominio, C^l. Las regiones V^h y V^l se pueden subdividir además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones de armazón (FR, por sus siglas en inglés). Cada V^h y V^l está compuesta de tres CDR y cuatro FR dispuestas desde el extremo amino hasta el extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, c DR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar en la unión de la inmunoglobulina a tejidos o factores del hospedador, incluidas diversas células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema del complemento clásico.

La expresión «porción de unión al antígeno» de un anticuerpo (o simplemente «porción antigénica»), como se utiliza en la presente, se refiere a la longitud completa o uno o más fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad de unirse específicamente a un antígeno (por ejemplo, una porción de CD40). Se ha mostrado que la función de unión al antígeno de un anticuerpo se puede realizar mediante fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de unión englobados dentro de la expresión «porción de unión al antígeno» de un anticuerpo incluyen un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios V ^l, V^h, C^l y CH1; un fragmento F(ab)², un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab ligados mediante un puente disulfuro en la región bisagra; un fragmento Fd que consiste en los dominios V^h y CH1; un fragmento Fv que consiste en los dominios V^l y V^h de un solo brazo de un anticuerpo; un fragmento dAb (Ward et al. 1989, Nature 341:544-546), que consiste en un dominio V^h; y una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada, o cualesquiera proteínas de fusión que comprendan dicha parte de unión al antígeno.

Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, V^l y V^h estén codificados por genes separados, se pueden unir, utilizando métodos recombinantes, a través de un conector sintético que permita prepararlos como proteína monocatenaria en la que las regiones V^l y V^h se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv monocatenario (scFv); véase, por ejemplo, Bird et al., 1988 Science 242:423-426; y Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883). Se pretende que dichos anticuerpos monocatenarios también estén englobados en la expresión «porción de unión al antígeno» de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen utilizando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia y los fragmentos se criban en función de su utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos.

Tal como se utiliza en la presente, la expresión "región Fc de IgG» se utiliza para definir la región del extremo C de una cadena pesada de inmunoglobulina, que incluye la región Fc de la secuencia nativa y las regiones Fc variantes. La región Fc de la cadena pesada de IgG humana en general se define como una que comprende el residuo aminoacídico desde la posición C226 o desde P230 hasta el extremo carboxilo del anticuerpo IgG. La numeración de los residuos en la región Fc es la del índice EU de Kabat. La lisina del extremo C (resto K447) de la región Fc se puede eliminar, por ejemplo, durante la producción o purificación del anticuerpo. Por consiguiente, una composición de anticuerpos de la divulgación puede comprender poblaciones de anticuerpos con todos los residuos K447 eliminados, poblaciones de anticuerpos donde no se han eliminado los residuos K447, y poblaciones de anticuerpos que tienen una mezcla de anticuerpos con y sin el residuo K447.

Un «anticuerpo aislado», tal como se utiliza en la presente, se refiere a un anticuerpo que está sustancialmente exento de otros anticuerpos con especificidades antigénicas diferentes (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a CD40 está sustancialmente exento de anticuerpos que se unen específicamente a otros antígenos que no son CD40). Un anticuerpo aislado que se une específicamente a CD40 puede presentar, sin embargo, reactividad cruzada con otros antígenos, tales como moléculas CD40 de otras especies (no humanas). Además, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente exento de otro material celular y/o productos químicos.

Las expresiones «anticuerpo monoclonal» o «composición de anticuerpo monoclonal» tal como se utilizan en la presente se refieren a un preparado de moléculas de anticuerpo de una sola composición molecular. Una composición de anticuerpo monoclonal muestra una sola especificidad de unión y afinidad por un epítopo particular.

Tal como se utiliza en la presente, la expresión «anticuerpo humanizado», se pretende que incluya anticuerpos que contienen una secuencia mínima derivada de secuencias de inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región hipervariable (también conocida como región determinante de la complementariedad o CDR) del receptor son reemplazados por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. La frase «región determinante de la complementariedad» se refiere a secuencias de aminoácidos que juntas definen la afinidad y especificidad de unión de una región Fv natural de un sitio de unión de inmunoglobulina nativo. Véase, por ejemplo, Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917: Kabat et al. (1991) Depto. Estadounidense de Sanidad y Servicios Sociales, Publicación de NIH N.° 91-3242). La frase «región constante» se refiere a la porción de la molécula del anticuerpo que confiere funciones efectoras. Entre trabajos anteriores, que trataban sobre la producción de anticuerpos no inmunógenas para su uso en la terapia de una enfermedad humana, se sustituyeron regiones constantes de ratón por regiones constantes humanas. Las regiones constantes de los anticuerpos humanizados en cuestión proceden de inmunoglobulinas humanas. La humanización se puede realizar siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327: Verhoeyen et al., (1988) Science 239: 1534-1536), sustituyendo con CDR o secuencias de CDR de roedor y de roedor mutadas las secuencias correspondientes de anticuerpo humano. En algunos casos, los residuos dentro de las regiones de armazón de una o más regiones variables de la inmunoglobulina humana son reemplazados por residuos no humanos correspondientes (vénase, por ejemplo, las Patentes de EE. UU. N.os 5585089; 5693761; 5693762; y 6180370). Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. El anticuerpo humanizado de la divulgación también comprenderá al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc). Normalmente, la de una inmunoglobulina humana y, en el presente caso, una región Fc inactivada de IgG.

Los anticuerpos de la divulgación pueden incluir residuos aminoacídicos no codificados por secuencias humanas (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica del sitio in vitro o por mutación somática in vivo). En particular, la expresión «anticuerpo humanizado» incluye anticuerpos que comprenden una variante inactivada de una región Fc de IgG.

La expresión «anticuerpo monoclonal humanizado» se refiere a anticuerpos que muestran una única especificidad de unión que tienen regiones variables en las que las regiones variables se humanizan a partir de secuencias no humanas.

La expresión «anticuerpo recombinante», tal como se utiliza en la presente, incluye todos los anticuerpos humanos o humanizados que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, tales como anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico o transcromosómico para genes de inmunoglobulina humana o un hibridoma preparado a partir de estos, anticuerpos aislados de una célula hospedadora transformada para expresar el anticuerpo humano o humanizado, por ejemplo, a partir de un transfectoma, anticuerpos aislados a partir de una colección de anticuerpos humanos combinatorios recombinantes y anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que conlleva el corte y empalme de la totalidad o de una porción de un gen de inmunoglobulina humana, secuencias en otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos humanos o humanizados recombinantes tienen regiones variables en las cuales las regiones de armazón y CDR pueden proceder de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. En ciertas realizaciones de la divulgación, sin embargo, dichos anticuerpos humanos o humanizados recombinantes se pueden someter a mutagénesis in vitro (o, cuando se utiliza un animal transgénico para secuencias de Ig humana, mutagénesis somática in vivo) y, por tanto, las secuencias de aminoácidos de las regiones V^h y V^l de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque proceden de y están relacionadas con las secuencias de V ^h y V^l de la línea germinal humana, no pueden existir de forma natural dentro del repertorio de la línea germinal de anticuerpos humanos in vivo.

Tal como se utiliza en la presente, «isotipo» se refiere a la clase de anticuerpo (por ejemplo, IgM, IgE, IgG, tal como IgG1 o IgG4) proporcionada por los genes de la región constante de la cadena pesada. Diferentes isotipos tienen una función efectora diferente. Por ejemplo, los isotipos de IgG1 e IgG3 humana natural median la actividad de citoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC, por sus siglas en inglés).

Las expresiones «un anticuerpo que reconoce un antígeno» y «un anticuerpo específico para un antígeno» y «un anticuerpo dirigido contra un antígeno» se utilizan de manera intercambiable en la presente con la expresión «un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno».

Tal como se utiliza en la presente, se pretende que un anticuerpo o una proteína que «se une específicamente al polipéptido CD40» se refiera a un anticuerpo o proteína que se une al polipéptido c D40 humano con una K^d igual o inferior a 100 nM, igual o inferior a 10 nM, igual o inferior a 1 nM.

Se pretende que un anticuerpo que «presenta reactividad cruzada con un antígeno que no es CD40» se refiera a un anticuerpo que se une a ese antígeno con una K^d igual o inferior a 1pM, igual o inferior a 100nM, igual o inferior a 10nM, igual o inferior a 1nM. Se pretende que un anticuerpo que «no presenta reactividad cruzada con un antígeno particular» se refiera a un anticuerpo que se une a ese antígeno, con una K^d igual o superior a 100 nM, o una K^d igual o superior a 1 pM, o una K^d igual o superior a 10 pM. En ciertas realizaciones de la divulgación, dichos anticuerpos que no presentan reactividad cruzada con el antígeno muestran una unión esencialmente indetectable contra estas proteínas en ensayos de unión estándar.

Se pretende que el término «K^asoc» o «K^a», tal como se utiliza en la presente, se refiera a la velocidad de asociación de una interacción particular de anticuerpo-antígeno, mientras se pretende que el término «K^dis» o «K^d», como se utiliza en la presente, se refiera a la velocidad de disociación de una interacción particular de anticuerpo-antígeno.

Se pretende que el término «K^d», tal como se utiliza en la presente, se refiera a la constante de disociación, que se obtiene de la relación de K^d respecto a K^a (es decir, K^d/K^a) y se expresa como una concentración molar (M). Los valores de K^d para anticuerpos se pueden determinar utilizando métodos muy consolidados en la técnica. Un método para determinar la K^d de un anticuerpo es la utilización de la resonancia de plasmones superficiales, o la utilización de un sistema biosensor tal como un sistema Biacore^® .

Tal como se utiliza en la presente, el término «afinidad» se refiere a la fuerza de la interacción entre el anticuerpo y el antígeno en sitios antigénicos individuales. Dentro de cada sitio antigénico, la región variable del «brazo» del anticuerpo interactúa a través de fuerzas no covalentes débiles con el antígeno en numerosos sitios; cuantas más interacciones, más fuerte es la afinidad.

Tal como se utiliza en la presente, el término «avidez» se refiere a una medida informativa de la estabilidad o fortaleza global del complejo de anticuerpo-antígeno. Está controlado por tres factores principales: afinidad del epítopo del anticuerpo; la valencia tanto del antígeno como del anticuerpo; y la disposición estructural de las partes que interactúan. En última instancia, estos factores definen la especificidad del anticuerpo, es decir, la probabilidad de que el anticuerpo particular se una a un epítopo antigénico preciso.

Tal como se utiliza en la presente, se pretende que la expresión «antagonista de CD40» se refiera a un anticuerpo o proteína que inhibe la actividad de señalización inducida por CD40 en presencia de CD40L en un ensayo con células humanas tales como el ensayo de proliferación de PBMC mediado por CD40L. Se describe un ensayo de este tipo más detalladamente en los ejemplos más adelante. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos de la invención inhiben la señalización inducida por CD40L con una CI⁵⁰ igual o inferior a 500 ng/mL, preferentemente con una CI⁵⁰ igual o inferior a 50 ng/mL, por ejemplo, con una CI⁵⁰ igual o inferior a 20 ng/mL, según se mide en un ensayo de proliferación de PBMC mediada por CD40L.

Tal como se utiliza en la presente, se pretende que un anticuerpo «sin actividad agonista» se refiera a un anticuerpo que no aumenta significativamente la actividad de señalización mediada por CD40 en ausencia de CD40L en un ensayo con células, tal como el ensayo de proliferación de PMBC mediada por CD40L. Se describe un ensayo de este tipo más detalladamente en los ejemplos más adelante.

Tal como se utiliza en la presente, el término «ADCC» o la actividad «citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos» se refiere a una actividad de reducción de células. La actividad ADCC se puede medir mediante el ensayo de ADCC como se describe más detalladamente en los Ejemplos más adelante.

Tal como se utiliza en la presente, el término anticuerpo «inactivado» se refiere a un anticuerpo que muestra una actividad ADCC reducida o nula según se mide en un ensayo de ADCC como se describe en los Ejemplos

En una realización, la expresión «actividad ADCC reducida o nula» significa que el anticuerpo inactivado muestra una actividad ADCC que es inferior a un 50 % de lisis celular específica, por ejemplo, inferior a un 10 % de lisis celular específica según se mide en el ensayo de ADCC como se describe en los Ejemplos. La ausencia de actividad ADCC significa que el anticuerpo inactivado muestra una actividad ADCC (lisis celular específica) que es inferior a un 1 %. En un aspecto específico de la divulgación, un anticuerpo inactivado de acuerdo con la divulgación no muestra ninguna actividad de ADCC significativa según se mide en un ensayo de ADCC como se describe en los Ejemplos.

Las funciones efectoras inactivadas se pueden obtener por mutación en la región Fc de los anticuerpos y se han descrito en la técnica: LALA y N297A (Strohl, W., 2009, Curr. Opin. Biotechnol. vol. 20(6):685-691); y D265A (Baudino et al., 2008, J. Immunol. 181: 6664-69; Strohl, W., mencionado anteriormente). Los ejemplos de anticuerpos IgG1 con Fc inactivado comprenden el denominado mutante LALA que comprende la mutación L234A y L235A en la secuencia de aminoácidos de Fc de IgG1. Otro ejemplo de un anticuerpo IgG1 inactivado comprende la mutación D265A. Otro anticuerpo IgG1 inactivado comprende la mutación N297A, que da como resultado anticuerpos aglucosilados/no glucosilados.

Tal como se utiliza en la presente, el término «selectividad» para un anticuerpo o proteína de la divulgación se refiere a un anticuerpo o proteína que se une a un cierto polipéptido diana pero no polipéptidos muy relacionados.

Tal como se utiliza en la presente, la expresión «afinidad elevada» de un anticuerpo se refiere a un anticuerpo que tiene una K^d igual o inferior a 1 nM por un antígeno diana. Tal como se utiliza en la presente, el término "sujeto" incluye cualquier ser humano o animal no humano.

La expresión «animal no humano» incluye todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, caballos, vacas, gallinas, anfibios, reptiles, etc.

Tal como se utiliza en la presente, el término "optimizada" significa que se ha alterado una secuencia de nucleótidos para que codifique una secuencia de aminoácidos utilizando codones que son preferidos en la célula u organismo de producción, en general una célula eucariota, por ejemplo, una célula de Pichia, una célula de Trichoderma, una célula de ovario de hámster chino (CHO) o una célula humana. La secuencia de nucleótidos optimizada se modifica para que conserve por completo o tanto como sea posible la secuencia de aminoácidos codificada originalmente por la secuencia de nucleótidos de partida, que también se conoce como la secuencia «original». Las secuencias optimizadas en la presente se han modificado para que tengan codones que son preferidos en células de mamífero CHO, sin embargo, también se prevé la expresión optimizada de estas secuencias en otras células eucariotas en la presente. Las secuencias de aminoácidos codificadas por secuencias de nucleótidos optimizadas también se denominan optimizadas.

Tal como se utiliza en la presente, el porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de identidad = n.° de posiciones idénticas/n.° total de posiciones x 100), teniendo en cuenta el número de huecos, y la longitud de cada hueco, que se deben introducir para un alineamiento óptimo de las dos secuencias. La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede conseguir utilizando un algoritmo matemático, tal como se describe más adelante.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar utilizando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17, 1988) que se ha incorporado al programa ALIGN (versión 2.0), utilizando una tabla de residuos ponderados PAM120, una penalización de longitud de hueco de 12 y una penalización de hueco de 4. Como alternativa, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch 1970 (J. Mol, Biol. 48:444-453, 1970) que se ha incorporado al programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com), que utiliza una matriz Blossom 62 o una matriz PAM250, y una ponderación de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y una ponderación de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos nucleotídicas también se puede determinar utilizando, por ejemplo, algoritmos tales como el programa BLASTN para secuencias de ácido nucleico utilizando por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una esperanza (E) de 10, M = 5, N = 4 y una comparación de ambas hebras.

Anticuerpos recombinantes

Los anticuerpos de la divulgación incluyen los anticuerpos recombinantes humanizados mAb1-mAb3, aislados y caracterizados estructuralmente por sus secuencias de aminoácidos completas de la cadena pesada y ligera como se describen en la Tabla 1 a continuación:

Tabla 1: Secuencias de aminoácidos completas de la cadena pesada y ligera de mAb1-mAb3.

Las correspondientes regiones variables, secuencias de aminoácidos de V^h y V^l de tales anticuerpos aislados mAb2-mAb3 de la divulgación y mAb1 de la invención proceden todos del mismo anticuerpo Chir12.12 descrito previamente, por ejemplo, en el documento WO2006/073443 y que consiste en la secuencia de aminoácidos de V ^h de la SEQ ID NO:7 y la secuencia de aminoácidos de V^l de la SEQ ID NO:8.

Una diferencia importante de los anticuerpos de la invención en comparación con CHIR12.12 original es que tiene una región Fc, constituida por una región Fc inactivada de IgG, por ejemplo, region Fc inactivada de IgG1.

En particular, la Tabla 2 resume la modificación de la región Fc de IgG1 realizada para obtener los anticuerpos mAbl -mAb3 en comparación con el anticuerpo original CHIR12.12.

Tabla 2: Modificación de la región Fc de IgG1 para obtener mAb1-mAb3

Otros anticuerpos de la divulgación incluyen aquellos que tienen aminoácidos que han sido mutados mediante una deleción, inserción o sustitución de aminoácidos, pero que siguen teniendo al menos un 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 por ciento de identidad con las regiones V ^h y V^l de CHIR12.12, respectivamente la SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:8, y que comprenden una región Fc inactivada de IgG, por ejemplo, una región Fc inactivada de IgG1.

En algunos aspectos de la divulgación, el anticuerpo de la divulgación es una variante mutante de uno cualquiera de mAb1-mAb3, donde dicho anticuerpo variante mutante incluye secuencias aminoacídicas mutantes donde se han mutado como máximo 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos mediante deleción, inserción o sustitución de aminoácidos en las regiones V^h y V^l en comparación con las regiones V^h y V^l de CHIR12.12, respectivamente la SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:8, y que mantienen las mismas regiones constantes que mAb1, mAb2 o mAb3.

Las secuencias de nucleótidos que codifican las cadenas ligera y pesada completas de mAb1-mAb3 se muestran en la Tabla 3 a continuación.

Tabla 3: Secuencias de ADN que codifican las cadenas pesada y ligera completas

Otros ácidos nucleicos que codifican anticuerpos de la divulgación incluyen ácidos nucleicos que han sido mutados mediante deleción, inserción o sustitución de nucleótidos, pero que siguen teniendo al menos un 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 por ciento de identidad con las regiones correspondientes que codifican V ^h y V^l de CHIR12.12, como se muestra en las secuencias descritas, por ejemplo, en la SEQ ID NO:20 y SEQ ID NO:21, respectivamente, y que comprenden una secuencia que codifica una región Fc inactivada de IgG, por ejemplo, una región Fc inactivada de IgG1.

En algunos aspectos de la divulgación, esta incluye ácidos nucleicos variantes donde han sufrido cambios como máximo 1, 2, 3, 4 o 5 nucleótidos mediante deleción, inserción o sustitución de nucleótidos en las regiones que codifican V^h y V^l, representándose las regiones que codifican V^h y V^l en las secuencias descritas, por ejemplo, en la SEQ ID NO:20 y SEQ ID NO:21, respectivamente, y que mantienen las mismas secuencias que codifican las regiones constantes que las correspondientes secuencias codificantes de mAb1, mAb2 o mAb3.

Anticuerpos homólogos

Los anticuerpos o proteínas homólogos de acuerdo con la divulgación son anticuerpos o proteínas que comprenden una porción de unión al antígeno de un anticuerpo dirigido contra un polipéptido CD40 diana (SEQ ID NO:28), caracterizados por que dicho anticuerpo o proteína

a) se une al polipéptido CD40 con una K^d igual o inferior a 10 nM, y

b) comprende una región Fc de IgG inactivada

y donde dichos anticuerpos o proteínas homólogos mantienen las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos mAb1-mAb3 originales.

Las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos mAb1-mAb3 originales se pueden seleccionar entre una o más de las siguientes propiedades:

(i) se une específicamente a CD40, por ejemplo, siendo la K^d igual o inferior a 100 nM, igual o inferior a 10 nM, o igual o inferior a 1 nM, según se mide en el ensayo de Biacore;

(ii) es un antagonista de CD40, por ejemplo, inhiben la señalización inducida por CD40L según se mide en un ensayo de proliferación de p Bm C mediado por CD40L;

(iii) muestra una actividad agonista reducida o nula, según se mide en un ensayo de proliferación de PBMC mediado por CD40L;

(iv) presenta reactividad cruzada con el polipéptido CD40 de mono cinomolgo;

(v) tiene una actividad ADCC reducida o nula; y

(vi) tiene propiedades adecuadas para el desarrollo de fármacos.

En un aspecto específico de la divulgación, dichos anticuerpos o proteínas homólogos de acuerdo con la divulgación comprenden una región Fc de IgG1 inactivada, por ejemplo, una región Fc de IgG1 inactivada seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18 o SEQ ID NO:19.

En un aspecto específico de la divulgación, la divulgación se refiere a un anticuerpo o proteína que tiene secuencias de nucleótidos de la cadena pesada y ligera de la región variable o secuencias de aminoácidos de la cadena pesada y ligera de la región variable, o las secuencias de nucleótidos que codifican o las secuencias de aminoácidos de las 6 CDR que son homólogas a las secuencias nucloetídicas o aminoacídicas correspondientes de los anticuerpos mAb1-mAb3 descritos anteriormente, en particular en la Tabla 1, y dicho anticuerpo o proteína comprende una región Fc de IgG inactivada seleccionada del grupo que consiste en la región Fc de mAb1 (SEQ ID NO:17), la región Fc de mAb2 (SEQ ID NO:18) y la región Fc de mAb3 (SEQ ID NO:19), donde dicho anticuerpo proteína homólogos se unen específicamente a CD40, y el anticuerpo o proteína muestra las siguientes propiedades funcionales: es un antagonista de CD40, muestra una actividad agonista reducida o nula y tiene una actividad ADCC reducida o nula.

Por ejemplo, la divulgación se refiere a anticuerpos o proteínas homólogos a mAb1 -mAb3, que comprenden una región Fc de IgG inactivada seleccionada del grupo que consiste en la región Fc de mAb1 (SEQ ID NO:17), la región Fc de mAb2 (SEQ ID NO:18) y la región Fc de mAb3 (SEQ ID NO:19), y que comprende secuencias de una cadena pesada variable (V^h) y una cadena ligera variable (V^l) donde las secuencias de CDR comparte al menos un 60, 70, 90, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 por ciento de identidad secuencial con las secuencias CDR correspondientes de mAb1-mAb3, respectivamente las SEQ ID Nos:1-6, donde dicho anticuerpo o proteína homólogo se une específicamente a CD40, y el anticuerpo o proteína homólogo muestra las siguientes propiedades funcionales: es un antagonista de CD40, muestra una actividad agonista reducida o nula y tiene una actividad ADCC reducida o nula.

