EA026133B1 - МОЛЧАЩИЕ Fc-ВАРИАНТЫ АНТИ-CD40 АНТИТЕЛ - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к молчащим Fc-вариантам анти-CD40 антител, композициям и методам использования указанных антител для лечения патологических нарушений, таких как аутоиммунные и воспалительные нарушения, и/или для предотвращения или снижения риска отторжения трансплантата при трансплантации.

Description

Настоящее изобретение относится к молчащим вариантам константного фрагмента (Рс) анти-СГО40 антител и композициям и методам использования указанных антител для лечения патологических нарушений, таких как аутоиммунные и воспалительные нарушения, и/или для предотвращения или снижения риска отторжения трансплантата при трансплантации.

Несмотря на наличие различных иммуносупрессивных способов лечения аутоиммунных заболеваний, остается большая востребованность более эффективных и безопасных лекарственных средств в многочисленной части популяции пациентов. Например, несмотря на описанную в литературе эффективность терапии по снижению числа/ингибированию В-клеток, как, например, лечение ритуксимабом или белимумабом ревматоидного артрита, системной красной волчанки, синдрома Шегрена и рассеянного склероза, эти виды терапии эффективны только у части пациентов, а в случае ритуксимаба имеется сопутствующий риск развития прогрессирующей мультифокальной лейкоэнцефалопатии. Более того, многочисленные другие типы лейкоцитов зачастую вовлечены в патологию этих аутоиммунных заболеваний, такие как макрофаги, дендритные клетки и Т-клетки, следовательно, терапевтическое воздействие на дополнительные типы клеток или ключевые иммунологические каскады реакций, которые будут ингибировать их функцию, может оказаться эффективным. Принимая во внимание разнообразные, иммунологически значимые роли СГО40-СГО154 в активации и функции этих типов клеток, предполагают, что анти-СО40 антитело окажет положительный терапевтический эффект у пациентов, страдающих аутоиммунными заболеваниями, упомянутыми выше, помимо обеспечиваемого проводимыми в настоящее время методами терапевтического лечения. Более того, центральная роль взаимодействий СГО40-СГО154 в воспалительных заболеваниях желудочно-кишечного тракта, таких как болезнь Крона и язвенный колит, и механистическая связь метаболического пути СГО40 с патологией при более редких нарушениях, таких как аутоиммунный васкулит, вульгарная пузырчатка и ИТП, также подчеркивает потенциал анти-СГО40 антител для применения.

Имеющиеся в наличие иммунодепрессанты, используемые после трансплантации паренхиматозных органов, обеспечивают отличную краткосрочную эффективность. Острое отторжение в течение вновь возникшего периода наблюдают у 5-20% реципиентов (в зависимости от органа, контингента пациентов и схемы лечения) и соотношение утраченных трансплантатов и острого отторжения в течение вновь возникшего периода ниже 5% для любых параметров. В настоящее время ключевые проблемы в медицине связаны с переносимостью иммуносупрессии пациентом и жизнеспособностью трансплантата в течение долгого периода времени. После трансплантации почек 33% пациентов умирают и/или утрачивают трансплантат в течение 5 лет; средний возраст реципиентов трансплантата со смертельным исходом составляет 58 лет. Ингибиторы кальциневрина (СЫ1) остаются основой иммуносупрессивной терапии для подавляющего большинства пациентов, которым проведена трансплантация. Несмотря на то что нефротоксичность и частота сердечно-сосудистых осложнений, ассоциированных с С№. являются одними из факторов, способствующих хронической нефропатии при аллотрансплантации, а также наступлению смерти пациента с функционирующим трансплантатом, альтернативная первичная иммуносупрессия была неспособна заменить СЫТ В целом имеются возможности для усовершенствования долгосрочной иммуносупрессии трансплантата. Опосредованное В-клетками иммунологическое повреждение трансплантированных почек может обусловливать неудовлетворительные отдаленные последствия, и необходимость разработки новых средств воздействия на отторжение трансплантата, опосредуемое В-клетками, все в большей мере признается медицинской общественностью.

СЫг12.12 представляет собой полностью гуманизированное, не являющееся агонистом анти-СО40 антитело (1§О1, каппа), которое блокирует опосредованную СГО154 (также известное как лиганд СЭ40; СГО40Б) активацию лейкоцитов и может опосредовать антителозависимую клеточную цитотоксичность (ЛОСС) лейкоцитов человека и В-клеточной лимфомы ίη νίίτο (см. ΥΟ 2006/073443). ΥΟ 2005/044306 также описывает анти-СЭ40 антагонистические антитела, включая СЙ1г12.12, для использования, в частности, в лечении аутоиммунных и воспалительных нарушений. Более того, СЫг12.12 эффективно в замедлении отторжения почечного аллотранслантата при назначении в виде монотерапии у Масаса Гаксюи1аг18 (яванского макака) [Ы с1 а1. (2008), Тгап8р1айайоп; 86(1):10-15]. Однако СЫг12.12 может также опосредовать обеднение фракции периферических В-клеток у не относящихся к человеку приматов (ΝΗΡ).

По теоретическим оценкам анти-СГО40 шЛЬ с молчащей ЛОСС-активностью обладают улучшенным профилем безопасности в сравнении с исходными анти-СО40 антителами, и, в частности, могут быть более пригодными по неонкологическим показаниям для применения, таким как аутоиммунные заболевания и использование в условиях трансплантации.

Таким образом, настоящее изобретение представляет молчащие Рс-фрагменты анти-СО40 моноклональных антител, которые сохраняют неагонистические, блокирующие СГО40Б свойства исходного антиСГО40 антитела СЫг12.12.

В частности, изобретение представляет выделенное антитело или белок, включающие антигенсвязывающий участок антитела, направленный против полипептида-мишени СЭ40 (8ЕЦ ГО ΝΟ: 28), характеризуемые тем, что указанное антитело или белок:

a) связывает полипептид СГО40 с К_с, равной 10 нМ или менее, и

b) включает молчащий Рс-фрагмент 1§О.

- 1 026133

В одном варианте осуществления изобретения указанное антитело или белок ингибирует индуцированное СИ40Ь проведение сигнала с 1С₅₀ величиной, равной 50 нг/мл или менее.

В другом варианте осуществления изобретения выделенное антитело или белок по данному изобретению не имеет или обладает низкой агонистической активностью в отношении проведения сигнала СИ40.

В другом варианте осуществления изобретения антитело или белок по настоящему изобретению включает молчащий Ре-фрагмент 1§О, выбранный из группы, состоящей из аминокислотной последовательности 81Т) ГО N0: 17, 81 У) ГО N0: 18 или 81 У) ГО N0: 19.

В другом варианте осуществления изобретения выделенное антитело или белок по данному изобретению включает вариабельные участки тяжелой цепи (Ун) и легкой цепи (УД имеющие по меньшей мере 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичности по последовательности в сравнении с У_н СЫг12.12 (8ЕЦ ГО N0: 9) и У_ь СЫг12.12 антитела (8ЕЦ ГО N0: 10) соответственно.

Частными примерами антител по данному изобретению являются шЛЫ, включающее аминокислотную последовательность тяжелой цепи 8ЕЦ ГО N0: 11 и аминокислотную последовательность легкой цепи 8ЕЦ ГО N0: 12;

шЛЬ2, включающее аминокислотную последовательность тяжелой цепи 8ЕЦ ГО N0: 13 и аминокислотную последовательность легкой цепи 8ЕЦ ГО N0: 14, или тАЬЗ, включающее аминокислотную последовательность тяжелой цепи 8ЕЦ ГО N0: 15 и аминокислотную последовательность легкой цепи 8ЕЦ ГО N0: 16.

Выделенное антитело или белок по данному изобретению могут быть использованы в качестве лекарственного средства. В частности, они пригодны для использования в лечении аутоиммунных нарушений, воспалительных нарушений и/или для предотвращения или уменьшения риска отторжения трансплантата при трансплантации.

Выделенное антитело или белок по данному изобретению могут быть использованы, в частности, в лечении рассеянного склероза, системной красной волчанки, синдрома Шегрена, ревматоидного артрита, отторжения трансплантата и реакции трансплантат против хозяина.

Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, включающим вышеперечисленные антитела или белки по данному изобретению, в сочетании, по меньшей мере, с фармацевтически приемлемым эксципиентом, разбавителем или носителем. Указанные фармацевтические композиции могут дополнительно включать другие активные ингредиенты.

Изобретение также относится к лиофилизату или жидкой лекарственной форме антитела или белка по данному изобретению.

Изобретение дополнительно относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей антитело или белок по данному изобретению, и соответствующему клонирующему или экспрессионному вектору, включающему по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, выбранную из группы, состоящей из 8ЕЦ ГО N0: 22-27.

Изобретение также относится к клетке-хозяину, включающей один или несколько клонирующих или экспрессионных векторов согласно вышеприведенному определению.

Изобретение дополнительно представляет процесс производства антитела или белка по изобретению, включающий культивирование клетки-хозяина согласно вышеприведенному определению, очистку и извлечение указанного антитела или белка.

С целью лучшего понимания настоящего изобретения в первую очередь даны определения конкретным терминам. Дополнительные определения изложены на всем протяжении подробного описания.

Термин иммунный ответ относится к реакции, например, лимфоцитов, антиген-презентирующих клеток, фагоцитарных клеток, гранулоцитов и растворимых макромолекул, продуцируемых вышеперечисленными клетками или печенью (включая антитела, цитокины и комплемент), что приводит к селективному повреждению, деструкции или элиминации из человеческого организма внедрившихся патогенов, клеток или тканей, инфицированных патогенами, раковых клеток, или, в случаях аутоиммунного или патологического воспаления, нормальных клеток или тканей человека.

Путь передачи сигнала или сигнальная активность относятся к биохимической причинноследственной взаимосвязи, как правило, инициируемой белок-белковым взаимодействием, таким как связывание ростового фактора с рецептором, приводящее к передаче сигнала от одной части клетки другой части клетки. В основном, передача сигнала включает специфическое фосфорилирование одного или нескольких остатков тирозина, серина или треонина в одном или нескольких белках в каскаде реакций, вызывая передачу сигнала. Предпоследние процессы обычно включают ядерные события, приводящие к изменению экспрессии гена.

Термин СГО40 относится к СГО40 человека, например, как определено в 8ЕЦ ГО N0: 28, если не описано иное.

Термин антитело в том смысле, в котором он здесь используется, включает полноразмерное антитело и любые антигенсвязывающие фрагменты (т.е. антигенсвязывающая часть) или одноцепочечные варианты вышеперечисленного.

Встречающееся в природе антитело является гликопротеином, включающим по меньшей мере две

- 2 026133 тяжелые (Н) цепи и две легкие (Ь) цепи, взаимосвязанных дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (сокращенное название в настоящем документе Ун) и константная область тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов, СН1, СН2 и СН3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращенное название в настоящем документе У_ь) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена, С_ь. Области У_н и У_ъ могут быть дополнительно подразделены на области гипервариабельности, названные определяющими комплементарность областями (СОК), вперемежку с областями, которые являются более консервативными и называются каркасными областями (РК). Каждая область У_н и У_ъ состоит из трех СОК и четырех РК, расположенных от амино-конца до карбокси-конца в следующем порядке: РК1, СЭРЕ РК2, СЭК2. РК3, СЭКЗ. РК4. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (С1ц) классической системы комплемента.

Термин антигенсвязывающий участок антитела (или упрощенно антигенный участок) в том смысле, в котором он здесь используется, относится к полноразмерному антителу или одному или нескольким его фрагментам, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном (например, частью С.П40). Было показано, что антигенсвязывающая функция антитела может выполняться фрагментами полноразмерного антитела. Примеры фрагментов связывания, подходящих под термин антигенсвязывающий участок антитела, включают фрагмент РаЬ, моновалентный фрагмент, состоящий из доменов Уь, У_н, Сь и СН1; фрагмент Р(аЬ)₂, бивалентный фрагмент, включающий два фрагмента РаЬ, связанные дисульфидным мостиком в шарнирной области; фрагмент РБ, состоящий из доменов У_н и СН1; фрагмент Ру, состоящий из доменов У_ъ и У_н одного плеча антитела; фрагмент БАЬ (№агБ е! а1., 1989, ЫаШге 341:544-546), который состоит из домена У_н; и выделенную определяющую комплементарность область (СОК) или любые химерные белки, включающие такие антигенсвязывающие области.

Более того, хотя два домена фрагмента Ру, У_ъ и У_н, кодируются отдельными генами, они могут быть соединены, используя рекомбинантные методы, синтетическим линкером, что позволяет им находиться в составе одноцепочечного белка, в котором области У_ъ и У_н соединены в пару с образованием моновалентных молекул (известных как одноцепочечный фрагмент Ру (ксРу); см., например, ВЬБ е! а1., 1988, §с1еисе 242:423-426 и ИнЦоп е! а1., 1988, Ргос. №Б. АсаБ. 8сг 85:5879-5883). Такие одноцепочечные антитела также предназначены быть включенными в термин антигенсвязывающий участок антитела. Эти фрагменты антитела получают, используя стандартные методики, известные специалистам в данной области техники, и проводят скрининг данных фрагментов на предмет практического применения таким же образом, как и интактные антитела.

Термин область Рс 1дО в том смысле, в котором он здесь используется, применяется для определения С-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина, включая область Рс нативной последовательности и вариантные области Рс. Область Рс тяжелой цепи 1§О человека, как правило, определяют как последовательность, включающую аминокислотные остатки, начиная с позиции С226 или Р230 до карбоксильного конца антитела 1§О. Нумерация остатков в области Рс соответствует системе нумерации ЕЙ 1пБех по КаЬа!. С-концевой лизин (остаток К447) области Рс может быть удален, например, во время производства или очистки антитела. Соответственно, композиция антител по изобретению может включать популяции антител со всеми удаленными остатками К447, содержащие остатки К447 популяции антител, и популяции антител, имеющие смесь антител, содержащих и не содержащих остаток К447.

Термин выделенное антитело в том смысле, в котором он здесь используется, относится к антителу, которое практически не содержит других антител, имеющих другую антигенную специфичность (например, выделенное антитело, которое специфически связывает СЭ40, практически не содержит антител, которые специфически связывают отличные от ί'.Ό40 антигены). Выделенное антитело, которое специфически связывает СЭ40, может, однако, иметь перекрестную реактивность с другими антигенами, такими как молекулы ί'.Ό40 из других (отличных от человека) видов. Более того, выделенное антитело может практически не содержать другого клеточного материала и/или химических веществ.

Термины моноклональное антитело или композиция моноклонального антитела в том смысле, в котором они здесь используются, относится к производству молекул антитела одномолекулярного состава. Композиция моноклонального антитела обладает единственной специфичностью связывания и аффинностью в отношении определенного эпитопа.

Термин гуманизированное антитело в том смысле, в котором он здесь используется, включает антитела, которые содержат минимальную последовательность, полученную из отличных от человеческих последовательностей иммуноглобулинов. В большинстве случаев, гуманизированные антитела представляют собой иммуноглобулины человека (реципиентное антитело), в которых остатки из гипервариабельной области (также известной как определяющая комплементарность область или СОК) реципиента заменены остатками из гипервариабельной области иммуноглобулинов, отличных от человека видов (донорское антитело), таких как мышь, крыса, кролик или отличные от человека приматы, имеющие заданную специфичность, аффинность и способность. Фраза определяющая комплементарность область от- 3 026133 носится к аминокислотным последовательностям, которые одновременно определяют аффинность и специфичность связывания области природного фрагмента Ρν сайта связывания нативного иммуноглобулина. См., например, Οιοίΐιίη е! а1. (1987), 1. Μοί. ΒίοΙ. 196:901-917: КаЬа! е! а1. (1991), И8 Όβρΐ. οί НеаНЪ апб Нитап 8ег\1ее5. ΝΙΗ РиЬНса110п Νο. 91-3242). Фраза константная область относится к фрагменту молекулы антитела, который придает эффекторные функции. В предыдущей работе, направленной на производство неиммуногенных антител для использования в терапии человеческих заболеваний, мышиные константные области были заменены человеческими константными областями. Константные области гуманизированных антител субъекта были получены из иммуноглобулинов человека. Гуманизация может быть выполнена, руководствуясь методом ХУиНег и соавторов (1опе8 е! а1. (1986), №ш.1ге 321:522-525; КгесЬтапп е! а1. (1988), №Лиге 332:323-327: Уебюеуеп е! а1. (1988), 8с1епсе 239: 1534-1536), путем замены крысиных и мутантных крысиных СОК или последовательностей СОК соответствующими последовательностями человеческого антитела. В некоторых случаях, остатки в каркасных областях одной или нескольких вариабельных областей человеческого иммуноглобулина замещают соответствующими остатками отличных от человеческих иммуноглобулинов (см., например, патенты США № 5585089; 5693761; 5693762 и 6180370). Более того, гуманизированные антитела могут включать остатки, которые нельзя обнаружить в реципиентном антителе или в донорском антителе.

Гуманизированное антитело по изобретению также включает, по меньшей мере, участок константной области иммуноглобулина (Рс), как правило, таковой человеческого иммуноглобулина и, в данном случае, молчащую область Рс 1дС.

Антитела по изобретению могут включать аминокислотные остатки, не кодируемые человеческими последовательностями (например, мутации, появившиеся в результате случайного или сайтспецифичного мутагенеза ш νίίΓο или в результате соматической мутации ш νίνο). В частности, термин гуманизированное антитело включает антитела, которые содержат в своем составе молчащий вариант области Рс 1дС.

Термин гуманизированное моноклональное антитело относится к антителам, обладающим единственной специфичностью связывания, которые имеют вариабельные области, в которых вариабельные области гуманизированы последовательностями, отличными от человеческих.

Термин рекомбинантное антитело в том смысле, в котором он здесь используется, включает все человеческие или гуманизированные антитела, которые синтезированы, экспрессированы, созданы или выделены рекомбинантными способами, как, например, антитела, выделенные из животного (например, мыши), которое является трансгенным или трансхромосомным в отношении генов иммуноглобулинов человека, гибридомы, созданной из них, антитела, выделенные из клетки-хозяина, трансформированной с целью экспрессии человеческого или гуманизированного антитела, например, из трансфектомы, антитела, выделенные из рекомбинантной, комбинаторной библиотеки человеческих антител, и антитела, синтезированные, экспрессированные, созданные или выделенные любыми другими способами, которые включают сплайсинг всего или части гена иммуноглобулина человека, последовательностей с другими последовательностями ДНК. Такие рекомбинантные человеческие или гуманизированные антитела имеют вариабельные области, в которых каркасная или СОК области могут быть получены из последовательностей иммуноглобулинов человека эмбрионального типа. В определенных вариантах осуществления изобретения, однако, такие рекомбинантные человеческие или гуманизированные антитела могут быть подвержены мутагенезу ш νίΐτο (или, когда используется животное, трансгенное в отношении человеческих последовательностей 1д, соматический мутагенез ш νίνο) и, следовательно, аминокислотные последовательности областей ν_Η и Уь рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые, хотя и получены из человеческих последовательностей У_Н и Уь эмбрионального типа и имеют к ним отношение, могут и не встречаться в природе ш νίνο среди репертуара человеческих антител эмбрионального типа.

Изотип в том смысле, в котором он здесь используется, относится к классу антител (например, Ι§Μ, 1дЕ, 1§С такие как 1§С1 или 1§С4), что обусловлено генами константной области тяжелой цепи. Различные изотипы имеют различные эффекторные функции. Например, изотипы дикого типа 1§С1 и 1§С3 человека опосредуют антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитоксическую (АОСС) активность.

Фразы антитело, узнающее антиген, антитело, специфичное для антигена и антитело, направленное против антигена используются взаимозаменяемо в настоящем документе вместе с термином антитело, которое связывается специфически с антигеном.

В том смысле, в котором используется в настоящем документе антитело или белок, которые специфически связываются с полипептидом СО40, предназначены для обозначения антитела или белка, которые связываются с человеческим полипептидом СО40 с К_с, равной 100 нМ или менее, 10 нМ или менее, 1 нМ или менее.

Антитело, которое перекрестно реагирует с антигеном, отличным от СО40, предназначено для обозначения антитела, которое связывается с этим антигеном с К_с, равной 1 мкМ или менее, 100 нМ или менее, 10 нМ или менее, 1 нМ или менее. Антитело, которое не реагирует перекрестно с определенным антигеном, предназначено для обозначения антитела, которое связывается с этим антигеном с К_с, рав- 4 026133 ной 100 нМ или более, или К_с, равной 1 мкМ или более, или К_с, равной 10 мкМ или более. В определенных вариантах осуществления изобретения такие антитела, которые не реагируют перекрестно с антигеном, демонстрируют практически не детектируемое связывание с этими белками в стандартных реакциях связывания.

Термин К_ажос или К_а в том смысле, в котором он здесь используется, предназначен для обозначения скорости ассоциации отдельно взятого взаимодействия антитело-антиген, тогда как термин К^, или К/' в том смысле, в котором он здесь используется, предназначен для обозначения скорости диссоциации отдельно взятого взаимодействия антитело-антиген.

Термин К_с в том смысле, в котором он здесь используется, предназначен для обозначения константы диссоциации, которую получают из отношения К,| к К_а (т.е. К₄/К_а) и выражают в виде молярной концентрации (М). Значения К_с для антител могут быть определены, используя методы, общепризнанные в данной области техники. Метод определения К_с антитела заключается в использовании поверхностного плазмонного резонанса или в использовании биосенсорной системы, такой как система Ыасоге®.

Термин аффинность в том смысле, в котором он здесь используется, относится к силе взаимодействия между антителом и антигеном в отдельно взятых иммунодоминантных сайтах. Внутри каждого иммунодоминантного сайта вариабельная область плеча антитела взаимодействует посредством слабых нековалентных связей с антигеном в многочисленных сайтах; чем больше взаимодействий, тем сильнее аффинность.

Термин авидность в том смысле, в котором он здесь используется, относится к информативному показателю общей стабильности или силы взаимодействия комплекса антитело-антиген. Она контролируется тремя основными факторами: аффинностью эпитопа антитела; валентностью как антигена, так и антитела; структурной конфигурацией взаимодействующих частей. В конечном счете эти факторы определяют специфичность антитела, т.е. вероятность того, что определенное антитело связывается с определенным эпитопом антигена.

Термин антагонист СО40 в том смысле, в котором он здесь используется, предназначен для обозначения антитела или белка, который ингибирует индуцированную СО40 сигнальную активность в присутствии СО40Ь в анализе клеток человека, таком как анализ СО40Ь-опосредованной пролиферации РВМС. Такой анализ описан более подробно в нижеприведенных примерах. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела или белки по изобретению ингибируют индуцированное СО40Ь проведение сигнала со значением 1С₅₀, равным 500 нг/мл или менее, предпочтительно, со значением 1С₅₀, равным 50 нг/мл или менее, например, со значением 1С₅₀, равным 20 нг/мл или менее, как было измерено в анализе СО40Ь-опосредованной пролиферации РВМС.

Антитело без агонистической активности в том смысле, в котором используется в настоящем документе, предназначено для обозначения антитела, которое значимо не увеличивает СО40опосредованную сигнальную активность в отсутствие СО40Ь в клеточном анализе, таком как анализ СО40Ь-опосредованной пролиферации РВМС. Такой анализ описан более подробно в нижеприведенных примерах.

Термин АОСС или антитело-зависимая клеточная цитотоксичность в том смысле, в котором он здесь используется, относится к антиклеточной активности. Активность АОСС может быть измерена анализом АОСС, как описано более подробно в нижеприведенных примерах.

Термин молчащее антитело в том смысле, в котором он используется в настоящем документе, относится к антителу, которое проявляет низкую активность АОСС или не проявляет вовсе, что измеряется анализом АОСС, как описано в примерах.

В одном варианте осуществления изобретения термин отсутствующая или низкая активность АОСС означает, что молчащее антитело проявляет активность АОСС, величина которой ниже 50% специфичного клеточного лизиса, например, ниже 10% специфичного клеточного лизиса, что измеряется анализом АОСС, как описано в примерах. Отсутствие активности АОСС означает, что молчащее антитело проявляет активность АОСС (специфичный клеточный лизис), величина которой ниже 1%. В конкретном варианте осуществления изобретения молчащее антитело по изобретению не проявляет какойлибо значимой активности АОСС, измеренной анализом АОСС, как описано в примерах.

Сниженные эффекторные функции могут быть получены введением мутации во фрагмент Рс антител и были описаны в данной области техники: ЬАЬА и Ν297Λ (§1тоЫ, 2009, Сигг. Ορίη. Вю1ес1ию1.

Уо1. 20(6):685-691); и О265А (Ваийшо е! а1., 2008, 1. 1ттипо1. 181:6664-69; §1гоЫ, кирга). Примеры молчащих Рс 1§О1 антител включают так называемый мутант 44, включающий мутацию Ь234А и Ь235А в аминокислотной последовательности Рс 1дО1. Другой пример молчащего антитела 1§О1 включает мутацию О265А. Другое молчащее антитело 1§О1 включает мутацию №97А, результатом которой являются агликозилированные/негликозилированные антитела.

Термин селективный для антитела или белка по изобретению в том смысле, в котором он здесь используется, относится к антителу или белку, которые связываются с определенным полипептидоммишенью, но не с близкородственным полипептидом.

Термин высокая аффинность для антитела в том смысле, в котором он здесь используется, относится к антителу, имеющему величину К_с, равную 1 нМ или менее, для антигена-мишени. Термин

- 5 026133 субъект в том смысле, в котором он здесь используется, включает любого человека или отличного от человека животного.

Термин отличное от человека животное включает всех позвоночных, например, млекопитающих и не являющихся млекопитающими, такие как отличные от человека приматы, овцы, собаки, кошки, лошади, коровы, куры, амфибии, рептилии и т.д.

Термин оптимизированный в том смысле, в котором он здесь используется, означает, что нуклеотидная последовательность была изменена для кодирования аминокислотной последовательности, используя кодоны, предпочтительные в продуцирующей клетке или организме, в основном, эукариотической клетке, например, клетке РюЫа, клетке ТпсНобсгта. клетке яичника китайского хомячка (СНО) или клетке человека. Оптимизированную нуклеотидную последовательность конструируют, чтобы полностью или как можно больше сохранить аминокислотную последовательность, изначально кодируемую исходной нуклеотидной последовательностью, которая также известна как родительская последовательность. Оптимизированная последовательность в настоящем документе была сконструирована, чтобы содержать кодоны, предпочтительные для клеток млекопитающих СНО, однако оптимизированная экспрессия этих последовательностей в других эукариотических клетках также предусмотрена в настоящем документе. Аминокислотные последовательности, кодируемые оптимизированными нуклеотидными последовательностями, также называются оптимизированными.

Процент идентичности между двумя последовательностями в том смысле, в котором используется в настоящем документе, является функцией числа идентичных позиций, являющихся общими для данных последовательностей (т.е. % идентичности = # идентичных позиций/общее количество # позиций х 100), учитывая количество несовпадений и длины каждого несовпадения, которые должны быть введены для оптимального наложения двух последовательностей. Сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями может быть выполнено, используя математический алгоритм, как описано ниже.

Процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями может быть определен, использую алгоритм Е. Меуетк и V. МШет (Сотри!. Αρρί. Βίοδα., 4:11-17, 1988), который был включен в программу ΑΕΙΟΝ (версия 2.0), используя таблицу веса остатков РАМ120, штраф длины разрыва 12 и штраф разрыва 4. Альтернативно, процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями может быть определен, используя алгоритм №еб1етап и ХУшъсН (1. Μοί. Βίοί. 48:444-453, 1970), который был включен в программу ΟΑΡ в пакете программы ОСО (доступно на сайте Ьйр://№№№.дсд.сот), используя либо матрицу Βίοκκοιη 62, либо матрицу РАМ250, и вес разрыва 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и вес длины 1, 2, 3, 4, 5 или 6.

Процент идентичности между двумя нуклеотидными последовательностями аминокислот может быть также определен, используя, например, алгоритмы, такие как программа ΒΕΑδΤΝ для последовательностей нуклеиновых кислот, используя по умолчанию длину слова (XV) 11, ожидание (Е) 10, М=5, Ν=4 и сравнительный анализ обеих цепей.

Рекомбинантные антитела

Антитела по изобретению включают гуманизированные рекомбинантные антитела тАЫ-тАЬЗ, выделенные и структурно охарактеризованные по их полноразмерным аминокислотным последовательностям тяжелой и легкой цепи, как описано ниже в табл. 1.

Таблица 1

Полноразмерные аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепи тАЬ1-тАЬ3

Антитело	Полноразмерная аминокислотная последовательность тяжелой цепи	Пол нора змерна я аминокислотная последовательность легкой цепи
тАЫ	ЗЕО Ιϋ ΝΟ:11	ЗЕО Ю N0:12
тАЬ2	ЗЕО Ιϋ ΝΟ:13	ЗЕО Ю N0:14
тАЬЗ	ЗЕО Ιϋ ΝΟ:15	ЗЕО Ю N0:16

Соответствующие вариабельные области, аминокислотные последовательности ν_Η и таких выделенных антител тАЬ1-тАЬ3 по изобретению все происходят из одного и того же антитела СЫт12.12, ранее описанного, например, в νΟ 2006/073443 и состоящего из аминокислотной последовательности ν_Η δΕφ ΙΌ ΝΟ: 7 и аминокислотной последовательности V,, δΕφ ГО ΝΟ: 8.

Одно важное отличие антител по изобретению по сравнению с исходным СЫт12.12 состоит в том, что они имеют область Рс, состоящую из молчащей области Рс 1дО, например молчащая область Рс 1дО1.

В частности, в табл. 2 суммированы данные по модификации области Рс 1дО1, выполненной для получения антител тАЬ1-тАЬ3, в сравнении с исходным антителом СЫт12.12.

- 6 026133

Таблица 2

Модификация области Рс 1§01 для получения тЛЫ-тЛЬЗ

Антитело	Модификация области Гс 1дС1	Аминокислотная последовательность области Гс
юАМ	Ν2 97Α	ЗЕО Ю ЫО:17
юАЬ2	Ц2 65А	ЗЕО Ю ЫО:18
тАЬЗ	Ц234А/Ц235А	ЗЕО Ю N0:19

Другие антитела по изобретению включают таковые, имеющие аминокислоты, которые были мутированы делецией, вставкой или заменой аминокислот, и, тем не менее, имеют по меньшей мере 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичности с областями ν_Η и СЫг12.12, соответственно 8Еф ГО N0: 7 и 8Еф ГО N0: 8, и включающие молчащую область Рс 1§С, например молчащую область Рс 1§О1.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело по изобретению представляет собой мутантный вариант любого из тАЬ1-тАЬ3, где указанное антитело мутантного варианта включает мутантную аминокислотную последовательность, где не более чем 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот были мутированы делецией, вставкой или заменой аминокислот в областях ν_Η и ν₂ при сравнении с областями ν_Η и V,, С1йг12.12, соответственно 8Еф ГО N0: 7 и 8Еф ГО N0: 8 и сохраняя те же самые константные области как тАЬ1, тАЬ2 или тАЬЗ.

Полноразмерные нуклеотидные кодирующие последовательности легкой и тяжелой цепи тАЬ1тАЬ3 представлены в табл. 3 ниже.

Таблица 3

Полноразмерные кодирующие ДНК-последовательности тяжелой и легкой цепи

Антитело	Полноразмерная кодирующая ДНК- последовательность тяжелой цепи	Полноразмерная кодирующая ДНК- последовательность легкой цепи
тАЫ	5Е0 Ю N0:22	ЗЕО Ы N0:23
тАЬ2	ЗЕО Ю N0:24	8Е0 Ю N0:25
тАЬЗ	5Е0 Ю N0:26	ЗЕО Ю N0:27

Другие нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела по изобретению, включают нуклеиновые кислоты, которые были мутированы нуклеотидной делецией, вставкой или заменой, и, тем не менее, имеют по меньшей мере 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичности кодирующим областям ν_Η и V,, СЫг12.12, как отображено в последовательностях, описанных, например, в 8Еф ГО N0: 20 и 8Еф ГО N0: 21 соответственно, и включая кодирующую последовательность молчащей области Рс 1§С, например, молчащей области Рс 1§01.

В некоторых вариантах осуществления, изобретение включает альтернативные варианты нуклеиновых кислот, где не более чем 1, 2, 3, 4 или 5 нуклеотидов были изменены нуклеотидной делецией, вставкой или заменой в кодирующих областях ν_Η и ν₂ с кодирующими областями ν_Η и Υ, представленных в последовательностях, описанных, например, в 8Еф ГО N0: 20 и 8Еф ГО N0: 21, соответственно, и сохраняя те же самые кодирующие последовательности константных областей как соответствующие кодирующие последовательности тАЬ1, тАЬ2 или тАЬЗ.

Гомологичные антитела

Помимо рекомбинантных антител по изобретению, тАЬ1-тАЬ3, изобретение также включает гомологичные антитела или белки, сохраняющие заданные функциональные свойства антител тАЬ1тАЬ3.

В частности, указанные гомологичные антитела или белки по изобретению представляют собой антитела или белки, включающие антигенсвязывающую часть антитела, направленного на целевой полипептид СГО40 (8Еф ГО N0: 28), характеризуемое тем, что указанное антитело или белок:

a) связывается с полипептидом СГО40 с К_с, равной 10 нМ или менее, и

b) включает молчащую область Рс 1дС, и где указанные гомологичные антитела или белки сохраняют заданные функциональные свойства исходных антител тАЬ1-тАЬ3.

Заданные функциональные свойства исходных антител тАЬ1-тАЬ3 могут быть выбраны из одного или нескольких следующих свойств:

(ί) специфически связывает СГО40. например, величина К_с равна 100 нМ или менее, 10 нМ или менее либо 1 нМ или менее, измеряемая методом В1асоге;

(ίί) является антагонистом ΤΌ40, например, оно ингибирует индуцированное СП40Ь проведение сигнала, измеряемое анализом СП40Ь-опосредованной пролиферации РВМС;

(ίίί) проявляет низкую агонистическую активность или не проявляет вовсе, измеряемую анализом СП40Ь-опосредованной пролиферации РВМС;

- 7 026133 (ίν) перекрестно реагирует с полипептидом СГО40 яванского макака;

(ν) имеет низкую активность ЛЭСС или вовсе ее не имеет и (νί) имеет подходящие свойства для разработки лекарственного средства.

В одном конкретном варианте осуществления изобретения указанные гомологичные антитела или белки по изобретению включают молчащую область Рс 1дС1, например, молчащую область Рс 1дС1, выбранную из группы, состоящую из 8Еф ГО N0: 17, 8Еф ГО N0: 18 или 8Еф ГО N0: 19.

В одном конкретном варианте осуществления изобретение относится к антителу или белку, которые имеют нуклеотидные последовательности вариабельной области тяжелой и легкой цепи, или аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой и легкой цепи, или аминокислотные последовательности или нуклеотидные кодирующие последовательности всех 6 СОК, которые гомологичны соответствующим аминокислотным или нуклеотидным последовательностям антител тЛЫ-тЛЬЗ, описанных выше, в частности, в табл. 1, и указанное антитело или белок включает молчащую область Рс 1§С, выбранную из группы, состоящую из области Рс тАЬ1 (8Еф ГО N0: 17), области Рс тАЬ2 (8Еф ГО N0: 18) и области Рс тАЬЗ (8Еф ГО N0: 19), где указанное гомологичное антитело или белок специфически связывается с СГО40. и антитело или белок обладает следующими функциональными свойствами: является антагонистом СО40, обладает низкой агонистической активностью или не обладает ею вовсе, и имеет низкую активность ЛЭСС или не имеет ее вовсе.

