JP2014500720A - 抗ＣＤ４０抗体のサイレントＦｃ変異体 - Google Patents

抗ＣＤ４０抗体のサイレントＦｃ変異体 Download PDF

Info

Publication number
JP2014500720A
JP2014500720A JP2013538229A JP2013538229A JP2014500720A JP 2014500720 A JP2014500720 A JP 2014500720A JP 2013538229 A JP2013538229 A JP 2013538229A JP 2013538229 A JP2013538229 A JP 2013538229A JP 2014500720 A JP2014500720 A JP 2014500720A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
antibody
protein
seq
mab1
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2013538229A
Other languages
English (en)
Other versions
JP5782132B2 (ja
Inventor
クリストフ・ホイサー
ジェイムズ・ラッシュ
カレン・ビンセント
Original Assignee
ノバルティス アーゲー
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=44925566&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=JP2014500720(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by ノバルティス アーゲー filed Critical ノバルティス アーゲー
Publication of JP2014500720A publication Critical patent/JP2014500720A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP5782132B2 publication Critical patent/JP5782132B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2875—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)

Abstract

本発明は、自己免疫および炎症性障害などの病的障害の処置のため、および／または移植における移植片拒絶の危険性の防止もしくは軽減のための抗ＣＤ４０抗体のサイレントＦｃ変異体ならびに前記抗体の組成物および使用方法に関する。

