MX2013005477A - Variantes de fc silenciosas de los anticuerpos anti-cd40. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a variantes de Fc silenciosas de los anticuerpos anti-CD40, y a composiciones y métodos de uso de estos anticuerpos, para el tratamiento de trastornos patológicos, tales como trastornos autoinmunes e inflamatorios, y/o para prevenir o reducir el riesgo de rechazo de injerto en el trasplante.

Description

VARIANTES DE Fe SILENCIOSAS DE LOS ANTICUERPOS ANTI-CD40 La presente invención se refiere a variantes de un fragmento constante (Fe) silenciosas de anticuerpos anti-CD40, y j a composiciones y métodos de uso de estos anticuerpos, paraj el tratamiento de trastornos patológicos, tales como trastornos autoinmunes e inflamatorios, y/o para prevenir o reducir el riesgolde rechazo de injerto en el trasplante.

A pesar de la disponibilidad de varios tratamientos ¡nmunosupresores para las enfermedades autoinmunes, sigue existiendo una gran necesidad insatisfecha de fármacos más eficaces y más seguros en una gran fracción de la población de pacientes. Por ejemplo, a pesar de la eficacia reportada de las terapias consumidoras/inhibidoras de las células-B, como Rituximab y Belimumab en artritis reumatoide, lupus eritematoso sistérriieo, síndrome de SjOgren, y esclerosis múltiple, estas terapias son solamente efectivas en una porción de los individuos enfermos,! y, con el Rituximab, con un riesgo aunado de leucoencefalopajtia I multifocal progresiva. Además, con frecuencia están involucrados otros múltiples tipos de células de leucocitos en la patología de estas enfermedades autoinmunes, tales como macrófagos, células dendríticas y células-T; por consiguiente, la intervención terapéutica que se dirija a tipos de células adicionales o a sendas inmunológjcas clave que inhiban su función, podría proporcionar un beneficio. i Dadas las múltiples funciones inmunológicamente relevantes del CD40-CD154 en la activación y función de estos tipos de células, es probable que un anticuerpo anti-CD40 conferiría un beneficio terapéutico a los pacientes que padezcan las enfermedades autoinmunes ilustradas anteriormente más allá de lo que proporcionan en el presente las terapias actuales. Además, la función central de las interacciones de CD40-CD154 en los trastornos inflamatorios intestinales, tales como enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa, y las vinculaciones mecánicas de la senda de CD40 con la patología en trastornos más raros, tales cómo vasculitis autoinmune, pénfigo vulgar, e ITP, también realzan el potencial de los anticuerpos anti-CD40 en estas indicaciones.

Los inmunosupresores actualmente disponibles utilizados después del trasplante de un órgano sólido, proporcionan una excelente eficacia a corto plazo. Se observan rechazos agudos dentro del período de novo en el 5 por ciento al 20 por ciento de los receptores (dependiendo del órgano, de la población de pacientes,] y del régimen), y la proporción de injertos perdidos por el rechazo agudo dentro del período de novo está por debajo del 5 por cien¡to i para cualquier establecimiento. Actualmente, la necesidad insatisfecha clave es la tolerabilidad de la inmunosupresión con el paciente y la sobrevivencia del injerto a largo plazo. Después dfel trasplante renal, el 33 por ciento de los pacientes mueren y/o pierden su injerto dentro de 5 años; la edad promedio de muerte del receptor del trasplante es de 58 años. Los inhibidores de calcineurina (C il) siguen siendo el fundamento de la terapia inmunosupresora para la gran mayoría de los pacientes de trasplante. Aunque la nefrotoxicidad y la patología cardiovascular asociada con los inhibidores de calcineurina (CNIs) es uno de los impulsores de la nefropatía de aloinjerto crónica, así como la muerte del paciente con un injerto funcionando, la inmunosupresión primaria alternativa no ha cada vez más la necesidad de nuevos agentes para resolver) el rechazo de las células-B. j I C h ir 12.12 es un anticuerpo anti-CD40 no agonista completamente humanizado (Ig G 1 , kappa) que bloquea la activación de los leucocitos mediada por el CD154 (también conocido como ligando CD40; CD40L), y puede mediar la citotoxicidad celu!lar dependiente de los anticuerpos (ADCC) de los leucocitos humanos y los linfomas de células-B in vitro (véase la Publicación Internacional Número WO2006/073443). a Publicación Internacional Número WO2005/044306 también describe anticuerpos antagonistas anti-CD40, incluyendo Chir12.12, para utilizarse en particular en el tratamiento de los trastornos autoinmunes e inflamatorios. Además, Chir12.12 es efectivo para retrasar el rechazo de aloinjerto de riñon cuando se dosifica como una monoterapia en Macaca fasciculá'ris (monos cinomolgos) [Li y colaboradores (2008) Transplantation; 86 (1): 10-15]. Sin embargo, C hir12.12 también pued el consumo de las células-B periféricas en los primates os (NHPs).