Например, изобретение относится к антителам или белкам, гомологичным тАЬ1-тАЬ3, включающим молчащую область Рс 1§С, выбранную из группы, состоящую из области Рс тАЬ1 (8Еф ГО N0: 17), области Рс тАЬ2 (8Еф ГО N0: 18) и области Рс тАЬЗ (8Еф ГО N0: 19), и включающим последовательности вариабельной тяжелой цепи (Ун) и вариабельной легкой цепи (Уь), где последовательности СОК имеют по меньшей мере 60, 70, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичности соответствующим последовательностям СОК тАЬ1-тАЬ3, соответственно 8Еф ГО N0: 1-6, где указанное гомологичное антитело или белок специфически связывается с СО40, и гомологичное антитело или белок обладает следующими функциональными свойствами: является антагонистом СО40, обладает низкой агонистической активностью или не обладает ею вовсе, и имеет низкую активность АЭСС или не имеет ее вовсе.

В соответствующем конкретном варианте осуществления изобретения гомологичное антитело или белок:

a) связывает СГО40 с К_с, равной 1 нМ или менее;

b) ингибирует индуцированное СН40Ь проведение сигнала с величиной 1С₅₀, равной 50 нг/мл или менее, измеренное в анализе СН40Ь-опосредованной пролиферации РВМС, описанном в примерах;

c) имеет низкую агонистическую активность или не имеет ее вовсе, измеренную в биоанализе, таком как анализ СН40Ь-опосредованной пролиферации РВМС, как описано в примерах;

ά) имеет низкую активность АЭСС или не имеет ее вовсе.

Кроме того, изобретение относится к антителам или белкам, гомологичным тАЬ1-тАЬ3, включающим молчащую область Рс 1§С, выбранную из группы, состоящую из области Рс тАЬ1 (8Еф ГО N0: 17), области Рс тАЬ2 (8Еф ГО N0: 18) и области Рс тАЬЗ (8Еф ГО N0: 19), и включающим последовательности вариабельной тяжелой цепи (У_н) и вариабельной легкой цепи (Уь), которые имеют по меньшей мере 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичности соответствующим последовательностям (У_н) и (Уь) тАЬ1-тАЬ3, соответственно 8Еф ГО N0: 7 и 8Еф ГО N0: 8, где указанное гомологичное антитело или белок специфически связывает СО40, и антитело или белок обладает следующими функциональными свойствами: является антагонистом СО40, обладает низкой агонистической активностью или не обладает ею вовсе, и имеет низкую активность АЭСС или не имеет ее вовсе.

В соответствующем конкретном варианте осуществления изобретения указанное гомологичное антитело или белок:

a) связывает СГО40 с К_с, равной 1 нМ или менее;

b) ингибирует индуцированное СН40Ь проведение сигнала с величиной 1С₅₀, равной 50 нг/мл или менее, измеренное в анализе СН40Ь-опосредованной пролиферации РВМС, описанном в примерах;

c) имеет низкую агонистическую активность или не имеет ее вовсе, измеренную в биоанализе, таком как анализ СН40Ь-опосредованной пролиферации РВМС, описанный в примерах;

ά) имеет низкую активность АЭСС или не имеет ее вовсе.

В другом примере изобретение относится к антителам или белкам, гомологичным тАЬ1-тАЬ3, включающим молчащую область Рс 1§С, выбранную из группы, состоящую из области Рс тАЬ1 (8Еф ГО N0: 17), области Рс тАЬ2 (8Еф ГО N0: 18) и области Рс тАЬ3 (8Еф ГО N0: 19), и где вариабельные тяжелые и легкие цепи кодируются нуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или на 100% идентична соответствующей кодирующей нуклеотидной последовательности вариабельным тяжелой и легкой цепям тАЬ1-тАЬ3, где указанное гомологичное антитело или белок специфически связывает СО40, и антитело или белок обладает следующими функциональными свойствами: является антагонистом СО40, обладает низкой агонистической активностью или не обладает ею вовсе, и имеет низкую активность АЭСС или не имеет ее вовсе.

В соответствующем конкретном варианте осуществления изобретения указанное гомологичное антитело или белок:

- 8 026133

a) связывает С’040 с К_с, равной 1 нМ или менее;

b) ингибирует индуцированное СО40Ь проведение сигнала с величиной 1С₅₀, равной 50 нг/мл или менее, измеренное в анализе СО40Ь-опосредованной пролиферации РВМС, описанном в примерах;

c) имеет низкую агонистическую активность или не имеет ее вовсе, измеренную в биоанализе, таком как анализ СО40Ь-опосредованной пролиферации РВМС, описанный в примерах;

ά) имеет низкую активность АЭСС или не имеет ее вовсе.

Антитела с мутантными аминокислотными последовательностями могут быть получены мутагенезом (например, сайт-направленным или ПЦР-опосредованным мутагенезом) молекул кодирующей нуклеиновой кислоты с последующим тестированием кодируемого измененного антитела на предмет сохраненной функции (т.е. изложенных выше функций), используя функциональные анализы, описанные в примерах ниже.

В определенных вариантах осуществления изобретения антитела или белки, гомологичные тАЬ1тАЬ3, как описано выше, имеют консервативные модификации последовательности.

Термин консервативные модификации последовательности в том смысле, в котором он здесь используется, предназначен для обозначения аминокислотных замен, в которых аминокислотные остатки замещены аминокислотными остатками, имеющими сходную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих сходные боковые цепи, были определены в данной области техники. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислые боковые цепи (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженные полярные боковые цепи (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярные боковые цепи (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилалалин, метионин), бета-разветвленные боковые цепи (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматические боковые цепи (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, один или несколько аминокислотных остатков внутри областей СОК антитела по изобретению могут быть замещены другими аминокислотными остатками из того же самого семейства боковых цепей, и измененное антитело может быть протестировано на предмет сохраненной функции, используя функциональные методы анализа, описанные в настоящем документе.

Модификации могут быть внесены в антитело по изобретению стандартными методами, известными в данной области техники, такими как сайт-направленный мутагенез и ПЦР-опосредованный мутагенез.

Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие антитела или белки по изобретению

Другой аспект изобретения относится к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют антитела или белки по изобретению, как описано выше.

Примеры нуклеотидных последовательностей легкой и тяжелой цепей любого из тАЬ1-тАЬ3 могут быть получены из табл. 3 (демонстрирующей полные нуклеотидные кодирующие последовательности тяжелой и легкой цепей тАЬ1-тАЬ3).

Другие примеры нуклеотидных последовательностей легкой и тяжелой цепей по изобретению представляют собой любую последовательность, кодирующую аминокислотные последовательности полноразмерной тяжелой и/или легкой цепей тАЬ1, тАЬ2 или тАЬ3, как описано в табл. 1.

Изобретение также относится к молекулам нуклеиновых кислот, которые получают из последних последовательностей, будучи оптимизированными для экспрессии белка в клетках млекопитающих, например, клеточных линиях СНО.

Нуклеиновые кислоты могут присутствовать в цельных клетках, в клеточных лизатах или могут быть нуклеиновыми кислотами в частично очищенном или практически чистом виде. Нуклеиновая кислота является выделенной или находится в практически чистом виде, когда очищена от других клеточных компонентов или других примесей, например, других клеточных нуклеиновых кислот или белков, стандартными методами, включая обработку щелочью/δΏδ, фракционирование в С§С1, колоночная хроматография, электрофорез в агарозном геле и другие хорошо известные в данной области техники методы. См. Р. Аи8иЬе1, с1 а1., ей. 1987, СиггеШ РгоЮсоК ίη Мо1еси1аг Βίοίο^ν. Сгееие РиЫЫйпд аий \УПеу 1п1сг5с1спсс. №\ν Уогк. Нуклеиновая кислота по изобретению может быть, например, ДНК или РНК и может содержать или не содержать последовательности интронов. В варианте осуществления изобретения нуклеиновая кислота представляет собой молекулу кДНК. Нуклеиновая кислота может находиться в составе вектора, таком как вектор фагового дисплея, или в рекомбинантном плазмидном векторе.

Нуклеиновые кислоты по изобретению могут быть получены, используя стандартные методы молекулярной биологии. Как только получают фрагменты ДНК, кодирующие, например, сегменты Ун и У_ь, в дальнейшем можно проводить манипуляции с этими фрагментами ДНК стандартными технологиями рекомбинантной ДНК, например, для преобразования генов вариабельной области в гены полноразмерной цепи антитела, гены фрагмента РаЬ или гена 8сРу. При этих манипуляциях, У_ь- или У_н-кодирующий фрагмент ДНК функционально связан с другой молекулой ДНК или с фрагментом, кодирующим константную область антитела тАЬ1-тАЬ3, включающую область Рс согласно 5>ЕО ГО N0: 17-19.

Термин функционально связанный в том смысле, в котором он используется в этом контексте, означает, что два фрагмента ДНК соединены функционально, например, таким образом, что аминокислот- 9 026133 ные последовательности, кодируемые двумя фрагментами ДНК, остаются внутри рамки считывания, или таким образом, что белок экспрессируется под контролем заданного промотора.

Выделенная ДНК, кодирующая область У_н, может быть преобразована в ген полноразмерной тяжелой цепи путем функционального связывания ^-кодирующей ДНК с другой молекулой ДНК, кодирующей константные области тяжелой цепи (СН1, СН2 и СНЗ). Последовательности генов константной области тяжелой цепи человека известны в данной области техники (см., например, КаЪа1. Е.А., е1 а1., 1991, 8сс.1испес5 оГ Ρτοΐβίηδ оГ 1ттипо1ощса1 1п1сгс51. ΡίΓιΗ ЕбШоп, и.8. ОераПтеЩ оГ НеаИЬ аиб Нитап 8сг\аес5. Ы1Н РиЪНсабоп Ыо. 91-3242), и фрагменты ДНК, содержащие эти области, могут быть получены стандартной ПЦР-амплификацией. Константная область тяжелой цепи может быть выбрана среди изотипов 1дС1, включающих область Рс согласно 8Еф ГО N0: 17-19.

Выделенная ДНК, кодирующая область Уь, может быть преобразована в ген полноразмерной легкой цепи (а также в ген легкой цепи РаЪ) путем функционального связывания νΕ-кодирующей ДНК с другой молекулой ДНК, кодирующей константную область легкой цепи, СЬ. Последовательности генов константной области легкой цепи человека хорошо известны в данной области техники (см., например, КаЬа1. Е.А., е1 а1., 1991 8ес.1иепсе5 оГ РгоЮнъ оГ 1ттипо1офса1 1и1ете81, ΡίΓιΗ Ебйюп, и.8. ОераПтеЩ оГ НеаИЬ аиб Нитап 8егуюе8, Ы1Н РиЪЬсайоп Ыо. 91-3242), и фрагменты ДНК, содержащие эти области, могут быть получены стандартной ПЦР-амплификацией. Константная область легкой цепи может представлять собой константную область каппа или лямбда.

Получение трансфертом, продуцирующих моноклональные антитела

Антитела или белки по изобретению могут быть получены в трансфектоме клетки-хозяина, используя, например, сочетание технологии рекомбинантной ДНК и методов генной трансфекции так, как это известно в данной области техники (например, Моткоп, 8. (1985), 8тепсе 229:1202).

Например, для экспрессии антител, молекулы ДНК, кодирующие частичные или полноразмерные легкие и тяжелые цепи, могут быть получены стандартными методами молекулярной биологии или биохимии (например, химическим синтезом ДНК, ПЦР-амплификацией или клонированием кДНК, используя гибридому, которая экспрессирует представляющий интерес антитело) и молекулы ДНК могут быть вставлены в экспрессионные векторы так, что гены становятся функционально связанными с контролирующими транскрипцию и трансляцию последовательностями. В этой связи, термин функционально связанный означает, что ген антитела вставлен в вектор таким образом, что контролирующие транскрипцию и трансляцию последовательности внутри вектора выполняют заданные им функции регуляции транскрипции и трансляции гена антитела. Экспрессионный вектор и контролирующие экспрессию последовательности выбирают так, чтобы они были совместимы с используемой в целях экспрессии клеткой-хозяином. Г ен легкой цепи антитела и ген тяжелой цепи антитела могут быть вставлены в отдельные векторы или, в большинстве случаев, оба гена вставлены в один и тот же экспрессионный вектор.

Гены антител вставляют в экспрессионный вектор стандартными методами (например, лигированием комплементарных сайтов рестрикции во фрагменте гена антитела и векторе, или лигирование по тупым концам, если нет в наличии сайтов рестрикции). Вариабельные области легкой и тяжелой цепи антител, описанные в настоящем документе, могут быть использованы для создания генов полноразмерного антитела путем их вставки в экспрессионные векторы, уже кодирующие константные области тяжелой цепи и константные области легкой цепи заданной последовательности, соответствующей указанным константным областям тАЪ1, тАЪ2 или тАЪЗ, так, что сегмент У_н функционально связан с сегментом(ами) С_Н внутри вектора и сегмент νΕ функционально связан с сегментом С_ъ внутри вектора. Дополнительно или альтернативно, рекомбинантный экспрессионный вектор может кодировать сигнальный пептид, который облегчает секрецию цепи антитела из клетки-хозяина. Ген цепи антитела может быть клонирован в вектор таким образом, что сигнальный пептид связан в рамке считывания с амино-концом цепи антитела. Сигнальный пептид может быть иммуноглобулиновым сигнальным пептидом или гетерологичным сигнальным пептидом (например, сигнальным пептидом из белков неиммуноглобулинового происхождения).

Помимо генов цепей антитела, рекомбинантные экспрессионные векторы по изобретению несут регуляторные последовательности, которые контролируют экспрессию генов цепей антитела в клеткехозяине. Термин регуляторная последовательность предусмотрен для включения промоторов, энхансеров и других элементов контроля экспрессии (например, сигналы полиаденилирования), которые контролируют транскрипцию или трансляцию генов цепей антитела. Такие регуляторные последовательности описаны, например, в Соеббе1 (Сепе Ехртеккюп ТесЬпо1о§у. Мебюбк ш Еп/уто1оду 185, Асабеннс Ргекк, 8ап П1едо, СА 1990). Специалистам в данной области техники ясно, что дизайн экспрессионного вектора, включая выбор регуляторных последовательностей, может зависеть от таких факторов, как выбор клетки-хозяина, подлежащей трансформации, уровень экспрессии целевого белка, и т.д. Регуляторные последовательности для экспрессии в клетке-хозяине млекопитающих включает вирусные элементы, которые контролируют высокие уровни экспрессии белка в клетках млекопитающих, как, например, промоторы и/или энхансеры, полученные из цитомегаловируса (СМС/ вируса обезьяны 40 (8ν40), аденовируса (например, основной поздний промотор аденовируса (АбМЬР) и вируса полиомы. Альтернативно, могут быть использованы регуляторные последовательности невирусного происхождения, такие

- 10 026133 как промотор убиквитина или Р-глобиновый промотор. Более того, регуляторные элементы состоят из последовательностей из различных источников, такие как промоторная система 8Ка, которая содержит последовательности из раннего промотора 8У40 и длинного терминального повтора вируса типа 1 Тклеточной лейкемии человека (ТакеЬе, Υ. е! а1., 1988, Мо1. Се11. ΒίοΙ. 8:466-472).

Помимо генов цепей антител и регуляторных последовательностей, рекомбинантные экспрессионные векторы по изобретению могут содержать дополнительные последовательности, такие как последовательности, которые регулируют репликацию вектора в клетках-хозяевах (например, точка начала репликации) и селектируемые маркерные гены. Селектируемый маркерный ген облегчает селекцию клетокхозяев, в которые был введен вектор (см., например, патент США № 4399216, 4634665 и 5179017, автором всех патентов является Ахе1 е! а1.). Например, как правило, селектируемый маркерный ген придает устойчивость к лекарственным средствам, таким как 0418, гигромицин или метотрексат, клетке-хозяину, в которую был введен вектор. Селектируемые маркерные гены включают ген дигидрофолатредуктазы (ΌΗΡΚ) (для использования в йЬГг- клетках-хозяевах с метотрексатной селекцией/амплификацией) и ген пео (для селекции 0418).

Для экспрессии легкой и тяжелой цепей клетку-хозяина трансфецируют экспрессионным(ми) вектором(ами), кодирующим(ими) тяжелые и легкие цепи, стандартными методами. Различные формы термина трансфекция предназначены для включения большого разнообразия методов, обычно используемых для введения экзогенной ДНК в прокариотическую или эукариотическую клетку-хозяина, например, электропорации, кальций-фосфатной преципитации, ПЕАЕ-декстрановой трансфекции и т.п. Теоретически возможно экспрессировать антитела по изобретению либо в прокариотической, либо в эукариотической клетке-хозяине. Экспрессия антител в эукариотических клетках, например, клетках-хозяевах млекопитающих, дрожжах или мицелиальных грибах, обсуждается, поскольку такие эукариотические клетки и, в частности, клетки млекопитающих чаще, чем прокариотические клетки, осуществляют сборку и секрецию правильно уложенного и иммунологически активного антитела.

В одном частном варианте осуществления изобретения, вектор клонирования или экспрессии по изобретению включает либо по меньшей мере одну из нижеприведенных кодирующих последовательностей (а)-(с), функционально связанных с подходящими промоторными последовательностями:

(a) 8Е0 ГО N0: 22 и 8Е0 ГО N0: 23, кодирующие, соответственно, полноразмерные тяжелые и легкие цепи тАЬ1;

(b) 8Е0 ГО N0: 24 и 8Е0 ГО N0: 25, кодирующие, соответственно, полноразмерные тяжелые и легкие цепи тАЬ2; или (c) 8Е0 ГО N0: 26 и 8Е0 ГО N0: 27, кодирующие, соответственно, полноразмерные тяжелые и легкие цепи тАЬ3.

Клетки-хозяева млекопитающих для экспрессии рекомбинантных антител по изобретению, включают клетки яичника китайского хомячка (клетки СНО) (включая йПГг- клетки СНО, описанные Иг1аЬ и СЬа81п, 1980, Ргос. №Н. Асай. 8сЕ И8А 77:4216-4220, используемые с ΌΗ РК селектируемым маркером, например, как описано в К.1. КаиГтап и Р.А. 8Ьагр, 1982, Мо1. Βίο1. 159:601-621), СН0К1 йЬГг+ клеточные линии, N80 клетки шеломы, клетки С08 и клетки 8Р2. В частности, для использования с N80 клетками миеломы, другой экспрессионной системой является система экспрессии гена 08, представленная в публикациях РСТ \\'0 87/04462, \\'0 89/01036 и ЕР 0338841.

При введении рекомбинантных экспрессионных векторов, кодирующих гены антител, в клеткихозяева млекопитающих, антитела продуцируются культивируемыми клетками-хозяевами в течение периода времени, достаточного для обеспечения возможности экспрессии антитела в клетках-хозяевах или секреции антитела в культуральную среду, в которой выращивают клетки-хозяева. Антитела могут быть извлечены из культуральной среды, используя стандартные методы очистки белка (см., например, АЬЫпау е! а1. 2007, 1оигпа1 оГ СЬгота1одгарйу 848: 28-37).

В одном частном варианте осуществления изобретения клетка-хозяин по изобретению является клеткой-хозяином, трансфецированной экспрессионным вектором, имеющим кодирующие последовательности, выбранные из группы, состоящей из (а)-(с), пригодные для экспрессии тАЬ1-тАЬ3, соответственно, функционально связанные с пригодными последовательностями промотора:

(a) 8ЕО ГО N0: 22 и 8ЕО ГО N0: 23;

(b) 8ЕО ГО N0: 24 и 8ЕО ГО N0: 25;

(c) 8ЕО ГО N0: 26 и 8ЕО ГО N0: 27.

Последние из упомянутых клеток-хозяев затем могут дополнительно культивироваться в пригодных условиях для экспрессии и продукции антитела по изобретению, выбранного из группы, состоящей из тАЬ1-тАЬ3 соответственно.

- 11 026133

Биспецифические молекулы

В другом аспекте настоящее изобретение представляет биспецифические или мультиспецифические молекулы, включающие антитело анти-СИ40 или белок по изобретению. Антитело или белок по изобретению могут образовать производное или быть присоединенными к другой функциональной молекуле, например, другому пептиду или белку (например, другому антителу или лиганду для рецептора), для образования биспецифической молекулы, которая связывается по меньшей мере с двумя различными сайтами связывания или молекулами-мишенями. Антитело по изобретению может фактически быть производными или быть связанным с более чем одной другой функциональной молекулой для образования мультиспецифических молекул, которые связываются с более чем двумя различными сайтами связывания и/или молекулами-мишенями; такие мультиспецифичные молекулы также попадают под термин биспецифическая молекула в том смысле, в котором он используется в настоящем документе. Для создания биспецифической молекулы по изобретению, антитело или белок по изобретению могут быть функционально связаны (например, химическим присоединением, генетическим сцеплением, нековалентной связью или иным способом) с одной или несколькими другими связывающими молекулами, такими как другим антителом, фрагментом антитела, пептидом или миметиком связывания, таким образом, чтобы в результате получить биспецифическую молекулу.

В этой связи настоящее изобретение включает биспецифическую молекулу, включающую по меньшей мере одну специфическую молекулу связывания для СИ40, например, одну антигенсвязывающую часть любого из шАЫ-шАЬЗ, и вторую специфическую молекулу связывания для второго эпитопа мишени.

Например, второй эпитоп мишени представляет собой другой эпитоп ί'.Ό40. отличный от первого эпитопа мишени. Другим примером является биспецифическая молекула, включающая по меньшей мере одну первую специфическую молекулу связывания СЭ40, например, одну антигенсвязывающую часть любого из тАЬ1-тАЬ3, и вторую специфическую молекулу связывания для эпитопа внутри СЭ40.

Кроме того, в случае изобретения, в котором биспецифическая молекула является мультиспецифичной, молекула может дополнительно включать третью специфическую молекулу связывания в дополнение к первому и второму эпитопу мишени.

Биспецифические молекулы настоящего изобретения могут быть получены путем объединения составных частей специфических молекул связывания, используя методы, известные в данной области техники. Например, каждая специфическая молекула связывания биспецифической молекулы может быть получена отдельно и затем объединена друг с другом. Когда специфические молекулы связывания являются белками или пептидами, разнообразные объединяющие или перекрестно-связывающие агенты могут быть использованы для ковалентного соединения. Примеры перекрестно-реагирующих агентов включают белок А, карбодиимид, Ы-сукцинимидил-8-ацетилтиоацетат (§АТА), 5,5'-дитио-бис-(2нитробензойная кислота) (ΌΤΝΒ), о-фенилендималеимид (οΡΌΜ), Ы-сукцинимидил-3-(2пиридилдитио)пропионат (8ΡΌΡ) и сульфосукцинимидил 4-^-малеимидометил)циклогексан-1карбоксилат (сульфо-8МСС) (см., например, Кагроукку е! а1., 1984, 1. Ехр. Меб. 160:1686; Ьш, МА е! а1., 1985, Ргос. Ν;·ι11. Асаб. §ск И8А 82:8648). Другие методы включают те, что описаны в Раи1ик, 1985, Вейгшд 1ик. Μίΐΐ. Νο. 78, 118-132; Вгеппап е! а1., 1985 §шеисе 229:81-83), и О1еише е! а1., 1987, 1. 1ттипо1. 139:2367-2375). Конъюгирующими агентами являются §АТА и сульфо-8МСС, имеющиеся в наличие в Р1егсе Сйешюа1 Со. (Коск&гб, Ш).

Когда специфическими молекулами связывания являются антитела, они могут быть конъюгированы посредством связывания сульфгидрильных групп С-концевых шарнирных областей двух тяжелых цепей. В частном варианте осуществления изобретения, шарнирную область модифицируют с целью содержания нечетного числа сульфгидрильных групп, например одной, до конъюгирования.

Альтернативно, обе специфических молекул связывания могут быть кодированы в одном и том же векторе, их экспрессия и сборка может происходить в одной и той же клетке-хозяине. Этот метод особенно удобен в том случае, когда биспецифическая молекула представляет собой тАЬхтАЬ, тАЬхРаЬ, РаЬхР(аЬ')₂ или лиганд х химерный белок РаЬ. Биспецифическая молекула по изобретению может быть одноцепочечной молекулой, включающей одно одноцепочечное антитело и детерминанту связывания, или одноцепочечной биспецифической молекулой, включающей две детерминанты связывания. Биспецифические молекулы могут включать по меньшей мере две одноцепочечные молекулы. Методы получения биспецифических молекул описаны, например, в патенте США № 5260203; патенте США № 5455030; патенте США № 4881175; патенте США № 5132405; патенте США № 5091513; патенте США № 5476786; патенте США № 5013653; патенте США № 5258498 и патенте США № 5482858.

Связывание биспецифических молекул с их специфическими мишенями может быть подтверждено, например, иммуносорбентным ферментным анализом (ЕЬ1§А), радиоиммунологическим анализом (КЕА), методом с использованием клеточного сортера с возбуждением флуоресценции (РАС8), биоанализом (например, ингибированием роста) или анализом Вестерн-блот. Каждый из этих анализов, в основном, определяет наличие представляющих особый интерес комплексов белок-антитело путем использования меченого реагента (например, антитела), специфичного к исследуемому комплексу.

- 12 026133

Мультивалентные антитела

В другом аспекте настоящее изобретение представляет мультивалентные антитела, включающие по меньшей мере две идентичные или отличные друг от друга антигенсвязывающие части антител по изобретению, связывающиеся с ί'.Ό40. например, выбранные из антигенсвязывающих частей любого из тЛЫ-тЛЬЗ. В одном варианте осуществления изобретения мультивалентные антитела обладают по меньшей мере двумя, тремя или четырьмя антигенсвязывающими частями антител. Антигенсвязывающие части могут быть связаны друг с другом посредством белкового сцепления или ковалентной или нековалентной связи. Альтернативно, методы соединения были описаны для биспецифических молекул. Четырехвалентные соединения могут быть получены, например, антителом, перекрестно связывающим антитела по изобретению, которое связывается с константными областями антител по изобретению, например, областью Рс или шарнирной областью.

Методы терапии, используя антагонистические анти-СБ40 антитела по изобретению

Методы изобретения направлены на использование анти-СЭ40 антител или белков по изобретению для лечения субъектов (например, пациентов), имеющих аутоиммунное заболевание и/или воспалительное заболевание, или предрасположенность к развитию аутоиммунного заболевания и/или воспалительного заболевания, где заболевание и/или воспаление опосредовано СО40Ь-опосредованным проведением сигнала ί'.Ό40 в клетках, экспрессирующих антиген СЭ40.

Методы определения экспрессии ί'.Ό40 в клетках хорошо известны в данной области техники и включают, помимо прочего, метод ПЦР, иммуногистохимию, проточную цитометрию, Вестерн-блот, ЕЫ8А и др.

Методы по изобретению особенно пригодны для лечения воспалительных и/или аутоиммунных заболеваний, где вовлечена СП40Ь-опосредованная стимуляция СЭ40.

Воспалительные заболевания характеризуются воспалением и деструкцией ткани или сочетанием этих двух процессов. Воспалительное заболевание включает любой воспалительный иммуноопосредованный процесс, где инициирующий фактор или мишень иммунного ответа включает чужой(ие) антиген(ы), включая, например, аллоантигены, ксеноантигены, вирусные антигены, бактериальные антигены, неизвестные антигены или аллергены.

Более того, в контексте настоящего изобретения, термин воспалительное(ые) заболевание(я) включает аутоиммунное(ые) заболевание(я). Под термином аутоиммунная реакция, в том смысле, в котором он используется в настоящем документе, в основном, понимают воспалительные иммуноопосредованные процессы, вовлекая собственные антигены. При аутоиммунных заболеваниях собственный(ые) антиген(ы) запускает иммунные ответы хозяина.

Кроме того, настоящее изобретение включает лечение воспаления, связанного с отторжением тканевого трансплантата. Отторжение трансплантата или отторжение пересаженного лоскута ткани относится к любому характерному для хозяина иммунному ответу против трансплантата, включая, помимо прочего, НЕА-антигены, антигены группы крови и т.п.

Изобретение также может быть использовано для лечения реакции трансплантат против хозяина таким же образом, как при трансплантации костного мозга, например. При такой реакции трансплантат против хозяина костный мозг донора включает лимфоциты и клетки, которые дифференцируются в лимфоциты. Лимфоциты донора распознают антигены реципиента как чужие и осуществляют воспалительный иммунный ответ. В связи с этим, патологический процесс трансплантат против хозяина в том смысле, в котором используется в настоящем документе, или реакция трансплантат против хозяина относится к любому Т-клеточно-опосредованному иммунному ответу, в котором лимфоциты донора реагируют на антигены хозяина.

Антагонистические анти-СЭ40 антитела или белки, описанные в настоящем документе, например тАЬ1, тАЬ2 или тАЬЗ, могут быть использованы в соответствии с методами изобретения для лечения аутоиммунных и/или воспалительных нарушений, включая, помимо прочего, системную красную волчанку (8ЬЕ), дискоидную волчанку, волчаночный нефрит, саркоидоз, воспалительный артрит, включая болезнь Стилла, ревматоидный артрит, псориатический артрит, синдром Рейтера, анкилозирующий спондилоартрит и подагрический артрит, отторжение трансплантата органа или ткани, сверхострое, острое или хроническое отторжение и/или реакцию трансплантат против хозяина, рассеянный склероз, синдром гипериммуноглобулинемии Е, узелковый полиартериит, первичный биллиарный цирроз, воспалительную болезнь кишечника, болезнь

Крона, целиакию (глютенчувствительную энтеропатию), первичный синдром Шегрена (ρδδ), аутоиммунный гепатит, пернициозную анемию, аутоиммунную гемолитическую анемию, псориаз, склеродермию, миастению гравис, аутоиммунную тромбоцитопеническую пурпуру, аутоиммунный тиреоидит, базедову болезнь, тиреоидит Хашимото, болезнь иммунных комплексов, хроническую усталость, синдром иммунной дисфункции (ΕΡΙΌδ), полимиозит и дерматомиозит, криоглобулинемию, тромболизис, кардиомиопатия, вульгарную пузырчатку, легочный интерстициальный фиброз, сахарный диабет типа 1 и типа 2, гиперчувствительность замедленного типа 1, 2, З и 4 типов, аллергию или аллергические нарушения, нежелательные/непредусмотренные иммунные ответы на терапевтические белки (см., например, патентную заявку США № υδ 2002/0119151 и Когеп е! а1. (2002), Сигг. РЬатт. Вю1есЬпо1. 3:349-60), аст- 1З 026133 му, синдром Чарга-Стросса (аллергический гранулематоз), атопический дерматит, аллергический и ирритативный контактный дерматит, крапивницу, 1дЕ-опосредованную аллергию, атеросклероз, АКСАассоциированные васкулиты, васкулит, идиопатические воспалительные миопатии, гемолитическая болезнь, болезнь Альцгеймера, хроническую воспалительную демиелинизирующую полинейропатию и т.п.

Ранее было показано, что генетическая абляция или фармакологическое ингибирование сигнального пути ί'.Ό40-ΤΌ154 оказывают терапевтический положительный эффект либо в клинических, либо доклинических моделях 8ЬЕ, ρδδ, ΙΤΡ, Μδ, болезни Крона, вульгарной пузырчатки, аутоиммунного васкулита и КА (Ьате С.Ь., Сге\\а1 Ιδ. (2009), Αάν. Ехр. Мей. ΒίοΙ. 2009; 647:8-36); медицинская потребность которых детально описана ниже.

В предпочтительных вариантах осуществления изобретения анти-СЭ40 антитела или белки по изобретению пригодны для лечения: (ί) системной красной волчанки (волчаночного нефрита), предпочтительно для обеспечения эффективной стероид-сберегающей терапии для индукции и поддержания ремиссии и для предотвращения терминальной стадии почечной недостаточности; (ίί) первичного синдрома Шегрена, предпочтительно в предотвращении деструкции слюнных и слезных желез, и индукции и поддержании ремиссии экстрагландулярных проявлений; (ίίί) аутоиммунной тромбоцитопенической пурпуры, предпочтительно для лечения пациентов, трудно поддающихся стандартной терапии; (ίν) ΑΝСА-ассоциированных васкулитов, предпочтительно индуцируя и поддерживая ремиссию у пациентов, трудно поддающихся терапии кортикостероидами и стероидами в умеренных дозах; (ν) вульгарной пузырчатки, предпочтительно для индукции и поддержания ремиссии у пациентов, трудно поддающихся терапии кортикостероидами и стероидами в умеренных дозах; (νί) рассеянного склероза, предпочтительно для обеспечения более эффективного лечения с целью предотвращения рецидивов и прогрессирования нетрудоспособности, и для достижения нормального состояния здоровья; (νίί) болезни Крона, предпочтительно для обеспечения более эффективной терапии для поддержания ремиссии, и для лечения пациентов, трудно поддающихся терапии анти-ΤΝΡ.

В некоторых других вариантах осуществления изобретения, анти-СЭ40 антитела или белки по изобретению пригодны для лечения воспалительных заболеваний легких, включая, помимо прочего, отторжение легочного трансплантата, астму, саркоидоз, эмфизему, муковисцидоз, идиопатический фиброз легких, хронический бронхит, аллергический ринит и аллергические заболевания легких, такие как аллергический альвеолит, эозинофильная пневмония, облитерирующий бронхиолит вследствие трансплантации костного мозга и/или легкого или других причин, атеросклероз/флебосклероз вследствие тканевой трансплантации, а также фиброз легких в результате коллагеновых, сосудистых и аутоиммунных заболеваний, таких как ревматоидный артрит, склеродермия и красная волчанка.

Лечение в настоящем документе означает применение или назначение анти-СЭ40 антитела или белка по изобретению, например антитело тАЫ, тАЬ2 или тАЬЗ, субъекту, или применение или назначение фармацевтической композиции, включающей указанное анти-СЭ40 антитело или белок по изобретению, в отношении выделенной ткани или клеточной линии из субъекта, где субъект имеет аутоиммунное заболевание и/или воспалительное заболевание, симптом, ассоциированный с аутоиммунным заболеванием и/или воспалительным заболеванием, или предрасположенность к развитию аутоиммунного заболевания и/или воспалительного заболевания, где целью является исцеление, заживление, облегчение состояния, ослабление симптомов, внесение изменений, лечение, улучшение, нормализация и воздействие на аутоиммунное заболевание и/или воспалительное заболевание, любые ассоциированные симптомы аутоиммунного заболевания и/или воспалительного заболевания, или на предрасположенность к развитию аутоиммунного заболевания и/или воспалительного заболевания.

Под термином лечение также подразумевают применение или назначение фармацевтической композиции, включающей анти-СЭ40 антитела или белок по изобретению, например, антитело тАЬ1, тАЬ2 или тАЬ3, субъекту, или применение или назначение фармацевтической композиции, включающей указанное анти-СЭ40 антитело или белок по изобретению, в отношении выделенной ткани или клеточной линии из субъекта, где субъект имеет аутоиммунное заболевание и/или воспалительное заболевание, симптом, ассоциированный с аутоиммунным заболеванием и/или воспалительным заболеванием, или предрасположенность к развитию аутоиммунного заболевания и/или воспалительного заболевания, где целью является исцеление, заживление, облегчение состояния, ослабление симптомов, внесение изменений, лечение, улучшение, нормализация и воздействие на аутоиммунное заболевание и/или воспалительное заболевание, любые ассоциированные симптомы аутоиммунного заболевания и/или воспалительного заболевания, или на предрасположенность к развитию аутоиммунного заболевания и/или воспалительного заболевания.