Description

本発明は、自己免疫および炎症性障害などの病的障害の処置のため、および／または移植における移植片拒絶の危険性の防止もしくは軽減のための抗ＣＤ４０抗体のサイレント定常断片（Ｆｃ）変異体ならびに前記抗体の組成物および使用方法に関する。
自己免疫疾患にはいくつかの免疫抑制処置が利用できるにも関わらず、患者人口の大部分においてより効果的でより安全な薬物の必要性は依然としてほとんど満たされていない。例えば、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群および多発性硬化症においてリツキシマブおよびベリムマブのようなＢ細胞除去／阻害療法の有効性が報告されているにも関わらず、これらの療法は、疾患のある個体の一部においてのみ有効であり、リツキシマブでは、進行性多発性白質脳症の危険性が伴う。さらに、マクロファージ、樹状細胞およびＴ細胞などの多数のその他の白血球細胞型がこれらの自己免疫疾患の病理に関与していることが多く、したがって、さらなる細胞種またはそれらの機能を阻害する重要な免疫経路を標的とする治療的介入が利益をもたらすことができた。これらの細胞種の活性化および機能において、ＣＤ４０−ＣＤ１５４に免疫学的に関連のある役割が多数あるならば、抗ＣＤ４０抗体は、上記に概略を述べた自己免疫疾患に罹患している患者に対して、現行の療法によって現在もたらされている効果を上回る治療上の利益をもたらすであろう。さらに、クローン病および潰瘍性大腸炎などの腸の炎症性障害においてＣＤ４０−ＣＤ１５４相互作用が中心的役割を果たすこと、自己免疫血管炎、尋常性天疱瘡およびＩＴＰなどのより稀な障害における病理にＣＤ４０経路が機構的に関与していることによってまた、これらの適応症において抗ＣＤ４０抗体が有望であることが強調される。
実質臓器移植後に使用される現在利用可能な免疫抑制剤は、短期ではすぐれた効果をもたらす。新規期間内の急性拒絶はレシピエントの５％〜２０％で認められるが（器官、患者の個体数および治療計画に応じて）、新規期間内の急性拒絶に対する移植片喪失の割合は、いかなる場合でも５％を下回る。免疫抑制に対する患者の忍容性および長期間における移植片生着は、現在でも重要な未だ満たされていないニーズである。腎臓移植後、患者の３３％が死亡し、および／または５年以内に移植片は喪失し、移植レシピエントの平均死亡年齢は５８歳である。カルシニューリン阻害剤（ＣＮＩ）は、移植患者の大多数にとって、依然として主力の免疫抑制療法である。ＣＮＩに関連した腎毒性および心血管罹患率は、慢性同種異系移植腎障害ならびに移植の実施による患者の死亡の促進要因の１つであるが、他の主要な免疫抑制法がＣＮＩの代わりになることはできなかった。結局、長期間の移植の免疫抑制を改善する余地はまだ残されている。移植された腎臓のＢ細胞による免疫学的損傷は、長期に亘る成績の悪さの一因である可能性があり、Ｂ細胞拒絶を標的とする新規薬剤の必要性が医学界によってますます認識されている。
Ｃｈｉｒ１２．１２は、ＣＤ１５４（ＣＤ４０リガンド、ＣＤ４０Ｌとしても知られている）が媒介する白血球活性化を遮断し、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）におけるヒト白血球およびＢ細胞リンパ腫の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介することができる完全にヒト化された非アゴニスト性抗ＣＤ４０抗体（ＩｇＧ１、カッパ）である（国際公開第２００６／０７３４４３号参照のこと）。国際公開第２００５／０４４３０６号はまた、特に自己免疫および炎症性障害の処置に使用する、Ｃｈｉｒ１２．１２を含む抗ＣＤ４０アンタゴニスト抗体について記載している。さらに、Ｃｈｉｒ１２．１２は、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）（カニクイザル）において単独療法として投与された場合、腎臓同種異系移植片拒絶の遅延に有効である[Li et al. (2008) Transplantation; 86 (1):10-15]。しかし、Ｃｈｉｒ１２．１２はまた、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）において末梢Ｂ細胞の除去を媒介することができる。
ＡＤＣＣ活性をサイレンシングした抗ＣＤ４０ｍＡｂは、親抗ＣＤ４０抗体と比較して改善された安全特性を有することが予測され、特に、自己免疫疾患などの非腫瘍性の適応症および移植の場合における使用により適している可能性がある。
したがって、本発明は、親抗ＣＤ４０抗体Ｃｈｉｒ１２．１２の非アゴニスト性のＣＤ４０Ｌ遮断特質を保持しているＦｃサイレント抗ＣＤ４０モノクローナル抗体を提供する。
特に、本発明は、標的ＣＤ４０ポリペプチド（配列番号２８）に対する抗体の抗原結合部分を含む単離された抗体またはタンパク質であって、
ａ）１０ｎＭ以下のＫＤでＣＤ４０ポリペプチドに結合し、
ｂ）サイレントＩｇＧ Ｆｃ領域を含む
ことを特徴とする抗体またはタンパク質を提供する。
一実施形態では、前記抗体またはタンパク質は、ＣＤ４０Ｌ誘導性シグナル伝達を５０ｎｇ／ｍｌ以下のＩＣ５０で阻害する。
別の実施形態では、本発明による単離された抗体またはタンパク質は、ＣＤ４０シグナル伝達に関してアゴニスト活性を有さないか、またはアゴニスト活性が低い。
別の実施形態では、本発明による抗体またはタンパク質は、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９のアミノ酸配列からなる群から選択されるサイレントＩｇＧ Ｆｃ領域を含む。
別の実施形態では、本発明の単離された抗体またはタンパク質は、Ｃｈｉｒ１２．１２の重鎖（ＶＨ）（配列番号９）およびＣｈｉｒ１２．１２抗体の軽鎖（ＶＬ）（配列番号１０）それぞれと少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００パーセントの配列同一性を有するＶＨおよびＶＬ可変領域を含む。
本発明による抗体の特定の例は、
配列番号１１の重鎖アミノ酸配列および配列番号１２の軽鎖アミノ酸配列を含むｍＡｂ１、
配列番号１３の重鎖アミノ酸配列および配列番号１４の軽鎖アミノ酸配列を含むｍＡｂ２、または
配列番号１５の重鎖アミノ酸配列および配列番号１６の軽鎖アミノ酸配列を含むｍＡｂ３である。
本発明による単離された抗体またはタンパク質は、医薬品として使用することができる。特に、本発明による単離された抗体またはタンパク質は、自己免疫障害、炎症性障害の処置および／または移植における移植片拒絶の危険性の防止または軽減において使用するために適している。
本発明による単離された抗体またはタンパク質は、特に多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、関節リウマチ、移植拒絶および移植片対宿主病の処置において使用することができる。
本発明はまた、少なくとも薬学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体と組み合わせた、本発明による上記抗体またはタンパク質を含む医薬組成物に関する。前記医薬組成物は、その他の活性成分をさらに含んでいてもよい。
本発明はまた、本発明による抗体またはタンパク質の凍結乾燥物または液体製剤に関する。
本発明はさらに、本発明による抗体またはタンパク質をコードする単離した核酸および配列番号２２から２７からなる群から選択される少なくとも１種の核酸を含む対応するクローニングベクターまたは発現ベクターに関する。
本発明はまた、上記で定義した１種または複数のクローニングベクターまたは発現ベクターを含む宿主細胞に関する。
本発明はさらに、上記で定義したような宿主細胞を培養することと前記抗体またはタンパク質を精製し回収することとを含む、本発明の抗体またはタンパク質の生産プロセスを提供する。
本発明をより容易に理解することができるように、特定の用語を最初に定義する。さらなる定義は、詳細な説明を通じて記載する。
「免疫応答」という用語は、例えば、リンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒球および上記の細胞または肝臓によって産生される可溶性高分子（抗体、サイトカインおよび補体を含む）の、侵入した病原体、病原体が感染した細胞もしくは組織、癌性細胞、または、自己免疫もしくは病的炎症の場合は、正常なヒト細胞もしくは組織への選択的損傷、破壊、またはヒトの身体からの排除を引き起こす作用を意味する。
「シグナル伝達経路」または「シグナル伝達活性」は、一般的には増殖因子の受容体への結合などのタンパク質−タンパク質相互作用によって開始し、細胞の一部分から細胞の別の部分へのシグナルの伝達を生じる生化学的因果関係を意味する。一般的に、伝達には、シグナル伝達を引き起こす一連の反応における１種または複数のタンパク質の１個または複数のチロシン、セリンもしくはトレオニン残基の特異的リン酸化が関与する。最後から２番目のプロセスには、通常核イベントが含まれ、遺伝子発現の変化が引き起こされる。
ＣＤ４０という用語は、特記しない限り、例えば、配列番号２８で定義したようなヒトＣＤ４０を意味する。
本明細書による「抗体」という用語は、完全な抗体および任意の抗原結合断片（すなわち、「抗原結合部分」）またはそれらの１本鎖を含む。
天然に生じる「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互に結合した少なくとも２本の重（Ｈ）鎖および軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略す）および重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３からなる。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略す）および軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬからなる。ＶＨおよびＶＬ領域はさらに、フレームワーク領域（ＦＲ）と称する、より保存された領域が挿入された相補性決定領域（ＣＤＲ）と称する超可変領域に細分され得る。それぞれのＶＨおよびＶＬは、３個のＣＤＲおよび４個のＦＲから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順番、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で並んでいる。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的な補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織または因子へのイムノグロブリンの結合を媒介することができる。
本明細書で使用したように、抗体の「抗原結合部分」（または単に「抗原部分」）という用語は、抗原（例えば、ＣＤ４０の一部）に特異的に結合する能力を保持している抗体の完全長または１個もしくは複数の断片を意味する。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって遂行され得ることが示された。抗体の「抗原結合部分」という用語内に包含される結合断片の例には、Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる１価の断片、Ｆ（ａｂ）２断片、ヒンジ領域のジスルフィド架橋によって結合した２個のＦａｂ断片を含む２価の断片、ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、抗体の１腕のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ward et al., 1989 Nature 341:544-546）および単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）またはこのような抗原結合部分を含む任意の融合タンパク質が含まれる。
さらに、Ｆｖ断片の２個のドメイン、ＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によってコードされるが、組換え法を使用して、ＶＬおよびＶＨ領域が組になって１価の分子を形成する１本鎖タンパク質（１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている；例えば、Bird et al., 1988 Science 242:423-426;および Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883を参照）を作らせることができる合成リンカーによって接合することができる。このような１本鎖抗体はまた、抗体の「抗原結合部分」という用語内に包含されるものである。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来技術を使用して得られ、この断片は、完全な抗体と同じ方法で利用するためにスクリーニングされる。
本明細書で使用したように、「ＩｇＧ Ｆｃ領域」という用語は、本来の配列Ｆｃ領域および変異型Ｆｃ領域を含むイムノグロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は一般的に、ＩｇＧ抗体のＣ２２６位またはＰ２３０位からカルボキシ末端までのアミノ酸残基を含むことが定義される。Ｆｃ領域の残基の番号付けは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けである。Ｆｃ領域のＣ末端リシン（残基Ｋ４４７）は、例えば、抗体の産生または精製中に除去されてもよい。したがって、本発明の抗体の組成物は、除去されたＫ４４７残基を全て有する抗体集団、除去されたＫ４４７残基を全く有さない抗体集団、およびＫ４４７残基を有する、または有さない抗体の混合物を有する抗体集団を含んでいてもよい。
本明細書で使用した「単離された抗体」とは、様々な抗原特異性を有するその他の抗体を実質的に含まない抗体（例えば、ＣＤ４０に特異的に結合する単離された抗体は、ＣＤ４０以外のその他の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）を意味する。しかし、ＣＤ４０に特異的に結合する単離された抗体は、その他の（非ヒト）種由来のＣＤ４０分子などのその他の抗原に対して交差反応性を有していてもよい。さらに、単離された抗体は、その他の細胞材料および／または化学物質を実質的に含まなくてもよい。
本明細書で使用した「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一の分子組成物の抗体分子の調製物を意味する。モノクローナル抗体組成物は、唯一の結合特異性および特定のエピトープに対する親和性を表す。
本明細書で使用した「ヒト化抗体」という用語は、非ヒトイムノグロブリン配列から得られた最小限の配列を含有する抗体を含むものとする。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域（相補性決定領域またはＣＤＲとしても知られている）の残基が、所望する特異性、親和性および能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域の残基によって置き換えられているヒトイムノグロブリン（レシピエント抗体）である。「相補性決定領域」という表現は、本来のイムノグロブリン結合部位の天然のＦｖ領域の結合親和性および特異性を一緒に定義するアミノ酸配列を意味する。例えば、Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917: Kabat et al. (1991) US Dept. of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242）を参照のこと。「定常領域」という表現は、エフェクター機能を与える抗体分子の部分を意味する。以前の研究では、ヒト疾患の療法において使用するために免疫原性のない抗体を産生するために、マウス定常領域をヒト定常領域に置換した。本発明のヒト化抗体の定常領域は、ヒトイムノグロブリンから得られた。ヒト化は、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者（Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327: Verhoeyen et al. (1988) Science 239: 1534-1536）の方法にしたがって、げっ歯類および突然変異型げっ歯類ＣＤＲ類またはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列と置換することによって実施することができる。場合によっては、ヒトイムノグロブリンの１つまたは複数の可変領域のフレームワーク領域内の残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられる（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６１号、第５，６９３，７６２号および第６，１８０，３７０号を参照のこと）。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体において見出されない残基を含んでいてもよい。本発明のヒト化抗体はまた、イムノグロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含む。典型的には、ヒトイムノグロブリンのものであり、この場合、サイレントＦｃ ＩｇＧ領域である。
本発明の抗体は、ヒト配列によってコードされていないアミノ酸残基を含んでいてもよい（例えば、インビトロにおける無作為もしくは部位特異的な変異誘発またはインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）における体細胞突然変異によって誘導された突然変異）。特に、「ヒト化抗体」という用語には、Ｆｃ ＩｇＧ領域のサイレント変異体を含む抗体が含まれる。
「ヒト化モノクローナル抗体」という用語は、可変領域が非ヒト配列からヒト化されている可変領域を有する単一の結合特異性を表す抗体を意味する。
本明細書で使用した「組換え抗体」という用語は、ヒトイムノグロブリン遺伝子を遺伝子導入した、もしくは染色体導入した動物（例えば、マウス）またはそれらの動物から調製されたハイブリドーマから単離された抗体、ヒトもしくはヒト化抗体を発現するように形質転換された宿主細胞、例えば、トランスフェクトーマから単離された抗体、組換え体、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、およびヒトイムノグロブリン遺伝子配列の全部または一部をその他のＤＮＡ配列にスプライシングすることが関与する任意のその他の手段によって調製、発現、生成または単離された抗体などの組換え手段によって調製、発現、生成または単離されたヒトまたはヒト化抗体全てを含む。そのような組換えヒトまたはヒト化抗体は、フレームワークおよびＣＤＲ領域をヒト生殖系列イムノグロブリン配列から得ることができる可変領域を有する。しかし、特定の実施形態では、そのような組換えヒトまたはヒト化抗体にインビトロにおいて変異誘発を行うことができ（または、ヒトＩｇ配列を遺伝子導入した動物を使用する場合は、インビボにおいて体細胞変異誘発を行うことができ）、したがって、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列から得られ、それらの配列に関係するが、インビボにおいてヒト抗体生殖系列レパートリー内で天然には存在することはできない配列である。
本明細書で使用したように、「アイソタイプ」とは、重鎖定常領域遺伝子によってもたらされる抗体の種類（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４などのＩｇＧ）を意味する。異なるアイソタイプは、異なるエフェクター機能を有する。例えば、野生型ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３アイソタイプは、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）活性を媒介する。
「抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的な抗体」および「抗原に対する抗体」という表現は、本明細書において、「抗原に特異的に結合する抗体」という用語と同義に使用される。
本明細書で使用したように、「ＣＤ４０ポリペプチドに特異的に結合する」抗体またはタンパク質とは、ヒトＣＤ４０ポリペプチドに１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下のＫＤで結合する抗体またはタンパク質を意味するものとする。
「ＣＤ４０以外の抗原と交差反応する」抗体とは、その抗原に１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下のＫＤで結合する抗体を意味するものとする。「特定の抗原と交差反応しない」抗体とは、その抗原に１００ｎＭ以上のＫＤ、または１μＭ以上のＫＤ、または１０μＭ以上のＫＤで結合する抗体を意味するものとする。特定の実施形態では、抗原と交差反応しないそのような抗体は、標準結合アッセイでこれらのタンパク質に対して本質的に検出可能な結合を示さない。
本明細書で使用した「Ｋａｓｓｏｃ」または「Ｋａ」という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の結合速度を意味するものとし、一方、本明細書で使用した「Ｋｄｉｓ」または「Ｋｄ」という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を意味するものとする。
本明細書で使用した「ＫＤ」という用語は、解離定数を意味するもので、ＫｄのＫａに対する比（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される。抗体のＫＤ値は、当技術分野でよく確立された方法を使用して測定することができる。抗体のＫＤを測定する方法は、表面プラズモン共鳴を使用して、またはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）系などのバイオセンサー系を使用することによる。
本明細書で使用したように、「親和性」という用語は、単一抗原部位での抗体と抗原の間の相互作用の強さを意味する。各抗原部位内で、抗体［腕」の可変領域は、弱い非共有結合力によって抗原の数多くの部位と相互作用し、相互作用が多ければ多いほど、親和性は強い。
本明細書で使用したように、「結合力」という用語は、抗体−抗原複合体の全体的な安定性または強度の情報的測定値を意味する。結合力は、３種類の主要な因子、抗体エピトープ親和性、抗原および抗体両方の結合価ならびに相互作用部分の構造的配置によって制御される。結局、これらの因子は、抗体の特異性、すなわち、特定の抗体が正確な抗原エピトープに結合する可能性を定義する。
本明細書で使用したように、「ＣＤ４０アンタゴニスト」という用語は、ＣＤ４０Ｌ媒介ＰＢＭＣ増殖アッセイなどのヒト細胞アッセイにおいて、ＣＤ４０Ｌの存在下でＣＤ４０誘導性シグナル伝達活性を阻害する抗体またはタンパク質を意味するものとする。そのようなアッセイは、以下の実施例でより詳細に説明する。いくつかの実施形態では、本発明の抗体またはタンパク質は、ＣＤ４０Ｌ媒介ＰＢＭＣ増殖アッセイで測定すると、５００ｎｇ／ｍｌ以下のＩＣ５０で、好ましくは５０ｎｇ／ｍｌ以下のＩＣ５０で、例えば、２０ｎｇ／ｍｌ以下のＩＣ５０でＣＤ４０Ｌ誘導性シグナル伝達を阻害する。
本明細書で使用したように、「アゴニスト活性のない」抗体とは、ＣＤ４０Ｌ媒介ＰＢＭＣ増殖アッセイなどの細胞をベースにしたアッセイにおいて、ＣＤ４０Ｌが存在しないとＣＤ４０媒介シグナル伝達活性を有意に増加させない抗体を意味するものとする。そのようなアッセイは、以下の実施例でより詳細に説明する。
本明細書で使用したように、「ＡＤＣＣ」または「抗体依存性細胞傷害」活性という用語は、細胞除去活性を意味する。ＡＤＣＣ活性は、以下の実施例でより詳細に説明したようなＡＤＣＣアッセイによって測定することができる。
本明細書で使用したように、「サイレント」抗体という用語は、実施例で説明したようなＡＤＣＣアッセイにおいて測定したとき、ＡＤＣＣ活性を示さないか、またはＡＤＣＣ活性が低い抗体を意味する。
一実施形態では、「ＡＤＣＣ活性を示さないか、またはＡＤＣＣ活性が低い」という用語は、サイレント抗体が、実施例で説明したようなＡＤＣＣアッセイにおいて測定したとき、特異的細胞溶解が５０％未満、例えば、特異的細胞溶解が１０％未満であるＡＤＣＣ活性を示す。ＡＤＣＣ活性を示さないとは、サイレント抗体が１％未満のＡＤＣＣ活性（特異的細胞溶解）を示すことを意味する。特定の実施形態では、本発明によるサイレント抗体は、実施例で説明したようなＡＤＣＣアッセイで測定したとき、いかなる有意なＡＤＣＣ活性も示さない。
サイレンシングされたエフェクター機能は、抗体のＦｃ領域の突然変異によって得ることができ、当技術分野で説明されている：LALA and N297A (Strohl, W., 2009, Curr. Opin. Biotechnol. vol. 20(6):685-691); および D265A (Baudino et al., 2008, J. Immunol. 181: 6664-69; Strohl, W.,前述）。サイレントＦｃ ＩｇＧ１抗体の例には、ＩｇＧ１ Ｆｃアミノ酸配列中にＬ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ突然変異を含むいわゆるＬＡＬＡ突然変異体が含まれる。サイレントＩｇＧ１抗体の別の例には、Ｄ２６５Ａ突然変異が含まれる。別のサイレントＩｇＧ１抗体には、未グリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）／非グリコシル化（ｎｏｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）抗体を生じるＮ２９７Ａ突然変異が含まれる。
本明細書で使用したように、本発明の抗体またはタンパク質の「選択性」という用語は、特定の標的ポリペプチドには結合するが、密接に関連したポリペプチドには結合しない抗体またはタンパク質を意味する。
本明細書で使用したように、抗体の「高親和性」という用語は、標的抗原に対して１ｎＭ以下のＫＤを有する抗体を意味する。本明細書で使用したように、「対象」という用語には、任意のヒトまたは非ヒト動物が含まれる。
「非ヒト動物」という用語には、脊椎動物全部、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、は虫類などの哺乳類および非哺乳類が含まれる。
本明細書で使用したように、「最適化した」という用語は、産生細胞または生物、一般的には真核細胞、例えば、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）の細胞、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはヒト細胞において好まれるコドンを使用して、アミノ酸配列をコードするためにヌクレオチド配列が変更されたことを意味する。最適化したヌクレオチド配列は、「親」配列としても知られる開始ヌクレオチド配列によって元々コードされているアミノ酸配列を完全に、または可能な限り多く保持するように操作される。本明細書で最適化した配列は、ＣＨＯ哺乳類細胞に好まれるコドンを有するように操作されているが、その他の真核細胞におけるこれらの配列の最適化した発現も本明細書では想定している。最適化したヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列はまた、最適化されているという。
本明細書で使用したように、２本の配列の間のパーセント同一性は、配列によって共有される同一の位置の数の関数（すなわち、％同一性＝同一の位置の数／位置の全数×１００）で、２本の配列の最適なアラインメントのために導入することが必要なギャップの数および各ギャップの長さを考慮する。２本の配列の間の配列の比較およびパーセント同一性の決定は、以下に記載したような数学的アルゴリズムを使用して実現することができる。
２本のアミノ酸配列の間のパーセント同一性は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれたＥ． ＭｅｙｅｒｓとＷ． Ｍｉｌｌｅｒ（Comput. Appl. Biosci., 4:11-17, 1988）のアルゴリズムを使用して、ＰＡＭ１２０重量残基表（ｗｅｉｇｈｔ ｒｅｓｉｄｕｅ ｔａｂｌｅ）、ギャップ長ペナルティ１２およびギャップペナルティー４を用いて決定することができる。あるいは、２本のアミノ酸配列の間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（http://www.gcg.comから入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ（J. Mol, Biol. 48:444-453, 1970）のアルゴリズムを使用して、ブロッサム６２マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクスのいずれかを使用し、１６、１４、１２、１０、８、６もしくは４のギャップ重量および１、２、３、４、５もしくは６の長さ重量を用いて決定することができる。
２本のヌクレオチドアミノ酸配列の間のパーセント同一性はまた、例えば、核酸配列のためのＢＬＡＳＴＮプログラムなどのアルゴリズムを使用して、初期設定としてワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４および両鎖の比較を用いて決定してもよい。
組換え抗体
本発明の抗体には、以下の表１に記載したような完全長重鎖および軽鎖アミノ酸配列を構造的特徴とする単離されたヒト化組換え抗体ｍＡｂ１〜ｍＡｂ３が含まれる。
表1:mAb1〜mAb3の完全長重鎖および軽鎖アミノ酸配列
Figure 2014500720
本発明の単離されたそのような抗体ｍＡｂ１〜ｍＡｂ３の対応する可変領域、ＶＨおよびＶＬアミノ酸配列は全て、例えば、国際公開第２００６／０７３４４３号において以前に記載された、同じ抗体Ｃｈｉｒ１２．１２から得られ、配列番号７のＶＨアミノ酸配列および配列番号８のＶＬアミノ酸配列からなる。
元のＣＨＩＲ１２．１２と比較して本発明の抗体の１つの重要な違いは、サイレントＦｃ ＩｇＧ領域、例えば、サイレントＦｃ ＩｇＧ１領域からなるＦｃ領域を有することである。
特に、表２は、元のＣＨＩＲ１２．１２抗体と比較して、抗体ｍＡｂ１〜ｍＡｂ３を得るために実施されたＦｃ ＩｇＧ１領域の改変の概要を示している。
表2:mAb1〜mAb3を得るためのFc IgG1領域の改変
Figure 2014500720
本発明のその他の抗体には、アミノ酸欠失、挿入または置換によって突然変異し、それでもＣＨＩＲ１２．１２のＶＨ領域およびＶＬ領域、それぞれ配列番号７および配列番号８と少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００パーセントの同一性を有し、サイレントＩｇＧ Ｆｃ領域、例えば、サイレントＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含むアミノ酸を有する抗体が含まれる。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、ｍＡｂ１〜ｍＡｂ３のいずれか１つの突然変異体であり、前記突然変異型抗体は、ＣＨＩＲ１２．１２のＶＨ領域およびＶＬ領域、それぞれ配列番号７および配列番号８と比較したとき、ＶＨおよびＶＬ領域において１、２、３、４もしくは５個以下のアミノ酸がアミノ酸欠失、挿入もしくは置換によって変異した突然変異型アミノ酸配列を含み、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２またはｍＡｂ３と同じ定常領域を保持している。
ｍＡｂ１〜ｍＡｂ３の配列をコードする完全長軽鎖および重鎖ヌクレオチドを以下の表３に示す。
表3:完全長重鎖および軽鎖DNAコーディング配列
Figure 2014500720
本発明の抗体をコードするその他の核酸には、ヌクレオチド欠失、挿入または置換によって突然変異しているが、それでもそれぞれが例えば配列番号２０および配列番号２１で表された配列で示されるようなＣＨＩＲ１２．１２のＶＨおよびＶＬ対応コーディング領域と少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００パーセントの同一性を有し、サイレントＩｇＧ Ｆｃ領域、例えば、サイレントＩｇＧ１ Ｆｃ領域のコーディング配列を含む核酸が含まれる。
いくつかの実施形態では、１、２、３、４もしくは５以下のヌクレオチドが、例えば、配列番号２０および配列番号２１それぞれで表された配列で示されたＶＨおよびＶＬコーディング領域を有するＶＨおよびＶＬコーディング領域におけるヌクレオチド欠失、挿入または置換によって変化し、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２またはｍＡｂ３の対応するコーディング配列と同じ定常領域のコーディング配列を保持している変異型核酸が含まれる。
同種抗体
本発明の組換え抗体、ｍＡｂ１〜ｍＡｂ３に加えて、本発明はまた、ｍＡｂ１〜ｍＡｂ３抗体の所望する機能的特性を保持している同種抗体またはタンパク質を包含する。
特に、本発明による前記同種抗体またはタンパク質は、標的ＣＤ４０ポリペプチド（配列番号２８）に対する抗体の抗原結合部分を含み、前記抗体またはタンパク質は、
ａ）１０ｎＭ以下のＫＤでＣＤ４０ポリペプチドに結合し、
ｂ）サイレントＩｇＧ Ｆｃ領域を含む
ことを特徴とし、前記同種抗体またはタンパク質は元のｍＡｂ１〜ｍＡｂ３抗体の所望する機能的特性を保持している抗体またはタンパク質である。
元のｍＡｂ１〜ｍＡｂ３抗体の所望する機能的特性は、以下の特性：
（ｉ）ＣＤ４０に特異的に結合し、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイで測定したとき、ＫＤが１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下または１ｎＭ以下であること、
（ｉｉ）ＣＤ４０アンタゴニストであること、例えば、ＣＤ４０Ｌ媒介ＰＢＭＣ増殖アッセイで測定したとき、ＣＤ４０Ｌ誘導性シグナル伝達を阻害すること、
（ｉｉｉ）ＣＤ４０Ｌ媒介ＰＢＭＣ増殖アッセイで測定したとき、アゴニスト活性を示さないか、または低いこと、
（ｉｖ）カニクイザルＣＤ４０ポリペプチドと交差反応すること、
（ｖ）ＡＤＣＣ活性がないか、または低いこと、および
（ｖｉ）薬物開発に適切な特性を有すること
の１つまたは複数から選択することができる。
特定の一実施形態では、本発明による前記同種抗体またはタンパク質は、サイレントＩｇＧ１ Ｆｃ領域、例えば、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９からなる群から選択されるサイレントＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。
特定の一実施形態では、本発明は、可変領域重鎖および軽鎖ヌクレオチド配列、または可変領域重鎖および軽鎖アミノ酸配列、または上記の、特に表１の抗体ｍＡｂ１〜ｍＡｂ３の対応するアミノ酸配列もしくはヌクレオチド配列と同種の全６個のＣＤＲアミノ酸配列もしくはヌクレオチドコーディング配列を有する抗体またはタンパク質に関し、前記抗体またはタンパク質は、ｍＡｂ１のＦｃ領域（配列番号１７）、ｍＡｂ２のＦｃ領域（配列番号１８）およびｍＡｂ３のＦｃ領域（配列番号１９）からなる群から選択されるサイレントＩｇＧ Ｆｃ領域を含み、前記同種抗体またはタンパク質はＣＤ４０に特異的に結合し、前記抗体またはタンパク質は、以下の機能的特性、ＣＤ４０アンタゴニストであること、アゴニスト活性を示さないか、または低いこと、およびＡＤＣＣ活性を有さないか、または低いことを示す。
例えば、本発明は、ｍＡｂ１のＦｃ領域（配列番号１７）、ｍＡｂ２のＦｃ領域（配列番号１８）およびｍＡｂ３のＦｃ領域（配列番号１９）からなる群から選択されたサイレントＩｇＧ Ｆｃ領域を含み、ＣＤＲ配列がｍＡｂ１〜ｍＡｂ３の対応するＣＤＲ配列、それぞれ配列番号１〜６と少なくとも６０、７０、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００パーセントの配列同一性を共有する可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）配列を含む、ｍＡｂ１〜ｍＡｂ３と同種の抗体またはタンパク質に関し、前記同種抗体またはタンパク質はＣＤ４０に特異的に結合し、前記同種抗体またはタンパク質は以下の機能特性、ＣＤ４０アンタゴニストであること、アゴニスト活性を示さないか、または低いこと、およびＡＤＣＣ活性を有さないか、または低いことを示す。
関連する特定の実施形態では、同種抗体またはタンパク質は、
ａ）１ｎＭ以下のＫＤでＣＤ４０に結合し、
ｂ）実施例で記載したＣＤ４０Ｌ媒介ＰＢＭＣ増殖アッセイで測定したとき、５０ｎｇ／ｍｌ以下のＩＣ５０でＣＤ４０Ｌ誘導性シグナル伝達を阻害し、
ｃ）実施例で記載したようなＣＤ４０Ｌ媒介ＰＢＭＣ増殖アッセイなどのバイオアッセイで測定したとき、アゴニスト活性がないか、または低く、
ｄ）ＡＤＣＣ活性がないか、または低い。
本発明はさらに、ｍＡｂ１のＦｃ領域（配列番号１７）、ｍＡｂ２のＦｃ領域（配列番号１８）およびｍＡｂ３のＦｃ領域（配列番号１９）からなる群から選択されたサイレントＩｇＧ Ｆｃ領域を含み、ｍＡｂ１〜ｍＡｂ３の対応する（ＶＨ）および（ＶＬ）配列、それぞれ配列番号７および配列番号８と少なくとも８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００パーセント配列同一性を共有する可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）配列を含む、ｍＡｂ１〜ｍＡｂ３と同種の抗体またはタンパク質に関し、前記同種抗体またはタンパク質はＣＤ４０に特異的に結合し、前記抗体またはタンパク質は以下の機能特性、ＣＤ４０アンタゴニストであること、アゴニスト活性を示さないか、または低いこと、およびＡＤＣＣ活性を有さないか、または低いことを示す。
関連する特定の実施形態では、前記同種抗体またはタンパク質は、
ａ）１ｎＭ以下のＫＤでＣＤ４０に結合し、
ｂ）実施例で記載したＣＤ４０Ｌ媒介ＰＢＭＣ増殖アッセイで測定したとき、５０ｎｇ／ｍｌ以下のＩＣ５０でＣＤ４０Ｌ誘導性シグナル伝達を阻害し、
ｃ）実施例で記載したＣＤ４０Ｌ媒介ＰＢＭＣ増殖アッセイなどのバイオアッセイで測定したとき、アゴニスト活性がないか、または低く、
ｄ）ＡＤＣＣ活性がないか、または低い。
別の例では、本発明は、ｍＡｂ１のＦｃ領域（配列番号１７）、ｍＡｂ２のＦｃ領域（配列番号１８）およびｍＡｂ３のＦｃ領域（配列番号１９）からなる群から選択されたサイレントＩｇＧ Ｆｃ領域を含み、可変重鎖および軽鎖がｍＡｂ１〜ｍＡｂ３の可変重鎖および軽鎖の対応するコーディングヌクレオチド配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％同一であるヌクレオチド配列によってコードされる、ｍＡｂ１〜ｍＡｂ３と同種の抗体またはタンパク質に関し、前記同種抗体またはタンパク質はＣＤ４０に特異的に結合し、前記抗体またはタンパク質は以下の機能特性、ＣＤ４０アンタゴニストであること、アゴニスト活性を示さないか、または低いこと、およびＡＤＣＣ活性を有さないか、または低いことを示す。
関連する特定の実施形態では、前記同種抗体またはタンパク質は、
ａ）１ｎＭ以下のＫＤでＣＤ４０に結合し、
ｂ）実施例で記載したＣＤ４０Ｌ媒介ＰＢＭＣ増殖アッセイで測定したとき、５０ｎｇ／ｍｌ以下のＩＣ５０でＣＤ４０Ｌ誘導性シグナル伝達を阻害し、
ｃ）実施例で記載したＣＤ４０Ｌ媒介ＰＢＭＣ増殖アッセイなどのバイオアッセイで測定したとき、アゴニスト活性がないか、または低く、
ｄ）ＡＤＣＣ活性がないか、または低い。
突然変異型アミノ酸配列を有する抗体は、コーディング核酸分子の変異誘発（例えば、部位特異的またはＰＣＲ媒介変異誘発）し、次いで以下の実施例で記載した機能アッセイを使用して、保持されている機能（すなわち、前述の機能）について、コードされた変更抗体を試験することによって得ることができる。
特定の実施形態では、前述のｍＡｂ１〜ｍＡｂ３と同種の抗体またはタンパク質は、保存的配列改変を有する。
本明細書で使用したように、「保存的配列改変」という用語は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基と置き換えられるアミノ酸置換を意味するものとする。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、電荷のない極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。したがって、本発明の抗体のＣＤＲ領域内の１個または複数のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーのその他のアミノ酸残基で置き換えられていてもよく、変更された抗体は、本明細書で記載した機能アッセイを使用して保持している機能について試験することができる。
改変は、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発などの当技術分野で公知の標準技術によって本発明の抗体に導入することができる。
本発明の抗体またはタンパク質をコードする核酸分子
本発明の別の態様は、前述したような本発明の抗体またはタンパク質をコードする核酸分子に関連する。
ｍＡｂ１からｍＡｂ３のいずれか１つの軽鎖および重鎖ヌクレオチド配列の例は、表３から得ることができる（ｍＡｂ１からｍＡｂ３の重鎖および軽鎖の完全なヌクレオチドコーディング配列を示す）。
本発明による軽鎖および重鎖ヌクレオチド配列のその他の例は、表１に記載したようなｍＡｂ１、ｍＡｂ２またはｍＡｂ３の完全長重鎖および／または軽鎖アミノ酸配列をコードする任意の配列である。
本発明はまた、哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ細胞系におけるタンパク質発現に最適化された後者の配列から得られる核酸分子に関連する。
核酸は、完全な細胞中、細胞溶解物中に存在していてもよく、部分的に精製された、または実質的に純粋な形態の核酸であってもよい。核酸は、その他の細胞構成要素またはその他の混入物、例えば、その他の細胞核酸またはタンパク質からアルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌによるバンド形成、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動および当技術分野で周知のその他を含む標準的技術によって精製されたとき、「単離されている」または「実質的に純粋にされている」。例えば、F. Ausubel, et al., ed. 1987 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New Yorkを参照のこと。本発明の核酸は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、イントロン配列を含有していても、いなくてもよい。一実施形態では、核酸はｃＤＮＡ分子である。核酸は、ファージディスプレイベクターなどのベクター中において、または組換えプラスミドベクター中において存在していてもよい。
本発明の核酸は、標準的な分子生物学的技術を使用して得ることができる。例えば、ＶＨおよびＶＬ部分をコードするＤＮＡ断片が一旦得られたら、これらのＤＮＡ断片はさらに、標準的組換えＤＮＡ技術によって操作して、例えば、可変領域遺伝子を完全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂ断片遺伝子またはｓｃＦｖ遺伝子に変換することができる。これらの操作では、ＶＬまたはＶＨをコードするＤＮＡ断片は、別のＤＮＡ分子、または配列番号１７〜１９で定義したようなＦｃ領域を含むｍＡｂ１〜ｍＡｂ３の抗体定常領域をコードする断片に作動可能に連結している。
この文脈で使用したように、「作動可能に連結した」という用語は、例えば、２個のＤＮＡ断片によってコードされたアミノ酸配列がインフレームを維持するように、またはタンパク質が所望するプロモーターの制御下で発現するように、２個のＤＮＡ断片が機能的な方法で接合することを意味するものとする。
ＶＨ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって、完全長重鎖遺伝子に変換することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当技術分野では公知であり（例えば、Kabat, E. A., el al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242を参照のこと）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的ＰＣＲ増幅によって得ることができる。重鎖定常領域は、配列番号１７〜１９で定義されたようなＦｃ領域を含むＩｇＧ１アイソタイプから選択することができる。
ＶＬ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶLをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域、ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって、完全長軽鎖遺伝子（ならびにＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当技術分野では公知であり（例えば、Kabat, E. A., et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242を参照のこと）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的ＰＣＲ増幅によって得ることができる。軽鎖定常領域は、カッパまたはラムダ定常領域であってもよい。
モノクローナル抗体を産生するトランスフェクトーマの作製
本発明の抗体またはタンパク質は、例えば、当技術分野で周知の組換えＤＮＡ技術および遺伝子導入法の組み合わせを使用して、宿主細胞トランスフェクトーマ中で産生することができる（例えば、Morrison, S. (1985) Science 229:1202）。
例えば、抗体を発現するため、部分的または完全長軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡは、標準的分子生物学または生化学技術（例えば、ＤＮＡの化学合成、ＰＣＲ増幅または関心のある抗体を発現するハイブリドーマを使用したｃＤＮＡクローニング）によって得ることができ、それらのＤＮＡは、遺伝子が転写および翻訳制御配列に作動可能に連結するように発現ベクター内に挿入することができる。この文脈では、「作動可能に連結した」という用語は、ベクター内の転写および翻訳制御配列が抗体遺伝子の転写および翻訳を調節するという意図した機能を発揮するように、抗体遺伝子がベクター内に連結されることを意味するものとする。発現ベクターおよび発現制御配列は、使用した発現宿主細胞に適合するように選択される。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子は、別々のベクターに挿入されてもよく、または、より典型的には、両遺伝子は、同じ発現ベクターに挿入される。
抗体遺伝子は、標準的方法（例えば、抗体遺伝子断片およびベクター上の相補的制限部位の連結、または制限部位が存在しない場合、平滑断端の連結）によって発現ベクター内に挿入される。本明細書で記載した抗体の軽鎖および重鎖可変領域を使用して、ＶＨ部分がベクター内のＣＨ部分（複数可）に作動可能に連結し、ＶＬ部分がベクター内のＣＬ部分に作動可能に連結するように、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２またはｍＡｂ３の前記定常領域に対応する所望の配列の重鎖定常領域および軽鎖定常領域を既にコードしている発現ベクターにそれらを挿入することによって、完全長抗体遺伝子を生成することができる。さらに、または、代わりに、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を容易にするシグナルペプチドをコードすることができる。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームで結合するように、ベクター内にクローニングすることができる。シグナルペプチドは、イムノグロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド（すなわち、非イムノグロブリンタンパク質のシグナルペプチド）であってもよい。
抗体鎖遺伝子に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞内での抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を備える。「調節配列」という用語は、プロモーター、エンハンサーおよび抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御するその他の発現制御因子（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むものとする。そのような調節配列は、例えば、Goeddel（Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA 1990）に記載されている。調節配列の選択を含む発現ベクターの設計は、形質転換する宿主細胞の選択、所望するタンパク質の発現レベルなどの要素に左右され得ることは当業者には理解されよう。哺乳類宿主細胞発現のための調節配列には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））およびポリオーマから得られたプロモーターおよび／またはエンハンサーなどの、哺乳類細胞での高レベルのタンパク質発現を対象とするウイルス要素が含まれる。あるいは、ユビキチンプロモーターまたはＰ−グロビンプロモーターなどの非ウイルス性調節配列を使用してもよい。さらに、調節要素は、ＳＶ４０初期プロモーターおよびヒトＴ細胞白血病ウイルス１型の長い末端反復配列からの配列を含有するＳＲプロモーター系などの様々な原料由来の配列からなる（Takebe, Y. et al., 1988 Mol. Cell. Biol. 8:466-472）。
抗体鎖遺伝子および調節配列に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞でのベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）および選択的マーカー遺伝子などのさらなる配列を備えていてもよい。選択的マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする（例えば、いずれもＡｘｅｌ ｅｔ ａｌ．による米国特許第４，３９９，２１６号、第４，６３４，６６５号および第５，１７９，０１７号を参照のこと）。例えば、典型的に、選択的マーカー遺伝子は、Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキセートなどの薬物に対する耐性を、ベクターが導入された宿主細胞に与える。選択的マーカー遺伝子には、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキセート選択／増幅を備えたｄｈｆｒ−宿主細胞において使用するため）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択のため）が含まれる。