Se predice que los mAbs anti-CD40 con actividad !de citotoxicidad celular dependiente de los anticuerpos (ADG IC) silenciada, tienen un perfil de seguridad mejorado en relación con ¡los anticuerpos anti-CD40 progenitores, y en particular, pueden ser más adecuados para las indicaciones no oncológicas, tales como las enfermedades autoinmunes, y para su uso en una situación de trasplante.

La presente invención, por consiguiente, proporciona anticuerpos monoclonales anti-CD40 silenciosos Fe que conservan los atributos bloqueadores del CD40L no agonistas del anticuerpo anti-CD40 progenitor Chir12.12.

En particular, la invención proporciona un anticuerpo aislado o una proteína que comprende una porción de enlace de antígenó de un anticuerpo dirigida contra el polipéptido de CD40 objetivo (SEQI ID NO: 28), caracterizado porque este anticuerpo o esta proteína: j a) se enlaza al polipéptido de CD40 con una KD de 10 nlyl o menos, y i b) comprende una región Fe de IgG silenciosa. I i En una modalidad, este anticuerpo o esta proteína inhibei la señalización inducida por CD40L con una IC50 de ¡50 j nanogramos/mililitro o menos.

En otra modalidad, el anticuerpo aislado o la proteína de acuerdo con la invención no tiene ninguna actividad agonista, o tiene una baja actividad agonista con respecto a la señalización de CD40.

En otra modalidad, el anticuerpo o la proteína de acuerdo con la presente invención comprende una región Fe de IgG silenciosa seleccionada a partir del grupo que consiste en la secuencia de i aminoácidos de la SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 1¡9.

En otra modalidad, el anticuerpo aislado o la proteína de la invención comprende regiones variables de cadena pesada (VH) y de cadena ligera (VL) que tienen cuando menos el 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 ó 100 por ciento de identidad de secuencia con la¡VH del anticuerpo Chir12.12 (SEQ ID NO: 9), y con la Vu del anticuerpo Chir12.12 (SEQ ID NO: 10), respectivamente.

Los ejemplos específicos de los anticuerpos de acuerdo con la invención son: i í mAb1, el cual comprende la secuencia de aminoácidosjde la cadena pesada de la SEQ ID NO: 11 y la secuencia |de aminoácidos de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 12, I mAb2, el cual comprende la secuencia de aminoácidosjde la cadena pesada de la SEQ ID NO: 13 y la secuencia jde i aminoácidos de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 14, o j mAb3, el cual comprende la secuencia de aminoácidos Ide la cadena pesada de la SEQ ID NO: 15 y la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 16.