Под противовоспалительной активностью подразумевают уменьшение или предотвращение воспаления. Терапия по меньшей мере одним анти-СЭ40 антителом или белком по изобретению вызывает физиологический ответ, который благотворно влияет на лечение аутоиммунного заболевания и/или воспалительного заболевания, где в заболевание вовлечены клетки, экспрессирующие СО40-антиген. Следует признать, что методы по изобретению могут быть пригодны для предотвращения фенотипических изменений клеток, таких как пролиферация, активация и т.п.

В соответствии с методами по настоящему изобретению по меньшей мере одно анти-СЭ40 антите- 14 026133 ло или белок по изобретению, как определено выше в настоящем документе, используется для стимуляции положительного терапевтического ответа в отношении лечения или предотвращения аутоиммунного заболевания и/или воспалительного заболевания.

Под положительным терапевтическим ответом в отношении аутоиммунного заболевания и/или воспалительного заболевания подразумевают улучшение течения заболевания в связи с противовоспалительной активностью этих антител или белков, и/или улучшение симптомов, ассоциированных с данным заболеванием. То есть можно наблюдать антипролиферативный эффект, предотвращение дальнейшей пролиферации СИ40-экспрессирующих клеток, уменьшение воспалительного ответа, включая, помимо прочего, сниженную секрецию цитокинов воспаления, молекул адгезии, протеаз, иммуноглобулинов (в примерах, где СИ40-экспрессирующей клеткой является В клетка), сочетание вышеперечисленного и тому подобное, повышенную продукцию противовоспалительных белков, уменьшение числа аутореактивных клеток, увеличение иммунной толерантности, ингибирование выживаемости аутореактивных клеток, и/или ослабление одного или нескольких симптомов, опосредованных стимуляцией СЭ40экспрессирующих клеток. Такие положительные терапевтические ответы не лимитированы способом применения и могут включать назначение донору, донорской ткани (как, например, перфузия органа), хозяину или сочетание вышеперечисленного и т.п.

Оценку клинического ответа можно получить, используя методы скрининга, такие как сканирование с помощью магнитной резонансной томографии (МЫ), рентгенография, сканирование с помощью компьютерной томографии (СТ), проточная цитометрия или анализ с использованием клеточного сортера с возбуждением флуоресценции (РАС8), гистология, макропатологическое исследование, биохимический анализ крови, включая, помимо прочего, изменения, детектируемые ЕЫ8А, ЫА, хроматографией и т.п. Помимо этих положительных терапевтических ответов, у субъекта, которому проводят терапию антагонистическим анти-СИ40 антителом или белком по изобретению, можно наблюдать положительное воздействие на симптомы, связанные с заболеванием.

Под терапевтически эффективной дозой или количеством или эффективным количеством подразумевают количество анти-СИ40 антитела или белка по изобретению, которое при применении вызывает положительный терапевтическое ответ в отношении лечения субъекта с аутоиммунным заболеванием и/или воспалительным заболеванием.

В некоторых вариантах осуществления изобретения терапевтически эффективная доза анти-СО40 антитела или белка по изобретению, например, тАЬ1, тАЬ2 или тАЬЗ, находится в диапазоне от 0,01 до 40 мг/кг, от 3 до 20 мг/кг или от 7 до 12 мг/кг. Следует признать, что метод лечения может включать единственное назначение терапевтически эффективной дозы или многократные назначения терапевтически эффективной дозы антагонистического анти-СЭ40 антитела или белка по изобретению.

Дополнительным вариантом осуществления изобретения является использование анти-СЭ40 антител или белков по изобретению для диагностического мониторирования уровней белка в ткани как часть процедуры клинических испытаний, например, определение эффективности определенной схемы лекарственной терапии. Определение может быть облегчено соединением антитела с детектируемым веществом. Примеры детектируемых веществ включают различные ферменты, простетические группы, флуоресцентные материалы, люминесцентные материалы, биолюминесцентные материалы и радиоактивные материалы. Примеры пригодных ферментов включают пероксидазу хрена, алкалинфосфатазу, Ргалактозидазу или ацетилхолинэстеразу; примеры пригодных комплексов простетических групп включают стрептавидин/биотин и авидин/биотин; примеры пригодных флуоресцентных материалов включают умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеинизотиоцианат, родамин, дихлортриазиниламинфлуоресцеин, дансилхлорид или фикоэритрин; пример люминесцентного материала включает люминол; примеры биолюминесцентного материала включают люциферазу, люциферин и экворин; примеры пригодных ра125 131 35 3 диоактивных материалов включают I, I, 8 или Н.

Анти-СО40 антитела или белки по изобретению, например, тАЬ1, тАЬ2 или тАЬ3 могут быть использованы в сочетании с любой известной терапией аутоиммунных и воспалительных заболеваний, включая любое вещество или комбинацию веществ, которые заведомо являются пригодными, или которые уже были использованы или в данный момент используются, для лечения аутоиммунных и воспалительных заболеваний. Такие терапевтические воздействия и терапевтические вещества включают, помимо прочего, хирургическую операцию или оперативное вмешательство (например, спленэктомию, лимфаденэктомию, тиреоидэктомию, плазмаферез, лейкофорез, трансплантацию клеток, ткани или органа, желудочно-кишечные манипуляции, перфузию органа и т.п.), лучевую терапию, терапию такую, как стероидная терапия и нестероидная терапия, гормонотерапия, цитокинотерапия, терапия с дерматологическими веществами (например, местнодействующими средствами, используемыми для лечения кожных патологий, таких как аллергия, контактный дерматит и псориаз), иммуносупрессивная терапия, и другие способы противовоспалительной терапии моноклональными антителами и т.п. Таким образом, антагонистические анти-СЭ40 антитела или белки, описанные в настоящем документе, назначают в сочетании по меньшей мере с одним другим видом терапии, включая, помимо прочего, хирургическую операцию, перфузию органа, лучевую терапию, стероидную терапию, нестероидную терапию, антибиотикотерапию, противогрибковую терапию, гормонотерапию, цитокинотерапию, терапию с дерматологическими

- 15 026133 веществами (например, местнодействующие средства, используемые для лечения кожных патологий, таких как аллергия, контактный дерматит и псориаз), иммуносупрессивная терапия, другие способы терапии с применением противовоспалительных моноклональных антител, их сочетания и т.п.

Таким образом, в случае, когда комбинированная терапия включает назначение анти-С.'О40 антитела или белка по изобретению, такого как тАЬ1, тАЬ2 или тАЬ3, в сочетании с назначением другого терапевтического средства, как со стероидами в качестве одного из примеров, методы по изобретению заключаются в совместном применении лекарственных средств, используя отдельные композиции или единственную фармацевтическую композицию, и в последовательном применении в любом порядке. В случае, когда методы по настоящему изобретению включают комбинированные терапевтические схемы, эти лекарственные средства могут быть применены одновременно, т.е. анти-СЭ40 антитела или белок по изобретению применяют параллельно или в пределах одних и тех же временных рамок как и другое лекарственное средство (т.е. лекарственные средства применяют параллельно, но анти-СЭ40 антитело или белок по изобретению не применяют точно в одно и то же время, как и другое лекарственное средство). Альтернативно, анти-СЭ40 антитело по настоящему изобретению или белок по изобретению может также быть применен до или после другой терапии. Последовательное применение различных лекарственных средств может быть выполнено независимо от того, отвечает ли лечащийся субъект на первый курс терапии, чтобы уменьшить вероятность появления ремиссии или рецидива заболевания.

В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-СЭ40 антитела или белки по изобретению, например, тАЬ1, тАЬ2 или тАЬ3 антитело, назначают в сочетании с иммунодепрессантами или противовоспалительными средствами, где антитело или белок и терапевтическое(ие) средство (а) могут применяться последовательно, в любом порядке, или одновременно (т.е. параллельно или в пределах одних и тех же временных рамок). Примеры пригодных иммунодепрессантов, которые можно применять в сочетании с антагонистическими анти-СЭ40 антителами или белками по изобретению, например, антителом тАЬ1, тАЬ2 или тАЬ3, включают, помимо прочего, метотрексат, циклофосфамид, мизорибин, хлорамбуцил, циклоспорин, такой как, например, аэрозольный циклоспорин (см. публикацию патентной заявки США № И8 2002/0006901), такролимус (РК506; РгоОгаГгМ), мофетила микофенолат и азатиоприн (6-меркаптопурин), сиролимус (рапамицин), деоксиспергуалин, лефлуномид и его малононитриламидные аналоги; иммуносупрессивные белки, включая, например, гибридные белки анти-СТЬА4 антитела и 1д, гибридные белки стимулирующих В-лимфоциты антител (например, ЬУМРНО8ТАТ-ВТМ) и 1д (В1у§-1§), анти-СЭ80 антитела и этанерцепт (ЕпЬге1 (8ТМ)), а также антитела против Т-клеток, такие как анти-СЭ3 (ОКТ3), анти-СЭ4 и т.п. Примеры пригодных противовоспалительных веществ включают, помимо прочего, кортикостероиды, такие как, например, клобетазол, галобетазол, гидрокортизон, триамцинолон, бетаметазон, флуоцинолон, флуоцинонид, преднизон, преднизолон, метилпреднизолон; нестероидные противовоспалительные средства (ΝδΑΙΌ), такие как, например, сульфасалазин, лекарственные средства, содержащие мезаламин (именуемые 5-ΑδΑ вещества), целекоксиб, диклофенак, этодолак, фенопрофен, флурбипрофен, ибупрофен, кетопрофен, меклофамат, мелоксикам, набуметон, напроксен, оксапрозин, пироксикам, рофекоксиб, салицилаты, сулиндак и толметин; ингибиторы фосфодиэстеразы-4, противовоспалительные антитела, такие как адалимумаб (ΗυΜΕΚΑ (8ТМ), антагонист ТОТ^а) и инфликсимаб (Ремикейд, антагонист ТОТ^а) и т.п. Также включены иммуномодуляторы текущего или потенциального использования при лечении аутоиммунного заболевания, такие как талидомид или его аналоги, такие как леналидомид.

Отторжение трансплантата и реакция трансплантат против хозяина могут быть сверхострыми (гуморальными), острыми (Т-клеточноопосредованными) или хроническими (неизвестной этиологии) или их комбинацией. Таким образом, анти-СЭ40 антитела или белки по изобретению, например антитело тΑЬ1, тΑЬ2 или тΑЬ3, используются в некоторых вариантах осуществления изобретения, чтобы предотвратить и/или избежать отторжение и/или симптомы, ассоциированные со сверхострым, острым и/или хроническим отторжением трансплантата любой ткани, включая, помимо прочего, печень, почки, поджелудочную железу, островковые клетки поджелудочной железы, тонкий кишечник, легкое, сердце, роговицу, кожу, кровяные сосуды, кость, гетерологичный или аутологичный костный мозг и т.п. Ткани трансплантата могут быть получены из любого донора и трансплантированы в любого реципиентахозяина, и, соответственно, процедура трансплантации может включать трансплантацию животной ткани людям (например, ксенотрансплантаты), трансплантацию ткани от одного человека другому человеку (например, аллотрансплантаты) и/или трансплантацию ткани из одной части тела человека в другую (например, аутотрансплантаты).

Лечение антителами или белками по изобретению может также уменьшать осложнения трансплантации, такие как лихорадка, анорексия, гемодинамические нарушения, лейкопения, инфильтрацию белыми клетками крови трансплантированного органа/ткани, а также оппортунистические инфекции.

В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-С.'О40 антитела или белки по изобретению, например, антитело тΑЬ1, тΑЬ2 или тΑЬ3, могут быть использованы по отдельности или в сочетании с иммунодепрессантами для лечения и/или предотвращения отторжения трансплантата, такого как сверхострое, острое и/или хроническое отторжение, и/или реакции трансплантат против хозяина.

- 16 026133

Соответственно, в некоторых вариантах осуществления изобретения, где анти-СИ40 антитела или белки по изобретению используются для лечения отторжения трансплантата, антитела, например антитело тАЬ1, тАЬ2 или тАЬ3, могут быть использованы в сочетании с пригодными иммунодепрессантами, включая, помимо прочего, метотрексат; циклофосфамид; мизорибин; хлорамбуцил; циклоспорин, такой как, например, аэрозольный циклоспорин (см. публикацию патентной заявки США № И820020006901), такролимус (РК506; РгоОгаТт), мофетила микофенолат и азатиоприн (6-меркаптопурин), сиролимус (рапамицин), деоксиспергуалин, лефлуномид и его малононитриламидные аналоги; иммуномодуляторы, включая, например, талидомид и его аналоги; и иммуносупрессивные белки, включая, например, гибридные белки анти-СТЬА антител и 1д, гибридные белки стимулирующих В-лимфоциты антител (например, ЬУМРН08ТАТ-ВТМ) и 1д (В1у8-1д), анти-СЭ80 антитела и этанерцепт (ЕпЬге1 (КТМ)), а также антитела против Т-клеток, такие как анти-СЭ3 (ОКТ3), анти-СЭ4 и т.п.

В связи с этим, специально предусмотрено, что композиции и методы по изобретению используются в сочетании с другими лекарственными средствами для дальнейшего улучшения симптомов и исходов у реципиентов трансплантата, как, например, у тех, которые получают трансплантаты легких или почек, например. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения анти-СО40 антитела или белки по изобретению, например, антитело тАЬ1, тАЬ2 или тАЬ3, используются для лечения отторжения трансплантата (такого, как, например, сверхострого, острого и/или хронического отторжения или реакция трансплантат против хозяина у реципиентов трансплантата легких или почек) по отдельности или в сочетании с циклоспорином, назначаемым парентерально и/или непарентерально, включая, например, циклоспорин перорального применения, инъецируемый циклоспорин, аэрозольный (например, ингаляционный) циклоспорин, и их комбинации. В некоторых вариантах осуществления изобретения, где, по меньшей мере, составляющей терапии является аэрозольный циклоспорин, циклоспорин поступает в легкие реципиента ингаляцией циклоспорина в виде аэрозольного спрея, используя, например, находящееся под давлением приспособление для доставки препарата или аэрозольный аппарат. Циклоспорин могут назначать в виде сухого порошка или влажной лекарственной формы. Циклоспорин могут назначать в субтерапевтической дозе.

В некоторых других вариантах осуществления изобретения, анти-СО40 антитела или белки по изобретению, например, антитело тАЬ1, тАЬ2 или тАЬ3, могут быть использованы по отдельности или в сочетании с иммунодепрессантами для лечения и/или предотвращения ревматоидного артрита. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения, где анти-СЭ40 антитела или белки по изобретению, например, антитело тАЬ1, тАЬ2 или тАЬ3, используются для лечения ревматоидного артрита, указанные антитела или белки могут быть использованы в сочетании с пригодными иммунодепрессантами, включая, помимо прочего, метотрексат, циклофосфамид, мизорибин, хлорамбуцил, циклоспорин, такролимус (РК506; РК00КЛРТМ), мофетила микофенолат и азатиоприн (6-меркаптопурин), сиролимус (рапамицин), деоксиспергуалин, лефлуномид и его малононитриламидные аналоги; иммуномодуляторы, включая, например, талидомид и его аналоги; и иммуносупрессивные белки, включая, например, гибридные белки анти-СТЬА антител и 1д, гибридные белки стимулирующих В-лимфоциты антител (например, ЬУМРН08ТАТ-ВТМ) и 1д (В1у8-1д), анти-СЭ20 антитела (например, ΚIТυXАN (д)); полностью человеческое антитело НиМах-СИ20, К-1594, 1ММИ-106, ТКИ-015, АМЕ-133, тозитумомаб/1-131, тозитумомаб (Веххаг (И), ибритумомаб титуксетан (УеуаПп (КТМ)); анти-СЭ80 антитела, и этанерцепт (ΕΥ ВКЕЬ), а также антитела против Т-клеток, такие как анти-СЭ3 (ОКТ3), анти-СЭ4 и т.п. Как обсуждалось выше, эффективность лечения может быть оценена, используя любые способы, и включает, помимо прочего, эффективность, измеряемую клиническими ответами, определяемыми критериями Американской коллегии ревматологии или любыми другими критериями. См., например, РеКоп е1 а1. (1995), ΛιΊΐιπΙίδ. КЬеит. 38: 727-35 апб уап Се51е1 е! а1. (1996), ЛгШпЫ КЬеит. 39:34-40.

В еще других вариантах осуществления изобретения анти-СИ40 антитела или белки по изобретению, например, антитело тАЬ1, тАЬ2 или тАЬ3, могут быть использованы по отдельности или в сочетании с иммунодепрессантами для лечения и/или предотвращения рассеянного склероза. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения, где анти-СИ40 антитела или белки по изобретению, например, антитело тАЬ1, тАЬ2 или тАЬ3, используются для лечения рассеянного склероза, антитела могут использоваться в сочетании с пригодными иммунодепрессантами, включая, помимо прочего, метотрексат, циклофосфамид, мизорибин, хлорамбуцил, циклоспорин, такролимус (РК506; РК0СКЛРТМ), мофетила микофенолат и азатиоприн (6-меркаптопурин), сиролимус (рапамицин), деоксиспергуалин, лефлуномид и его малононитриламидные аналоги; и иммуносупрессивные белки, включая, например, гибридные белки анти-СТЬА антител и 1д, гибридные белки стимулирующих В-лимфоциты антител (например, ЬУМРН08ТАТ-ВТМ) и 1д (В1у8-1д), анти-СЭ20 антитела (например, КIТυXАN (И); полностью человеческое антитело НиМах-СИ20, К-1594, 1ММИ-106, ТКИ-015, АМЕ-133, тозитумомаб/1-131, тозитумомаб (Веххаг (КТМ)), ибритумомаб титуксетан (УеуаПп (КТМ)); анти-СИ80 антитела, и этанерцепт (ЕИВКЕЬ), а также антитела против Т-клеток, такие как анти-СИ3 (ОКТ3), анти-СИ4, вещества, вовлеченные в модуляцию рецептора 81Р, включая, например, финголимод; и т.п.

- 17 026133

Фармацевтические композиции и способы применения

Анти-СО40 антитела или белки по изобретению применяют в концентрации, которая является терапевтически эффективной для предотвращения или лечения аутоиммунных заболеваний и/или воспалительных заболеваний и/или для предотвращения или снижения рисков, ассоциированных с отторжением трансплантата при трансплантации.

Для достижения этой цели антитела могут быть изготовлены, используя ряд приемлемых вспомогательных веществ, известных в данной области техники. Как правило, антитела или белки назначают в виде инъекций, например, либо внутривенно, внутрибрюшинно или подкожно. Методы выполнения этого назначения известны среднему специалисту в данной области техники. Также представляется возможным получить композиции, которые могут быть применены местно или перорально, или которые могут обладать способностью проникать через мембраны слизистой.

Внутривенное применение осуществляют предпочтительно инфузией в течение периода от приблизительно 1 до приблизительно 10 ч, более предпочтительно в течение периода от приблизительно 1 до приблизительно 8 ч, еще более предпочтительно в течение периода от приблизительно 2 до приблизительно 7 ч, еще более предпочтительно в течение периода от приблизительно 4 до приблизительно 6 ч, в зависимости от применения анти-С.'О40 антитела или белка. Начальная инфузия фармацевтической композиции может быть назначена в течение периода от приблизительно 4 до приблизительно 6 ч с последующими инфузиями, проводимыми быстрее. Последующие инфузии могут быть назначены в течение периода от приблизительно 1 до приблизительно 6 ч, включая, например, от приблизительно 1 до приблизительно 4 ч, от приблизительно 1 до приблизительно 3 ч или от приблизительно 1 до приблизительно 2 ч.

Фармацевтическая композиция по изобретению создается, чтобы быть совместимой с предусмотренным способом применения. Примеры возможных способов применения включают парентеральный (например, внутривенный (IV), внутримышечный (1М), внутрикожный, подкожный (8С) или инфузионный), пероральный или легочный (например, ингаляционный), назальный, трансдермальный (местный), трансмукозальный и ректальный способ применения. Растворы или суспензии, используемые для парентерального, внутрикожного или подкожного применения могут включать следующие компоненты: стериальный разбавитель, такой как вода для инъекции, солевой раствор, жирные масла, полиэтиленгликоли, глицерин, пропиленгликоль или другие синтетические растворители; антибактериальные вещества, такие как бензиловый спирт или метилпарабены; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или бисульфит натрия; хелатирующие агенты, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота; буферы, такие как ацетаты, цитраты или фосфаты и вещества для корректировки тоничности, такие как хлорид натрия или декстроза. Величина рН может быть скорректирована кислотами или основаниями, такими как соляная кислота или гидроксид натрия. Парентеральное средство может быть заключено в ампулы, одноразовые шприцы, или флаконы для многократного приема, сделанные из стекла или пластика.

Анти-СО40 антитела или белки по изобретению обычно обеспечивают стандартным способом фармацевтически приемлемым буфером, например, стерильным солевым раствором, стерильная буферная вода, пропиленгликоль, комбинации вышеупомянутого, и др. Методы приготовления парентерально применяемых веществ описаны в Кеш1п§1оп'8 РЬагтасеийса1 8сюпсс5 (18* ей., Маск РиЫЫйпд Сотрапу, ЕаЮп, Реппкуката, 1990). См. также, например, ΥΟ 98/56418, который описывает стабилизированные фармацевтические композиции антител, пригодные для использования в методах по настоящему изобретению.

Количество по меньшей мере одного антагонистического анти-СЭ40 антитела или белков по изобретению, подлежащих применению, легко определяется любым средним специалистом в данной области техники. Факторы, влияющие на способ применения и соответствующее количество по меньшей мере одного антагонистического анти-СЭ40 антитела или белка, включают, помимо прочего, определенное заболевание, подлежащее терапевтическому воздействию, тяжесть заболевания, история заболевания, и возраст, рост, вес, состояние здоровья, состояние по данным физикального обследования индивидуума, проходящего терапевтическое лечение. Аналогичным образом, количество антагонистического антиСЭ40 антитела или белка, подлежащего применению, будет зависеть от способа применения и вводят ли субъекту единичную дозу или многократные дозы этого вещества. Как правило, более высокое дозирование анти-СЭ40 антитела или белка является предпочтительным с увеличением веса пациента, проходящего терапевтическое лечение. Доза анти-СЭ40 антитела или белка, подлежащего применению, находится в диапазоне от приблизительно 0,003 до приблизительно 50 мг/кг, предпочтительно в диапазоне от 0,01 до приблизительно 40 мг/кг.

Таким образом, например, доза может составлять 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 мг/кг.

В другом варианте осуществления изобретения метод включает назначение многократных доз антагонистического анти-СЭ40 антитела или его фрагмента. Метод может включать назначение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 или более терапевтически эффективных доз фармацевтической композиции, включающей антагонистическое анти-СЭ40 антитело или его фрагмент. Частота и продолжительность применения многократных доз фармацевтических композиций, включающих анти-СЭ40 антитело

- 18 026133 или белок, может быть легко определено любым специалистом в данной области техники. Более того, лечение субъекта терапевтически эффективным количеством антитела или белка может включать однократное лекарственное воздействие или, предпочтительно, может включать серию лекарственных воздействий. В предпочтительном примере субъекта лечат антагонистическим анти-СЭ40 антителом или белком по изобретению в диапазоне от приблизительно 0,1 до 20 мг/кг массы тела, один раз в неделю в течение от приблизительно 1 до 10 недель, предпочтительно от приблизительно 2 до 8 недель, более предпочтительно от приблизительно 3 до 7 недель, и даже более предпочтительно в течение приблизительно 4, 5 или 6 недель. Лечение можно проводить ежегодно для предотвращения рецидива или при указании на рецидив. Также принимается во внимание то, что эффективное дозирование антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, используемого для лечения, может увеличиваться или уменьшаться в ходе определенного терапевтического лечения. Изменения в дозировании могут проистекать и становится очевидными из результатов диагностических анализов, как описано в настоящем документе.

Таким образом, в одном варианте осуществления изобретения схема дозирования включает первое применение терапевтически эффективной дозы по меньшей мере одного анти-СЭ40 антитела или белка по изобретению на 1, 7, 14 и 21 дни лечебного периода. В другом варианте осуществления изобретения схема дозирования включает первое применение терапевтически эффективной дозы по меньшей мере одного анти-СЭ40 антитела или белка по изобретению на 1, 2, 3, 4, 5, 6 и7 дни недели в лечебном периоде. Дополнительные варианты осуществления изобретения включают схему дозирования, имеющую первое применение терапевтически эффективной дозы по меньшей мере одного анти-СЭ40 антитела или белка по изобретению на 1, 3, 5 и 7 дни недели в лечебном периоде; схему дозирования, включающую первое назначение терапевтически эффективной дозы по меньшей мере одного анти-СЭ40 антитела или белка по изобретению на 1 и 3 дни недели в лечебном периоде; и предпочтительную схему дозирования, включающую первое применение терапевтически эффективной дозы по меньшей мере одного антиί'.Ό40 антитела или белка по изобретению в 1 день недели лечебного периода. Лечебный период может включать 1, 2, 3 недели, месяц, 3, 6 месяцев или год. Лечебные периоды могут следовать друг за другом или отделены друг от друга днем, неделей, 2 неделями, месяцем, 3, 6 месяцами или годом с режимом дозирования от 0,003 до 50 мг/кг, от 0,01 до 40 мг/кг, от 0,01 до 30 мг/кг, от 0,1 до 30 мг/кг, от 0,5 до 30 мг/кг, от 1 до 30 мг/кг, от 3 до 30 мг/кг, от 3 до 25 мг/кг, от 3 до 20 мг/кг, от 5 до 15 мг/кг или от 7 до 12 мг/кг. Таким образом, например, доза любого антагонистического анти-СЭ40 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, например, анти-СЭ40 моноклонального антитела или белка по изобретению, может составлять 0,003, 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 мг/кг или другие такие дозы, находящихся в пределах диапазона от 0,003 до 50 мг/кг. Одна и та же терапевтически эффективная доза анти-СЭ40 антитела или белка по изобретению может быть назначена на всем протяжении каждой недели дозирования антитела.

Альтернативно, различные терапевтически эффективные дозы антагонистического анти-СЭ40 антитела или белка по изобретению могут быть использованы в течение лечебного периода.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, начальная терапевтически эффективная доза антагонистического анти-СЭ40 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, как определено гделибо еще в настоящем документе, может находиться в более низком диапазоне дозирования (т.е. от 0,003 до 20 мг/кг) с последующими дозами, находящимися в пределах более высокого диапазона дозирования (т.е. от 20 до 50 мг/кг).

В альтернативных вариантах осуществления изобретения начальная терапевтически эффективная доза антагонистического анти-СЭ40 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, как определено где-либо еще в настоящем документе, может находиться в верхнем диапазоне дозирования (т.е. от 20 до 50 мг/кг) с последующими дозами, находящимися в пределах более низкого диапазона дозирования (т.е. от 0,003 до 20 мг/кг). Таким образом, в одном варианте осуществления изобретения, начальная терапевтически эффективная доза антагонистического анти-СЭ40 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента составляет от 20 до 35 мг/кг, включая приблизительно 20 мг/кг, приблизительно 25 мг/кг, приблизительно 30 мг/кг и приблизительно 35 мг/кг, и последующие терапевтически эффективные дозы антагонистического анти-СЭ40 антитела или белка по изобретению составляют от приблизительно 5 мг/кг до приблизительно 15 мг/кг, включая приблизительно 5, 8, 10, 12 мг/кг и приблизительно 15 мг/кг.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, анти-СЭ40 терапия начинается с назначения нагрузочной дозы антитела или белка по изобретению субъекту, нуждающемуся в анти-СЭ40 терапии. Под нагрузочной дозой подразумевают начальную дозу анти-СЭ40 антитела или белка по изобретению, которых назначают субъекту, где назначаемая доза антитела или белка по изобретению находится в пределах более высокого диапазона дозирования (т.е. от приблизительно 20 до приблизительно 50 мг/кг). Нагрузочная доза может быть назначена в виде однократного применения, например, однократной инфузии, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент назначается IV, или в виде многократных применений, например, многократных инфузий, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент назначается IV до тех пор, пока полная нагрузочная доза не будет введена в пределах приблизительно 24-часового периода. Вслед за назначением нагрузочной дозы субъекту затем вводят одну или несколько дополнительных терапевтически эффективных доз анти-СЭ40 антитела или белка по изобрете- 19 026133 нию. Последовательные терапевтически эффективные дозы могут быть назначены, например, в соответствии с еженедельной схемой дозирования, или один раз каждые две недели, один раз каждые три недели, или один раз каждые четыре недели. В таких вариантах осуществления изобретения, последовательные терапевтически эффективные дозы, как правило, находятся в пределах более низкого диапазона дозирования (т.е. от 0,003 до 20 мг/кг).

Альтернативно, в некоторых вариантах осуществления изобретения, вслед за нагрузочной дозой назначают последовательные терапевтически эффективные дозы анти-СЭ40 антитела или белка по изобретению в соответствии со схемой поддержания нужного состояния, где терапевтически эффективную дозу антитела или белка по изобретению назначают один раз в месяц, один раз каждые 6 недель, один раз каждые два месяца, один раз каждые 10 недель, один раз каждые три месяца, один раз каждые 14 недель, один раз каждые четыре месяца, один раз каждые 18 недель, один раз каждые пять месяцев, один раз каждые 22 недели, один раз каждые шесть месяцев, один раз каждые 7 месяцев, один раз каждые 8 месяцев, один раз каждые 9 месяцев, один раз каждые 10 месяцев, один раз каждые 11 месяцев, или один раз каждые 12 месяцев. В таких вариантах осуществления изобретения терапевтически эффективные дозы анти-СЭ40 антитела или белка по изобретению находятся в пределах более низкого диапазона дозирования (т.е. от 0,003 мг/кг до приблизительно 20 мг/кг), в частности, когда последовательные дозы назначают с более частыми интервалами, например, один раз каждые две недели до одного раза каждый месяц, или в пределах более высокого диапазона дозирования (т.е. от 20 до 50 мг/кг), в частности, когда последовательные дозы назначают с менее частыми интервалами, например, где последовательные дозы назначают с интервалом от одного месяца до 12 месяцев.

Любая фармацевтическая композиция, включающая анти-СЭ40 антитело или белок по изобретению, обладающие заданными функциональными свойствами, описанными в настоящем документе, в качестве терапевтически активного компонента может быть использована в методах по изобретению. Следовательно, жидкие, лиофилизированные или высушенные распылением композиции, включающие одно или несколько анти-СО40 антител или белков по изобретению, например, антитела тАЬ1, тАЬ2 или тАЬ3, могут быть приготовлены в виде водного или неводного раствора или суспензии для последовательного назначения субъекту в соответствии с методами по изобретению.

Каждая из этих композиций включает по меньшей мере одно из анти-СО40 антител или один из белков по настоящему изобретению в качестве терапевтически или профилактически активного компонента.

Под терапевтически или профилактически активным компонентом подразумевают анти-СЭ40 антитело или белок по изобретению, специфически включенные в композицию для достижения желаемого терапевтического или профилактического ответа в отношении лечения, предотвращения возникновения или диагностики заболевания или патологического состояния у субъекта, когда фармацевтическую композицию назначают данному субъекту. Предпочтительно фармацевтические композиции включают стабилизирующие вещества, объемообразующие вещества или оба вещества для минимизации проблем, связанных с потерей стабильности и биологической активности белка во время приготовления и хранения.

Инертные вещества могут быть добавлены к фармацевтическим композициям, включающим антиί'.Ό40 антитело или белок по изобретению. Эти инертные вещества могут включать, помимо прочего, масла, полимеры, витамины, углеводы, аминокислоты, соли, буферы, альбумин, сурфактанты или объемообразующие вещества. Предпочтительно углеводы включают сахар или сахарные спирты, такие как моно-, ди- или полисахариды, или водорастворимые глюканы. Сахариды или глюканы могут включать фруктозу, глюкозу, маннозу, сорбозу, ксилозу, мальтозу, сахарозу, декстран, пуллулан, декстрин, α- и βциклодекстрин, растворимый крахмал, гидроксиэтиловый крахмал и карбоксиметилцеллюлозу или смеси вышеперечисленного.

Сахарный спирт - это углеводород С₄-С₈, имеющий гидроксильную группу, и включает галактитол, инозитол, маннитол, ксилитол, сорбитол, глицерол и арабит. Эти сахара или сахарные спирты могут быть использованы индивидуально или комбинированно. Концентрация сахара или сахарного спирта может находиться в пределах от 1,0 до 7% вес./об., более предпочтительно от 2,0 до 6% вес./об. Например, аминокислоты включают левовращающие (Ь) формы карнитина, аргинина и бетаина; однако, другие аминокислоты могут быть добавлены.

Предпочтительные полимеры включают поливинилпирролидон (РУР) со средним молекулярным весом от 2000 до 3000, или полиэтиленгликоль (РЕО) со средним молекулярным весом от 3000 до 5000. Сурфактанты, которые могут быть добавлены к композиции, представлены в ЕР № 270799 и 268110.

Кроме того, антитела могут быть химически модифицированы ковалентной конъюгацией с полимером для увеличения их времени жизни в циркулирующей крови, например. Предпочтительные полимеры и методы их прикрепления к пептидам представлены в патенте США № 4766106; 4179337; 4495285; и 4609546. Предпочтительные полимеры являются полиоксиэтилированными полиолами и полиэтиленгликолями (РЕО). РЕО растворим в воде при комнатной температуре и имеет основную формулу К(ОСн₂-Сн₂)_пО-К, где К может быть водородом или защитной группой, такой как алкильная или алканольная группа. Предпочтительно защитная группа имеет от 1 до 8 углеродов, более предпочтительно, когда

- 20 026133 она является метильной. Символ и является положительным целым числом, предпочтительно, от 1 до 1000, более предпочтительно от 2 до 500. РЕС имеет предпочтительный средний молекулярный вес от 1000 до 40000, более предпочтительно от 2000 до 20000, наиболее предпочтительно от 3000 до 12000. Предпочтительно РЕС имеет по меньшей мере одну гидроксигруппу, которая более предпочтительно является концевой гидроксигруппой. Она является именно той гидроксигруппой, которая предпочтительно активируется для взаимодействия со свободной аминогруппой на ингибиторе. Однако следует понимать, что тип и количество реактивных групп может варьировать для достижения ковалентно конъюгированного соединения РЕС/антитело по настоящему изобретению.

Водорастворимые полиоксиэтилированные полиолы также пригодны в настоящем изобретении.

Они включают полиоксиэтилированный сорбитол, полиоксиэтилированную глюкозу, полиоксиэтилированный глицерол (Р0С) и т.п. Предпочтительным является Р0С. Одна причина состоит в том, что глицероловый скелет полиоксиэтилированного глицерола является таким же, какой встречается в природе, например, у животных и людей в моно-, ди-, триглицеридах.