軽鎖および重鎖の発現のため、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクター（複数可）は、標準的技術によって宿主細胞に遺伝子導入される。「遺伝子導入」という用語の様々な形態は、外来ＤＮＡを原核もしくは真核宿主細胞に導入するために通常使用される多種多様な技術、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥ−デキストラン遺伝子導入などを包含するものとする。原核または真核いずれかの宿主細胞内で本発明の抗体を発現することは理論的に可能である。真核細胞、例えば、哺乳類宿主細胞、酵母または糸状菌における抗体の発現は、そのような真核細胞、特に哺乳類細胞が、原核細胞よりも、適切に折り畳まれた免疫学的に活性のある抗体をアセンブルし、分泌しやすいので、検討されている。
特定の一実施形態では、本発明によるクローニングまたは発現ベクターは、適切なプロモーター配列に作動可能に連結した、以下のコーディング配列（ａ）〜（ｃ）のいずれか少なくとも１つを含む：
（ａ）ｍＡｂ１の完全長重鎖および軽鎖をそれぞれコードする配列番号２２および配列番号２３、
（ｂ）ｍＡｂ２の完全長重鎖および軽鎖をそれぞれコードする配列番号２４および配列番号２５、または
（ｃ）ｍＡｂ３の完全長重鎖および軽鎖をそれぞれコードする配列番号２６および配列番号２７。
本発明の組換え抗体を発現するための哺乳類宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）（例えば、R.J. Kaufman and P.A. Sharp, 1982 Mol. Biol. 159:601-621で記載されたようなＤＨ ＦＲ選択的マーカーと共に使用されるUrlaub and Chasin, 1980 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220で記載されたｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む）、ＣＨＯＫ１ ｄｈｆｒ＋細胞系、ＮＳＯミエローマ細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞が含まれる。特に、ＮＳＯミエローマ細胞で使用するための別の発現系は、ＰＣＴ公報、国際公開第８７／０４４６２号、国際公開第８９／０１０３６号および欧州特許第０３３８８４１号で示されたＧＳ遺伝子発現系である。
抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを哺乳類宿主細胞に導入するとき、抗体は、宿主細胞における抗体の発現または宿主細胞が増殖する培養培地中への抗体の分泌を可能にするために十分な期間、宿主細胞を培養することによって産生される。抗体は、標準的タンパク質精製法（例えば、Abhinav et al. 2007, Journal of Chromatography 848: 28-37参照）を使用して、培養培地から回収することができる。
特定の一実施形態では、本発明の宿主細胞は、適切なプロモーター配列に作動可能に連結した、ｍＡｂ１〜ｍＡｂ３それぞれの発現に適した（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択されたコーディング配列を有する発現ベクターで遺伝子導入された宿主細胞である：
（ａ）配列番号２２および配列番号２３、
（ｂ）配列番号２４および配列番号２５、ならびに
（ｃ）配列番号２６および配列番号２７。
後者の宿主細胞は、次に、ｍＡｂ１〜ｍＡｂ３それぞれからなる群から選択された本発明の抗体の発現および産生のために適切な条件下でさらに培養することができる。
二重特異的分子
別の態様では、本発明は、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質を含む二重特異的または多重特異的分子を特色とする。本発明の抗体またはタンパク質は、少なくとも２つの異なる結合部位または標的分子に結合する二重特異的分子を作製するために、別の機能的分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質（例えば、別の抗体または受容体のリガンド）に誘導体化または結合することができる。本発明の抗体は、２個を上回る異なる結合部位および／または標的分子に結合する多重特異的分子を作製するために、複数のその他の機能的分子に実際に誘導体化または結合することができ、このような多重特異的分子はまた、本明細書で使用したような「二重特異的分子」という用語によって包含されるものとする。本発明の二重特異的分子を生成するために、本発明の抗体またはタンパク質は、別の抗体、抗体断片、ペプチドまたは結合様物質などの１個または複数のその他の結合分子に機能的に結合することができ（例えば、化学結合、遺伝子的融合、非共有的会合またはその他によって）、したがって二重特異的分子が生じる。
したがって、本発明は、ＣＤ４０に対する少なくとも１個の第１の結合特異性、例えば、ｍＡｂ１〜ｍＡｂ３のいずれか１つの１個の抗原結合部分および第２の標的エピトープに対する第２の結合特異性を含む二重特異的分子を含む。例えば、第２の標的エピトープは、第１の標的エピトープとは異なるＣＤ４０の別のエピトープである。別の例は、ＣＤ４０に対する少なくとも１個の第１の結合特異性、例えば、ｍＡｂ１〜ｍＡｂ３のいずれか１つの１個の抗原結合部分およびＣＤ４０内のエピトープに対する第２の結合特異性を含む二重特異的分子である。
さらに、二重特異的分子が多重特異的である本発明では、分子はさらに、第１および第２の標的エピトープに加えて、第３の結合特性を含むことができる。
本発明の二重特異的分子は、当技術分野で公知の方法を使用して、構成物結合特異性をコンジュゲートすることによって調製することができる。例えば、二重特異的分子のそれぞれの結合特異性は別々に作製し、その後互いにコンジュゲートすることができる。結合特異性がタンパク質またはペプチドである場合、共有的コンジュゲーションのために、様々な結合剤または架橋結合剤を使用することができる。架橋結合剤の例には、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシニミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−スクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）およびスルホスクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−Ｉ−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）（例えば、Karpovsky et al., 1984 J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648を参照のこと）が含まれる。その他の方法には、Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No. 78,118-132; Brennan et al., 1985 Science 229:81-83)およびGlennie et al., 1987 J. Immunol. 139: 2367-2375）に記載された方法が含まれる。コンジュゲート剤は、ＳＡＴＡおよびスルホ−ＳＭＣＣで、いずれもＰｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）から入手可能である。
結合特異性が抗体である場合、２本の重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合によってコンジュゲートすることができる。特定の実施形態では、ヒンジ領域は、コンジュゲーションの前に奇数個のスルフヒドリル残基、例えば、１個を含有するように改変される。
あるいは、両方の結合特異性は、同じベクターでコードされていてもよく、同じ宿主細胞内でアセンブルされていてもよい。この方法は、二重特異的分子がｍＡｂ×ｍＡｂ、ｍＡｂ×Ｆａｂ、Ｆａｂ×Ｆ（ａｂ’）２またはリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質の場合、特に有用である。本発明の二重特異的分子は、１個の１本鎖抗体および結合決定基を含む１本鎖分子または２個の結合決定基を含む１本鎖二重特異的分子であってもよい。二重特異的分子は、少なくとも２個の１本鎖分子を含んでいてもよい。二重特異的分子を調製するための方法は、例えば、米国特許第５，２６０，２０３号、米国特許第５，４５５，０３０号、米国特許第４，８８１，１７５号、米国特許第５，１３２，４０５号、米国特許第５，０９１，５１３号、米国特許第５，４７６，７８６号、米国特許第５，０１３，６５３号、米国特許第５，２５８，４９８号および米国特許第５，４８２，８５８号において記載されている。
二重特異的分子のそれらの特異的標的に対する結合は、例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＥＡ）、ＦＡＣＳ分析法、バイオアッセイ（例えば、増殖阻害法）またはウェスタンブロットアッセイ法によって確認することができる。これらのアッセイのそれぞれは一般的に、関心のある複合体に特異的な標識試薬（例えば、抗体）を使用することによって、特に関心のあるタンパク質−抗体複合体の存在を検出する。
多価抗体
別の態様では、本発明は、例えば、ｍＡｂ１〜ｍＡｂ３のいずれか１つの抗原結合部分から選択された、ＣＤ４０に結合する本発明の抗体の少なくとも２個の同一または異なる抗原結合部分を含む多価抗体を提供する。一実施形態では、多価抗体は、抗体の少なくとも２個、３個または４個の抗原結合部分を提供する。抗原結合部分は、タンパク質融合または共有的または非共有的連結を介して一緒に連結することができる。あるいは、連結方法は、二重特異的分子のために記載されている。例えば、本発明の抗体の定常領域、例えば、Ｆｃまたはヒンジ領域に結合する抗体と本発明の抗体の架橋結合抗体によって、四価化合物を得ることができる。
本発明のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体を使用する治療方法
本発明の方法は、自己免疫疾患および／または炎症性疾患あるいは自己免疫疾患および／または炎症性疾患を発症しやすい素因を有する対象（すなわち、患者）を処置するための本発明の抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質の使用を対象としており、この疾患および／または炎症性疾患はＣＤ４０抗原を発現する細胞上のＣＤ４０Ｌ媒介ＣＤ４０シグナル伝達によって媒介される。
細胞中のＣＤ４０発現を検出する方法は、当技術分野では周知で、限定はしないが、ＰＣＲ技術、免疫組織学、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡなどが含まれる。
本発明の方法は、ＣＤ４０Ｌ媒介によるＣＤ４０の刺激が関与する炎症および／または自己免疫疾患の処置に特に有用である。
炎症性疾患は、炎症および組織破壊またはそれらの組み合わせを特徴とする。「炎症性疾患」には、免疫応答の開始イベントまたは標的に、例えば、同種異系抗原、異種抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、未知の抗原またはアレルゲンを含む、非自己抗原（複数可）が関与するいかなる炎症性免疫媒介性のプロセスも含まれる。
さらに、本発明の目的のために、「炎症性疾患（複数可）」という用語は、「自己免疫疾患（複数可）」を含む。本明細書で使用したように、「自己免疫」という用語は一般的に、「自己」抗原が関与する炎症性免疫媒介性のプロセスを包含するものと理解される。自己免疫疾患では、自己抗原（複数可）が宿主の免疫応答を誘発する。
また、本発明は、組織移植拒絶に関連した炎症の処置を含む。「移植拒絶」または「移植片拒絶」とは、限定はしないが、ＨＬＡ抗原、血液型抗原などを含む移植片に対するいかなる宿主開始免疫応答（ｈｏｓｔ−ｍｏｕｎｔｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）も意味する。
本発明はまた、例えば、骨髄移植に関連したものなどの移植片対宿主病を処置するために使用することができる。そのような移植片対宿主病では、ドナーの骨髄には、リンパ球およびリンパ球に成熟する細胞が含まれる。ドナーのリンパ球は、レシピエントの抗原を非自己として認識し、炎症性免疫応答を開始する。したがって、本明細書で使用したように、「移植片対宿主病」または「移植片対宿主反応」とは、ドナーリンパ球が宿主抗原と反応するいかなるＴ細胞媒介性免疫応答も意味する。
本明細書で記載したアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質、例えば、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２またはｍＡｂ３は、限定はしないが、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、円盤状エリトマトーデス、ループス腎炎、サルコイドーシス、若年性関節炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎、ライター症候群、強直性脊椎炎、および痛風性関節炎を含む炎症性関節炎、器官または組織移植の拒絶、超急性、急性もしくは慢性拒絶および／または移植片対宿主病、多発性硬化症、高ＩｇＥ症候群、結節性多発性動脈炎、原発性胆汁性肝硬変、炎症性腸疾患、クローン病、セリアック病（グルテン過敏性腸症）、原発性シェーグレン症候群（ｐＳＳ）、自己免疫性肝炎、悪性貧血、自己免疫性溶血性貧血、乾癬、強皮症、重症筋無力症、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性甲状腺炎、グレーヴズ病、橋本甲状腺炎、免疫複合体病、慢性疲労、免疫機能障害症候群（ＣＦＩＤＳ）、多発性筋炎および皮膚筋炎、クリオグロブリン血症、血栓溶解、心筋症、尋常性天疱瘡、間質性肺線維症、Ｉ型およびＩＩ型糖尿病、１、２、３および４型遅延型過敏症、アレルギーまたはアレルギー性障害、治療用タンパク質に対する望ましくない／意図しない免疫応答（例えば、米国特許出願第２００２／０１１９１５１号およびKoren,et al.(2002) Curr.Pharm.Biotechnol.3:349-60を参照のこと）、喘息、チャーグ−ストラウス症候群（アレルギー性肉芽腫症）、アトピー性皮膚炎、アレルギー性および刺激性接触皮膚炎、じんま疹（ｕｒｔｅｃａｒｉａ）、ＩｇＥ媒介性アレルギー、アテローム性動脈硬化症、ＡＮＣＡ−関連血管炎、血管炎、特発性炎症性筋疾患、溶血性疾患、アルツハイマー病、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシーなどを含む自己免疫および／または炎症性障害を処置するために本発明の方法に従って使用することができる。
ＣＤ４０−ＣＤ１５４経路の遺伝的切断または薬理学的阻害は、ＳＬＥ、ｐＳＳ、ＩＴＰ、ＭＳ、クローン病、尋常性天疱瘡、自己免疫血管炎およびＲＡの臨床または前臨床モデルのいずれかにおいて治療上の利益が以前に示されており(Law CL, Grewal IS. (2009). Adv. Exp. Med. Biol. 2009;647:8-36)、その医学的必要性を以下に詳細に示す。
好ましい実施形態では、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質は、（ｉ）全身性エリテマトーデス（ループス腎炎）の処置、好ましくは、寛解を誘導および維持するために効果的なステロイド節約治療の提供、ならびに末期腎疾患の予防、（ｉｉ）原発性シェーグレン症候群の処置、好ましくは唾液腺および涙腺破壊の予防ならびに腺外徴候の寛解の誘導および維持、（ｉｉｉ）自己免疫性血小板減少性紫斑病の処置、好ましくは標準的ケアに対する患者の不応症の処置、（ｉｖ）ＡＮＣＡ−関連血管炎の処置、好ましくは副腎皮質ステロイドに対する患者の不応症における寛解の誘導および維持、ならびにステロイド節約処置、（ｖ）尋常性天疱瘡の処置、好ましくは副腎皮質ステロイドに対する患者の不応症における寛解の誘導および維持、ならびにステロイド節約処置、（ｖｉ）多発性硬化症の処置、好ましくは再発および能力障害の進行の予防により有効な処置の提供、ならびに疾患のない状態の実現、ならびに（ｖｉｉ）クローン病の処置、好ましくは寛解の維持により有効な療法の提供、ならびに抗ＴＮＦに対する患者の不応症の治療において有用である。
いくつかのその他の実施形態では、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質は、限定はしないが、肺移植拒絶、喘息、サルコイドーシス、肺気腫、嚢胞性線維症、特発性肺線維症、慢性気管支炎、アレルギー性鼻炎および過敏性肺炎などの肺のアレルギー性疾患、好酸球性肺炎、骨髄および／または肺移植またはその他の原因に起因する閉塞性細気管支炎、移植片アテローム性動脈硬化症／移植片静脈硬化症、ならびにコラーゲン、脈管および関節リウマチ、強皮症、エリテマトーデスなどの自己免疫疾患から生じる肺線維症を含む肺の炎症の処置に有用である。
「処置」とは、本明細書では、対象への本発明による抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質、例えば、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２またはｍＡｂ３抗体の適用または投与、あるいは対象から単離された組織または細胞系への本発明の前記抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質を含む医薬組成物の適用または投与と定義され、対象は、自己免疫疾患および／または炎症性疾患、自己免疫疾患および／または炎症性疾患に関連する症状、あるいは自己免疫疾患および／または炎症性疾患を発症しやすい素因を有し、目的は、自己免疫疾患および／または炎症性疾患、自己免疫疾患および／または炎症性疾患のいかなる関連症状、あるいは自己免疫疾患および／または炎症性疾患を発症しやすい素因を、治療、治癒、緩和、軽減、変更、除去、改良、改善するか、またはこれに影響を与えることである。
「処置」によってまた、対象への本発明による抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質、例えば、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２またはｍＡｂ３抗体を含む医薬組成物の適用または投与、あるいは対象から単離された組織または細胞系への本発明の前記抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質を含む医薬組成物の適用または投与が意図され、対象は、自己免疫疾患および／または炎症性疾患、自己免疫疾患および／または炎症性疾患に関連する症状、あるいは自己免疫疾患および／または炎症性疾患を発症しやすい素因を有し、目的は、自己免疫疾患および／または炎症性疾患、自己免疫疾患および／または炎症性疾患のいかなる関連症状、あるいは自己免疫疾患および／または炎症性疾患を発症しやすい素因を、治療、治癒、緩和、軽減、変更、除去、改良、改善するか、またはこれに影響を与えることである。
「抗炎症活性」によって、炎症の軽減または予防が意図される。本発明による少なくとも１種の抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質による治療によって、自己免疫疾患および／または炎症性疾患の処置に関して有益な生理学的応答が引き起こされ、この疾患にはＣＤ４０抗原を発現する細胞が関与している。本発明の方法は、増殖、活性化などの細胞における表現型の変化の防止において有用であり得ることが認識される。
本発明の方法によれば、本明細書において上記で定義したような本発明の少なくとも１種の抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質は、自己免疫疾患および／または炎症性疾患の処置または予防に関して正の治療応答を促進するために使用される。
自己免疫疾患および／または炎症性疾患に関する「正の治療応答」によって、これらの抗体またはタンパク質の抗炎症活性と関連した疾患の改善、および／または疾患に関連した症状の改善が意図される。すなわち、抗増殖効果、ＣＤ４０発現細胞のさらなる増殖の防止、限定はしないが、炎症性サイトカイン、接着分子、プロテアーゼ、イムノグロブリン（ＣＤ４０を有する細胞がＢ細胞の場合において）、それらの組み合わせなどの分泌低下を含む炎症応答の低下、抗炎症タンパク質の産生増加、自己反応性細胞数の減少、免疫寛容の増大、自己反応性細胞生存の阻害、および／またはＣＤ４０発現細胞の刺激によって媒介される１種または複数の症状の減少を観察することができる。そのような正の治療応答は、投与経路に限定されず、ドナー、ドナー組織（例えば、臓器灌流など）、宿主、それらの任意の組み合わせなどを含むことができる。
臨床応答は、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）スキャン、ｘ線画像、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン、フローサイトメトリーまたは蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）分析などのスクリーニング技術、組織学的検査、肉眼所見および、限定はしないが、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、クロマトグラフィーなどによって検出され得る変化を含む血液化学検査を使用して評価することができる。これらの正の治療応答に加えて、本発明のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質による療法を受けている対象は、疾患に関連した症状の改善という有益な効果を経験することができる。
「治療有効用量または量」あるいは「有効量」によって、投与されたとき、自己免疫疾患および／または炎症性疾患を有する対象の処置に関して正の治療応答をもたらす、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質の量が意図される。
本発明のいくつかの実施形態では、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質、例えば、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２またはｍＡｂ３の治療有効用量は、０．０１ｍｇ／ｋｇから４０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇまたは７ｍｇ／ｋｇから１２ｍｇ／ｋｇの範囲内である。処置方法は、本発明のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質の治療有効用量の単回投与または治療有効用量の複数回投与を含んでいてもよいことが認識される。
本発明の他の実施形態は、例えば、所与の処置計画の有効性を決定するために、臨床試験手順の一部として、組織中のタンパク質レベルを診断用にモニターするための本発明の抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質の使用である。検出は、検出可能な物質に抗体を結合することによって容易にすることができる。検出可能な物質の例には、様々な酵素、接合団、蛍光材料、発光材料、生物発光材料および放射活性材料が含まれる。適切な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、Ｐ−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが含まれ、適切な接合団複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが含まれ、適切な蛍光材料の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンが含まれ、発光材料の例には、ルミノールが含まれ、生物発光材料の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが含まれ、適切な放射活性材料の例には、ｌ２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが含まれる。
本発明の抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質、例えば、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２またはｍＡｂ３は、自己免疫および炎症性疾患の治療のために有用であることが知られている任意の薬剤または薬剤の組み合わせを含むか、または自己免疫および炎症性疾患の処置のために使用されてきた、または現在使用されている自己免疫および炎症性疾患の任意の公知の療法と組み合わせて使用することができる。そのような療法および治療薬には、限定はしないが、外科手術または外科的手順（例えば、脾臓摘出術、リンパ節切除、甲状腺摘出術、血漿フェレーシス、白血球フェレーシス、細胞、組織もしくは器官の移植、腸手順、器官の灌流など）、放射線療法、ステロイド療法および非ステロイド療法などの療法、ホルモン療法、サイトカイン療法、皮膚科用薬剤（例えば、アレルギー、接触性皮膚炎および乾癬などの皮膚の状態を処置するために使用される局所用薬剤）による療法、免疫抑制療法ならびにその他の抗炎症性モノクローナル抗体療法などが含まれる。このような方法では、本明細書で記載したアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質は、限定はしないが、手術、器官灌流、放射線療法、ステロイド療法、非ステロイド療法、抗生物質療法、抗真菌療法、ホルモン療法、サイトカイン療法、皮膚科用薬剤（例えば、アレルギー、接触性皮膚炎および乾癬などの皮膚の状態を処置するために使用される局所用薬剤）による療法、免疫抑制療法、その他の抗炎症性モノクローナル抗体療法、それらの組み合わせなどを含む少なくとも１種のその他の療法と組み合わせて投与される。
したがって、併用療法が、一例としてステロイドのような別の治療薬剤の投与と組み合わせた、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２またはｍＡｂ３抗体などの本発明の抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質の投与を含む場合、本発明の方法は、別々の製剤または単一の医薬製剤を使用した同時投与およびいずれかの順番の連続投与を包含する。本発明の方法が、併用治療計画を含む場合、これらの療法は併行して施されてもよく、すなわち、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質はその他の療法と同じ時に、または同じ時間枠内で投与される（すなわち、療法は同じ時に進行しているが、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質はその他の療法と正確に同時には投与されない）。あるいは、本発明の抗ＣＤ４０抗体または本発明のタンパク質はまた、その他の療養の前または後に投与されてもよい。処置された対象が寛解または再発の可能性を減少させるための第１の療法に応答するかどうかに関わらず、異なる療法の逐次投与を実施してもよい。
本発明のいくつかの実施形態では、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質、例えば、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２またはｍＡｂ３抗体は、免疫抑制薬または抗炎症薬と組み合わせて投与され、抗体またはタンパク質および治療薬（複数可）は、いずれかの順番で逐次、または併行して（すなわち、同じ時に、または同じ時間枠内で）投与されてもよい。本発明のアンタゴニスト性抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質、例えば、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２またはｍＡｂ３抗体と組み合わせて投与することができる適切な免疫抑制薬の例には、限定はしないが、メトトレキセート、シクロホスファミド、ミゾリビン、クロラムブシル、例えば、エアロゾル化したシクロスポリンなどのシクロスポリン（米国特許出願公開第２００２／０００６９０１号参照）、タクロリムス（ＦＫ５０６；ＰｒｏＧｒａｆｒＭ）、ミコフェノール酸モフェチル、およびアザチオプリン（６−メルカプトプリン）、シロリムス（ラパマイシン）、デオキシスパガリン、レフルノミドおよびそのマロノニトリロアミド類似体が含まれ、ならびに、免疫抑制タンパク質には、例えば、抗ＣＴＬＡ４抗体およびＩｇ融合体、抗Ｂリンパ球刺激抗体（例えば、ＬＹＭＰＨＯＳＴＡＴ−ＢＴＭ）およびＩｇ融合体（ＢＬｙＳ−Ｉｇ）、抗ＣＤ８０抗体およびエタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））および抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）、抗ＣＤ４などの抗Ｔ細胞抗体が含まれる。適切な抗炎症剤の例には、限定はしないが、例えば、クロベタゾール、ハロベタソール、ヒドロコルチゾン、トリアムシノロン、ベタメタゾン、フルオシノール（ｆｌｕｏｃｉｎｏｌｅ）、フルオシノニド、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロンなどの副腎皮質ステロイド、例えば、スルファサラジン、メサラミンを含有する治療薬（５−ＡＳＡ剤として知られる）、セレコキシブ、ジクロフェナク、エトドラク、フェンプロフェン（ｆｅｎｐｒｏｆｅｎ）、フルルビプロフェン、イブプロフェン、ケトプロフェン、メクロファメート（ｍｅｃｌｏｆａｍａｔｅ）、メロキシカム、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピロキシカム、ロフェコキシブ、サリチル酸、スリンダク、およびトルメチンなどの非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、ホスホジエステラーゼ−４阻害剤、アダリムマブ（ＨＵＭＥＲＡ（登録商標）、ＴＮＦ−αアンタゴニスト）およびインフィリキシマブ（レミカド、ＴＮＦ−αアンタゴニスト）などの抗炎症性抗体などが含まれる。サリドマイドまたはレナリドマイドなどのその類似体などの自己免疫疾患の処置に現在または潜在的に使用される免疫調節剤も含まれる。
移植拒絶および移植片対宿主病は、超急性（体液性）、急性（Ｔ細胞媒介性）、または慢性（未知の病因）、またはこれらの組み合わせであり得る。したがって、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質、例えば、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２またはｍＡｂ３抗体は、いくつかの実施形態では、限定はしないが、肝臓、腎臓、膵臓、膵島細胞、小腸、肺、心臓、角膜、皮膚、血管、骨、異種もしくは自己の骨髄などを含む任意の組織の、超急性、急性および／または慢性移植片拒絶の拒絶および／または関連する症状を予防および／または改良するために使用される。移植片組織は、任意のドナーから得られ、任意のレシピエント宿主に移植することが可能で、したがって、移植手順には、動物組織をヒトに移植すること（例えば、異種移植）、あるヒトから別のヒトに組織を移植すること（例えば、同種異系移植）、および／またはヒトの身体のある部分の組織を別の部分に移植すること（例えば、自己移植）を含めることができる。
本発明の抗体またはタンパク質による処置はまた、熱、食欲不振、血行力学的異常、白血球減少症、移植された器官／組織の白血球浸潤、および日和見感染などの移植後遺症を軽減することができる。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質は、例えば、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２またはｍＡｂ３抗体は、単独または免疫抑制薬と組み合わせて使用され、超急性、急性および／もしくは慢性拒絶ならびに／または移植片対宿主病などの移植拒絶を処置および／または予防することができる。
したがって、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質が移植片拒絶を処置するために使用されるいくつかの実施形態では、抗体、例えば、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２またはｍＡｂ３抗体は、限定はしないが、メトトレキセート、シクロホスファミド、ミゾリビン、クロラムブシル、例えば、エアロゾル化シクロスポリンなどのシクロスポリン（例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２００２０００６９０１号参照）、タクロリムス（ＦＫ５０６、ＰｒｏＧｒａｆｍ）、ミコフェノール酸モフェチルおよびアザチオプリン（６−メルカプトプリン）、シロリムス（ラパマイシン）、デオキシスペルグアリン、レフルノミドおよびそのマロノニトリロアミド類似体を含む適切な免疫抑制薬、例えば、サリドマイドおよびその類似体を含む免疫調節剤、ならびに、例えば、抗ＣＴＬＡ４抗体およびＩｇ融合体、抗Ｂリンパ球刺激抗体（例えば、ＬＹＭＰＨＯＳＴＡＴ−ＢＴＭ）およびＩｇ融合体（ＢＬｙＳ−Ｉｇ）、抗ＣＤ８０抗体およびエタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））および抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）、抗ＣＤ４などの抗Ｔ細胞抗体などを含む免疫抑制タンパク質と組み合わせて使用することができる。
したがって、本発明の組成物および方法は、その他の薬物と組み合わせて使用して、例えば、肺または腎臓移植片を受け入れたレシピエントなどの移植レシピエントにおいて、症状および転帰をさらに改善することが特に企図される。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質、例えば、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２またはｍＡｂ３抗体は、移植拒絶（例えば、肺または腎臓移植レシピエントにおける超急性、急性および／もしくは慢性の拒絶または移植片対宿主病など）を処置するために、単独または経口投与および／または非経口投与された、例えば、経口用シクロスポリン、注射可能なシクロスポリン、エアロゾル化（例えば、吸入）シクロスポリン、およびそれらの組み合わせを含むシクロスポリンと組み合わせて使用される。療法の少なくとも１つの構成要素がエアロゾル化シクロスポリンであるいくつかの実施形態では、シクロスポリンは、例えば、加圧型デリバリー装置または噴霧器を使用して、エアロゾルスプレー形態でのシクロスポリンの吸入によって、レシピエントの肺にデリバリーされる。シクロスポリンは、乾燥粉末または湿潤形態のいずれで投与されてもよい。シクロスポリンは、治療用量以下で投与されてもよい。
いくつかの他の実施形態では、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質、例えば、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２またはｍＡｂ３抗体は、単独または免疫抑制薬と組み合わせて使用して、慢性関節リウマチを処置および／または予防することができる。したがって、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質、例えば、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２またはｍＡｂ３抗体を使用して、関節リウマチを処置するいくつかの実施形態では、前記抗体またはタンパク質は、限定はしないが、メトトレキセート、シクロホスファミド、ミゾリビン、クロラムブシル、シクロスポリン、タクロリムス（ＦＫ５０６；ＰＲＯＧＲＡＦＴＭ）、ミコフェノール酸モフェチルおよびアザチオプリン（６−メルカプトプリン）、シロリムス（ラパマイシン）、デオキシスパガリン、レフルノミドおよびそのマロノニトリロアミド類似体を含む適切な免疫抑制薬、ならびに、例えば、抗ＣＴＬＡ４抗体およびＩｇ融合体、抗Ｂリンパ球刺激抗体（例えば、ＬＹＭＰＨＯＳＴＡＴ−ＢＴＭ）およびＩｇ融合体（ＢＬｙＳ−Ｉｇ）、抗ＣＤ２０抗体（例えば、ＲＩＴＵＸＡＮ（ｇ））完全なヒト抗体ＨｕＭａｘ−ＣＤ２０、Ｒ−１５９４、ＩＭＭＵ−１０６、ＴＲＵ−０１５、ＡＭＥ−１３３、トシツモマブ／１−１３１、トシツモマブ（Ｂｅｘｘａｒ（Ｄ））、イブリツモマブチウキセタン（Ｚｃｖａｌｉｎ（登録商標））、抗ＣＤ８０抗体およびエタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ）、ならびに抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）、抗ＣＤ４などの抗Ｔ細胞抗体などを含む免疫抑制タンパク質と組み合わせて使用することができる。上記で検討したように、処置の有効性は、任意の手段を使用して評価することができ、限定はしないが、アメリカリウマチ学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｒｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ）の診断基準、ヨーロッパ連盟（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｌｅａｇｕｅ）のリウマチ診断基準、または任意のその他の診断基準によって定義された臨床応答によって測定されるような有効性が含まれる。例えば、Felson et al. (1995) Arthritis. Rheum. 38 : 727-35およびvan Gestel et al. (1996) Arthritis Rheum. 39: 34-40を参照のこと。
さらにその他の実施形態では、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質、例えば、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２またはｍＡｂ３抗体は、単独または免疫抑制薬と組み合わせて使用して、多発性硬化症を処置および／または予防することができる。したがって、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質、例えば、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２またはｍＡｂ３抗体を使用して、多発性硬化症を処置するいくつかの実施形態では、抗体は、限定はしないが、メトトレキセート、シクロホスファミド、ミゾリビン、クロラムブシル、シクロスポリン、タクロリムス（ＦＫ５０６；ＰＲＯＧＲＡＦＴＭ）、ミコフェノール酸モフェチルおよびアザチオプリン（６−メルカプトプリン）、シロリムス（ラパマイシン）、デオキシスパガリン、レフルノミドおよびそのマロノニトリロアミド類似体を含む適切な免疫抑制薬、ならびに、例えば、抗ＣＴＬＡ抗体およびＩｇ融合体、抗Ｂリンパ球刺激抗体（例えば、ＬＹＭＰＨＯＳＴＡＴ−ＢＴＭ）およびＩｇ融合体（ＢＬｙＳ−Ｉｇ）、抗ＣＤ２０抗体（例えば、ＲＩＴＵＸＡＮ（Ｄ））完全なヒト抗体ＨｕＭａｘ−ＣＤ２０、Ｒ−１５９４、ＩＭＭＩＪ−１０６、ＴＲＵ−０１５、ＡＭＥ−１３３、トシツモマブ／１−１３１、トシツモマブ（Ｂｅｘｘａｒ（登録商標））、イブリツモマブチウキセタン（Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標））、抗ＣＤ８０抗体およびエタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ）、ならびに抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）、抗ＣＤ４などの抗Ｔ細胞抗体、例えば、フィンゴリモドを含むＳ１Ｐ受容体の調節に関与する薬剤などを含む免疫抑制タンパク質と組み合わせて使用することができる。
医薬製剤および投与様式
本発明の抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質は、自己免疫疾患および／または炎症性疾患を予防または処置するため、および／または移植における移植片拒絶に関連した危険性を防止または軽減するために治療上有効な濃度で投与される。
目的を実現するため、抗体は、当技術分野で公知の許容される様々な賦形剤を使用して製剤化することができる。典型的には、抗体またはタンパク質は、注射によって、例えば、静脈内、腹腔内または皮下のいずれかに投与される。この投与を実現する方法は、当業者には公知である。局所的に、または経口的に投与することができ、または粘膜を横断して透過することができる組成物を得ることも可能であり得る。
静脈内投与は、好ましくは注入によって、投与する抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質に応じて、約１から約１０時間、より好ましくは約１から約８時間、さらにより好ましくは約２から約７時間、さらにより好ましくは約４から約６時間の期間に亘って行う。医薬組成物による最初の注入は、約４から約６時間の期間に亘って行われ、その後の注入はより迅速に送達されてもよい。その後の注入は、例えば、約１から約４時間、約１から約３時間または約１から約２時間を含む約１から約６時間の期間に亘って投与されてもよい。
本発明の医薬組成物は、企図する投与経路に適合して製剤化される。可能な投与経路の例には、非経口（例えば、静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）、皮内、皮下（ＳＣ）、または注入）、経口および肺（例えば、吸入）、経鼻、経皮（局所）経粘膜および直腸投与が含まれる。非経口、皮内または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液は、以下の構成要素、注射用の水などの滅菌希釈液、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたはその他の合成溶媒、ベンジルアルコールもしくはメチルパラベンなどの抗菌剤、アスコルビン酸もしくは亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤、エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤、酢酸塩、クエン酸塩もしくはリン酸塩などの緩衝剤および塩化ナトリウムもしくはデキストロースなどの浸透圧調整のための薬剤を含むことができる。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調節することができる。非経口用調製物は、アンプル、使い捨てシリンジまたはガラスもしくはプラスチック製の複数用量用バイアルに封入することができる。
本発明の抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質は通常、薬学的に許容される緩衝液、例えば、滅菌生理食塩水、滅菌緩衝化水、プロピレングリコール、前記の組み合わせなどの中で標準的技術によって用意される。非経口的投与が可能な薬剤の調製方法は、Remington's Pharmaceutical Sciences（18th ed．; Mack Publishing Company, Eaton, Pennsylvania, 1990）に記載されている。例えば、本発明の方法で使用するために適した安定化抗体医薬製剤について記載している国際公開第９８／５６４１８号も参照のこと。
投与する本発明の少なくとも１種のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質の量は、当業者によって容易に決定される。少なくとも１種のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質の投与様式およびそれぞれの量に影響を及ぼす要素には、限定はしないが、療法を受ける特定の疾患、疾患の重症度、疾患の病歴、ならびに療法を受ける個体の年齢、身長、体重、健康状態および身体的状態が含まれる。同様に、投与されるアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質の量は、投与の様式およびその対象がこの薬剤の単回用量または複数回用量のどちらを受けるかに左右される。一般的には、抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質の投薬量をより高くすることが、療法を受ける患者の体重の増加には好ましい。投与される抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質の用量は、約０．００３ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇの範囲であり、好ましくは、０．０１ｍｇ／ｋｇから約４０ｍｇ／ｋｇの範囲である。
したがって、例えば、用量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、または５０ｍｇ／ｋｇであってもよい。
本発明の別の実施形態では、この方法は、複数回用量のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその断片の投与を含む。この方法は、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１５回、２０回、２５回、３０回、３５回、４０回もしくはそれ以上のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその断片を含む治療有効用量の医薬組成物の投与を含むことができる。抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質を含む医薬組成物の複数回用量の投与の頻度および期間は、当業者によって容易に決定することができる。さらに、治療有効量の抗体またはタンパク質による対象の処置は、一回の処置を含んでいてもよく、または好ましくは一連の処置を含んでいてもよい。好ましい実施例において、対象は、約０．１から２０ｍｇ／ｋｇ体重の間の範囲の本発明のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質によって、週に１回、約１から１０週間、好ましくは約２から８週間、より好ましくは約３から７週間、そしてさらにより好ましくは約４、５もしくは６週間処置される。処置は、再発を防止するためか、または再発の適応症に対して毎年行ってもよい。処置に使用される抗体またはその抗原結合断片の有効投薬量は、特定の処置の間に増加しても減少してもよいことも理解されよう。投薬量の変化は、本明細書で記載したような診断アッセイの結果から得られ、明らかになり得る。
したがって、一実施形態では、投与計画には、処置期間の１、７、１４および２１日目の本発明の少なくとも１種の抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質の治療有効用量の第１の投与が含まれる。別の実施形態では、投与計画には、処置期間の１週目の１、２、３、４、５、６および７日目の本発明の少なくとも１種の抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質の治療有効用量の第１の投与が含まれる。他の実施形態には、処置期間の１週目の１、３、５および７日目の本発明の少なくとも１種の抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質の治療有効用量の第１の投与を有する投与計画、処置期間の１週目の１および３日目の本発明の少なくとも１種の抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質の治療有効用量の第１の投与を含む投与計画、ならびに処置期間の１週目の１日目の本発明の少なくとも１種の抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質の治療有効用量の第１の投与を含む好ましい処置計画が含まれる。この処置期間は、１週、２週、３週、１カ月、３カ月、６カ月、または１年を含むことができる。処置期間は、続いていてもよいし、または互いに１日、１週、２週、１カ月、３カ月、６カ月または１年離れていてもよい。０．００３ｍｇ／ｋｇから５０ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇから４０ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇから３０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇから３０ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇから３０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇから３０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇから３０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇから２５ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ、または７ｍｇ／ｋｇから１２ｍｇ／ｋｇの範囲である。したがって、例えば、任意の１種のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合断片、例えば、本発明の抗ＣＤ４０モノクローナル抗体またはタンパク質の用量は、０．００３ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇまたは０．００３ｍｇ／ｋｇから５０ｍｇ／ｋｇの範囲内にあるその他のそのような用量であってもよい。本発明の抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質の同じ治療有効用量は、抗体を投与する各週を通じて投与することができる。
あるいは、本発明のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質の異なる治療有効用量は、処置期間に亘って使用することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書の他の部分で定義したように、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合断片の最初の治療有効用量はより低い用量範囲（すなわち、０．００３ｍｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇ）であり、その後の用量はより高い用量範囲内（すなわち、２０ｍｇ／ｋｇから５０ｍｇ／ｋｇ）であってもよい。
代替の実施形態では、本明細書の他の部分で定義したように、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合断片の最初の治療有効用量はより高い用量範囲（すなわち、２０ｍｇ／ｋｇから５０ｍｇ／ｋｇ）であり、その後の用量はより低い用量範囲内（すなわち、０．００３ｍｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇ）であってもよい。したがって、一実施形態では、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合断片の最初の治療有効用量は、約２０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、および約３５ｍｇ／ｋｇを含む２０ｍｇ／ｋｇから３５ｍｇ／ｋｇであり、本発明のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質のその後の治療有効用量は、約５ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇおよび約１５ｍｇ／ｋｇを含む約５ｍｇ／ｋｇから約１５ｍｇ／ｋｇである。