El anticuerpo aislado o la proteína de acuerdo con la invención se puede utilizar como un medicamento. En particular, !>on adecuados para utilizarse en el tratamiento de trastornos autoinmunes, trastornos inflamatorios, y/o en la prevención o reducción del riesgo de rechazo de injerto en el trasplante. ¡ El anticuerpo aislado o la proteína de acuerdo con la invencjión se puede utilizar en particular en el tratamiento de esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, síndrome de Sjógren, artritis reumatoide, rechazo de trasplante, y la enfermedad del injerto contra el huésped . ¡ La invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos o las proteínas anteriores de acuerdo con la invención, en combinación con cuando menos un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable. Esjtas composiciones farmacéuticas pueden comprender adicionalmejnte otros ingredientes activos. ¡ La invención también se refiere a un liofilizado o lina i formulación líquida de un anticuerpo o de una proteína de acuerdo i con la invención. ¡ La invención se refiere además al ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo o la proteína de acuerdo con la invención, y al vector de clonación o de expresión correspondiente, el c|ual comprende cuando menos un ácido nucleico seleccionado a partir ¡del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 22 a 27.

La invención también se refiere a una célula huésped, la cual comprende uno o más vectores de clonación o de expresión como se definen anteriormente.

La invención proporciona además un proceso para la producción de un anticuerpo o de una proteína de la invención, el I cual comprende cultivar la célula huésped como se def'ine anteriormente, purificar y recuperar este anticuerpo o esta proteína.

Con el objeto de que la presente invención se pueda entender más fácilmente, primero se definen ciertos términos. Se estipulan definiciones adicionales a través de toda la descripción detallada.

El término "respuesta inmunitaria" se refiere a la acción de, por ejemplo, los linfocitos, las células presentadoras de antígeno, las células fagocíticas, los granulocitos, y las macromoléculas solubles producidas por las células anteriores o por el hígado (incluyendo los anticuerpos, las citoquinas, y el complemento), dando colmo resultado un daño selectivo a, destrucción de, o eliminación el cuerpo humano, de patógenos invasores, células o tejidos infectados i con patógenos, células cancerosas, o, en los casos ¡de autoinmunidad o de inflamación patológica, células o tejidos humanos normales.

Una "senda de transducción de señales" o "actividad ¡de señalización" se refiere a una relación causal bioquímica iniciada!en i términos generales por una interacción de proteína-proteína, jtal como el enlace de un factor de crecimiento al receptor A, que da como resultado la transmisión de una señal a partir de una porción de una célula hasta otra porción de una célula. En general, ¡ la transmisión involucra la fosforilación específica de uno o más ¡ residuos de tirosina, serina, o treonina sobre una o más proteínas ¡en la serie de reacciones que causa la transducción de señales. penúltimos procesos típicamente incluyen eventos nucleares que como resultado un cambio en la expresión genética. ¡ El término CD40 se refiere al CD40 humano, por ejemplo, como se define en la SEQ ID NO: 28, a menos que se describa de otra manera.

El término "anticuerpo", como es referido en la presente, incluye los anticuerpos enteros y cualesquiera fragmentos de enla'ce j de antígeno (es decir, "porción de enlace de antígeno"), o (as cadenas individuales de los mismos. ' Un "anticuerpo" que se presenta naturalmente es glicoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y I dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces de disulfuro.

Cada cadena pesada está compuesta de una región variable jde cadena pesada (abreviada en la presente como VH) y una regijón j constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesaba está compuesta de tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cade'na ligera está compuesta de una región variable de cadena Mge a (abreviada en la presente como VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera está compuesta de un dominio, CL. Las regiones VH y VL se pueden subdividir además en regiones de hipervariabilidad, denominadas como regiones determinantes de complementariedad (CDRs), interca con regiones que están más conservadas, denominadas regiones de estructura (FRs). Cada VH y VL está compuesta de tres regiones determinantes de complementariedad (CDRs) y cuajtro regiones de estructura (FRs) acomodadas desde el término amjno hasta el término carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, I CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de enlace que ¡nteractúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar el enlace de la inmunoglobulina a los tejidos o factores del huésped, incluyendo distintas células del sistema inmunológico ([ or ejemplo, las células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema clásico de complementos. i El término "porción de enlace de antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "porción de antígeno"), como se utiliza en la presenjte, se refiere a un anticuerpo de longitud completa, o a uno o fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad enlazarse específicamente a un antígeno (por ejemplo, una porción de CD40). Se ha mostrado que la función de enlace de antígeno de un anticuerpo se puede llevar a cabo mediante los fragmentos delun anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de los fragmentos Ide enlace abarcados dentro del término de "porción de enlace íde antígeno" de un anticuerpo incluyen un fragmento Fab, un fragmento i monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; ¡un fragmento F(ab)2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados por un puente de disulfuro en la región de articulación; un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo; un fragmento dAb (Ward y colaboradores, i 1989, Nature 341: 544-546), que consiste en un dominio VH; y ? na región determinante de complementariedad (CDR) aislada, j o cualesquiera proteínas de fusión que comprendan esta porción! de enlace de antígeno.