Следовательно, это разветвление не обязательно будет рассматриваться как чужеродное вещество в организме. Р0С имеет предпочтительный молекулярный вес в том же диапазоне, что и РЕС. Структура Р0С показана в КпаиТ е! а1. (1988, Ε Βίο. СЬет. 263: 15064-15070) и обсуждение конъюгатов Р0С/1Ь-2 можно найти в патенте США № 4766106.

Другой системой доставки лекарственного средства для повышения его времени жизни в циркулирующей крови является липосома.

Методы приготовления липосомных систем доставки обсуждаются в СаЫ/оп е! а1. (1982), Сапсег КекеагсЬ 42:4734; СаГйо (1981), ВюсЬет ВюрЬук Ас!а 649: 129; и 8/ока (1980), Апп. Кеу. Вюр1аук. Епд. 9: 467. Другие системы доставки лекарственного средства известны в данной области техники и описаны, например, в Ро/папкку е! а1. (1980), Эгид ОеЬуегу БуЧепъ (К. Ь. .ТиЬапо, ей., ОхТогй, N. Υ.), р. 253-315; Ро/пап^ку (1984), РЬагт Кеук 36:277.

Инертное вещество, подлежащее включению в фармацевтическую композицию, должно обеспечить стабильность антагонистического анти-СЭ40 антитела или белка по изобретению. То есть анти-СЭ40 антитело или белок по изобретению должен сохранять свою физическую и/или химическую стабильность и обладать заданными функциональными свойствами, т.е. одним или несколькими заданными функциональными свойствами, определенными выше в настоящем документе.

Методы мониторинга стабильности белка хорошо известны в данной области техники. См., например, 1опе8 (1993), Αάν. Эгид ОеЬуегу Кеу. 10:29-90; Ьее, ей. (1991), Рерййе апй РгоТеш Эгид ОеЬуегу (Магсе1 Эеккег, 1пс., Νον Υο^к. Νον Υο^к); и анализ стабильности рассмотрены в настоящем документе ниже. Как правило, стабильность белка измеряется при выбранной температуре в определенный период времени. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения, стабильная фармацевтическая композиция антитела обеспечивает стабильность антагонистического анти-СЭ40 антитела или белка по изобретению в условиях хранения при комнатной температуре (приблизительно 25°С) в течение по меньшей мере 1 месяца, по меньшей мере 3 месяцев или по меньшей мере 6 месяцев, и/или стабильна приблизительно при 2-8°С в течение по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 9 месяцев, по меньшей мере 12 месяцев, по меньшей мере 18 месяцев, по меньшей мере 24 месяцев.

Считается, что белок, такой как антитело, входящий в состав фармацевтической композиции, сохраняет свою физическую стабильность в данный момент времени, если у него не обнаруживают никаких видимых признаков (т.е. изменение цвета или потеря прозрачности) или измеряемых признаков (например, используя гель-фильтрацию (8ЕС) или рассеивание УФ-излучения) преципитации, агрегации и/или денатурации в этой фармацевтической композиции. Что касается химической стабильности, считается, что белок, такой как антитело, входящий в состав фармацевтической композиции, сохраняет свою химическую стабильность в данный момент времени, если измерения химической стабильности указывают на то, что данный белок (т.е. антитело) сохраняет представляющую интерес биологическую активность в данной фармацевтической композиции. Методы мониторинга изменений химической стабильности хорошо известны специалистам в данной области техники и включают, помимо прочего, методы определения химически измененных форм белка, таких, которые являются результатом усечения, используя, например, δΌδ-РАСЕ, §ЕС и/или времяпролетную масс-спектрометрию с лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой матрицы; и деградацию, связанную с изменениями молекулярного заряда (например, связанными с дезамидированием), используя, например, ион-обменную хроматографию. См., например, методы, рассмотренные ниже в настоящем документе.

Считается, что анти-СЭ40 антитело или белок по изобретению в составе фармацевтической композиции сохраняет желаемую биологическую активность в данный момент времени, если желаемая биологическая активность в этот момент времени находится в пределах приблизительно 30%, предпочтительно в пределах приблизительно 20% желаемой биологической активности, проявляемой в момент создания фармацевтической композиции, как определяемой подходящим методом анализа желаемой биологической активности. Методы измерения желаемой биологической активности антагонистических анти-СЭ40 антител или белков, рассмотренных в настоящем документе, могут быть выполнены, как описано в примерах в настоящем документе. См. также методы анализа, описанные в 5>с1ш1/е е! а1. (1998), Ргос. №·ιΐ1.

- 21 026133

Асай. 8с1. И8А 92: 8200-8204; ЭеШоп е! а1. (1998), РеЙ1а1г Тгап5р1ап!. 2:6-15; Еуапк е! а1. (2000), Лттипок 164: 688-697; №е11е (1998), Адеп!к Асйопк 8ирр1. 49: 17-22; Ьейегтап е! а1. (1996), Сигг Орш. Нета!о1. 3: 77-86; Сокдап е! а1. (1991), Сиггеп1Рго!осо18 ш 1ттипо1оду 13: 12; К\уеккеЬоот е! а1. (1993), 1ттипо1оду 79: 439-444; апй И8 Ра!еп! N«5. 5674492 апй 5847082.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, анти-СЭ40 антитело, например, выбранное среди рекомбинантных антител тАЫ-тАЬ3, входит в состав жидкой фармацевтической композиции. Анти-СО40 антитело или белок по изобретению могут быть приготовлены, используя любой метод, известный в данной области техники, включая методы, описанные выше в настоящем документе. В одном варианте осуществления изобретения, анти-СЭ40 антитело, например, выбранное среди тАЬ1-тАЬ3 антител, продуцируется с использованием рекомбинантных ДНК-технологий в клеточной линии СНО.

После приготовления и очистки анти-СЭ40 антитела оно может входить в состав жидкой фармацевтической композиции в форме, изложенной выше в данном документе. В случае, когда антагонистическое анти-СЭ40 антитело подлежит хранению до создания композиции, оно может быть заморожено, например, при -20°С, и затем оттаяно при комнатной температуре для дальнейшего составления рецептуры.

Жидкая фармацевтическая композиция включает терапевтически эффективное количество антиί'.Ό40 антитела или белка по изобретению, например, тАЬ1, тАЬ2 или тАЬ3 антитела. Количество антитела, находящееся в композиции, учитывает способ применения и желаемый объем дозы.

Таким образом, жидкая фармацевтическая композиция включает анти-СО40 антитело, например, тАЬ1, тАЬ2 или тАЬ3 антитело, в концентрации в диапазоне от 0,1 до 300,0 мг/мл, от 1,0 до 200 мг/мл, от 5,0 до 100,0 мг/мл, от 7,5 до 50 мг/мл или от 15,0 до 25,0 мг/мл.

Жидкая фармацевтическая композиция включает анти-СЭ40 антитело, например, тАЬ1, тАЬ2 или тАЬ3 антитело и буфер, который поддерживает значение рН композиции в диапазоне от рН 5,0 до 7,0.

Любой пригодный буфер, который поддерживает значение рН жидкой композиции анти-СЭ40 антитела в диапазоне от приблизительно рН 5,0 до приблизительно рН 7,0, может быть использован в композиции при условии, что физикохимическая стабильность и желаемая биологическая активность антитела сохраняются, как указано выше в настоящем документе. Пригодные буферы включают, помимо прочего, общепринятые кислоты и их соли, где противоион может быть, например, натрием, калием, аммонием, кальцием или магнием. Примеры общепринятых кислот и их солей, которые могут быть использованы для забуферивания фармацевтической жидкой композиции, включают, помимо прочего, янтарную кислоту или сукцинат, гистидин или гидрохлорид гистидина, лимонную кислоту или цитрат, уксусную кислоту или ацетат, винную кислоту или тартрат, фосфорную кислоту или фосфат, глюконовую кислоту или глюконат, глутаминовую кислоту или глутамат, аспарагиновую кислоту или аспартат, малеиновую кислоту или малеат, оксиянтарную кислоту или малат. Концентрация буфера в составе композиции может быть в диапазоне от 1 до 50 мМ, включая приблизительно 1, 2, 5, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 мМ или другие такие значения в пределах диапазона от 1 до 50 мМ.

В некоторых вариантах осуществления изобретения жидкая фармацевтическая композиция включает терапевтически эффективное количество анти-СЭ40 антитела, например, тАЬ1, тАЬ2 или тАЬ3 антитела, и сукцинатный буфер или цитратный буфер или гистидиновый буфер или гистидингидрохлоридный буфер в концентрации, которая поддерживает значение рН композиции в диапазоне рН от приблизительно 5,0 до 7,0. Под сукцинатный буфер или цитратный буфер подразумевают буфер, включающий соль янтарной кислоты или соль лимонной кислоты соответственно. Под гистидиновым буфером подразумевают буфер, включающий соль аминокислоты гистидин.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, буфер является гистидиновым буфером, например, буфером гистидина гидрохлорида. Как указано выше, концентрация гистидинового буфера в составе композиции может находиться в диапазоне от 1 до 50 мМ, включая приблизительно 1, 2, 5, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 мМ или другие такие значения в пределах диапазона от 1 до 50 мМ.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения противоионом сукцината или цитрата является катион натрия, и следовательно, буфер является сукцинатом натрия или цитратом натрия соответственно. Однако любой катион потенциально является эффективным. Другие возможные катионы сукцината или цитрата включают, помимо прочего, калий, аммоний, кальций и магний. Как указано выше, концентрации сукцинатного или цитратного буфера в составе композиции могут находиться в диапазоне от 1 до 50 мМ, включая приблизительно 1, 2, 5, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 мМ или другие такие значения в пределах диапазона от 1 до 50 мМ.

В другом варианте осуществления изобретения жидкая фармацевтическая композиция включает антагонист анти-СЭ40 антитела, например, тАЬ1, тАЬ2 или тАЬ3 антитела, в концентрации от 0,1 до 300,0 мг/мл, от 1,0 до 200 мг/мл, от 5,0 до 100,0 мг/мл, от 7,5 до 50 мг/мл или от 15,0 до 25,0 мг/мл, и гистидиновый или сукцинатный или цитратный буфер, например, буфер сукцината натрия или цитрата натрия или гистидина гидрохлорида в концентрации от 1 до 50 мМ, от 5 до 40 мМ, от 10 до 35 мМ, предпочтительно приблизительно 30 мМ.

В случаях, когда желательно, чтобы жидкая фармацевтическая композиция была примерно изотонической, жидкая фармацевтическая композиция, включающая терапевтически эффективное количество

- 22 026133 анти-СЭ40 антитела или белка по изобретению, например, тАЬ1, тАЬ2 или тАЬ3 антитела, и буфер для поддержания значения рН композиции в пределах диапазона от приблизительно рН 5,0 до приблизительно рН 7,0, может дополнительно включать количество изотонизирующего вещества, достаточного для превращения композиции в примерно изотоническую. Под термином примерно изотонический подразумевают, что водная композиция имеет осмолярность в диапазоне от 240 до 800 ммоль/кг, от приблизительно 240 до приблизительно 600 ммоль/кг, более предпочтительно от 240 до приблизительно 440 ммоль/кг, более предпочтительно от приблизительно 260 до приблизительно 320 ммоль/кг, еще более предпочтительно от приблизительно 270 до приблизительно 310 ммоль/кг.

Методы определения изотоничности раствора хорошо известны специалистам в данной области техники. См., например, 8с1шкаг с1 а1. (1959), ί. Ат. РЬагт. Аккос. 48:628. Специалисты в данной области техники знакомы с целым рядом фармацевтически приемлемых растворов, пригодных для обеспечения изотоничности в фармацевтических композициях. Изотонирующее вещество может быть любым реагентом, способным регулировать осмотическое давление жидкой фармацевтической композиции по настоящему изобретению до получения значения, примерно равного таковому жидкости организма. Желательно использовать физиологически приемлемое изотонирующее вещество.

Таким образом, жидкая фармацевтическая композиция, включающая терапевтически эффективное количество антагонистического анти-СИ40 антитела, например, антитела тАЬ1, тАЬ2 или тАЬ3, и буфер для поддержания значения рН композиции в пределах диапазона от приблизительно рН 5,0 до приблизительно рН 7,0, может дополнительно включать компоненты, которые могут быть использованы для обеспечения изотоничности, например, хлорид натрия; аминокислоты, такие как аланин, валин и глицин; сахара и сахарные спирты (полиолы), включая, помимо прочего, глюкозу, декстрозу, фруктозу, сахарозу, мальтозу, маннитол, трегалозу, глицерол, сорбитол и ксилитол; уксусную кислоту, другие органические кислоты и их соли, и относительно незначительные количества цитратов или фосфатов. Специалист среднего звена знает дополнительные вещества, которые пригодны для обеспечения оптимальной тоничности жидкой композиции.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения жидкая фармацевтическая композиция, включающая терапевтически эффективное количество анти-СИ40 антитела, например, антитела тАЬ1, тАЬ2 или тАЬ3, и буфер для поддержания значения рН композиции в пределах диапазона от приблизительно рН 5,0 до приблизительно рН 7,0, дополнительно включает хлорид натрия в качестве изотонизирующего вещества.

Концентрация хлорида натрия в композиции зависит от вклада других компонентов в тоничность. В некоторых вариантах осуществления изобретения, концентрация хлорида натрия составляет от 50 до 300 мМ. В одном таком варианте осуществления изобретения, концентрация хлорида натрия составляет приблизительно 150 мМ. В других таких вариантах осуществления изобретения концентрация хлорида натрия составляет приблизительно 150 мМ, буфером является буфер сукцината натрия или цитрата натрия в концентрации от 5 до 15 мМ, жидкая фармацевтическая композиция включает терапевтически эффективное количество анти-СИ40 антитела или белка по изобретению, например, антитела тАЬ1, тАЬ2 или тАЬ3, и композиция имеет значение рН от 5,0 до 7,0.

В других вариантах осуществления изобретения жидкая фармацевтическая композиция включает анти-СИ40 антитело или белок по изобретению, например, антитело тАЬ1, тАЬ2 или тАЬ3, в концентрации в диапазоне от 0,1 до 50 мг/мл или от 5,0 до 25,0 мг/мл, приблизительно 150 мМ хлорида натрия, и приблизительно 10, 20, 30, 40 или 50 мМ сукцината натрия или цитрата натрия, со значением рН, равным приблизительно 5,5.

Деградация белка вследствие замораживания/оттаивания или механической деформации во время обработки жидкой фармацевтической композиции по настоящему изобретению могут быть ингибированы включением сурфактантов в композицию для снижения поверхностного натяжения на границе раздела раствора/воздуха. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения, жидкая фармацевтическая композиция включает терапевтически эффективное количество анти-СИ40 антитела или белка по изобретению, например антитела тАЬ1, тАЬ2 или тАЬ3, буфер для поддержания значения рН композиции в пределах диапазона от приблизительно рН 5,0 до приблизительно рН 7,0, и дополнительно включает сурфактант. В других вариантах осуществления изобретения, жидкая фармацевтическая композиция включает терапевтически эффективное количество анти-СИ40 антитела или белка по изобретению, например, антитела тАЬ1, тАЬ2 или тАЬ3, буфер для поддержания значения рН композиции в пределах диапазона от приблизительно рН 5, 0 до приблизительно рН 7,0, изотонизирующее вещество, такое как хлорид натрия в концентрации от приблизительно 50 мМ до приблизительно 300 мМ, и дополнительно включает сурфактант.

Общепринятыми применяемыми сурфактантами являются неионные сурфактанты, включая эфиры полиоксиэтиленсорбитола, такие как полисорбат 80 (Т\\ееп 80) и полисорбат 20 (Тетееп 20); эфиры полиоксипропилена-полиоксиэтилена, такие как Р1иготс Р68; полиоксиэтиленовые спирты, такие как Вгу 35; симетикон; полиэтиленгликоль, такой как РЕ0400; лизофосфатидилхолин; полиоксиэтилен-п-токтилфенол, такой как ТгПоп Х-100.

Классическая стабилизация фармацевтических средств сурфактантами или эмульсификаторами

- 23 026133 описана, например, в Ьеуше е! а1. (1991), 1. Рагейега1 8сЕ ТесЬио1. 45(3):160-165, включенная в настоящий документ в качестве ссылки. Предпочтительным сурфактантом, применяемым на практике по настоящему изобретению, является полисорбат 80. Там, где включен сурфактант, он обычно добавляется в количестве от 0,001 до 1,0% (вес./об.).

Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения, жидкая фармацевтическая композиция включает терапевтически эффективное количество анти-СО40 антитела или белка по изобретению, например, белка тАЬ1, тАЬ2 или тАЬ3, буфером является буфер сукцината натрия или цитрата натрия или гистидина или гистидина гидрохлорида в концентрации от 1 до 50 мМ, от 3 до 40 мМ или от 5 до 35 мМ, или от 7,5 до 30 мМ; композиция имеет значение рН от 5,0 до 7,0; и данная композиция дополнительно включает сурфактант, например, полисорбат 80, в количестве от 0,001% до 1,0% или от 0,001% до 0,5%. Такие композиции могут в некоторых случаях включать изотонизирующее вещество, такое как хлорид натрия в концентрации от 50 до 300 мМ, от 50 до 200 мМ или от 50 до 150 мМ.

В других вариантах осуществления изобретения, жидкая фармацевтическая композиция включает анти-СЭ40 антитело или белок по изобретению, например, антитело тАЬ1, тАЬ2 или тАЬ3, в концентрации от 0,1 до 200,0 мг/мл или от 1 до 100,0 мг/мл, или от 2 до 50,0 мг/мл, или от 5,0 до 25,0 мг/мл, включая приблизительно 20,0 мг/мл; от 50 до 200 мМ хлорида натрия, включая приблизительно 150 мМ хлорида натрия; сукцината натрия или цитрата натрия от 5 до 20 мМ, включая приблизительно 10 мМ сукцината натрия или цитрата натрия; хлорида натрия в концентрации от 50 до 200 мМ, включая приблизительно 150 мМ; гистидин или хлорид гистидина от 5 до 50 мМ, включая приблизительно 30 мМ гистидина или хлорида гистидина; и в некоторых случаях сурфактант, например, полисорбат 80, в количестве от 0,001 до 1,0%, включая от 0,001 до 0,5%; где жидкая фармацевтическая композиция имеет значение рН, равное от приблизительно 5,0 до приблизительно 7,0.

Жидкая фармацевтическая композиция может практически не содержать каких-либо консервантов и других носителей, вспомогательных веществ или стабилизаторов, указанных выше в настоящем документе. Альтернативно, композиция может включать один или несколько консервантов, например, антибактериальных веществ, фармацевтически приемлемые носители, вспомогательные вещества или стабилизаторы, описанные выше в настоящем документе, при условии, что они не оказывают неблагоприятного воздействия на физикохимическую стабильность антагонистического анти-СО40 антитела или антигенсвязывающего фрагмента вышеуказанного. Примеры приемлемых носителей, вспомогательных веществ и стабилизаторов включают, помимо прочего, дополнительные буферные вещества, вспомогательные растворители, сурфактанты, антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин, хелатирующие агенты, такие как ЭДТА, металлокомплексы (например, Ζπ-белковые комплексы), и биоразлагаемые полимеры, такие как полиэфиры. Детальное обсуждение композиции и выбор фармацевтически приемлемых носителей, стабилизаторов и изомолитов можно найти в КепипдЮп/ РЬагтасеи1юа1 8с1епсе§ (18'¹' ей., Маск РиЬЬкЫпд Сотрапу, ЕаЮп, Реппкуката, 1990).

После того, как жидкая фармацевтическая композиция или другие фармацевтические композиции, описанные в настоящем документе, приготовлены, они могут быть лиофилизированы для предотвращения деградации. Методы лиофилизирования жидких композиций известны средним специалистам в данной области техники. Непосредственно перед использованием композиция может быть растворены в стерильном разбавителе (растворе Рингера, дистиллированной воде или стерильном солевом растворе, например), который может включать дополнительные ингредиенты.

После растворения композицию предпочтительно назначают субъектам, используя те методы, которые известны специалистам в данной области техники.

Применение антагонистических анти-СБ40 антител в производстве лекарственных средств

Настоящее изобретение также представляет антагонистическое анти-С.'О40 антитело или белки по изобретению для использования в лечении аутоиммунных заболеваний и/или воспалительных заболеваний у субъекта, где прием лекарственного средства скоординирован по меньшей мере с одним другим видом терапевтического лечения.

Под термином координированный подразумевают, что лекарственное средство должно быть использовано либо до, либо во время, либо после лечения субъекта по меньшей мере одним другим видом терапии. Примеры других видов терапии включают, помимо прочего, те, что описаны выше в настоящем документе, т.е. хирургическую операцию или оперативные вмешательства (например, спленэктомию, лимфаденэктомию, тиреоидэктомию, плазмаферез, лейкофорез, трансплантацию клеток, ткани или органа, перфузию органа, желудочно-кишечные манипуляции, и т.п.), лучевую терапию, терапию такую, как стероидная терапия и нестероидная терапия, гормонотерапия, цитокинотерапия, терапия с дерматологическими веществами (например, местнодействующими средствами, используемыми для лечения кожных патологий, таких как аллергия, контактный дерматит и псориаз), иммуносупрессивная терапия, и другие способы противовоспалительной терапии моноклональными антителами и т.п., где лечение дополнительным терапевтическим воздействием или дополнительными терапевтическими воздействиями происходит до, во время или после лечения субъекта лекарственным средством, включающим антагонистическое анти-СО40 антитело или белки по изобретению, как указано выше в настоящем документе.

В одном таком варианте осуществления, настоящее изобретение представляет антитело тАЬ1,

- 24 026133 тАЬ2 или тАЬ3 для использования в лечении аутоиммунного заболевания и/или воспалительного заболевания у субъекта, где применение лекарственного средства скоординировано с лечением по меньшей мере одним другим видом терапевтического воздействия, как описано выше в настоящем документе.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, применение лекарственного средства, включающего антагонистическое анти-СЭ40 антитело, например, моноклональное антитело тАЬ1, тАЬ2 или тАЬ3, рассмотренное в настоящем документе, или антигенсвязывающий фрагмент вышеперечисленного, скоординировано с лечением двумя другими видами терапевтического воздействия.

В случае, когда применение лекарственного средства, включающего антагонистическое анти-СО40, скоординировано с двумя другими видами терапевтического воздействия, использование лекарственного средства может быть до, во время или после лечения субъекта любым из двух или обоими вместе другими видами терапевтического воздействия.

Изобретение также представляет антагонистическое анти-С.'О40 антитело, например, антитело тАЬ1, тАЬ1 или тАЬ3, рассмотренное в настоящем документе, для использования в лечении аутоиммунного заболевания и/или воспалительного заболевания у субъекта, где лекарственное средство используется у субъекта, который предварительно уже прошел курс по меньшей мере одного другого вида терапевтического лечения.

Под термином предварительно прошедший курс терапии или предварительный курс терапии подразумевают, что субъекту был уже проведен один или несколько других видов терапевтического лечения до получения лекарственного средства, включающего антагонистическое анти-С.'О40 антитело или белок по изобретению.

Нижеприведенные примеры предлагаются в качестве иллюстрации, а не в качестве ограничения. Описание чертежей

Фиг. 1 демонстрирует включение ³Н-тимидина после того, как 72-часовая культура РВМС человека была стимулирована дозозависимым воздействием СЫт12.12 (незаштрихованный кружок), тАЬ1 (заштрихованный кружок), тАЬ2 (заштрихованный квадрат), тАЬ3 (заштрихованный треугольник) или СО40Ь человека (незаштрихованный квадрат).

Фиг. 2 демонстрирует включение ³Н-тимидина после того, как 72-часовая культура РВМС человека была стимулирована дозозависимым воздействием СЫт12.12 (незаштрихованный кружок), тАЬ1 (заштрихованный кружок), тАЬ2 (заштрихованный квадрат), тАЬ3 (заштрихованный треугольник) или СО40Ь человека (незаштрихованный квадрат), изотипический контроль (заштрихованный ромб) был костимулирован в присутствии либо 5 мкг/мл анти-1дМ Р(аЬ')₂, либо 1 мкМ СрО2006.

Фиг. 3 демонстрирует включение ³Н-тимидина после того, как 72-часовая культура РВМС человека была стимулирована дозозависимым воздействием СЫт12.12 (незаштрихованный кружок), тАЬ1 (заштрихованный кружок), тАЬ2 (заштрихованный квадрат), тАЬЗ (черный треугольник) или СО40Ь человека (незаштрихованный квадрат), изотипический контроль (заштрихованный ромб) был костимулирован в присутствии 75 нг/мл 1Ь-4.

Фиг. 4 демонстрирует включение ³Н-тимидина после того, как 72-часовая культура РВМС человека была стимулирована 20 мкг/мл СО40Ь с дозозависимым воздействием СЫт12.12 (незаштрихованный кружок), тАЬ1 (заштрихованный кружок), тАЬ2 (заштрихованный квадрат), тАЬ3 (черный треугольник) или СО40Ь человека (незаштрихованный квадрат).

Фиг. 5 демонстрирует дозозависимое связывание анти-СЭ40 антитело человека с клеточными линиями В1АВ, соответственно, СЫт12.12 (заштрихованный кружок), тАЬ1 (незаштрихованный квадрат), тАЬ2 (незаштрихованный треугольник), тАЬ3 (заштрихованный треугольник).

Примеры

Материалы.

1. Моноклональные антитела.

СЫт12.12 (1.9 мг/мл), тАЬ1 (0,88 мг/мл), тАЬ2 (1,9 мг/мл) и тАЬЗ (1,9 мг/мл) были поставлены в 50 мМ цитрате рН 7,0, 140 мМ ЫаС1. Изотипический контроль 1§О был также использован для отдельных экспериментов (δίβΗκτ δΐ. Ьош8, υδΛ).

2. Стимулы активации В-клеток.

Кроличьи антитела против фрагмента Ай^Рите Р(аЬ') 1дМ человека были получены из .Тасккоп 1ттипо КекеагсЬ ^ийо1к, иК), и СрО2006 было получено из МютокуйЪ (Ва1дасЬ, δ^ϋ^τΗηά). Рекомбинантный СО40Ь человека был получен, используя стандартные методы, известные средним специалистам в данной области техники. Супернатант, содержащий 1Ь-4 человека, был получен, используя стандартные методы, известные средним специалистам в данной области техники.

3. Реагенты для работы с тканевыми культурами ш уйго.

Культуральная среда для РВМС: КРМ1-1640, 10% ΡΒδ, 1% пенициллин/стрептомицин, 1% неосновные аминокислоты, 1% пируват натрия, 5 мМ β-меркаптоэтанол (все из 1пуйтодеп, δаη П1едо, ^А).

Методы.

1. Анализ СО40Ь-опосредованной пролиферации РВМС.

1.1. Очистка мононуклеарных клеток периферической крови человека (РВМС).

Первичные РВМС были очищены из лейкотромбоцитарного слоя цельной крови, полученного от

- 25 026133 здоровых добровольцев (ЫШкрепбе/етгит, Ваке1). Лейкотромбоцитарный слой был разведен 1:4 РВ§ без Са₂+ и Мд₂+, содержащего 5 мМ ЭДТА, и расфасован аликвотами по 25 мл в пробирки Ра1соп объемом 50 мл. Поверх разведенного лейкотромбоцитарного слоя наслаивали 14 мл фиколла Р1со11-Р1ас|ие Р1и8 (ОЕ Неаййсаге) в расчете на одну пробирку Ра1соп, и центрифугировали при комнатной температуре в течение 20 мин при 2250 об/мин (без торможения). После центрифугирования слой интерфазы был перенесен в отдельную пробирку Ра1соп объемом 50 мл. Слои интерфазы из нескольких пробирок (от одного донора) были объединены с образованием объема, равного или меньшего 30 мл. РВ§, дополнительно содержащий 5 мМ ЭДТА, был добавлен, и клетки были центрифугированы при комнатной температуре в течение 5 мин при 2250 об/мин. Супернатант удаляли до добавления 15 мл лизирующего эритроциты буфера (КВС) и инкубации при комнатной температуре в течение 5 мин. Затем 20 мл РВ§/5мМ ЭДТА были добавлены и клетки были снова центрифугированы (комнатная температура, 5 мин, 2250 об/мин). Клетки были промыты дважды в РВ§/5мМ ЭДТА (с промежуточными этапами центрифугирования) и ресуспендированы в 35 мл культуральной среды для РВМС до определения числа живых клеток, используя метод исключения трипанового синего. Клетки, не подлежащие немедленному использованию для стимуляции ш уйго, были криоконсервированы.

1.2. Анализ стимуляции РВМС ш уйго.

Серия из семи двукратных разведений каждого анти-СЭ40 или изотипического контроля тАЬ была сделана трижды в 96-луночных планшетах Сок!аг в присутствии и в отсутствие постоянной дозы величиной 5 мкг/мл анти-1дМ Р(аЬ')₂, 1 мкМ СрО2006, супернатанта, содержащего 1Ь-4 (75 нг/мл) человека, или 40 мкг/мл рекомбинантного йиСП40Ь (указаны конечные концентрации). Начальные концентрации каждого анти-СЭ40 тАЬ находились в диапазоне от 20 до 100 мкг/мл в зависимости от эксперимента. СО40Ь был использован в анализе дозозависимого эффекта в качестве положительного контроля для всех экспериментов. Дозы анти-1дМ, СрО2006, 1Ь-4 и СО40Й были выбраны, руководствуясь предыдущими экспериментами, где способность этих реагентов (по отдельности или в комбинации) индуцировать пролиферацию РВМС или В-клеток была оценена в анализе дозозависимого эффекта (данные не показаны). РВМС (конечная плотность 8х10⁴ клеток на лунку) были последовательно добавлены в каждую лунку до инкубации в течение 3 дней при 37°С/5% СО₂. ³Н-тимидин (1 мкКи/50 мкл/лунка) был добавлен в каждую лунку для культивирования в течение последних 6 ч до сбора клеток и определения включения тимидина, используя сцинтилляционный счетчик М1сгоВе!аТгйих. Важно отметить, что клетки плюс культуральная среда и клетки плюс культуральная среда плюс анти-1дМ, 1Ь-4, СрО2006 или СО40Й контрольные культуры (в отсутствие анти-СЭ40 тАЬ) были включены в каждый эксперимент.

Сцинтилляционные данные были проанализированы программой Ехсе1 и программным обеспечением ОгарйРаб Ргйт. Результаты представлены среднее число импульсов в минуту (срт) (+/-стандартная ошибка среднего) в зависимости от концентрации анти-СЭ40тАЬ в логарифмической шкале. Фоновый уровень положительных контролей и клеток плюс культуральные среды указаны на каждом графике. Значения 1С₅₀ или ЕС₅₀ были вычислены в соответствии с результативной аппроксимацией данных с помощью программы Ргйт.

РВМС были стимулированы, как указано выше, 20 мкг/мл СО40Ь в присутствии или в отсутствие дозозависимого эффекта тестируемого анти-СО40 тАЬ в течение 3 дней. Пролиферацию оценивали по включению 3Н-тимидина после 72 ч культивирования. Результаты представлены в виде среднего значения трижды повторенного культивирования клеток с 8ЕМ и характерны для 4 доноров (независимые эксперименты). Значения 1С₅₀ для опосредованного анти-СЭ40 тАЬ ингибирования представлены в мкг/мл.

2. 1п уйго анализ агонистов РВМС.

РВМС человека были стимулированы, как указано выше в параграфе 1.2, с дозозависимым эффектом СЙЙ12.12, тАЬ1, тАЬ2 или тАЬ3 в течение 3 дней либо в отсутствие костимуляции, либо в присутствии либо 5 мкг/мл анти-1дМ Р(аЬ')₂ либо 1 мкМ СрО2006. Пролиферацию оценивали включением ³Нтимидина после 72 ч культивирования. Результаты представлены в виде среднего значения трижды повторенного культивирования клеток с 8ЕМ и характерны для 4 доноров (независимые эксперименты).

3. Анализ АРСС.

мкл суспензии РВМС (10х10⁶ клеток/мл) было добавлено в плашкис круглодонными ячейками (Согшпд 1псогрога!еб - Сок!аг #3790), 50 мкл окрашенных кальцеином клеток Кар (2х 10⁵ клеток/мл) и 100 мкл разведения антитела или контролей были добавлены. Максимальный лизис определяли в 2% Тгйоп 100.

Клетки были собраны на дне плашки (3 мин при 250хд) и инкубированы при 37°С в увлажненной СО₂-атмосфере (5%) в течение 1 ч. Клетки были отделены от культуральной среды центрифугированием (3 мин при 750хд), и 100 мкл супернатанта было перенесено в чистые плашки с темным дном (Согшпд 1псогрога!еб - Сок!аг #3904) для измерения.

Флуоресценцию измеряли при 535 нм после возбуждения при 485 нм на спектрофотометре 8ресйаМах Оетии (Мо1еси1аг Оеуюек). Специфический лизис был вычислен, используя следующую формулу:

- 26 026133 (экспериментальное испускание - спонтанное испускание)/(максимальное испускание спонтанное испускание) х 100.

4. Связывание вариантов антитела против СГО40 человека с человеческой клеточной линией В1АВ.

Была использована проточная цитометрия для сравнительного анализа связывания различных вариантов фрагмента Рс анти-СЭ40 антитела с клетками В1АВ человека. В связи с этим, 2х10⁵ клеток были посеяны в каждую лунку 96-луночного планшета с ν-образным дном. Планшеты были промыты дважды 200 мкл буфера РАС8 (РВ8, 5% РС8, 2 мМ ЭДТА) в течение 2 мин при 4°С при 1350хд. Супернатанты были удалены и клетки были ресуспендированы в 100 мкл буфера РАС8, содержащего 8% сыворотку человека (ΙπνίΙΐΌίικχ, по каталогу № 84190) и инкубированы в течение 10 мин. После двух промывок варианты Рс-фрагмента антитела против СЭ40 человека были добавлены в 50 мкл буфера РАС8 с 1% сывороткой человека, начиная с концентрации 10 мкг/мл в разведении 1:2. Клетки были инкубированы в течение 30 мин на льду с последующими двумя этапами промывок. 50 мкл поликлональных кроличьих поликлональных антител против Р(аЪ')₂ 1дС-Р1ТС человека (ΌΛΚΟ, по каталогу № Р 0315) были добавлены в каждую лунку и инкубированы в течение 30 мин на льду. В конце инкубации клетки были промыты дважды, ресуспендированы в 100 мкл буфера РАС8, и была получена информация на РАС8 Сап1о11.

После получения информации средняя интенсивность флуоресценции по каналу Р1ТС была получена в Р1о1о. Построение графиков и аппроксимация кривой было выполнено с помощью СгарНРаб Рпкт 5.0. Ввиду меняющихся интенсивностей между индивидуальными экспериментами, данные были нормированы. Таким образом, наибольшее значение каждой тестовой серии антитела было равно 100%. Нелинейная аппроксимация была проведена для значений в процентах.

5. Анализ СО40Б-опосредованной продукции цитокинов в дендритных клетках моноцитарного происхождения (МоЭС).

5.1. Приготовление дендритных клеток моноцитарного происхождения человека.