En una realización específica relacionada, el anticuerpo o proteína homólogo

a) se une a CD40 con una K^d igual o inferior a 1 nM;

b) inhibe la señalización inducida por CD40L con una CI⁵⁰ igual o inferior a 50 ng/mL según se mide en un ensayo de proliferación de PBMC mediada por CD40L descrito en los Ejemplos;

c) tiene una actividad agonista reducida o nula según se mide en un bioensayo tal como el ensayo de proliferación de PBMC mediado por CD40L según se describe en los Ejemplos; y

d) tiene una actividad ADCC reducida o nula.

La divulgación se refiere además a anticuerpos o proteínas homólogos a mAb1-mAb3, que comprenden una región Fc de IgG inactivada seleccionada del grupo que consiste en la región Fc de mAb1 (SEQ ID NO:17), la región Fc de mAb2 (SEQ ID NO:18) y la región Fc de mAb3 (SEQ ID NO:19), y que comprende secuencias de una cadena pesada variable (V^h) y una cadena ligera variable (V^l) que comparten al menos un 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 por ciento de identidad secuencial con las correspondientes secuencias de (V^h) y (V^l) de mAb1-mAb3, respectivamente la SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:8, donde dicho anticuerpo o proteína homólogo se une específicamente a CD40, y el anticuerpo o proteína muestra las siguientes propiedades funcionales: es un antagonista de CD40, muestra una actividad agonista reducida o nula y tiene una actividad ADCC reducida o nula.

En un aspecto específico relacionado de la divulgación, dicho anticuerpo o proteína homólogo

a) se une a CD40 con una K^d igual o inferior a 1 nM;

b) inhibe la señalización inducida por CD40L con una CI⁵⁰ igual o inferior a 50 ng/mL según se mide en un ensayo de proliferación de PBMC mediada por CD40L descrito en los Ejemplos;

c) tiene una actividad agonista reducida o nula según se mide en un bioensayo tal como el ensayo de proliferación de PBMC mediado por CD40L descrito en los Ejemplos; y

d) tiene una actividad ADCC reducida o nula.

En otro ejemplo, la divulgación se refiere a anticuerpos o proteínas homólogos a mAb1-mAb3 que comprenden una región Fc de IgG inactivada seleccionada del grupo que consiste en la región Fc de mAb1 (SEQ ID NO:17), la región Fc de mAb2 (SEQ ID NO:18) y la región Fc de mAb3 (SEQ ID NO:19), y donde: las cadenas variables pesada y ligera están codificadas por una secuencia de nucleótidos que es al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o un 100 % idéntica a la secuencia de nucleótidos correspondiente que codifica a las cadenas variables pesada y ligera de mAb1-mAb3, donde dicho anticuerpo o proteína homólogo se une específicamente a CD40, y el anticuerpo o proteína muestra las siguientes propiedades funcionales: es un antagonista de CD40, muestra una actividad agonista reducida o nula y tiene una actividad ADCC reducida o nula.

En un aspecto específico relacionado de la divulgación, dicho anticuerpo o proteína homólogo

a) se une a CD40 con una K^d igual o inferior a 1 nM;

b) inhibe la señalización inducida por CD40L con una CI⁵⁰ igual o inferior a 50 ng/mL según se mide en un ensayo de proliferación de PBMC mediada por CD40L descrito en los Ejemplos;

c) tiene una actividad agonista reducida o nula según se mide en un bioensayo tal como el ensayo de proliferación de PBMC mediado por CD40L descrito en los Ejemplos; y

d) tiene una actividad ADCC reducida o nula.

Los anticuerpos con secuencias de aminoácidos mutantes se pueden obtener por mutagénesis (por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio o mediada por PCR) de las moléculas de ácido nucleico codificantes, seguida de estudio del anticuerpo alterado codificado para determinar la función conservada (es decir, las funciones expuestas anteriormente) utilizando los ensayos funcionales descritos en los Ejemplos más adelante.

En ciertos aspectos de la divulgación, los anticuerpos o proteínas homólogos a mAb1-mAb3 como se han descrito anteriormente tienen modificaciones conservadoras de la secuencia.

Tal como se utiliza en la presente, se pretende que la expresión «modificaciones conservadoras de la secuencia» haga referencia a sustituciones de aminoácido en los que el residuo aminoacídico es reemplazado por un residuo aminoacídico que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de residuos aminoacídicos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen los aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales ramificadas en la posición beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por lo tanto, uno o más residuos aminoacídicos dentro de las regiones CDR de un anticuerpo de la divulgación pueden ser reemplazados por otros residuos aminoacídicos de la misma familia de cadenas laterales, y el anticuerpo alterado se puede estudiar para determinar la función retenida utilizando los ensayos funcionales descritos en la presente.

Se pueden introducir modificaciones en un anticuerpo de la invención mediante técnicas estándares conocidas en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR.

Moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpos de la invención

Otro aspecto de la divulgación se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican los anticuerpos de la invención como se ha descrito anteriormente.

Se pueden obtener ejemplos de secuencias de nucleótidos de las cadenas ligera y pesada de uno cualquiera de mAb1 a mAb3 de la Tabla 3 (que muestra las secuencias de nucleótidos completas que codifican las cadenas pesada y ligera de mAb1 a mAb3).

Otros ejemplos de secuencias de nucleótidos de las cadenas ligera y pesada de acuerdo con la divulgación son cualquier secuencia que codifica las secuencias de aminoácidos pesada y/o ligera completas de mAb1, mAb2 o mAb3, como se describe en la Tabla 1.

La divulgación también se refiere a moléculas de ácido nucleico que se obtienen de estas últimas secuencias que se han optimizado respecto a la expresión de proteínas en células de mamífero, por ejemplo, líneas celulares CHO.

Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en células completas, en un lisado celular, o pueden ser ácidos nucleicos en una forma purificada parcialmente o sustancialmente pura. Un ácido nucleico se «aísla» o «se hace sustancialmente puro» cuando se purifica de otros componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo, otros ácidos nucleicos o proteínas celulares, por técnicas convencionales, que incluyen el tratamiento alcalino/con SDS, generación de bandas con CsCl, cromatografía en columna, electroforesis en gel de agarosa y otras bien conocidas en la técnica. Véase, F. Ausubel, et al., ed. 1987, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, Nueva York. Un ácido nucleico de la divulgación puede ser, por ejemplo, ADN o ARN y puede contener secuencias intrónicas o no. En una realización, el ácido nucleico es una molécula de ADNc. El ácido nucleico puede estar presente en un vector tal como un vector de presentación en fagos, o en un vector plasmídico recombinante.

Los ácidos nucleicos de la divulgación se pueden obtener utilizando técnicas convencionales de biología molecular. Una vez obtenidos fragmentos de ADN que codifican, por ejemplo, segmentos V^h y V^l, estos fragmentos de ADN se pueden manipular adicionalmente por técnicas convencionales de ADN recombinante, por ejemplo, para convertir los genes de la región variable en genes de cadena de anticuerpo de longitud completa, en genes de un fragmento Fab o en un gen de scFv. En estas manipulaciones, un fragmento de ADN que codifica V ^l o V^h se liga operablemente a otra molécula de ADN, o a un fragmento que codifica la región constante del anticuerpo de mAb1-mAb3 que comprende la región Fc como se define en las SEQ ID NOs:17-19.

Se pretende que la expresión «ligado operablemente», como se utiliza en este contexto, signifique que los dos fragmentos de ADN se unen de una manera funcional, por ejemplo, de modo que las secuencias de aminoácidos codificadas por los dos fragmentos de ADN permanecen en el marco de lectura, o de modo que la proteína se exprese bajo el control de un promotor deseado.

El ADN aislado que codifica la región V^h se puede convertir en un gen de cadena pesada de longitud completa ligando operablemente el ADN que codifica V^h a otra molécula de ADN que codifica las regiones constantes de la cadena pesada (CH1, CH2 y CH3). En la técnica se conocen las secuencias de los genes de la región constante de la cadena pesada humana (véase, por ejemplo, Kabat, E. A., et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, Departamento Estadounidense de Sanidad y Servicios Sociales, Publicación NIH N.° 91-3242) y se pueden obtener fragmentos de ADN que abarcan estas regiones mediante amplificación por PCR estándar. La región constante de la cadena pesada se puede seleccionar entre los isotipos de IgG1 que comprenden una región Fc como se define en las SEQ ID NOs:17-19.

El ADN aislado que codifica la región V^l se puede convertir en un gen de cadena ligera de longitud completa (así como un gen de la cadena ligera de Fab) ligando operablemente el ADN que codifica V^l a otra molécula de a Dn que codifica la región constante de la cadena ligera, CL. En la técnica se conocen las secuencias de los genes de la región constante de la cadena ligera humana (véase, por ejemplo, Kabat, E. A., et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, Departamento Estadounidense de Sanidad y Servicios Sociales, Publicación NIH N.° 91-3242) y se pueden obtener fragmentos de ADN que abarcan estas regiones mediante amplificación por PCR estándar. La región constante de la cadena ligera puede ser una región constante kappa o lambda.

Generación de transfectomas que producen anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos de la invención se pueden producir en un transfectoma de células hospedadoras utilizando, por ejemplo, una combinación de técnicas de ADN recombinante y métodos de transfección génica como es bien conocido en la técnica (por ejemplo, Morrison, S. (1985) Science 229:1202).

Por ejemplo, para expresar los anticuerpos, se pueden obtener ADN que codifican cadenas ligeras y pesadas parciales o de longitud completa por técnicas convencionales de biología molecular o bioquímica (por ejemplo, síntesis química de ADN, amplificación por PCR o clonación de ADNc utilizando un hibridoma que expresa el anticuerpo de interés) y los ADN se pueden insertar en vectores de expresión de modo que los genes se ligan operablemente a secuencias de control de la transcripción y la traducción. En este contexto, se pretende que la expresión «ligado operablemente» se refiera a que un gen de anticuerpo se liga en un vector de modo que las secuencias de control de la transcripción y la traducción dentro del vector cumplen su función pretendida de regular la transcripción y traducción del gen de anticuerpo. El vector de expresión y las secuencias de control de la expresión se eligen para que sean compatibles con la célula hospedadora de expresión utilizada. El gen de la cadena ligera del anticuerpo y el gen de la cadena pesada del anticuerpo se pueden insertar en vectores distintos o, más habitualmente, ambos genes se insertan en el mismo vector de expresión.

Los genes del anticuerpo se insertan en el vector de expresión mediante métodos convencionales (por ejemplo, ligando sitios de restricción complementarios en el fragmento del gen del anticuerpo y el vector, o ligando extremos romos si no hay presentes sitios de restricción). Las regiones variables de la cadena ligera y pesada de los anticuerpos descritos en la presente se pueden utilizar para crear genes de anticuerpo de longitud completa insertándolas en vectores de expresión que ya codifican las regiones constantes de la cadena pesada y regiones constantes de la cadena ligera de la secuencia deseada que corresponde a dichas regiones constantes de mAb1, mAb2 o mAb3 de modo que el segmento de V^h se liga operablemente al segmento o segmentos de C^h dentro del vector y el segmento de V^l se liga operablemente al segmento de C^l dentro del vector. De manera adicional o alternativa, el vector de expresión recombinante puede codificar un péptido señal que facilita la secreción de la cadena de anticuerpo desde una célula hospedadora. El gen de la cadena de anticuerpo se puede clonar en el vector de modo que el péptido señal se ligue en el mismo marco al extremo amino del gen de la cadena de anticuerpo. El péptido señal puede ser un péptido señal de inmunoglobulina o un péptido señal heterólogo (es decir, un péptido señal de una proteína que no es inmunoglobulina).

Además de los genes de cadena de anticuerpo, los vectores de expresión recombinante de la divulgación portan secuencias reguladoras que controlan la expresión de los genes de la cadena de anticuerpo en una célula hospedadora. Se pretende que la expresión «secuencia reguladora» incluya promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación) que controlan la transcripción o traducción de los genes de la cadena de anticuerpo. Se describen secuencias reguladoras de este tipo, por ejemplo, en Goeddel (Gene Expression Technology.

Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA 1990). Los expertos en la técnica apreciarán que el diseño del vector de expresión, incluida la selección de secuencias reguladoras, puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedadora que se va a transformar, el nivel de expresión de la proteína deseada, etc. Las secuencias reguladoras para la expresión en células hospedadoras de mamífero incluyen elementos víricos que dirigen niveles elevados de expresión de proteínas en células de mamífero, tales como promotores y/o potenciadores derivados de citomegalovirus (CMV), virus del simio 40 (SV40), adenovirus (por ejemplo, el promotor tardío principal de adenovirus (AdMLP)) y polioma. Como alternativa, se pueden utilizar secuencias reguladoras no víricas, tales como el promotor de la ubiquitina o el promotor de P-globina. Aún más, los elementos reguladores compuestos por secuencias de diferentes fuentes, tales como el sistema promotor SRa, que contiene secuencias del promotor temprano de SV40 y la repetición terminal larga del virus de la leucemia de linfocitos T humana tipo 1 (Takebe, Y. et al., 1988 Mol. Cell. Biol. 8:466-472).

Además de los genes de la cadena de anticuerpo y las secuencias reguladoras, los vectores de expresión recombinante de la divulgación pueden portar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la replicación del vector en células hospedadoras (por ejemplo, orígenes de replicación) y genes marcadores seleccionables. El gen marcador de la selección facilita la selección de células hospedadoras en las que se ha introducido el vector (véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N.os 4399216, 4634665 y 5179017, todas de Axel et al.). Por ejemplo, normalmente, el gen marcador seleccionable confiere resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina o metotrexato, en una célula hospedadora en que se ha introducido el vector. Los genes marcadores seleccionables incluyen el gen de la dihidrofolato-reductasa (DHFR) (para su uso en células hospedadoras dhfr- con selección/amplificación con metotrexato) y el gen neo (para selección con G418).

Para la expresión de las cadenas ligeras y pesadas, el vector o los vectores de expresión que codifican las cadenas pesadas y ligeras se introducen en una célula hospedadora mediante técnicas estándares para transfectarla. Se pretende que las diversas formas del término «transfección» engloben una amplia diversidad de técnicas utilizadas habitualmente para la introducción de ADN exógeno en una célula hospedadora procariota o eucariota, por ejemplo, electroporación, precipitación con fosfato de calcio, transfección con DEAE-dextrano y similares. Teóricamente es posible expresar los anticuerpos de la invención en células hospedadoras procariotas o eucariotas. La expresión de anticuerpos en células eucariotas, por ejemplo, células hospedadoras de mamífero, levaduras u hongos filamentosos, se analiza porque dichas células eucariotas y, en particular, células de mamífero, tienen una mayor probabilidad que las células procariotas de ensamblar y secretar el anticuerpo plegado correctamente y con actividad inmunológica.

En un aspecto específico, un vector de clonación o expresión de acuerdo con la divulgación comprende al menos una de las siguientes secuencias codificantes (a)-(c), ligadas operablemente a secuencias promotoras adecuadas:

(a) la SEQ ID NO:22 y SEQ ID NO:23 que codifican respectivamente las cadenas pesadas y ligeras de longitud completa de mAb1;

(b) la SEQ ID NO:24 y SEQ ID NO:25 que codifican respectivamente las cadenas pesadas y ligeras de longitud completa de mAb2; o

(c) la SEQ ID NO:26 y SEQ ID NO:27 que codifican respectivamente las cadenas pesadas y ligeras de longitud completa de mAb3.

Las células hospedadoras de mamífero para expresar los anticuerpos recombinantes de la invención incluyen células de ovario de hámster chino (células CHO) (incluidas células CHO dhfr-, descritas en Urlaub y Chasin, 1980 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220 utilizadas con un marcador seleccionable DHFR, por ejemplo, como se describe en R.J. Kaufman y P.A. Sharp, 1982 Mol. Biol. 159:601-621), líneas celulares CHOK1 dhfr+, células de mieloma NSO, células COS y células SP2. En particular, para su uso con células de mieloma NSO, otro sistema de expresión es el sistema de expresión del gen g S mostrado en las publicaciones PCT WO 87/04462, WO 89/01036 y EP 0338841.

Cuando se introducen vectores de expresión recombinante que codifican genes de anticuerpo en células hospedadoras de mamífero, los anticuerpos se producen cultivando las células hospedadoras durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células hospedadoras o la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en que se cultivan las células hospedadoras. Los anticuerpos se pueden recuperar del medio de cultivo utilizando métodos convencionales de purificación de proteínas (véase, por ejemplo, Abhinav et al. 2007, Journal of Chromatography 848: 28-37).

En una realización específica, la célula hospedadora de la divulgación es una célula hospedadora transfectada con un vector de expresión que tiene las secuencias codificantes seleccionadas del grupo que consiste en (a)-(c) adecuadas para la expresión de mAb1-mAb3, respectivamente, ligadas operablemente a secuencias promotoras adecuadas:

(a) la SEQ ID NO:22 y SEQ ID NO:23;

(b) la SEQ ID NO:24 y SEQ ID NO:25; y,

(c) la SEQ ID NO:26 y SEQ ID NO:27.

Estas últimas células hospedadoras se pueden cultivar adicionalmente en condiciones adecuadas para la expresión y producción del anticuerpo de la invención mAb1.

Moléculas biespecíficas

En otro aspecto, la presente divulgación presenta moléculas biespecíficas o multiespecíficas que comprenden una proteína o anticuerpo anti-CD40 de la divulgación. Un anticuerpo o proteína de la divulgación se puede obtener de o ligar a otra molécula funcional, por ejemplo, otro péptido o proteína (por ejemplo, otro anticuerpo o ligando para un receptor) para generar una molécula biespecífica que se une a al menos dos sitios de unión diferentes o moléculas diana. El anticuerpo de la invención, de hecho, se puede obtener de o ligar a más de una molécula funcional diferente para generar moléculas multiespecíficas que se unan a más de dos sitios de unión y/o moléculas diana diferentes; también se pretende que dichas moléculas multiespecíficas estén abarcadas por la expresión «molécula biespecífica» tal como se utiliza en la presente. Para crear una molécula biespecífica, un anticuerpo o proteína de la divulgación se puede ligar funcionalmente (por ejemplo, mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro tipo) a una o más moléculas de unión diferentes, tales como otro anticuerpo, fragmento de anticuerpo, péptido o mimético de unión, de modo que se produzca una molécula biespecífica.

Por consiguiente, la presente divulgación incluye moléculas biespecíficas que comprenden al menos una primera especificidad de unión por CD40, por ejemplo, una porción de unión al antígeno de uno cualquiera de mAb1 -mAb3 y una segunda especificidad de unión por un segundo epítopo diana. Por ejemplo, el segundo epítopo diana es otro epítopo de CD40 diferente del primer epítopo diana. Otro ejemplo es una molécula biespecífica que comprende al menos una primera especificidad de unión por CD40, por ejemplo, una porción de unión al antígeno de uno cualquiera de mAb1-mAb3 y una segunda especificidad de unión por un epítopo dentro de CD40.

Además, para la divulgación en que la molécula biespecífica es multiespecífica, la molécula puede incluir además una tercera especificidad de unión, además del primer y segundo epítopos dianas.

Las moléculas biespecíficas de la presente divulgación se pueden preparar conjugando las especificidades de unión de los componentes, utilizando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, cada especificidad de unión de la molécula biespecífica se puede generar por separado y después conjugarlas entre ellas. Cuando las especificidades de unión son proteínas o péptidos, se pueden utilizar varios agentes de acoplamiento o reticulación para la conjugación covalente. Los ejemplos de agentes de reticulación incluyen proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetiltioacetato (SATA), 5,5'-ditiobis(ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB), o-fenilendimaleimida (oPDM), 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo (SPDP) y 4-(W-maleimidometil)ciclohexan-1-carboxilato de sulfosuccinimidilo (sulfo-SMCC) (véanse, por ejemplo, Karpovsky et al., 1984 J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648). Otros métodos incluyen los descritos en Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. N.° 78 118-132; Brennan et al., 1985 Science 229:81-83), y Glennie et al., 1987 J. Immunol. 139: 2367-2375). Los agentes de conjugación son SATA y sulfo-SMCC, ambos disponibles de Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).

Cuando las especificidades de unión son anticuerpos, estos se pueden conjugar mediante unión de tipo sulfhidrilo de las regiones bisagra del extremo C de las dos cadenas pesadas. En una realización particular, la región bisagra se modifica para que contenga un número impar de restos sulfhidrilo, por ejemplo, uno, antes de la conjugación.

Como alternativa, ambas especificidades de unión se pueden codificar en el mismo vector, y expresarse y ensamblarse en la misma célula hospedadora. Este método es particularmente útil cuando la molécula biespecífica es una proteína de fusión de tipo mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')² o ligando x Fab. Una molécula biespecífica de la divulgación puede ser una molécula monocatenaria que comprenda un anticuerpo monocatenario y un determinante de unión, o una molécula biespecífica monocatenaria que comprenda dos determinantes de unión. Las moléculas biespecíficas pueden comprender al menos dos moléculas monocatenarias. Los métodos para preparar moléculas biespecíficas se describen, por ejemplo, en la Patente de EE. UU. Número 5260203; la Patente de EE. UU. Número 5455030; la Patente de EE. UU. Número 4881 175; la Patente de EE. UU. Número 5132405; la Patente de EE. UU. Número 5 091 513; la Patente de EE. UU. Número 5476786; la Patente de EE. UU. Número 5013653; la Patente de EE. UU. Número 5258498; y la Patente de EE. UU. Número 5482858.

La unión de las moléculas biespecíficas a sus dianas específicas se puede confirmar, por ejemplo, por ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA), radioinmunoensayo (REA), análisis FACS, bioensayo (por ejemplo, inhibición del crecimiento) o ensayo de inmunoelectrotransferencia. Cada uno de estos ensayos en general detecta la presencia de complejos de proteína-anticuerpo de interés especial empleando un reactivo marcado (por ejemplo, un anticuerpo) específico para el complejo de interés.

Anticuerpos multivalentes

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona anticuerpos multivalentes que comprenden al menos dos porciones de unión al antígeno idénticas o diferentes de los anticuerpos de la divulgación que se unen a CD40, por ejemplo, seleccionadas entre porciones de unión al antígeno de uno cualquiera de mAb1-mAb3. En una realización, los anticuerpos multivalentes proporcionan al menos dos, tres o cuatro porciones de unión al antígeno de los anticuerpos. Las porciones de unión al antígeno se pueden ligar entre sí a través de la fusión de proteínas o enlace covalente o no covalente. Como alternativa, se han descrito métodos de enlace para las moléculas biespecíficas. Se pueden obtener compuestos tetravalentes, por ejemplo, reticulando anticuerpos de la invención con un anticuerpo que se una a las regiones constantes de los anticuerpos de la invención, por ejemplo, la región Fc o bisagra.

Métodos de terapia que utilizan anticuerpos antagonistas anti-CD40 de la invención

La invención se refiere a anticuerpos anti-CD40 que comprenden la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 11 y la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 12, para su uso en el tratamiento de trastornos autoinmunitarios y/o trastornos inflamatorios, donde el anticuerpo se administra combinado con fármacos inmunosupresores o fármacos antiinflamatorios.

En la técnica se conocen métodos para detectar la expresión de CD40 en células y estos incluyen, entre otros, técnicas de PCR, inmunohistoquímica, citometría de flujo, inmunoelectrotransferencia, ELISA y similares.