Adicionalmente, aunque los dos dominios del fragmento Fv, el VL y el VH, son codificados por genes separados, se pueden unir, empleando métodos recombinantes, mediante un enlazador sintético que les permite hacerse como una proteína de una sola cadena.j en la cual las regiones VL y VH forman pares para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de una sola cadena (scFv); véase también Bird y colaboradores, 1988, Science 242: 423-426; y Huston y colaboradores, 1988 Proc. Nati. Acad. Sci. 85: 5879-5883). Estos anticuerpos de una sola cadena también pretenden estar abarcaidos dentro del término "porción de enlace de antígeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen empleando las técnicas i convencionales conocidas para los expertos en este campo, yj los fragmentos son seleccionados por su utilidad de la misma manera que lo son los anticuerpos intactos. ' i Como se utiliza en la presente, el término "región Fe de lgG|" se utiliza para definir la región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina, incluyendo la región Fe de la secuencia nativa y las regiones Fe variantes. La región Fe de la cadena pesada de IgG humana se define en general como aquélla que comprende el residuo de aminoácido a partir de la posición C226 o a partir de P230 hasta el término carboxilo del anticuerpo de IgG. La numeración de Ijos residuos en la región Fe es aquélla del índice EU de Kabat. La li C-terminal (residuo K447) de la región Fe se puede remover, ejemplo, durante producción o purificación del anticuerpo. conformidad con lo anterior, una composición de los anticuerpos jde la invención puede comprender poblaciones de anticuerpos con tod'os los residuos K447 removidos, poblaciones de anticuerpos in residujos K447 removidos, y poblaciones de anticuerpos que tengan una i mezcla de los anticuerpos con y sin el residuo K447.

Un "anticuerpo aislado", como se utiliza en la presente, se i refiere a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se enlaza específicamente al CD40 está sustancialmente libre de anticuerpos que se enlacen específicamente a antígenos distintos del CD40). Un anticuerpo aislado que se enlaza específicamente al CD40, sin embargo, puede tener reactividad cruzada con otros antígenos, tales como moléculas de CD40 de otras especies (no humanas). Más aún, un anticuerpo i aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o productos químicos. ¡ Los términos "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal", como se utilizan en la presente, se refieren a una preparación de moléculas de anticuerpos de una sola composición molecular. Una composición de anticuerpo monoclonal exhibe una sola especificidad de enlace y afinidad por un epítopo particular.

El término "anticuerpo humanizado", como se utiliza en la presente, pretende incluir los anticuerpos que contienen una i secuencia mínima derivada a partir de las secuencias ^le inmunoglobulina no humanas. Para la mayor parte, los anticuerpjos I humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor), I en donde los residuos a partir de una región hipervariable (también conocida como región determinante de complementariedad o CD¡R) j del receptor son reemplazados por residuos a partir de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donador), tal como ratón, rata, conejo, o primate no humano que tiene ¡la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. La frase "región determinante de complementariedad" se refiere a las secuencias de aminoácidos que definen juntas la afinidad y especificidad de enlace i de la región Fv natural de un sitio de enlace de inmunoglobuliifia nativo. Véase, por ejemplo, Chotia y colaboradores (1987) J. Mol.