РВМС человека были приготовлены из лейкотромбоцитарных слоев, поставляемых 8\νίκκ Кеб Сгокк. Лейкотромбоцитарная масса была разбавлена 1:5 в РВ8 (1пуЦтодеп, по каталогу № 20012019) и расфасована в виде аликвот по 35 мл в пробирках Ра1соп объемом 50 мл. Затем 13 мл Рюо11 (СЕ НеаИЬсаге, по каталогу № 171440-02) были внесены на дно каждой пробирки. Клетки были центрифугированы при 1680хд при комнатной температуре в течение 20 мин без торможения. Содержащий РВМС слой был собран и промыт дважды в большом объеме РВ8 в течение 5 мин при 1000хд. В конечном итоге клетки были ресуспендированы в 10 мл РВ8 и посчитаны.

Моноциты человека были выделены методом негативной селекции из 100х10⁷ РВМС, используя коммерческий набор по выделению моноцитов кН II производства МШепуа (МШепуц Сегтапу, по каталогу № 130-091-153) на приборе Аи1оМАС8 в соответствии с инструкцией производителя. После выделения клетки были промыты дважды в течение 5 мин при 1000хд при 4°С в культуральной среде КРМ11640 (1пуЦгодеп, по каталогу № 61870010), 10% РС8 (1пуЦгодеп, по каталогу № 16000044, американского происхождения), 1 мМ пирувате натрия (1пуЦгодеп, по каталогу № 11360039), 1хЫЕАА ОпуНгодеп, по каталогу № 11140035), 1хпенициллин/стрептомицин (1пуЬтодеп, по каталогу № 15140122)). Выделенные моноциты были посчитаны, посеяны в 6-луночные планшеты плотностью 0,4х10⁶/мл и были культивированы в течение семи дней при 37°С, 5% С02. Для дифференцировки моноцитов в дендритные клетки рекомбинант, 1Ь-4 человека [80 нг/мл] и СМ-С8Р человека [100 нг/мл] (оба продуцируются в лошади), были добавлены к клеточной культуре в начале культивирования.

5.2. Стимуляция дендритных клеток (ИС) для цитокиновой секреции.

Незрелые дендритные клетки были собраны после 7 дней культивирования путем ополаскивания 6луночных планшетов, объединения клеток в пул и промывания их дважды в течение 5 мин при 1400х д в культуральной среде. Затем 2х10⁵ ГОС были посеяны в 96-луночный плоскодонные планшеты (Вес1оп О|ск|пкоп, по каталогу № 353072) в 100 мкл. Для положительного контроля клетки были стимулированы МедаСП40Ь (А1ех1к, по каталогу № АБХ-522-110-С010) в концентрации 1 мкг/мл, отрицательный контроль состоял из ГОС, находящихся только в культуральной среде. При анализе антагонизма варианты Рс-фрагмента антитела против СГО40 человека были добавлены в концентрации 10 мкг/мл в разведении 1:2 наряду с 1 мкг/мл МедаСЭ40Ь для дозозависимого эффекта. Супернатанты стимулированных клеток были собраны через 24 ч для измерения ТЫРа. При анализе агонизма были добавлены только лишь варианты Рс-фрагмента антитела против СГО40 человека в концентрации 10 мкг/мл в разведении 1:2, и супернатанты были собраны через 48 ч после измерения ТЫРа. Клетки были посеяны и стимулированы трижды для всех видов анализа.

5.3. Измерения ТЫР альфа методом ЕЫ8А.

Для измерения количества ТЫРа в супернатантах был выполнен метод ЕЫ8А следующим образом. Захватывающим антителом анти-ТЫРа (ВИ РЬагт1пдеп, по каталогу № 551220) были покрыты планшеты для ЕЫ8А (Стешет, Ыипс Р96 Мах1когр, по каталогу № 442404) в концентрации 5 мкг/мл в 50 мкл, приходящихся на лунку, в течение ночи при 4°С. Для каждого этапа промывки планшеты были промыты 3 раза 250 мкл в устройстве для мойки планшетов ВюТек Е1х. После первой промывки 200 мкл 8иретЫоск

- 27 026133

ΤΒδ (Тйегто δΥηΙίΠα Р1егсе, по каталогу № 37535) были инкубированы в течение 1 ч при 37°С. Затем стандарт ΤΝΡα (рекомбинантный ΤΝΡα человека, К&И δуδΐетδ, по каталогу № 210-ТА) или образец были добавлены в 25 мкл. Конечная исходная концентрация стандарта составляла 20 нг/мл в серии разведений 1:2. Кроме того, 25 мкл детекторного антитела (биотинилированного антитела против ΤΝΡα человека, ΒΌ РНагпипдеп. по каталогу № 554511) было добавлено в разведении 1:500. Планшеты были инкубированы в течение ночи при 4°С. После промывки, конъюгат авидин-ΡΘΌ (щелочная фосфатаза Ех1гАУ, δίβΐηα, по каталогу № Е-2636) был разведен 1:5000 в δиρе^Ь1οск ΤΒδ, добавлен в 50 мкл и инкубирован в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты были промыты, и 50 мкл субстрата пнитрофенилфосфата (δίβΐηα, по каталогу № С-3041) было добавлено для развития цветной реакции в течение 15 мин. Планшеты ЕЬКА были сканированы при 450 нм с помощью программного обеспечения δοΓίΜαχ Рго на оборудовании δρесΐ^аΜаx М5 (Мо1еси1аг Эеуюез).

6. Токсикологическое исследование.

Исходной первичной целью токсикологического исследования была оценка потенциальной токсичности высокой дозы (100 мг/кг) тАЬ1 в сравнении с СЫг12.12.

Тридцать яванских макак маврикийского происхождения было использовано для данного исследования. На момент введения дозы препарата возраст животных составлял от приблизительно 4 до 5 лет, а их вес - от 4,5 до 6,6 кг для самцов и от 3,1 до 4,3 кг для самок.

тАЬ 1 (50 мг/мл) был назначен внутривенно одной группе яванских макак (5 самцов/5 самок; группа

2) в дозе 100 мг/кг и объемом 2 мл/кг один раз в неделю в течение 5 недель (применение исследуемого препарата на 1, 8, 15, 22, 29 и 36 дни). Дополнительная группа яванских макак (5 самцов/5 самок; группа

3) получала первичное антитело СЫг12.12 внутривенно путем медленной болюсной инфузии в дозе 100 мг/кг и объемом 5 мл/кг. Плацебо тАЬ1 объемом 2 мл/кг было введено другой группе яванских макак, которые служили в качестве контролей (5 самцов/5 самок; группа 1). Некропсия была проведена всем животным один или два дня спустя после введения последней дозы препарата.

Было решено включить иммунизацию гемоцианином лимфы улитки (КЬН) с целью оценки эффективности обоих антител анти-СИ40. На 2-й день животные были иммунизированы 1 мг КЬН, адсорбированного на квасцах, с последующей бустер-инъекцией 0,5 мг КЬН, адсорбированного на квасцах, на 23 день. Образцы сыворотки были взяты до иммунизации/бустера, а также на 7 и 14 дни после иммунизации и бустера соответственно. Титры Ι§Μ/Ι§Ο, специфичных к КЬН, были определены ЕЬКА, используя контрольную сыворотку анти-КЬН Ι§Μ/Ι§Ο яванских макак в качестве стандарта. Образцы крови были взяты накануне трех введений препаратов и на 15, 29 дни и в момент некропсии (день 37/38) с целью иммунофенотипирования необученных В-клеток (СЭ20+СО21+СЭ27-). Абсолютное количество необученных СИ20 В-клеток было вычислено из общего количества лимфоцитов в образце крови и относительного количества необученных СИ20 В-клеток, посчитанных проточной цитометрией.

Таблица 4

Сводная информация по результатам токсикологического исследования

Номер группы	Описание группы	Величина дозы (мг/кг/доэа)	Объем дозы® (мл/кг)	Количество животных в группе	Некропсия после 5 недель
Самцы	Самки
1	Контроль	0	2	5	5	5 самок/5 самцов
2	тАЫ	100	2	5	5	5 самок/5 самцов
3	СЫг12.12	100	5	5	5	5 самок/5 самцов

* На основании последних, на тот момент, данных об индивидуальном весе животного.

Оценку токсичности проводили на основании смертности, клинических наблюдений (клинических симптомов, включая наблюдения после введения дозы препарата, анализа кала, осмотра шерсти и потребления пищи), веса тела, офтальмологических исследований, сердечно-сосудистых исследований, клинической патологии (включая коагуляцию, оценку внешней активации тромбоцитов, гематологию, клиническую химию и анализ мочи), веса органов, макроскопических и микроскопических аутопсийных данных. Иммунофенотипирование крови было выполнено три раза до введения дозы препарата, на 15 и 29 день в фазу дозирования, а также в день некропсии. Кроме того, иммунофенотипирование ткани селезенки и дренирующих лимфатических узлов в местах инъекции гемоцианина лимфы улитки (КЬН) было выполнено в момент некропсии. Кроме того, Т-клеточнозависимый антительный ответ (ЕОАК) на КЬН был исследован для непосредственного сравнения влияния вызывающего в полной мере АЭСС СЫг12.12 с таковым тАЬ1. Образцы крови были взяты от всех животных для токсикокинетической оценки и для возможной оценки антител к лекарственному средству (АЭА).

- 28 026133

7. Дополнительный анализ ίη νίίΓΟ профиля тАЬ1.

7.1. Очистка РВМС.

Мононуклеарные клетки периферической крови человека были получены, как описано выше в разделе 1.1.

7.2. Очистка В-клеток миндалины человека.

Капсула миндалины и соединительная ткань были удалены и ткань миндалины затем была нарезана на приблизительно 5 мм большие куски до пропускания через металлическое ячеистое сито с периодическим промыванием средой для В-клеток. Клетки миндалины были затем профильтрованы дважды через 70 мкМ ячеистое сито для удаления клеточных обломков. В-клетки были выделены из свежеполученных РВМС, используя коммерческий набор Еа§у8ср №даГОс 8с1ссНоп Нитап В сс11 ЕппсНтсШ Κίί (81стсс11 ТссНпо1од1с8, Уапсот'сг ВС, Сапаба). В-клетки были очищены, используя коммерческий набор Еа§у8ср №да^с 8с1ссйоп Нитап В сс11 ЕппсНтсШ Κίί, следуя инструкциям фирмы-производителя (81стсс11 ТссНпо1од1с8, Уапсощсг ВС, Сапаба).

7.3. Оценка значений ЕС₅₀ связывания СО₄₀, используя РВМС или В-клетки человека и отличных от человека приматов.

РВМС (макака-резус, яванского макака или человека) или В-клетки миндалины (только человеческие) были инкубированы при 4°С в течение 30 мин с очищенными мечеными тАЬ1 или изотипическими контрольными антителами в исследовании дозозависимого эффекта (диапазон конечной концентрации 2,5-0,00125 мкг/мл). Клетки были затем промыты до инкубации с биотинилированными антителами против 1§О человека (перекрестно реагирующими с таковыми отличных от человека приматов) и против 1дС человека с минимальной перекрестной реактивностью с таковыми отличных от человека приматов (МНР) (£10; важно отметить, что было возможно различить В-клетки человека с мембранной экспрессией 1§О либо по наличию окрашивания анти-1дМ, либо путем дифференциальной интенсивности РАС8окрашивания). Клетки были снова инкубированы при 4°С в течение 30 мин до отмывки и подвержены заключительному окрашиванию со стрептавидин-Р1ТС в течение 20 мин при 4°С. Затем клетки были промыты, и была выполнена оценка экспрессии СЭ40 на клетках СЭ20+ методом проточной цитометрии.

7.4. Оценка ингибирования СО154-индуцированной пролиферации РВМС или В-клеток человека и отличных от человека приматов.

Серия из семи двукратных разведений каждого анти-СО40 или изотипического контрольного тАЬ была сделана трижды в 96-луночном планшете в присутствии концентраций ЕС80 человеческого рекомбинантного СЭ154 и 1Ь-4. Начальные концентрации каждого анти-СО40 тАЬ находились в диапазоне от 20 до 100 мкг/мл в зависимости от эксперимента. Клетки и контроли среды были использованы в качестве отрицательных контролей для всех экспериментов. РВМС (макака-резус, яванского макака или человека) или В-клетки миндалины (только человеческие) были последовательно добавлены в каждую лунку до инкубации в течение 3 дней при 37°С/5% С0₂. ³Н-тимидин (1 мкКи/50 мкл/лунка) был добавлен в каждую лунку для культивирования в течение последних 6 ч до сбора клеток и определения включения тимидина, используя сцинтилляционный счетчик.

8. Эффективность тАЬ1 в сочетании с циклоспорином А в модели аллотрансплантации почек у яванского макака.

8.1. Животные.

Все используемые яванские макаки (Масаса ГакасШабк) были самцами в возрасте 7,5-9 лет (#5529/#5533, #5523/#5524 и #5536/#5538), выведенные в неволе, с массой тела 7,7±0,9 кг и родом из Филиппин (81сопЬгсс, Макай СНу, РНШрршск). В момент трансплантации животные имели нормальные гематологические показатели, нормальный биохимический анализ сыворотки и мочи и у них не было обнаружено туберкулеза, сальмонеллы/шигеллы, антител против вирусных антигенов (Герпеса В, вируса Тклеточного лейкоза обезьян, вируса иммунодефицита обезьян, ретровируса типа Ό обезьян, гепатита В) и свойственных им экто/эндопаразитов. Однако у всех животных были выявлены антитела против цитомегаловируса и вируса гепатита А (НАУ) (исследованы в 2010; животное #5536 не имело антител к НАУ). У животного #5523 был положительный копрологический анализ на Ва1апббшт соН в декабре 2010.

В течение первой недели после операции животных содержали в одиночных телеметрических клетках, обеспечивающие визуальный контакт с другими животными. Остальное время животных #5536/#5538 содержали вместе и 4 оставшихся животных содержали выделенно друг от друга в течение всего эксперимента (несовместимые животные). Всех животных содержали в условиях заданной температуры (20-24°С), по меньшей мере 40% влажности и естественного светового цикла. Всех кормили по меньшей мере два раза в день смесью фруктов и овощей. Вода и гранулы КНЬа ШГад 3446 (Ка18сгаид8к Осгтапу) были предоставлены неограниченно.

Все эксперименты были выполнены в соответствии со швейцарскими нормами условий содержания животных по лицензии В81555.

- 29 026133

Таблица 5

Характеристики животных

Вид	Порода	Категория	Поставщик	Пол	Вес	Возраст
Яванский макак (Масаса Гавскикпа)	Любая	Не определена	ΒίοΡΚΙΜ	Самцы /самки	7,7±0,9	7,5-9

8.2. Экспериментальные условия.

8.2.1. Трансплантация почек и послеоперационное наблюдение.

Пары донор/реципиент были выбраны ориентируясь на совпадение по антигенам АВО, отсутствию совпадений по экзону 2 Ό8Β (В1аисЬег Α., Пккеуге Р., Эи1аиг М., е! а1. (2006), Iттиηοдеηе!^ск; 58(4):26982) и ответы в односторонней реакции смешанной культуры лимфоцитов (МЬК), имеющие показатели МЬК-стимуляции (МЬК-Б1к) больше 7 и меньше 47 (В1§аиД М., Маигег С., Vеά^^пе, е! а1. (2004), I. РЬагιη;κο1. ^χ^ο! Мейюйк; 50(2):153-9). Результаты этого отбора представлены в табл. 6 и заключались в двойной трансплантации (обмен трансплантатами между 2 донорами). Каждому реципиенту имплантировали телеметрический зонд (Эа1а Баепсек 1пс, υδΑ) для мониторинга артериального кровяного давления, частоты сердечных сокращений и двигательной активности.

Для операции общая анестезия была вызвана кетамином; 10 мг/кг, внутримышечно, (в.м.) в сочетании с атропином (0,05 мг/кг в.м.) и поддерживалась вентиляцией Ν₂Ο/Ο₂ (50:50) и пропофолом внутривенно (в.в.) (4-10 мг/кг/ч; с добавлением 5-10 мг болюсов в случае необходимости). Почки донора были изъяты, промыты холодным (4°С) раствором υν ШшуегкПу οΓ νί^ο^ω) (время консервирования холодом меньше или равно 4 ча) и гетеротопически трансплантированы, используя стандартные микрососудистые технологии для создания анастомоза конец в бок между почечной веной трансплантата и полой веной реципиента и между почечной артерией трансплантата и дистальным участком аорты реципиента (время создания анастомоза меньше или равно 40 мин). Уретеро-цистонеостомия была выполнена сразу после появления мочи из трансплантата. Собственные почки были удалены. Послеоперационное обезболивание обеспечивали введением бупренорфином, 0,01-0,02 мг/кг, в.м., три раза в день; антибиотики (цефотаксим, 25 мг/кг, в.м., два раза в день или цефтриаксон, 50 мг/кг, в.м. в 1% лидокаине, четыре раза в день). Обезболивание и введение антибиотиков проводили в течение 5 дней. Всякий раз, когда происходило заметное повышение или снижение числа тромбоцитов, назначали аспирин в дозе 5 мг/кг в.м. ежедневно Укре^с, δаηοΓ^-Ανеηί^к, Меули Б\\Л/ег1апй).

У реципиентов контролировали изменения клинических и сердечно-сосудистых показателей, веса тела, потребления еды и воды (пополнялось до макс. 100-150 мл/кг/день), выведения мочи, гематологии (используя Весктапп СоиНег ΑΟΥΟίΓΓ), биохимический анализ сыворотки и мочи (используя анализатор Vе!ксап апа1у/ег для ежедневного определения δС^еа/δυ^еа/δΑтуίаке и анализатор Весктапп БупсЬгоп СХ5 для заключительного подтверждения данных по образцам сыворотки и мочи). Уровни сывороточного креатинина и мочевины (Бигеа) были использованы в качестве маркеров функции трансплантата. Чрескожные биопсии под ультразвуковым наблюдением были выполнены иглой 16О, как описано ранее (ОаксЬеп Ь., Кипк1ег Α., Мептпдег К., е! а1. (2001), Vе!. Кайю1. иЬгабюипй; 42(3):259-64), в условиях общей анестезии на 30 день (только для животных #5529 и #5533). Кроме того, был также проведен специальный контроль свертываемости крови и агрегации тромбоцитов у животных #5529/#5533 и #5523/#5524 до и после трансплантации.

Реципиентам, в конечном счете, была проведена эвтаназия в случае (ί) тяжелой степени отторжения трансплантата (например, Бсгеа больше 500 мкмоль/л или Бигеа больше 20 ммоль/л), ассоциированная или нет с повышенной бальной ультразвуковой оценкой; или (ίί) общих проблем со здоровьем и/или явных клинических признаков тяжелого недомогания. В момент некропсии аллотрансплантаты почек были изъяты (включая мочеточник и анастомоз) наряду с другими важными органами и обработаны для дальнейшего гистологического анализа.

- 30 026133

Таблица 6

Основная информация о комбинациях донор/реципиент и используемой схемы лечения

8.2.2. Воздействие тЛЫ и циклоспоринаА (СвА).

тАЫ поставляли в жидкой форме при температуре хранения -80°С, будучи размороженным только в день инфузии. Был применен в дозе 30 мг/кг/в.в. еженедельно, за исключением первых трех доз в день -1, 0 и 1 (до и после трансплантации). СвА для перорального применения (р.о.) представлял собой первичный концентрат микроэмульсии (раствор для питья БапЛттии №ога1 (КТМ), 100 мг/мл, Νοναηίδ РЬагта АО). СвА применяли в ежедневной дозе (начиная с -1 дня), равной 20 мг/кг/р.о., в сочетании с тАЫ (см. табл. 6).

8.2.3. Мониторинг фармакокинетики (РК), иммуногенности (антитело приматов против человеческого иммуноглобулина) и фармакодинамика (РЫ) тАЬ 1.

Образцы крови (500 мкл сыворотки) были взяты (до внутривенного введения дозы препарата) для определения воздействия тАЬ1 в день -1, 3, 7 (исходный уровень и 15 мин), 14, 28, 42, 56, 70, 84 и 100. Для анализа СвА образцы крови были взяты до перорального введения дозы или СвА (С0/С24) и спустя 2 ч после применения (С2). С2 соответствует пиковым уровням абсорбции СвА. Все образцы хранили при 80°С до дальнейшего использования (СвА беЮсйои кЬ, Но1 §1аг Тад Мав1ег Μίχ, О|адси МитсвоЮ. И8). Образцы для тАЬ1-иммуногенности были взяты (50 мкл сыворотки) в день -1, 7, 14, 28, 42, 56, 70, 84 и 100 и хранили при -80°С. Вкратце, девяносто шестилуночные планшеты для микротитрования были покрыты рекомбинантным СЭ40 человека. Их хранили при 4°С в пределах ночи. После блокирования стандарты калибратора (Св), образцы контроля качества (ОС) и опытные экземпляры образцов, содержащие тАЬ1, были добавлены в планшет. Планшет был инкубирован при 25°С в пределах 120 мин с перемешиванием. После промывки планшета мышиные антитела против легкой цепи каппа человека с последующим использованием ИКР овечьего антимышиного (И+Ь) конъюгата были добавлены в планшет для определения сколько-нибудь тАЬ1, связанного с рекомбинантным СЭ40. Для визуализации этого связывания был добавлен хромогенный субстрат (ТМВ) и интенсивность окрашивания (поглощения) была прямо пропорциональна концентрации имеющегося тАЬ1. Концентрация тАЬ1 в образцах затем была вычислена из калибровочной кривой. Образцы ΡΌ были получены на 2-3 дни до трансплантации в качестве исходных уровней (0,5 мл в гепарине). Впоследствии коллекция образцов была проанализирована по той же схеме, что и для образцов РК. СИ20+ и СИ3+ клетки были посчитаны с помощью ТгиСоии! ТиЬев (ВесЮи О|ск|ивои, по каталогу № 340334), используемые в соответствии с инструкциями фирмы-производителя с помощью тАЬ против СИ40-АРС человека (клон 5С3, ВесЮи О|ск|ивои, по каталогу № 555591), против СИ3-РегСР человека (клон 8Р34-2, ВесЮп Оюктвои, по каталогу № 552851) и тАЬ против СИ20-Р1ТС человека (клон ЬТ20, 1ттиио1оо1в, по каталогу № 21279203X2). Данные были получены на проточном цитометре Ь§К11 (ВесЮп Оюктвои Вюваеисев), используя программное обеспечение ΩΐνΛ (версия 6.1.1). Лимфоциты и гранулы были введены в Р§С/88С дот-блот в соответствии с размером и зернистостью, и впоследствии в них была проанализирована экспрессия СЭ20 и СЭ3.

8.2.4. Гистология.

Все полученные ткани (биопсия трансплантата или аутопсийный материал) были исследованы макроскопически и фиксированы в 4% формалине, содержащем буферный раствор. После дегидратации они были заключены в парафин. Парафиновые блоки были нарезаны толщиной 3 мкм и окрашены гематоксилином и эозином (НЕ). Три дополнительных окрашивания (Шифф-йодной кислотой, трихромом и методом Верхофа) были выполнены на срезах почки. Образцы биопсии и аутопсии были исследованы опытным патоморфологом и были выставлены баллы в соответствии с классификацией Ваий 07 патологии аллотрансплантата почки (8о1е/ К., СоМи К.В., Касивеи Ь.С. е1 а1 (2008), Ат. 1. Тгаивр1аи1; 8(4):75360). Независимая оценка была также выполнена приглашенными экспертами.

Кроме того, иммуногистохимия по выявлению белка комплемента С4б была выполнена, используя поливалентное анти-С4б антитело, пригодное для окрашивания парафиновых срезов (Кеде1е Н., Ехиег

- 31 026133

М., №а!8сЫпдег В., е! а1. 2001, ЫерЬго1, Э1а1. Тгапкр1ап!; 16: 2058-2066). С4Ь считают стабильным и надежным маркером острого гуморального отторжения (АнК). После фиксации и заключения в парафин стекла (8ирегРго81Р1и8, КТМ, Меп/е1-О1аекег, Оегтапу) с нанесенными срезами толщиной 3 мкм были приготовлены и высушены в течение ночи в термостате при 37°С для оптимальной адгезии к стеклам. Срезы отторгнутых почек человека были добавлены в качестве положительного контроля. Перед использованием стекла со срезами ткани были депарафинированы в ксилоле (10 мин), регидратированы путем проводки через ряд концентраций этанола и помещены в дистиллированную воду. Демаскирование антигена было выполнено варкой под давлением величиной 1 бар в течение 10 мин в цитратном буфере (рН 6.0), как описано ранее (8едегег δ., Маск М., Кеде1е н., Кеца8сНк1 Ό., 5сН1бпБогГГ Ό. КзБпеу 1п!. 1999; 56: 52-64). Для иммуноокрашивания была использована следующая методика: (ί) инактивировать эндогенную пероксидазу 0,5% Н₂О₂ в абсолютном метаноле в течение 20 мин при комнатной температуре; (ίί) промыть срезы на стеклах в 0,01 М РВ§, рН 7,4 (§1§та-А1БпсЬ СНепие ОтЬн, Оегтапу); (ίίί) инкубировать срезы на стеклах 4% обезжиренным порошковым молоком КарПаД в РВ§ (М1дгок Оепо88еп8сЬаЙ8ЬипБ, 5>\Уй/ег1апБ) в течение 60 мин при комнатной температуре; отобрать раствор, не промывать; (ίν) инкубировать один срез на стекле с кроличьими рАЬ против С4Б человека (ВютеБюа МеБ1/1пргоБик1е, У1еппа, Ли51г1а) 1:40 в РВ§, содержащем 1% ΝΟΐδ, в течение ночи при 4°С. Второй срез на стекле служил в качестве отрицательного контроля путем нанесения кроличьего изотипического контроля (2утеБ ЬаЬогаЮпек 1пс, И8А) вместо первичного антитела; (ν) промыть стекла со срезами в 0,01М РВ§, рН 7,4; (νί) инкубировать все стекла со срезами с биотинилированными овечьими антителами против 1дО кролика (Уес!ог ЬаЬогаЮпек, 1пс. И8А) 1:200 в РВ§, содержащем 1% ΝΟΐδ, в течение 30 мин при комнатной температуре; (νίί) промыть стекла со срезами в 0,01М ΡВδ, рН 7,4; (νίίί) инкубировать со стрептавидином/нКР (Уес!ог ЬаЬога!опе8, 1пс. и5А) в ΡВδ в течение 30 мин при комнатной температуре, (ίχ) проявить активность нКР с помощью АЕС+ (ОакоСу!ота!юп Согр., СагреШепа, и5А) в течение 8-10 мин, контролировать интенсивность окрашивания микроскопически, промыть дистиллированной водой, (х) докрасить Эако (КТМ) Аи!ота!юп ИетаЮхуПп (ОакоСуЮтаБоп Согр., СагреШепа, и5А) в течение 2 мин и поменять окраску на синюю в проточной водопроводной воде в течение 5 мин; (χί) заключить в водную заливочную среду (МеБДе МеБ1/т1ес1ийк АО, 5\\л1/ег1апБ).

Пример 1. Оценка агонистической активности тАЬ1, тАЬ2 и тАЬ3.

Экспериментальные данные основаны на использовании выделенных, нефракционированных исходных РВМС человека. Препараты всех РВМС (вместо выделенных В-клеток или моноцитов) более точно воспроизводят ситуацию ш νί\Ό, где анти-СЭ40 тАЬ могут оказывать разнообразные прямые и непрямые воздействия на различные клеточные типы лейкоцитов. Используя этот анализ пролиферации РВМС, было выявлено, что негликозилированные анти-СЭ40 тАЬ1 (Ш97А) и тАЬ2 (О265А), которые сохранили аминокислотную последовательность антигенсвязывающей области, остались без изменений по сравнению с исходным С1йг12.12 тАЬ, сохранили неагонистические, блокирующие СО40Ь свойства исходного СЫг12.12 тАЬ. Антитело тАЬ3 (мутант ВАВА) проявляло слабые агонистические свойства в присутствии 1Ь-4.

В частности, экспериментальные данные демонстрируют, что ни один из молчащих фрагментов Рс анти-СО40 тАЬ не был способен стимулировать клеточное деление РВМС человека (п=4 донора), результат, подобный тому, что наблюдают с исходным СЫг12.12 тАЬ (см. фиг. 1). РВМС пролиферировали в ответ на СО40Ь. Ни тАЬ1, ни тАЬ2 не могли усилить индуцированную СрО2006 или анти-1дМ Р(аЬ')₂ пролиферацию РВМС (фиг. 2). Кроме того, СЫг12.12 не смог усилить индуцированную анти-1дМ Р(аЬ')₂ пролиферацию РВМС, однако в отличие от тАЬ1 и тАЬ2, оно полностью ингибировало индуцированную СрО пролиферацию РВМС.

В присутствии 1Ь-4, тАЬ3 (БАГА мутация) индуцировало низкие, но воспроизводимые (п=4 донора) уровни включения тимидина выше тех, что индуцировал 1Ь-4 в отдельности, в то время как тАЬ1, тАЬ2 и СЫг12.12 не обладали таким свойством (фиг. 3). Вместе взятые эти результаты указывают на то, что за исключением тАЬ3, (в присутствии 1Ь-4) ни одно из анти-СЭ40 тАЬ не обладало агонистической активностью.

Упомянутые выше результаты также отчетливо продемонстрировали, что тАЬ 1 и тАЬ2 не обладали агонистической активностью в присутствии костимулирующих сигналов. Эти данные имеют важное значение, поскольку полагают, что лейкоциты пациента с хроническим аутоиммунным заболеванием могут иметь активированный или частично активированный фенотип и, следовательно, могут быть сенсибилизированы к сигнальному пути, опосредованному СЭ40, или другим стимулам. Было замечено, что С1йг12.12 (но не молчащий фрагмент Рс тАЬ или СО40Ь) полностью ингибировало СрО2006индуцированную пролиферацию РВМС. СрО2006 является синтетическим лигандом для То11-подобного рецептора 9 (ТЬК9), рецептора, демонстрирующего связывание патогена и 88^NА (одноцепочечную ДНК) хозяйского происхождения. У человека ТЬК9 экспрессируется В-клетками и (в меньшей степени) моноцитами в периферической крови. Поскольку СрО-содержащие ΟΌΝ, как было уже показано, усиливают АЭСС (Мода, е! а1. 2008), можно предположить, что СрО2006 способен усилить АЭСС, опосредуемую Рс фрагментом 1дО1 эмбрионального типа исходного СНгг12.12 тАЬ.

- 32 026133

Пример 2. Оценка способности молчащего фрагмента Рс анти-СЭ40 тАЬ блокировать СЭ40Ьопосредуемую пролиферацию РВМС.

Предыдущие данные указывали на то, что СЫг12.12 может блокировать СО40Ь-опосредуемую пролиферацию первичных В-клеток человека и клеточных линий В-клеточной лимфомы человека. Мы измерили ингибирование СО40Ь-опосредованной пролиферации РВМС под действием СЫг12.12 и трех антител по изобретению тАЬ1, тАЬ2, тАЬ3. В нижеприведенной табл. 7 представлены значения 1С₅₀ для такого ингибирования в мг/мл (результаты представлены в виде среднего значения по трижды повторенным экспериментам на культурах с 8ЕМ и характерны для 4 доноров, независимые эксперименты). Результаты демонстрируют, что СЫг12.12 может также ингибировать СО40Ь-опосредуемую пролиферацию РВМС. Кроме того, тАЬ1, тАЬ2 и тАЬ3 также полностью блокировали СЭ40Ь-опосредуемое деление РВМС с эффективностью, подобной СЫг12.12. Ни одно из анти-СЭ40 тАЬ не блокировало индуцируемую анти-1дМ+ 1Ь-2 пролиферацию РВМС (данные не показаны), предполагая, что блокирующая активность анти-СЭ40 тАЬ зависела от мишени (и не была связана с функцией Рс).

Таблица 7

Значения 1С₅₀ для опосредуемого анти-СЭ40 тАЬ ингибирования СО40Ь-опосредуемой пролиферации РВМС (мкг/мл)

Пример 3. Связывание вариантов антитела против СЭ40 человека с клеточной линией ΒίΛΒ человека.

Для исключения возможных изменений в специфическом связывании с СЭ40, связывание трех вариантов тАЬ1, тАЬ1 и тАЬ3 было протестировано в сравнении с исходным СЫг12.12 на В-клеточной линии, Β.ΙΑΒ, которая конститутивно экспрессирует СЭ40. Связывание было протестировано при титровании дозы, начиная с 10 мкг/мл при разведении 1:2.

Для сравнения кривых, полученных в разных экспериментах, наибольшее значение медианы интенсивности флуоресценции при каждом индивидуальном титровании дозы принимали за 100% связывания, и была применена нелинейная аппроксимация. В двух отдельных экспериментах все четыре варианта антител СЫг12.12, тАЬ1, тАЬ2 и тАЬ3, демонстрировали эквивалентные кривые связывания на клетках В1АВ (фиг. 5). Никаких изменений связывающей способности данных вариантов антител не могли наблюдать при различных мутациях связывающей области Рс СЫг12.12.

Таким образом, приведенные выше результаты, показали, что мутация связывающего сайта Рс не влияла на сайт связывания СЭ40 различных областей исходного СЫг12.12. тАЬ1, тАЬ2 и тАЬ3 сохраняли эквивалентное связывание СЭ40 на клетках В1АВ.

Пример 4. Стимуляция/ингибирование секреции ΤΝΒ альфа из дендритных клеток человека моноцитарного происхождения под действием вариантов Рс анти-СО40.

Стимуляция секреции ΤΝΒ альфа из МоЭС человека под действием вариантов Рс анти-СЭ40.

Некоторые антитела против СЭ40 человека, как было показано, оказывают агонистическое воздействие на различные клеточные популяции (ОгиЬег 1989). Для исключения того, что Рс-варианты тАЬ1, тАЬ2, тАЬ3 и СЫг12.12 приводят к активации МоЭС, авторы изобретения исследовали, могут ли антитела сами по себе индуцировать секрецию ΤΝΒα при инкубации в течение 48 ч с клетками. В отличие от антагонистического анализа семидневную культуру МоЭС человека культивировали в течение 48 ч только в присутствии всех четырех анти-СЭ40 вариантов для получения дозозависимой кривой, начиная с 10 мкг/мл. Затем в супернатантах было проанализировано количество ΤΝΒα методом ЕЫ8А. Все антиСЭ40 варианты тАЬ1, тАЬ2, тАЬ3 и СЫг12.12 не индуцировали секрецию ΤΝΒα из МоЭС по сравнению с СП40Ь-стимуляцией в качестве положительного контроля (данные не представлены). Никакой зависимости от дозы не было обнаружено для всех четырех вариантов антитела. Количество ΤΝΒα значительно не поднималось выше уровня такового нестимулированных МоЭС (данные не представлены). Следовательно, агонистическую активность этих четырех антител можно исключить.

Ингибирование секреции ΤΝΒ альфа из МоЭС человека под действием вариантов Рс анти-СЭ40.

Исходное антитело СЫг12.12 блокирует взаимодействие СЭ40-С040Ь и, следовательно, должно также блокировать активацию клетки. Стимуляция СЭ40 на дендритных клетках человека моноцитарного происхождения под действием триммера СЭ40Ь приводит, например, к секреции провоспалительных цитокинов, таких как ΤΝΒα (Ма 2009). Опять-таки, изменение фрагмента Рс не должно повлиять на блокирующие функции вариантов при сравнении с СЫг12.12. Все четыре антитела должны ингибировать СО40Ь-опосредуемую секрецию ΤΝΒα из МоЭС человека с эквивалентным значением 1С₅₀.