Los anticuerpos de la invención para su uso en el tratamiento de trastornos autoinmunitarios y/o trastornos inflamatorios, administrados combinados con fármacos inmunosupresores o fármacos antiinflamatorios, son especialmente útiles para tratar enfermedades inflamatorias y/o autoinmunitarias donde está involucrada la estimulación de CD40 mediada por CD40L.

Las enfermedades inflamatorias están caracterizadas por la inflamación y destrucción de tejido, o una combinación de estos. La «enfermedad inflamatoria» incluye cualquier proceso inflamatorio mediado por el sistema inmunitario donde el evento iniciador o diana de la respuesta inmunitaria involucra un antígeno o antígenos que no son propios, incluidos, por ejemplo, aloantígenos, xenoantígenos, antígenos víricos, antígenos bacterianos, antígenos desconocidos o alérgenos.

Además, a efectos de la presente invención, la expresión «enfermedad o enfermedades inflamatorias» incluye la «enfermedad o enfermedades autoinmunitarias». Tal como se utiliza en la presente, en general se entiende que la expresión «autoinmunidad» engloba procesos inflamatorios mediados por el sistema inmunitario que involucran «autoantígenos». En las enfermedades autoinmunitarias, el autoantígeno o autoantígenos desencadenan las respuestas inmunitarias del hospedador.

Además, la presente divulgación incluye el tratamiento de la inflamación asociada con rechazo de trasplante de tejido. El «rechazo de trasplante» o «rechazo de injerto» se refiere a cualquier respuesta inmunitaria generada por el hospedador contra un injerto, incluidos, entre otros, antígenos HLA, antígenos del grupo sanguíneo y similares.

La invención también se puede utilizar para tratar la enfermedad del injerto contra el hospedador, tal como la asociada con trasplante de médula ósea, por ejemplo. En dicha enfermedad del injerto contra el hospedador, la médula ósea donante incluye linfocitos y células que maduran y dan lugar a linfocitos. Los linfocitos del donante reconocerán los antígenos del receptor como no propios y generarán una respuesta inmunitaria inflamatoria. Por tanto, tal como se utiliza en la presente, «enfermedad del injerto contra el hospedador» o «reacción del injerto contra el hospedador» se refiere a cualquier respuesta inmunitaria mediada por linfocitos T en que los linfocitos donantes reaccionan contra los antígenos del hospedador.

Los anticuerpos antagonistas anti-CD40 mAb1 se pueden utilizar de acuerdo con los métodos de la invención para tratar trastornos autoinmunitarios y/o inflamatorios incluidos, entre otros, lupus eritematoso diseminado (SLE), lupus discoide, nefritis lúpica, sarcoidosis, artritis inflamatoria, incluida la artritis juvenil, artritis reumatoide, artritis psoriásica, síndrome de Reiter, espondilitis anquilosante y artritis gotosa, rechazo de un trasplante de órgano o tejido, rechazo hiperagudo, agudo o crónico y/o enfermedad del injerto contra el hospedador, esclerosis múltiple, síndrome de hiperIgE, poliarteritis nodosa, cirrosis biliar primaria, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn, celiaquía (enteropatía sensible a gluten), síndrome de Sjogren primario (pSS), hepatitis autoinmunitaria, anemia perniciosa, anemia hemolítica autoinmunitaria, psoriasis, esclerodermia, miastenia grave, púrpura trombocitopénica autoinmunitaria, tiroiditis autoinmunitaria, enfermedad de Graves, tiroiditis de Hasimoto, enfermedad de inmunocomplejos, fatiga crónica, síndrome de disfunción inmunitaria (CFIDS), polimiositis y dermatomiositis, crioglobulinemia, trombólisis, miocardiopatía, pénfigo vulgar, fibrosis intersticial pulmonar, diabetes mellitus de tipo I y de tipo II, hipersensibilidad de tipo retardado de tipo 1,2, 3 y 4, alergia o trastornos alérgicos, respuestas inmunitarias indeseadas/imprevistas contra proteínas terapéuticas (véase, por ejemplo, la Solicitud de Patente de EE. UU. N.° US 2002/0119151 y Koren, et al. (2002) Curr. Pharm. Biotechnol. 3: 349-60), asma, síndrome de Churg-Strauss (granulomatosis alérgica), dermatitis atópica, dermatitis por contacto alérgica e irritante, urticaria, alergia mediada por IgE, ateroesclerosis, vasculitis asociadas a ANCA, vasculitis, miopatías inflamatorias idiopáticas, enfermedad hemolítica, enfermedad de Alzheimer, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica y similares.

La destrucción genética o inhibición farmacológica de la ruta de CD40-CD154 ha demostrado previamente beneficio terapéutico en los modelos clínicos o preclínicos de SLE, pSS, ITP, MS, enfermedad de Crohn, pénfigo vulgar, vasculitis autoinmunitaria y RA (Law c L, Grewal IS. (2009). Adv. Exp. Med. Biol. 2009; 647:8-36); cuya necesidad médica se detalla a continuación.

En realizaciones preferidas, los anticuerpos anti-CD40 mAb1 de la invención son útiles en el tratamiento de: (i) lupus eritematoso diseminado (nefritis lúpica), preferiblemente para proporcionar terapias eficaces que evitan los esteroides para la inducción y mantenimiento de la remisión, y prevención de la insuficiencia renal terminal; (ii) síndrome de Sjogren primario, preferentemente para la prevención de la destrucción de glándulas salivales y lagrimales, e inducción y mantenimiento de la remisión de manifestaciones extraglandulares; (iii) púrpura trombocitopénica autoinmunitaria, preferentemente tratamiento de pacientes que no responden al tratamiento habitual; (iv) vasculitis asociadas a ANCA, preferentemente inducción y mantenimiento de la remisión en pacientes que no responden a corticoesteroides, y tratamiento que evita los esteroides; (v) pénfigo vulgar, preferentemente para la inducción y mantenimiento de la remisión en pacientes que no responden a corticoesteroides, y tratamiento que evita los esteroides; (vi) esclerosis múltiple, preferentemente para proporcionar tratamientos más eficaces para la prevención de recidivas y avance de la discapacidad, y conseguir un estado sin enfermedad; y (vii) enfermedad de Crohn, preferentemente para proporcionar terapias más eficaces para el mantenimiento de la remisión, y tratamiento de pacientes que no responden a anti-TNF.

En algunas otras realizaciones, los anticuerpos anti-CD40 mAb1 de la invención son útiles para el tratamiento de inflamación pulmonar, incluidos, entre otros, rechazo de injerto de pulmón, asma, sarcoidosis, enfisema, fibrosis quística, fibrosis pulmonar idiopática, bronquitis crónica, rinitis alérgica y enfermedades alérgicas del pulmón tales como neumonitis por hipersensibilidad, neumonía eosinofílica, bronquiolitis obliterante debida a trasplante de médula ósea y/o pulmón u otras causas, ateroesclerosis de injerto/fleboesclerosis de injerto, así como fibrosis pulmonar resultante de enfermedades del colágeno, vasculares y autoinmunitarias tales como artritis reumatoide, esclerodermia y lupus eritematoso.

En la presente, «tratamiento» se define como la aplicación o administración de un anticuerpo anti-CD40 mAb1, combinado con fármacos inmunosupresores o fármacos antiinflamatorios, a un sujeto, o aplicación o administración de una composición farmacéutica que comprende dicho anticuerpo anti-CD40 a un tejido o línea celular aislados de un sujeto, donde el sujeto tiene una enfermedad autoinmunitaria y/o enfermedad inflamatoria, un síntoma asociado con una enfermedad autoinmunitaria y/o enfermedad inflamatoria, o una predisposición al desarrollo de una enfermedad autoinmunitaria y/o enfermedad inflamatoria, donde el propósito es curar, sanar, aliviar, mitigar, alterar, remediar, paliar, mejorar o influir en la enfermedad autoinmunitaria y/o enfermedad inflamatoria, cualquier síntoma asociado de la enfermedad autoinmunitaria y/o enfermedad inflamatoria, o la predisposición al desarrollo de la enfermedad autoinmunitaria y/o enfermedad inflamatoria.

Por "tratamiento" también se pretende la aplicación o administración de una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-CD40 mAb1 combinado con fármacos inmunosupresores o fármacos antiinflamatorios a un sujeto, o aplicación o administración de una composición farmacéutica que comprende dicho anticuerpo anti-CD40 a un tejido o línea celular aislados de un sujeto, donde el sujeto tiene una enfermedad autoinmunitaria y/o enfermedad inflamatoria, un síntoma asociado con una enfermedad autoinmunitaria y/o enfermedad inflamatoria, o una predisposición al desarrollo de una enfermedad autoinmunitaria y/o enfermedad inflamatoria, donde el propósito es curar, sanar, aliviar, mitigar, alterar, remediar, paliar, mejorar o influir en la enfermedad autoinmunitaria y/o enfermedad inflamatoria, cualquier síntoma asociado de la enfermedad autoinmunitaria y/o enfermedad inflamatoria, o la predisposición al desarrollo de la enfermedad autoinmunitaria y/o enfermedad inflamatoria.

Con "actividad antiinflamatoria" se quiere hacer referencia a una reducción o prevención de la inflamación. La terapia con al menos un anticuerpo anti-CD40 o proteína de acuerdo con la divulgación provoca una respuesta fisiológica que es beneficiosa con respecto al tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria y/o enfermedad inflamatoria, donde la enfermedad involucra células que expresan el antígeno CD40. Se reconoce que los métodos de la invención pueden ser útiles en la prevención del cambio fenotípico en las células, tal como proliferación, activación y similares.

De acuerdo con los métodos de la presente invención, el anticuerpo anti-CD40 mAb1 como se ha definido anteriormente en la presente se utiliza, combinado con fármacos inmunosupresores o fármacos antiinflamatorios, para fomentar una respuesta terapéutica positiva con respecto al tratamiento o prevención de una enfermedad autoinmunitaria y/o enfermedad inflamatoria.

Con «respuesta terapéutica positiva» con respecto a una enfermedad autoinmunitaria y/o enfermedad inflamatoria se quiere hacer referencia a una mejora en la enfermedad que se asocia con la actividad antiinflamatoria de estos anticuerpos o proteínas, y/o una mejora en los síntomas asociados con la enfermedad. Es decir, se puede observar un efecto antiproliferativo, y la prevención de una proliferación adicional de la célula que expresa CD40, una reducción de la respuesta inflamatoria que incluye, entre otros, reducción de la secreción de citocinas inflamatorias, moléculas de adhesión, proteasas, inmunoglobulinas (en casos en los que la célula que porta CD40 es un linfocito B), o combinaciones de estas, y similares, mayor producción de proteínas antiinflamatorias, una reducción del número de células autorreactivas, un aumento en la tolerancia inmunitaria, inhibición de la supervivencia de células autorreactivas y/o una disminución en uno o más síntomas mediados por la estimulación de células que expresan CD40. Dichas respuestas terapéuticas positivas no se limitan a la vía de administración y pueden comprender la administración al donante, al tejido donante (tal como, por ejemplo, perfusión del órgano), al hospedador, cualquier combinación de estos, y similares.

La respuesta clínica se puede evaluar utilizando técnicas de cribado tales como obtención de imágenes por resonancia magnética nuclear (RMN), obtención de imágenes por rayos X, tomografía axial computarizada (TAC), análisis por citometría de flujo o por clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), histología, anatomía patológica macroscópica y análisis químicos sanguíneos que incluyen, entre otros, cambios detectables por ELISA, RIA, cromatografía y similares. Además de estas respuestas terapéuticas positivas, el sujeto que recibe la terapia con la proteína o anticuerpo antagonista anti-CD40 de la invención puede experimentar el efecto beneficioso de una mejora de los síntomas asociados con la enfermedad.

Con «cantidad o dosis terapéuticamente eficaz» o «cantidad eficaz» se quiere hacer referencia a una cantidad de un anticuerpo anti-CD40 de la invención que, cuando se administra combinado con fármacos inmunosupresores o fármacos antiinflamatorios, propicia una respuesta terapéutica positiva con respecto al tratamiento de un sujeto con una enfermedad autoinmunitaria y/o enfermedad inflamatoria.

En algunos aspectos de la divulgación, una dosis terapéuticamente eficaz de la proteína o anticuerpo anti-CD40 de la divulgación, por ejemplo, mAb1, mAb2 o mAb3 está en el intervalo de 0. 01 mg/kg a 40 mg/kg, de 3 mg/kg a 20 mg/kg o de 7 mg/kg a 12 mg/kg. Se reconoce que el método de tratamiento puede comprender una única administración de una dosis terapéuticamente eficaz o múltiples administraciones de una dosis terapéuticamente eficaz de la proteína o anticuerpo antagonista anti-CD40 de la divulgación.

Un aspecto adicional de la divulgación es el uso de proteínas o anticuerpos anti-CD40 de la divulgación para la monitorización diagnóstica de niveles proteicos en el tejido como parte de un procedimiento de estudio clínico, por ejemplo, para determinar la eficacia de una pauta concreta de tratamiento. La detección se puede facilitar mediante el acoplamiento del anticuerpo a una sustancia detectable. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes y materiales radioactivos. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, P-galactosidasa o acetilcolinesterasa; los ejemplos de complejos de grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilaminfluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; los ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, lucifenina y aecuorina; y los ejemplos de material radiactivo adecuado incluyen 125I, 131I, 35S o 3H.

El anticuerpo anti-CD40 mAb1 se puede utilizar combinado con cualesquiera terapias conocidas para enfermedades autoinmunitarias e inflamatorias, que incluyen cualquier agente o combinación de agentes que se saben que son útiles, o que se han utilizado o que se están utilizando en la actualidad, para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias e inflamatorias. Dichas terapias y agentes terapéuticos incluyen, entre otros, cirugía o procedimientos quirúrgicos (por ejemplo, esplenectomía, linfadenectomía, tiroidectomía, plasmaféresis, leucoféresis, trasplante de células, tejidos u órganos, procedimientos intestinales, perfusión de órganos y similares), radioterapia, terapia tal como la terapia con esteroides y terapia con compuestos no esteroideos, terapia hormonal, terapia con citocinas, terapia con agentes dermatológicos (por ejemplo, agentes tópicos utilizados para tratar afecciones de la piel tales como alergias, dermatitis por contacto y psoriasis), terapia inmunosupresora y otra terapia antiinflamatoria con anticuerpos monoclonales y similares. De esta manera, las proteínas o anticuerpos antagonistas anti-CD40 descritos en la presente se administran combinados con al menos una terapia diferente, incluidos, entre otros, cirugía, perfusión de órganos, radioterapia, terapia con esteroides, terapia con compuestos no esteroideos, terapia con antibióticos, terapia antifúngica, terapia hormonal, terapia con citocinas, terapia con agentes dermatológicos (por ejemplo, agentes tópicos utilizados para tratar afecciones de la piel tales como alergias, dermatitis por contacto y psoriasis), terapia inmunosupresora, terapia con otros anticuerpos monoclonales antiinflamatorios, combinaciones de estos y similares.

Por lo tanto, cuando las terapias combinadas comprenden la administración del anticuerpo anti-CD40 mAb1, combinado con la administración de otro agente terapéutico, como con esteroides por poner un ejemplo, los métodos de la invención abarcan la coadministración, utilizando formulaciones independientes o una única formulación farmacéutica, y la administración consecutiva en cualquier orden. Cuando los métodos de la presente invención comprenden pautas terapéuticas combinadas, estas terapias se pueden administrar simultáneamente, es decir, el anticuerpo anti-CD40 de la invención se administra a la vez o en el mismo intervalo de tiempo que la otra terapia (es decir, las terapias están en curso a la vez, pero la proteína o anticuerpo anti-CD40 de la invención no se administra precisamente a la vez que la otra terapia). Como alternativa, el anticuerpo anti-CD40 de la presente invención también se puede administrar antes o después que la otra terapia. La administración secuencial de las diferentes terapias se puede realizar sin tener en cuenta si el sujeto tratado responde al primer ciclo de la terapia para disminuir la posibilidad de remisión o recidiva.

En la invención, el anticuerpo anti-CD40 mAb1 se administra combinado con fármacos inmunosupresores o fármacos antiinflamatorios, donde el anticuerpo y el agente o los agentes terapéuticos se pueden administrar secuencialmente, en cualquier orden, o simultáneamente (es decir a la vez o en el mismo intervalo de tiempo). Los ejemplos de fármacos inmunosupresores adecuados que se pueden administrar combinados con el anticuerpo antagonista anti-CD40 mAb1 incluyen, entre otros, metotrexato, ciclofosfamida, mizoribina, clorambucilo, ciclosporina, tales como, por ejemplo, ciclosporina aerosolizada (véase la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. N.° US 2002/0006901), tacrolimus (FK506; ProGrafrM), micofenolato mofetilo y azatiopurina (6-mercaptopurina), sirolimus (rapamicina), desoxiespergualina, leflunomida y sus análogos de malononitriloamida; y proteínas inmunosupresoras, incluidos, por ejemplo, anticuerpos anti-CTLA4 y fusiones de Ig, anticuerpos anti-estimuladores de linfocitos B (por ejemplo, LYm Ph OSTAT-bTm ) y fusiones de Ig (BLyS-Ig), anticuerpos anti-CD80 y etanercept (Enbrel (RTM)), así como otros anticuerpos anti-linfocitos T tales como anti-CD3 (OKT3), anti-CD4 y similares. Los ejemplos de agentes antiinflamatorios adecuados incluyen, entre otros, corticoesteroides tales como, por ejemplo, clobetasol, halobetasol, hidrocortisona, triamcinolona, betametasona, fluocinol, fluocinonida, prednisona, prednisolona, metilprednisolona; fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) tales como, por ejemplo, sulfasalazina, medicamentos que contienen mesalamina (conocidos como agentes 5-ASA), celocoxib, diclofenaco, etodolaco, fenprofeno, flurbiprofeno, ibuprofeno, ketoprofeno, meclofamato, meloxicam, nabumetona, naproxeno, oxaprocina, piroxicam, rofecoxib, salicilatos, sulindac y tolmetina; inhibidores de la fosfodiesterasa-4, anticuerpos antiinflamatorios tales como adalimumab (HUMERA (RTM), un antagonista de TNF-a) e infliximab (Remicade, un antagonista de TNF-a), y similares. También se incluyen agentes inmunomoduladores de uso actual o posible para tratar una enfermedad autoinmunitaria tales como talidomida o sus análogos tales como lenalidomida.

El rechazo de trasplante y la enfermedad de injerto frente a hospedador puede ser hiperagudo (humoral), agudo (mediado por linfocitos T) o crónico (etiología desconocida), o una combinación de estos. Por lo tanto, el anticuerpo anti-CD40 mAb1 se utiliza en algunas realizaciones para prevenir y/o mejorar el rechazo y/o los síntomas asociados con el rechazo de trasplante hiperagudo, agudo y/o crónico de cualquier tejido, incluidos, entre otros, hígado, riñón, páncreas, células de los islotes pancreáticos, intestino delgado, pulmón, corazón, córneas, piel, vasos sanguíneos, hueso, de médula ósea heteróloga o autóloga y similares. Los tejidos injertados se pueden obtener de cualquier donante y trasplantar a cualquier hospedador receptor y, por lo tanto, el procedimiento del trasplante puede comprender trasplantar tejido animal a los seres humanos (por ejemplo, xenoinjertos), trasplantar tejido de un ser humano a otro ser humano (por ejemplo, aloinjertos) y/o trasplantar tejido de una parte del cuerpo de un ser humano a otra (por ejemplo, autoinjertos).

El tratamiento con los anticuerpos o proteínas de la divulgación también puede reducir las secuelas del trasplante tales como fiebre, anorexia, anomalías hemodinámicas, leucopenia, infiltración de glóbulos blancos del órgano/tejido trasplantado, así como infecciones oportunistas.

En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD40 mAb1 se puede utilizar combinado con fármacos inmunosupresores para tratar y/o prevenir la enfermedad de injerto frente a hospedador.

Por lo tanto, en algunas realizaciones donde se utiliza el anticuerpo anti-CD40 de la invención para tratar el rechazo del injerto, se puede utilizar el anticuerpo mAb1 combinado con fármacos inmunosupresores adecuados, incluidos, entre otros, metotrexato, ciclofosfamida, mizoribina, clorambucilo, ciclosporina, tales como, por ejemplo, ciclosporina aerosolizada (véase la Publicación de Solicitud de Patente de EE. u U. N.° US20020006901), tacrolimus (FK506; ProGrafm), micofenolato mofetilo y azatiopurina (6-mercaptopurina), sirolimus (rapamicina), desoxiespergualina, leflunomida y sus análogos de malononitriloamida; moduladores inmunitarios, incluida, por ejemplo, la talidomida y sus análogos; y proteínas inmunosupresoras, incluidos, por ejemplo, anticuerpos anti-CTLA4 y fusiones de Ig, anticuerpos anti-estimuladores de linfocitos B (por ejemplo, LYMPHOSTAT-BTM) y fusiones de Ig (BLyS-Ig), anticuerpos anti-CD80 y etanercept (Enbrel (RTM)), así como otros anticuerpos anti-linfocitos T tales como anti-CD3 (OKT3), anti-CD4 y similares.

Como tal, se contempla específicamente que las composiciones y métodos de la invención se utilizan combinados con otros fármacos para mejorar adicionalmente los síntomas y desenlaces en los receptores de trasplantes, tales como los que reciben injertos pulmonares o renales, por ejemplo. Por lo tanto, en algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD40 mAb1 se utiliza para tratar la enfermedad de injerto contra hospedador en los receptores de trasplantes pulmonares o renales combinado con la administración por vía parenteral y/o no parenteral de ciclosporina, incluidas, por ejemplo, ciclosporina oral, ciclosporina inyectable, ciclosporina aerosolizada (por ejemplo, inhalada) y combinaciones de estas. En algunas realizaciones donde al menos un componente de la terapia es ciclosporina aerosolizada, la ciclosporina se suministra al pulmón del receptor mediante inhalación de la ciclosporina en forma de espray de tipo aerosol, por ejemplo, un nebulizador o dispositivo de suministro presurizado. La ciclosporina se puede administrar en forma húmeda o de polvo seco. La ciclosporina se puede administrar como una dosis subterapéutica.