Biol. 196: 901-917: Kabat y colaboradores (1991) US Dept. of Heal¡th i and Human Services (Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos), NIH Publicación No. 91-3242). La frase "región constante" se refiere a la porción de la molécula de anticuerpo que confiere las funciones efectoras. En el trabajo I anterior, que se refiere a la producción de anticuerpos no inmunogénicos para utilizarse en la terapia de las enfermedades humanas, las regiones constantes de ratón fueron sustituidas por regiones constantes humanas. Las regiones constantes de jos presentes anticuerpos humanizados se derivaron a partir de jas inmunoglobulinas humanas. La humanización se puede llevar a cJbo siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones j y colaboradores (1986) Nature 321: 522-525; Riechmann y colaboradores (1988) Nature 332: 323-327: Verhoeyen y colaboradores (1988) Science 239: 1534-1536), mediante la sustitución de las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) o de las secuencias de regiones determinantes jde I complementariedad (CDR) de roedor y de roedor mutante, por jas secuencias correspondientes del anticuerpo humano. En algunas instancias, los residuos dentro de las regiones de estructura de una i o más regiones variables de la inmunoglobulina humana son reemplazados por los residuos no humanos correspondientes (véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos ¡de Norteamérica Números 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762; y 6,180,370). Adicionalmente, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentren en el anticuerpo recepjtor o en el anticuerpo donador. El anticuerpo humanizado de : la invención también comprenderá cuando menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe). Típicamente, aquélla de una inmunoglobulina humana, y en el presente caso, una región Fe I de IgG silenciosa. | Los anticuerpos de la invención pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por las secuencias humanas (por ejemplo, las mutaciones introducidas mediante mutagénesis aleatoria o específica del sitio in vitro o mediante mutación somática in viv ). En particular, el término "anticuerpo humanizado" incluye os anticuerpos que comprenden una variante silenciosa de la región Fe de IgG. i El término "anticuerpo monoclonal humanizado" se refiere a los I anticuerpos que exhiben una sola especificidad de enlace, los cuales tienen regiones variables, en donde las regiones variables se humanizan a partir de las secuencias no humanas.

El término "anticuerpo recombinante", como se utiliza en la presente, incluye todos los anticuerpos humanos o humanizados que son preparados, expresados, creados o aislados por med iios recombinantes, tales como anticuerpos aislados a partir de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico o transcromosómico para los genes de inmunoglobulina humana, o un hibridoma preparado a partir de los mismos, anticuerpos aislados a partir de una célula huésped transformada para expresar el anticuerpo humano! o humanizado, por ejemplo, de un transfectoma, anticuerpos aislados a partir de una biblioteca de anticuerpos humanos combinatorijos, recombinantes, y anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique separar toda o una porción de un gen de inmunoglobulina humana, secuencias para otras secuencias de ADN. Estos anticuerpos humanos o humanizados recombinantes tienen regiones variables en las cua es las regiones de estructura y las regiones determinantes ¡de complementariedad (CDR) se pueden derivar a partir de ijas secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. En ciertas modalidades, sin embargo, estos anticuerpos humanos humanizados recombinantes se pueden someter a mutagénesis j in vitro (o, cuando se usa un animal transgénico para las de la Ig humana, a mutagénesis somática in vivo), y de las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque se derivan a partir de, y se relacionan con, las secuencias VH y VL de la línea germinal humana, pueden no existir naturalmente dentro del repertorio de la línea germinal de anticuerpos humanos in vivo. \ j Como se utiliza en la presente, "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpo (por ejemplo, IgM, IgE, IgG, tales como lgG1 o lgG4) que ¡ es proporcionado por los genes de región constante de cadena pesada. Diferentes isotipos tienen diferentes funciones efectorás. Por ejemplo, Los isotipos lgG1 e lgG3 humanos de tipo silvestre median la actividad de citotoxicidad mediada por células dependiente del anticuerpo (ADCC). j Las frases "un anticuerpo que reconoce un antígeno" y "ún anticuerpo específico para un antígeno" y "un anticuerpo dirigido contra un antígeno", se utilizan indistintamente en la presente con leí término "un anticuerpo que se enlaza específicamente a un antígeno".