本発明のいくつかの実施形態では、抗ＣＤ４０療法は、本発明の抗体またはタンパク質の「負荷用量」を、抗ＣＤ４０療法を必要としている対象に投与することによって開始される。「負荷用量」によって、投与される本発明の抗体またはタンパク質の用量がより高い用量範囲内（すなわち、約２０ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇ）にある、対象に投与される本発明の抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質の最初の用量が意図される。「負荷用量」は、全「負荷用量」が約２４時間の期間内に投与される限り、単回投与、例えば、抗体またはその抗原結合断片がＩＶ投与される単回注入として、または複数回投与、例えば、抗体またはその抗原結合断片がＩＶ投与される複数回注入として投与することができる。「負荷用量」の投与に続いて、その後、対象は、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質の１回または複数の追加の治療有効用量を投与される。その後の治療有効用量は、例えば、毎週の投与計画に従って、または２週間に一度、３週間に一度、または４週間に一度投与することができる。そのような実施形態では、その後の治療有効用量は一般的に、より低い用量範囲内にある（すなわち、０．００３ｍｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇ）。
あるいは、いくつかの実施形態では、「負荷用量」に続いて、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質のその後の治療有効用量は、「維持計画」に従って投与され、本発明の抗体またはタンパク質の治療有効用量は、１カ月に１回、６週間に１回、２カ月に１回、１０週間に１回、３カ月に１回、１４週間に１回、４カ月に１回、１８週間に１回、５カ月に１回、２２週間に１回、６カ月に１回、７カ月に１回、８カ月に１回、９カ月に１回、１０カ月に１回、１１カ月に１回、または１２カ月に１回投与される。そのような実施形態では、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質の治療有効用量は、特にその後の用量がより頻繁な間隔、例えば、２週間に１回から１カ月に１回で投与されるときはより低い用量範囲内（すなわち、０．００３ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇ）で、あるいは特にその後の用量があまり頻繁ではない間隔で投与されるとき、例えば、その後の用量が１カ月から１２カ月離れて投与されるときはより高い用量範囲内（すなわち、２０ｍｇ／ｋｇから５０ｍｇ／ｋｇ）である。
治療上活性のある構成要素として本明細書中に記載されている所望する機能特性を有する本発明の抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質を含むいかなる医薬組成物も、本発明の方法において使用することができる。したがって、１種または複数の本発明の抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質、例えば、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２またはｍＡｂ３抗体を含む液体、凍結乾燥または噴霧乾燥組成物は、本発明の方法による対象へのその後の投与のために、水性もしくは非水性の溶液または懸濁液として調製することができる。
これらの組成物の各々は、治療上または予防上活性のある構成要素として、本発明の少なくとも１種の抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質を含む。
「治療上または予防上活性のある構成要素」によって、医薬組成物が対象に投与されるときに、この対象内の疾患もしくは状態の処置、予防または診断に関して所望する処置上または予防上の応答をもたらすために、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質が特に組成物中に組み込まれることが意図される。好ましくは、医薬組成物は、適切な安定化剤、充填剤またはそれら両方を含み、調製および保存の間のタンパク質の安定性および生物学的活性の喪失に伴う問題を最小限にする。
製剤化剤を、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質を含む医薬組成物に添加することができる。これらの製剤化剤は、限定はしないが、油、ポリマー、ビタミン、炭水化物、アミン酸、塩、緩衝液、アルブミン、界面活性剤または充填剤を含むことができる。好ましくは、炭水化物は、単糖類、二糖類、もしくは多糖類などの糖または糖アルコールあるいは水溶性グルカンを含む。糖類またはグルカンは、フルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、スクロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、αおよびβシクロデキストリン、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプンならびにカルボキシメチルセルロースまたはそれらの混合物を含むことができる。
「糖アルコール」は、ヒドロキシル基を有するＣ４からＣ８炭化水素として定義され、ガラクチトール、イノシトール、マンニトール、キシリトール、ソルビトール、グリセロールおよびアラビトールが含まれる。これらの糖または糖アルコールは、個々にまたは組み合わせて使用することができる。糖または糖アルコールの濃度は、１．０％ｗ／ｖと７％ｗ／ｖとの間であり、より好ましくは、２．０％ｗ／ｖと６．０％ｗ／ｖとの間であってもよい。例えば、アミノ酸には、左旋（Ｌ）型のカルニチン、アルギニンおよびベタインが含まれるが、その他のアミノ酸を添加してもよい。好ましいポリマーには、平均分子量が２，０００と３，０００との間であるポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、または、平均分子量が３，０００と５，０００との間であるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれる。製剤に添加することができる界面活性剤は、欧州特許第２７０，７９９号および第２６８，１１０号に示されている。
さらに、抗体は、例えば、その循環半減期を延長するために、ポリマーへの共有的コンジュゲーションによって化学的に修飾することができる。好ましいポリマーおよびそれらのポリマーをペプチドに付着させる方法は、米国特許第４，７６６，１０６号、第４，１７９，３３７号、第４，４９５，２８５号および第４，６０９，５４６号に示されている。好ましいポリマーは、ポリオキシエチル化ポリオールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧは、室温で水溶性であり、一般式：Ｒ（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎＯ−Ｒを有し、式中、Ｒは、水素またはアルキル基もしくはアルカノール基などの保護基であることができる。好ましくは、保護基は、１個と８個の間の炭素を有し、より好ましくは、この保護基はメチルである。記号ｎは、正の整数であり、好ましくは、１と１，０００との間、より好ましくは、２と５００との間である。ＰＥＧの好ましい平均分子量は、１，０００と４０，０００との間、より好ましくは、２，０００と２０，０００との間、最も好ましくは、３，０００と１２，０００との間である。好ましくは、ＰＥＧは、少なくとも１個のヒドロキシ基を有し、より好ましくは、それは末端のヒドロキシ基である。好ましくは阻害剤上の遊離アミノ基と反応するように活性化されるのは、このヒドロキシ基である。しかし、反応基の種類および量は、本発明の共有的コンジュゲート化ＰＥＧ／抗体を実現するために変化していてもよいことが理解されよう。
水溶性ポリオキシエチル化ポリオールもまた、本発明において有用である。
これらには、ポリオキシエチル化ソルビトール、ポリオキシエチル化グルコース、ポリオキシエチル化グリセロール（ＰＯＧ）などが含まれる。ＰＯＧが好ましい。１つの理由は、ポリオキシエチル化グリセロールのグリセロール骨格が、例えば、動物およびヒトのモノ−、ジ−、トリグリセリドにおいて天然に生じるものと同じ骨格であるからである。したがって、この分枝形成は、必ずしも体内で外来因子として認識されない。ＰＯＧは、ＰＥＧと同じ範囲の好ましい分子量を有する。ＰＯＧの構造は、Knauf et al． （1988, J． Bio． Chem． 263: 15064-15070）に示されており、ＰＯＧ／ＩＬ−２コンジュゲートの考察については、米国特許第４，７６６，１０６号に見出される。
循環半減期を延長するための別の薬物送達系は、リポソームである。
リポソーム送達系を調製する方法は、Gabizon et al. （1982） Cancer Research 42: 4734; Cafiso （1981） Biochem Biophys Acta 649: 129およびSzoka （1980） Ann. Rev. Bioplays. Eng. 9: 467において考察されている。その他の薬物送達系が当技術分野で公知であり、例えば、Poznansky et al. (1980) Drug Delivery Systems (R. L. Juliano, ed. , Oxford, N. Y. ) pp. 253-315;Poznansky (1984) Pharm Revs 36: 277に記載されている。
医薬組成物に組み込まれる製剤化剤は、本発明のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質の安定性を提供するべきである。すなわち、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質は、その物理的および／または化学的安定性を保持し、所望の機能的活特性、すなわち、本明細書で上記に定義した所望する機能的特性の１つまたは複数を有する。
タンパク質の安定性をモニターするための方法は、当技術分野で周知である。例えば、Jones （1993） Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90; Lee, ed. （1991） Peptide and Protein Drug Delivery （Marcel Dekker, Inc., New York, New York）および本明細書で以下に開示した安定性アッセイを参照のこと。一般的に、タンパク質の安定性は、特定の時間で選択された温度において測定される。好ましい実施形態では、安定な抗体医薬製剤は、室温（約２５℃）において、少なくとも１カ月、少なくとも３カ月、もしくは少なくとも６カ月保存した場合に、本発明のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質の安定性を提供し、および／または、約２〜８Ｃにおいて、少なくとも６カ月、少なくとも９カ月、少なくとも１２カ月、少なくとも１８カ月、少なくとも２４カ月安定である。
医薬組成物中に製剤化される場合、抗体などのタンパク質は、その医薬組成物中で、沈殿、凝集および／または変性の視覚的徴候（すなわち、変色または透明度の喪失）または測定可能な徴候（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）またはＵＶ光散乱を使用して）を示さない場合に、所定の時点において、その物理的安定性を保持していると考えられる。化学的安定性に関しては、医薬組成物中に製剤化される場合、抗体などのタンパク質は、化学的安定性の測定によって、その医薬組成物中においてタンパク質（すなわち、抗体）が関心のある生物学的活性を保持することが示唆される場合に、所定の時点においてその化学的安定性を保持していると考えられる。化学的安定性の変化をモニターするための方法は当技術分野で周知であり、限定はしないが、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＳＥＣおよび／またはマトリックス支援レーザー脱離イオン化／時間飛行型質量分析を使用する、クリッピングの結果などのタンパク質の化学的に変更された形態を検出する方法、ならびに、例えば、イオン交換クロマトグラフィーを使用する、分子の電荷の変化に伴う（例えば、脱アミドに伴う）分解を検出する方法が含まれる。例えば、本明細書において以下に開示した方法を参照のこと。
医薬組成物中に製剤化される場合、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質は、所望の生物学的活性に適切なアッセイにおいて測定されるとき、所定の時点での所望の生物学的活性が、その医薬組成物が調製された時点で示される所望の生物学的活性の約３０％以内、好ましくは、約２０％以内である場合に、所定の時点において所望の生物学的活性を保持すると考えられる。本明細書において開示されるアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質の所望の生物学的活性を測定するためのアッセイは、本明細書の実施例に記載されるように実施することができる。Schutze et al. （1998） Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8200-8204; Denton et al. （1998） Pediatr Transplant. 2: 6-15; Evans et al. （2000） J : Immunol. 164: 688-697 ; Noelle （1998） Agents Actions Suppl. 49: 17-22; Lederman et al. （1996） Curr Opin． Hematol. 3: 77-86; Coligan et al. （1991） CurrentProtocols in Immunology 13: 12; Kwekkeboom et al. （1993） Immunology 79: 439-444; および米国特許第５，６７４，４９２号および第５，８４７，０８２号に記載されたアッセイも参照のこと。
本発明のいくつかの実施形態では、例えば、ｍＡｂ１〜ｍＡｂ３組換え抗体から選択された抗ＣＤ４０抗体は、液体医薬製剤中において製剤化される。本発明の抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質は、当技術分野で公知の任意の方法を使用して調製することができ、本明細書において上記で開示した方法が含まれる。一実施形態において、例えば、ｍＡｂ１〜ｍＡｂ３抗体から選択された抗ＣＤ４０抗体は、ＣＨＯ細胞系で組換えによって産生される。
その調製および精製の後、抗ＣＤ４０抗体は、本明細書で記載した方法で液体医薬製剤として製剤化することができる。アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体がその製剤化前に保存される場合、例えば、−２０℃で凍結され、次いで、さらに製剤化するために室温で融解することができる。
液体医薬製剤は、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質、例えば、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２またはｍＡｂ３抗体の治療有効量を含む。製剤中に存在する抗体の量は、投与経路および所望の投薬量を考慮する。
この方法において、液体医薬組成物は、抗ＣＤ４０抗体、例えば、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２またはｍＡｂ３抗体を、０．１ｍｇ／ｍｌから３００．０ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍｇ／ｍｌから２００ｍｇ／ｍｌ、５．０ｍｇ／ｍｌから１００．０ｍｇ／ｍｌ、７．５ｍｇ／ｍｌから５０ｍｇ／ｍｌまたは１５．０ｍｇ／ｍｌから２５．０ｍｇ／ｍｌの濃度で含む。
液体医薬組成物は、抗ＣＤ４０抗体、例えば、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２またはｍＡｂ３抗体および製剤のｐＨをｐＨ５．０からｐＨ７．０の範囲に維持する緩衝液を含む。
液体抗ＣＤ４０抗体製剤のｐＨをｐＨ約５．０からｐＨ約７．０の範囲に維持する任意の適切な緩衝液は、抗体の物理化学的安定性および所望する生物学的活性が本明細書で上記に記載したように維持される限り、製剤において使用することができる。適切な緩衝液には、限定はしないが、従来の酸およびその塩が含まれ、その対イオンは、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたはマグネシウムであってもよい。薬学的な液体製剤を緩衝するために使用することができる従来の酸およびその塩の例には、限定はしないが、コハク酸またはコハク酸塩、ヒスチジンまたはヒスチジン塩酸塩、クエン酸またはクエン酸塩、酢酸または酢酸塩、酒石酸または酒石酸塩、リン酸またはリン酸塩、グルコン酸またはグルコン酸塩、グルタミン酸またはグルタミン酸塩、アスパラギン酸またはアスパラギン酸塩、マレイン酸またはマレイン酸塩およびリンゴ酸またはリンゴ酸塩の緩衝液が含まれる。製剤内の緩衝液の濃度は、約１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭ、８ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、または１ｍＭから５０ｍＭの範囲内のその他のそのような値を含む１ｍＭから５０ｍＭであってもよい。
本発明のいくつかの実施形態では、液体医薬製剤は、抗ＣＤ４０抗体、例えば、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２またはｍＡｂ３抗体の治療有効量および製剤のｐＨをｐＨ約５．０からｐＨ７．０の範囲に維持する濃度のコハク酸緩衝液またはクエン酸緩衝液またはヒスチジン緩衝液またはヒスチジン塩酸塩緩衝液を含む。「コハク酸緩衝液」または「クエン酸緩衝液」によって、コハク酸の塩またはクエン酸の塩それぞれを含む緩衝液が意図される。「ヒスチジン緩衝液」によって、アミノ酸ヒスチジンの塩を含む緩衝液が意図される。
好ましい実施形態では、緩衝液は、ヒスチジン緩衝液、例えば、ヒスチジン塩酸塩である。上記のように、製剤内のヒスチジン緩衝液の濃度は、約１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭ、８ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、または１ｍＭから５０ｍＭの範囲内のその他のそのような値を含む１ｍＭから５０ｍＭであってもよい。
好ましい実施形態では、コハク酸またはクエン酸の対イオンは、ナトリウムカチオンであり、したがって、緩衝液は、それぞれ、コハク酸ナトリウムまたはクエン酸ナトリウムである。しかし、任意のカチオンが、有効であると予想される。その他の可能なコハク酸またはクエン酸カチオンには、限定はしないが、カリウム、アンモニウム、カルシウムおよびマグネシウムが含まれる。上記のように、製剤内のコハク酸緩衝液またはクエン酸緩衝液の濃度は、約１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭ、８ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、または１ｍＭから５０ｍＭの範囲内のその他のそのような値を含む１ｍＭから５０ｍＭであってもよい。
その他の実施形態では、液体医薬製剤は、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体、例えば、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２またはｍＡｂ３抗体を、０．１ｍｇ／ｍｌから３００．０ｍｇ／ｍｌ、または１．０ｍｇ／ｍｌから２００ｍｇ／ｍｌ、５．０ｍｇ／ｍｌから１００．０ｍｇ／ｍｌ、７．５ｍｇ／ｍｌから５０ｍｇ／ｍｌまたは１５．０ｍｇ／ｍｌから２５．０ｍｇ／ｍｌの濃度で含み、ヒスチジンまたはコハク酸塩またはクエン酸塩緩衝液、例えば、コハク酸ナトリウムまたはクエン酸ナトリウム緩衝液またはヒスチジン塩酸塩を１ｍＭから５０ｍＭ、５ｍＭから４０ｍＭ、１０ｍＭから３５ｍＭ、好ましくは約３０ｍＭの濃度で含む。
液体医薬製剤が等張付近であることが望ましい場合、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質、例えば、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２またはｍＡｂ３抗体の治療有効量、および製剤のｐＨをｐＨ約５．０からｐＨ約７．０の範囲内に維持するための緩衝液を含む液体医薬製剤はさらに、製剤を等張付近にするために十分な量の等張化剤を含むことができる。「等張付近」によって、水性製剤が、２４０ｍｍｏｌ／ｋｇから８００ｍｍｏｌ／ｋｇ、好ましくは約２４０から約６００ｍｍｏｌ／ｋｇ、より好ましくは約２４０から約４４０ｍｍｏｌ／ｋｇ、より好ましくは約２５０から約３３０ｍｍｏｌ／ｋｇ、さらにより好ましくは約２６０から約３２０ｍｍｏｌ／ｋｇ、さらにより好ましくは約２７０から約３１０ｍｍｏｌ／ｋｇの浸透圧を有することが意図される。
溶液の等張度を測定する方法は、当業者に公知である。例えば、Setnikar et al． （1959） J． Am． Pharm． Assoc． 48:628を参照のこと。当業者は、医薬組成物に等張性をもたらすのに有用な、薬学的に許容される様々な溶質に精通している。等張化剤は、本発明の液体医薬製剤の浸透圧を体液の浸透圧にほぼ等しい値に調節することができるいかなる試薬であってもよい。生理学的に許容される等張化剤を使用することが望ましい。
したがって、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体、例えば、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２またはｍＡｂ３抗体の治療有効量および製剤のｐＨをｐＨ約５．０からｐＨ約７．０の範囲内に維持するための緩衝液を含む液体医薬製剤はさらに、等張性をもたらすために使用することができる構成要素、例えば、塩化ナトリウム；アラニン、バリンおよびグリシンなどのアミノ酸；限定はしないが、グルコース、デキストロース、フルクトース、スクロース、マルトース、マンニトール、トレハロース、グリセロール、ソルビトールおよびキシリトールを含む糖類および糖アルコール（ポリオール）；酢酸、その他の有機酸またはそれらの塩および比較的少量のクエン酸塩またはリン酸塩を含むことができる。当業者であれば、液体製剤の最適な張度をもたらすために適切なさらなる薬剤を知っている。
いくつかの好ましい実施形態では、抗ＣＤ４０抗体、例えば、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２またはｍＡｂ３抗体の治療有効量および製剤のｐＨをｐＨ約５．０からｐＨ約７．０の範囲内に維持するための緩衝液を含む液体医薬製剤はさらに、等張化剤として塩化ナトリウムを含む。
製剤中の塩化ナトリウムの濃度は、張度に対するその他の構成要素の関与に左右される。いくつかの実施形態では、塩化ナトリウムの濃度は、５０ｍＭから３００ｍＭである。そのような一実施形態では、塩化ナトリウムの濃度は約１５０ｍＭである。その他のそのような実施形態では、塩化ナトリウムの濃度は約１５０ｍＭで、緩衝液は、５ｍＭから１５ｍＭの濃度のコハク酸ナトリウム緩衝液またはクエン酸ナトリウム緩衝液であり、この液体医薬製剤は、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質、例えば、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２またはｍＡｂ３抗体の治療有効量を含み、この製剤のｐＨは、ｐＨ５．０からｐＨ７．０である。
その他の実施形態では、液体医薬製剤は、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質、例えば、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２またはｍＡｂ３抗体、濃度０．１ｍｇ／ｍｌから５０．０ｍｇ／ｍｌまたは５．０ｍｇ／ｍｌから２５．０ｍｇ／ｍｌ、塩化ナトリウムを約１５０ｍＭ、およびコハク酸ナトリウムまたはクエン酸ナトリウムを約１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭまたは５０ｍＭで含み、ｐＨはｐＨ約５．５である。
本発明の液体医薬製剤の処理中の凍結融解または機械的なせん断によるタンパク質の分解は、溶液−空気界面における表面張力を低下させるために、製剤内に界面活性剤を組み込むことによって阻害することができる。したがって、いくつかの実施形態では、液体医薬製剤は、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質、例えば、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２またはｍＡｂ３抗体の治療有効量、製剤のｐＨをｐＨ約５．０からｐＨ約７．０の範囲内に維持するための緩衝液を含み、さらに界面活性剤を含む。その他の実施形態では、液体医薬製剤は、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質、例えば、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２またはｍＡｂ３抗体の治療有効量、製剤のｐＨをｐＨ約５．０からｐＨ約７．０の範囲内に維持するための緩衝液、約５０ｍＭから約３００ｍＭの濃度の塩化ナトリウムなどの等張化剤を含み、さらに界面活性剤を含む。
使用される典型的な界面活性剤は、非イオン性界面活性剤であり、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）およびポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ２０）などのポリオキシエチレンソルビトールエステル；Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８などのポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンエステル；Ｂｒｉｊ ３５などのポリオキシエチレンアルコール；シメチコン；ＰＥＧ４００などのポリエチレングリコール；リゾホスファチジルコリン；およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００などのポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノールが含まれる。
界面活性剤または乳化剤による医薬品の古典的な安定化については、例えば、本明細書に参考として組み込んだLevine et al． （1991） J． Parenteral Sci． Technol． 45 （3）: 160-165に記載されている。本発明の実施で使用される好ましい界面活性剤は、ポリソルベート８０である。界面活性剤が含まれる場合、界面活性剤は、典型的には、０．００１％から１．０％（ｗ／ｖ）の量で添加される。
したがって、いくつかの実施形態では、液体医薬製剤は、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質、例えば、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２またはｍＡｂ３抗体の治療有効量を含み、緩衝液は１ｍＭから５０ｍＭ、３ｍＭから４０ｍＭまたは５ｍＭから３５ｍＭまたは７．５ｍＭから３０ｍＭの濃度のコハク酸ナトリウムまたはクエン酸ナトリウムまたはヒスチジン緩衝液またはヒスチジン塩酸塩緩衝液であり、製剤のｐＨはｐＨ５．０からｐＨ７．０であり、製剤はさらに界面活性剤、例えば、ポリソルベート８０を０．００１％から１．０％または０．００１％から０．５％の量で含む。そのような製剤は所望により、５０ｍＭから３００ｍＭ、５０ｍＭから２００ｍＭまたは５０ｍＭから１５０ｍＭの濃度の塩化ナトリウムなどの等張化剤を含むことができる。
その他の実施形態では、液体医薬製剤は、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質、例えば、約２０．０ｍｇ／ｍｌを含む０．１ｍｇ／ｍｌから２００．０ｍｇ／ｍｌまたは１ｍｇ／ｍｌから１００．０ｍｇ／ｍｌまたは２ｍｇ／ｍｌから５０．０ｍｇ／ｍｌまたは５．０ｍｇ／ｍｌから２５．０ｍｇ／ｍｌの濃度のｍＡｂ１、ｍＡｂ２またはｍＡｂ３抗体；約１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭから２００ｍＭの塩化ナトリウム；約１０ｍＭのコハク酸ナトリウムまたはクエン酸ナトリウムを含む５ｍＭから２０ｍＭのコハク酸ナトリウムまたはクエン酸ナトリウム；約１５０ｍＭを含む５０ｍＭから約２００ｍＭの濃度の塩化ナトリウム；約３０ｍＭのヒスチジンまたはヒスチジン塩化物を含む５ｍＭから５０ｍＭのヒスチジンまたはヒスチジン塩化物、および所望により界面活性剤、例えば、０．００１％から０．５％を含む０．００１％から１．０％の量のポリソルベート８０を含み、この液体医薬製剤のｐＨはｐＨ約５．０からｐＨ約７．０である。
液体医薬製剤は、本質的にいかなる保存剤および本明細書で前述したその他の担体、賦形剤または安定化剤も含まなくてもよい。あるいは、この製剤は、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合断片の物理化学的安定性に悪影響を及ぼさないならば、１種または複数の保存剤、例えば、抗細菌剤、本明細書で前述した薬学的に許容される担体、賦形剤または安定化剤を含んでいてもよい。許容される担体、賦形剤および安定化剤の例には、限定はしないが、さらなる緩衝化剤、共溶媒、界面活性剤、アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤、ＥＤＴＡなどのキレート化剤、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）、およびポリエステルなどの生分解性ポリマーが含まれる。薬学的に許容される担体、安定化剤、および等モル化剤（ｉｓｏｍｏｌｙｔｅ）の製剤化および選択の徹底的な議論は、Remington's Pharmaceutical Sciences （18th ed.; Mack Publishing Company, Eaton, Pennsylvania, 1990）に見出すことができる。
本明細書で記載した液体医薬製剤またはその他の医薬組成物が調製された後、分解を防ぐために凍結乾燥することができる。液体組成物を凍結乾燥するための方法は、当業者には公知である。使用の直前に、組成物は、さらなる成分を含んでいてもよい滅菌希釈剤（例えば、リンガー溶液、蒸留水または滅菌生理食塩水）で再構成することができる。
再構成されたら、組成物は好ましくは、当業者に公知の方法を使用して対象に投与される。
医薬品の製造におけるアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の使用
本発明はまた、医薬品が少なくとも１種のその他の療法による処置と協調している、対象における自己免疫疾患および／または炎症性疾患の処置で使用するための本発明のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質を提供する。
「協調する（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ）」により、医薬品が、少なくとも１種のその他の療法による対象の処置の前、間または後のいずれかに使用されることが意図される。その他の療法の例には、限定はしないが、本明細書で前述した療法、すなわち、外科手術または外科的手順（例えば、脾臓摘出術、リンパ節切除術、甲状腺摘出術、血漿フェレーシス、白血球フェレーシス、細胞、組織もしくは器官の移植、器官の灌流、腸手順など）、放射線療法、ステロイド療法および非ステロイド療法などの療法、ホルモン療法、サイトカイン療法、皮膚科用薬剤（例えば、アレルギー、接触性皮膚炎および乾癬などの皮膚の状態を処置するために使用される局所用薬剤）による治療、免疫抑制療法ならびにその他の抗炎症性モノクローナル抗体療法などが含まれ、さらなる療法またはさらなる療法類による治療は、本明細書で前述したような本発明のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質を含む医薬品による対象の処置の前、間または後に行われる。
そのような一実施形態では、本発明は、医薬品が本明細書で前述した少なくとも１種のその他の療法による治療と協調している、対象における自己免疫疾患および／または炎症性疾患の処置で使用するためにｍＡｂ１、ｍＡｂ２またはｍＡｂ３抗体を提供する。
いくつかの実施形態では、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体、例えば、本明細書で開示したｍＡｂ１、ｍＡｂ２またはｍＡｂ３またはその抗原結合断片を含む医薬品は、２種類のその他の療法による治療と協調する。
アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体を含む医薬品が２種類のその他の療法と協調する場合、この医薬品の使用は、その他の療法のいずれかまたは両方による対象の処置の前、間または後であってもよい。
本発明はまた、医薬品が少なくとも１種のその他の療法で事前に処置された対象において使用される、対象における自己免疫疾患および／または炎症性疾患の処置で使用するためのアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体、例えば、本明細書で開示した抗体ｍＡｂ１、ｍＡｂ２またはｍＡｂ３を提供する。
「事前に処置された（ｐｒｅｔｒｅａｔｅｄ）」または「事前の処置（ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」により、対象が、本発明のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはタンパク質を含む医薬品を受け入れる前に、１種または複数のその他の療法で処置されていることが意図される。
以下の実施例は、限定するためではなく、例示のために提供される。
図１は、Ｃｈｉｒ１２．１２（白丸）、ｍＡｂ１（黒丸）、ｍＡｂ２（黒四角）、ｍＡｂ３（黒三角）またはヒトＣＤ４０Ｌ（白四角）の用量応答を用いて刺激したヒトＰＢＭＣ培養物の７２時間後の３Ｈ−チミジンの取り込みを示す。 図２は、抗ＩｇＭ Ｆ（ａｂ’）２ ５μｇ／ｍｌまたはＣｐＧ２００６ １μＭのいずれかの存在下で同時刺激した、Ｃｈｉｒ１２．１２（白丸）、ｍＡｂ１（黒丸）、ｍＡｂ２（黒四角）、ｍＡｂ３（黒三角）、ヒトＣＤ４０Ｌ（白四角）、アイソタイプ対照（黒菱形）の用量応答を用いて刺激したヒトＰＢＭＣ培養物の７２時間後の３Ｈ−チミジンの取り込みを示す。 図３は、ＩＬ−４ ７５ｎｇ／ｍｌの存在下で同時刺激した、Ｃｈｉｒ１２．１２（白丸）、ｍＡｂ１（黒丸）、ｍＡｂ２（黒四角）、ｍＡｂ３（黒三角）、ヒトＣＤ４０Ｌ（白四角）、アイソタイプ対照（黒菱形）の用量応答を用いて刺激したヒトＰＢＭＣ培養物の７２時間後の３Ｈ−チミジンの取り込みを示す。 図４は、Ｃｈｉｒ１２．１２（白丸）、ｍＡｂ１（黒丸）、ｍＡｂ２（黒四角）、ｍＡｂ３（黒三角）またはヒトＣＤ４０Ｌ（白四角）の用量応答を用いてＣＤ４０Ｌ ２０μｇ／ｍｌで刺激したヒトＰＢＭＣ培養物の７２時間後の３Ｈ−チミジンの取り込みを示す。 図５は、Ｃｈｉｒ１２．１２（黒丸）、ｍＡｂ１（白四角）、ｍＡｂ２（白三角）、ｍＡｂ３（黒三角）それぞれのＢＪＡＢ細胞系に対する抗ヒトＣＤ抗体の用量依存的結合を示す。
材料
１．モノクローナル抗体
Ｃｈｉｒ１２．１２（１．９ｍｇ／ｍｌ）、ｍＡｂ１（０．８８ｍｇ／ｍｌ）、ｍＡｂ２（１．９ｍｇ／ｍｌ）およびｍＡｂ３（１．９ｍｇ／ｍｌ）は、クエン酸塩 ５０ｍＭ、ｐＨ７．０、ＮａＣｌ １４０ｍＭ中に用意した。選択実験のためにＩｇＧアイソタイプ対照も使用した（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＵＳＡ）。
２．Ｂ細胞活性化刺激
ＡｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ウサギ抗ヒトＩｇＭは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｕｆｆｏｌｋ、ＵＫ）から入手し、ＣｐＧ２００６はＭｉｃｒｏｓｙｎｔｈ（Ｂａｌｇａｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から入手した。組換えヒトＣＤ４０Ｌは、当業者に公知の標準的手順を使用して作製した。ヒトＩＬ−４を含有する上清は、当業者に公知の標準的手順を使用して作製した。
３．インビトロ組織培養試薬
ＰＢＭＣ培養培地：ＲＰＭＩ−１６４０、ＦＢＳ １０％、ペニシリン／ストレプトマイシン １％、非必須アミノ酸 １％、ピルビン酸ナトリウム １％、β−メルカプトエタノール ５ｍＭ（いずれもＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＵＳＡ）。
方法
１．ＣＤ４０Ｌ媒介ＰＢＭＣ増殖アッセイ
１．１ ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の精製
初代ＰＢＭＣは、健康なボランティアから得られた全血バフィーコートから精製した（Ｂｌｕｔｓｐｅｎｄｅｚｅｎｔｒｕｍ、Ｂａｓｅｌ）。ＥＤＴＡ ５ｍＭを含有しＣａ２＋およびＭｇ２＋を含まないＰＢＳでバフィーコートを１:４に希釈し、２５ｍｌずつ５０ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブに分注した。希釈したバフィーコートをＦａｌｃｏｎチューブ１本当たりＦｉｃｏｌｌ−Ｐｌａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）１４ｍｌと共に重層し、室温において２２５０ｒｐｍで２０分間遠心した（ブレーキをかけない）。遠心後、中間層を１本の５０ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブに移した。複数のチューブ（１ドナーから）の中間層を一緒にして容量を３０ｍｌにした。ＥＤＴＡ ５ｍＭを補給したＰＢＳを添加し、細胞を室温において２２５０ｒｐｍで５分間回転した。上清を廃棄してから赤血球（ＲＢＣ）溶解緩衝液１５ｍｌを添加し、室温で５分間インキュベートした。その後、ＰＢＳ／ＥＤＴＡ ５ｍＭを２０ｍｌ添加し、細胞を再度回転した（２２５０ｒｐｍでＲＴ／５分）。細胞をＰＢＳ／ＥＤＴＡ ５ｍＭで２回洗浄し（遠心工程を介在させる）、ＰＢＭＣ培地 ３５ｍｌに再懸濁してからトリパンブルー色素排除法を使用して生細胞数を測定した。インビトロ刺激にすぐに使用しない細胞は凍結保存した。
１．２ インビトロＰＢＭＣ刺激アッセイ
Ｃｏｓｔａｒ９６ウェルプレートにおいて、抗−ＩｇＭ Ｆ（ａｂ’）２ ５μｇ／ｍｌ、ＣｐＧ２００６ １μＭ、ヒトＩＬ−４（７５ｎｇ／ｍｌ）を含有する上清または組換えｈｕＣＤ４０Ｌ ４０μｇ／ｍｌ（最終濃度を示した）の一定用量存在下または非存在下で、各抗ＣＤ４０またはアイソタイプ対照ｍＡｂの２倍希釈系列７点を３連で作った。各抗ＣＤ４０ｍＡｂの開始濃度は、実験に応じて２０μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌの範囲であった。ＣＤ４０Ｌは、全実験について陽性対照として用量応答において使用した。抗ＩｇＭ、ＣｐＧ２００６、ＩＬ−４およびＣＤ４０Ｌの用量は、これらの試薬（単独または組み合わせ）がＰＢＭＣまたはＢ細胞増殖を誘導する能力を用量応答において評価した以前の実験（データは示さず）に基づいて選択した。ＰＢＭＣ（最終密度はウェル当たり８×１０４個）をその後各ウェルに添加し、３７℃／ＣＯ２５％で３日間インキュベートした。３Ｈ−チミジン（１μＣｉ／５０μｌ／ウェル）を各ウェルに添加し、最後に６時間培養してから収集し、ＭｉｃｒｏＢｅｔａＴｒｉｌｕｘシンチレーションカウンターを使用してチミジン取り込みを測定した。細胞および培地ならびに細胞および培地および抗ＩｇＭ、ＩＬ−４、ＣｐＧ２００６またはＣＤ４０Ｌ対照培養物（抗ＣＤ４０ｍＡｂの非存在下）は各実験に含めたことに注意されたい。
シンチレーションデータは、ＥｘｃｅｌおよびＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して解析した。結果は、1分当たりの平均計数率（ｃｐｍ）（＋／−平均の標準誤差）対抗ＣＤ４０ｍＡｂ濃度の対数変換として表す。陽性対照ならびに細胞および培地のバックグラウンドレベルは、各グラフについて示す。ＩＣ５０またはＥＣ５０値を算出し、Ｐｒｉｓｍによってデータの曲線フィッティングをうまく行った。
ＰＢＭＣは、上記で示したように、試験する抗ＣＤ４０ｍＡｂの用量応答性の存在下または非存在下で、ＣＤ４０Ｌ ２０μｇ／ｍｌで３日間刺激した。増殖は、培養して７２時間後の３Ｈ−チミジン取り込みによって評価した。結果は、３回の培養の平均およびＳＥＭとして表し、４ドナー（独立した実験）を代表する。抗ＣＤ４０ｍＡｂ媒介阻害のＩＣ５０値は、μｇ／ｍｌで集計する。
２．インビトロＰＢＭＣアゴニストアッセイ
ヒトＰＢＭＣは、同時刺激非存在下で、または抗ＩｇＭ Ｆ（ａｂ’）２ ５μｇ／ｍｌもしくはＣｐＧ２００６ １μＭのいずれかの存在下で、上記の項１．２で示したようにＣｈｉｒ１２．１２、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２またはｍＡｂ３の用量応答を用いて３日間刺激した。増殖は、培養して７２時間後の３Ｈ−チミジン取り込みによって評価した。結果は、３回の培養の平均およびＳＥＭとして表し、４ドナー（独立した実験）を代表している。
３．ＡＤＣＣアッセイ
ＰＢＭＣ懸濁液（１０×１０６細胞／ｍＬ）５０μｌを丸底ウェル（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ−Ｃｏｓｔａｒ ＃３７９０）に添加し、カルセイン染色したラージ細胞（２×１０５細胞／ｍＬ）５０μｌおよび抗体希釈液または対照１００μｌを添加した。最大の溶解は、２％Ｔｒｉｔｏｎ １００中で測定された。
細胞をプレートの底に収集し（２５０ｇで３分）、３７℃において湿潤なＣＯ２雰囲気（５％）中で１時間インキュベートした。細胞を遠心（７５０ｇで３分）によって培地から分離し、測定のために上清１００μｌを透明底の黒いプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ−Ｃｏｓｔａｒ ＃３９０４）に移した。
蛍光は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｇｅｍｉｎｉ分光計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で４８５ｎｍで励起した後５３５ｎｍで測定した。特異的溶解は、以下の式を使用して計算した：
（実験的放出−自然放出）／（最大放出−自然放出）×１００。
４．抗ヒトＣＤ４０抗体変異体のヒトＢＪＡＢ細胞系に対する結合
ヒトＢＪＡＢ細胞への結合における様々な抗ＣＤ４０抗体Ｆｃ変異体の結合を比較するために、フローサイトメトリーを使用した。したがって、９６ウェルＶ底プレートにおいてウェル当たり２×１０５細胞を接種した。プレートはＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、ＦＣＳ ５％、ＥＤＴＡ ２ｍＭ）２００μＬで４℃において１３５０×ｇで２分間で２回洗浄した。上清を廃棄し、ヒト血清８％を含有するＦＡＣＳ緩衝液（ＩｎＶｉｔｒｏｍｅｘ、カタログ番号Ｓ４１９０）１００ｍＬに細胞を再懸濁し、１０分間インキュベートした。２回洗浄した後で、抗ヒトＣＤ４０Ｆｃ変異体を、ヒト血清 １％を含むＦＡＣＳ緩衝液５０μＬに１０μｇ／ｍＬの濃度で開始して１：２の希釈で添加した。細胞は、氷上で３０分間インキュベートし、その後２回洗浄工程を行った。ポリクローナルウサギ抗ヒトＩｇＧ ＦＩＴＣ Ｆ（ａｂ’）２（ＤＡＫＯ、カタログ番号Ｆ０３１５）５０μｌを各ウェルに添加し、氷上で３０分間インキュベートした。インキュベーション終了時に、細胞を２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液１００μＬに再懸濁し、ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩで取得した。
取得後、ＦＩＴＣチャネルの平均蛍光強度をＦｌｏＪｏで取得した。グラフ作成および曲線フィッティングは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５．０で実施した。個々の実験の強度には変化があるため、値は正規化した。したがって、各抗体試験系列の最高値は、１００％に相当した。非線形曲線フィッティングは、パーセント値で実施した。
５．単核球由来の樹状細胞（ＭｏＤＣ）におけるＣＤ４０Ｌ媒介サイトカイン産生アッセイ
５．１ ヒト単核球由来の樹状細胞の調製
ヒトＰＢＭＣは、スイス赤十字によって提供されたヒトバフィーコートから調製した。バフィーコートはＰＢＳで１：５に希釈し（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号２００１２０１９）、５０ｍＬＦａｌｃｏｎチューブに３５ｍＬずつ分注した。その後、Ｆｉｃｏｌｌ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号１７ １４４０−０２）１３ｍＬを各チューブに重層した。細胞をＲＴにおいて１６８０×ｇで２０分間、ブレーキをかけずに遠心した。ＰＢＭＣを含有する層を収集し、大量のＰＢＳで１０００×ｇで５分間、２回洗浄した。最終的に、細胞をＰＢＳ １０ｍＬに再懸濁し、計数した。
ヒト単核球は、ＡｕｔｏＭＡＣＳ機器でＭｉｌｔｅｎｙｉ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、Ｇｅｒｍａｎｙ、カタログ番号１３０−０９１−１５３）製のヒト単核球単離キットＩＩを使用して、製造者の指示に従って、ＰＢＭＣ１００×１０７から逆に単離された。単離後、細胞は４℃において培養培地（ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号６１８７００１０）、ＦＣＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１６００００４４、ＵＳ由来）１０％、ピルビン酸ナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１３６００３９）１ｍＭ、１×ＮＥＡＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１１４００３５）１×ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１５１４０１２２））で１０００×ｇで５分間、２回洗浄した。単離された単核球を計数し、６ウェルプレートに０．４×１０６／ｍＬの密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ２で７日間培養した。単核球を樹状細胞組換え体に分化させるために、培養開始時にヒトＩＬ−４［８０ｎｇ／ｍＬ］およびヒトＧＭ−ＣＳＦ［１００ｎｇ／ｍＬ］（いずれも自家製）を培養培地に添加した。
５．２ サイトカイン放出のための樹状細胞（ＤＣ）の刺激
培養７日後に６ウェルプレートを濯ぐことによって未熟なＤＣを収集し、細胞をプールし、培養培地で１４００×ｇで５分間、２回洗浄した。その後、ｉＤＣ ２×１０５個を９６ウェル平底プレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カタログ番号３５３０７２）中の１００μＬに接種した。陽性対照として、細胞を１μｇ／ｍＬの濃度のＭｅｇａＣＤ４０Ｌ（Ａｌｅｘｉｓ、カタログ番号ＡＬＸ−５２２−１１０−Ｃ０１０）で刺激し、陰性対照は、培地のみに入れたｉＤＣからなった。アンタゴニズムアッセイでは、用量応答のため、抗ヒトＣＤ４０抗体Ｆｃ変異体を１０μｇ／ｍＬで１：２希釈で、ＭｅｇａＣＤ４０Ｌ １μｇ／ｍＬと一緒に添加した。刺激した細胞の上清をＴＮＦα測定のために２４時間後に収集した。アゴニズムアッセイでは、抗ヒトＣＤ４０抗体Ｆｃ変異体を１０μｇ／ｍＬで、１：２希釈のみで添加し、上清をＴＮＦα測定のために４８ｈ後に収集した。細胞を接種し、全アッセイについて３連で刺激した。
５．３ ＥＬＩＳＡによるＴＮＦアルファの測定
上清中のＴＮＦαの量を測定するため、ＥＬＩＳＡを以下のように実施した。抗ＴＮＦα捕捉抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５１２２０）をＥＬＩＳＡプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、Ｎｕｎｃ Ｆ９６ Ｍａｘｉｓｏｒｐ、カタログ番号４４２４０４）に５μｇ／ｍＬでウェル当たり５０μＬで４℃において一晩コーティングした。洗浄工程毎に、プレートはＢｉｏＴｅｋ ＥＬｘ ４０５プレート洗浄器で２５０μＬで３回洗浄した。１回目の洗浄後、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ ＴＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号３７５３５）２００μＬを３７℃で１時間インキュベートした。次に、ＴＮＦα標準物（組換えヒトＴＮＦα、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２１０−ＴＡ）または試料を２５μｌ添加した。標準物は、最終濃度２０ｎｇ／ｍＬで開始し、１：２で連続希釈した。さらに、検出抗体（抗ヒトＴＮＦαビオチン、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５４５１１）２５μＬを１：５００希釈で添加した。プレートを４℃で一晩インキュベートした。洗浄後、アビジン−ＰＯＤコンジュゲート（ＥｘｔｒＡＶアルカリホスファターゼ、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｅ−２６３６）をＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋ ＴＢＳで１:５０００に希釈し、５０μＬで添加し、ＲＴで１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、基質ｐ−ニトロフェニルホスフェート（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｃ−３０４１）５０μＬを添加し、１５分間発色させた。ＥＬＩＳＡプレートをＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５でソフトウェアＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて４５０ｎｍで読み取った。
６．毒性試験
毒性試験の最初の主要な目的は、Ｃｈｉｒ１２．１２と比較して高用量（１００ｍｇ／ｋｇ）ｍＡｂ１の潜在的毒性を調べることであった。
モーリシャス産のカニクイザル３０匹をこの試験に使用した。投与開始時、動物の年齢は約４から５歳で、体重は雄４．５から６．６ｋｇ、雌３．１から４．３ｋｇであった。
ｍＡｂ１（５０ｍｇ／ｍＬ）をカニクイザルの一群（雄５匹／雌５匹；群２）に１００ｍｇ／ｋｇの用量レベルで、２ｍＬ／ｋｇの投与量で、１週１回５週間静脈内投与した（１、８、１５、２２、２９および３６日目に試験物質を適用）。カニクイザルの他の群（雄５匹／雌５匹；群３）には、親抗体Ｃｈｉｒ１２．１２を低速ボーラス注入によって１００ｍｇ／ｋｇの用量レベルおよび５ｍＬ／ｋｇの投与量で静脈内投与した。ｍＡｂ１プラセボは２ｍＬ／ｋｇの投与量で、対照として使用したカニクイザルの別の群（雄５匹／雌５匹；群１）に与えた。動物は全て、最後の投与の１または２日後に剖検した。