En otras realizaciones, el anticuerpo anti-CD40 mAb1 se puede utilizar combinado con fármacos inmunosupresores para tratar y/o prevenir la artritis reumatoide. Por lo tanto, en algunas realizaciones donde se utiliza el anticuerpo anti-CD40 mAb1 para tratar la artritis reumatoide, dicho anticuerpo se puede utilizar combinado con fármacos inmunosupresores adecuados incluidos, sin carácter limitante, metotrexato, ciclofosfamida, mizoribina, clorambucilo, ciclosporina, tacrolimus (FK506; PROGRAFTM), micofenolato mofetilo y azatioprina (6-mercaptopurina), sirolimus (rapamicina), desoxiespergualina, leflunomida y sus análogos de malononitriloamida; y proteínas inmunosupresoras incluidos, por ejemplo, anticuerpos anti-CTLA y fusiones de Ig, anticuerpos anti-estimuladores de linfocitos B (por ejemplo, LYMPHo StAT-BTM) y fusiones de Ig (BLyS-Ig), anticuerpos anti-CD20 (por ejemplo, RITUXAN (g)); el anticuerpo totalmente humano HuMax-CD20, R-1594, IMMU-106, TRU-015, Am E-133, tositumomab/1-131, tositumomab (Bexxar (D), ibritumomab tituxetano (Zcvalin (RTM)); anticuerpos anti-CD80 y etanercept (ENBREL), así como anticuerpos anti-linfocitos T tales como anti-CD3 (OKT3), anti-CD4, y similares. Como se han analizado anteriormente, la eficacia del tratamiento se puede evaluar utilizando cualquier medio e incluye, entre otros, efectividad medida en función de las respuestas clínicas definidas por los criterios del Colegio Estadounidense de Reumatología, los criterios de la Liga Europea de Reumatismo o cualesquiera otros criterios. Véanse, por ejemplo, Felson et al. (1995) Arthritis. Rheum. 38 : 727-35 y van Gestel et al. (1996) Arthritis Rheum. 39: 34-40.

En otras realizaciones más, el anticuerpo anti-CD40 mAb1 se puede utilizar combinado con fármacos inmunosupresores para tratar y/o prevenir la esclerosis múltiple. Por lo tanto, en algunas realizaciones donde se utiliza el anticuerpo anti-CD40 mAb1 para tratar la esclerosis múltiple, los anticuerpos se pueden utilizar combinados con fármacos inmunosupresores adecuados incluidos, sin carácter limitante, metotrexato, ciclofosfamida, mizoribina, clorambucilo, ciclosporina, tacrolimus (FK506; PROGRAFTM), micofenolato mofetilo y azatioprina (6-mercaptopurina), sirolimus (rapamicina), desoxiespergualina, leflunomida y sus análogos de malononitriloamida; y proteínas inmunosupresoras incluidos, por ejemplo, anticuerpos anti-CTLA y fusiones de Ig, anticuerpos anti-estimuladores de linfocitos B (por ejemplo, LYMPHOSTAT-BTM) y fusiones de Ig (BLyS-Ig), anticuerpos anti-CD20 (por ejemplo, RITUXAN (D)); el anticuerpo totalmente humano HuMax-CD20, R-1594, IMMIJ-106, TRU-015, AME-133, tositumomab/1-131, tositumomab (Bexxar (RTM), ibritumomab tituxetano (Zevalin (RTM)); anticuerpos anti-CD80 y etanercept (ENBREL), así como anticuerpos anti-linfocitos T tales como anti-CD3 (OKT3), anti-CD4, agentes involucrados en la modulación del receptor de S1P, incluidos, por ejemplo, fingolimod; y similares.

Formulaciones farmacéuticas y modos de administración

El anticuerpo anti-CD40 de esta invención se administra a una concentración que es terapéuticamente eficaz para prevenir o tratar enfermedades autoinmunitarias y/o enfermedades inflamatorias y/o para prevenir o reducir los riesgos asociados a la enfermedad de injerto contra hospedador en el trasplante.

Para conseguir este objetivo, los anticuerpos se pueden formular utilizando diversos excipientes aceptables conocidos en la técnica. Normalmente, los anticuerpos o proteínas se administran mediante inyección, por ejemplo, por vía intravenosa, intraperitoneal o subcutánea. Los expertos en la técnica conocen los métodos para conseguir esta administración. También puede ser posible obtener composiciones que se pueden administrar por vía tópica u oral, o cuya transmisión a través de las membranas mucosas sea posible.

La administración intravenosa ocurre preferentemente con infusión durante un periodo de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 horas, más preferentemente durante de aproximadamente 1 a aproximadamente 8 horas, aún más preferentemente durante de aproximadamente 2 a aproximadamente 7 horas, aún más preferentemente todavía durante de aproximadamente 4 a aproximadamente 6 horas, dependiendo de la proteína o anticuerpo anti-CD40 que se está administrando. La infusión inicial con la composición farmacéutica se puede administrar durante un periodo de aproximadamente 4 a aproximadamente 6 horas suministrando las infusiones posteriores con mayor rapidez. Las posteriores infusiones se pueden administrar durante un periodo de aproximadamente 1 a aproximadamente 6 horas, incluidos, por ejemplo, de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 horas, de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 horas o de aproximadamente 1 a aproximadamente 2 horas.

Una composición farmacéutica de la divulgación se formula para que sea compatible con su vía de administración prevista. Los ejemplos de posibles vías de administración incluyen la administración parenteral (por ejemplo, intravenosa (IV), intramuscular (IM), intradérmica, subcutánea (SC) o infusión), oral y pulmonar (por ejemplo, inhalación), nasal, transdérmica (tópica), transmucosa y rectal. Las soluciones o suspensiones utilizadas para la aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metilparabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminatetraacético; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. El pH se puede ajustar con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. El preparado parenteral se puede encapsular en ampollas, jeringuillas desechables o viales multidosis hechos de vidrio o plástico.

Las proteínas o anticuerpos anti-CD40 de la divulgación se proporcionan normalmente mediante una técnica estándar en el seno de un tampón farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, solución salina estéril, agua tamponada estéril, propilenglicol, combinaciones de los anteriores, etc. Los métodos para preparar agentes que se pueden administrar por vía parenteral se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences (18.a ed.; Mack Publishing Company, Eaton, Pensilvania, 1990). Véase también, por ejemplo, el documento WO 98/56418, que describe formulaciones farmacéuticas de anticuerpos estabilizadas adecuados para su uso en los métodos de la presente invención.

Un experto en la técnica puede determinar fácilmente la cantidad del anticuerpo antagonista anti-CD40 de la invención que se debe administrar. Los factores que influencian el modo de administración y la cantidad respectiva de al menos una proteína o anticuerpo antagonista anti-CD40 incluyen, entre otros, la enfermedad particular que está recibiendo terapia, la gravedad de la enfermedad, los antecedentes de la enfermedad, la edad, altura, peso, salud y estado físico del individuo que está recibiendo la terapia. De manera similar, la cantidad de proteína o anticuerpo antagonista anti-CD40 que se va a administrar dependerá del modo de administración y de si el sujeto recibirá una única dosis o múltiples dosis de este agente. Generalmente, se prefiere una dosificación más elevada de proteína o anticuerpo anti-CD40 según aumenta el peso del paciente que está recibiendo la terapia. La dosis de la proteína o anticuerpo anti-CD40 que se va a administrar está en el intervalo de aproximadamente 0,003 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, preferentemente en el intervalo de 0,01 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg.

Por lo tanto, por ejemplo, la dosis puede ser de 0,01 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 7 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg o 50 mg/kg.

En otro aspecto de la divulgación, el método comprende la administración de múltiples dosis del anticuerpo antagonista anti-CD40 o fragmento de este. El método puede comprender la administración de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 o más dosis terapéuticamente eficaces de una composición farmacéutica comprende un anticuerpo antagonista anti-CD40 o fragmento de este. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente la frecuencia y duración de la administración de múltiples dosis de las composiciones farmacéuticas que comprenden la proteína o anticuerpo anti-CD40. Además, el tratamiento de un sujeto con una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o proteína puede incluir un único tratamiento o, preferentemente, puede incluir una serie de tratamientos. En un ejemplo preferido, se trata un sujeto con una proteína o anticuerpo antagonista anti-CD40 de la divulgación en el intervalo de entre aproximadamente 0,1 y 20 mg/kg de peso corporal, una vez a la semana durante de entre aproximadamente 1 y 10 semanas, preferentemente entre aproximadamente 2 y 8 semanas, más preferentemente entre aproximadamente 3 y 7 semanas y aún más preferentemente durante aproximadamente 4, 5 o 6 semanas. El tratamiento se puede producir anualmente para prevenir la recidiva o tras indicios de recidiva. También se apreciará que la dosificación eficaz de anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este utilizado para el tratamiento puede aumentar o disminuir durante el transcurso de un tratamiento particular. Los cambios en la dosificación pueden ser el resultado y ser evidentes a partir de los resultados de los ensayos diagnósticos como se describe en la presente.

Por lo tanto, en un aspecto, la pauta posológica incluye una primera administración de una dosis terapéuticamente eficaz de al menos una proteína o anticuerpo anti-CD40 de la divulgación en los días 1, 7, 14 y 21 de un periodo de tratamiento. En otro aspecto, la pauta posológica incluye una primera administración de una dosis terapéuticamente eficaz de al menos una proteína o anticuerpo anti-CD40 de la divulgación en los días 1,2, 3, 4, 5, 6 y 7 de una semana en un periodo de tratamiento. Aspectos adicionales de la divulgación incluyen una pauta posológica que tiene una primera administración de una dosis terapéuticamente eficaz de al menos una proteína o anticuerpo anti-CD40 de la divulgación en los días 1, 3, 5 y 7 de una semana en un periodo de tratamiento; una pauta posológica que incluye una primera administración de una dosis terapéuticamente eficaz de al menos una proteína o anticuerpo anti-CD40 de la divulgación en los días 1 y 3 de una semana en un periodo de tratamiento; y una pauta posológica preferida que incluye una primera administración de una dosis terapéuticamente eficaz de al menos una proteína o anticuerpo anti-CD40 de la divulgación en el día 1 de una semana en un periodo de tratamiento. El periodo de tratamiento puede comprender 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, un mes, 3 meses, 6 meses o un año. Los periodos de tratamiento pueden ser posteriores o estar separados entre sí por un día, una semana, 2 semanas, un mes, 3 meses, 6 meses o un año. Intervalos de 0,003 mg/kg a 50 mg/kg, de 0,01 mg/kg a 40 mg/kg, de 0,01 mg/kg a 30 mg/kg, de 0,1 mg/kg a 30 mg/kg, de 0,5 mg/kg a 30 mg/kg, de 1 mg/kg a 30 mg/kg, de 3 mg/kg a 30 mg/kg, de 3 mg/kg a 25 mg/kg, de 3 mg/kg a 20 mg/kg, de 5 mg/kg a 15 mg/kg, o de 7 mg/kg a 12 mg/kg. Por lo tanto, por ejemplo, la dosis de cualquier anticuerpo antagonista anti-CD40 o fragmento de unión al antígeno de este, por ejemplo, la proteína o anticuerpo monoclonal anti-CD40 de la divulgación, puede ser de 0,003 mg/kg, 0,01 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 7 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg, 50 mg/kg, u otras dosis de este tipo comprendidas en el intervalo de 0,003 mg/kg a 50 mg/kg. La misma dosis terapéuticamente eficaz de una proteína o anticuerpo anti-CD40 de la divulgación se puede administrar a lo largo de cada semana de la dosificación del anticuerpo.

Como alternativa, durante el transcurso de un periodo de tratamiento se pueden utilizar dosis terapéuticamente eficaces diferentes de una proteína o anticuerpo antagonista anti-CD40 de la divulgación.

En algunos aspectos de la divulgación, la dosis terapéuticamente eficaz inicial de un anticuerpo antagonista anti-CD40 o fragmento de unión al antígeno de este como se define en otro punto de la presente puede estar en el intervalo posológico inferior (es decir, de 0,003 mg/kg a 20 mg/kg) con dosis posteriores comprendidas en el intervalo de dosificación superior (es decir, de 20 mg/kg a 50 mg/kg).

En aspectos alternativos de la divulgación, la dosis terapéuticamente eficaz inicial de un anticuerpo antagonista anti-CD40 o fragmento de unión al antígeno de este como se define en otro punto de la presente puede estar en el intervalo posológico superior (es decir, de 20 mg/kg a 50 mg/kg) con dosis posteriores comprendidas en el intervalo de dosificación inferior (es decir, de 0,003 mg/kg a 20 mg/kg). Por lo tanto, en una realización, la dosis terapéuticamente eficaz inicial del anticuerpo antagonista anti-CD40 o fragmento de unión a antígeno de este es de 20 mg/kg a 35 mg/kg, que incluye aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 25 mg/kg, aproximadamente 30 mg/kg y aproximadamente 35 mg/kg, y las dosis terapéuticamente eficaces posteriores de la proteína o anticuerpo antagonista anti-CD40 de la divulgación son de aproximadamente 5 mg/kg a aproximadamente 15 mg/kg, que incluye aproximadamente 5 mg/kg, 8 mg/kg, 10 mg/kg, 12 mg/kg y aproximadamente 15 mg/kg.

En algunos aspectos de la divulgación de la divulgación, la terapia anti-CD40 se inicia mediante la administración de una «dosis de carga» de la proteína o anticuerpo de la divulgación al sujeto que necesita terapia anti-CD40. Con «dosis de carga» se quiere hacer referencia a una dosis inicial de la proteína o anticuerpo anti-CD40 de la divulgación que se administra al sujeto, donde la dosis de la proteína o anticuerpo de la divulgación administrada está comprendida en el intervalo posológico superior (es decir, de aproximadamente 20 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg). La «dosis de carga» se puede administrar como una administración única, por ejemplo, una única infusión donde el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este se administra IV, o como múltiples administraciones, por ejemplo, múltiples infusiones donde el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este se administra IV, siempre que la «dosis de carga» completa se administre en un periodo de aproximadamente 24 horas. Tras la administración de la «dosis de carga», se administran entonces al sujeto una o más dosis terapéuticamente eficaces adicionales de la proteína o anticuerpo anti-CD40 de la divulgación. Las dosis terapéuticamente eficaces posteriores se pueden administrar, por ejemplo, de acuerdo con una programación posológica semanal, o una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas o una vez cada cuatro semanas. En tales realizaciones de la divulgación, las dosis terapéuticamente eficaces posteriores por lo general están comprendidas en el intervalo posológico inferior (es decir de 0,003 mg/kg a 20 mg/kg).

Como alternativa, en algunos aspectos de la divulgación, tras la «dosis de carga», las dosis terapéuticamente eficaces posteriores de la proteína o anticuerpo anti-CD40 de la divulgación se administran de acuerdo con una «programación de mantenimiento», donde la dosis terapéuticamente eficaz de la proteína o anticuerpo de la divulgación se administra una vez al mes, una vez cada 6 semanas, una vez cada dos meses, una vez cada 10 semanas, una vez cada tres meses, una vez cada 14 semanas, una vez cada cuatro meses, una vez cada 18 semanas, una vez cada cinco meses, una vez cada 22 semanas, una vez cada seis meses, una vez cada 7 meses, una vez cada 8 meses, una vez cada 9 meses, una vez cada 10 meses, una vez cada 11 meses o una vez cada 12 meses. En tales realizaciones de la divulgación, las dosis terapéuticamente eficaces de la proteína o anticuerpo anti-CD40 de la divulgación están comprendidas en el intervalo posológico inferior (es decir, de 0,003 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg), especialmente cuando las dosis posteriores se administran con intervalos más frecuentes, por ejemplo, de una vez cada dos semanas a una vez cada mes, o están comprendidas en el intervalo posológico superior (es decir, de 20 mg/kg a 50 mg/kg), especialmente cuando las dosis posteriores se administran con intervalos menos frecuentes, por ejemplo, cuando las dosis posteriores se administran con una separación de un mes a 12 meses.

En los métodos de la divulgación se puede utilizar cualquier composición farmacéutica que comprenda una proteína o anticuerpo anti-CD40 de la divulgación que tenga las propiedades funcionales deseadas descritas en la presente como el componente terapéuticamente activo. Por lo tanto, las composiciones líquidas, liofilizadas o secadas por pulverización que comprenden el anticuerpo anti-CD40 mAb1 se pueden preparar como una solución o suspensión acuosa o no acuosa para la administración posterior a un sujeto de acuerdo con los métodos de la invención.

Cada una de estas composiciones comprenderá al menos una de las proteínas o anticuerpos anti-CD40 de la presente divulgación como un componente terapéutica o profilácticamente activo.

Con «componente terapéutica o profilácticamente activo» se quiere dar a entender que la proteína o anticuerpo anti-CD40 de la divulgación se incorpora específicamente a la composición para propiciar una respuesta terapéutica o profiláctica deseada con respecto al tratamiento, prevención o diagnóstico de una enfermedad o afección en un sujeto cuando la composición farmacéutica se administra a ese sujeto. Preferentemente, las composiciones farmacéuticas comprenden agentes estabilizantes adecuados, agentes espesantes adecuados o ambos para minimizar los programas asociados con la pérdida de estabilidad proteica y actividad biológica durante la preparación y el almacenamiento.

Se pueden añadir formulantes a las composiciones farmacéuticas que comprenden una proteína o anticuerpo anti-CD40 de la divulgación. Estos formulantes pueden incluir, entre otros, aceites, polímeros, vitaminas, carbohidratos, aminoácidos, sales, tampones, albúmina, surfactantes o agentes espesantes. Preferentemente los carbohidratos incluyen un azúcar o alditol tal como mono-, di- o polisacáridos, o glucanos solubles en agua. Los sacáridos o glucanos pueden incluir fructosa, glucosa, mañosa, sorbosa, xilosa, maltosa, sacarosa, dextrano, pululano, dextrina, a y p ciclodextrina, almidón soluble, hidroxietilalmidón y carboximetilcelulosa o mezclas de estos.

Se define «alditol» como un hidrocarburo de C⁴ a C8 que tiene un grupo hidroxilo e incluye galactitol, inositol, manitol, xilitol, sorbitol, glicerol y arabitol. Estos azúcares o alditoles se pueden utilizar individualmente o combinados. La concentración de azúcar o alditol puede estar entre un 1,0 % y un 7 % p/v, más preferentemente entre un 2,0 % y un 6,0 % p/v. Por ejemplo, los aminoácidos incluyen las formas levorrotatorias (L) de carnitina, arginina y betaína; sin embargo, se pueden añadir otros aminoácidos. Los polímeros preferidos incluyen polivinilpirrolidona (PVP) con un peso molecular promedio entre 2000 y 3000, o polietilenglicol (PEG) con un peso molecular promedio entre 3000 y 5000. Los surfactantes que se pueden añadir a la formulación se muestran en los documentos EP N.os 270799 y 268 110.

Además, los anticuerpos se pueden modificar químicamente mediante conjugación covalente a un polímero para aumentar su semivida de circulación, por ejemplo. En las Patentes de EE. u U. N.os 4766 106; 4179337; 4495285; y 4609546 se muestran los polímeros preferidos y métodos para unirlos a péptidos. Los polímeros preferidos son polioles polioxietilados y polietilenglicol (PEG). PEG es soluble en agua a temperatura ambiente y tienen la fórmula general: R (O--CH2--CH2) n O--R donde R puede ser hidrógeno o un grupo protector tal como un grupo alquilo o alcanol. Preferentemente, el grupo protector tiene entre 1 y 8 carbonos, más preferentemente es metilo. El símbolo n es un número entero positivo, preferentemente entre 1 y 1000, más preferentemente entre 2 y 500. El PEG tiene un peso molecular promedio preferido entre 1000 y 40000, más preferentemente entre 2000 y 20000, lo más preferente entre 3000 y 12000. Preferentemente, PEG tiene al menos un grupo hidroxi, más preferentemente es un grupo hidroxi terminal. Es este grupo hidroxi el que se activa preferentemente para reaccionar con un grupo amino libre en el inhibidor. Sin embargo, se entenderá que el tipo y la cantidad de los grupos reactivos se puede variar para conseguir un PEG/anticuerpo conjugado covalentemente de la presente divulgación.

En la presente divulgación también son útiles polioles polioxietilados solubles en agua.

Estos incluyen sorbitol polioxietilado, glucosa polioxietilada, glicerol polioxietilado (POG) y similares. Se prefiere el POG. Una razón se debe a que el esqueleto del glicerol del glicerol polioxietilado es el mismo esqueleto presente de manera natural en, por ejemplo, los mono-, di- y triglicéridos de animales y seres humanos. Por lo tanto, esta ramificación no se vería necesariamente como un agente exógeno en el cuerpo. El POG tiene un peso molecular preferido en el mismo intervalo que PEG. La estructura de POG se muestra en Knauf et al. (1988, J. Bio. Chem. 263: 15064-15070) y se puede encontrar un análisis de los conjugados de POG/IL-2 en la Patente de EE. UU. N.° 4 766 106.

Otro sistema de suministro de fármacos para aumentar la semivida de circulación es el liposoma.

Los métodos para preparar sistemas de suministro de tipo liposoma se analizan en Gabizon et al. (1982) Cáncer Research 42: 4734; Cafiso (1981) Biochem Biophys Acta 649: 129; y Szoka (1980) Ann. Rev. Bioplays. Eng. 9: 467. En la técnica se conocen otros sistemas de suministro de fármacos y estos se describen en, por ejemplo, Poznansky et al. (1980) Drug Delivery Systems (R. L. Juliano, ed., Oxford, N. Y.) págs. 253-315; Poznansky (1984) Pharm Revs 36: 277.

El formulante que se va a incorporar en una composición farmacéutica debe proporcionar estabilidad a la proteína o anticuerpo antagoista anti-CD40 de la divulgación. Es decir, la proteína o anticuerpo anti-CD40 de la divulgación debe conservar su estabilidad física y/o química y debe tener las propiedades funcionales deseadas, es decir, una o más de las propiedades funcionales deseadas definidas en la presente anteriormente.

Los métodos para monitorizar la estabilidad de proteínas son muy conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Jones (1993) Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90; Lee, ed. (1991) Peptide and Protein Drug Delivery (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, Nueva York); y los ensayos de estabilidad divulgados en la presente más adelante. Por lo general, la estabilidad de proteínas se mide a una temperatura elegida durante un periodo de tiempo especificado. En realizaciones preferidas de la divulgación, una formulación farmacéutica de anticuerpos estable proporciona estabilidad a la proteína o anticuerpo antagonista anti-CD40 de la divulgación cuando se almacena a temperatura ambiente (aproximadamente 25 °C) durante al menos 1 mes, al menos 3 meses o al menos 6 meses, y/o es estable a aproximadamente 2-8 °C durante al menos 6 meses, al menos 9 meses, al menos 12 meses, al menos 18 meses, al menos 24 meses.

Se considera que una proteína tal como un anticuerpo, cuando se formula en una composición farmacéutica, mantienen su estabilidad física en un determinado momento si no muestra signos visuales (es decir, decoloración o pérdida de transparencia) o signos medibles (por ejemplo, utilizando cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) o dispersión de luz UV) de precipitación, agregación y/o desnaturalización en esa composición farmacéutica. Con respecto a la estabilidad química, se considera que una proteína tal como un anticuerpo, cuando se formula en una composición farmacéutica, mantiene su estabilidad química en un momento determinado si las medidas de la estabilidad química indican que la proteína (es decir, anticuerpo) conserva la actividad biológica de interés en esa composición farmacéutica. Los métodos para monitorizar cambios en la estabilidad química son muy conocidos en la técnica e incluyen, entre otros, métodos para detectar formas alteradas químicamente de la proteína como resultado de recortes (clipping), utilizando, por ejemplo, SDS-PAGE, SEC y/o ionización/desorción mediante láser asistida por matriz/espectrometría de masas de tiempo de vuelo; y degradación asociada con cambios en la carga molecular (por ejemplo, asociada con la desamidación), utilizando, por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico. Véanse, por ejemplo, los métodos divulgados en la presente más adelante.