Como se utiliza en la presente, un anticuerpo o una proteílna que "se enlaza específicamente al polipéptido de CD40" pretende referirse a un anticuerpo o una proteína que se enlaza al polipéptido de CD40 humano con una KD de 100 nM o menos, de 10 nM o menos o de 1 nM o menos.

Un anticuerpo que "tiene reacción cruzada con un antígeno distinto del CD40" pretende referirse a un anticuerpo que se enlaza a este antígeno con una D de 1 µ? o menor, de 100 nM o menor, de 10 nM o menor, o de 1 nM o menor. Un anticuerpo que "no tiene reacción cruzada con un antígeno particular" pretende referirse a un anticuerpo que se enlaza a ese antígeno, con una KD de 100 nMj mayor, o con una KD de 1 µ? o mayor, o una KD de 10 µ? o mayor. En ciertas modalidades, estos anticuerpos que no tienen reacción, cruzada con el antígeno exhiben un enlace esencialmente indetectable contra estas proteínas en los ensayos de enlate convencionales. ¡ El término "Kasoc" o "Ka", como se utiliza en la presente, pretende referirse al índice de asociación de una interacción particular de anticuerpo-antígeno, mientras que el término "Kdis" o "Kd", como se utiliza en la presente, pretende referirse al índice de disociación de una interacción particular de anticuerpo-antígeno. ¡ El término "KD", como se utiliza en la presente, pretende referirse a la constante de disociación, la cual se obtiene a partir de la proporción de Kd a Ka (es decir, Kd/Ka), y se expresa como uña concentración molar (M). Los valores KD para los anticuerpos se pueden determinar empleando los métodos bien establecidos en este campo. Un método para determinar la KD de un anticuerpo Íes utilizando resonancia de plasmón superficial, o utilizando un sistema í biosensor, tal como un sistema Biacore®. ¡ i Como se utiliza en la presente, el término "Afinidad" se refiere a la fuerza de interacción entre el anticuerpo y el antígeno en Ijos sitios antigénicos individuales. Dentro de cada sitio antigénico, la región variable del "brazo" del anticuerpo interactúa a través de fuerzas no covalentes débiles con el antígeno en numerosos sitios; mientras más interacciones haya, más fuerte será la afinidad.

Como se utiliza en la presente, el término "Avidez" se refiere a una medida de información de la estabilidad o fuerza global del complejo de anticuerpo-antígeno. Se controla mediante tres factorjes i principales: la afinidad del epítopo del anticuerpo; la valencia ide tanto el antígeno como del anticuerpo; y la configuración estructural de las partes que interactúan. Por último estos factores definenj la i especificidad del anticuerpo, es decir, la probabilidad de que el i anticuerpo particular se enlace al epítopo preciso del antígeno. ] Como se utiliza en la presente, el término "antagonista ide CD40" pretende referirse a un anticuerpo o a una proteína que inhijbe la actividad de señalización inducida por CD40 en la presencia del CD40L en un ensayo de células humanas, tal como el ensayo :de i proliferación de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) mediada por el CD40L. Este ensayo se describe con mayor detalle ¡en los Ejemplos más adelante. En algunas modalidades, los anticuerpos o las proteínas de la invención inhiben la señalización inducida por CD40L con una IC50 de 500 nanogramos/mililitro o menos, cié preferencia con una IC50 de 50 nanogramos/mililitro o menos, p¡or ejemplo, con una IC50 de 20 nanogramos/mililitro o menos, como se mide en el ensayo de proliferación de células mononucleares jde sangre periférica (PBMC) mediada por el CD40L. | Como se utiliza en la presente, un anticuerpo con "ninguna Este ensayo se describe con más detalles en los Ejemplos más adelante. i Como se utiliza en la presente, el término "ADCC" o actividlad de "citotoxicidad celular dependiente de los anticuerpos" se refiere a la actividad de consumo de células. La actividad de citotoxicidjad celular dependiente de los anticuerpos (ADCC) se puede mejdir mediante el ensayo de citotoxicidad celular dependiente de jos anticuerpos (ADCC) como se describe con más detalles en los i Ejemplos más adelante. j Como se utiliza en la presente, el término anticuerpo "silencioso" se refiere a un anticuerpo que no exhibe ninguna actividad, o que exhibe una baja actividad de citotoxicidad celular I I dependiente de los anticuerpos (ADCC), como se mide en un ensayo de citotoxicidad celular dependiente de los anticuerpos (ADCC) se describe en los Ejemplos.