両抗ＣＤ４０Ａｂの有効性を評価するために、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）免疫を組み込むことに決定した。２日目に、動物をＡｌｕｍに溶かしたＫＬＨ １ｍｇで免疫し、その後、２３日目にＡｌｕｍに溶かしたＫＬＨ ０．５ｍｇで追加免疫注射を行った。血清を免疫前／追加免疫ならびに免疫および追加免疫後７日目および１４日目それぞれから採取した。ＫＬＨ特異的ＩｇＭ／ＩｇＧ力価は、標準物としてカニクイザル抗ＫＬＨ ＩｇＭ／ＩｇＧ参考血清を使用してＥＬＩＳＡによって測定した。血液は、未処理Ｂ細胞の免疫表現型検査（ＣＤ２０＋ＣＤ２１＋ＣＤ２７−）のために、投与前に３回および１５、２９日目および剖検時（３７／３８日目）に採取した。未処理ＣＤ２０Ｂ細胞の絶対数は、血液試料当たりの全リンパ球数から計算し、未処理ＣＤ２０Ｂ細胞の相対数はフローサイトメトリーによって計算した。
表4:毒性試験の概要
Figure 2014500720
 *直近の個体の体重に基づく
毒性の評価は、死亡率、臨床的所見（投与後の所見、便検査、毛並みの検査および食物摂取を含む臨床徴候）、体重、眼科検査、心血管所見、臨床病理学検査（凝固、外部血小板活性化検査、血液学的検査、臨床化学検査および尿検査を含む）、器官重量、ならびに肉眼的および顕微鏡的剖検所見に基づいた。血液免疫表現型検査は、投与前３回、投与相の１５日目および２９日目ならびに剖検日に実施した。さらに、脾臓組織およびキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）注射部位の流入領域リンパ節の免疫表現型検査は剖検時に実施した。さらに、完全なＡＤＣＣを引き起こすことができるＣｈｉｒ１２．１２の影響をｍＡｂ１と直接比較するために、ＫＬＨに対するＴ細胞依存抗体応答（ＴＤＡＲ）を調べた。毒物動態学評価および有望な抗薬物抗体（ＡＤＡ）評価のために全動物から血液を収集した。
７．ｍＡｂ１のさらなるインビトロプロファイル
７．１ ＰＢＭＣ精製
ヒト末梢血単核細胞は、既に項１．１に記載したように調製した。
７．２ ヒト扁桃腺Ｂ細胞の精製
扁桃被膜および結合組織を取り出し、扁桃物質は扁桃腺を約５ｍｍの大きさの切片に切断した後、金属製のセルストレーナーですりつぶし、Ｂ細胞培地で通常通り洗浄した。次に、細胞残渣を取り除くため、扁桃腺細胞を７０μＭセルストレーナーで２回濾過した。Ｂ細胞は、ＥａｓｙＳｅｐネガティブ選択ヒトＢ細胞濃縮キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ、Ｃａｎａｄａ）を使用して新鮮なＰＢＭＣから単離した。Ｂ細胞は、ＥａｓｙＳｅｐネガティブ選択ヒトＢ細胞濃縮キットを使用して、製造元（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ、Ｃａｎａｄａ）の指示の通りに精製した。
７．３ ヒトおよび非ヒト霊長類ＰＢＭＣまたはＢ細胞を使用したＣＤ４０結合ＥＣ５０値の評価
ＰＢＭＣ（アカゲザル、カニクイザルまたはヒト）または扁桃腺Ｂ細胞（ヒトのみ）を、用量応答における精製した標識ｍＡｂ１またはアイソタイプ対照抗体（最終濃度範囲２．５μｇ／ｍｌ〜０．００１２５μｇ／ｍｌ）と共に４℃で３０分間インキュベートした。その後細胞を洗浄し、続いて抗ヒト（非ヒト霊長類交差反応性）およびＮＨＰとの交差反応性が最小限のビオチン化抗ヒトＩｇＧ抗体とインキュベートした（Ｒ１０、抗ＩｇＭ染色を含めるか、またはＦＡＣＳ染色の強度差のいずれかによって、膜ＩｇＧ発現ヒトＢ細胞を区別することが可能なことに注意）。細胞を再度４℃で３０分間インキュベートしてから洗浄し、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣを用いて４℃で２０分間、最後の染色を行った。その後細胞を洗浄し、フローサイトメトリーによってＣＤ２０＋細胞上のＣＤ４０発現の評価を実施した。
７．４ ヒトおよび非ヒト霊長類ＰＢＭＣまたはＢ細胞のＣＤ１５４誘導性増殖の阻害の評価
９６ウェルプレートにおいて、ヒト組換えＣＤ１５４およびＩＬ−４のＥＣ８０濃度の存在下で、各抗ＣＤ４０またはアイソタイプ対照ｍＡｂの２倍希釈系列７点を３連で作った。各抗ＣＤ４０ｍＡｂの開始濃度は、実験に応じて２０μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌの範囲であった。細胞および培地対照は、全実験について陰性対照として使用した。ＰＢＭＣ（アカゲザル、カニクイザルまたはヒト）または扁桃腺Ｂ細胞（ヒトのみ）をその後各ウェルに添加し、３７℃／ＣＯ２５％で３日間インキュベートした。３Ｈ−チミジン（１μＣｉ／５０μｌ／ウェル）を各ウェルに添加し、最後に６時間培養してから収集し、シンチレーションカウンターを使用してチミジン取り込みを測定した。
８．カニクイザルの腎臓同種異系移植モデルにおけるシクロスポリンＡと併用したｍＡｂ１の有効性
８．１ 動物
使用したカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）は全て、７．５〜９歳の雄（＃５５２９／＃５５３３、＃５５２３／＃５５２４および＃５５３６／＃５５３８）で、捕捉飼育され、７．７±０．９ｋｇで、フィリピン産であった（Ｓｉｃｏｎｂｒｅｃ、Ｍａｋａｔｉ Ｃｉｔｙ、Ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅｓ）。移植時に、動物は正常な血液学的検査、血清／尿化学検査を示し、結核、サルモネラ／シゲラ、ウイルス因子（ヘルペスＢ、サルＴ細胞白血病ウイルス、サル免疫不全ウイルス、サルＤ型レトロウイルス、Ｂ型肝炎）に対する抗体および関連のある内外寄生虫は陰性だった。しかし、動物は全て、サイトメガロウイルスおよびＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）に対する抗体を示した（２０１０に試験した；動物＃５５３６はＨＡＶについて陰性だった）。動物＃５５２３の糞便試験は、２０１０年１２月にバランチジウム・コリ（Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ ｃｏｌｉ）について陽性であった。
手術後の最初の１週間、動物は遠隔測定個室ケージに収容し、他の動物とは視覚的に接触可能にさせた。残りの時間、動物＃５５３６／＃５５３８は一緒に収容して、残りの４頭の動物は全実験中隔離を維持した（性格が合わない動物）。動物は全て維持された温度下で（２０〜２４℃）、湿度は少なくとも４０％で、天然の光周期の下で収容した。全動物に、毎日少なくとも２回果物および野菜の混合物を給餌した。水およびＫｌｉｂａ Ｎａｆａｇ ３４４６ペレット（Ｋａｉｓｅｒａｕｇｓｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）は自由に与えた。
実験は全て、スイスにおける動物福祉規制に従い、ＢＳ１５５５の認可の元で実施された。
表5:動物の特徴
Figure 2014500720
８．２実験条件
８．２．１ 腎臓移植および術後のモニタリング
ドナー／レシピエントの組み合わせは、ＡＢＯ一致、ＤＲＢエキソン２ミスマッチ(Blancher A, Tisseyre P, Dutaur M, et al. (2006) Immunogenetics; 58(4):269-82)および一方向混合リンパ球反応（ＭＬＲ）における応答に従って選択し、ＭＬＲ刺激指標（ＭＬＲ−ＳＩ）は＞７および＜４７であった(Bigaud M, Maurer C, Vedrine, et al. (2004) J. Pharmacol. Toxicol. Methods; 50(2):153-9）。この選択の結果は表６に示し、２重移植（２匹のドナー間の交換移植）が存在した。各レシピエントには、動脈血圧、心拍数および運動活性をモニターするため、遠隔測定プローブ（Ｄａｔａ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ、ＵＳＡ）を埋め込んだ。
手術のために、一般的麻酔は、アトロピン（０．０５ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｍ．）と共にケタミン １０ｍｇ／ｋｇの筋肉注射（ｉ．ｍ．）によって導入し、Ｎ２Ｏ／Ｏ２（５０:５０）で人工呼吸を維持し、プロポフォールを静脈注射（ｉ．ｖ．）した（４〜１０ｍｇ／ｋｇ／ｈ；必要ならいつでも５〜１０ｍｇのボーラスを補給した）。ドナーの腎臓を取り出し、冷（４℃）ウィスコンシン大学液で洗浄し（低温保存時間≦４時間）、移植片腎静脈とレシピエントの大静脈との間および移植片腎動脈とレシピエント遠位大動脈との間に端側吻合を生成するため標準的微小血管技術を使用して（吻合時間≦４０分）異所性移植した。移植片から尿が出現したら、尿管膀胱瘻造設術を実施した。元の腎臓は摘出した。術後の鎮痛は、ブプレノルフィン０．０１〜０．０２ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｍ．、１日３回）;抗生物質（セファタキシム、２５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｍ．、１日２回またはセフトリアキソン、５０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｍ．リドカイン１％溶液、１日４回）によって行った。鎮痛剤および抗生物質は、５日間与えた。血小板数が著しく増加または減少したらいつでも、アスピリンを５ｍｇ／ｋｇの用量で毎日ｉ．ｍ．で投与した（Ａｓｐｅｇｉｃ、Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ、Ｍｅｙｒｉｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。
レシピエントの臨床的および心血管状態の変化、体重、食物および水の摂取（最大１００〜１５０ｍｌ／ｋｇ／日を補給）、尿量、血液学的検査（Ｂｅｃｋｍａｎｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＡＣＴ５Ｄｉｆｆを使用）、血清および尿化学検査（毎日のＳＣｒｅａ／Ｓｕｒｅａ／ＳＡｍｙｌａｓｅ測定にはＶｅｔｓｃａｎ分析器を使用し、血清および尿試料の最終的な確認にはＢｅｃｋｍａｎｎ Ｓｙｎｃｈｒｏｎ ＣＸ５分析器を使用）をモニターした。血清クレアチニン（ＳＣｒｅａ）および尿素（Ｓｕｒｅａ）レベルは移植片機能のマーカーとして使用した。経皮的超音波ガイド下生検は、３０日目に一般的麻酔下で以前に記載されたように(Gaschen L, Kunkler A, Menninger K, et al. (2001) Vet. Radiol. Ultrasound; 42(3):259-64)１６Ｇ針で実施した（動物＃５５２９および＃５５３３のみ）。さらに、血液凝固能および血小板凝集の特別なモニタリングはまた、移植前後に動物＃５５２９／＃５５３３および＃５５２３／＃５５２４で実施した。
レシピエントは、（ｉ）超音波スコアの増加が伴っても伴わなくても重篤な移植不全（例えば、ＳＣｒｅａ＞５００μｍｏｌ／ｌまたはＳｕｒｅａ＞２０mｍｏｌ／ｌ）の場合、あるいは（ｉｉ）全般的な健康問題および／または苦痛の明白な臨床徴候がある場合、最終的に安楽死させた。剖検では、その他の主要な器官全てと一緒に腎臓同種異系移植を収集し（尿管および吻合部を含む）、その後の組織学的解析のために処理した。
表6:ドナー/レシピエントの組み合わせおよび使用した処置計画についての一般的情報
Figure 2014500720
８．２．２ ｍＡｂ１およびシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）処置
ｍＡｂ１は、注入の日に−８０℃から新たに解凍して液体形態で用意した。−１、０および１日目（移植前および移植後）の最初の３回の投与以外は、週に１回３０ｍｇ／ｋｇ／ｉ．ｖ．の適用を行った。経口投与（ｐ．ｏ．）用のＣｓＡは、マイクロエマルジョンプレコンセントレート（ｍｉｃｒｏｅｍｕｌｓｉｏｎ ｐｒｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）（Ｓａｎｄｉｍｍｕｎ Ｎｅｏｒａｌ（登録商標）飲用液、１００ｍｇ／ｍｌ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａ ＡＧ）であった。ＣｓＡは、２０ｍｇ／ｋｇ／ｐ．ｏ．の１日用量で（−１日目に開始）、ｍＡｂ１と組み合わせて適用した（表６参照）。
８．２．３ ｍＡｂ１薬物動態（ＰＫ）、免疫原性（霊長類抗ヒト抗体）および薬物動力学（ＰＤ）のモニタリング
ｍＡｂ１曝露を測定するために、−１、３、７（ベースラインおよび１５分）、１４、２８、４２、５６、７０、８４および１００日目の血液試料（血清５００μｌ）を採取した（ｉ．ｖ．投与前）。ＣｓＡ測定のために、血液試料をＣｓＡの経口投与前（Ｃ０／Ｃ２４）および適用の２時間後（Ｃ２）に採取した。Ｃ２は、ＣｓＡ吸収のピークレベルに対応する。さらに処理するまで（ＣｓＡ検出キット、Ｈｏｔ Ｓｔａｒ Ｔａｑ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、Ｑｉａｇｅｎ Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ、ＵＳ）、材料は全て−８０℃で保存した。ｍＡｂ１免疫原性のための試料は、−１、７、１４、２８、４２、５６、７０、８４および１００日目に採取し（血清５０μｌ）、−８０℃で凍結を維持した。簡単に説明すると、９６ウェルマイクロタイタープレートを組換えヒトＣＤ４０でコーティングした。これらを名目上４℃で一晩保存した。ブロッキング後、較正標準物質（Ｃｓ）、品質管理（ＱＣ）試料およびｍＡｂ１を含有する試料標本をプレートに添加した。プレートを名目上＋２５℃で撹拌しながら１２０分間インキュベートした。プレートを洗浄後、マウス抗ヒトカッパ軽鎖抗体、続いてＨＲＰヤギ抗マウス（Ｈ＋Ｌ）コンジュゲートをプレートに添加し、組換えＣＤ４０に結合したいかなるｍＡｂ１も検出した。これは、色素原基質（ＴＭＢ）を添加することによって視覚化され、生じた色（吸収）の強度は存在するｍＡｂ１の濃度に正比例した。次に、試料中のｍＡｂ１の濃度を較正曲線から逆算した。ＰＤ試料は、ベースラインとして移植の２〜３日前に得た（ヘパリン中０．５ｍｌ）。その後、収集物はＰＫ試料と同じ計画に従った。ＣＤ２０＋およびＣＤ３＋細胞は、使用したＴｒｕＣｏｕｎｔチューブ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カタログ番号３４０３３４）によって、製造者の指示に従って、抗ヒトＣＤ４０−ＡＰＣ ｍＡｂ（クローン５Ｃ３、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カタログ番号５５５５９１）、抗ヒトＣＤ３−ＰｅｒＣＰ（クローンＳＰ３４−２、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カタログ番号５５２８５１）および抗ヒトＣＤ２０−ＦＩＴＣ ｍＡｂ（クローンＬＴ２０、Ｉｍｍｕｎｏｔｏｏｌｓ、カタログ番号 ２１２７９２０３Ｘ２）を用いて計数した。データは、ＬＳＲＩＩフローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって、ＤＩＶＡ（バージョン６．１．１）ソフトウェアを使用して取得した。リンパ球およびビーズは、サイズおよび粒度に従ってＦＳＣ／ＳＳＣドットブロットでゲーティングして、ＣＤ２０およびＣＤ３の発現についてさらに分析した。
８．２．４ 組織学的検査
採取した組織（移植片生検または剖検時）は全て、肉眼によって調べ、４％緩衝化ホルマリンで固定した。脱水後、パラフィンワックスに包埋した。厚さ３μｍの切片をパラフィンブロックから切断し、ヘマトキシリンおよびエオジン（ＨＥ）で染色した。腎臓の切片ではさらに３種類の染色（過ヨウ素酸シッフ染色、トリクローム染色およびＶｅｒｈｏｅｆｆ染色）を実施した。生検および剖検試料は、経験のある病理学者が調べ、Ｂａｎｆｆ ０７の同種異系移植腎病理の診断基準に従って記録した（Solez K, Colvin RB, Racusen LC, et al (2008) Am. J. Transplant; 8(4):753-60）。ピアレビューはまた、外部の専門家が実施した。
さらに、補体タンパク質Ｃ４ｄの免疫組織化学検査は、パラフィン切片の染色に適した多価抗Ｃ４ｄ抗体を使用して実施した(Regele H, Exner M, Watschinger B, et al. 2001, Nephrol. Dial. Transplant; 16: 2058-2066)。Ｃ４ｂは、急性体液性拒絶（ＡＨＲ）の安定した信頼性のあるマーカーと考えられる。固定し、パラフィンワックスに包埋した後、厚さ３μｍの切片を有するガラススライド（ＳｕｐｅｒＦｒｏｓｔＰｌｕｓ、登録商標、Ｍｅｎｚｅｌ−Ｇｌａｅｓｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用意し、スライドへの接着を最適にするために、３７℃でオーブンで一晩乾燥させた。ヒト拒絶腎臓切片を陽性対照として追加した。使用前に、スライドをキシレンで脱パラフィンし（１０分）、エタノールで段階的に再水和し、蒸留水に入れた。抗原の取り出しは、以前に記載されたように（Segerer S, Mack M, Regele H, Kerjaschki D, Schloendorff D. Kidney Int. 1999; 56: 52-64）クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で１バールで１０分間加圧処理することによって実施した。免疫染色のため、以下の手順を使用した：（ｉ）Ｈ２Ｏ２ ０．５％無水メタノール溶液で室温で２０分間、内在性ペルオキシダーゼを不活性化し、（ｉｉ）０．０１Ｍ ＰＢＳ、ｐＨ７．４でスライドを洗浄し（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、（ｉｉｉ）スライドをＰＢＳに溶かした無脂肪粉乳「Ｒａｐｉｌａｉｔ」４％（Ｍｉｇｒｏｓ Ｇｅｎｏｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｓｂｕｎｄ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で室温で６０分間インキュベートし、はたいて、洗浄はせず、（ｉｖ）ＮＧｔＳ １％を含有するＰＢＳに溶かしたｐＡｂウサギ抗ヒトＣ４ｄ（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ Ｍｅｄｉｚｉｎｐｒｏｄｕｋｔｅ、Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ）１：４０で１枚のスライドを＋４℃で一晩インキュベートした。第２のスライドは、1次抗体の代わりにウサギアイソタイプ対照を適用することによって陰性対照として用い（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ、ＵＳＡ）、（ｖ）０．０１Ｍ ＰＢＳ、ｐＨ７．４でスライドを洗浄し、（ｖｉ）全スライドをＮＧｔＳ １％を含有するＰＢＳで１：２００に溶かしたビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．ＵＳＡ）で室温で３０分間インキュベートし、（ｖｉｉ）０．０１Ｍ ＰＢＳ、ｐＨ７．４でスライドを洗浄し、（ｖｉｉｉ）ＰＢＳに溶かしたストレプトアビジン／ＨＲＰ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．ＵＳＡ）で室温で３０分間インキュベートし、（ｉｘ）ＡＥＣ＋（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｐｅｎｔｅｒｉａ、ＵＳＡ）で８〜１０分間ＨＲＰ活性を発色させ、顕微鏡によって染色強度を制御し、蒸留水で洗浄し、（ｘ）Ｄａｋｏ（登録商標）自動ヘマトキシリン（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｐｅｎｔｅｒｉａ、ＵＳＡ）で２分間対比染色し、水道水を５分間流して青色にして、（ｘｉ）水性封入剤（Ｍｅｄｉｔｅ Ｍｅｄｉｚｉｎｔｅｃｈｎｉｋ ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で封入した。
実施例１：ｍＡｂ１、ｍＡｂ２およびｍＡｂ３のアゴニスト活性の評価
実験データは、単離した未分画の初代ヒトＰＢＭＣの使用に基づく。全ＰＢＭＣ調製物（単離されたＢ細胞または単核球の代わり）は、抗ＣＤ４０ｍＡｂが様々な種類の白血球に対して複数の直接的および間接的影響を有し得るインビボの状況に極めて似ている。このＰＢＭＣ増殖アッセイを使用して、親Ｃｈｉｒ１２．１２抗体から変化していない抗原結合部分のアミノ酸配列を保持している未グリコシル化抗ＣＤ４０ｍＡｂであるｍＡｂ１（Ｎ２９７Ａ）およびｍＡｂ２（Ｄ２６５Ａ）は、親Ｃｈｉｒ１２．１２ｍＡｂの非アゴニスト性ＣＤ４０Ｌブロッキング特性を保持していることが測定された。抗体ｍＡｂ３（ＬＡＬＡ突然変異体）は、ＩＬ−４の存在下で弱アゴニスト性であった。
特に、実験結果は、どのＦｃサイレント抗ＣＤ４０ｍＡｂもヒトＰＢＭＣ（ｎ＝４ドナー）による細胞分裂を刺激することはできないことを示しており、親Ｃｈｉｒ１２．１２ｍＡｂで認められた結果と類似した結果である（図１参照）。ＰＢＭＣは、ＣＤ４０Ｌに応じて増殖した。ｍＡｂ１もｍＡｂ２もＰＢＭＣのＣｐＧ２００６または抗ＩｇＭ Ｆ（ａｂ’）２誘導性増殖を増強することはできなかった（図２）。さらに、Ｃｈｉｒ１２．１２はＰＢＭＣの抗ＩｇＭ Ｆ（ａｂ’）２誘導性増殖を増強することはできなかったが、ｍＡｂ１およびｍＡｂ２とは異なり、ＣｐＧ誘導性ＰＢＭＣ増殖を完全に阻害した。
ＩＬ−４の存在下では、ｍＡｂ３（ＬＡＬＡ突然変異）は、ＩＬ−４単独によって誘導されるチミジン取り込みレベルを上回る、低いが再現性のよいチミジン取り込みレベルを誘導することが認められた（ｎ＝４ドナー）が、一方、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２およびＣｈｉｒ１２．１２では認められなかった（図３）。総合的に、これらの結果は、ｍＡｂ３（ＩＬ−４の存在下）を除いてどの抗ＣＤ４０ｍＡｂもアゴニスト活性を有さないことを示唆した。
上記の結果はまた、ｍＡｂ１およびｍＡｂ２が共刺激シグナルの存在下ではアゴニスト活性を有さないことを明らかに示した。慢性自己免疫疾患の患者の白血球は活性化された、または部分的に活性化された表現型を有する可能性があり、したがって、ＣＤ４０またはその他の刺激物を介したシグナル伝達に敏感な可能性があるようなので、このことは重要な発見である。Ｃｈｉｒ１２．１２はＣｐＧ２００６誘導性ＰＢＭＣ増殖を完全に阻害する（が、ＦｃサイレントｍＡｂまたはＣＤ４０Ｌは阻害しない）ことが示された。ＣｐＧ２００６はＴｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）の合成リガントで、この受容体は病原体および宿主由来のｓｓＤＮＡに結合することが示された。ヒトにおいて、ＴＬＲ９は末梢血中のＢ細胞および（より少ない程度で）単核球によって発現する。ＣｐＧ含有ＯＤＮは以前にＡＤＣＣを増強することが示されたので（Moga, et al. 2008）、ＣｐＧ２００６は、親Ｃｈｉｒ１２．１２ｍＡｂの生殖系列ＩｇＧ１ Ｆｃ部分によって媒介されるＡＤＣＣを増強することができると推測することができる。
実施例２：Ｆｃサイレント抗ＣＤ４０ｍＡｂがＣＤ４０Ｌ媒介ＰＢＭＣ増殖を遮断する能力の評価
以前のデータは、Ｃｈｉｒ１２．１２が初代ヒトＢ細胞およびヒトＢ細胞リンパ腫細胞系のＣＤ４０Ｌ媒介増殖を遮断できることを示した。Ｃｈｉｒ１２．１２および本発明による３種類の抗体、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２、ｍＡｂ３によるＣＤ４０Ｌ媒介ＰＢＭＣ増殖の阻害を測定した。以下の表７は、ｍｇ／ｍｌで表に示したそのような阻害のＩＣ５０値を表している（結果は、３連の培養の平均およびＳＥＭとして示され、４ドナーの独立した実験の代表である）。結果によって、Ｃｈｉｒ１２．１２はまた、ＣＤ４０Ｌ媒介ＰＢＭＣ増殖を阻害できることが示される。さらに、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２およびｍＡｂ３はまた、Ｃｈｉｒ１２．１２と類似の能力でＣＤ４０Ｌ媒介ＰＢＭＣ分裂を完全に遮断した。抗ＣＤ４０ｍＡｂのいずれも、抗ＩｇＭ＋ＩＬ−２誘導性ＰＢＭＣ増殖を遮断せず（データは示さず）、抗ＣＤ４０ｍＡｂのブロッキング活性は、標的依存であること（およびＦｃ機能に関係がないこと）が示唆された。
表7:PBMCのCD40L媒介増殖の抗CD40mAbによる阻害のIC50値(μg/ml)
Figure 2014500720
実施例３：抗ヒトＣＤ４０抗体変異体のヒトＢＪＡＢ細胞系に対する結合
ＣＤ４０への特異的結合の変化の可能性を排除するために、３種類の変異体、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２およびｍＡｂ３の、構成的にＣＤ４０を発現するＢ細胞系ＢＪＡＢへの結合を、親Ｃｈｉｒ１２．１２と比較して試験した。結合は、１０μｇ／ｍＬで開始し１：２希釈によって用量漸増法で試験した。
異なる実験の曲線を比較するために、個々の用量漸増法それぞれの最高の蛍光強度中央値を１００％結合に設定して、非線形曲線フィッティングを適用した。２つの別々の実験において、４種類の抗体変異体、Ｃｈｉｒ１２．１２、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２およびｍＡｂ３全てがＢＪＡＢ細胞に対して同等の結合曲線を示した（図５）。Ｃｈｉｒ１２．１２のＦｃ結合領域の様々な突然変異では、変異体の結合能力に変化を認めることはできなかった。
したがって、上記の結果は、Ｆｃ結合部位の突然変異は親Ｃｈｉｒ１２．１２の可変領域のＣＤ４０結合部位に影響を及ぼさないことを示した。ｍＡｂ１、ｍＡｂ２およびｍＡｂ３は、ＢＪＡＢ細胞上のＣＤ４０に同等の結合を保持していた。
実施例４：抗ＣＤ４０ Ｆｃ変異体によるヒト単核球由来の樹状細胞からのＴＮＦアルファ放出の刺激／阻害
抗ＣＤ４０ Ｆｃ変異体によるヒトＭｏＤＣからのＴＮＦアルファ放出の刺激
いくつかの抗ヒトＣＤ４０抗体は、様々な細胞集団に対してアゴニスト効果を有することが示されている（Gruber 1989）。Ｆｃ変異体、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２、ｍＡｂ３およびＣｈｉｒ１２．１２がＭｏＤＣの活性化を引き起こすのを排除するため、細胞と４８時間インキュベートしたとき、抗体がそれら自体ＴＮＦα放出を誘導するかどうかを調べた。アンタゴニストのアッセイとは対照的に、７日齢のヒトＭｏＤＣを４種類の抗ＣＤ４０変異体全ての存在下のみで４８時間培養し、用量反応曲線を１０μｇ／ｍＬから開始した。その後、上清のＴＮＦαの量をＥＬＩＳＡによって試験した。抗ＣＤ４０変異体 ｍＡｂ１、ｍＡｂ２、ｍＡｂ３およびＣｈｉｒ１２．１２は全て、陽性対照であるＣＤ４０Ｌ刺激と比較してＭｏＤＣからのＴＮＦαの放出を誘導しなかった（データは示さず）。４種類の抗体変異体いずれによっても用量依存性を認めることはできなかった。ＴＮＦαの量は、未刺激ＭｏＤＣのレベルを超えて有意には上昇しなかった（データは示さず）。したがって、これら４種類の抗体のアゴニスト活性は排除することができた。
抗ＣＤ４０ Ｆｃ変異体によるヒトＭｏＤＣからのＴＮＦアルファ放出の阻害
親Ｃｈｉｒ１２．１２抗体は、ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌの相互作用を遮断するので、細胞活性化も遮断するはずである。ヒト単核球由来樹状細胞上のＣＤ４０のＣＤ４０Ｌトリマーによる刺激は、例えばＴＮＦαのような炎症誘発サイトカインの放出を導く（Ma 2009）。また、Ｆｃ領域の変化は、Ｃｈｉｒ１２．１２と比較して、変異体のブロッキング機能に影響は及ぼさないはずである。４種類の抗体は全て、ヒトＭｏＤＣからのＣＤ４０Ｌ媒介ＴＮＦαの放出を同等のＩＣ５０で阻害するはずである。
したがって、７日齢ヒトＭｏＤＣを、４種類のブロッキング抗ＣＤ４０変異体全ての存在下で、ＭｅｇａＣＤ４０Ｌ、２重３量体（ｄｏｕｂｌｅ ｔｒｉｍｅｒｉｃ）組換えコンストラクトで２４時間刺激した。その後、上清のＴＮＦαの量をＥＬＩＳＡによって試験した。Ｆｃ突然変異による変異体ｍＡｂ１、ｍＡｂ２およびｍＡｂ３は全て、３つの異なる実験においてＣｈｉｒ１２．１２と同じ用量応答阻害を示した（データは示さず）。予備段階の結果はまた、ヒトＭｏＤＣからのＩＬ−２３放出の類似の阻害を示している（データは示さず）。
４種類の抗体全てのＩＣ５０を推定するために非線形曲線フィッティングを適用し、実験から平均ＩＣ５０を計算した。ヒトＭｏＤＣからのＴＮＦα放出についての４種類の変異体の平均ＩＣ５０は、３２ｎｇ／ｍＬと４０ｎｇ／ｍＬの間の範囲である（表８）。要約すると、Ｆｃ領域の突然変異は、抗体変異体のアンタゴニスト効果に影響を及ぼさなかった。
表8:TNFアルファの阻害についての様々なFc変異体のIC50
Figure 2014500720
 3つの独立した実験の様々な抗ヒトCD40 Fc変異体のng/mLで表したIC50。Chir12.12の#1では、非線形曲線フィッティングによって、IC50の有効な推定を行うことは不可能であった(n.c.=計算せず)。
したがって、上記の結果によって、４種類の変異体は全てＭｏＤＣからのＴＮＦα放出の誘導には不活性であることが示された。より重要なことに、変異体ｍＡｂ１、ｍＡｂ２およびｍＡｂ３は全て、Ｃｈｉｒ１２．１２と比較してインビトロにおいて類似の有効性でヒトＭｏＤＣによるＣＤ４０Ｌ媒介サイトカイン産生を阻害した。
実施例５：データの概要
以下の表９は、親Ｃｈｉｒ１２．１２抗体と比較して本発明の抗体ｍＡｂ１、ｍＡｂ２およびｍＡｂ３の重要な特性のいくつかをまとめて示す。
表9:比較データ
Figure 2014500720
実施例６：本発明の実施に有用なアミノ酸およびヌクレオチド配列の簡単な説明
Figure 2014500720
Figure 2014500720
実施例７：本発明の実施に有用なアミノ酸およびヌクレオチド配列
Figure 2014500720
Figure 2014500720
Figure 2014500720
Figure 2014500720
Figure 2014500720
Figure 2014500720
実施例８：毒性試験の結果
毒性試験の第１の目的は、カニクイザルに週１回５週間静脈内投与した後、ｍＡｂ１の毒性を測定することであった（６つの試験項目を適用）。この抗体（Ｃｈｉｒ１２．１２）の非サイレント（ＡＤＣＣ）型も、ＡＤＣＣ活性型抗体の効果をＡＤＣＣ−サイレント型（ｍＡｂ１）と比較するために使用した。
さらに、両抗ＣＤ４０Ａｂの有効性を評価するために、動物をＫＬＨで免疫した。
ｍＡｂ１またはＣｈｉｒ１２．１２による処置に起因する死亡率または体重の変化、臨床徴候および推定食物消費の変化はなかった。ＫＬＨ注射部位の局所的な反応は、全群で同程度であった。
また、眼科および心血管の検査において試験項目に関連した所見はなかった。
血液学的検査では、好塩基球の割合および絶対数にわずかではあるが統計学的に有意な減少がｍＡｂ１およびＣｈｉｒ１２．１２で処置した動物において認められ、試験項目−処置の関連は排除することができなかった。尿検査によって、ｍＡｂ１で処置した雌の１／５およびＣｈｉｒ１２．１２で処置した雌の２／５の尿において、投与との関連が不確かなケトンが明らかになった。臨床化学検査では、Ｃｈｉｒ１２．１２で処置した雄ならびにＣｈｉｒ１２．１２で処置した雌１頭にリパーゼ濃度のわずかな増加傾向が認められたが、これは限定的に毒性が関連していると見なされた。
血液凝固は、プロトロンビン時間、活性化部分プロトロンビン時間およびフィブリノーゲンによって評価すると、ｍＡｂ１またはＣｈｉｒ１２．１２による処置によって影響を受けなかった。血小板数は、正常範囲内で現れた。血漿中のＰセレクチンまたはｓＣＤ４０Ｌ濃度は、血小板の活性化を示さなかった。
Ｃｈｉｒ１２．１２で処置した動物では、血液の免疫表現型検査によって、ＣＤ２０＋Ｂ細胞の顕著な減少が示され、これはこの抗体の予測された薬理学的作用であった。特に、ＣＤ２０ｌｏｗＣＤ２１＋Ｂ細胞（ＣＤ４０ｈｉｇｈであると考えられる）は、Ｃｈｉｒ１２．１２によって除去された。しかし、ＣＤ２０ｈｉｇｈＣＤ２１−Ｂ細胞も特に試験終了時に向かって実質的に減少した。優先的に、ＣＤ２０＋ＣＤ２１＋ＣＤ２７−未処理Ｂ細胞は、ＡＤＣＣ活性抗体Ｃｈｉｒ１２．１２によって除去され、一方、ＣＤ２０＋ＣＤ２１＋ＣＤ２７＋記憶Ｂ細胞はほとんど影響を受けなかった。Ｃｈｉｒ１２．１２で処置した動物では、ＣＤ１６＋ＮＫ細胞の絶対数も約５０％減少した。予測通り、ｍＡｂ１（ＡＤＣＣサイレントである）による処置の後、ＣＤ２０＋Ｂ細胞の顕著な減少は認められず、ＣＤ１６＋ＮＫ細胞の絶対数のいかなる減少も認められなかった。投与中、中程度の減少を示した唯一のＢ細胞は、ＣＤ２０ｈｉｇｈＣＤ２１−Ｂ細胞であった。これらの細胞は、マカクサル特異的で、胚中心由来であることが知られており、したがって、この所見は、ヒトへの移行に関係があるとは見なされない。
剖検時の脾臓およびＫＬＨ流入領域リンパ節の免疫表現型検査によって類似の臨床像が明らかになった。Ｃｈｉｒ１２．１２で処置した動物では、ＣＤ２０＋Ｂ細胞の相対数の減少があったが、ｍＡｂ１で処置した動物ではＣＤ２０＋Ｂ細胞の関連のある減少は認められず、ＣＤ２１−Ｂ細胞の軽度から中程度の減少が伴った（リンパ節では両性別で、脾臓では雄のみ）。ＫＬＨ注射部位から流入する左右リンパ節の免疫表現型検査の結果には差はなかった。
Ｔ細胞依存性抗体反応（ＴＤＡＲ）によって、対照群と比較して、ＫＬＨに対するＩｇＧおよびＩｇＭ応答は、ｍＡｂ１またはＣｈｉｒ１２．１２で処置した動物では認められないことが示された。ＣＤ４０−ＣＤ４０リガンド相互作用の阻害によるＢ細胞活性化の遮断はｍＡｂ１の意図した薬理学的作用であり、Ｃｈｉｒ１２．１２はＢ細胞の除去を意図するので、この所見は、毒物学的に関連があるとは見なされない。
毒物動態学的評価によって、トラフ濃度は試験経過中に増加することが明らかになり、ｍＡｂ１およびＣｈｉｒ１２．１２の蓄積が示唆された。４回目および５回目の投与後の平均トラフ濃度は類似しており、ｍＡｂ１およびＣｈｉｒ１２．１２では、５回目の投与後は定常状態に近い状態であることを示している。４回目および５回目の投与後の投与間隔の平均曝露（両性別）（ＡＵＣＴ）はそれぞれ、ｍＡｂ１では９０６および９９０ｈ．ｍｇ／Lで、Ｃｈｉｒ１２．１２では７５７および７５１ｈ．ｍｇ／ｍLであった。ＡＵＣＴ値はまた、５回目の投与後の定常状態に近い状態を示していた。
肉眼的検査では、標的器官毒性のいかなる証拠も示されず、器官の重量はまた、この種の正常範囲内であった。
顕微鏡的には、両抗体の試験項目関連の所見は、全リンパ性器官［脾臓およびリンパ節（腸間膜、下顎、腋窩および鼠径部）］で認められ、ｍＡｂ１およびＣｈｉｒ１２．１２は皮質のＢ細胞領域における胚中心の発達の完全な抑制を引き起こした。脾臓ならびにＫＬＨ流入領域および反対側リンパ節組織のＣＤ２０免疫染色によって、脾臓のリンパ濾胞の大きさの減少ならびに脾臓およびリンパ節のＢ細胞除去が示され、この効果は、ｍＡｂ１による処置と比較して、Ｃｈｉｒ１２．１２で処置した動物ではるかに顕著であった。ｍＡｂ１で処置した動物の胚中心の所見は、免疫表現型検査時に認められたＣＤ２１−Ｂ細胞の減少に対応した。ＣＤ４０免疫染色によって、ｍＡｂ１またはＣｈｉｒ１２．１２のいずれかによる処置後のリンパ節および脾臓におけるＣＤ４０の染色の著しい減少が示された。
結論として、この研究の結果に基づいて、雌雄のカニクイザルにｍＡｂ１またはＣｈｉｒ１２．１２を１００ｍｇ／ｋｇの濃度で週に１回５週間静脈内投与すると（６回投与）、耐容性が良好であった。免疫表現型検査によって、Ｂ細胞の除去はＣｈｉｒ１２．１２で処置した動物では示されたが、ＣＤ２１−Ｂ細胞を除いてｍＡｂ１で処置した動物では示されず、しかしながら、ＴＤＡＲでは、ｍＡｂ１およびＣｈｉｒ１２．１２で処置した動物の両方においてＫＬＨ免疫後にＩｇＧおよびＩｇＭ反応がないことが示された。組織病理学検査によって、ｍＡｂ１およびＣｈｉｒ１２．１２で処置した動物では脾臓およびリンパ節には胚中心が欠如していることが明らかになった。Ｂ細胞に対する効果は望ましい薬理学的作用であり、したがって、有害とは見なされない。無有害作用量（ＮＯＡＥＬ）は、この研究の条件下では、ｍＡｂ１およびＣｈｉｒ１２．１２の両方について１００ｍｇ／ｋｇの用量であると考えられる。
実施例９：ｍＡｂ１のさらなるインビトロプロファイル
ｍＡｂ１の結合および機能的交差反応性をヒト、アカゲザルおよびカニクイザル白血球の間で測定した。表１０は、３種全てにおけるｍＡｂ１の結合ＥＣ５０を直接比較して示している。
表10:mAb1のヒトおよびNHP交差反応性
Figure 2014500720
ｍＡｂ１は、３種全てのＣＤ２０＋細胞（Ｂ細胞）に同程度のＥＣ５０で結合する。さらに、ｍＡｂ１はヒト扁桃腺Ｂ細胞のならびにカニクイザルおよびアカゲザルのＰＢＭＣのＣＤ１５４＋ＩＬ−４誘導性増殖を阻害することができた。総合すると、これらの結果は、ｍＡｂ１がＣＤ４０に結合し、ヒトＢ細胞または非ヒト霊長類ＰＢＭＣのＣＤ１５４誘導性増殖を阻害する能力は非常に類似していることを示唆した。インビトロにおける受容体占有（ＲＯ）データの利用および機能阻害によって、これら２つの変数の間の関係をそれぞれの種について測定することが可能になった（表１１）。
表11:mAb1 ROと機能阻害との間の関係
Figure 2014500720
 aアカゲザルのPBMCおよびヒト扁桃腺B細胞における可溶性CD154+IL4誘導性増殖
bアカゲザルおよびヒトにおけるインビボKDは、カニクイザルにおけるPK/PD試験で算出されたものと同じであると仮定する。
cmAb1が[標的]よりも十分に高いと仮定すると、ヒル-ラングミュアの式が適用可能である。
この結果は、ヒトＢ細胞と比較してアカゲザルＰＢＭＣでは、ＰＢＭＣ増殖を５０％阻害するのにｍＡｂ１によって必要とされるＲＯは約２倍少ないことを示している。ヒトでは、完全な阻害は、約７５％（インビボにおいて予想）のＲＯで得ることができた。
実施例１０：移植試験
移植片の生着
腎臓同種異系移植中にｍＡｂ１（３０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）および経口的シクロスポリンＡ、２０ｍｇ／ｋｇで併用処置することによって、試験に関与した動物６頭の生着の著しい延長が引き起こされた。移植片は、動物＃５５２９において＞９１日＊、＃５５３３において３１日、＃５５２３において＞９２日＊、＃５５２４において＞９２日＊、＃５５３６において＞９８日＊および＃５５３８において＞９８日＊（平均：＞８３．６日）機能した（＊プロトコル終了時）。未処理動物（または治療ＩＳ以下の用量で処置された動物）における生着は、７〜１０日の範囲であった（病歴データ）。
動物＃５５３３は、移植後３１日目に、急性腎不全および無尿のため安楽死させた。この病変は、高血圧の期間が継続し、生検を採取するために麻酔した後で出現した。
移植後のモニタリング
（ａ）クレアチニン（ＳＣｒｅａ）および尿素（Ｓｕｒｅａ）血清濃度
ＳＣｒｅａは、腎臓機能を評価するために使用した主なパラメータであった。６頭の動物全てにおいて、ＳＣｒｅａレベルは、移植１日後にベースラインレベルを上回って増加した（８１．８±１４．６から２２１．５±３７．１μｍｏｌ／ｌ）。ＳＣｒｅａのそのような上昇は、移植後第１週の間の通常の特徴である（表１２）。
表12:mAb1 30mg/kgおよびCsA 20mg/kgによる併用療法で処置したNHP腎臓同種異系移植レシピエントにおいて認められたSCreaの変化
Figure 2014500720
第１週の間、ＳＵｒｅａ濃度は、０日目に測定したベースライン（４．５±１．３ｍｍｏｌ／ｌ）を上回って急激な上昇を示した（表１３）。動物＃５５２９／＃５５３３および＃５５３６／＃５５３８では、ＳＵｒｅａレベルは１６〜２０ｍｍｏｌ／ｌ（３〜５日目）で、一方、動物＃５５２３および＃５５２４ではそれぞれ９または８ｍｍｏｌ／ｌ（７日目）であった。
表13:mAb1 30mg/kgおよびCsA 20mg/kgによる併用療法で処置したNHP腎臓同種異系移植レシピエントにおいて認められたSUreaの変化
Figure 2014500720
移植１週間後、腎臓機能は正常化する傾向にあり、ＳＣｒｅａ／Ｓｕｒｅａはベースラインレベルに近づくようになる。しかし、動物＃５５３３、＃５５２３および＃５５２４は、移植後７日と１９〜２５日との間にＳＣｒｅａ／Ｓｕｒｅａのさらなる増加を示し（しかし、＃５５２９、＃５５３６および＃５５３８は示さなかった）、腎臓の機能不全を示唆した。この期間中、多飲症／多尿（＃５５２３および＃５５２４）のような徴候、高血清カルシウム（ＳＣａ）の維持（＃５５３３）または移植片容量の増加（＃５５２３および＃５５２４）を認めることができた。
２０〜２５日後、動物＃５５２９、＃５５２３、＃５５２４、＃５５３６および＃５５３８は、試験が終了するまで改善し、すぐれた腎臓機能を示した。しかし、３１日目に、動物＃５５３３はＳＣｒｅａ／ＳＵｒｅａレベルの顕著な増加を示し、急性腎不全が確認された（ＳＣｒｅａ；６２９μｍｏｌ／ｌおよびＳＵｒｅａ；１８ mｍｏｌ／ｌ）。この病変は、高血圧の期間が継続し、麻酔１日前の生検手順後に出現した。この期間中、高血圧ピーク（収縮期約１７０ｍｍｇＨｇ）および低血圧エピソード（収縮期約４０ｍｍｇＨｇ）が記録された。
（ｂ）血清アミラーゼ、リパーゼ濃度、体重および血小板数
血清アミラーゼ濃度は、全動物で移植後１〜７日目に約１．３倍に少し増加した（移植後０日目 ３１１±５３Ｕ／Ｌおよび８日目 ４１８±６６．８Ｕ／Ｌ）（表１４）。動物＃５５３３は、移植後１日目の試験で観察された最高のアミラーゼ濃度を示した（１０５０Ｕ／Ｌ）。移植前では、１回目のｍＡｂ１投与前および２４時間後（−１日目および０日目）に観察されたアミラーゼレベルの間には差はなかった。
表14:mAb1 30mg/kg i.v.およびCsA 20mg/kg p.o.を併用して処置した腎臓移植動物における血清アミラーゼ濃度(U/L)
Figure 2014500720
リパーゼ血清濃度は、平均して、移植前後にわずかな変化を示した（表１５）。実験プロトコルの終了時のみ、わずかな増加が認められた（８４日目；２．１８倍）。動物＃５５３３は、１日目に測定された最高のリパーゼ濃度を示した（２８４．４Ｕ／Ｌ）。動物＃５５３６および＃５５３８のリパーゼデータは使用できなかった。アミラーゼおよびリパーゼ濃度の変化は、異なる抗体または低分子量化合物を使用したその他の移植実験で見出されたレベルと類似していた（データは示さず）。
表15:mAb1 30mg/kg i.v.およびCsA 20mg/kg p.o.の濃度で処置した腎臓移植動物4頭における血清リパーゼ濃度(U/L)
Figure 2014500720
迅速で著しい体重の減少は、主に動物＃５５２９、＃５５３３および＃５５３６で認めることができた。移植された動物６頭全てにおいて、移植後の最初の２１日の間、体重は−４から−１８％の範囲であった。しかし、体重減少は、その時点以降および試験終了に向かって回復傾向にあった。
血小板数は、移植後の期間中に正常（３００〜４００細胞×１０３／μｌ）であるかまたは増加した６００〜８００細胞×１０３／μｌ。動物＃５５２９は、血小板数が急速に増加したため、３日間（７〜９日目）アスピリン処置を受けた。動物＃５５３３は長期間血小板増加症（＞１０００細胞×１０３／μｌ）を示し、７〜２６日の間、アスピリン処置を受けた。
（ｃ）ｍＡｂ１血液レベルおよびＢ細胞数
参考のＰＫ／ＰＤ試験および分析は以前に実施され、カニクイザルは抗体１０ｍｇ／ｋｇの静脈内単回投与を受けた（データは示さず）。この試験において、濃度対時間プロファイルは、明らかな標的介在性の動態（ＴＭＤ）を示し、１動物は、おそらくより高い標的発現レベルの結果として、別の動物と比較してより迅速な排泄を示し、ＰＫの管理における標的発現レベルの役割が強調された。この試験から、ｍＡｂ１血清濃度が約５マイクロｇ／ｍＬを上回ったとき、これはＣＤ４０受容体占有率がほぼ１００％であると解釈することも確認された。
移植試験の設計（毎週高レベルのｍＡｂ１、３０ｍｇ／ｋｇを投与および回復／休薬期間なし）では、以前実施されたＰＫ／ＰＤ試験と同じ分析レベルおよびモデリングは可能ではなかった。それにも関わらず、以下の所見が認められた（表１６にまとめて示した）；ｉ）ｍＡｂ１は１回目の投与前に採取した試料では検出されなかった、ｉｉ）ｍＡｂ１は投与期間全体を通じて検出された、およびｉｉｉ）採取された試料全てにおいて、個体間のトラフ濃度は変動した（カニクイザル５５２４では１２００〜２５００マイクロｇ／ｍＬ、カニクイザル５５２３では１０００〜２０００マイクロｇ／ｍＬおよびカニクイザル５５２９では８５０〜２４００マイクロｇ／ｍＬ）。曝露値は全て、カニクイザルにおける完全な受容体占有率を得るために必要な濃度を十分上回っていた（１７０〜５００倍）。
表16:カニクイザル#5533、#5529、#5523および#5524のmAb1血清濃度
Figure 2014500720
免疫原性試験（サル抗ｍＡｂ１抗体）もこの試験において評価した。試料結果は全て陰性であったが、この試料ではｍＡｂ１レベルが高く、薬剤の干渉のため検出が妨害された可能性があった。
ＣＤ２０＋細胞の部分的な除去が、処置した動物全てにおいて時間と共に認められた。類似の所見が、以前実施されたＰＫ／ＰＤ試験で認められた（データは示さず）。
組織学的検査結果
腎臓同種異系移植の組織病理学的評価によって、移植片＃５５２３、＃５５２４、＃５５２９および＃５５３８における急性および慢性拒絶はなく、実験終了に到達した移植片＃５５３６における境界変化が明らかになった、すなわち、（結果は表１７にまとめて示した）。動物＃５５２３、＃５５２４および＃５５３８における最小限の血管周囲または間質浸潤ならびに動物＃５５２９における最小限の腎糸球体細胞過形成が認められた。
表17:組織学的検査の結果
Figure 2014500720
移植後３１日目に安楽死させた動物＃５５３３は、尿細管拡張、間質浸潤および線維症を示したが、尿細管炎は最小限のみであった。さらに、尿管近傍の顕著な好酸球浸潤および吻合部に近接した膿瘍が見出された。これらの所見は全て、腎機能の長期に亘る不良を示すが、拒絶を確認することはできなかった。
Ｃ４ｄ免疫染色は全例において陰性であった。
濾包性萎縮を有する、または有さない胚中心の発達欠如が全動物のリンパ器官において認められた。バランチジウム・コリ感染に起因する盲腸炎が動物＃５５２９および＃５５３３で診断された。
その他の処置に関連した変化には直面しなかった。
移植試験−考察
移植試験の目的は、腎臓同種異系移植片拒絶の非ヒト霊長類モデルにおいて、治療量以下のシクロスポリンＡとの併用療法として投与した場合のｍＡｂ１の有益な効果を評価することであった。さらに、全身炎症が誘導されたモデルにおいて副作用がないことを評価することに関連した。
治療量以下のＣｓＡ（２０ｍｇ／ｋｇ ｐ．ｏ．）との併用療法として適用したとき、ｍＡｂ１はＮＨＰにおける腎臓同種異系移植の生着期間延長において有効性を示した。平均移植片生着期間は＞８３．６日であり、６頭中５頭の動物が実験プロトコルの終了まで到達した（９１〜９８日と確認された）。
非アゴニスト性ブロッキング抗ＣＤ４０抗体（ｍＡｂ１）を使用したＣＤ４０の標的化によって、腎臓または膵島移植ＮＨＰにおける移植片生着期間の延長がもたらされた。さらに、ｍＡｂ１（Ｆｃサイレントである）を使用することによって、以前に報告されたＣｈｉｒ１２．１２（Ｂ細胞除去および共刺激ブロッキング特性を備えたＩｇＧ１／カッパアイソタイプの完全なヒトモノクローナル抗ＣＤ４０抗体）と比較してより良好な有効性および安全性を評価することができた。
移植後の全期間中、いかなる関連性のある臨床上の病変イベント（例えば、移植後の一般的な腎機能障害に起因するアミラーゼ／リパーゼレベルのわずかな増加）もなかった。しかし、動物＃５３３３、＃５５２３および＃５５２４は７〜１９日の間に腎機能の低下を表した。この期間は通常、移植後の動物のＳＣｒｅａ／Ｓｕｒｅａレベル、血圧および移植片容量の回復によって特徴付けられる。これらの動物では、ＳＣｒｅａ／ＳＵｒｅａの増加（３動物全て）、移植片容量の一時的な増加（＃５５２３、＃５５２４）または多飲症／多尿（＃５５２３、＃５５２４）などの腎機能障害の徴候が見られた。１つの仮説は、これらの動物は早期に拒絶過程を発症し、ｍＡｂ１処置の３週間後に制御されるようになったことである。移植後早期におけるこの異常は、ＣＤ４０経路を標的とする分子（Ｆｃサイレント）の作用の免疫様式によって誘導される差によるものであり得る。
１頭の動物（＃５５３３）は、急性腎不全（拒絶なし）のため３１日目に安楽死させた。この結果は、移植手順後の腎機能の不完全な回復によって引き起こされた。腎機能不良を示す徴候は、高レベルのＳＵｒｅａ（１１〜１９ｍｍｏｌ／ｌ）または高いＳＣａ濃度の維持（＞２．８ｍｍｏｌ／ｌ）であった。最終的な移植片喪失は、高血圧の継続（収縮期＞１４０ｍｍＨｇ）に相俟って生検採取手順中に適用された麻酔中に低血圧が認められたこと、および安楽死前夜に高血圧ピーク（収縮期約１７０ｍｍＨｇ）が記録されたことによって加速した（Palmer BF (2002) N. Engl. J. Med; 347(16):1256-1261)。このようなイベントは全て、ｍＡｂ１処置に起因するのではなく、移植後における個体差にのみ起因する。
併用療法の高い有効性はまた、組織学的に示すことができた。６つの移植片のうち５つが、実験終了時にすぐれた移植片の質を示した。Ｃｈｉｒ１２．１２による移植実験においても、胚中心発達の欠如は認められた。その他の処置に関連した組織変化には認められなかった。
長期間生着の１頭（＃５５２９）がバランチジウム・コリによる盲腸炎を発症した。しかし、この感染はマカクでは一般的で、無症状のことが多く、免疫抑制が急性疾患の発病を引き起こす可能性がある(Schuster FL, Ramirez-Avila L, (2008) Clin. Microbiol. Rev; 21(4): 626-38)。この動物では、下痢または体重減少などの臨床徴候は認められなかった。
Ｂ細胞数モニタリングに関して、部分的な除去が処置した動物全てにおいて時間と共に認めることができた。ｍＡｂ１がサイレントされた抗体であり、ＦｃＲに結合せず、インビトロＡＤＣＣも媒介しないので、この部分的な除去はおそらく活性Ｆｃ受容体が媒介する除去によるものではない。部分的な除去は、胚中心の欠如を反映することができ、実験終了時の組織学的検査において認められる。この部分的な除去は、生着シグナルの欠如によるものである可能性がある。
結論として、移植試験の結果によって、すぐれた安全性特性を備えた併用療法における腎臓拒絶の処置の妥当な標的としてｍＡｂ１（また拡大すれば、本発明のその他の抗体およびタンパク質）を使用することが支持される。すぐれた安全性特性および有効性によってさらに、自己免疫障害および／または炎症性障害の処置ならびにＣＤ４０抗原を発現する細胞上のＣＤ４０Ｌ媒介ＣＤ４０シグナル伝達によって媒介される移植拒絶の予防において本発明の抗体を使用することが支持される。
概要
抗ＣＤ４０抗体が、患者における止血イベントを誘導することは報告されたことはないが、抗ＣＤ４０Ａｂ Ｃｈｉｒ１２．１２を投与されたＢ細胞リンパ腫患者における膵臓酵素の上昇は報告されており、膵炎の危険性があり得るので、安全性のため慢性自己免疫疾患および移植においてＦｃコンピテント抗ＣＤ４０抗体を使用することは避けられている。したがって、インビトロおよびインビボの両方において抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）を媒介することができないＦｃサイレントＩｇＧ１抗ＣＤ４０抗体（ｍＡｂ１、ｍＡｂ２およびｍＡｂ３）を作製した。ｍＡｂ１は、治療量以下のシクロスポリンと併用して、非ヒト霊長類の腎臓同種異系移植生着期間を延長することができた。さらに、ｍＡｂ１はＴ細胞依存性抗原による免疫に対する１次および２次抗体応答を完全に抑制することができた。移植または免疫試験のいずれにおいても、止血イベントまたは膵臓の組織学的異常の証拠はなかったことは重大である。総合的に、これらの結果は、ｍＡｂ１が安全で治療上有効であり、Ｂリンパ球および抗原提示細胞由来の自己免疫疾患を罹患している患者またはＣＤ４０−ＣＤ１５４相互作用が病理の一因として寄与している同種異系移植を受けている患者の処置に使用することができることを示唆している。