Se considera que una proteína o anticuerpo anti-CD40 de la divulgación, cuando se formula en una composición farmacéutica, conserva una actividad biológica deseada en un momento determinado si la actividad biológica deseada en ese momento está dentro de aproximadamente un 30 %, preferentemente dentro de aproximadamente un 20 % de la actividad biológica deseada mostrada en el momento en que se preparó la composición farmacéutica según se determina en un ensayo adecuado para la actividad biológica deseada. Los ensayos para medir la actividad biológica deseada de las proteínas o anticuerpos antagonistas anti-CD40 divulgados en la presente, se pueden realizar como se describe en los Ejemplos de la presente. Véanse también los ensayos descritos en Schutze et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8200-8204; Denton et al. (1998) Pediatr Transplant. 2: 6-15; Evans et al. (2000) J : Immunol. 164: 688-697; Noelle (1998) Agents Actions Supl. 49: 17-22; Lederman et al. (1996) Curr Opin. Hematol. 3: 77-86; Coligan et al. (1991) CurrentProtocols in Immunology 13: 12; Kwekkeboom et al. (1993) Immunology 79: 439-444; y en las Patentes de EE. UU. N.os 5674492 y 5847082.

En algunos aspectos de la divulgación de la invención, el anticuerpo anti-CD40 mAb1 se formula en una formulación farmacéutica líquida. La proteína o anticuerpo anti-CD40 de la invención se puede preparar utilizando cualquier método conocido en la técnica, incluidos los métodos divulgados en la presente anteriormente. En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo anti-CD40 mAb1 se produce de manera recombinante en una línea celular CHO.

Después de su preparación y purificación, el anticuerpo anti-CD40 se puede formular como una formulación farmacéutica líquida en la manera expuesta en la presente. Cuando el anticuerpo antagonista anti-CD40 se va a almacenar antes de su formulación, se puede congelar, por ejemplo, a -20 °C, y después descongelar a temperatura ambiente para una formulación posterior.

La formulación farmacéutica líquida comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-CD40 mAb1. La cantidad de anticuerpo presente en la formulación tiene en cuenta la vía de administración y el volumen de dosis deseado.

De esta manera, la composición farmacéutica líquida comprende el anticuerpo anti-CD40, por ejemplo, mAb1, mAb2 o el anticuerpo mAb3, a una concentración de 0,1 mg/mL a 300,0 mg/mL, de 1,0 mg/mL a 200 mg/mL, 5,0 mg/mL a 100,0 mg/mL, de 7,5 mg/mL a 50 mg/mL, o de 15,0 mg/mL a 25,0 mg/mL.

La composición farmacéutica líquida comprende el anticuerpo anti-CD40, por ejemplo, anticuerpo mAb1, mAb2 o mAb3 y un tampón que mantiene el pH de la formulación en el intervalo de pH 5,0 a pH 7,0.

Se puede utilizar en la formulación cualquier tampón adecuado que mantenga el pH de la formulación líquida de anticuerpo anti-CD40 en el intervalo de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 7,0, siempre que la estabilidad fisicoquímica y la actividad biológica deseada del anticuerpo se conserven como se ha señalado anteriormente en la presente. Los tampones adecuados incluyen, entre otros, ácidos convencionales y sales de estos, donde el contraión puede ser, por ejemplo, sodio, potasio, amonio, calcio o magnesio. Los ejemplos de ácidos convencionales y sales de estos que se pueden utilizar para tamponar la formulación líquida farmacéutica incluyen, entre otros, tampones de ácido succínico o succinato, histidina o clorhidrato de histidina, ácido cítrico o citrato, ácido acético o acetato, ácido tartárico o tartarato, ácido fosfórico o fosfato, ácido glucónico o gluconato, ácido glutámico o glutamato, ácido aspártico o aspartato, ácido maleico o maleato y ácido málico o malato. La concentración del tampón en la formulación puede ser de 1 mM a 50 mM, incluidos aproximadamente 1 mM, 2 mM, 5 mM, 8 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, u otros valores de este tipo en el intervalo de 1 mM a 50 mM.

En algunos aspectos de la divulgación, la formulación farmacéutica líquida comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-CD40, por ejemplo, el anticuerpo mAb1, mAb2 o mAb3, y tampón de succinato o tampón de citrato o tampón de histidina o tampón de clorhidrato de histidina a una concentración que mantiene el pH de la formulación en el intervalo de aproximadamente pH 5,0 a pH 7,0. Con «tampón de succinato» o «tampón de citrato» se quiere hacer referencia a un tampón que comprende una sal de ácido succínico o una sal de ácido cítrico, respectivamente. Con «tampón de histidina» se quiere hacer referencia a un tampón que comprende una sal del aminoácido histidina.

En un aspecto preferido, el tampón es un tampón de histidina, por ejemplo, clorhidrato de histidina. Como se ha señalado anteriormente, la concentración del tampón de histidina en la formulación puede ser de 1 mM a 50 mM, incluidos aproximadamente 1 mM, 2 mM, 5 mM, 8 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, u otros valores de este tipo en el intervalo de 1 mM a 50 mM.

En un aspecto preferido, el contraión del succinato o citrato es el catión de sodio y, por lo tanto, el tampón es succinato de sodio o citrato de sodio, respectivamente. Sin embargo, se espera que cualquier catión sea eficaz. Otros posibles cationes para el succinato o citrato incluyen, entre otros, potasio, amonio, calcio y magnesio. Como se ha señalado anteriormente, la concentración del tampón de succinato o citrato en la formulación puede ser de 1 mM a 50 mM, incluidos aproximadamente 1 mM, 2 mM, 5 mM, 8 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, u otros valores de este tipo en el intervalo de 1 mM a 50 mM.

En otros aspectos de la divulgación, la formulación farmacéutica líquida comprende el anticuerpo antagonista anti-CD40, por ejemplo, el anticuerpo mAb1, mAb2 o mAb3, a una concentración de 0,1 mg/mL a 300,0 mg/mL, o de 1,0 mg/mL a 200 mg/mL, de 5,0 mg/mL a 100,0 mg/mL, de 7,5 mg/mL a 50 mg/mL, o de 15,0 mg/mL a 25,0 mg/mL, y tampón de histidina o succinato o citrato, por ejemplo, tampón de succinato de sodio o citrato de sodio o clorhidrato de histidina, a una concentración de 1 mM a 50 mM, de 5 mM a 40 mM, de 10mM a 35mM, preferentemente de aproximadamente 30 mM.

Cuando sea deseable que la formulación farmacéutica líquida sea casi isotónica, la formulación farmacéutica líquida que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína o anticuerpo anti-CD40 de la divulgación, por ejemplo, el anticuerpo mAb1, mAb2 o mAb3, y un tampón para mantener el pH de la formulación en el intervalo de aproximadamente pH 5. 0 a aproximadamente pH 7,0 puede comprender además una cantidad de un agente isotonificante suficiente para hacer que la formulación sea casi isotónica. Con «casi isotónica» se quiere dar a entender que la formulación acuosa tiene una osmolaridad de 240 mmol/kg a 800 mmol/kg, preferentemente de aproximadamente 240 a aproximadamente 600 mmol/kg, más preferentemente de aproximadamente 240 a aproximadamente 440 mmol/kg, más preferentemente de aproximadamente 250 a aproximadamente 330 mmol/kg, aún más preferentemente de aproximadamente 260 a aproximadamente 320 mmol/kg, todavía más preferentemente de aproximadamente 270 a aproximadamente 310 mmol/kg.

Los expertos en la técnica conocen métodos para determinar la isotonicidad de una solución.

Véase, por ejemplo, Setnikar et al. (1959) J. Am. Pharm. Assoc. 48:628. Los expertos en la técnica están familiarizados con diversos solutos farmacéuticamente aceptables útiles para proporcionar isotonicidad a las composiciones farmacéuticas. El agente isotonificante puede ser cualquier reactivo capaz de ajustar la presión osmótica de la formulación farmacéutica líquida de la presente divulgación hasta un valor casi igual al de un fluido corporal. Resulta deseable utilizar un agente isotonificante fisiológicamente aceptable.

Por lo tanto, la formulación farmacéutica líquida que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo antagonista anti-CD40, por ejemplo, el anticuerpo mAb1, mAb2 o mAb3 y un tampón para mantener el pH de la formulación en el intervalo de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 7,0 puede comprender además componentes que se pueden utilizar para proporcionar isotonicidad, por ejemplo, cloruro de sodio; aminoácidos tales como alanina, valina y glicina; azúcares y alditoles (polioles), que incluyen, entre otros, glucosa, dextrosa, fructosa, sacarosa, maltosa, manitol, trehalosa, glicerol, sorbitol y xilitol; ácido acético, otros ácidos orgánicos o sus sales, y cantidades relativamente minoritarias de citratos o fosfatos. El experto conocerá agentes adicionales que son adecuados para proporcionar una tonicidad óptima a la formulación líquida.

En algunos aspectos preferidos de la divulgación, la formulación farmacéutica líquida que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-CD40, por ejemplo, el anticuerpo mAb1, mAb2 o mAb3, y un tampón para mantener el pH de la formulación dentro del intervalo de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 7,0, comprende además cloruro de sodio como el agente isotonificante.

La concentración de cloruro de sodio en la formulación dependerá de la contribución de los otros componentes a la tonicidad. En algunas realizaciones de la divulgación, la concentración de cloruro de sodio es de 50 mM a 300 mM. En una realización de este tipo, la concentración de cloruro de sodio es de aproximadamente 150 mM. En otra de tales realizaciones de la divulgación, la concentración de cloruro de sodio es de aproximadamente 150 mM, el tampón es tampón de succinato de sodio o citrato de sodio a una concentración de 5 mM a 15 mM, la formulación farmacéutica líquida comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína o anticuerpo anti-CD40 de la divulgación, por ejemplo, el anticuerpo mAb1, mAb2 o mAb3, y la formulación tiene un pH de 5,0 a pH 7,0.

En otro aspecto de la divulgación, la formulación farmacéutica líquida comprende la proteína o anticuerpo anti-CD40 de la divulgación, por ejemplo, el anticuerpo mAb1, mAb2 o mAb3, a una concentración de 0,1 mg/mL a 50,0 mg/mL o de 5,0 mg/mL a 25,0 mg/mL, cloruro de sodio a aproximadamente 150 mM, y succinato de sodio o citrato de sodio a aproximadamente 10 mM, 20mM 30 mM, 40 mM o 50 mM, a un pH de aproximadamente pH 5,5.

La degradación proteica debido a la congelación-descongelación o cizallamiento mecánico durante el procesamiento de una formulación farmacéutica líquida de la presente divulgación se puede inhibir mediante la incorporación de surfactantes a la formulación con el fin de reducir la tensión superficial en la interfase solución-aire. Por lo tanto, en algunas realizaciones de la divulgación, la formulación farmacéutica líquida comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-CD40 mAb1, un tampón para mantener el pH de la formulación en el intervalo de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 7,0, y comprende además un surfactante. En otras realizaciones de la divulgación, la formulación farmacéutica líquida comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-CD40 mAb1, un tampón para mantener el pH de la formulación en el intervalo de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 7,0, un agente isotonificante tal como cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 300 mM, y comprende además un surfactante.

Los surfactantes típicos empleados son surfactantes no iónicos incluidos ésteres de sorbitol polioxietilenados tales como polisorbato 80 (Tween 80) y polisorbato 20 (Tween 20); ésteres de polioxipropileno-polioxietileno tales como Pluronic F68; alcoholes

polioxietilenados tales como Brij 35; simeticona; polietilenglicol tal como PEG400; lisofosfatidilcolina; y polioxietilenop-t-octilfenol tal como Tritón X-100.

La estabilización clásica de los agentes farmacéuticos por surfactantes o emulsionantes se describe, por ejemplo, en Levine et al. (1991) J. Parenteral Sci. Technol. 45 (3): 160-165. Un surfactante preferido empleado en la puesta en práctica de la presente divulgación es el polisorbato 80. Cuando se incluye un surfactante, este se añade normalmente en una cantidad de un 0,001 % a un 1,0 % (p/v).

Por lo tanto, en algunos aspectos de la divulgación, la formulación farmacéutica líquida comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína o anticuerpo anti-CD40 de la divulgación, por ejemplo, el anticuerpo mAb1, mAb2 o mAb3, el tampón es tampón de succinato de sodio o citrato de sodio o histidina o tampón de clorhidrato de histidina a una concentración de 1 mM a 50 mM, de 3 mM a 40 mM, o de 5 mM a 35 mM; o de 7,5 mM a 30mM; la formulación tiene un pH de pH 5,0 a pH 7,0; y la formulación comprende además un surfactante, por ejemplo, polisorbato 80, en una cantidad de un 0,001 % a un 1,0 % o de un 0,001 % a un 0,5 %. Tales formulaciones pueden comprender opcionalmente un agente isotonificante, tal como cloruro de sodio a una concentración de 50 mM a 300 mM, de 50 mM a 200 mM, o de 50 mM a 150 mM.

En otros aspectos de la divulgación, la formulación farmacéutica líquida comprende la proteína o anticuerpo anti-CD40 de la divulgación, por ejemplo, el anticuerpo mAb1, mAb2 o mAb3, a una concentración de 0,1 mg/mL a 200,0 mg/mL o de 1 mg/mL a 100,0 mg/mL o de 2 mg/mL a 50,0 mg/mL o 5,0 mg/mL a 25,0 mg/mL, que incluye aproximadamente 20,0 mg/mL; cloruro de sodio de 50 mM a 200 mM, que incluye cloruro de sodio aproximadamente 150 mM; succinato de sodio o citrato de sodio de 5 mM a 20 mM, que incluye succinato de sodio o citrato de sodio a aproximadamente 10 mM; cloruro de sodio a una concentración de 50 mM a 200 mM, que incluye aproximadamente 150 mM; histidina o cloruro de histidina de 5 mM a 50 mM, que incluye histidina o cloruro de histidina a aproximadamente 30 mM; y opcionalmente un surfactante, por ejemplo, polisorbato 80, en una cantidad de un 0,001 % a un 1,0 %, que incluye de un 0,001 % a un 0,5 %; en donde la formulación farmacéutica líquida tiene un pH de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 7,0.

La formulación farmacéutica líquida puede estar esencialmente exenta de cualesquiera conservantes y otros portadores, excipientes y estabilizantes indicados en la presente anteriormente. Como alternativa, la formulación puede incluir uno o más conservantes, por ejemplo, agentes antibacterianos, portadores, excipientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables descritos anteriormente en la presente siempre que no afecten de manera adversa la estabilidad fisicoquímica del anticuerpo antagonista anti-CD40 o fragmento de unión al antígeno de este. Los ejemplos de portadores, excipientes y estabilizantes aceptables incluyen, entre otros, agentes tamponantes adicionales, codisolventes, surfactantes, antioxidantes que incluyen el ácido ascórbico y metionina, agentes quelantes tales como EDTA, complejos de metales (por ejemplo, complejos de Zn-proteína) y polímeros biodegradables tales como poliésteres. Se puede encontrar un análisis exhaustivo de la formulación y selección de portadores, estabilizantes e isomolitos farmacéuticamente aceptables en Remington's Pharmaceutical Sciences (18.a ed.; Mack Publishing Company, Eaton, Pensilvania, 1990).

Después de preparar la formulación farmacéutica líquida u otra composición farmacéutica descrita en la presente, esta se puede liofilizar para prevenir la degradación. Los expertos en la técnica conocen los métodos para liofilizar composiciones líquidas. Justo antes de su uso, la composición se puede reconstituir con un diluyente estéril (solución de Ringer, agua destilada o solución salina estéril, por ejemplo) que puede incluir ingredientes adicionales.

Tras la reconstitución, la composición se administra preferentemente a sujetos utilizando los métodos conocidos por los expertos en la técnica.

Uso de anticuerpos antagonistas anti-CD40 en la fabricación de medicamentos

La presente invención también proporciona el anticuerpo antagonista anti-CD40 mAb1 para su uso en el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria y/o inflamatoria en un sujeto, donde el medicamento se coordina con el tratamiento con al menos otra terapia.

Con «coordinado» se quiere dar a entender que el medicamento se va a utilizar antes, durante o después del tratamiento del sujeto con al menos otra terapia. Los ejemplos de otras terapias incluyen, entre otras, las descritas en la presente anteriormente, es decir, cirugía o procedimientos quirúrgicos (por ejemplo, esplenectomía, linfadenectomía, tiroidectomía, plasmaféresis, leucoféresis, trasplante de células, tejidos u órganos, perfusión de órganos, procedimientos intestinales y similares), radioterapia, terapia tal como la terapia con esteroides y terapia no esteroidea, terapia hormonal, terapia con citocinas, terapia con agentes dermatológicos (por ejemplo, agentes tópicos utilizados para tratar afecciones de la piel tales como alergias, dermatitis por contacto y psoriasis), terapia inmunosupresora y otra terapia antiinflamatoria con anticuerpos monoclonales y similares, donde el tratamiento con la terapia adicional, o terapias adicionales, ocurre antes, durante o después del tratamiento del sujeto con el medicamento que comprende el anticuerpo antagonista anti-CD40 mAb1 como se ha indicado anteriormente en la presente.

En una realización de este tipo, la presente invención proporciona el anticuerpo mAb1 para su uso en el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria y/o inflamatoria en un sujeto, donde el medicamento se coordina con el tratamiento con al menos otra terapia como se ha indicado anteriormente en la presente.

En algunas realizaciones, el medicamento que comprende el anticuerpo antagonista anti-CD40 mAb1 divulgado en la presente se coordina con el tratamiento con otras dos terapias.

Cuando el medicamento que comprende el anticuerpo antagonista anti-CD40 se coordina con otras dos terapias, el uso del medicamento puede ser antes, durante o después del tratamiento del sujeto con una de las otras terapias o con ambas.

La divulgación también proporciona un anticuerpo antagonista anti-CD40, por ejemplo, el anticuerpo mAb1, mAb2 o mAb3 divulgado en la presente, para su uso en el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria y/o inflamatoria en un sujeto, donde el medicamento se utiliza en un sujeto que ha recibido tratamiento previo con al menos otra terapia.

Con «tratado previamente» o «tratamiento previo» se quiere dar a entender que el sujeto ha sido tratado con una o más de otras terapias antes de recibir el medicamento que comprende la proteína o anticuerpo antagonista anti-CD40 de la divulgación.

Los siguientes ejemplos se ofrecen de manera ilustrativa y no de manera limitante.

LEYENDA DE LAS FIGURAS

La Figura 1 muestra la incorporación de ³H-timidina después de 72 horas de un cultivo de PBMC humanas estimuladas con una dosis de respuesta de Chir12.12 (círculos en blanco), mAb1 (círculos negros), mAb2 (cuadrados negros), mAb3 (triángulos negros) o CD40L humana (cuadrados en blanco).

La Figura 2 muestra la incoporación de ³H-timidina después de 72 horas de un cultivo de PBMC humanas estimuladas con una dosis de respuesta de Chir12.12 (círculos en blanco), mAb1 (círculos negros), mAb2 (cuadrados negros), mAb3 (triángulos negros), CD40L humana (cuadrados en blanco), control de isotipo (rombos negros) coestimuladas en presencia de 5|jg/mL de F(ab')² anti-IgM o CpG20061 jM .

La Figura 3 muestra la incoporación de ³H-timidina después de 72 horas de un cultivo de PBMC humanas estimuladas con una dosis de respuesta de Chir12.12 (círculos en blanco), mAb1 (círculos negros), mAb2 (cuadrados negros), mAb3 (triángulos negros), CD40L humana (cuadrados en blanco), control de isotipo (rombos negros) coestimuladas en presencia de 75ng/mL de IL-4.

La Figura 4 muestra la incorporación de ³H-timidina después de 72 horas de un cultivo de PBMC humanas estimuladas con 20 jg/m L de CD40L con una dosis de respuesta de Chir12.12 (círculos en blanco), mAb1 (círculos negros), mAb2 (cuadrados negros), mAb3 (triángulos negros) o CD40L humana (cuadrados en blanco).

La Figura 5 muestra la unión dependiente de la dosis del anticuerpo anti-CD40 humano a las líneas celulares BJAB, respectivamente, Chir12.12 (círculos negros), mAb1 (cuadrados en blanco), mAb2 (triángulos en blanco), mAb3 (triángulos negros).

EJEMPLOS

Materiales

1. Anticuerpos monoclonales

C hirl2.12 (1,9 mg/mL), mAbl (0,88 mg/mL), mAb2 (1,9 mg/mL) y mAb3 (1,9 mg/mL) se proporcionaron en citrato 50 mM pH 7,0, NaCl 140 mM. También se utilizó un control de isotipo de IgG para experimentos seleccionados (Sigma, St. Louis, EE. UU.).

2. Estímulo de activación de linfocitos B

Se obtuvo el fragmento F(ab')2 AfiniPure de conejo anti-IgM humana de Jackson Immuno Research (Suffolk, Reino Unido) y se obtuvo CpG2006 de Microsynth (Balgach, Suiza). Se generó CD40L humana recombinante utilizando procedimientos estándar conocidos por los expertos en la técnica. Se generó sobrenadante que contenía IL-4 humana utilizando procedimientos estándar conocidos por los expertos en la técnica.

3. Reactivos de cultivo tisular in vitro

Medio de cultivo PBMC: RPMI-1640, 10 % de FBS, 1 % de penicilina/estreptomicina, 1 % de aminoácidos no esenciales, 1 % de piruvato de sodio, p-mercaptoetanol 5 mM (todos de Invitrogen, San Diego, EE. UU.).

Métodos

1. Ensayo de proliferación de PBMC mediada por CD40L

1.1. Purificación de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC, por sus siglas en inglés)

Se purificaron PBMC primarias a partir de las capas leucoplaquetarias de sangre entera obtenidas de voluntarios sanos (Blutspendezentrum, Basilea). Las capas leucoplaquetarias se diluyeron 1:4 con PBS exento de Ca²⁺ y Mg²⁺ que contenía EDTA 5 mM y se alicuotaron 25 mL en tubos Falcon de 50 mL. Se colocó una capa de 14 mL de Ficoll-Plaque Plus (GE Healthcare) por tubo Falcon debajo de las capas leucoplaquetarias diluidas y se centrifugó a temperatura ambiente durante 20 min a 2250 rpm (sin freno). Después de la centrifugación, la capa de la interfase se transfirió a un único tubo Falcon de 50 mL. Se combinaron las capas de la interfase de múltiples tubos (de un único donante) hasta un volumen de 30 mL. Se añadió PBS suplementado con EDTA 5 mM y las células se centrifugaron a temperatura ambiente durante 5 min a 2250 rpm. El sobrenadante se desechó antes de añadir 15 mL de tampón de lisis de glóbulos rojos (RBC, por sus siglas en inglés) y se incubó a temperatura ambiente durante 5 min. Posteriormente, se añadieron 20 mL de PBS/EDTA 5 mM y las células se centrifugaron de nuevo (TA/5 min a 2250 rpm). Las células se lavaron dos veces en PBS/EDTA 5 mM (con pasos intercalados de centrifugación) y se resuspendieron en 35 mL de medio para PBMC antes de determinar el número de células viables utilizando exclusión con tinte azul triptano. Las células que no se utilizaron inmediatamente para la estimulación in vitro se crioconservaron.