Таким образом, семидневную культуру МоЭС человека стимулировали в течение 24 ч МедаСП40Ь

- 33 026133 двойным тримерным, рекомбинантным конструктом в присутствии всех четырех блокирующих антиί'.Ό40 вариантов. Затем в супернатантах было проанализировано количество ΤΝΡα методом ЕЫ8А. Все Рс-мутированные варианты тАЬ1, тАЬ2 и тАЬ3 демонстрировали одинаковое дозозависимое ингибирование подобно СЫг12.12 в трех независимых экспериментах (данные не представлены).

Предварительные результаты также демонстрируют подобное ингибирование секреции 1Ь-23 из ΜοΌΟ человека (данные не представлены).

Была использована нелинейная аппроксимация для определения 1С₅₀ всех четырех антител, и было вычислено среднее значение 1С₅₀ из этих экспериментов. Среднее значение 1С₅₀ четырех вариантов в отношении секреции ΤΝΡα из ΜοΌΟ человека находилось в диапазоне от 32 до 40 нг/мл (табл. 8). Таким образом, мутации фрагмента Рс не оказывают влияния на антагонистический эффект вариантов антител.

Таблица 8

1С₅₀ различных вариантов Рс в отношении ингибирования ΤΝΡ альфа

	#1	#2	#3	Среднее значение	ЗЕМ
СЫг12,12	п.с»	41	30	36	4
тАЫ	23	44	58	40	10
тАЬ2	41	12	42	33	10
тАЬЗ	39	8	47	32	12

Значение 1С₅₀ приведено в нг/мл для различных вариантов Рс против СЭ40 человека для трех независимых экспериментов. Нелинейная аппроксимирующая кривая в эксперименте #1 для С1йг12.12 не позволила точно оценить 1С₅₀ (п.с. = не вычислено).

Таким образом, приведенные выше результаты показали, что все четыре варианта были неактивны в отношении стимуляции секреции ΤΝΕα из ΜοΩΟ. Гораздо более важным является тот факт, что все варианты тАЬ1, тАЬ2 и тАЬ3 ингибировали СО40Ь-опосредованную цитокиновую продукцию ΜοΩΟ человека со схожей эффективностью ш νίΐτο при сравнении с С1йг12.12.

Пример 5. Суммирование данных.

Приведенная ниже табл. 9 суммирует некоторые из важных свойств антител тАЬ1, тАЬ2 и тАЬ3 по изобретению при сравнении с исходным антителом С1йг12.12.

Таблица 9

Сравнительные данные

Критерии выбора	СМг12.12	тАЫ	тАЬ2	тАЬЗ
Связывание антн-С1)4О АЬ с СО40 человека (Шасоге. КО нМ)	0,55	0,69	0,49	0,33
Активность АИСС (нормированный специфический лизис)	100%	<1%	<1%	40%
Агонистическая активность на РВМС человека (ЕС50, нг/мл)	>10000	>10000	>10000	>10000
Ингибирование СО40Ц-РВМС человека (1Сзо, нг/мл)	13	15	17	15
Τιπ (дни)-Вы РК (10 мг/кг)	9,3+/-0,90	9,8+/-0,49	11,6+/-2,3	н.о. (не определено)

- 34 026133

Пример 6. Краткое описание пригодных аминокислотных и нуклеотидных последовательностей для использования изобретения на практике.

ЗЕф Ю ΝΟ:	Описание последовательности
1	НСЬК1 аминокислотная последовательность СН1К12.12, тАЬ1 г тАЬ2, тАЬЗ
2	НСОР.2 аминокислотная последовательность СН1К12.12/ тАЫ, тАЬ2, тАЬЗ
3	НСЬКЗ аминокислотная последовательность СН1К12.12, тАЫ, тАЬ2, тАЬЗ
4	ЬСОК1 аминокислотная последовательность СН1Р.12.12, тАЫ, тАЬ2, тАЬЗ
5	ЬСЬК2 аминокислотная последовательность СН1К12.12, тАЫ, тАЬ2, тАЬЗ
6	ЬСЬКЗ аминокислотная последовательность СН1К12.12, тАЫ, тАЬ2, тАЬЗ
7	та аминокислотная последовательность СН1Н-12*12, тАЫ/ тАЬ2/ тАЬЗ
8	УЬ аминокислотная последовательность СН1Г-12Т12, тАЬ1/ тАЬ2/ тАЬЗ
9	Аминокислотная последовательность полноразмерной тяжелой цепи СН1К-12.12
10	Аминокислотная последовательность полноразмерной легкой цепи СН1Е-12.12
11	Аминокислотная последовательность полноразмерной тяжелой цепи тАЫ
12	Аминокислотная последовательность полноразмерной легкой цепи тАЫ
13	Аминокислотная последовательность полноразмерной тяжелой цепи тАЬ2
14	Аминокислотная последовательность полноразмерной легкой цепи тАЬ2
15	Аминокислотная последовательность полноразмерной тяжелой цепи тАЬЗ
16	Аминокислотная последовательность полноразмерной легкой цепи тАЬЗ
17	Аминокислотная последовательность Гс-фрагмента тАЫ
18	Аминокислотная последовательность Гс-фрагмента тАЬ2
19	Аминокислотная последовательность Гс-фрагмента тАЬЗ

20	ДНК, СН1К-	кодирующая полноразмерную тяжелую 12.12	цепь
21	ДНК, 12.12	кодирующая полноразмерную легкую цепь	СН1К-
22	ДНК,	кодирующая полноразмерную тяжелую цепь	тАЫ
23	ДНК,	кодирующая полноразмерную легкую цепь	тАЫ
24	ДНК,	кодирующая полноразмерную тяжелую цепь	тАЬ2
25	ДНК,	кодирующая полноразмерную легкую цепь	тАЬ2
26	ДНК,	кодирующая полноразмерную тяжелую цепь	тАЬЗ
27	ДНК,	кодирующая полноразмерную легкую цепь	тАЬЗ
28	Аминокислотная последовательность СО40 человека

- 35 026133

Пример 7. Пригодные аминокислотные и нуклеотидные последовательности для использования изобретения на практике

ЗЕО Ю ΝΟ:	Подробные аминокислотные или нуклеотидные последовательности
1	3Υ3ΜΗ
2	νΐ3ΥΕΕ3ΝΚΥΗΑϋ3νΚι3
3	ϋίίΙΑΑΡΰΡϋΥ
4	НЗЗОЗЬЬУЗЖУЫУЪР
5	ЫЗЗЫРАЗ
6	МОАКОТРЕТ
7	ОУаЬУЕЗеОЗУУОРЗЕЗЬЕЪЗСААЗеЕТЕЗЗУСМНИУЕСАРСКеЪЕТдГУ АУР5УЕЕ5ЫЕУНАО57К<ЗРЕТ15РЕЬ15К1ТЬУЬ0МЫ5ЬРТЕРТАУУУС АЕОСС1ААРЗРОУИЗОСТЪУТУЗЗ
8	О17МТ05РЬ5ЬТУТРЗЕРА313СР3303ЕЕУЗЫСУЫУЕРИУЕ0КРСаЗ Р0УЫЗЬ63ЫКАЗетРОКГЗС363СТРГТЬК13КУЕАЕРУ6УУУСМ<ЗА κοτρΓΤΓεΡΞΤκνϋΐκ
9	ОУОЬУЕЗеОЗтеаРЗКЗЬКЬЗСААЗСЕТГЗЗУбМНИУКаАРбКСЪЕИУ Ανΐ5ΥΕΕ3ΝΕΥΗΑϋ3νΚΰΡΕΤΙ5ΡΕΝ3ΚΙΤΕΥΕαΜΝ5ΕΡΤΕΡΤΑνΥΥΟ АРП13<31ААРЗРПУИЗОЗТЬУТУ35АЗТКЗРЗУЕРЬАРАЗКЗТ53СТАА ЪЗСЪУКОУЕРЕРУТУЗКЫЗСАЪТЗСУНТЕРАУЬОЗЗСЬУЗЪЗЗУУТУР ЗЗЗЬСТОТУЮИУЫНКРЗЫТКУРКЕУЕРКЗСРКТНТСРРСРАРЕЬЬСС Р5УЕЪЕРРКРКОТЬМ15КТРЕУТСУУУОУ5НЕРРЕУКЕНИУУЕСУЕУН ЫАКТКРКЕЕ0УКЗТУКУУЗУЬТУЬНаРИЬПСКЕУКСКУ5ИКАЬРАР1Е КТ15КАК30РКЕР0УУТЬРР$РЕЕМТКНаУ5ЪТСЪУКСЕУР8Р1АУЕИ ЕЗЫ<30РЕЫЫУКТТРР7ЬП5ЕС5ЕЕ1А5КЬТУРК5РИ00СЫУЕ5С5\/МН ЕАЬНЫНУТОКЗЬЗЬЗРЗК
10	О1УМТаЗРЬЗЬТУТРОЕРА313СР53а5ЕЬУЗЫСУиУЬЕИУЬаКРСа5 РОУЫЗЬЗЗЫРАЗСУРПНЕЗЗЗеЗСТРЕТЪКТЗРУЕАЕПУСУУУСМОА РОТРЕТЕЗРЗТКУМРРТУААРЗУЕТЕРРЗРЕОЬКЗСТАЗУУСЬЬЫЫЕ УРЕЕАКУО^КУОЫАЪОЗСЫЗОЕЗУТЕОРЗКЕЗТУЗЪЗЗТЬТЪЗКАОУЕ КНКУУАСЕУТНОСЬЗЗРУТКЗЕЫКСЕС

- 36 026133

11	ОУОЕУЕЗСССУУОРЗЕЗЕЕЕЗСААЗСЕТЕЗЗУбМНИУЕОАРОКОЕЕМУ ΑΥΤ3ΥΕΕ3ΝΕΥΗ АРЗУКСЕЕТ1 ЗЕРКЗК1ТЬУ ЬОМЛЗЕЕТЕР ТАУУУСАЕР<3<31ААР13РРУИ СОСТЕУТУЗЗ АЗТКСРЗУГР ЬАРЗЗКЗТЗС СТААЬССЬУКРУЕРЕРУТУЗ ИЫЗСАЬТЗСУ НТЕРАУЬОЗЗ СЬУЗЬЗЗУУТ УРЗЗЗЬСТ0ТУ1СЫУЯНКРЗ ЫТКУРКЕУЕР КЗСРКТНТСР РСРАРЕЕЕСС Р5УЕЪЕРРКРКПТЬМ15РТР ЕУТСУУУРУЗ НЕРРЕУКЕЫИ УУЬСУЕУНЫА КТКРЕЕЕОУАЗТУЕУУЗУЬТ УЬНСРИЬЫСК ЕУКСКУЗЫКА ЬРАР1ЕКТ13 КАКСОРКЕРОУУТЬРРЗЕЕЕ МТКЫОУЗЬТС ЬУКСЕУРЗРТ АУЕИЕЗЫСОР ЕЫЫУКТТРРУЬРЗРСЗЕЕЬУ ЗКЬТУЕКЗЕИ СССКУЕЗСЗУ МНЕАЬНЫНУТ £К5Ь5Ь5РСК
12	РТУМТЗЗРЬЗ ЬТУТРСЕРАЗ 13СЕЗЗдЗЬЬ УЗЫСУКУЬРИ УЬОКРСОЗРОУЫЗЬСЗЫЕА ЗСУРРЕЕЗСЗ 636ТЕЕТЬК1 ЗЕУЕАЕРУСУ УУСМОАЕОТРЕТЕСРСТКУР 1ЕЕТУААР8У ЕТЕРРЗРЕОЬ КЗСТАЗУУСЬ ЬШЕУРРЕАКУОИКУЕПЛЬО ЗЗЫЗОЕЗУТЕ ОРЗКРЗТУЗЬ ЗЗТЬТЬЗКАР УЕКНКУУАСЕУТНССЬЗЗРУ ТКЗЕЫЕСЕС
13	ОУОЬУЕЗССС УУОРСЕЗЬЕЕ ЗСААЗСЕТЕЗ 5УСМНИУК0А РСКСЬЕИУАУ13УЕЕЗЫЕУН АРЗУКСЕЕТ1 ЗЕРЫЗК1ТЬУ ЬОМЫЗЬЕТЕП ТАУУУСАЕРССРААРСРРУИ СОСТЕУТУЗЗ АЗТКЗРЗУЕР ЬАРЗЗКЗТЗС СТААЕССЕУКРУГРЕРУТУЗ ИЫЗСАЬТЗСУ НТЕРАУЬОЗЗ СЬУЗЕЗЗУУТ УРЗЗЗЬСТСТУТС1ТУЫНКРЗ ЫТКУЕКЕУЕР КЗСРКТНТСР РСРАРЕЬЬСС Р5УЕЕЕРРКРКРТЕМ15РТР ЕУТСУУУАУЗ НЕРРЕУКЕШ УУРСУЕУНЫА КТКРКЕЕдУЫЗТУКУУЗУЬТ УЬНОРИЬЫСК ЕУКСКУЗЫКА ЬРАР1ЕКТ13 КАКСОРКЕРСУУТЬРРЗКЕЕ МТКЫОУЗЕТС ЬУКСЕУРЗРТ АУЕИЕЗЫСОР ЕЫЫУКТТРРУЬРЗРСЗЕЕЬУ ЗКЬТУРКЗКИ СССЫУЕЗСЗУ МНЕАЬНЫНУТ СКЗЬЗЬЗРСК
14	Р1УМТ05РЬ5 ЬТУТРСЕРАЗ 13СК3303ЬЬ Υ5ΝΟΥΝΥΕϋ№ УЬОКРСОЗРОУЫЗЬСЗЫРА ЗСУРРЕЕЗСЗ СЗСТРЕТЬК1 ЗЕУЕАЕРУСУ УУСМфАКфТРЕТЕСРСТКУР ΪΕΕΤΥΑΑΡ3Υ Е1ЕРРЗРЕ()Ь КЗСТАЗУУСЬ ЕШЕУРЕЕАКУОИКУЕЫАЕО ЗЗЫ50Е5УТЕ ОРЗКРЭТУЗЬ ЗЗТЬТЕЗКАР УЕКНКУУАСЕУТНОЗЕЗЗРУ ΤΚ3ΕΝΕΘΕΟ
15	□УОЕУЕЗССС УУ0РЗЕ5ЕЕЕ ЗСААЗСЕТЕЗ ЗУСМНМУЕОА РСКСЬЕИУАУ13УЕЕЗЫЕУН АРЗУКСЕЕТ1 ЗЕРЫЗК1ТЬУ ЬСМЫЗЕЕТЕР ТАУУУСАЕРСС1ААРСРРУК СССТЕУТУЗЗ А5ТКСР5УЕР ЬАРЗЗКЗТЗС СТААЬССЕУКРУГРЕРУТУЗ МЫЗСАЬТЗСУ НТЕРАУЬдЗЗ СЬУЗЬЗЗУУТ УРЗЗЗЬСТСТУТСКУЫНКРЗ ЫТКУРКЕУЕР КЗСРКТНТСР РСРАРЕААСС Ρ5ΥΕΕΕΡΡΚΡΚΡΤΕΜΙ5ΚΤΡ ЕУТСУУУРУЗ НЕРРЕУКЕЫИ УУРСУЕУНЫА КТКРЕЕЕОУЫЗТУЕУУЗУЕТ уьнавдьыок ЕУКСКУЗЫКА ЬРАР1ЕКТ13 КАКЗОРЕЕРОУУТЬРРЗЕЕЕ МТКЫОУЗЕТС ЬУКСЕУРЗРТ АУЕИЕЗЫеОР ЕЫЫУКТТРРУЬРЗРСЗЕЕЬУ ЗКЬТУРКЗЕИ ООЗЫУЕЗСЗУ ΜΗΕΑΕΗΝΗΥΤ СКЗЕЗЬЗРСК

16	Р1УМТОЗРЪЗ ЬТУТРСЕРАЗ 13СЕ3303ЕЕ Υ3ΝΟΥΝΥΕΡΜ ΥΕ0ΚΡΘ03Ρ0ΥΕΤ3Ε33ΝΕΑ ЗСУРРЕЕЗСЗ СЗСТРЕТЬК1 ЗЕУЕАЕРУСУ УУСМрАЕСТРЕТГСРСТКУР ТЕЕТУААРЗУ ΕΙΕΡΡ3ΡΕ0Ρ КЗСТАЗУУСЬ ЬЫЫЕУРЕЕАКУОИКУРЫАЬС ЗСЫЗОЕЗУТЕ рРЗКРЗТУЗЬ ЗЗТЬТЬЗКАР УЕКНКУУАСЕУТНОСЬЗЗРУ ТКЗГЫЕСЕС
17	АРЕЕЕССРЗУЕЬЕРРКРКРТЕМТЗЕТРЕУТСУУУРУЗНЕРРЕУКГЫИУ УРСУЕУНЫАКТКРЕЕЕОУАЗТУЕУУЗУЕТУЬНСРКЕЫСКЕУКСКУЗЫК АЬРАР1ЕКТТЗКАКС0РЕЕРСУУТЬРРЗЕЕЕМТКЫаУЗЬТСЬУКСЕУР ЗР1АУЕ№ЕЗЫСрРЕЫЫУКТТРРУЬРЗРСЗЕЕЬУ5КЬТУРКЗЕИСССЫУ ЕЗСЗУМНЕАЕНЫНУТОКЗЕЗЬЗРСК
1Θ	АРЕЕЕССРЗУЕЕЕРРКРКРТЕМТЗЕТРЕУТСУУУАУЗНЕРРЕУКГЫИУ УРСУЕУНЫАКТКРЕЕЕОУЫЗТУЕУУЗУЕТУЕНОРИЕЫСКЕУКСКУЗЫК АЕРАР1ЕКТ13КАКО0РЕЕР0УУТЕРРЗЕЕЕМТКЫ0УЗЕТСЬУКСЕУР ЗШАУЕИЕЗЫЗОРЕЫЫУКТТРРУЕРЗРСЗЕЕЕУЗКЕТУРКЗЕИООСЫУ ЕЗСЗУМНЕАЕНЫНУТОКЗЕЗЬЗРСК
19	АРЕААССРЗУЕЬЕРРКРКРТЕМТЗЕТРЕУТСУУУРУЗНЕРРЕУКЕЫИУ УРеУЕУНЫАКТКРЕЕЕаУКЗТУЕУУЗУЬТУЬНдРИЕЫСКЕУКСКУЗЫК АРРАР1ЕКТТЗКАКС0РЕЕРСУУТЬРРЗЕЕЕМТКЫ0УЗЬТСРУКСЕУР ЗШАУЕИЕЗЫЗОРЕЫЫУКТТРРУЕРЗРСЗЕЕЕУЗКЕТУРКЗЕИООСЫУ ЕЗСЗУМНЕАЬНЫНУТаКЗЬЗЬЗРСК

- 37 026133

20

САЗЗТЗСАЗТТЗЗТЗЗАЗТСТЗЗЗЗЗАЗЗСЗТЗЗТССАЗССТЗЗЗАЗЗ ТСССТЗАЗАСТСТССТЗТССАСССТСТССАТТСАССТТСАСТАССТАТ ЗЗСАТЗСАСТЗЗЗТССЗССАЗЗСТССАЗЗСААЗЗЗЗСТЗЗАЗТЗЗЗТЗ С САЙТ Т АТ АТ САТАТ САС6АААС Т ААТАСАТ АС С АТ ЗСАЗАС Т С С ЗТ С ААЗОЗССЗАТТСАССАТСТССАСАСАСААТТССААСАТСАСССТСТАТ С Т 3 САААТ 3 ААС АЗ С С Т САСААС Т ЗАОЗАСАСООС Т 3 Т 3 Т АТ Т АС Т 3 Т ЗСЗАЗАЗАТЗЗЗЗЗТАТАЗСАЗСАССТЗЗЗССТЗАСТАСТЗЗЗЗССАЗ ЗСААСССТСЗТСАССЗТСТССТСАЗСААЗТАССААСЗЗСССАТССбТС ТТСССССТСЗСССССЗСТАЗСААЗАЗСАССТСТЗЗЗЗЗСАСАССЗССС СТЗЗССТСССТЗСТСААЗЗАСТАСТТССССЗААССЗЗТЗАСЗЗТЗТСЗ ТССААСТСА0СС0СССТЗАССАССССССТССАСАССТТССССССТСТС СТАСАЗТССТСАЗЗАСТСТАСТСССТСАЗСАЗСЗТЗЗТЗАССЗТЗССС Т С САЗ САЗ С Τ Т333С АС ССАЗАССТАСАТ С Т ЗСААСЗ Τ ЗААТ САСААЗ СССАЗСААСАССААЗОТЗСАСААСАСАСТТЗСТСАСАССССАЗСАСАС ЗЗАЗСЗАСЗЗТЗТСТЗСТЗЗААЗССАЗЗСТСАЗСЗСТССТЗССТЗЗАС ЗСАТСССЗЗСТАТЗСАЗТСССАЗТССАЗЗЗСАЗСААЗЗСАЗЗССССЗТ СТСССТСТТСАСССЗЗАЗСССТСТССССЗССССАСТСАТ6СТСА666А ЗАЗЗЗТСТТСТЗЗСТТТТТССССАЗеСТСТеебСАбеСАСАббСТАЗб ТЗССССТААСССАЗССССТССАСАСАААСССССАЗСТССТССССТСАС АССТЗССАА0А0ССАТАТСССССАСЗАСССТЗССССТЗАССТААЗССС АССССАААЗЗССАААСТСТССАСТСССТСАЗСТСССАСАССТТСТСТС СТСССАЗАТТССАЗТААСТСССААТСТТСТСТСТЗСАЗАЗСССАААТС ТТЗТСАСААААСТСАСАСАТбСССАССеТбСССАЗбТААбССАбСССА ЗСССТСЗСССТССАЗСТСААССССССАСАССТССССТАСАСТАСССТС САТССАСЗСАСАСЗССССАЗССЗЗЗТЗСТЗАСАСЗТССАССТССАТСТ СТТССТСАОСАССТЗААСТССТССССССАСССТСАСТСТТССТСТТСС ССССААААСССААСЗАСАСССТСАТСАТСТСССССАССССТСАССТСА САТЗСЗТЗЗТЗЗТЗЗАСЗТЗАЗССАСЗААЗАСССТЗАЗЗТСААЗТТСА АСТЗЗТАСЗТЗЗАСЗЗСЗТССАССТССАТААТСССААСАСАААССССС ЗЗеАЗЗАЗСАЗТАСААСАЗСАСеТАССЗТСТеСТСАЗСбТССТСАССб ТССТЗСАССАЗСАСТЗЗСТЗААТЗЗСААЗЗАЗТАСААЗТССААЗСТСТ ССААСАААЗСССТСССАЗСССССАТСЗАЗААААССАТСТССАААЗССА АА30Т00САССС0Т00С0ТСССАСССССАСАТССАСАСАСССССССТС ЗЗСССАСССТСТССССТЗАЗАЗТСАССЗСТСТАССААССТСТСТСССТ АСАЗЗЗСАЗССССЗАЗААССАСАЗЗТЗТАСАСССТЗСССССАТСССЗЗ ЗАСЗАЗАТЗАССААЗААССАССТСАСССТЗАССТЗССТССТСАААСЗС ТТСТАТСССАЗСЗАСАТСЗССЗТЗЗАЗТЗЗЗАЗАЗСААТЗЗЗСАЗССЗ САСААСААСТАСААСАССАСЗССТСССЗТЗСТЗЗАСТССЗАСЗЗСТСС ТТСТТССТСТАТАЗСААЗСТСАСССТССАСААСАССАССТСССАССАС ЗЗЗААСЗТСТТСТСАТССТССЗТЗАТЗСАТЗАЗЗСТСТЗСАСААССАС ТАСАСЗСАЗААЗАЗССТСТСССТЗТСТССЗЗЗТААА

- 38 026133

21

САТАТТСТСАТСАСТСАСТСТССАСТСТСССТОАССОТСАССССТССА САСССССССТССАТСТССТССАССТССАСТСАСАСССТССТСТАТАСТ ААТССАТАСААСТАТТТССАТТССТАССТССАСААСССАСОССАОТСТ ССАСАССТССТСАТСТСТТТСССТТСТААТССССССТССССССТСССТ САСАССТТСАСТСССАСТССАТСАСССАСАСАТТТТАСАСТСААААТС АССАСАЗТССАСССТСАЗСАТЗТТСЗССТТТАТТАСТССАТССААССТ С САСАААС Т СС АТ Т С АС Τ Τ Т СССССС Т СССАССАААС Τ 3ΘΑΤ АТ САСА ССААСТСТСССТССАССАТСТСТСТТСАТСТТССССССАТСТСАТСАС САСТТСАААТСТССААСТСССТСТОТТСТСТСССТССТСААТААСТТС ТАТСССАСАСАССССАААСТАСАСТССААССТССАТААСССССТССАА ТССССТААСТСССАССАСАСТСТСАСАбАеСАССАСАССААеСАСАСС АССТАСАСССТСАССАССАСССТСАСССТСАССАААССАСАСТАССАС АААСАСАААСТСТАССССТСС6ААСТСАСССАТСАСССССТСАССТСС С С С ОТ САСАААСАССΤТСААСАССССАСАСТСТ

22

САССТССАССТССТССААТСТССС6СС66АСТССТ6САСССТС6ССС6 ТСССТСАСАСТСТСТТССССССССТСССССТТСАССТТСТССАССТАС СССАТССАСТСССТСССАСАССССССТСССААСССАСТССААТСССТС ССССТСАТСТССТАССАССААТССААСАСАТАССАСССТСАСТСССТС ААСССССССТТСАСААТСТССССССАСААСТССААСАТСАСССТСТАС СТССАСАТСААСТСССТССССАСССАССАСАССССССТСТАСТАСТСС СССАСССАСССАССААТССССССТССТССАССТСАТТАТТССС6ССАС СССАСССТССТСАСАСТСТССТССССТАССАССААСССССССТСССТС ТТСССТСТСССССССТССАССААСТССАССТСТССССССАСССССССТ СТССССТСССТССТСАААСАСТАСТТСССССАОСССОТСАСССТОТСС ТССААСТСТСССССССТСАССТССССССТССАСАССТТТССАССССТС СТССАСТССТССССССТСТАСТСССТСТССТСССТСОТСАСССТСССС Т с т АС с т с т ст с С 3 С АС ССАОАСС т АСАТ с т ССААСС т СААС САС ААС СССТССААСАССААССТССАСААСССССТССААСССААСТССТСССАС ААЗАСССАСАССТСТССССССТССССТСССССТСААСТССТССССССА ССТТССЗТСТТССТСТТССССССАААССССААССАСАСССТСАТСАТС ТСССССАССССССААСТСАССТСССТС6ТССТССАССТСТСССАССАС САСССТЗААСТСААСТТСААТТССТАССТССАСССССТССААСТССАС ААС С С СААСАС СААС С С С АСАС АС СААСАС ТАС С С С Т С САС С ТАСССС СТССТСТСТСТССТСАСССТССТССАССАССАСТСССТСААССССААА САСТАСААСТССААССТСТССААСААСССССТСССТССССССАТССАА ААСАССАТСТССААССССААСССССАССССССССАСССАСАССТСТАС АСАСТСССССССАССССССААСАСАТСАССААСААССАССТСТСССТС АССТСТСТССТСАААСССТТСТАССССТСССАТАТСССССТССАСТСС САСТССААСССАСАСССССАОААСААСТАСААСАССАСССССССТСТО СТССАСТСССАССССТСАТТСТТССТСТАСТССААССТСАСССТССАС ААСТСССССТСССАССАССССААССТСТТСТССТССТСС6ТСАТССАС САЗССССТССАСААССАСТАСАСССАСААСТСССТСТСССТСАССССС СССААС

- 39 026133

23

САСАТССТСАТСАСССАСТССССССТСТСССТСАСССТСАСАССТССС САСССТСССТСТАТСТССТССАСАТССТСССАСТСССТССТСТАСТСС ААССССТАСААСТАССТССАСТССТАТСТССАСААССССССССАСТСС ССАСАССТССТСАТСТСССТ6СССТССААСАСАСССТСТС6ССТСССС САССССТТСТСССССТСТСССТСТСССАСССАСТТСАСАСТСААСАТС ТСАССССТССААССССАС6АССТ6ССС6ТСТАСТАСТ6САТССАСССС ССССАСАСССССТТСАССТТССССССТСССАССААССТССАСАТСССС ССТАСССТССССССТСССАСССТСТТСАТСТТСССССССАСССАССАС САССТСААСАСССССАСССССАСССТОеТСТОССТОСТСААСААСТТС ТАССССССССАССССААС6ТССА6ТССААССТ66АСААСССССТССА6 АСССССААСАСССАССАСАСССТСАСССАССАССАСАССААССАСТСС АС С Т АСАС С С Т САС САС САС С С Т САС С С Т САС С ААС ССС САС Т АССАС ААССАТААССТСТАССССТССОАССТОАСССАССАООСССТОТССАОС ССССТСАССААСАССТТСААСАССССССАСТСС

24

САсетссАсстсетссААТстсбсебСбеАбтсетбСАесстбесссб ТСССТСАСАСТСТСТТССССССССТСССССТТСАССТТСТССАССТАС СССАТССАСТСССТСССАСАССССССТСССААСССАСТССААТСССТС ССССТСАТСТССТАССАССААТССААСАСАТАССАСССТСАСТСС6ТС ААСССССееТТСАСААТСТССССеСАСААСТССААбАТСАСССТеТАС СТССАСАТСААСТСССТССССАСССАССАСАССССССТСТАСТАСТСС СССАСССАСССАССААТССССССТССТССАССТСАТТАТТССССССАС СССАСССТССТСАСАСТСТССТССССТАССАССАА666ССССТСС6Т6 ТТСССТСТСССССССТССАССААСТССАССТСТССССССАСССССССТ СТССССТСССТССТСАААСАСТАСТТСССССАСССССТСАСССТСТСС ТССААСТСТСССССССТСАССТССССССТССАСАССТТТССАССССТС СТССАСТССТССССССТСТАСТСССТСТССТСССТССТСАСССТСССС Т С ТАС СТСТСТССС САС ССАСАСС ТАСАТ С Т ССААСС Т СААССАСААС СССТССААСАССААССТССАСААСССССТССААСССААСТССТСССАС аасасссасасстстсссссстсссстссссстсаастсстсссссса ССТТСССТСТТССТСТТССССССАААССССААССАСАСССТСАТСАТС ТСССССАССССССААСТСАССТСССТССТССТСССССТСТСССАССАС САСССТСААСТСААСТТСААТТССТАССТССАСССССТССААСТССАС ААС С С С ААС АС СААС С С САСАСАССААСАС Т АСААС ТССАС С ТАС ССС стсетстстстсстсАссетсстесАССАебАстебстеААСсесААА САСТАСААСТССААССТСТССААСААСССССТСССТССССССАТССАА ААСАССАТСТССААССССААСССССАССССССССАСССАСАССТСТАС АСАСТСССССССАССССССААСАСАТСАССААСААССАССТСТСССТС АССТСТСТССТСАААСССТТСТАССССТСС6АТАТС6СССТ6САСТ6С САС Т С СААС С САСАС ССС САСААСААС ТАСААСАС САС ССССССТСТС СТССАСТСССАССССТСАТТСТТССТСТАСТССАА6СТСАСССТС6АС ААСТСССССТСССАССАССССААССТСТТСТССТССТСССТСАТССАС САСССССТССАСААССАСТАСАСССАСААСТСССТСТСССТСАССССС СССААС

- 40 026133

25

САСАТССТСАТСАСССАСТССССССТСТСССТСАСССТСАСАССТССС САСССТСССТСТАТСТССТССАСАТССТСССАСТСССТССТСТАСТСС ААССССТАСААСТАССТССАСТССТАТСТССАСААССССССССАСТСС ССАСАССТССТСАТСТСССТССССТССААСАСАСССТСТССССТСССС САССССТТСТСССССТСТСССТСТСССАСССАСТТСАСАСТСААСАТС ТСАССССТССААССССАССАССТСССССТСТАСТАСТССАТССАСССС ССССАСАСССССТТСАССТТССССССТСССАССААССТССАСАТСССС сстассстсссссстсссассстсттсатсттсссссссасссассас САССТСААСАССС0САСС6ССАСССТССТСТСССТССТ6ААСААСТТС ТАССССССССАССССААССТССАСТССААССТССАСААСССССТССАС АСССССААСАСССАССАСАСССТСАСССАССАССАСАССААССАСТСС АССТАСАСССТСАССАССАСССТСАСССТСАССААС6СС6АСТАССАС ААССАТААССТСТАССССТСССАССТСАСССАССАСССССТСТССАСС ССССТСАССААСАССТТСААСАССССССАСТСС

26

САССТССАССТССТССААТСТССССССССАСТССТССАСССТСССССС ТСССТСАСАСТСТСТТССССССССТСССССТТСАССТТСТССАССТАС СССАТССАСТСССТСССАСАС6ССССТСССААСССАСТ6СААТСССТС ССССТСАТСТССТАССАССААТССААСАСАТАССАСССТСАСТСССТС ААСССССССТТСАСААТСТССССССАСААСТССААСАТСАСССТСТАС СТССАСАТСААСТСССТССССАСССАССАСАССССССТСТАСТАСТСС сссасссасссасоаатсссссстсстссасстсаттаттссссссас СССАСССТССТСАСАСТСТССТССССТАССАССААСССССССТСССТС ТТСССТСТССССССТТССАССААСТСТАССТССССССССАСАССТССТ СТССССТСССТССТСААССАСТАСТТСССТСАСССТ6ТСАСАСТСТСС тссААСтстсессссстсАсстстсссетссАСАСсттссстесссте СТССАСТССТССССССТСТАСТСССТСТССТСССТССТСАСАСТСССТ Т С ААС САС С С Т С С С САС ССАСАСС ТАТ АТС Т ОСААСС Т СААССАСААС ССТТССААСАССААССТССАСАА6СС6СТССАСССТААСТССТ6ССАС ААСАСССАСАССТСТССТСССТССССТССТССТСААССТССТСССССС ССТТСТСТСТТССТСТТСССТССАААССССААССАСАСССТСАТСАТС ТСССССАССССТСААСТСАССТСССТССТССТССАССТСТСССАССАС САТССТСААСТСААСТТСААТТСОТАССТССАССОССТССАССТССАС ААС С С СААСАС СААС С С ТССССАССААСАС ТАСААС Т ССАСС ТАСССС СТССТСТСССТССТСАСС6Т6СТ6САССАССАСТСССТСААССССААА САСТАСААСТССАААСТСТССААСААСССССТСССТСССССТАТССАА ААОАСААТСТССААООССААСССССАОССТАООСААССССАССТСТАС АСССТСССАСССАССССССАССАААТСАССААСААССАССТСТСССТС АсстстстсстсААСсссттстАсссттсссАТАТсессетсеАстсе САС Т с ТААС ССС САС С С Т6АСААСААСТАСААСАССАССС С Т С С Т С ТС СТССАСТСССАССССТССТТСТТССТСТАСТССАААСТСАСССТССАС ААСТСССССТСССАССАССССААССТСТТСТССТССТСССТСАТССАС САСССССТССАСААССАСТАСАСССАСААСТСССТСТСССТСТСТССС СССААС

27

САСАТССТСАТСАСССАСТССССССТСТСССТСАСССТСАСАССТССС САСССТСССТСТАТСТССТССАСАТССТСССАСТСССТССТСТАСТСС ААССССТАСААСТАССТССАСТССТАТСТССАСААССССССССАСТСС ССАСАССТССТСАТСТСССТССССТССААСАСАСССТСТССССТСССС САССССТТСТСССССТСТСССТСТСССАСССАСТТСАСАСТСААОАТС ТСАССССТССААССССАССАССТСССССТСТАСТАСТССАТССАСССС ССССАСАСССССТТСАССТТССССССТСССАССААССТССАСАТСССС ССТАСССТССССССТСССАСССТСТТСАТСТТСССССССАСССАССАС САССТСААСАСССССАСССССАСССТССТСТСССТССТСААСААСТТС ТАССССССССАССССААССТССАСТССААССТССАСААСССССТССАС АСССОСААСАСССАСОАОАСССТСАССОАОСАССАСАССААССАСТСС АС С ТАСАСС С Т САССАССАСС С Т САС ССТ САССААССС С САС ТАС САС ААССАТААССТСТАССССТСССАССТСАСССАССАСССССТСТССАСС ССССТСАССААОАОСТТСААСАСССССОАОТСС

28

МУНЬРЬОСУЬМССЬЬТАУНРЕРРТАСР-ЕКОУЫЫЗОССЗЬСОРСОКЬУ 5ЭСТЕЕТЕТЕСЬРСОЕ5ЕЕЬЕТ ШКЕТНСНаНК¥СОРКЬСЬКУС0КСТ5ЕТЕТ1СТСЕЕСИНСТ5ЕАСЕ5 СУЬНР5С5РСЕСУК01АТС¥5Р Т1СЕРСР7СЕЕ5Ы755АЕЕКСНРНТ5СЕТКПЬ7У00АСТЫКТЕУУССР 0ОЕЬЕАЬУУ1Ρ11ЕС1Ь ΕΑΙЬЬ УЪУЕ1КК7АККРТМКАРНРК0ЕРаЕ1ИГРРЕЬРС5ИТААР¥аЕТЬНСС 0ΡνΤ0ΕϋαΚΕ5ΡΙ5ν0ΕΡ0

Пример 8. Результаты токсикологического анализа.