En una modalidad, el término "ninguna o baja actividad de citotoxicidad celular dependiente de los anticuerpos (ADC¡C)" significa que el anticuerpo silencioso exhibe una actividad | de citotoxicidad celular dependiente de los anticuerpos (ADCC) que ejstá por debajo del 50 por ciento de lisis celular específica, por ejemplo, por debajo del 10 por ciento de lisis celular específica, como se en el ensayo de citotoxicidad celular dependiente de los anticuerpos (ADCC), como se describe en los Ejemplos. Ninguna actividadj de citotoxicidad celular dependiente de los anticuerpos (ADCC) significa que el anticuerpo silencioso exhibe una actividad de citotoxiciélad celular dependiente de los anticuerpos (ADCC) (lisis celular específica) que está debajo del 1 por ciento. En una modalidad, específica, un anticuerpo silencioso de acuerdo con la invención! no exhibe ninguna actividad significativa de citotoxicidad celúlar dependiente de los anticuerpos (ADCC), como se mide en un ensayo de citotoxicidad celular dependiente de los anticuerpos (ADCC) cómo se describe en los Ejemplos.

Las funciones efectoras silenciadas se pueden obte.ner mediante una mutación en la región Fe de los anticuerpos, y se han descrito en la materia: LALA y N297A (Strohl, W., 2009, Curr. 0¿in. Biotechnol. Volumen 20(6): 685-691); y D265A (Baudinoj y colaboradores, 2008, J. Immunol. 181: 6664-69; Strohl, W., supr'a).

Los ejemplos de los anticuerpos Fe de I g G 1 silenciosos comprenden los denominados como LALA muíante, el cual comprende as mutaciones L234A y L235A en la secuencia de aminoácidos de Fe de I g G 1. Otro ejemplo de un anticuerpo de I g G 1 silencioso comprende la mutación D265A. Otro anticuerpo de IgG 1 silencioso comprende la mutación N297A, la cual da como resultado anticuerpos aglicosilados/no glicosilados Como se utiliza en la presente, el término "selectividad" para un anticuerpo o una proteína de la invención, se refiere a |uri anticuerpo o a una proteína que se enlaza a cierto polipéptjdo objetivo pero no a los polipéptidos estrechamente relacionados.

Como se utiliza en la presente, el término "alta afinidad" por|un anticuerpo, se refiere a un anticuerpo que tiene una KD de 1 nlv) o menos para un antígeno objetivo. Como se utiliza en la presente,! el término "sujeto" incluye a cualquier animal humano o no humano.

El término "animal no humano" incluye a todos los vertebrados, por ejemplo mamíferos y no mamíferos, tales como primates no i humanos, ovejas, perros, gatos, caballos, vacas, pollos, anfibios, reptiles, etc. ; Como se utiliza en la presente, el térm significa que una secuencia de nucleótidos se codificar una secuencia de aminoácidos que utiliza preferidos en la célula u organismo de producción, en general uina célula eucariótica, por ejemplo una célula de Pichia, una célula de Trichoderma, una célula de ovario de hámster chino (CHO), o u'na célula humana. La secuencia de nucleótidos optimizada se diseña para retener completamente, o tanto como sea posible, la secuencia de aminoácidos originalmente codificada por la secuencia de nucleótidos inicial, la cual también se conoce como la secuencia i "progenitora". Las secuencias optimizadas de la presente se h¡an diseñado para tener codones que son preferidos en las células de i mamífero de ovario de hámster chino; sin embargo, también se prejvé en la presente la expresión optimizada de estas secuencias en otras células eucarióticas. Las secuencias de aminoácidos codificadas por las secuencias de nucleótidos optimizadas también son referidas como optimizadas.