1.2 Ensayo de estimulación de PBMC in vitro

Se realizaron series de diluciones por un factor de 2 de siete puntos para cada mAb de control de isotipo o anti-CD40 por triplicado en placas de 96 pocillos Costar en presencia o ausencia de una dosis constante de 5 pg/mL de F(ab')² anti-IgM, CpG20061 pM, sobrenandante que contiene IL-4 humana (75 ng/mL) o 40 pg/mL de huCD40L recombinante (indicadas las concentraciones finales). Las concentraciones de partida de cada mAb anti-CD40 estuvieron comprendidas entre 20 pg/mL y 100 pg/mL dependiendo del experimento. Se utilizó CD40L en una dosis de respuesta como control positivo para todos los experimentos. Se seleccionaron las dosis de anti-IgM, CpG2006, IL-4 y CD40L basándose en experimentos anteriores donde se evaluó la capacidad de estos reactivos (solos o combinados) para inducir la proliferación de PBMC o linfocitos B en dosis de respuesta (datos que no se muestran). Posteriormente, se añadieron las PBMC (densidad final de 8x10⁴ por pocillo) a cada pocillo antes de la incubación durante 3 días a 37 °C/5 % de CO². Se añadió ³H-timidina (1 pCi/50 pL/pocillo) a cada pocillo para las 6 horas finales del cultivo antes de la recolección y determinación de la incorporación de timidina utilizando un contador de centelleo MicroBetaTrilux. Nótese que en cada experimento se incluyeron cultivos de control con células más medio y células más medio más anti-IgM, IL-4, CpG2006 o CD40L (en ausencia de mAb anti-CD40).

Se analizaron los datos de centelleo utilizando software Excel y GraphPad Prism. Los resultados se presentan como cuentas medias por minuto (cpm) (+/- error estándar de la media) frente a la transformación log de la concentración de mAb anti-CD40. En cada gráfico se indican los niveles de fondo de los controles positivos y células más medio. Se calcularon los valores de CI⁵⁰ o CE⁵⁰ con un ajuste con éxito de los datos a la curva con Prism.

Las PBMC se estimularon como se ha indicado anteriormente con 20 pg/mL de CD40L en presencia o ausencia de una dosis de respuesta del mAb anti-CD40 de prueba durante 3 días. La proliferación se evaluó mediante la incorporación de ³H-timidina después de 72 horas de cultivo. Los resultados se presentan como la media de cultivos triplicados con EEM y son representativos de 4 donantes (experimentos independientes). Los valores de CI⁵⁰ para cada inhibición mediada por mAb anti-CD40 se tabulan en pg/mL.

2. Ensayo agonistas de PBMC in vitro

Se estimularon PBMC humanas como se ha indicado anteriormente en el párrafo 1.2 con una dosis de respuesta de C h irl2.12, mAbl, mAb2 o mAb3 durante 3 días en ausencia de coestimulación o en presencia de 5 pg/mL de F(ab')² anti-IgM o CpG2006 1 pM. La proliferación se evaluó mediante la incorporación de ³H-timidina después de 72 horas de cultivo. Los resultados se presentan como la media de cultivos triplicados con EEM y son representativos de 4 donantes (experimentos independientes).

3. Ensayo de ADCC

Se añadieron 50 pL de una suspensión de PBMC (10x10⁶ células/mL) a pocillos de fondo redondo (Corning Incorporated - Costar n.° 3790), 50 pL de células Raji teñidas con calceína en una cantidad de (2x105 células/mL) y 100 pL de dilución del anticuerpo o controles. Se determinó la lisis máxima con un 2 % de Tritón 100.

Las células se recogieron en el fondo de la placa (3 minutos a 250g) y se incubaron a 37 °C en una atmósfera de CO² humidificada (5 %) durante 1 hora. Las células se separaron del medio mediante centrifugación (3 minutos a 750g) y se transfirieron 100 pL de sobrenadante a una placa negra con fondo transparente (Corning Incorporated - Costar n.° 3904) para la medida.

Se determinó la florescencia a 535 nm después de la excitación 485 nm con un espectrómetro SpectraMax Gemini (Molecular Devices). Se calculó la lisis específica utilizando la siguiente fórmula:

(liberación experimental - liberación espontánea)/(liberación máxima - liberación espontánea) x 100

4. Unión de variantes del anticuerpo anti-CD40 humano a la línea celular BJAB humana

Se utilizó la citometría de flujo, con el fin de comparar la unión de las diferentes variantes de Fc del anticuerpo anti-CD40 en su unión a las células BJAB humanas. Por lo tanto, se sembraron 2 x 10⁵ células por pocillo en una placa con fondo en V de 96 pocillos. Las placas se lavaron dos veces con 200 pL de tampón FACS (PBS, 5 % de FCS, EDTA 2 mM) durante 2 min a 4 °C a 1350 x g. Se desecharon los sobrenadantes y las células se resuspendieron en 100 mL de tampón FACS que contenía un 8 % de suero humano (InVitromex, n.° cat. S4190) y se incubaron durante 10 min. Después de dos lavados se añadieron variantes de Fc de anticuerpo anti-CD40 humano a 50 pL de tampón FACS con un 1 % de suero humano comenzando con una concentración de 10 pg/mL en una dilución 1:2. Las células se incubaron durante 30 min en hielo seguido de dos pasos de lavado. Se añadieron 50 pL de F(ab') ² policlonal de conejo anti-IgG humana con FITC (DAKO, n.° cat. F 0315) a cada pocillo y se incubaron durante 30 min en hielo. Al final de la incubación las células se lavaron dos veces, se resuspendieron en 100 pL de tampón FACS y se adquirieron en un FACS CantoII.

Después de la adquisición, se adquirió la intensidad de la fluorescencia media del canal FITC en FloJo.La representación gráfica y el ajuste de la curva se realizaron con GraphPad Prism 5.0. Debido a la variación de la intensidad entre los experimentos individuales, se normalizaron los valores. Por lo tanto el valor más elevado de cada serie de prueba con anticuerpo se igualó a un 100 %. Se realizaron ajustes no lineales de las curvas con los valores porcentuales.

5. Ensayo de producción de citocinas mediada por CD40L en células dendríticas procedentes de monocitos (MoDC)

5.1 Preparación de células dendríticas procedentes de monocitos humanos

Se prepararon PBMC humanas a partir de las capas leucoplaquetarias humanas proporcionadas por la Cruz Roja Suiza. La capa leucoplaquetaria se diluyó 1:5 en PBS (Invitrogen, n.° cat. 20012019) y se distribuyó en alícuotas de 35 mL en tubos Falcon de 50 mL. Posteriormente, se introdujeron 13 mL de Ficoll (GE Healthcare, n.° cat. 171440­ 02) debajo de ellas en cada tubo. Las células se centrifugaron a 1680 x g a TA durante 20 min sin freno. La capa que contenía las PBMC se recogió y lavó dos veces en un volumen grande de PBS durante 5 min a 1000 x g. Finalmente, las células se resuspendieron en 10 mL de PBS y se contaron.

Los monocitos humanos se aislaron negativamente de las 100 x 10⁷ PBMC utilizando el kit II de aislamiento de monocitos humanos de Miltenyi (Miltenyi, Alemania, n.° cat. 130-091-153) en un instrumento AutoMACS de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Después del aislamiento, las células se lavaron dos veces durante 5 min a 1000 x g a 4 °C en medio de cultivo (RPMI1640 (Invitrogen, n.° cat. 61870010), 10 % de FCS (Invitrogen, n.° cat. 16000044, origen EE. UU.), piruvato de sodio 1 mM (Invitrogen, n.° cat. 11360039), 1 x NEAA (Invitrogen, n.° cat. 11140035) 1 x penicilina/estreptomicina (Invitrogen, n.° cat. 15140122). Se contaron los monocitos aislados, se sembraron en placas de 6 pocillos con una densidad de 0,4 x 106/mL y se cultivaron durante siete días a 37 °C, 5 % de CO². Para diferenciar los monocitos en células dendríticas recombinantes, se añadieron IL-4 humana [80 ng/mL] y GM-CSF humano [100 ng/mL] (ambos de producción interna) al medio de cultivo al inicio del cultivo.

5.2 Estimulación de células dendríticas (CD) para la liberación de citocinas

Se recolectaron DC inmaduras después de 7 días de cultivo lavando las placas de 6 pocillos, combinando las células y lavándolas dos veces durante 5 min a 1400 x g en medio de cultivo. Posteriormente, se sembraron 2 x 105 iDC en placas de fondo plano de 96 pocillos (Becton Dickinson, n.° cat. 353072) en 100 pL. Para el control positivo, las células se estimularon con MegaCD40L (Alexis, n.° cat. ALX-522-110-C010) a una concentración de 1 pg/mL, el control negativo consistió únicamente en iDC en medio. En el ensayo de antagonismo, se añadieron 10 pg/mL de variantes de Fc del anticuerpo anti-CD40 humano en una dilución 1:2 junto con 1 pg/mL de MegaCD40L para una dosisrespuesta. Los sobrenadantes de las células estimuladas se recogieron 24 h más tarde para la medida de TNFa. En el ensayo de antagonismo, se añadieron 10 pg/mL de las variantes de Fc del anticuerpo anti-CD40 humano en una dilución 1:2 y se recogieron los sobrenadantes después de 48 h para la medida de TNFa. Las células se sembraron y estimularon por triplicado para todos los ensayos.

5.3 Medida de TNF alfa por ELISA

Para medir la cantidad de TNFa en los sobrenadantes, se llevó a cabo un ELISA de la siguiente manera. Se recubrieron con anticuerpo de captura anti-TNFa (BD Pharmingen, n.° cat. 551220) placas de ELISA (Greiner, Nunc F96 Maxisorp, n.° cat. 442404) con una concentración de 5 pg/mL en 50 pL por pocillo durante la noche a 4 °C. Para cada paso de lavado las placas se lavaron 3 x con 250 pL en un dispositivo para lavar placas ELx 405 de BioTek. Después del primer lavado, se incubaron 200 pL de Superblock TBS (Thermo Scientific, Pierce, n.° cat. 37535) durante 1 h a 37 °C. A continuación, se añadieron 25 pL de un patrón de TNFa (TNFa humano recombinante, R&D Systems, n.° cat. 210-TA) o de una muestra. El patrón comenzó con una concentración final de 20 ng/mL en una serie de dilución 1:2. Además, se añadieron 25 pL de anticuerpo de detección (anti-TNFa humano biotina, BD Pharmingen, n.° cat. 554511) en una dilución 1:500. Las placas se incubaron durante la noche a 4°C. Después del lavado, se diluyó el conjugado Avidina-POD (fosfatasa alcalina ExtrAV, Sigma, n.° cat. E-2636) 1:5000 en Superblock TBS, se añadió en 50 pL y se incubó a TA durante 1 h. Las placas se lavaron y se añadieron 50 pL del sustrato p-nitrofenilfosfato (Sigma, n.° cat. C-3041) para un desarrollo de 15 min. Las placas de ELISA se leyeron a 450nm con el software SoftMax Pro en un SpectraMax M5 (Molecular Devices).

6. Estudio toxicológico

El propósito inicial primario del estudio toxicológico fue investigar la potencial toxicidad de una dosis elevada (100 mg/kg) de mAb1 en comparación con Chir12.12.

Para este estudio se utilizaron treinta monos cinomolgos de Mauritania. Al inicio de la administración de dosis, los animales tuvieron una edad de aproximadamente 4 a 5 años de edad y pesaron de 4,5 a 6,6 kg en el caso de los machos y de 3,1 a 4,3 en el caso de las hembras.

Se administró mAb1 (50 mg/mL) por vía intravenosa a un grupo de monos cinomolgos (5 machos/5 hembras; grupo 2) a un nivel posológico de 100 mg/kg y a un volumen posológico de 2 mL/kg una vez a la semana durante 5 semanas (aplicaciones del artículo de prueba en los días 1, 8, 15, 22, 29 y 36). Un grupo adicional de monos cinomolgos (5 machos/5 hembras; grupo 3) recibieron el anticuerpo original Chir12.12 por vía intravenosa mediante una infusión embolada lenta a un nivel posológico de 100 mg/kg y un volumen posológico de 5 mL/kg. Se administró placebo en forma de mAb1 a un volumen posológico de 2 mL/kg a otro grupo de monos cinomolgos que sirvieron de controles (5 machos/5 hembras; grupo 1). Todos los animales se sometieron a una autopsia uno o dos días después de la última administración de dosis.

Se decidió incorporar inmunización con hemocianina de lapa californiana (KLH, por sus siglas en inglés) con el fin de evaluar la eficacia de ambos Ab anti-CD40. En el día 2 los animales fueron inmunizados con 1 mg de KLH en alumbre seguido de una inyección de refuerzo de 0,5 mg de KLH en alumbre en el día 23. Se obtuvieron muestras de suero antes de la inmunización/refuerzo así como en los días 7 y 14 después de la inmunización y refuerzo, respectivamente. Se determinaron los títulos de IgM/IgG específicos de KLH con ELISA utilizando como patrón suero de referencia con IgM/IgG anti-KLH de mono cinomolgo. Se obtuvieron muestras de la sangre en 3 ocasiones antes de la dosis y en el día 15, 29 y en la autopsia (día 37/38) para el inmunofenotipado de los linfocitos B vírgenes (CD20+CD21+CD27-). Se calcularon los recuentos absolutos de linfocitos B CD20 vírgenes a partir del recuento total de linfocitos por muestra de sangre y el recuento relativo de linfocitos B CD20 vírgenes por citrometría de flujo.

Tabla 4: Resumen del estudio toxicoló ico

*Basándose en el peso corporal individual más reciente

La evaluación de la toxicidad se basó en la mortalidad, observaciones clínicas (signos clínicos que incluyen observaciones posteriores a la administración de dosis, evaluación de las heces, inspección del pelaje y consumo de alimentos), pesos corporales, exámenes oftálmicos, investigaciones cardiovasculares, patología clínica (incluida la coagulación, exámenes de la activación de plaquetas externa, hematología, química clínica y análisis de orina), pesos de órganos y hallazgos necroscópicos macroscópicos y microscópicos. El inmunofenotipado sanguíneo se realizó tres veces antes de la dosis, en los días 15 y 29 de la fase de administración de dosis así como en el día de la autopsia. Además, el inmunofenotipado del tejido del bazo y drenaje de los glándulos linfáticos del sitio de inyección de hemocianina de lapa californiana (KLH) se realizaron en la autopsia. Además, se examinó la respuesta de anticuerpos dependiente de linfocitos T (TDAR, por sus siglas en inglés) a KLH para comparar directamente la influencia del Chir12.12 completamente capaz de ADCC con el mAb1. Se recogió sangre de todos los animales para la evaluación toxicocinética y para una posible evaluación anti-fármaco-anticuerpo (ADA, por sus siglas en inglés).

7. Obtención del perfil in vitro adicional de mAbl

7.1 Purificación de PBMC

Se prepararon células mononucleares de sangre periférica humana como se ha descrito previamente en la sección 1.1.

7.2 Purificación de linfocitos B de amígdalas humanas

Se retiraron la cápsula de la amígdala y el tejido conectivo y el material de la amígdala después de cortar la amígdala en trozos grandes de ~ 5 mm antes de machacarlo con un cedazo metálico para células con lavado regular con medio de linfocitos B. Las células de la amígdala se filtraron a continuación dos veces a través de un cedazo para células 70 pM con el fin de eliminar los desechos celulares. Se aislaron los linfocitos B a partir de PBMC frescas utilizando un kit de enriquecimiento de linfocitos B humanos con selección negativa EasySep (Stemcell Technologies, Vancouver, BC, Canadá). Los linfocitos B se purificaron utilizando un kit de enriquecimiento de linfocitos B humanos con selección negativa EasySep siguiendo las instrucciones del proveedor (Stemcell Technologies, Vancouver, BC, Canadá).

7.3 Evaluación de los valores de CE50 de unión a CD40 utilizando linfocitos B o PBMC de primate no humano o de ser humano

Se incubaron PBMC (rhesus, cinomolgo o ser humano) o linfocitos B de la amígdala (solo de ser humano) a 4 °C durante 30 min con anticuerpos de control de isotipo o mAb1 marcados purificados en dosis de respuesta (intervalo de la concentración final 2,5 pg/mL - 0,00125 pg/mL). Las células se lavaron posteriormente antes de ser incubadas con un anticuerpo anti-humano (reactividad cruzada con primates no humanos) y un anticuerpo anti-IgG humana biotinilado con una reactividad cruzada mínima con NHP (R10; nótese que fue posible distinguir linfocitos B humanos que expresan IgG de la membrana ya sea mediante inclusión de un tinte anti-IgM o mediante intensidad diferencial de tinción FACS). Nuevamente, las células se incubaron a 4°C durante 30 min antes de lavarlas y someterlas a una tinción final con estreptavidina-FITC durante 20 min a 4 °C. Las células se lavaron posteriormente y se realizó la evaluación de la expresión de CD40 en células CD20+ mediante citometría de flujo.

7.4 Evaluación de la inhibición de la proliferación inducida por CD154 de linfocitos B o PBMC de primate no humano y de ser humano

Se realizaron series de diluciones por un factor de 2 de siete puntos de cada mAb anti-CD40 o de control de isotipo por triplicado en placas de 96 pocillos en presencia de concentraciones CE^s0 de IL-4 y CD154 recombinante humano. Las concentraciones de partida de cada mAb anti-CD40 estuvieron comprendidas entre 20 pg/mL y 100 pg/mL dependiendo del experimento. Para todos los experimentos se utilizaron células y controles de medio como controles negativos. Posteriormente, se añadieron las PBMC (rhesus, cinomolgo o ser humano) o linfocitos B de amígdala (solo de ser humano) a cada pocillo antes de la incubación durante 3 días a 37 °C/5 % de CO². Se añadió 3H-timidina (1 pCi/50 pL/pocillo) a cada pocillo para las 6 horas finales del cultivo antes de la recolección y determinación de la incorporación de timidina utilizando un contador de centelleo.

8. Eficacia de mAbl combinado con ciclosporina A en un modelo de alotrasplante de riñón en mono cinomolgo

8.1 Animales

Todos los monos cinomolgos (Macaca fascicularis) utilizados fueron machos de 7,5-9 años de edad (n.° 5529/n.° 5533, n.° 5523/n.° 5524 y n.° 5536/n.° 5538), criados en cautividad, 7,7±0,9 kg y originarios de las Filipinas (Siconbrec, Makati City, Filipinas). En el momento del trasplante, los animales presentaron una hematología y análisis químico de suero/orina normales y fueron negativos para tuberculosis, salmonela/Shigella, para anticuerpos contra agentes víricos (herpes B, virus de la leucemia de linfocitos T de los simios, virus de la inmunodeficiencia de los simios, retrovirus de tipo D de los simios, hepatitis B) y para los ecto/endoparásitos relevantes. Sin embargo, todos los animales presentaron anticuerpos contra el citomegalovirus y virus de la hepatitis A (HAV, por sus siglas en inglés), (evaluados en 2010; el animal n.° 5536 fue negativo para HAV). La coprología del animal n.° 5523 fue positiva para Balantidium coli en diciembre de 2010.

Durante la primera semana después de la cirugía, los animales se alojaron en jaulas de telemetría individuales que permitieron el contacto visual con los demás. El resto del tiempo, los animales n.° 5536/n.° 5538 se alojaron juntos y los 4 animales restantes se mantuvieron aislados durante todo el experimento (animales incompatibles). Todos los animales se alojaron en una temperatura mantenida (20-24 °C), al menos un 40 % de humedad y un ciclo de luz natural. Todos se alimentaron al menos dos veces al día con una mezcla de frutas y verduras. Se proporcionaron agua y pelets de Kliba Nafag 3446 (Kaiseraugst, Alemania) sin restricciones.

Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las Regulaciones Suizas para el Bienestar Animal y con la licencia BS1555.

Tabla 5: Características de los animales

8.2 Condiciones experimentales

8.2.1 Trasplante de riñón y monitorización posoperatoria

Se seleccionaron las parejas de donantes/receptor de acuerdo con un emparejamiento ABO, emparejamiento incorrecto del exón 2 de DRB (Blancher A, Tisseyre P, Dutaur M, et al. (2006) Immunogenetics; 58(4):269-82) y respuestas en la reacción de linfocitos mixtos (MLR, por sus siglas en inglés) unidireccional, que tenían índices de estimulación de MLR (MLR-SI) >7 y <47 (Bigaud M, Maurer C, Vedrine, et al. (2004) J. Pharmacol. Toxicol. Methods; 50(2):153-9). Los resultados de esta selección se muestran en la Tabla 6 y consistieron en un trasplante doble (intercambio de trasplantes entre 2 donantes). En cada receptor se implantó una sonda telemétrica (Data Sciences Inc, EE. UU.) para monitorizar la tensión arterial, velocidad cardiaca y actividad motora.

Para la cirugía, se indujo anestesia general mediante quetamina; 10 mg/kg, por vía intramuscular, (i.m.) asociada con atropina (0,05 mg/kg i.m.) y se mantuvo mediante ventilación con N²O/O² (50:50) y propofol por vía intravenosa (i.v.) (4-10 mg/kg/h; con suplementos de 5-10 mg en bolo cuando fue necesario). Se extrajeron dos riñones de los donantes, se lavaron con solución de la Universidad de Wisconsin fría (4 °C) (tiempo de conservación del frío < 4 horas) y se trasplantaron heterotópicamente, utilizando técnicas microvasculares estándar para crear una anastomosis terminolateral entre la vena renal del injerto y la vena cava del receptor y entre la arteria renal del injerto y la aorta distal del receptor (tiempo de anastomosis < 4o minutos). Se realizó una ureterocistostomía tras la aparición de orina del injerto. Se retiraron los riñones nativos. Se proporcionó analgesia posoperatoria con buprenorfina, 0,01-0,02 mg/kg, i.m., tres veces al día); antibióticos (cefotaxima, 25 mg/kg, i.m., dos veces al día o ceftriaxón, 50 mg/kg, i.m. en lidocaína al 1 %, cuatro veces al día). Se proporcionaron analgesia y antibióticos durante 5 días. Siempre que el recuento de plaquetas experimentó un aumento o descenso notable, se administró aspirina en una dosis de 5 mg/kg i.m. al día (Aspegic, Sanofi-Aventis, Meyrin, Suiza).