Claims (18)

  1. 標的ＣＤ４０ポリペプチド（配列番号２８）に対する抗体の抗原結合部分を含む単離された抗体またはタンパク質であって、
    ａ．１０ｎＭ以下のＫＤでＣＤ４０ポリペプチドに結合し、
    ｂ．サイレントＩｇＧ Ｆｃ領域を含む
    ことを特徴とする抗体またはタンパク質。
  2. ＣＤ４０Ｌ誘導性シグナル伝達を５０ｎｇ／ｍｌ以下のＩＣ５０で阻害する、請求項１に記載の単離された抗体またはタンパク質。
  3. ＣＤ４０シグナル伝達に関してアゴニスト活性を有さないか、またはアゴニスト活性が低い、請求項１または２のいずれか一項に記載の単離された抗体またはタンパク質。
  4. 配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９のアミノ酸配列からなる群から選択されるサイレントＩｇＧ Ｆｃ領域を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の単離された抗体またはタンパク質。
  5. 配列番号９の重鎖（ＶＨ）および配列番号１０の軽鎖（ＶＬ）それぞれと少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００パーセントの配列同一性を有するＶＨおよびＶＬ可変領域を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の単離された抗体またはタンパク質。
  6. ａ．配列番号１１の重鎖アミノ酸配列および配列番号１２の軽鎖アミノ酸配列を含むｍＡｂ１抗体、
    ｂ．配列番号１３の重鎖アミノ酸配列および配列番号１４の軽鎖アミノ酸配列を含むｍＡｂ２抗体、ならびに
    ｃ．配列番号１５の重鎖アミノ酸配列および配列番号１６の軽鎖アミノ酸配列を含むｍＡｂ３抗体
    からなる群から選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載の単離された抗体またはタンパク質。
  7. 医薬品として使用するための、請求項１から６のいずれか一項に記載の単離された抗体またはタンパク質。
  8. 自己免疫障害および／または炎症性障害の処置に使用するための、請求項１から７のいずれか一項に記載の単離された抗体またはタンパク質。
  9. 移植における移植片拒絶の危険性の防止または軽減において使用するための、請求項１から８のいずれか一項に記載の単離された抗体またはタンパク質。
  10. 多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、関節リウマチ、移植拒絶および移植片対宿主病の処置において使用するための、請求項７に記載の単離された抗体またはタンパク質。
  11. 少なくとも薬学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体と組み合わせた、請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体またはタンパク質を含む医薬組成物。
  12. その他の活性成分をさらに含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
  13. 少なくとも緩衝液と共に請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体またはタンパク質を含む液体医薬製剤。
  14. 請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体またはタンパク質をコードする単離された核酸。
  15. 請求項１４に記載の１種または複数の核酸を含むクローニングまたは発現ベクター。
  16. 適切なプロモーター配列に作動可能に連結した、以下のコーディング配列（ａ）〜（ｃ）：
    （ａ）配列番号２２および配列番号２３、
    （ｂ）配列番号２４および配列番号２５、または
    （ｃ）配列番号２６および配列番号２７
    の少なくとも１つを含む、請求項１５に記載のクローニングまたは発現ベクター。
  17. 請求項１５から１６に記載の１種または複数のクローニングまたは発現ベクターを含む宿主細胞。
  18. 請求項１７の宿主細胞を培養することと、前記抗体またはタンパク質を精製し回収することとを含む、請求項１から６のいずれか一項の抗体またはタンパク質の生産方法。
JP2013538229A 2010-11-15 2011-11-14 抗ＣＤ４０抗体のサイレントＦｃ変異体 Active JP5782132B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US41356710P 2010-11-15 2010-11-15
US61/413,567 2010-11-15
PCT/EP2011/070058 WO2012065950A1 (en) 2010-11-15 2011-11-14 Silent fc variants of anti-cd40 antibodies