Первоочередной задачей токсикологического исследования было определение токсичности тАЬ1 после еженедельного внутривенного введения яванскому макаку в течение 5 недель (6 применений исследуемого препарата). Не молчащая (АЭСС) версия этого антитела (СЫг12.12) была также использована с целью сравнения эффектов АЭСС-активного антитела с АЭСС-молчащей версией (тАЬ1).

Кроме того, животные были иммунизированы КЬН, чтобы оценить эффективность обоих антиСЭ40 АЬ.

Не было зафиксировано смертельных исходов или изменений массы тела, клинических симптомов и оцениваемого потребления пищи, обусловленных лечением тАЬ1 или СЫг12.12. Местные реакции в

- 41 026133 местах инъекции КЬН были аналогичны во всех группах.

Также не было никаких связанных с применением элемента тестирования данных в офтальмологических и сердечно-сосудистых исследованиях.

В гематологическом анализе небольшое, но статистически значимое, снижение процентного и абсолютного числа базофилов было обнаружено у животных, леченных тАЬ1 и СЫг12.12: связь с применением элемента тестирования не может быть исключена. Анализ мочи выявил кетоны в моче 1/5 самок, леченных тАЬ1, и 2/5 самок, леченных СЫг12.12, с невыясненной связью с дозированием препарата. В клиническом биохимическом анализе обнаружили незначительную тенденцию к повышению концентраций липазы в случае леченных СЫг12.12 самцов, а также одной самки, леченной СЫг12.12, однако это имело ограниченную токсикологическую значимость.

На свертываемость крови не повлияло лечение тАЬ1 или СЫг12.12, руководствуясь данными протромбинового времени, активированного частичного протромбинового времени и фибриногена. Число тромбоцитов оказалось в нормальном диапазоне значений. Концентрации Р-селектина или §СО40Ь в плазме не указывали на активацию тромбоцитов.

У животных, леченных СЫг12.12, иммунофенотипирование крови выявило выраженное снижение СЭ20' В-клеток, что являлось ожидаемым фармакологическим действием этого антитела. Особенно фракция СО20^низкий СО21+ В-клеток (которых рассматривают как СО40^{высокий}) была обеднена под действием СЫг12.12. Однако также было значительно снижено количество СО20^{высокий} СЭ21^- В-клеток, особенно к концу исследования. Преимущественно была обеднена фракция не обученных В-клеток С020+С021+С027^- под действием АОСС-активных антител СЫг12.12, в то время как на фракцию Вклеток памяти 0020+0021+0027+ почти не было оказано никакого влияния. Также было обнаружено приблизительное снижение на 50% абсолютного числа С016+ ΝΚ-клеток у животных, леченных СЫг12.12. Как и ожидалось, после лечения тАЬ1 (которое является АОСС-молчащим) значительного снижения числа СО20+ В-клеток не было обнаружено, так же как и не было какого-либо снижения абсолютного числа С016+ ΝΚ-клеток. Единственной фракцией В-клеток, демонстрирующей умеренное снижение количества во время дозирования препарата, были СО20^{высокий} С02ГВ-клетки. Известно, что эти клетки являются специфичными для макак и происходят из герминативного центра, следовательно, эти данные нельзя экстраполировать на человека.

Иммунофенотипирование селезенки и дренирующих КЬН лимфатических узлов при некропсии выявило схожую картину. Было обнаружено снижение относительного количества СО20+ В-клеток у леченных СЫг12.12 животных, однако никакого относящегося к данному случаю снижения числа СО20+ Вклеток не наблюдали у животных, леченных тАЬ1, с небольшим вплоть до умеренного снижения С021 В-клеток (в лимфатических узлах обоих полов, в селезенке - только у самцов). Не было различий в результатах иммунофенотипирования для правого и левого лимфатических узлов, дренирующих сайт инъекции КЬН.

Т-клеточно-зависимая реакция антител (ТОЛК) показала, что при сравнении с контрольной группой, не было обнаружено 1дО и 1дМ ответа на КЬН у животных, леченных тАЬ1 или СЫг12.12. Поскольку блокирование активации В-клеток путем ингибирования взаимодействия СО40 - лиганда СО40 подразумевает фармакологическое действие тАЬ1, и поскольку полагают, что под действием СЫг12.12 обедняется фракция В-клеток, эти данные не рассматриваются как токсикологически значимые.

Токсикокинетическая оценка выявила, что минимальные концентрации препарата увеличивались в ходе исследования, указывая на накопление тАЬ1 и СЫг12.12. Средние значения минимальных концентраций после введения 4-й и 5-й дозы были сходными, указывая на близость к условиям стационарного состояния после введения 5-й дозы для тАЬ1 и СЫг12.12. Среднее значение воздействия (оба пола) в течение интервала дозирования (АИС_Т) после 4-й и 5-й дозы составляло 906 и 990 ч.мг/мл, соответственно для тАЬ1, и 757 и 751 ч.мг/мл, соответственно для СЫг12.12. Значения АИС_Т также указывали на близость к условиям стационарного состояния после введения 5-й дозы.

При макроскопическом исследовании не было выявлено каких-либо доказательств токсического целевого повреждения органов, и вес органов также находился в пределах нормы для данного вида.

Микроскопически, связь с применением элемента тестирования в отношении двух антител обнаружили во всех органах лимфатической системы (селезенке и лимфатических узлах (брыжеечных, нижнечелюстных, подмышечных и паховых)), где тАЬ1 и СЫг12.12 вызывали полную супрессию герминативного центра развития в кортикальных В-клеточных областях. СО20-иммуноокрашивание ткани селезенки и дренирующих КЬН и контралатеральных лимфатических узлов выявило уменьшенный размер лимфоидных фолликулов в селезенке, а также обеднение фракции В-клеток в селезенке и лимфатических узлах, эффект, который был намного более выражен у животных, леченных СЫг12.12, по сравнению с таковыми, леченными тАЬ1. Данные по герминативному центру у животных, леченных тАЬ1, соответствовали снижению числа С021^- В-клеток, обнаруженного при иммунофенотипировании. СВ40иммуноокрашивание выявило значительное снижение окрашивания СО40 в лимфатических узлах и селезенке после лечения либо тАЬ1, либо СЫг12.12.

В заключение, руководствуясь результатами данного исследования, еженедельное внутривенное введение тАЬ1 или СЫг12.12 в течение 5 недель (6 назначений) в концентрации 100 мг/кг самцам и сам- 42 026133 кам яванских макак было хорошо переносимым. При иммунофенотипировании обнаружено уменьшение числа В-клеток у животных, леченных СЫг12.12, но не у животных, леченных тАЪ1, за исключением СЭ2Г В-клеток, однако ТЭАК продемонстрировал отсутствие 1дС и 1дМ реакции после иммунизации КЬН у тАЪ1- и СЫг12.12-леченных животных. При гистопатологическом исследовании выявлено отсутствие герминативных центров в селезенке и лимфатических узлах у тАЪ1-и СЫг12.12-леченных животных. Воздействие на В-клетки является целевым фармакологическим действием и, следовательно, не рассматривается в качестве неблагоприятного эффекта. Принимают во внимание, что уровень ненаблюдаемого неблагоприятного эффекта (ЫОАЕЬ) закреплен за дозой, равной 100 мг/кг, тАЪ1 и СЫг12.12 в условиях данного исследования.

Пример 9. Дополнительный ш уйго анализ профиля тАЪ1.

Связывание и функциональная перекрестная реактивность тАЪ1 была определена между лейкоцитами человека, макака-резус, яванского макака. В табл. 10 представлены данные прямого сравнения связывания ЕС₅₀ для тАЪ 1 во всех трех видах.

Таблица 10

Перекрестная реактивность тАЪ1 в отношении человека и ЫНР

Аналиэ	Человек	Макак-реэус	Яванский макак
Связывание СЭ4 0 (СЦ20+ В-клетки ГАС5) (ЕС50, мкг/мл	0,26, 0,28	0,22+/-0,033 (п=6)	0,3, 0,24
Ингибирование СО154 (В-клетки человека & РВМС) (1С50, мкг/мл)	0,058, 0,075 (В- клетки миндалины человека)	0,03+/-0,017 (п=6) (РВМС)	0,015, 0,02

тАЪ1 связывается с СЭ20' клетками (В-клетки) всех трех видов с соизмеримыми значениями ЕС₅₀. Кроме того, тАЪ1 может ингибировать СП154+1Ь-4-индуцируемую пролиферацию В-клеток миндалины человека, а также РВМС яванского макака и макака-резус. Вместе взятые эти результаты указывают на то, что способность тАЪ1 связывать СЭ40 и ингибировать СО154-индуцируемую пролиферацию Вклеток человека или РВМС отличных от человека приматов была очень схожей. Данные по наличию занятости рецептора ш уйго (КО) и функциональное ингибирование позволили определить взаимосвязь между этими двумя переменными величинами для каждого вида (табл. 11).

Таблица 11

Взаимосвязь между тАЪ1 КО и функциональным ингибированием

	1Сбо в тесте функционального интпбирования а (мкг/мл)	Соответствующий ίη νίνο ЕО ь,е (%)
Макак-резус	0,02551	22, 9
Человек	0, 067	43, 8

^а Растворимый СЭ154 + 1Ь4-индуцируемая пролиферация РВМС у макакарезус и В-клеток миндалины у человека.

^Ъ При условии, что КО ш У1уо у макака-резус и у человека такая же, как рассчитанная в исследовании РК/РЭ у яванского макака. ^с При условии, что тАЪ1 значительно выше [мишени] в применяемом уравнении Хилла-Ленгмюра.

Результаты указывают на то, что приблизительно в 2 раза меньше КО требуется тАЪ1, чтобы ингибировать пролиферацию РВМС у макака-резус на 50% по сравнению с В-клетками человека. У человека полное ингибирование может быть получено при приблизительно 75% КО (величина теоретически найдена ш У1Уо).

Пример 10. Исследование трансплантата.

Жизнеспособность трансплантата.

Комбинированное лечение тАЪ1 (30 мг/кг внутривенно) и циклоспорина А, 20 мг/кг перорально во время аллотрансплантации почек приводило к значительному пролонгированию выживаемости 6 животных, включенных в исследование. Трансплантаты были функциональны в течение больше 91*, 31, больше 92*, больше 92*, больше 98* и больше 98* дней (среднее значение: больше 83,6 дня) у животных #5529, #5533, #5523, #5524, #5536 и #5538, соответственно (* конец протокола). Выживаемость у не леченных животных (или леченных субтерапевтическими 18-дозами) находилась в диапазоне от 7 до 10 дней (статистические данные).

Животному #5533 провели эвтаназию на 31 день после трансплантации из-за острой почечной недостаточности и анурии. Эта патология возникает после поддержания гипертензивного периода и анестезии для забора биопсийного материала.

- 43 026133

Послетрансплантационное наблюдение (а) Сывороточные концентрации креатинина (8Сгса) и мочевины (8Игса).

8Сгса был основным параметром, используемым для оценки функции почек. У всех 6 животных уровни 8Сгса повышались выше исходного уровня в первый день после трансплантации (от 81,8±14,6 до 221,5±37,1 мкмоль/л). Такое повышение 8Сгса является распространенной особенностью в течение первой недели после трансплантации (табл. 12).

Таблица 12

Изменения 8Сгса, наблюдаемые у реципиентов аллотрансплантата почек ННР, леченных комбинированной терапией тАЬ1 и СкА в дозе 30 и 20 мг/кг соответственно

Дни после трансплантации	Уровень ЗСгеа (мкмоль/л)
#5536	#5538	#5523	#5524	#5529	#5533
-4	101	109	85	73	81	86
-1	106	89	80	71	95	76
0	95	105	74	72	76	69
1	234	238	213	198	277	169
3	190	261	148	155	243	191
7	112	189	136	141	110	110
10	111	172	193	206	102	139
14	101	166	209	165	103	156
17	113	181	277	157	94	175
21	114	162	192	117	111	206
24	112	156	155	124	111	191
28	95	133	119	111	100	170
31	95	139	119	106	122	629
35	103	135	110	100	104
38	104	128	111	109	108
42	107	113	110	101	114
45	95	124	108	115	113
49	103	118	104	106	101
52	107	129	105	111	102
56	122	103	112	95	101
59	112	105	94	97	99
63	110	120	115	115	99
66	103	132	110	104	107
70	101	116	91	100	105
73	103	124	105	120	109
77	103	109	98	121	105
80	103	101	102	113	109
84	101	104	120	126	110
87	107	103	111	112	108
91	100	112	119	112	105

94

117

133

В течение первой недели концентрации 8Игса претерпевала быстрый подъем выше исходного уровня, измеренного в 0 день (4,5±1,3 ммоль/л) (табл. 13). У животных #5529/#5533 и #5536/#5538 уровни 8Игса составляли 16-20 ммоль/л (3-5 день), в то время как у животных #5523 и #5524 эти величины составляли 9 или 8 ммоль/л (7 день) соответственно.

- 44 026133

Таблица 13

Изменения §игеа, наблюдаемые у реципиентов аллотрансплантата почек ΝΗΡ, леченных комбинированной терапией тΑЬ1 и ΥΑ в дозе 30 и 20 мг/кг соответственно

Дни после трансплантации	Уровень зигеа (мкмоль/л)
#5536	#5538	#5523	#5524	#5529	#5533
-4	7	5	4	4	8	5
-1	7	6	5	6	9	5
0	6	4	3	4	б	5
1	14	12	7	8	13	9
3	20	17	5	6	16	15
7	9	14	9	8	9	11
10	5	10	17	14	6	11
14	6	8	18	13	5	18
17	7	10	16	8	5	15
21	7	10	14	7	4	19
24	6	9	8	6	4	17
28	8	10	11	8	4	12
31	6	9	11	8	4	18
35	7	10	8	7	6
38	7	8	6	5	6
42	7	9	10	7	б
45	7	9	10	8	6
49	9	9	8	6	8
52	6	8	6	6	7
56	8	9	9	9	6
59	4	8	9	10	8
63	6	9	8	7	7
66	7	11	7	7	7
70	6	9	10	9	7
73	7	9	9	10	5
77	11	14	8	10	7
80	6	7	7	8	7
84	6	7	9	9	6
87	6	8	8	8	б
91	7	8	10	10	5
94	7	8

Через одну неделю после трансплантации функция почек имела тенденцию к нормализации, и 8Сгеа/8игеа становилось ближе к исходному уровню. Однако у животных #5533, #5523 и #5524 (но не #5529, #5536 и #5538) зафиксировано дополнительное увеличение 8Сгеа/8игеа между 7 днем и 19-25 днями после трансплантации, указывая на почечную дисфункцию. Во время этого периода можно было наблюдать такие признаки, как полидипсия/полиурия (#5523 и #5524), высокий поддерживаемый уровень сывороточного кальция (§Са) (#5533) или увеличение объема трансплантата (#5523 и #5524).

После 20-25 дня у животных #5529, #5523, #5524, #5536 и #5538 отмечали улучшения и прекрасную работу почек вплоть до конца исследования. Однако на 31 день у животного №5533 зафиксировано выраженное увеличение уровней §Сгеа/8игеа, подтверждая острую почечную недостаточность (§Сгеа; 629 мкмоль/л и §игеа; 18 ммоль/л). Эта патология имела место после поддерживаемого гипертензивного периода и процедуры биопсии за день до эвтаназии. Во время этого периода были зафиксированы гипертензивные пики (приблизительно 170 мм рт. ст. систолический) и эпизод гипотензии (приблизительно 40 мм рт. ст. систолический).

(Ь) Сывороточные концентрации амилазы, липазы, вес тела и число тромбоцитов.

Сывороточные концентрации амилазы немного увеличивались у всех животных приблизительно в 1,3 раза в 1-7 дни после трансплантации (311±53 ед./л в 0 день и 418±66,8 ед./л на 7 день после трансплантации) (табл. 14). У животного #5533 зафиксировано наибольшая концентрация амилазы, измеряемая в исследовании в 1 день после трансплантации (1050 ед./л). До трансплантации не было выявлено каких-либо различий в уровнях амилазы до введения первой дозы тΑЬ1 и через 24 ч (-1 день и 0 день).

- 45 026133

Таблица 14

Сывороточные концентрации амилазы (ед./л) у животных с трансплантацией почек, леченных комбинированием тАЬ1 в дозе 30 мг/кг внутривенно и СкА в дозе 20 мг/кг перорально

Время после трансплантации	Среднее значение уровня амилазы (ед/л)	ЗТБЕУ	Кратность изменения
0 день	311	52,95
7 день	418,2	66, 8	1, 34
14 день	459,2	71,5	1,48
56 день	526, 6	121,5	1, 69
84 день	460,4	66, 8	1,48

Сывороточные концентрации липазы претерпевали, в среднем, небольшие изменения до и после трансплантации (табл. 15). Только в конце экспериментального протокола отмечали незначительное увеличение (84 день; 2,18 раза). У животного #5533 зафиксирована наибольшая концентрация липазы, измеренная в 1 день (284,4 ед./л). Данные по концентрации липазы у животных #5536 и #5538 отсутствовали. Изменения концентраций амилазы и липазы были аналогичными уровням, обнаруженным в других экспериментах по трансплантации, используя других антитела или низкомолекулярные соединения (данные не представлены).

Таблица 15

Сывороточные концентрации липазы (ед./л) у четырех животных с трансплантацией почек, леченных комбинированием тАЬ1 в дозе 30 мг/кг внутривенно и СкА в дозе 20 мг/кг перорально

Время после трансплантации	Среднее значение уровня липазы (ед/л)	ЗТЦЕУ	Кратность изменения
0 день	12	1,3
7 день	13, 05	2,26	1,09

14 день	12, 9	1,25	1, 08
56 день	16, 6	3,41	1, 38
84 день	26, 2	21,06	2,18

Быстрая и значительная потеря массы тела в основном наблюдали у животных #5529, #5533 и #5536. У всех трансплантированных животных она варьировала от -4 до -18% во время первых 21 дней после трансплантации. Однако потеря массы тела имела тенденцию к восстановлению после этого временного периода и до конца исследования.

Число тромбоцитов было в норме (300-400 клеток х10³/мкл) или повышено во время посттрансплантационного периода 600-800 клеток х10³/мкл. Животному #5529 проводили лечение аспирином в течение 3 дней (7-9 день) вследствие быстрого роста числа тромбоцитов. У животного #5533 отмечали долговременный тромбоцитов (больше 1000 клеток х 10³/мкл) и ему проводили лечение аспирином в период 7-26 дни.

(с) Уровни тАЬ1 в крови и число В-клеток.

Контрольные изучение и анализ РК/ΡΌ были проведены ранее, в которых яванскому макаку внутривенно вводили единичную дозу антитела, равную 10 мг/кг (данные не показаны). В этом исследовании профили зависимости концентрации от времени демонстрировали четкое мишень-опосредованное распределение (ΤΜΌ), где у одного животного обнаружили более быстрый клиренс по сравнению с другими животными вследствие вероятно более высокого уровня экспрессии мишени, подчеркивая роль уровней экспрессии мишени в регулировании РК. В этом исследовании также пришли к заключению о том, что в случае сывороточных концентраций тАЬ1 свыше приблизительно 5 мкг/мл это обусловливает почти 100% занятость рецептора ί'.Ό40.

Дизайн исследования трансплантации (еженедельные и высокие уровни дозирования тАЬ1 - 30 мг/кг и отсутствие фазы восстановления/отмывки) не обеспечили того же уровня анализа и моделирования как в случае ранее проведенного исследования РК/ΡΌ. Тем не менее, были получены следующие наблюдения (сведены в табл. 16); ί) тАЬ1 не был обнаружен в образцах, полученных до введения первой дозы, ίί) тАЬ1 выявляли на протяжении всей фазы дозирования препарата и ίίί) во всех собранных образцах межиндивидуальные минимальные концентрации препарата варьировали (1200-2500 мкг/мл для яванского макака 5524, 1000-2000 мкг/мл для яванского макака 5523 и 850-2400 мкг/мл для яванского макака 5529). Значения экспозиции были значительно выше (в 170-500 раз) концентрации, необходимой для получения полной рецепторной занятости у яванского макака.

- 46 026133

Таблица 16

Сывороточные концентрации тАЬ1 у яванских макак #5533, #5529, #5523 и #5524

	тАЫ (микрограим/мп)
Время	Яванский	Яванский	Яванский	Яванский
<ДНИ)	макак 5533	макак 5529	макак 5523	макак 5524
-1	0	0	0	0
3	591	618	1315	1384
7	682	1003	1033	1135
7,01	1557	1553	2452	2669
14	925	1037	1463	1744
28	654	896	1672	1965
42		851	1770	1259
56		1896	1991	1283
70		2385	1641	2534
84		2191	1266	2402
91		2069	1066	2071

Была также проведена оценка тестового анализа иммуногенности (анти-тАЬ1 антитела макака) в этом исследовании. Все образцы были отрицательными, но высокие уровни тАЬ1 в этих образцах могли потенциально препятствовать их детектирования вследствие лекарственной интерференции.

Частичное обеднение фракции СИ20+ клеток можно было наблюдать с течением времени во всех леченных животных. Подобные наблюдения были зафиксированы в ранее проведенном исследовании РК/РИ (данные не показаны).

Результаты гистологического анализа.

При гистопатологическом исследовании аллотрансплантатов почек отмечено отсутствие острого и хронического отторжения трансплантата #5523, #5524, #5529 и #5538, и пограничные изменения в трансплантате #5536, который достиг конца эксперимента (результаты сведены в табл. 17). Были обнаружены минимальные периваскулярные или интерстициальные инфильтраты у животных #5523, #5524 и #5538, и повышенное содержание гломерулярных паренхиматозных клеток у животного #5529.

Таблица 17

Результаты гистологии

Номер животного	Образец	Дни после трансплантации	Сгеа/Чгеа	Диагноз
#5529	Биопсия	30	100/4	ВапГГ: нет отторжения
10-0001	Аутопсия	91	105/5	ВапГГ нет отторжения (минимальное повышение содержания гломерулярных паренхиматозных клеток, минимальный фиброз интимы)
	Другое: Отсутствие формирования герминативного центра во вторичных лимфоидных органах. Воспаление толстой и слепой кишки (В. сой) Никаких других изменений, связанных с лечением.
#5533	Биопсия	30	170/12	ВапН: ΙΑ, диффузный ранний интерстициальный фиброз, тубулярная вакуолизация
10-0002	Аутопсия	31	629/18	ВапН другие (тубулярная дилатация, интерстициальные инфильтраты и фиброз, минимальный тубулит, абсцесс вокруг анастомозов, эозинофилы вокруг мочеточника)
	Другое: Отсутствие формирования герминативного центра во вторичных лимфоидных органах, Цекоколит (В, сой). Никаких других изменений, связанных с лечением.
#5523	Биопсия	Нет	Нет
11-0001	Аутопсия	92	119/10	ВапН: нет отторжения (минимальные периваскулярные инфильтраты, мукоидное вещество в одной вене)
	Отсутствие формирования герминативного центра во вторичных лимфоидных органах Никаких других изменений, связанных с лечением
#5524	Биопсия	Нет	Нет
11-0002	Аутопсия	92	112/10	Ваий: нет отторжения (минимальные мультифокальные интерстициальные инфильтраты)

- 47 026133

	Отсутствие формирования герминативного центра во вторичных лимфоидных органах. Никаких других изменений, связанных с лечением.
#5536	Биопсия	Нет	Нет
11-0002	Аутопсия	98	104/8	ВапГГ: пограничные изменения (минимальные мультифокальные интерстициальные инфильтраты с минимальным фокальным тубулитом), фокальные плазматические клетки
	Отсутствие формирования герминативного центра во вторичных лимфоидных органах. Никаких других изменений, связанных с лечением.
#5538	Биопсия	Нет	Нет
11-0002	Аутопсия	98	114/9	ВапГ£: нет отторжения (присутствуют минимальные мультифокальные интерстициальные инфильтраты)
	Отсутствие формирования герминативного центра во вторичных лимфоидных органах Одностороннее фокальное лимфо-гистиоцитарное воспаление легкого Никаких других изменений, связанных с лечением.

У животного #5533, которому провели эвтаназию на 31 день после трансплантации, обнаружили тубулярную дилатацию, интерстициальные инфильтраты и фиброз, но только минимальный тубулит. Кроме того, была обнаружена значительная эозинофильная инфильтрация вблизи мочеточника и абсцесс рядом с анастомозом. Все эти данные указывают на длительное нарушение функции почек, но отторжение может быть не подтверждено.

Иммуноокрашивание С4й было отрицательным во всех случаях.

Отсутствие герминативного центра размножения с фолликулярной атрофией или без нее было обнаружено в лимфоидных органах всех животных. Цекоколит, обусловленный инфекцией Ва1апййшт соН, был диагностирован у животных #5529 и #5533.

Никаких других изменений, связанных с лечением, обнаружено не было.

Исследование трансплантации - обсуждение.

Цель исследования трансплантации, на модели отторжения аллотрансплантата почек отличных от человека приматов, состояла в оценке положительного эффекта тАЬ1, назначаемого в виде комбинированной терапии с субтерапевтической дозой циклоспорина А. Кроме того, актуальной являлась оценка отсутствия побочных эффектов на модели, в которой имеет место индукция системного воспаления.

В условиях применения в виде комбинированной терапии с субтерапевтической дозой СкА (20 мг/кг перорально), эффективность воздействия тАЬ1 проявлялась в увеличении жизнеспособности аллотрансплантата почки у ΝΗΡ. Среднее значение выживаемости трансплантата составляло больше 83,6 дней, и 5 из 6 животных дожили до конца экспериментального протокола (рассчитан на 91-98 дней).

Результатом целевого воздействия на СЭ40, используя неагонистическое блокирующее антитело анти-СЭ40 (тАЬ1), являлось пролонгирование жизнеспособности трансплантата почки или кусочка ткани, трансплантированной ΝΗΡ. Кроме того, нам удалось продемонстрировать лучшую эффективность и безопасность использования тАЬ1 (которое является молчащим Рс) по сравнению с ранее описанным СЫг12.12 (полностью человеческое моноклональное анти-СЭ40 антитело изотипа 1дО1/каппа, обусловливающее обеднение фракции В-клеток и обладающее блокирующими свойствами совместной стимуляции).

В течение всего посттрансплантационного периода отмечено отсутствие какого-либо значимого клинического патологического осложнения (например, небольшое увеличение уровня амилазы/липазы было связано с обычным нарушением функции почек после трансплантации). Однако у животных #5333, #5523 и #5524 было обнаружено снижение функции почек в период 7-19 дни. Этот период времени обычно характеризуется восстановлением уровней 8Сгеа/8игеа, кровяного давления и объема трансплантата у животных после трансплантации. У этих животных были обнаружены такие признаки нарушения функции почек, как повышенные уровни 8Сгеа/8Игеа (у всех 3 животных), временное увеличение объема трансплантата (#5523, #5524) или полидипсия/полиурия (#5523, #5524). Одна из гипотез заключается в том, что у этих животных развивался ранний процесс отторжения трансплантата, который становился контролируемым после 3 недель лечения тАЬ1. Это отклонение от нормы в ранней посттрансплантационной фазе может быть следствием различий, вызванных иммунологическим способом действия молекулы (Рс-молчащей), направленно воздействующей на СЭ40-сигнальный путь.

Одному животному (#5533) провели эвтаназию на 31 день вследствие острой почечной недостаточности (без отторжения). Этот исход был обусловлен неполным восстановлением функции почек после процедуры трансплантации. Признаками, указывающими на недостаточную функцию почек, были высокие уровни 8Игеа (11-19 ммоль/л) или поддерживаемые высокие концентрации 8Са (больше 2,8 ммоль/л). Предсмертное отторжение трансплантата ускорялось сохраняющейся гипертензией (больше 140 мм рт. ст., систолическое) в сочетании с гипотензией, что наблюдали во время анестезии, применяемой во время процедуры взятия биопсийного материала, и высокие гипертензивные пики были зарегистрированы ночью до эвтаназии (приблизительно 170 мм рт. ст., систолическое) (Ра1тег ВР (2002) Ν. Епд1. I. Мей; 347(16):1256-1261). Все эти события не могут быть обусловлены лечением тАЬ1, а могут быть связаны только с индивидуальными различиями в посттрансплантационную фазу.

- 48 026133

Высокая эффективность комбинированной терапии может быть также продемонстрирована гистологически. Пять из шести трансплантатов были отличного качества к концу эксперимента. Отсутствие герминативного центра размножения было также продемонстрировано в эксперименте по трансплантации с СЫг12.12. Никаких других изменений, связанных с лечением, обнаружено не было.

У одного из долгожителей (#5529) развился цекоколит, вызванный Βαίαηΐίάίιιιη сой. Хотя эта инфекция часто встречается у макак и обычно бессимптомно протекает, иммуносупрессия может приводить к обострению заболевания (8с1шк1ег РЬ, Кат^^еζ-Аν^1а Ь, (2008) СНп. МюгоЬю1. Кеу; 21(4):626-38). У этих животных не было обнаружено никаких клинических симптомов заболевания, таких как диарея или потеря массы тела.

Рассматривая результаты мониторинга числа В-клеток, частичное обеднение со временем этой фракции клеток наблюдали у всех леченных животных. Это частичное обеднение клеточной фракции, по-видимому, не является следствием опосредованного активным Рс-рецептором уменьшения числа клеток, поскольку тАЬ1 является молчащим антителом, которое не связывается с РсК и не опосредует ίη νίίΐΌ АЭСС. Частичное обеднение фракции клеток может быть отражением отсутствия герминативных центров, что было обнаружено при гистологическом анализе в конце эксперимента. Это частичное обеднение фракции клеток может быть следствием отсутствия жизнеобеспечивающих сигналов.

В заключение необходимо отметить, что результаты исследования трансплантации поддерживают использование тАЬ1 (и как само собой разумеющееся, другие антитела и белки по изобретению) в качестве эффективных молекул для лечения отторжения трансплантата почек в комбинированной терапии с отличными показателями безопасности. Отличные показатели безопасности и эффективность дополнительно подтверждают пригодность антител по изобретению в лечении аутоиммунных нарушений и/или воспалительных нарушений, и в предотвращении отторжения трансплантата, опосредуемого проведением сигнала СО40Ь через СО40-сигнальный путь в клетках, экспрессирующих СЭ40 антиген.

Заключение.

Данных о том, что анти-СЭ40 антитела индуцируют гемостатические процессы у пациентов, еще не было опубликовано, однако увеличение уровня ферментов поджелудочной железы у пациентов, страдающих В-клеточной лимфомой, получающих анти-СО40 АЬ СЫг12.12, и возможный риск развития панкреатита исключает использование этого Рс-компетентного анти-СЭ40 антитела при хронических аутоиммунных заболеваниях и трансплантации по причинам безопасности. В связи с этим, мы получили Рсмолчащие 1§С1 анти-СЭ40 антитела (тАЬ1, тАЬ2 и тАЬ3), не способные опосредовать антителозависимую клеточную цитотоксичность (АЭСС) или комплемент-зависимую цитотоксичность (СЭС) как ίη νίΡΌ, так и ίη νί\Ό. тАЬ1 обладало способностью пролонгировать жизнеспособность аллотрансплантата почек отличных от человека приматов в сочетании с субтерапевтическими дозами циклоспорина. Кроме того, тАЬ1 обладало способностью полностью подавлять первичный и вторичный ответ антител на иммунизацию Т клеточно-зависимым антигеном. Существенным является то, что не было фактов наличия гемостатических осложнений или патологической гистологической картины поджелудочной железы в исследовании трансплантата или иммунизации. В совокупности эти результаты предполагают, что тАЬ1 будет использоваться в качестве безопасного и эффективного терапевтического средства и может быть использовано для лечения пациентов, страдающих аутоиммунными заболеваниями, в патогенез которых вовлечены В-лимфоциты и антиген-презентирующие клетки, или переносящих аллотрансплантацию, где взаимодействия СЭ40-СЭ154 вовлечены в развитие патологии.