Se monitorizaron los receptores para detectar cambios en las condiciones clínicas y cardiovasculares, peso corporal, ingesta de alimentos y agua (suplementados hasta un máx. de 100-150 ml/kg/día), eliminación de orina, hematología (utilizando un ACT5Diff de Beckmann Coulter), análisis químicos de suero y orina (utilizando un analizador Vetscan para la determinación diaria de SCrea/SUrea/SAmilasa y un analizador Synchron CX5 de Beckmann para la confirmación final de las muestras de suero y orina). Se utilizaron los niveles séricos de creatinina (SCrea) y urea (Surea) como marcadores de la función del injerto. Se realizaron biopsias transcutáneas asistidas por ecografía con una aguja 16G, como se ha descrito anteriormente (Gaschen L, Kunkler A, Menninger K, et al. (2001) Vet. Radiol. Ultrasound; 42(3):259-64), con anestesia general en el día 30 (solamente los animales n.° 5529 y n.° 5533). Además, también se realizó una monitorización especial para determinar la coagulabilidad de la sangre y la agregación de plaquetas en los animales n.° 5529/n.° 5533 y n.° 5523/n.° 5524 antes y después del trasplante.

Los receptores fueron sacrificados finalmente en el caso de (i) fallo grave del injerto (por ejemplo, Screa >500 pmol/L o Surea >20 mmol/L) asociado o no con un aumento de la calificación ecográfica; o (ii) problemas de salud generales y/o signos clínicos evidentes de sufrimiento. En la autopsia, se recogieron los aloinjertos renales (incluidos uréter y anastomosis), junto con todos los otros órganos principales y se procesaron para el análisis histológico posterior.

T l : Inf rm i n n r l r l m in i n n n r r r r mi n iliz

8.2.2 Tratamientos con mAbl y ciclosporina A (CsA)

Se proporcionó mAbl en forma líquida que se acababa de descongelar en el día de la infusión de -80°C. La aplicación de 30 mg/kg/i.v. se realizó una vez a la semana, excepto para las tres primeras dosis en el día -1, 0 y 1 (antes y después del trasplante). CsA para la administración oral (v.o.) fue una solución de bebida de un preconcentrado de microemulsión (Sandimmun Neoral (RTM), 100 mg/mL, Novartis Pharma AG). Se aplicó CsA en una dosis diaria (comenzando en el día -1) de 20 mg/kg/v.o., en combinación con mAb1 (véase la Tabla 6).

8.2.3 Monitorización de la farmacocinética (PK), inmunogenicidad (anticuerpo de primate anti-humano) y farmacodinámica (PD) de mAb1

Se recogieron muestras de sangre (500 pl de suero) (antes de la administración i.v. de dosis) para la determinación de la exposición a mAb1 en el día -1, 3, 7 (referencia y 15 min), 14, 28, 42, 56, 70, 84 y 100. Para las determinaciones de CsA, se recogieron muestras de sangre antes de la administración oral de dosis o CsA (C0/C24) y 2 horas después de la aplicación (C2). C2 corresponde a los niveles máximos de absorción de CsA. Todo el material se almacenó a -80°C hasta el procesamiento posterior (kit de detección de CsA, Hot Star Taq Master Mix, Qiagen Minnesota, EE. UU.). Las muestras para determinar la inmunogenicidad de mAb1 se recogieron (50 pL de suero) en los días -1, 7, 14, 28, 42, 56, 70, 84 y 100 y se mantuvieron congeladas -80 °C. Resumiendo, se recubrieron placas de microtitulación de noventa y seis pocillos con CD40 recombinante humana. Esto se mantuvieron a 4 °C nominales durante la noche. Tras el bloqueo, se añadieron a la placa los patrones de calibración (Cs), muestras de control de calidad (QC) y especímenes de muestra que contenían mAb1. La placa se incubó a 25 °C nominales durante 120 minutos con agitación. Después del lavado de la placa, se añadió anticuerpo de ratón anti-cadena ligera kappa humana y después conjugado de anticuerpo de cabra anti-ratón (H+L) con HRP a la placa para detectar cualquier mAb1 unido a CD40 recombinante. Esto se visualizó mediante la adición de un sustrato cromogénico (TMB) y la intensidad del color producido (absorbancia) fue directamente proporcional a la concentración de mAb1 presente. La concentración de mAb1 en las muestras se retrocalculó a continuación a partir de una curva de calibración. Las muestras PD se obtuvieron 2-3 días antes del trasplante como referencia (0,5 mL en heparina). Posteriormente la recogida siguió la misma programación que para las muestras PK. Se contaron las células CD20+ y CD3+ con tubos TruCount (Becton Dickinson, n.° cat. 340334) utilizados de acuerdo con las instrucciones del proveedor con mAb anti-CD40 humano-APC (clon 5C3, Becton Dickinson, n.° cat. 555591), un anticuerpo anti-CD3 humana-PerCP (clon SP34-2, Becton Dickinson, n.° cat. 552851) y de mAb anti-CD20 humana-FITC (clon LT20, Immunotools, n.° cat. 21279203X2). Los datos se adquirieron en un citómetro de flujo LSRII (Becton Dickinson Biosciences) utilizando el software DIVA (versión 6.1.1). Los linfocitos y microesferas se seleccionaron en la inmunotransferencia por puntos FSC/SSC de acuerdo con el tamaño y la granularidad y se analizaron posteriormente para detectar la expresión de CD20 y CD3.

8.2.4 Histología

Todos los tejidos recogidos (biopsias de injertos o en la autopsia) se examinaron macroscópicamente y se fijaron en formalina tamponada al 4 %. Después de la deshidratación, se incluyeron en parafina. Se cortaron secciones con un grosor de tres pm a partir de los bloques de parafina y se tiñeron con hematoxilina y eosina (HE). Se realizaron tres tinciones adicionales (ácido peryódico de Schiff, tricromo y Verhoeff) en las secciones renales. Un patólogo con experiencia examinó las muestras de las biopsias y autopsias y las calificó de acuerdo con la clasificación de Banff 07 de patología de aloinjerto renal (Solez K, Colvin RB, Racusen LC, et al. (2008) Am. J. Transplant; 8(4):753-60). Expertos externos también realizaron una revisión científica externa.

Además, se realizó la ¡nmunohistoquímica para la proteína del complemento C4d utilizando un anticuerpo anti-Cd4 polivalente adecuado para secciones de parafina teñidas (Regele H, Exner M, Watschinger B, et al. 2001, Nephrol. Dial. Transplant; 16: 2058-2066). Se considera C4b como un marcador estable y fiable del rechazo humoral agudo (AHR, por sus siglas en inglés). Después de la fijación y la inclusión en parafina, se prepararon portaobjetos de vidrio (SuperFrostPlus, RTM, Menzel-Glaeser, Alemania) con secciones con un grosor de 3 pm y se secaron durante la noche en una estufa a 37 °C para una adhesión óptima a los portaobjetos. Se añadieron secciones de riñón humano rechazado como control positivo.

Antes de su uso, se desparafinaron los portaobjetos con xileno (10 min), se rehidrataron con etanol graduado y se colocaron en agua destilada. La recuperación del antígeno se llevó a cabo mediante cocción a presión durante 10 min a 1 bar en tampón de citrato (pH 6,0) como se ha descrito previamente (Segerer S, Mack M, Regele H, Kerjaschki D, Schlondorff D. Kidney Int. 1999; 56: 52-64). Para la inmunotinción, se utilizó el siguiente procedimiento: (i) inactivar la peroxidasa endógena con un 0,5 % de H²O² en metanol absoluto durante 20 min a temperatura ambiente; (ii) lavar los portaobjetos con PBS 0,01 M, pH 7,4 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Alemania); (iii) incubar los portaobjetos con leche desnatada en polvo al 4 % "Rapilait" en PBS, (Migros Genossenschaftsbund, Suiza) durante 60 min a temperatura ambiente; dejar escurrir para eliminar el exceso, no lavar; (iv) incubar un portaobjetos con pAb de conejo anti-C4d humana (Biomedica Medizinprodukte, Vienna, Austria) 1:40 en PBS que contiene un 1 % de NGtS durante la noche a 4 °C. El segundo portaobjetos actúa como control negativo al aplicar un control de isotipo de conejo (Zymed Laboratories Inc, EE. UU.) en lugar del anticuerpo primario; (v) lavar los portaobjetos en PBS 0,01 M, pH 7,4; (vi) incubar todos los portaobjetos con anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo biotinilado (Vector Laboratories, Inc. EE. UU.) 1:200 en PBS que contiene un 1 % de NGtS durante 30 min a temperatura ambiente; (vii) lavar los portaobjetos en PBS 0,01 M, pH 7,4; (viii) incubar con estreptavidina/HRP (Vector Laboratories, Inc. EE. UU.) en PBS durante 30 min a temperatura ambiente, (ix) desarrollar la actividad HRP con AEC+ (DakoCytomation Corp., Carpenteria, EE. UU.) durante 8-10 min, controlar la intensidad de la tinción microscópicamente, lavar en agua destilada, (x) contrateñir con Dako (RTM) Automation Hematoxylin (DakoCytomation Corp., Carpenteria, EE. UU.) durante 2 min y con azul en agua del grifo durante 5 min; (xi) montar con un medio de montaje acuoso (Medite Medizintechnik AG, Suiza).

Ejemplo 1: Evaluación de la actividad agonista de m Abl, mAb2 y mAb3

Los datos experimentales se basan en el uso de PBMC humanas primarias no fraccionadas y aisladas. Los preparados de PBMC enteras (en lugar de monocitos o linfocitos B aislados) imitan mejor la situación in vivo donde un mAb anti-CD40 podría tener múltiples efectos directos e indirectos en diferentes tipos celulares leucocitarios. Utilizando este ensayo de proliferación de PBMC se determinó que los mAb anti-CD40 aglucosilados mAb1 (N297A) y mAb2 (D265A), que conservaban la secuencia de aminoácidos de la porción de unión al antígeno sin alteraciones del anticuerpo Chir12.12 original, conservaron las propiedades de bloqueo de CD40L, no agonistas del mAb Chir12.12 original. El anticuerpo mAb3 (mutante LALA) fue levemente agonista en presencia de IL-4.

En particular, los resultados experimentales muestran que ninguno de los mAb anti-CD40 con Fc inactivado fue capaz de estimular la división celular de PBMC humanas (n = 4 donantes), un resultado similar al observado con el mAb Chir12.12 original (véase la Figura 1). Las PBMC proliferaron en respuesta a CD40L. Ni mAb1 ni mAb2 pudieron potenciar la proliferación inducida por CpG2006 o F(ab')² anti-IgM de PBMC (Figura 2). Además, Chir12.12 no fue capaz de potenciar la proliferación inducida por F(ab')² anti-IgM de PBMC, sin embargo a diferencia de mAb1 y mAb2 inhibió por completo la proliferación de PBMC inducida por CpG.

En presencia de IL-4, se observó que mAb3 (mutación LALA) induce niveles bajos pero reproducibles (n = 4 donantes) de incorporación de timidina superiores a los inducidos por IL-4 sola, mientras que mAb1, mAb2 y Chir12.12 no lo hicieron (Figura 3). De manera colectiva, estos resultados indican que con la excepción de mAb3 (en presencia de IL-4), ninguno de los mAb anti-CD40 poseyeron actividad agonista.

Los resultados anteriores también demostraron claramente que mAb1 y mAb2 no tienen actividad agonista en presencia de señales coestimuladoras. Este es un hallazgo importante ya que es probable que los leucocitos en un paciente con una enfermedad autoinmunitaria crónica puedan tener un fenotipo activado o parcialmente activado y, por lo tanto, ser sensibles a la señalización mediante CD40 u otro estímulo. Se observó que Chir12.12 (pero no los mAb con Fc inactivado o CD40L) inhibió completamente la proliferación de PBMC inducida por CpG2006. CpG2006 es un ligando sintético para el receptor de tipo Toll 9 (TLR9), un receptor que ha demostrado que se une a patógenos y ADNmc que tiene su origen en el hospedador. En los seres humanos, TLR9 es expresado por los linfocitos B y (en menor medida) monocitos en la sangre periférica. Como se ha mostrado previamente que los ODN que contienen CpG potencian la ADCC (Moga, et al. 2008), se puede especular que CpG2006 es capaz de potenciar la ADCC mediada por la porción Fc de IgG1 de la línea germinal del mAb original Chir12.12.

Ejemplo 2: Evaluación de la capacidad de los mAb anti-CD40 con Fc inactivado para bloquear la proliferación de PBMC mediada por CD40L

Los datos anteriores indicaron que Chir12.12 podía bloquear la proliferación mediada por CD40L de linfocitos B humanos primarios y líneas celulares de linfoma de linfocitos B humanas. Los autores midieron la inhibición de la proliferación de PBMC mediada por CD40L por parte de Chir12.12 y los tres anticuerpos de acuerdo con la divulgación mAb1, mAb2, mAb3. La Tabla 7 a continuación presenta los valores de CI⁵⁰ para dicha inhibición tabulados en mg/mL (resultados presentados como la media de cultivos triplicados con EEM y representativos de 4 donantes, experimentos independientes). Los resultados demostraron que Chir12.12 también pueden inhibir la proliferación de PBMC mediada por CD40L. Además, mAb1, mAb2 y mAb3 también bloquearon completamente la división de PBMC mediada por CD40L con una potencia similar a Chir12.12. Ninguno de los mAb anti-CD40 bloquearon la proliferación de PBMC inducida por anti-IgM IL-2 (datos que no se muestran) lo que sugiere que la actividad bloqueante de los mAb anti-CD40 dependió de la diana (y no está relacionada con la función de Fc).

Tabla 7: Valores de CI⁵⁰ para la inhibición mediada por mAb anti-CD40 de la proliferación de PBMC mediada por CD40L (pg/mL).

Ejemplo 3: Unión de variantes del anticuerpo anti-CD40 humano a la línea celular BJAB humana

Para excluir posibles cambios en la unión específica a CD40, se estudió la unión de las tres variantes mAb1, mAb2 y mAb3 en comparación con Chir12.12 original en una línea de linfocitos B, BJAB, que expresa constitutivamente CD40. La unión se estudió con un ajuste de la dosis que comenzó con 10 pg/mL con una dilución 1:2.

Para comparar las curvas de los diferentes experimentos, se fijó la intensidad de fluorescencia media más elevada de cada ajuste de la dosis individual a un 100 % de unión y se aplicó un ajuste a la curva no lineal. En dos experimentos independientes las cuatro variantes de anticuerpo Chir12.12, mAb1, mAb2 y mAb3 mostraron unas curvas de unión equivalentes en células BJAB (Figura 5). No se pudieron observar cambios en la capacidad de unión de las variantes con las diferentes mutaciones en la región de unión de Fc de Chir12.12.

Por lo tanto, los resultados anteriores demostraron que la mutación del sitio de unión de Fc no tuvo un efecto en el sitio de unión a CD40 de las regiones variables del Chir12.12 original, mAb1, mAb2 y mAb3 conservaron una unión a CD40 equivalente en células BJAB.

Ejemplo 4: Estimulación/inhibición de la liberación de TNF alfa a partir de células dendríticas procedentes de monocitos humanos por las variantes de Fc anti-CD40

Estimulación de la liberación de TNF alfa a partir de MoDC humanas por las variantes de Fc anti-CD40

Algunos anticuerpos anti-CD40 humano han mostrado tener efectos agonistas sobre una población celular diferente (Gruber 1989). Para excluir que las variantes de Fc mAb1, mAb2, mAb3 y Chir12.12 den lugar a la activación de MoDC, los autores investigaron si los anticuerpos por sí solos inducen la liberación de TNFa cuando se incuban durante 48 h con las células. A diferencia del ensayo antagonista, se cultivaron MoDC humanas de siete días de edad durante 48 h únicamente en presencia de las cuatro variantes anti-CD40 en una curva de dosis-respuesta comenzando con 10 pg/mL. Posteriormente, se estudiaron los sobrenadantes para determinar la cantidad de TNFa por ELISA. Ninguna de las variantes anti-CD40 mAbl, mAb2, mAb3 y C h irl2.12 indujo la liberación de TNFa a partir de MoDC en comparación con la estimulación con CD40L como un control positivo (datos que no se muestran). No se pudo observar una dependencia de la dosis por parte de las cuatro variantes de anticuerpo. Las cantidades de TNFa no se elevaron significativamente por encima del nivel de MoDC no estimuladas (datos que no se muestran). Por lo tanto, se pudo excluir una actividad agonista de estos cuatro anticuerpos.

Inhibición de la liberación de TNF alfa a partir de MoDC humanas por las variantes de Fc anti-CD40

El anticuerpo Chir12.12 original bloquea la interacción de CD40-CD40L y, por lo tanto, también debería bloquear la activación celular. La estimulación de CD40 en células dendríticas procedentes de monocitos humanos con trímeros de CD40L da lugar, por ejemplo, a la liberación de citocinas proinflamatorias como TNFa (Ma 2009). Nuevamente, el cambio en la región Fc no debería afectar a la función bloqueante de las variantes en comparación con Chir12.12. Los cuatro anticuerpos deberían inhibir la liberación de TNFa mediada por CD40L a partir de MoDC humanas con una CI⁵⁰ equivalente.

Por lo tanto, las MoDC humanas de siete días de edad se estimularon durante 24 h con MegaCD40L, un constructo recombinante, trimérico doble en presencia de las cuatro variantes anti-CD40 bloqueantes. Posteriormente, se estudiaron los sobrenadantes para determinar la cantidad de TNFa por ELISA. Todas las variantes mutadas en Fc mAb1, mAb2 y mAb3 mostraron la misma inhibición en dosis-respuesta que Chir12.12 en tres experimentos independientes (datos que no se muestran). Los resultados preeliminares también muestran una inhibición similar de liberación de IL-23 a partir de MoDC humanas (datos que no se muestran).

Se aplicó un ajuste a la curva no lineal para estimar la CI⁵⁰ de los cuatro anticuerpos y se calculó la CI⁵⁰ promedio a partir de los experimentos. La CI⁵⁰ promedio de las cuatro variantes para la liberación de TNFa a partir de MoDC humanas está comprendida entre 32 ng/mL y 40 ng/mL (Tabla 8). En resumen, las mutaciones en la región Fc no afectaron a los efectos antagonistas de las variantes de anticuerpo.

Tabla 8: CI⁵⁰ de las diferentes variantes de Fc para la inhibición de TNF alfa

CI⁵⁰ en ng/mL para las diferentes variantes de Fc anti-CD40 humano a partir de tres experimentos independientes. El ajuste a la curva no lineal en el n.° 1 para Chir12.12 no permitió una estimación válida de una CI⁵⁰ (n. c. = no calculada).

Por lo tanto, los resultados anteriores mostraron que las cuatro variantes son inactivas en lo que se refiere a la inducción de la liberación de TNFa a partir de MoDC. Más importante aún, todas las variantes mAbl, mAb2 y mAb3 inhibieron la producción de citocinas mediada por CD40L por MoDC humanas con una eficacia similar in vitro en comparación con Chir12.12.

Ejemplo 5: Resumen de los datos

La siguiente tabla 9 resume algunas de las importantes propiedades de los anticuerpos mAb1, mAb2 y mAb3 de la divulgación en comparación con el anticuerpo Chir12.12 original.

Tabla 9: Datos comparativos

Ejemplo 6: Descripción breve de secuencias de aminoácidos y nucleótidos útiles para poner en práctica la invención

Ejemplo 7: Secuencias de aminoácidos y nucleótidos útiles para llevar a la práctica la invención

Ejemplo 8: Resultados toxicológicos

El objetivo principal del estudio toxicológico puede determinar la toxicidad de mAbl, tras una administración intravenosa una vez a la semana al mono cinomolgo durante 5 semanas (6 aplicaciones del artículo de prueba). La versión no inactivada (ADCC) de este anticuerpo (Chir12.12) también se utilizó con el fin de comparar los efectos de un anticuerpo con actividad ADCC con la versión inactivada para ADCC (mAb1).

Además, los animales se inmunizaron con KLH con el fin de evaluar la eficacia de ambos Ab anti-CD40.

No hubo mortalidades ni cambios en los pesos corporales, signos clínicos y consumo estimado de alimentos atribuibles al tratamiento con mAb1 o Chir12.12. Las reacciones locales en los sitios de inyección de KLH fueron comparables en todos los grupos.

Asimismo, no hubo hallazgos relacionados con el artículo de prueba en los estudios oftálmicos y cardiovasculares.

En la hematología, se observó una disminución ligera pero estadísticamente significativa en el porcentaje y números absolutos de basófilos en animales tratados con mAb1 y Chir12.12: no se puede eliminar una relación con el tratamiento con el artículo de prueba. El análisis de orina reveló cetonas en la orina en 1/5 hembras tratadas con mAb1 y 2/5 hembras tratadas con Chir12.12 con una relación incierta con la administración de dosis. En la química clínica, se observó una ligera tendencia a concentraciones elevadas de lipasa para los machos tratados con Chir12.12 así como una hembra tratada con Chir12.12, sin embargo se consideró que esto tenía una relevancia toxicológica limitada.

La coagulación sanguínea no se vio afectada por el tratamiento con mAb1 o Chir12.12 según se evaluó mediante el tiempo de protrombina, tiempo de protrombina parcial activada y fibrinógeno. Los recuentos de plaquetas estuvieron en el intervalo normal. Las concentraciones de P-selectina o sCD40L en el plasma no indicaron activación de plaquetas.

En animales tratados con Chir12.12, el inmunofenotipado sanguíneo mostró una disminución notable en linfocitos B CD20+, que fue la acción farmacológica esperada de este anticuerpo. Especialmente, Chir12.12 provocó una reducción de linfocitos B CD20bajoCD21+ (que se considera que son CD40elevado). Sin embargo, los linfocitos CD20elevad°CD21" también experimentaron un descenso sustancial especialmente hacia el final del estudio. Preferencialmente, los linfocitos B vírgenes CD20+CD21+CD27- sufrieron una reducción debida al anticuerpo Chir12.12 con actividad ADCC, mientras que los linfocitos B de memoria CD20+CD21+CD27+ apenas se vieron afectados. También hubo un descenso aproximado de un 50% en los números absolutos de los linfocitos citolíticos naturales CD16+ en animales tratados con Chir12.12. Como se esperaba, después del tratamiento con mAb1 (que no tiene actividad ADCC), no se observó una disminución notable en los linfocitos B CD20+ ni hubo ningún descenso en los números absolutos de linfocitos citolíticos naturales CD16+. Los únicos linfocitos B que mostraron una reducción moderada durante la administración de dosis fueron los linfocitos B CD20elevad°CD21\ Se sabe que estas células son específicas de macacos y se originan en el centro germinal, por lo tanto no se consideró que este hallazgo era relevante para transición a seres humanos.

El inmunofenotipado del bazo y ganglios linfáticos que drenan KLH en la autopsia revelaron una situación similar. Hubo un descenso en el número relativo de linfocitos B CD20+ en animales tratados con Chir12.12, sin embargo no se observó una reducción relevante de linfocitos B CD20+ en los animales tratados con mAb1, con una reducción de ligera a moderada de linfocitos B CD21-(glanglios linfáticos de ambos sexos, bazos solo de machos). No hubo diferencias en los resultados de inmunofenotipado para el ganglio linfático derecho e izquierdo que drenaba el sitio de inyección de KLH.