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2014500720A true JP2014500720A (ja) 2014-01-16
JP5782132B2 JP5782132B2 (ja) 2015-09-24

Family

ID=44925566

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2013538229A Active JP5782132B2 (ja) 2010-11-15 2011-11-14 抗ＣＤ４０抗体のサイレントＦｃ変異体

Country Status (38)

Country Link
US (8) US8828396B2 (ja)
EP (4) EP4023676A1 (ja)
JP (1) JP5782132B2 (ja)
KR (1) KR101632775B1 (ja)
CN (2) CN105949314B (ja)
AR (2) AR083847A1 (ja)
AU (1) AU2011331288B2 (ja)
BR (1) BR112013011644B1 (ja)
CA (1) CA2815921C (ja)
CL (1) CL2013001124A1 (ja)
CO (1) CO6801629A2 (ja)
CR (1) CR20130222A (ja)
CU (1) CU24057B1 (ja)
CY (1) CY1119097T1 (ja)
DK (2) DK3502138T3 (ja)
EA (1) EA026133B1 (ja)
ES (2) ES2911460T3 (ja)
GT (1) GT201300128A (ja)
HR (2) HRP20220413T1 (ja)
HU (2) HUE058015T2 (ja)
IL (1) IL225719A (ja)
JO (1) JO3266B1 (ja)
LT (2) LT2640749T (ja)
MA (1) MA34654B1 (ja)
MX (1) MX336633B (ja)
MY (1) MY159316A (ja)
NZ (1) NZ609549A (ja)
PE (1) PE20140979A1 (ja)
PL (2) PL2640749T3 (ja)
PT (2) PT3502138T (ja)
RS (2) RS56153B1 (ja)
SG (1) SG189928A1 (ja)
SI (2) SI3502138T1 (ja)
TW (2) TWI608016B (ja)
UA (1) UA112417C2 (ja)
UY (2) UY33728A (ja)
WO (1) WO2012065950A1 (ja)
ZA (1) ZA201302532B (ja)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016202179A (ja) * 2015-04-17 2016-12-08 エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft 細胞分析装置用の圧伝達液体、細胞分析装置、および液体細胞試料を分析するための方法
JP2020519634A (ja) * 2018-04-13 2020-07-02 ノバルティス アーゲー 移植片拒絶の予防に使用するための抗ｃｄ４０抗体
JP2020521788A (ja) * 2017-06-02 2020-07-27 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 免疫アゴニストの投与経路
JP2021501748A (ja) * 2017-11-03 2021-01-21 ノバルティス アーゲー シェーグレン症候群の治療に使用するための抗ｃｄ４０抗体
JP2021506953A (ja) * 2019-01-11 2021-02-22 ノバルティス アーゲー 化膿性汗腺炎の治療に使用するための抗ｃｄ４０抗体