- 49 026133

Список последовательностей

<110>	Νονβτΐί£	АС
<120>	Молчащие	Гс-варианты
<130>	РАТ54423
<150>	из 61/413567
<151>	2010-11-:	15
<160>	28
<170>	РаЬепЫп	ν6Γ5ΪΟΠ 3.5
<210>	1
<211>	5
<212>	Белок
<213>	Человек
<400>	1
Зег Туг С1у Мес	ΗΪ3

<210>	2
<211>	17
<212>	Белок
<213>	Человек
<400>	2
Уа1 11е	Зег Ту:

Уа1 Не Зег Туг 31и 01и Зег Азп Агд Туг Нпз А1а Азр Зег Уа1 Ьуз

С1у <210> 3 <211> 11 <212> Белок <213> Человек <400> 3

Азр О1у С1у 11е А1а А1а Рго С1у Рго Азр Туг 15 10

<210>	4
<211>	16
<212>	Белок
<213>	Человек
<400>	4
Агд Зег Зег С11 1

Агд Зег Зег С1п Зег Ьеи Ьеи Туг Зег Азп С1у Туг Азп Туг Ьеи Азр 5 10 15

<210> 8 <211> 112 <212> Белок

- 51 026133

- 52 026133

- 53 026133

- 57 026133

- 58 026133

145 150 155 160

Тгр Азп Зег СЬу АЬа Ьеи ТЬг Зег СЬу УаЬ Ше ТЬг РЬе Рго АЬа УаЬ 165 170 175

Ьеи СЬп Зег Зег ЕЬу Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег УаЬ УаЬ ТЬг УаЬ Рго

180 185 190

Бег Зег Зег Ьеи СЬу ТЬг 61п ТЬг Туг Не Суз Азп УаЬ Азп Нгз Ьуз 195 200 205

Рго Зег Азп ТЬг Ьуз УаЬ Азр Ьуз Агд УаЬ СЬи Рго Ьуз Зег Суз Азр 210 215 220

Ьуз ТЬг НЬз ТЬг Суз Рго Рго Суз Рго АЬа Рго СЬи Ьеи Ьеи СЬу СЬу 225 230 235 240

Рго Зег УаЬ РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи МеЬ 11е 245 250 255

Бег Агд ТЬг Рго СЬи УаЬ ТЬг Суз УаЬ УаЬ УаЬ АЬа УаЬ Бег НЬз СЬи 260 265 270

Азр Рго СЬи УаЬ Ьуз РЬе Азп Тгр Туг УаЬ Азр СЬу УаЬ СЬи УаЬ НЬз 275 280 285

Азп АЬа Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд СЬи СЬи СЬп Туг Азп Зег ТЬг Туг Агд

290 295 300

УаЬ УаЬ Бег УаЬ Ьеи ТЬг УаЬ Ьеи НЬз СЬп Азр Тгр Ьеи Азп СЬу Ьуз 305 310 315 320

СЬи Туг Ьуз Суз Ьуз УаЬ Зег Азп Ьуз АЬа Ьеи Рго АЬа Рго 11е СЬи 325 330 335

Ьуз ТЬг Ые Бег Ьуз АЬа Ьуз СЬу СЬп Рго Агд СЬи Рго СЬп УаЬ Туг 340 345 350

ТЬг Ьеи Рго Рго Бег Агд СЬи СЬи МеЬ ТЬг Ьуз Азп СЬп УаЬ Бег Ьеи 355 360 365

ТЬг Суз Ьеи УаЬ Ьуз СЬу РЬе Туг Рго Бег Азр Ые АЬа УаЬ СЬи Тгр 370 375 380

СЬи Бег Азп СЬу СЬп Рго СЬи Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго УаЬ 385 390 395 400

Ьеи Азр Бег Азр СЬу Бег РЬе РЬе Ьеи Туг Бег Ьуз Ьеи ТЬг УаЬ Азр

- 59 026133

- 60 026133

ТЬг

Туг

Зег

Ьеи 180

Зег

Зег

ТЬг

Ьеи

ТЬг 185

Ьеи

Зег

Ьуз

А1а

Азр 190

Туг

С1и

Ьуз

Ηί5

Ьуз

Уа1

Туг

А1а

Суз

С1и

УаЬ

ТЬг

Шз

С1п

С1у

Ьеи

Зег

Зег

195

200

205

Рго

Уа1

ТЬг

Ьуз

Зег

РЬе

Азп

Агд

С1у

С1и

Суз

210

215

<210>

15

<211>

450

<212>

Белок

<213>

Человек

<400>

15

С1п

Уа1

С1п

Ьеи

Уа1

С1и

Зег

С1у

С1у

С1у

Уа1

Уа1

С1п

Рго

С1у

Агд

1

5

10

15

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

А1а

Зег

С1у

РЬе

ТЬг

РЬе

Зег

Зег

Туг

20

25

30

С1у

МеЬ

Шз

Тгр

Уа1

Агд

С1п

А1а

Рго

С1у

Ьуз

С1у

Ьеи

С1и

Тгр

Уа1

35

40

45

А1а

Уа1

Не

Зег

Туг

С1и

С1и

Зег

Азп

Агд

Туг

Шз

А1а

Азр

Зег

Уа1

50

55

60

Ьуз

С1у

Агд

РЬе

ТЬг

11е

Зег

Агд

Азр

Азп

Зег

Ьуз

11е

ТЬг

Ьеи

Туг

65

70

75

80

Ьеи

εΐη

МеЬ

Азп

Зег

Ьеи

Агд

ТЬг

С1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

А1а

Агд

Аер

С1у

С1у

11е

А1а

А1а

Рго

С1у

Рго

Азр

Туг

Тгр

С1у

С1п

100

105

110

С1у

ТЬг

Ьеи

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

А1а

Зег

ТЬг

Ьуз

С1у

Рго

Зег

Уа1

115

120

125

РЬе

Рго

Ьеи

А1а

Рго

Зег

Зег

Ьуз

Зег

ТЬг

Зег

С1у

С1у

ТЬг

А1а

А1а

130

135

140

Ьеи

е1у

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

Азр

Туг

РЬе

Рго

С1и

Рго

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

145

150

155

160

Тгр

Α5ΙΊ

Зег

СТу

АТа

Ьеи

ТЬг

Зег

СТу

Уа1

Низ

ТЬг

РЬе

Рго

А1а

Уа1

165 170 175

- 61 026133

- 62 026133

- 63 026133

Ьуз

Шз

Ьуз 195

Уа1

Туг

А1а

Суз

С1и 200

УаЬ

ТЬг

Шз

СЬп

С1у 205

Ьеи

Зег

Зег

Рго

УаЬ

ТЬг

Ьуз

Зег

РЬе

Азп

Агд

СЬу

СЬи

Суз

210

215

<210>

17

<211>

217

<212>

Белок

<213>

Человек

<400>

17

АЬа

Рго

СЬи

Ьеи

Ьеи

СЬу

СЬу

Рго

Зег

УаЬ

РЬе

Ьеи

РЬе

Рго

Рго

Ьуз

1

5

10

15

Рго

Ьуз

Азр

ТЬг

Ьеи

МеЬ

Не

Зег

Агд

ТЬг

Рго

СЬи

УаЬ

ТЬг

Суз

УаЬ

20

25

30

УаЬ

УаЬ

Азр

УаЬ

Зег

Ηί8

СЬи

Азр

Рго

СЬи

УаЬ

Ьуз

РЬе

Азп

Тгр

Туг

35

40

45

УаЬ

Азр

СЬу

УаЬ

СЬи

УаЬ

Ньз

Азп

А1а

Ьуз

ТЬг

Ьуз

Рго

Агд

СЬи

СЬи

50

55

60

СЬп

Туг

А1а

Зег

ТЬг

Туг

Агд

УаЬ

УаЬ

Зег

УаЬ

Ьеи

ТЬг

УаЬ

Ьеи

Ньз

65

70

75

80

СЬп

Азр

Тгр

Ьеи

АЗП

С1у

Ьуз

С1и

Туг

Ьуз

Суз

Ьуз

Уа1

Зег

Азп

Ьуз

85

90

95

А1а

Ьеи

Рго

А1а

Рго

11е

СЬи

Ьуз

ТЬг

Не

Зег

Ьуз

А1а

Ьуз

СЬу

С1п

100

105

110

Рго

Агд

СЬи

Рго

С1п

УаЬ

Туг

ТЬг

Ьеи

Рго

Рго

Зег

Агд

СЬи

СЬи

МеЬ

115

120

125

ТЬг

Ьуз

Азп

СЬп

УаЬ

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

Ьеи

УаЬ

Ьуз

СЬу

РЬе

Туг

Рго

130

135

140

Зег

Азр

Не

АЬа

УаЬ

СЬи

Тгр

С1и

Зег

Азп

С1у

СЬп

Рго

СЬи

Азп

Азп

145

150

155

160

Туг

Ьуз

ТЬг

ТЬг

Рго

Рго

УаЬ

Ьеи

Азр

Зег

Азр

СЬу

Зег

РЬе

РЬе

Ьеи

165

170

175

Туг

Зег

Ьуз

Ьеи

ТЬг

УаЬ

Азр

Ьуз

Зег

Агд

Тгр

СЬп

СЬп

СЬу

Азп

УаЬ

180

185

190

РЬе

Зег

Суз

Зег

УаЬ

МеЬ

НЬз

С1и

АЬа

Ьеи

Шз

Азп

Нтз

Туг

ТЬг

СЬп

- 64 026133

- 65 026133

- 66 026133

Ьу® Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у Ьу® 210 215

<210> 20 <211> 1956 <212> ДНК <213> Человек <400> 20 саддЬдсадЬ ЬддЬддадЬс	Ьдддддаддс	дЬддЬссадс	сЬдддаддЬс	ссЬдадасЬс	60
ЬссЬдЬдсад	ссЬсЬддаЬЬ	сассЬЬсадЬ	адсЬаЬддса	ЬдсасЬдддЬ	ссдссаддсЬ	120
ссаддсаадд	ддсЬддадЬд	ддЬддсадЬЬ	аЬаЬсаЬаЬд	аддааадЬаа	ЬадаЬассаЬ	130
дсадасЬссд	Ьдаадддссд	аЬЬсассаЬс	Ьссададаса	аЬЬссаадаЬ	сасдсЬдЬаЬ	240
сЬдсаааЬда	асадссЬсад	аасЬдаддас	асддсьдьдь	аЬЬасЬдЬдс	дададаЬддд	300
ддЬаЬадсад	сассЬдддсс	ЬдасЬасЬдд	ддссадддаа	сссЬддЬсас	сдЬсЬссЬса	360
дсаадЬасса	адддсссаЬс	сдЬсЬЬсссс	сЬддсдсссд	сЬадсаадад	сассЬсЬддд	420
ддсасадсдд	сссЬдддсЬд	ссЬддЬсаад	дасьасЬьсс	ссдаассддЬ	дасддьдьсд	430
ЬддаасЬсад	дсдсссЬдас	садсддсдЬд	сасассЬЬсс	сддсЬдЬссЬ	асадЬссЬса	540
ддасьсьасЬ	сссьсадсад	сдЬддЬдасс	дЬдсссЬсса	дсадсЬЬддд	сасссадасс	600
ЬасаЬсЬдса	асдЬдааЬса	саадсссадс	аасассаадд	Ьддасаадад	адЬЬддЬдад	660
аддссадсас	адддадддад	ддЬдЬсЬдсЬ	ддаадссадд	сЬсадсдсЬс	сЬдссЬддас	720
дсаЬсссддс	ЬаЬдсадЬсс	садЬссаддд	садсааддса	ддссссдЬсЬ	дссЬсЬЬсас	780
ссддаддссЬ	сьдсссдссс	сасЬсаЬдсЬ	садддададд	дЬсЬЬсЬддс	ЬьььЬсссса	840
ддсЬсЬдддс	аддсасаддс	ЬаддЬдсссс	Ьаасссаддс	ссьдсасаса	ааддддсадд	900
ЬдсЬдддсЬс	адассЬдсса	ададссаЬаЬ	ссдддаддас	ссЬдссссЬд	ассЬаадссс	960
ассссааадд	ссааасЬсЬс	сасЬсссЬса	дсЬсддасас	сЬЬсЬсЬссЬ	сссадаЬЬсс	1020
адЬаасЬссс	ааЬсЬЬсЬсЬ	сЬдсададсс	саааЬсЬЬдЬ	дасаааасЬс	асасаЬдссс	1080
ассдьдссса	ддЬаадссад	сссаддссьс	дсссЬссадс	ьсааддсддд	асаддьдссс	1140
ЬададЬадсс	ЬдсаЬссадд	дасаддсссс	адссдддЬдс	ЬдасасдЬсс	ассЬссаЬсЬ	1200
сЬЬссЬсадс	ассЬдаасЬс	сЬддддддас	сдЬсадЬсЬЬ	ссЬсЬЬсссс	ссаааассса	1260
аддасасссь	саЬдаЬсЬсс	сддассссЬд	аддЬсасаЬд	сдьддьддьд	дасдЬдадсс	1320
асдаадассс	ЬдаддЬсаад	ЬЬсаасЬддЬ	асдЬддасдд	сдЬддаддЬд	саЬааЬдсса	1380
адасааадсс	дсдддаддад	садЬасааса	дсасдьассд	ЬдЬддЬсадс	дЬссЬсассд	1440
ЬссЬдсасса	ддасЬддсЬд	ааьддсаадд	адЬасаадЬд	сааддЬсьсс	аасааадссс	1500
Ьсссадсссс	саЬсдадааа	ассаЬсЬсса	аадссааадд	ЬдддасссдЬ	ддддЬдсдад	1560
ддссасаЬдд	асададдссд	дсЬсддссса	сссЬсЬдссс	ЬдададЬдас	сдсЬдЬасса	1620

- 67 026133

ассбсЬдЬсс	сбасадддса	дссссдадаа	ссасаддОд!	асасссЪдсс	сссабсссдд	1680
даддадабда	ссаадаасса	ддбсадссбд	ассбдссбдд	бсаааддсьь	сбабсссадс	1740
дасабедссд	Оддадбддда	дадсаабддд	садссддада	асаасЬасаа	дассасдссб	1800
сссдКдсбдд	асЪссдасдд	сбссЫсОКс	сКсКаКадса	адсЬсассдЬ	ддасаададс	1860
аддЬддсадс	аддддаасдЪ	сбОеЬеаЬдс	ОссдЬдаЬдс	абдаддсЬеО	дсасааесас	1920
Ьасасдсада	ададссЬсбс	ссбдбсбссд	ддЬааа			1956

<210> 21 <211> 657 <212> ДНК <213> Человек <400> 21

даДаДЬдОда	ЬдасЬсадЬс	ДссасЬсОсс	сбдассдДса	ссссДддада	дссддссДсс	60
аСсбссЬдса	ддбссадЬса	дадссЬссСд	ОабадбааОд	дабасаасЬа	ОООддаЬОдд	120
ОасеКдсада	адссадддеа	дбсЬсеаеад	дКесбдаКсС	сбКЬдддЫс	ОааКсдддсс	180
лссддддьсс	сОдасадсОс	садьддсадь	дда1;саддса	садаИШс	асьдааааьс	240
адсададбдд	аддсбдадда	ОдОбддддОО	ОаЬОасЬдса	ОдсаадсОсд	асааасбсса	300
0. са:-10 0 сд	дсссбдддас	сааадбддао	абсадасдаа	сбдОддсОдс	ассабсЬдОс	360
ОКсаКеКОсс	сдесаКсКда	КдадсадОКд	аааКеКддаа	сбдссбсКдЬ	ОдбдЬдесбд	420
сДдааЬаасЬ	ЬсЬаЬсссад	ададдесааа	дбасадЬдда	аддЬддаДаа	сдсссДссаа	480
ОсдддЬаасО	сссаддадад	ОдОсасадад	саддасадса	аддасадсас	сОасадссбс	540
адсадсассс	лдасдсьдад	сааадсадас	ласдадааас	асааадО сна	сдссьдсдаа	600
дКсасесаКс	адддссбдад	сбсдсссдСс	асааададсе	Ссаасадддд	ададбдь	657

<210> 22 <211> 1350 <212> ДНК <213> Человек <400> 22

саддКдсадс	ОддКддааЬе	Ьддеддсдда	дЬддЬдеаде	сЬддееддЬе	есЬдадаеЬд	60
лсЬЬдсдссд	ссЬссддсЫ	сассЬЬсЬсс	адсЬасддса	Ьдсасьдддь	дсдасаддсс	120
ссОддсаадд	дасОддаабд	ддЬддссдЬд	аЬсЬссЬасд	аддааЬссаа	садаЬассас	180
дсбдасбссд	Одаадддссд	дЬЬсасааЬс	Ьсссдддаса	асЬссаадаЬ	сасссЬдЬас	240
сСдсадабда	асЪсссбдсд	даседаддае	ассдеедЬдЬ	аеЬаеЬдеде	садддасдда	300
ддааДсдссд	сбссЬддасс	ЬдаЬЬаЬЬдд	ддссадддса	сссЬддЬдас	адЬдЬссЬсс	360
дсОадсасса	адддссссбс	сдЬдЬЬсссЬ	сЬддсссссЬ	ссадсаадЬс	сассЬсЬддс	420
ддсассдссд	сОсОдддсьд	ссЬддьдааа	дасЬасьЬсс	ссдадсссдь	дассдЬдЬсс	480

- 68 026133

Ьддаас1;с1;д	дсдсссьдас	сьссддсд/д	сасассИьс	садссд/дсь	дсадьсс/сс	540
ддссЬдЬасО	сссЬдЬсссс	сдЬддвдасс	дЬдсссссса	дсЬсЬсЬддд	сасссадасс	600
ЬасаКсКдса	асдКдаасса	саадсссбсс	аасассаадд	Кддасаадсд	ддбддаассс	660
аадбссбдсд	асаадассса	сассбдбссс	сссбдсссбд	ссссбдаасб	дсЬдддсдда	720
ссСОссдЬдО	ОссСдСЬссс	сссааадссс	ааддасассс	СдаЬдаСсЬс	ссддассссс	780
даадЬдассь	дсдЬддьдд/	ддасдьдьсс	сасдаддасс	сьдаад/даа	дбЬсааИдд	840
васдЬддасд	дсдЬддаад#	дсасаасдсс	аадассаадс	ссадададда	асадсасдсс	900
ЬссассКасс	дддКддЬдбс	КдКдсЬдасс	дКдсЬдсасс	аддасбддсб	даасддсааа	960
дадбасаадо	дсааддЬсбс	саасааддсс	сбдссбдссс	ссаЬсдаааа	дассабсКсс	1020
ааддссаадд	дссадссссд	сдадссасад	дСдСасасас	Сдссссссад	ссдддаадад	1080
аЬдассаада	ассаддьдьс	ссЬдассЬдЬ	сбддьсааад	дсНсгассс	сЬссдагапс	1140
дссдЬддадь	дддадЬссаа	сддасадссс	дадаасаас#	асаадассас	сссссссдвд	1200
сКддасКссд	асддсКсабК	сЬКссЬдбас	ЬссаадсКда	ссдбддасаа	дКсссддКдд	1260
садсадддса	асдбдЬЬсбс	сбдсбссдКд	абдсасдадд	сссбдсасаа	ссасбасасс	1320
садаадбссс	ОдОсссЬдад	ссссддсаад				1350

<210> 23 <211> 657 <212> ДНК <213> Человек <400> 23

дасаЬсдЬда	ьдасссадос	сссссьдосс	сЬдассдЬда	сассЬддсда	дсс1дсс7с1;	60
аЬсбссбдса	дабссбссса	дбсссЬдсКд	Оасбссаасд	дсбасаасба	ссбддасКдд	120
ЬаЪсЬдсада	адсссддсса	дЬссссасад	дЬдсЬдаЪсЪ	сссЬдддсЬс	саасададсс	180
ЬсКддсдЬдс	ссдассддбК	сбссддсбсб	ддсКсКддса	ссдасбКсас	асЬдаадабс	240
ЬсасдддЬдд	аадссдадда	сдЬдддсдЬд	ЬасЬасЬдса	Ьдсаддсссд	дсадассссс	300
ЫсассЪЬсд	дсссЬддсас	сааддЬддас	аЪссддсдЬа	сддЬддссдс	ЬсссадсдЬд	360
ГЬсабсбЬсс	сссссадсда	сдадсадсКд	аададсддса	ссдссадсдб	ддбдбдссбд	420
сСдаасаасО	ОсОасссссд	ддаддссаад	дбдсадОдда	аддЬддасаа	сдсссбдсад	480
адсддсааса	дссаддадад	сдКсассдад	саддасадса	аддасбссас	сКасадссбд	540
адсадсассс	ьдасссвдад	сааддссдас	васдадаадс	ас.аадд7дьа	сдсссдсдад	600
дбдасссасс	адддссЬдЬс	садссссдОд	ассаададсО	Осаасадддд	сдадЬдс	657

<210> 24 <211> 1350 <212> ДНК

- 69 026133

<213> Человек
<400> 24 саддкдсадс	ЬддЬддааЬс	Ьддсддсдда	дЬддЬдсадс	сЬддссддЬс	ссЬдадасЬд	60
ЬсЬЬдсдссд	ссЬссддсЬЬ	сассСЬсЬсс	адсСасддса	СдсасЬдддЬ	дсдасаддсс	120
ссЬддсаадд	дасЬддааЬд	ддЬддссдЬд	аЬсЬссЬасд	аддааЬссаа	садаЬассас	180
дсЬдасЬссд	Ьдаадддссд	дЬЬсасааЬс	Ьсссдддаса	асЬссаадаЬ	сасссЬдЬас	240
сЬдсадаьда	асьсссьдсд	дассдаддас	ассдссдЬдЬ	асЬасьдсдс	садддасдда	300
ддааЬсдссд	сЬссьддасс	ЬдаЬЬаЬЬдд	ддссадддса	сссЬддЬдас	адьдьссбсс	360
дсЬадсасса	адддссссЬс	сдЬдЬЬсссЬ	сЬддсссссЬ	ссадсаадЬс	сассЬсЬддс	420
ддсассдссд	сЬсЬдддсЬд	ссЬддЬдааа	дасЬасЬЬсс	ссдадсссдь	дассдЬдЬсс	480
ЬддаасЬсЬд	дсдсссЬдас	сЬссддсдЬд	сасассЬЬЬс	садссдЬдсЬ	дсадЬссЬсс	540
ддссЬдЬасЬ	сссЬдЬссьс	сдЬддьдасс	дЬдсссьсьа	дсЬсЬсЬддд	сасссадасс	600
ьасаЬсЬдса	асдЬдаасса	саадсссьсс	аасассаадд	Ьддасаадсд	ддьддаассс	660
аадЬссЬдсд	асаадассса	сассЬдЬссс	сссЬдсссЬд	ссссЬдаасЬ	дсЬдддсдда	720
ссЬЬссдЬдЬ	ЬссЬдЬЬссс	сссааадссс	ааддасассс	ЬдаЬдаЬсЬс	ссддассссс	780
даадЬдассЬ	дсдЬддЬддЬ	ддссдЬдЬсс	сасдаддасс	сЬдаадЬдаа	дЬЬсааЬЬдд	840
ьасдЬддасд	дсдЬддаадЬ	дсасаасдсс	аадассаадс	ссадададда	асадьасаас	900
ьссассЬасс	дддЬддЬдЬс	ЬдЬдсЬдасс	дЬдсьдсасс	аддасьддсь	даасддсааа	960
дадЬасаадЬ	дсааддЬсЬс	саасааддсс	сЬдссЬдссс	ссаЬсдаааа	дассаЬсЬсс	1020
ааддссаадд	дссадссссд	сдадссасад	дЬдЬасасас	Ьдссссссад	ссдддаадад	1080
аЬдассаада	ассаддЬдЬс	ссЬдассЬдЬ	сЬддЬсааад	дсЬЬсЬассс	сЬссдаЬаЬс	1140
дссдЬддадЬ	дддадЬссаа	сддасадссс	дадаасаасЬ	асаадассас	ссссссЬдЬд	1200
сЬддасЬссд	асддсЬсаЬЬ	сЬЬссЬдЬас	ЬссаадсЬда	ссдЬддасаа	дЬсссддЬдд	1260
садсадддса	асдЬдЬЬсЬс	сЬдсЬссдЬд	аЬдсасдадд	сссЬдсасаа	ссасЬасасс	1320
садаадЬссс	ЬдЬсссЬдад	ссссддсаад				1350
<210> 25 <211> 657 <212> ДНК <213> Человек
<400> 25 дасаЬсдьда	ЬдасссадЬс	сссссьдьсс	сЬдассдЬда	сассЬддсда	дссЬдссЬсЬ	60
аЬсЬссЬдса	даьссЬссса	дЬсссЬдсЬд	ьасЬссаасд	дсЬасаасьа	ссЬддасЬдд	120
ЬаЬсЬдсада	адессддсса	дЬссссасад	дЬдсЬдаЬсЬ	сссЬдддсЬс	саасададсс	180
ЬсЬддсдЬдс	ссдассддЬЬ	сЬссддсЬсЬ	ддсЬсЬддса	ссдасЬЬсас	асЬдаадаЬс	240

- 70 026133

СсасдддСдд	аадссдадда	сдСдддсдСд	гас^асЕдса	Сдсаддсссд	дсадассссс	300
ССсассССсд	дсссЪддсас	сааддСддас	а£.ссддсд£а	сддСддссдс	СсссадсдЬд	360
исабсисс	сссссадсда	сдадсадсСд	аададсддса	ссдссадсдС	ддСдСдссСд	420
сСдаасаасс	исиасссссд	ддаддссаад	д^дсадЕдда	аддСддасаа	сдсссСдсад	480
адсддсааса	дссаддадад	сдСсассдад	саддасадса	аддассесас	сСасадссСд	540
адсадсассс	^дасссЪдад	сааддссдас	^асдадаадс	аСааддСдСа	сдссСдсдад	600
дСдасссасс	адддссЪдЕс	садссссдСд	ассаададс!;	Ссаасадддд	сдадСдс	657

<210> 26 <211> 1350 <212> ДНК <213> Человек <400> 26

саддСдсадс	ЬддСддааСс	Сддсддсдда	дСддЬдсадс	ссддссддсс	ссСдадасСд	60
СсССдсдссд	ссьссддссс	сассССсСсс	адсСасддса	СдсаеСдддС	дсдасаддсс	120
ссСддсаадд	дасСддааСд	ддСддссдСд	аСсСссСасд	аддааСссаа	садаСассас	180
дсСдасСссд	Сдаадддссд	дССсасааСс	Ссссдддаса	асСссаадаС	сасссСдСас	240
сСдсадаСда	асСсссСдсд	дассдаддас	ассдссдСдС	асСасСдсдс	садддасдда	300
ддааСсдссд	сСссСддасс	СдаССаССдд	ддссадддса	сссСддСдас	адСдСссСсс	360
дсСадсасса	адддсссссс	сдСдССсссС	сСддссссСС	ссадсаадсс	СассСссддс	420
ддсасадсСд	сСсСдддсСд	ссСддСсаад	дасСасССсс	сСдадссСдС	дасадСдСсс	480
СддаасСсСд	дсдсссЪдас	сЬсСддсдСд	сасассССсс	сСдссдСдсЬ	дсадСссСсс	540
ддссСдСасС	сссСдСссСс	сдСддСсаса	дСдссССсаа	дсадссСддд	сасссадасс	600
саСаСсСдса	асдСдаасса	саадссСссс	аасассаадд	Сддасаадсд	ддСддадссС	660
аадсссСдсд	асаадассса	сассСдСссс	сссСдсссСд	ссссСдаадс	сдсСддсддс	720
ссССсСдСдС	СссСдССссс	Сссааадссс	ааддасассс	СдаСдаСсСс	ссддассссС	780
даадСдассС	дсдСддСддС	ддасдСдСсс	сасдаддаСс	сСдаадСдаа	дССсааССдд	840
СасдСддасд	дсдСддаддС	дсасаасдсс	аадассаадс	сСсдддадда	асадСасаас	900
СссассСасс	дддСддСдСс	сдСдсСдасс	дСдсСдсасс	аддассддсс	даасддсааа	960
дадЬасаадЬ	дсааадСсЬс	саасааддсс	сСдссСдссс	сСаСсдаааа	дасааСсСсс	1020
ааддссаадд	дссадссСад	ддаассссад	дСдСасассс	Сдссасссад	ссдддаддаа	1080
аСдассаада	ассаддСдСс	ссСдассСдС	сСддСсаадд	дсССсСассс	ССссдаСаСс	1140
дссдСддадЬ	дддадСсСаа	сддссадссЬ	дадаасаасС	асаадассас	сссСссЬдЬд	1200
сСддасСссд	асддсСссСС	сССссСдСас	СссааасСда	ссдсддасаа	дСсссддСдд	1260
садсадддса	асдСдСссСс	сЬдсСссдСд	аСдсасдадд	ссссдсасаа	ссассасасс	1320

- 71 026133

садаадсссс	СдСсссСдСс	Ссссддсаад				1350
<210> 27 <211> 657 <212> ДНК <213> Человек
<400> 27 дасаСсдСда	СдасссадСс	сссссЬдЬсс	сЪдассдЪда	сассСддсда	дсс^дссЪсЪ	60
аСсСссСдса	даСссСссса	дСсссСдсСд	^ас^ссаасд	дсСасаасСа	ссЪддас^дд	120
ЬаСсСдсада	адсссддсса	дСссссасад	д!;дсЬда1;с11	сссСдддсСс	саасададсс	180
ьсСддсдСдс	ссдассддьС	ссссддсссс	ддс1;с1;ддса	ссдасьСсас	асидаадаис	240
ЬсасдддСдд	аадссдадда	сдСдддсдСд	Ьас^асЬдса	Сдсаддсссд	дсадассссс	300
ЬСсассССсд	дсссбддсас	сааддЬддас	а^ссддсд^а	сддбддссдс	ЪсссадсдЪд	360
ССсаСсССсс	сссссадсда	сдадсадсСд	аададсддса	ссдссадсдС	ддЪдЪдссЪд	420
сСдаасаасС	СсСасссссд	ддаддсоаад	д^дсад^дда	аддСддасаа	сдсссцдсад	480
адсддсааса	дссаддадад	сдСсассдад	саддасадса	аддасьссас	с^асадссид	540
адсадсассс	ЬдасссЬдад	сааддссдас	гасдадаадс	аЬааддСдЬа	сдссИдсдад	600
дСдасссасс	адддссСдСс	садссссдСд	ассаададс1э	Ссаасадддд	сдадЪдс	657

Claims (15)

1. Зег С1и ТЬг Азр 100 ТЬг 11е Суз ТЬг Суз 105 С1и С1и С1у Тгр Нхз 110 Суз ТЬг Зег СЬи АЬа Суз СЬи Зег Суз УаЬ Ьеи НЬз Агд Зег Суз Зег Рхо СЬу 115 120 125 РЬе СЬу Уа1 Ьуз СЬп Не АЬа ТЬг СЬу Уа1 Зег Азр ТЬг 11е Суз СЬи 130 135 140 Рго Суз Рго УаЬ СЬу РЬе РЬе Зег Азп УаЬ Зег Зег А1а РЬе С1и Ьуз 145 150 155 160 Суз Н1з Рго Тгр ТЬг Зег Суз СЬи ТЬг Ьуз Азр Ьеи Уа1 Уа1 СЬп СЬп 165 ПО 175 АЬа СЬу ТЫ Азп Ьуз ТЫ Азр УаЬ УаЬ Суз СЬу Рго СЬп Азр Агд Ьеи 180 185 190 Агд АЬа Ьеи УаЬ УаЬ 1Ье Рго 1Ье 11е РЬе СЬу 11е Ьеи РЬе А1а 11е 195 200 205 Ьеи Ьеи УаЬ Ьеи УаЬ РЬе 11е Ьуз Ьуз УаЬ АЬа Ьуз Ьуз Рго ТЬг Азп 210 215 220 Ьуз АЬа Рго Нхз Рго Ьуз СЬп СЬи Рго СЬп С1и 11е Азп РЬе Рго Азр 225 230 235 240 Азр Ьеи Рго С1у Зег Азп ТЬг А1а АЬа Рго Уа1 С1п С1и ТЬг Ьеи Нхз 245 250 255 СЬу Суз СЬп Рго УаЬ ТЬг СЬп СЬи Азр СЬу Ьуз СЬи Зег Агд 11е Зег 260 265 270 УаЬ СЬп СЬи Агд СЬп 275 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Выделенное антитело или белок, включающие антигенсвязывающую область антитела, направленную против целевого полипептида СГО40 (8Еф ГО N0: 28), где указанное антитело или белок включают вариабельную область легкой цепи, содержащую Ь-СЭК1 с аминокислотной последовательностью 8Еф ГО N0: 4, Ь-СЭК2 с аминокислотной последовательностью 8Еф ГО N0: 5, Ь-СОК3 с аминокислотной последовательностью 8Еф ГО N0: 6, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую Н-СГОК1 с аминокислотной последовательностью 8Еф ГО N0: 1, Н-СГОК2 с аминокислотной последовательностью 8Еф ГО N0: 2, Н-СГОК3 с аминокислотной последовательностью 8Еф ГО N0: 3, и характеризуются тем, что:

   a) связывают полипептид СГО40 с величиной К_с, равной 10 нМ или менее, и

   b) включают молчащий фрагмент Рс 1§С1 с аминокислотными модификациями №97А или Э265А.
2. 2. Выделенное антитело или белок по п.1, где указанное антитело или белок ингибируют СО40Ьиндуцируемое проведение сигнала с величиной 1С₅₀, равной 50 нг/мл или менее.
3. 3. Выделенное антитело или белок по любому из пп.1 или 2, где указанный молчащий фрагмент Рс 1§С1 содержит аминокислотную последовательность 8Еф ГО N0: 17 или 8Еф ГО N0: 18.
4. 4. Выделенное антитело или белок по любому из пп.1 или 2, которые включают вариабельную область тяжелой цепи (У_н) с аминокислотной последовательностью 8Еф ГО N0: 7 и вариабельную область легкой цепи (У_ъ) с аминокислотной последовательностью 8Еф ГО N0: 8.
5. 5. Выделенное антитело или белок по любому из пп.1 или 2, выбранные из группы, состоящей из:

   a) антитела тАЬ1, содержащего аминокислотную последовательность тяжелой цепи 8Еф ГО N0: 11 и аминокислотную последовательность легкой цепи 8Еф ГО N0: 12, и

   b) антитела тАЬ2, содержащего аминокислотную последовательность тяжелой цепи 8Еф ГО N0: 13 и аминокислотную последовательность легкой цепи 8Еф ГО N0: 14.

   - 73 026133
6. 6. Применение выделенного антитела или белка по любому из пп.1 или 2 для лечения аутоиммунных нарушений и/или воспалительных нарушений.
7. 7. Применение выделенного антитела или белка по любому из пп.1 или 2 для предотвращения или снижения риска отторжения трансплантата при трансплантации.
8. 8. Применение выделенного антитела или белка по любому из пп.1 или 2 для лечения рассеянного склероза, системной красной волчанки, синдрома Шегрена, ревматоидного артрита, отторжения трансплантата, миастении гравис и реакции трансплантат против хозяина.
9. 9. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело или белок по любому из пп.1 или 2, в комбинации с фармацевтически приемлемым вспомогательным веществом, разбавителем или носителем для лечения аутоиммунных нарушений и/или воспалительных нарушений.
10. 10. Жидкая фармацевтическая композиция, содержащая антитело или белок по любому из пп.1 или 2 и буфер, для лечения аутоиммунных нарушений и/или воспалительных нарушений.
11. 11. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело или белок по любому из пп. 1 или 2.
12. 12. Клонирующий или экспрессионный вектор, содержащий одну или несколько нуклеиновых кислот по п.11.
13. 13. Клонирующий или экспрессионный вектор по п.12, содержащий по меньшей мере одну из нижепредставленных кодирующих последовательностей (а), (Ь), функционально связанных с последовательностями подходящего промотора:

    (a) 8ЕО ГО N0: 22 и 8Е^ ГО N0: 23 или (b) 8ЕО ГО N0: 24 и 8Е^ ГО N0: 25.
14. 14. Клетка-хозяин для получения антитела или белка по любому из пп.1 или 2, содержащая один или несколько клонирующих или экспрессионных векторов по п.12 или 13.
15. 15. Способ получения антитела или белка по любому из пп.1 или 2, включающий культивирование клетки-хозяина, содержащей один или несколько клонирующих или экспрессионных векторов, которые содержат одну или несколько нуклеиновых кислот, кодирующих указанные антитело или белок, и очистку и извлечение указанного антитела или белка.