La reacción de anticuerpos dependiente de linfocitos T (TDAR, por sus siglas en inglés) mostró que, en comparación con el grupo de control, no se observó una respuesta de IgG e IgM a KLH en los animales tratados con mAb1 o Chir12.12. Ya que el bloqueo de la activación de linfocitos B inhibiendo la interacción de CD40 - ligando de CD40 es la acción farmacológica buscada de mAb1, y ya que se pretende que Chir12.12 reduzca los linfocitos B, no se consideró que este hallazgo fuera relevante desde un punto de vista toxicológico.

La evaluación toxicocinética reveló que las concentraciones mínimas aumentaron durante el transcurso del estudio lo que indica una acumulación de mAb1 y Chir12.12. Las concentraciones mínimas medias después de la 4.a y 5.a dosis fueron similares, lo que indica condiciones cercanas al estado estacionario después de la 5.a dosis de mAb1 y Chir12.12. Las exposiciones medias (ambos sexos) durante el intervalo de administración de dosis (AUC^t ) después de la 4.a y 5.a dosis fueron de 906 y 990 h.mg/mL, respectivamente para mAb1, y 757 y 751 h.mg/mL, respectivamente para Chir12.12. Los valores de AUC^t también fueron indicativos de condiciones cercanas al estado estacionario después de la 5.a dosis.

Los exámenes macroscópicos no mostraron ninguna evidencia de toxicidad del órgano diana, y el peso de los órganos también estuvo dentro del intervalo normal para esta especie.

Microscópicamente, se observaron manifestaciones relacionadas con el artículo de prueba de ambos anticuerpos en todos los órganos linfáticos (bazo y ganglios linfáticos (mesentéricos, mandibulares, axilares e inguinales)), donde mAbl y Chir12.12 provocaron una supresión completa del desarrollo del centro germinal en las áreas corticales de linfocitos B. La inmunotinción de CD20 del bazo y tejido de los ganglios linfáticos contralaterales y de drenaje de KLH mostró un tamaño reducido de los folículos linfoides en el bazo así como reducción de linfocitos B en el bazo y los ganglios linfáticos, un efecto que fue mucho más pronunciado en animales tratados con Chir12.12 en comparación con el tratamiento con mAb1. Las manifestaciones en el centro germinal en animales tratados con mAb1 correspondieron a la reducción de linfocitos B CD21- observada en el inmunofenotipado. La inmunotinción de CD40 mostró una reducción significativa en la tinción de CD40 en los ganglios linfáticos y el bazo tras el tratamiento con mAb1 o Chir12.12.

En conclusión, basándose en los resultados de este estudio, la administración intravenosa una vez a la semana de mAb1 o Chir12.12 durante 5 semanas (6 administraciones) en una concentración de 100 mg/kg a monos cinomolgos macho y hembra se toleró bien. El inmunofenotipado mostró una reducción de los linfocitos B en animales tratados con Chir12.12 pero no en los tratados con mAb1 con la excepción de linfocitos B CD21-, sin embargo, TDAR mostró una ausencia de reacción de IgG e IgM después de la inmunización con KLH tanto en animales tratados con mAb1 como con Chir12.12. La histopatología reveló una falta de centros germinales en el bazo y los ganglios linfáticos para animales tratados con mAb1 y Chir12.12. Los efectos en los linfocitos B son las acciones farmacológicas deseadas y por lo tanto no se considera que sean adversos. Se considera que el nivel de efecto adverso no observable (NOAEL, por sus siglas en inglés) está en una dosis de 100 mg/kg tanto para mAb1 como para Chir12.12 en las condiciones de este estudio.

Ejemplo 9: Obtención del perfil in vitro adicional de mAbl

Se determinó la unión y reactividad cruzada funcional de mAb1 entre leucocitos de seres humanos, Rhesus y cinomolgo. La Tabla 10 muestra una comparación directa de las CE⁵⁰ de unión para mAb1 en las tres especies.

Tabla 10: Reactividad cruzada con seres humanos y NHP de mAb1.

mAb1 se une a células (linfocitos B) CD20⁺ de las tres especies con CE⁵⁰ comparables. Además, mAb1 pudo inhibir la proliferación inducida por CD154+IL-4 de linfocitos B de amígdalas humanas así como de PBMC de cinomolgos y Rhesus. En conjunto, estos resultados indican que la capacidad de mAb1 para unirse a CD40 e inhibir la proliferación inducida por CD154 de linfocitos B humanos o PBMC de primates no humanos fue muy similar. La disponibilidad de datos de ocupación del receptor (RO, por sus siglas en inglés) in vitro e inhibición funcional permitieron que se determinara para cada especie la relación entre estos dos valores (Tabla 11).

Tabla 11: Relación entre RO de mAb1 e inhibición funcional

Proliferación inducida por CD154 soluble IL4 en rhesus de PBMC y en seres humanos de linfocitos B de la amígdala.

basumiendo que la KD in vivo en rhesus y en seres humanos es la misma que la computada en el estudio PK/PD en cino.

casumiendo que mAb1 está muy por encima [de la diana] es aplicable la ecuación de Hill-Langmuir.

Los resultados indican que se necesita una RO por parte de mAbl de aproximadamente 2 veces menor en PBMC de Rhesus para inhibir la proliferación de PBMC en un 50 % en comparación con linfocitos B humanos. En seres humanos, se podría obtener una inhibición completa con aprox. un 75 % (predicho in vivo) de RO.

Ejemplo 10: Estudio del trasplante

Supervivencia del injerto

El tratamiento combinado con mAb1 (30 mg/kg i.v.) y ciclosporina A, 20 mg/kg por vía oral durante el trasplante de aloinjerto de riñón dio como resultado una prolongación significativa de la supervivencia de los 6 animales que participaron en el estudio. Los injertos fueron funcionales durante >91*, 31, >92*, >92*, >98* y >98* días (media: >83,6 días) en los animales n.° 5529, n.° 5533, n.° 5523, n.° 5524, n.° 5536 y n.° 5538, respectivamente (*final del protocolo). La supervivencia en animales no tratados (o tratados con dosis IS subterapéuticas) estuvo comprendida entre 7-10 días (datos históricos).

El animal n.° 5533 se sacrificó 31 días después del trasplante, debido a insuficiencia renal aguda y anuria. Esta patología apareció después de un período mantenido de hipertensión y anestesia para la recogida de la biopsia. Monitorización después del trasplante

(a) Concentraciones séricas de creatinina (SCrea) y urea (SUrea)

Screa fue el parámetro principal utilizado para la evaluación de la función renal. En los 6 animales, los niveles de Screa aumentaron por encima de los valores de referencia un día después del trasplante (de 81,8 ± 14,6 a 221,5 ± 37,1 pmol/L). Un aumento de este tipo en Screa es una característica común durante la primera semana después del trasplante (Tabla 12).

Tabla 12: Cambios en SCrea observados en receptores de aloinjerto de riñón NHP tratados con una terapia combinada de mAb1 y CsA con 30 20 m /k res ectivamente.

Durante la primera semana, las concentraciones de SUrea experimentaron elevaciones rápidas por encima de la referencia medida en el día 0 (4,5 ± 1,3 mmol/L) (Tabla 13). En los animales n.° 5529/n.° 5533 y n.° 5536/n.° 5538, los niveles de SUrea fueron de 16-20 mmol/L (día 3-5), mientras que en los animales n.° 5523 y n.° 5524 fueron de 9 u 8 mmol/L (día 7), respectivamente.

Tabla 13: Cambios en SUrea observados en receptores de aloinjerto de riñón NHP tratados con una terapia combinada de mAb1 y CsA con 30 20 m /k res ectivamente.

Una semana después del trasplante, la función renal tiende a normalizarse y SCrea/Surea se acercan a los niveles de referencia. Sin embargo, los animales n.° 5533, n.° 5523 y n.° 5524 (pero no n.° 5529, n.° 5536 y n.° 5538) presentaron un aumento adicional de SCrea/SUrea entre los días 7 y 19-25 después del trasplante, lo que indica disfunción renal. Durante este periodo se pudieron observar signos como polidipsia/poliuria (n.° 5523 y n.° 5524), calcio sérico elevado mantenido (SCa) (n.° 5533) o aumento del volumen del injerto (n.° 5523 y n.° 5524).

Después del día 20-25, los animales n.° 5529, n.° 5523, n.° 5524, n.° 5536 y n.° 5538 mejoraron y mostraron una función renal excelente hasta el final del estudio. Sin embargo, en el día 31, el animal n.° 5533 mostró un aumento pronunciado de los niveles de SCrea/SUrea lo que confirma una insuficiencia renal aguda (SCrea; 629 pmol/L y SUrea; 18 mmol/L). Esta patología ocurrió después de un periodo de hipertensión mantenida y el procedimiento de biopsia un día antes de la eutanasia. Durante este periodo se registraron picos de hipertensión (~170 mmgHg sistólica) y un episodio de hipotensión (~40 mmgHg sistólica).

(b) Amilasa sérica, concentraciones de lipasa, peso corporal y recuento de plaquetas

Las concentraciones séricas de amilasa experimentaron un ligero aumento en todos los animales de aproximadamente 1,3 veces en los días 1 -7 después del trasplante (311 ± 53 U/L en el día 0 y 418 ± 66,8 U/L en el día 7 después del trasplante) (Tabla 14). El animal n.° 5533 presentó la concentración de amilasa más elevada observada en el estudio en el día 1 después del trasplante (1050 U/L). Antes del trasplante, no hubo diferencia entre los niveles de amilasa observados antes de la primera dosis de mAb1 y 24 horas después (día -1 y día 0).

Tabla 14: Concentraciones séricas de amilasa (U/L) en animales con trasplante de riñón tratados con una combinación de 30 mg/kg i.v. de mAb1 y 20 mg/kg v.o. de CsA.

Las concentraciones séricas de lipasa experimentaron, en promedio, cambios poco importantes antes y después del trasplante (Tabla 15). Únicamente al final del protocolo experimental, se pudo apreciar un pequeño incremento (día 84; 2,18 veces). El animal n.° 5533 presentó la concentración de lipasa más elevada medida en el día 1 (284,4 U/L). No se pudo disponer de los datos de lipasas de los animales n.° 5536 y n.° 5538. Los cambios en las concentraciones de amilasa y lipasa fueron similares a los niveles detectados en otros experimentos de trasplante utilizando anticuerpos diferentes o compuestos de bajo peso molecular (datos que no se muestran).

Tabla 15: Concentraciones séricas de lipasa (U/L) en cuatro de los animales con trasplante de riñón tratados con una combinaci n m k i.v. mA 1 2 m k v. . A.

Se pudo observar una pérdida de peso corporal rápida y notable principalmente en los animales n.° 5529, n.° 5533 y n.° 5536. En los seis animales trasplantados, varió entre un -4 y un -18 % durante los primeros 21 días después del trasplante. Sin embargo, después de ese momento y hacia el final del estudio la pérdida de peso corporal tendió a recuperarse.

Los recuentos de plaquetas fueron normales (300-400 células x 103/pL) o aumentaron durante el periodo después del trasplante 600-800 células x 103/pL. El animal n.° 5529 recibió tratamiento con aspirina durante 3 días (días 7-9) debido a un rápido incremento en el recuento de plaquetas. El animal n.° 5533 presentó una trombocitosis a largo plazo (>1000 células x 103/pL) y recibió tratamiento con aspirina entre los días 7-26.

(c) Niveles sanguíneos de mAb1 y recuento de linfocitos B

Previamente se llevó a cabo un estudio y análisis PK/PD de referencia en el que se administró a monos cinomolgos una única dosis intravenosa de 10mg/kg de anticuerpo (datos que no se muestran). En este estudio, los perfiles de concentración frente al tiempo mostraron una disposición evidente mediada por la diana (TMD, por sus siglas en inglés) donde un animal demostró un aclaramiento más rápido en comparación con otro animal, como consecuencia de un nivel de expresión de la diana probablemente más elevado, lo que resalta la función de los niveles de expresión de la diana para regir la PK. A partir de este estudio, también se estableció que cuando las concentraciones séricas de mAb1 fueron superiores a aprox. 4 microg/mL, esto se tradujo en casi un 100 % de ocupación del receptor CD40.

El diseño del estudio del trasplante (niveles posológicos de mAb1 semanales y elevados - 30 mg/kg, y sin fase de recuperación/de reposo farmacológico) no permitió el mismo nivel de análisis y modelización que el estudio PK/PD realizado previamente. No obstante, se realizaron las siguientes observaciones (resumidas en la Tabla 16); i) no se detectó mAb1 en las muestras recogidas antes de la primera dosis, ii) se detectó mAb1 a lo largo de todas las dosis de la fase de administración de dosis y iii) en todas las muestras recogidas e interindividuales las concentraciones mínimas fueron variables (1200 - 2500 microg/mL para el cinomolgo 5524, 1000 - 2000 microg/mL para el cinomolgo 5523 y 850 - 2400 microg/mL para el cinomolgo 5529). Todos los valores de exposición estuvieron muy por encima (de 170 a 500 veces) la concentración necesaria para obtener una ocupación total del receptor en mono cinomolgo.

Tabla 16: ° ° ° ° 4

En este estudio también se evaluó el estudio de inmunogenicidad (anticuerpos anti-mAb1 de mono). Todas las muestras fueron negativas, pero los niveles elevados de mAb1 en estas muestras podrían potencialmente evitar su detección debido a interferencias farmacológicas.

Se pudo observar una reducción parcial de células CD20+ en el tiempo en todos los animales tratados. Se apreciaron observaciones similares en el estudio PK/PD llevado a cabo con anterioridad (datos que no se muestran).

Resultados histológicos

La evaluación histopatológica de los aloinjertos de riñón no reveló rechazo agudo y crónico en los injertos de n.° 5523, n.° 5524, n.° 5529 y n.° 5538, y cambios en el límite en el injerto n.° 5536 que llegaron al final del experimento, es decir (resultados resumidos en la Tabla 17). Se observaron infiltrados perivasculares o intersticiales mínimas en los animales n.° 5523, n.° 5524 y n.° 5538, y una hipercelularidad glomerular mínima en el animal n.° 5529.

Tabla 17: Resultados histológicos

El animal n.° 5533 que se sacrificó en el día 31 después del trasplante mostró dilatación tubular, fibrosis e infiltrados intersticiales pero tubulitis tan solo mínima. Además, se observaron una infiltración eosinofílica notable en las cercanías del uréter y un absceso al lado de la anastomosis. Todos estos hallazgos indicaron una disfunción renal prolongada pero no se pudo confirmar el rechazo.

La inmunotinción de C4d fue negativa en todos los casos.

Se observó ausencia de desarrollo de los centros germinales con o sin atrofia folicular en los órganos linfoides en todos los animales. Se diagnóstico cecocolitis provocada por infección por Balantidium coli en los animales n.° 5529 y n.° 5533.

No sé detectaron otros cambios relacionados con el tratamiento.

Estudio del trasplante - análisis

El objetivo del estudio del trasplante fue evaluar, en un modelo en primates no humanos de rechazo de aloinjerto de riñón, los efectos beneficiosos de mAbl cuando se administra en una terapia combinada con dosis subterapéuticas de ciclosporina A. Además, resultó relevante evaluar la ausencia de efectos secundarios en un modelo donde se induce una inflamación sistémica.

Cuando se aplica como una terapia combinada con una dosis subterapéutica de CsA (20 mg/kg v.o.), mAbl demostró eficacia en forma de aumento de la supervivencia de los aloinjertos de riñón en NHP. La supervivencia media del injerto fue >83,6 días y 5 de 6 animales alcanzaron el final del protocolo experimental (establecido en 91-98 días).

Actuar sobre CD40 utilizando un anticuerpo anti-CD40 bloqueante no agonista (mAb1) dio como resultado una prolongación de la supervivencia del injerto en NHP con trasplante de islotes o riñón. Además, los autores pudieron evaluar una mejor eficacia y seguridad utilizando mAbl (que tiene un Fc inactivado) en comparación con Chirl 2.12 publicado previamente (anticuerpo anti-CD40 monoclonal totalmente humano del isotipo IgG1/kappa con propiedades de reducción de linfocitos B y bloqueo de la coestimulación).

Durante todo el periodo después del trasplante, hubo ausencia de cualesquiera eventos patológicos clínicos relevantes (por ejemplo, aumento poco importante de niveles de amilasa/lipasa atribuidos a la típica alteración de la función renal tras el trasplante). Sin embargo, los animales n.° 5333, n.° 5523 y n.° 5524 presentaron una reducción de la función renal entre los días 7-19. Este periodo de tiempo se caracteriza normalmente por una recuperación de los niveles de SCrea/SUrea, presión sanguínea y volumen del injerto en los animales después del trasplante. En estos animales, se observaron signos de función renal alterada tales como aumento de SCrea/SUrea (en los 3 animales), aumento transitorio del volumen del injerto (n.° 5523, n.° 5524) o polidipsia/poliuria (n.° 5523, n.° 5524). Una hipótesis podría ser que esos animales desarrollaron un proceso de rechazo temprano, que se controló después de 3 semanas de tratamiento con mAb1. Esta anomalía en la fase temprana después del trasplante podría deberse a diferencias inducidas por el modo de acción inmunológico de una molécula (con Fc inactivado) que tiene como diana la ruta de CD40.

Se sacrificó un animal (n.° 5533) en el día 31 debido a insuficiencia renal aguda (sin rechazo). Este desenlace estuvo provocado por una recuperación incompleta de la función renal después del procedimiento de trasplante. Los signos que indican una disfunción renal fueron niveles de Surea elevados (11-19 mmol/L) o concentraciones elevadas mantenidas de SCa (>2,8 mmol/L). La pérdida del injerto terminal se vio acelerada por una hipertensión mantenida (>140 mmHg sistólica) combinada con hipotensión observada durante la anestesia aplicada durante el procedimiento de recogida de biopsias y picos elevados de hipertensión registrados la noche antes de la eutanasia (~170 mmHg sistólica) (Palmer BF (2002) N. Engl. J. Med; 347(16):1256-1261). No se pudo atribuir todos estos eventos al tratamiento con mAb1 sino solamente a diferencias individuales en la fase posterior al trasplante.

La elevada eficacia de la terapia combinada se pudo demostrar también histológicamente. Cinco de los seis injertos mostraron una excelente calidad del injerto al final del experimento. La ausencia de desarrollo de centros germinales también se observó en un experimento de trasplante con Chir12.12. No sé observaron otros cambios tisulares relacionados con el tratamiento.

Uno de los supervivientes a largo plazo (n.° 5529) desarrolló cecocolitis provocada por Balantidium coli. Aunque la infección es habitual en macacos y a menudo asintomática, la inmunosupresión puede dar lugar al inicio de la enfermedad aguda (Schuster FL, Ramirez-Avila L, (2008) Clin. Microbiol. Rev; 21(4): 626-38). En este animal no se observaron signos clínicos tales como diarrea o pérdida de peso corporal.

Respecto a la monitorización del recuento de linfocitos B, se pudo observar una reducción parcial en el tiempo en todos los animales tratados. Esta reducción parcial probablemente no se debe a una reducción mediada por Fc activoreceptor ya que mAb1 es un anticuerpo inactivado, que no se une a FcR ni media en la ADCC in vitro. La reducción parcial puede ser un reflejo de la ausencia de centros criminales, que se observa en la histología al final del experimento. Esta reducción parcial se puede deber a la ausencia de señales de supervivencia.

En conclusión, los resultados del estudio del trasplante respaldan el uso de mAb1 (y por extensión, los otros anticuerpos y proteínas de la divulgación) como dianas válidas para el tratamiento del rechazo de riñón en una terapia combinada con un excelente perfil de seguridad. El excelente perfil de seguridad y eficacia respaldan adicionalmente el uso de los anticuerpos de la divulgación en el tratamiento de trastornos autoinmunitarios y/o trastornos inflamatorios y la prevención del rechazo del trasplante mediado por la señalización de CD40 mediada por CD40L en células que expresan el antígeno CD40.

Sumario

No se ha publicado que los anticuerpos anti-CD40 induzcan eventos hemostáticos en los pacientes, sin embargo las elevaciones en las enzimas pancreáticas en pacientes con linfoma de linfocitos B que recibieron el Ab anti-CD40 Chir12.12 y el posible riesgo de pancreatitis excluye el uso de este anticuerpo anti-CD40 con Fc competente en la enfermedad autoinmunitaria crónica y trasplante por razones de seguridad. Por lo tanto, los autores generaron anticuerpos anti-CD40 de tipo IgG1 con Fc inactivado (mAb1, mAb2 y mAb3) incapaces de mediar en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) tanto in vitro como in vivo. mAb1 fue capaz de prolongar la supervivencia de aloinjerto renal en primates no humanos combinado con dosis subterapéuticas de ciclosporina. Además, mAb1 fue capaz de suprimir completamente las respuestas primaria y secundaria de anticuerpos a la inmunización con un antígeno dependiente de linfocitos T. Significativamente, no hubo evidencia de eventos hemostáticos o histología pancreática anómala en el estudio del trasplante o inmunización. En conjunto, estos resultados sugieren que mAb1 sería un agente terapéutico seguro y eficaz y se podría utilizar para tratar pacientes que padecen enfermedades autoinmunitarias provocadas por linfocitos B y células presentadoras de antígenos o que se han sometido a un trasplante de aloinjerto donde están involucradas las interacciones CD40-CD154 en el desarrollo de la patología.

Claims (5)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo aislado dirigido contra un polipéptido CD40 diana (SEQ ID NO: 28), caracterizado por que dicho anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 11 y la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 12, para su uso en el tratamiento de trastornos autoinmunitarios y/o trastornos inflamatorios, donde el anticuerpo se administra combinado con fármacos inmunosupresores o fármacos antiinflamatorios.

2. El anticuerpo aislado para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho anticuerpo y los fármacos inmunosupresores o antiinflamatorios se pueden administrar secuencialmente, en cualquier orden, o simultáneamente.

3. El anticuerpo aislado para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, donde el fármaco inmunosupresor es metotrexato, ciclofosfamida, mizoribina, clorambucilo, ciclosporina, ciclosporina aerosolizada, tacrolimus, micofenolato mofetilo y azatioprina, sirolimus, desoxiespergualina o leflunomida y sus análogos de malononitriloamida.

4. El anticuerpo aislado para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 2, donde dicho fármaco antiinflamatorio es corticosteroides, clobetasol, halobetasol, hidrocortisona, triamcinolona, betametasona, fluocinol, fluocinonida, prednisona, prednisolona, metilprednisolona o fármacos antiinflamatorios no esteroideos, sulfasalazina, medicamentos que contienen mesalamina, celecoxib, diclofenaco, etodolaco, fenprofeno, flurbiprofeno, ibuprofeno, ketoprofeno, meclofamato, meloxicam, nabumetona, naproxeno, oxaprocina, piroxicam, rofecoxib, salicilatos, sulindac y tolmetina o inhibidores de la fosfodiesterasa-4 o anticuerpos antiinflamatorios, adalimumab e infliximab.

5. El anticuerpo aislado para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 4, donde los trastornos autoinmunitarios y/o trastornos inflamatorios son esclerosis múltiple, lupus eritematoso diseminado, nefritis lúpica, síndrome de Sjogren, artritis reumatoide, enfermedad de injerto contra el hospedador, miastenia grave, enfermedad de Graves o diabetes mellitus de tipo 1.