Families Citing this family (85)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3153526B1 (en) 2008-01-31 2020-09-23 INSERM - Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Antibodies against human cd39 and use thereof for inhibiting t regulatory cells activity
AR083847A1 (es) 2010-11-15 2013-03-27 Novartis Ag Variantes de fc (fragmento constante) silenciosas de los anticuerpos anti-cd40
EP2676677B1 (en) * 2011-02-17 2019-05-22 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Highly concentrated anti-cd40 antibody pharmaceutical preparation
DK2683406T3 (da) 2011-03-11 2019-07-08 Beth Israel Deaconess Medical Ct Inc Anti-cd40-antistoffer og anvendelser deraf
ES2664619T3 (es) 2011-04-21 2018-04-20 Bristol-Myers Squibb Company Polipéptidos de anticuerpos que antagonizan CD40
AU2012249454B2 (en) 2011-04-29 2016-03-24 Apexigen, Inc. Anti-CD40 antibodies and methods of use
TWI585102B (zh) 2011-10-13 2017-06-01 必治妥美雅史谷比公司 拮抗ｃｄ４０ｌ之抗體多肽
US20140004131A1 (en) 2012-05-04 2014-01-02 Novartis Ag Antibody formulation
EP2914627B1 (en) 2012-10-30 2021-04-07 Apexigen, Inc. Anti-cd40 antibodies and methods of use
CA2903772A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Novartis Ag Antibody drug conjugates
WO2015134988A1 (en) 2014-03-07 2015-09-11 Bristol-Myers Squibb Company Method of using antibody polypeptides that antagonize cd40 to treat ibd
US10786578B2 (en) 2014-08-05 2020-09-29 Novartis Ag CKIT antibody drug conjugates
US10238748B2 (en) 2014-08-12 2019-03-26 Novartis Ag Anti-CDH6 antibody drug conjugates
MX2017004691A (es) 2014-10-10 2017-10-02 Innate Pharma Bloqueo de cd73.
CN107249318A (zh) 2014-12-10 2017-10-13 明尼苏达大学董事会 用于治疗疾病的遗传修饰的细胞、组织和器官
GB201501613D0 (en) * 2015-01-30 2015-03-18 Ucb Biopharma Sprl Treatment of autoimmune disorders with CD154 antibodies
BR112017025693A2 (pt) 2015-05-29 2018-08-14 Abbvie Inc. anticorpos anti-cd40 e seus usos
JP6976931B2 (ja) 2015-09-04 2021-12-08 プリマトープ・セラピューティクス・インコーポレイテッド ヒト化抗ｃｄ４０抗体及びその使用
EP3328881B1 (en) 2015-09-08 2019-08-28 Theripion, Inc. Apoa-1 fusion polypeptides and related compositions and methods
US9862760B2 (en) 2015-09-16 2018-01-09 Novartis Ag Polyomavirus neutralizing antibodies
CN108368510B (zh) * 2015-09-30 2023-09-01 詹森生物科技公司 特异性结合人cd40的激动性抗体和使用方法
US11130817B2 (en) 2015-10-12 2021-09-28 Innate Pharma CD73 blocking agents
WO2017118965A1 (en) 2016-02-10 2017-07-13 Novartis Ag Use of inhibitors of the activity or function of pi3k for the treatment of primary sjögren's syndrome
EP3426688A1 (en) 2016-03-08 2019-01-16 Innate Pharma Siglec neutralizing antibodies
WO2017157948A1 (en) 2016-03-14 2017-09-21 Innate Pharma Anti-cd39 antibodies
CN109475602B (zh) 2016-06-20 2023-05-16 科马布有限公司 抗pd-l1和il-2细胞因子
WO2018065552A1 (en) 2016-10-06 2018-04-12 Innate Pharma Anti-cd39 antibodies
WO2018083080A2 (en) 2016-11-04 2018-05-11 Innate Pharma Nkp46 ligand
JP2020508436A (ja) 2016-12-07 2020-03-19 プロジェニティ， インコーポレイテッド 胃腸管の検出方法、装置およびシステム
CA3046548A1 (en) 2017-01-24 2018-08-02 Innate Pharma Nkp46 binding agents
EP3577138A1 (en) 2017-02-06 2019-12-11 Innate Pharma Immunomodulatory antibody drug conjugates binding to a human mica polypeptide
KR102584011B1 (ko) 2017-03-16 2023-09-27 이나뜨 파르마 에스.에이. 암 치료를 위한 조성물 및 방법
WO2018182562A1 (en) * 2017-03-26 2018-10-04 Stafford Vivi Robyn Method of treatment of skin conditions of eye lids
EP4108183A1 (en) 2017-03-30 2022-12-28 Biora Therapeutics, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immune modulatory agent released using an ingestible device
WO2018185618A1 (en) 2017-04-03 2018-10-11 Novartis Ag Anti-cdh6 antibody drug conjugates and anti-gitr antibody combinations and methods of treatment
CN110637035A (zh) * 2017-05-25 2019-12-31 百时美施贵宝公司 经修饰的IgG1 Fc结构域与抗-CD40域抗体的融合
KR102713355B1 (ko) 2017-05-25 2024-10-02 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 길항작용 cd40 모노클로날 항체 및 그의 용도
CA3066571A1 (en) 2017-07-10 2019-01-17 Innate Pharma Combination therapy using antibody to human siglec-9 and antibody to human nkg2a for treating cancer
US11623954B2 (en) 2017-07-10 2023-04-11 Innate Pharma Siglec-9-neutralizing antibodies
WO2019057792A1 (en) * 2017-09-19 2019-03-28 Mab Discovery Gmbh CD40 ANTIBODY AGONISTS
CN111417651B (zh) 2017-12-01 2023-09-29 诺华股份有限公司 多瘤病毒中和抗体
IT201800004853A1 (it) 2018-04-24 2019-10-24 Metodi per trattare il cancro
JP7490574B2 (ja) 2018-05-31 2024-05-27 ノバルティス アーゲー Ｂ型肝炎抗体
AU2019287765A1 (en) 2018-06-15 2021-01-07 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Increasing immune activity through modulation of postcellular signaling factors
AU2019289646A1 (en) 2018-06-18 2020-11-26 Innate Pharma Compositions and methods for treating cancer
WO2019246312A1 (en) 2018-06-20 2019-12-26 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immunomodulator
US20230009902A1 (en) 2018-06-20 2023-01-12 Progenity, Inc. Treatment of a disease or condition in a tissue orginating from the endoderm
WO2020053742A2 (en) 2018-09-10 2020-03-19 Novartis Ag Anti-hla-hbv peptide antibodies
WO2020106750A1 (en) 2018-11-19 2020-05-28 Progenity, Inc. Methods and devices for treating a disease with biotherapeutics
AR117091A1 (es) 2018-11-19 2021-07-07 Bristol Myers Squibb Co Anticuerpos monoclonales antagonistas contra cd40 y sus usos
TW202039554A (zh) 2018-12-19 2020-11-01 瑞士商諾華公司 抗ＴＮＦ－α抗體
AU2019414793A1 (en) 2018-12-26 2021-06-24 Innate Pharma Compounds and methods for treatment of head and neck cancer
CA3136698A1 (en) 2019-04-23 2020-10-29 Innate Pharma Cd73 blocking antibodies
MA55805A (fr) 2019-05-03 2022-03-09 Flagship Pioneering Innovations V Inc Métodes de modulation de l'activité immunitaire
MX2021013631A (es) 2019-05-08 2022-04-12 Novartis Ag Anticuerpos anti-cd40 para el uso en el tratamiento de t1dm e insulitis.
US11434291B2 (en) 2019-05-14 2022-09-06 Provention Bio, Inc. Methods and compositions for preventing type 1 diabetes
BR112021024938A2 (pt) 2019-06-12 2022-01-25 Novartis Ag Anticorpos de receptor 1 de peptídeo natriurético e métodos de uso
CA3145453A1 (en) * 2019-07-01 2021-01-07 Tonix Pharma Limited Anti-cd154 antibodies and uses thereof
AU2019465294A1 (en) * 2019-09-11 2022-03-24 Novartis Ag A method for preventing human virus associated disorders in patients
EP4031566A1 (en) 2019-09-18 2022-07-27 Novartis AG Nkg2d fusion proteins and uses thereof
WO2021119482A1 (en) 2019-12-13 2021-06-17 Progenity, Inc. Ingestible device for delivery of therapeutic agent to the gastrointestinal tract
WO2021127217A1 (en) 2019-12-17 2021-06-24 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Combination anti-cancer therapies with inducers of iron-dependent cellular disassembly
CN115397394A (zh) * 2020-01-31 2022-11-25 赛诺菲 抗体的肺部递送
AR121461A1 (es) 2020-02-27 2022-06-08 Novartis Ag Métodos para la fabricación de células que expresan el receptor de antígeno quimérico
WO2021252917A2 (en) 2020-06-11 2021-12-16 Provention Bio, Inc. Methods and compositions for preventing type 1 diabetes
US20230355804A1 (en) 2020-06-29 2023-11-09 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Viruses engineered to promote thanotransmission and their use in treating cancer
JP2023537115A (ja) 2020-08-13 2023-08-30 イナート・ファルマ・ソシエテ・アノニム 抗ｃｄ７３抗体を使用する癌処置方法
KR20230048112A (ko) * 2020-08-21 2023-04-10 우시 바이올로직스 (상하이) 컴퍼니 리미티드 Cd40 효능성 항체 및 이의 사용 방법
IL300489A (en) 2020-08-21 2023-04-01 Novartis Ag Compositions and methods for in vivo production of CAR expressing cells
JP2023547499A (ja) 2020-11-06 2023-11-10 ノバルティス アーゲー 抗体Ｆｃ変異体
US20240052042A1 (en) 2020-12-14 2024-02-15 Novartis Ag Reversal binding agents for anti-natriuretic peptide receptor i (npri) antibodies and uses thereof
AU2022246895A1 (en) 2021-03-31 2023-10-19 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Thanotransmission polypeptides and their use in treating cancer
BR112023026111A2 (pt) * 2021-06-28 2024-03-05 Jiangsu Hengrui Pharmaceuticals Co Ltd Anticorpo anti-cd40, fragmento de ligação ao antígeno e uso médico do mesmo
EP4363059A1 (en) 2021-06-29 2024-05-08 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Immune cells engineered to promote thanotransmission and uses thereof
CN117858901A (zh) 2021-08-20 2024-04-09 诺华股份有限公司 制备表达嵌合抗原受体的细胞的方法
EP4393937A1 (en) 2021-08-26 2024-07-03 Duality Biologics (Suzhou) Co., Ltd. Steroid compound and conjugate thereof
EP4402174A1 (en) 2021-09-17 2024-07-24 Novartis AG Methods for prevention of graft rejection in xenotransplantation
EP4406971A1 (en) 2021-09-24 2024-07-31 Chia Tai Tianqing Pharmaceutical Group Co., Ltd. Anti-cd40 antibody and use thereof
CN118139886A (zh) 2021-10-01 2024-06-04 Mab发现股份有限公司 作为免疫刺激剂的激动性cd40抗体
TW202405009A (zh) 2022-03-30 2024-02-01 瑞士商諾華公司 使用抗利尿鈉肽受體１（ｎｐｒ１）抗體治療障礙之方法
TW202423983A (zh) 2022-09-15 2024-06-16 瑞士商諾華公司 使用嵌合抗原受體療法的自體免疫性障礙的治療
WO2024077191A1 (en) 2022-10-05 2024-04-11 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Nucleic acid molecules encoding trif and additionalpolypeptides and their use in treating cancer
US20240190978A1 (en) 2022-11-15 2024-06-13 CSBioAsset LLC Compositions and methods for immunomodulatory bifunctional fusion molecules
WO2024140917A1 (zh) * 2022-12-28 2024-07-04 上海盛迪医药有限公司 抗cd40抗体药物偶联物、其制备方法及其医药用途
WO2024151687A1 (en) 2023-01-09 2024-07-18 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Genetic switches and their use in treating cancer

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006073443A2 (en) * 2004-04-27 2006-07-13 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Antagonist anti-cd40 monoclonal antibodies and methods for their use
JP2007510666A (ja) * 2003-11-04 2007-04-26 カイロン コーポレイション 自己免疫疾患および炎症性疾患ならびに臓器移植拒絶の処置のためのアンタゴニスト抗ｃｄ４０抗体の使用
WO2008150494A1 (en) * 2007-05-30 2008-12-11 Xencor, Inc. Methods and compositions for inhibiting cd32b expressing cells
WO2010123012A1 (ja) * 2009-04-20 2010-10-28 協和発酵キリン株式会社 アミノ酸変異が導入されたIgG2を有する抗体

Family Cites Families (69)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4766A (en) 1846-09-19 Stbaw-cutter
US106A (en) 1915-08-24 Specipication
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
JPS5896026A (ja) 1981-10-30 1983-06-07 Nippon Chemiphar Co Ltd 新規ウロキナ−ゼ誘導体およびその製造法ならびにそれを含有する血栓溶解剤
EP0098110B1 (en) 1982-06-24 1989-10-18 NIHON CHEMICAL RESEARCH KABUSHIKI KAISHA also known as JAPAN CHEMICAL RESEARCH CO., LTD Long-acting composition
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4881175A (en) 1986-09-02 1989-11-14 Genex Corporation Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
CA1294215C (en) 1986-10-27 1992-01-14 Ze'ev Shaked Pharmaceutical compositions of recombinant beta-interferon and formulation processes
CA1292686C (en) 1986-10-27 1991-12-03 Ze'ev Shaked Pharmaceutical compositions of recombinant interleukin-2 and formulation process
US5013653A (en) 1987-03-20 1991-05-07 Creative Biomolecules, Inc. Product and process for introduction of a hinge region into a fusion protein to facilitate cleavage
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5132405A (en) 1987-05-21 1992-07-21 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
JPH02500329A (ja) 1987-05-21 1990-02-08 クリエイテイブ・バイオマリキユールズ・インコーポレーテツド ターゲット化多機能蛋白質
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5397703A (en) 1992-07-09 1995-03-14 Cetus Oncology Corporation Method for generation of antibodies to cell surface molecules
US5874082A (en) 1992-07-09 1999-02-23 Chiron Corporation Humanized anti-CD40 monoclonal antibodies and fragments capable of blocking B cell proliferation
KR960704576A (ko) 1993-10-01 1996-10-09 크리스토퍼 엘. 와이트 CD40에 대한 항체(Antibodies to CD40)
WO1995017202A1 (en) 1993-12-23 1995-06-29 Immunex Corporation Method of preventing or treating disease characterized by neoplastic cells expressing cd40
ES2204944T3 (es) 1994-03-03 2004-05-01 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Genes y proteinas de fusion inhibidores del complemento terminal.
GB9425060D0 (en) 1994-12-13 1995-02-08 Univ Birmingham Carcinoma treatment
WO1997004801A1 (en) 1995-07-27 1997-02-13 Genentech, Inc. Stabile isotonic lyophilized protein formulation
AU740284B2 (en) 1997-06-13 2001-11-01 Genentech Inc. Stabilized antibody formulation
CA2294138A1 (en) 1997-06-20 1998-12-30 Biogen, Inc. Cd154 blockade therapy for therapeutic protein inhibitor syndrome
CA2304808C (en) 1997-09-23 2011-03-22 Michael Tschope Liquid interferon-.beta. formulations
US6051228A (en) 1998-02-19 2000-04-18 Bristol-Myers Squibb Co. Antibodies against human CD40
US20020006901A1 (en) 1999-02-05 2002-01-17 Aldo T. Iacono Use of aerosolized cyclosporine for prevention and treatment of pulmonary disease
WO2001034649A2 (en) 1999-11-09 2001-05-17 Chiron Corporation Compositions and methods for treating autoimmune diseases and transplant rejections
US20030059427A1 (en) 2000-04-28 2003-03-27 Force Walker R. Isolation and characterization of highly active anti-CD40 antibody
US7063845B2 (en) 2000-04-28 2006-06-20 Gemini Science, Inc. Human anti-CD40 antibodies
AU2001259215A1 (en) 2000-04-28 2001-11-12 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Human anti-cd40 antibodies and methods of making and using same
AU6461201A (en) 2000-07-12 2002-01-21 Idec Pharma Corp Treatment of b cell malignancies using combination of b cell depleting antibody and immune modulating antibody related applications
KR20040023565A (ko) 2000-09-18 2004-03-18 아이덱 파마슈티칼즈 코포레이션 Ｂ 세포 고갈/면역조절 항체 조합을 이용한 자가면역질환의 치료를 위한 조합 요법
CA2424296A1 (en) 2000-10-02 2002-04-11 Chiron Corporation Human anti-cd40 antibodies
WO2002060485A2 (en) 2001-01-31 2002-08-08 Idec Pharmaceuticals Corporation Use of immunoregulatory antibodies in the treatment of neoplastic disorders
WO2002078766A2 (en) 2001-04-02 2002-10-10 Genentech, Inc. Combination therapy
PT1391464E (pt) 2001-04-27 2007-11-15 Kirin Pharma Kk Anticorpo monoclonal anti-cd40
WO2003029296A1 (en) 2001-10-02 2003-04-10 Chiron Corporation Human anti-cd40 antibodies
AR039067A1 (es) 2001-11-09 2005-02-09 Pfizer Prod Inc Anticuerpos para cd40
WO2003045978A2 (en) 2001-11-26 2003-06-05 Chiron Corporation Antagonist anti-cd40 monoclonal antibody therapy for multiple sclerosis treatment
WO2003074679A2 (en) * 2002-03-01 2003-09-12 Xencor Antibody optimization
US20080199471A1 (en) * 2002-03-01 2008-08-21 Bernett Matthew J Optimized cd40 antibodies and methods of using the same
RU2358763C2 (ru) 2003-02-10 2009-06-20 Элан Фармасьютикалз, Инк. Композиции иммуноглобулина и способ их получения
SI1682177T1 (sl) 2003-11-04 2010-12-31 Novartis Vaccines & Diagnostic Uporaba antagonističnih anti-CD40 protiteles za zdravljenje kronične limfocitne levkemije
US8277810B2 (en) 2003-11-04 2012-10-02 Novartis Vaccines & Diagnostics, Inc. Antagonist anti-CD40 antibodies
EP1844815B1 (en) 2003-11-04 2011-09-14 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Combination therapy comprising anti-CD20 and anti-CD40 antibodies for the treatment of B cell-related cancers
DE602004028643D1 (de) 2003-11-04 2010-09-23 Novartis Vaccines & Diagnostic Verfahren zur behandlung von soliden tumoren mit expression des cd40-zelloberflächen-antigens
ES2346978T3 (es) 2003-11-04 2010-10-22 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Uso de anticuerpos monoclonantes anti-cd40 antagonistas para el tratamiento del mieloma multiple.
BRPI0417266B8 (pt) * 2003-12-25 2021-05-25 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd anticorpo monoclonal, seu uso e composição farmacêutica
US20080057070A1 (en) * 2004-11-04 2008-03-06 Chiron Corporation Antagonist Anti-Cd40 Monoclonal Antibodies and Methods for Their Use
WO2006125117A2 (en) 2005-05-18 2006-11-23 Novartis Ag Methods for diagnosis and treatment of diseases having an autoimmune and/or inflammatory component
RU2442606C2 (ru) 2005-11-01 2012-02-20 Новартис Аг Применение анти-cd40-антител
JP2009519718A (ja) * 2005-12-16 2009-05-21 ジェネンテック・インコーポレーテッド 抗ｏｘ４０ｌ抗体とその使用方法
MEP39508A (en) 2006-04-21 2011-02-10 Novartis Ag Antagonist anti-cd40 antibody pharmaceutical compositions
EP1854810A1 (en) 2006-05-09 2007-11-14 PanGenetics B.V. Deimmunized antagonistic anti-human CD40 monoclonal antibody from the ch5D12 antibody
TW200815467A (en) * 2006-06-06 2008-04-01 Genentech Inc Anti-DLL4 antibodies and methods using same
US20090204489A1 (en) * 2007-04-02 2009-08-13 Genentech, Inc. Biological markers predictive of rheumatoid arthritis response to b-cell antagonists
PE20090227A1 (es) * 2007-04-02 2009-04-03 Genentech Inc Composiciones farmaceuticas que comprenden agentes anti-beta-klotho
KR20190069615A (ko) * 2008-12-09 2019-06-19 제넨테크, 인크. 항-ｐｄ-ｌ１ 항체 및 ｔ 세포 기능을 향상시키기 위한 그의 용도
AR083847A1 (es) * 2010-11-15 2013-03-27 Novartis Ag Variantes de fc (fragmento constante) silenciosas de los anticuerpos anti-cd40
US20140004131A1 (en) 2012-05-04 2014-01-02 Novartis Ag Antibody formulation
WO2014139023A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Synaptive Medical (Barbados) Inc. Intelligent positioning system and methods therefore

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007510666A (ja) * 2003-11-04 2007-04-26 カイロン コーポレイション 自己免疫疾患および炎症性疾患ならびに臓器移植拒絶の処置のためのアンタゴニスト抗ｃｄ４０抗体の使用
WO2006073443A2 (en) * 2004-04-27 2006-07-13 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Antagonist anti-cd40 monoclonal antibodies and methods for their use
WO2008150494A1 (en) * 2007-05-30 2008-12-11 Xencor, Inc. Methods and compositions for inhibiting cd32b expressing cells
WO2010123012A1 (ja) * 2009-04-20 2010-10-28 協和発酵キリン株式会社 アミノ酸変異が導入されたIgG2を有する抗体

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JPN6014044140; ＢＬＯＯＤ Ｖｏｌ．１１６, 2010, ｐ．３００４-３０１２ *
JPN6014044144; Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｖｏｌ．５８, 2006, ｐ．６４０-６５６ *
JPN6014044147; Ｃｒｉｔｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　ｉｎ　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ／Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．６２, 2007, ｐ．２６-３３ *
JPN6014044150; Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｖｏｌ．８６, 2008, ｐ．１０-１５ *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016202179A (ja) * 2015-04-17 2016-12-08 エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft 細胞分析装置用の圧伝達液体、細胞分析装置、および液体細胞試料を分析するための方法
JP2020521788A (ja) * 2017-06-02 2020-07-27 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 免疫アゴニストの投与経路
JP2021501748A (ja) * 2017-11-03 2021-01-21 ノバルティス アーゲー シェーグレン症候群の治療に使用するための抗ｃｄ４０抗体
JP2022137233A (ja) * 2017-11-03 2022-09-21 ノバルティス アーゲー シェーグレン症候群の治療に使用するための抗ｃｄ４０抗体
JP7357120B2 (ja) 2017-11-03 2023-10-05 ノバルティス アーゲー シェーグレン症候群の治療に使用するための抗ｃｄ４０抗体
JP2020519634A (ja) * 2018-04-13 2020-07-02 ノバルティス アーゲー 移植片拒絶の予防に使用するための抗ｃｄ４０抗体
JP2021113190A (ja) * 2018-04-13 2021-08-05 ノバルティス アーゲー 移植片拒絶の予防に使用するための抗ｃｄ４０抗体
JP2021506953A (ja) * 2019-01-11 2021-02-22 ノバルティス アーゲー 化膿性汗腺炎の治療に使用するための抗ｃｄ４０抗体
JP7558900B2 (ja) 2019-01-11 2024-10-01 ノバルティス アーゲー 化膿性汗腺炎の治療に使用するための抗ｃｄ４０抗体

Also Published As

Publication number Publication date
HRP20220413T1 (hr) 2022-05-27
UY39292A (es) 2021-07-30
EA201390725A1 (ru) 2013-09-30
US20240228640A9 (en) 2024-07-11
ES2633817T3 (es) 2017-09-25
EP4023676A1 (en) 2022-07-06
KR20130080856A (ko) 2013-07-15
MY159316A (en) 2016-12-30
MX2013005477A (es) 2013-06-12
DK2640749T3 (en) 2017-07-31
NZ609549A (en) 2015-05-29
ES2911460T3 (es) 2022-05-19
CO6801629A2 (es) 2013-11-29
US20200087409A1 (en) 2020-03-19
LT3502138T (lt) 2022-04-11
PL2640749T3 (pl) 2017-09-29
IL225719A0 (en) 2013-06-27
US9828433B2 (en) 2017-11-28
TWI531581B (zh) 2016-05-01
CN105949314A (zh) 2016-09-21
JP5782132B2 (ja) 2015-09-24
WO2012065950A1 (en) 2012-05-24
EP2640749B1 (en) 2017-04-19
MA34654B1 (fr) 2013-11-02
UY33728A (es) 2012-06-29
US20220204635A1 (en) 2022-06-30
US11124578B2 (en) 2021-09-21
TW201623335A (zh) 2016-07-01
DK3502138T3 (da) 2022-04-19
SI3502138T1 (sl) 2022-05-31
AR122999A2 (es) 2022-10-19
US20140341898A1 (en) 2014-11-20
US20180118843A1 (en) 2018-05-03
EP3502138A1 (en) 2019-06-26
CR20130222A (es) 2013-06-28
KR101632775B1 (ko) 2016-06-22
IL225719A (en) 2017-09-28
PT2640749T (pt) 2017-07-25
MX336633B (es) 2016-01-26
ZA201302532B (en) 2014-09-25
EP2640749A1 (en) 2013-09-25
CN103209996A (zh) 2013-07-17
US20160152721A1 (en) 2016-06-02
CA2815921A1 (en) 2012-05-24
EP3502138B9 (en) 2022-03-09
BR112013011644A2 (pt) 2016-08-02
HUE058015T2 (hu) 2022-06-28
US20120121585A1 (en) 2012-05-17
BR112013011644B1 (pt) 2022-02-22
EA026133B1 (ru) 2017-03-31
CU24057B1 (es) 2014-12-26
TWI608016B (zh) 2017-12-11
UA112417C2 (uk) 2016-09-12
US20240132606A1 (en) 2024-04-25
SI2640749T1 (sl) 2017-07-31
SG189928A1 (en) 2013-06-28
US8828396B2 (en) 2014-09-09
US20170267772A1 (en) 2017-09-21
JO3266B1 (ar) 2018-09-16
RS56153B1 (sr) 2017-11-30
AU2011331288A1 (en) 2013-05-02
US10323096B2 (en) 2019-06-18
EP3502138B1 (en) 2022-01-19
CU20130071A7 (es) 2013-09-27
EP3222636A1 (en) 2017-09-27
AR083847A1 (es) 2013-03-27
PT3502138T (pt) 2022-04-06
CL2013001124A1 (es) 2014-07-04
HUE034203T2 (en) 2018-01-29
HRP20171084T1 (hr) 2017-10-06
CY1119097T1 (el) 2018-01-10
CN105949314B (zh) 2021-04-09
CA2815921C (en) 2021-07-06
TW201305208A (zh) 2013-02-01
PL3502138T3 (pl) 2022-05-02
GT201300128A (es) 2015-06-02
LT2640749T (lt) 2017-07-10
AU2011331288B2 (en) 2014-09-11
RS63094B1 (sr) 2022-04-29
CN103209996B (zh) 2016-07-20
PE20140979A1 (es) 2014-08-09
US9221913B2 (en) 2015-12-29
US9688768B2 (en) 2017-06-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5782132B2 (ja) 抗ＣＤ４０抗体のサイレントＦｃ変異体
AU2016201742B2 (en) Silent Fc variants of anti-CD40 antibodies
AU2014274598A1 (en) Silent Fc variants of anti-CD40 antibodies

Legal Events

Date Code Title Description
RD03 Notification of appointment of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423

Effective date: 20140818

RD04 Notification of resignation of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424

Effective date: 20140902

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20141021

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20150121

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20150616

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20150716

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 5782132

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250