Como se utiliza en la presente, el porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, el porcentaje de identidad = # de posiciones idénticas/# total de posiciones x 100), tomando en cuenta el número de huecos, y la longitud de calda i hueco, que se necesiten introducir para una alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias, se pueden llevar a cabo utilizando un algoritmo matemático, como se describe más adelante.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias ¡de i aminoácidos se puede determinar utilizando el algoritmo de |E. Meyers y W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4: 11-17, 1988), el cualjse ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), utilizando u|na tabla de residuos ponderados PAM120, una multa por longitud Ide hueco de 12, y una multa por hueco de 4. De una manera alternativa, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol, Biol. 48: 444-453, 1970), el cual se ha incorporado en ¡ el programa Gap en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com), utilizando ya sea una matriz Blossom 62 o bien una matriz PAM250, y un peso de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6, ó y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5, ó 6. j El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos también se puede determinar utilizando, por ejemplo, algoritmos tales como el programa BLASTN para secuencias de ácidos nucleicos, utilizando por omisión, una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M = 5, N = 4, y una comparación de ambas cadenas. j i í Anticuerpos Recombinantes | Los anticuerpos de la invención incluyen los anticuerpos recombinantes humanizados mAb1-mAb3, aislados ' y ! estructuralmente caracterizados by sus secuencias de aminoácidos ¡ de cadena pesada y ligera de longitud completa, como se describen en la siguiente Tabla 1: j I I Tabla 1 Secuencias de aminoácidos de cadena pesada y ligera de longitud completa de los mAb1-mAb3 Las secuencias de aminoácidos de las regiones variables correspondientes VH y VL de los anticuerpos aislados mAb1-mAb3 de la invención, se derivan todas a partir del mismo anticuerpo Chir12.12 anteriormente descrito, por ejemplo, en la Publicación Internacional Número WO2006/073443, y que consiste en i la secuencia de aminoácidos VH de la SEQ ID NO: 7, y la secuencia' de aminoácidos VL de la SEQ ID NO: 8. I Una diferencia importante de los anticuerpos de la ¡nvencjón, comparándose con el CHIR12.12 original, es que tienen una región Fe, la cual consiste en una región Fe de IgG silenciosa, por ejemplo, la región Fe de lgG1 silenciosa.

En particular, la Tabla 2 resume la modificación de la región Fe de lgG1 realizada para obtener los anticuerpos mAb1-mAb3, comparándose con el anticuerpo CHIR12.12 original.

Tabla 2 Modificación de la región Fe de lgG1 para obtener los mAbl- mAb3 Otros anticuerpos de la invención incluyen aquéllos que tienen aminoácidos que se han mutado mediante supresión, inserciónj o sustitución de aminoácidos, y no obstante, tienen cuando menos|el 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 ó 100 por ciento de identidad don í I las regiones VH y VL de Chir12.12, respectivamente, las SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8, y que comprenden una región Fe de IgG silenciosa, por ejemplo, una región Fe de I g G 1 silenciosa. i En algunas modalidades, el anticuerpo de la invención es una I variante muíante de cualquiera de los mAb1-mAb3, en donde ¡el anticuerpo variante muíante incluye secuencias de aminoácidjos mutaníes, en donde no más de 1, 2, 3, 4 ó 5 aminoácidos se han i mutado mediante supresión, inserción o sustitución de aminoácidos en las regiones VH y VL, cuando se comparan con las regiones VH y VL de Chir12.12, respectivamente, las SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8, y que conservan las mismas regiones constantes que mAb1, mAb2 o mAb3. I I Las secuencias de codificación de nucleótidos de cadena ligera y pesada de longitud completa de los mAb1-mAb3 se muestran enj la siguiente Tabla 3. ¡ Tabla 3 Secuencias de codificación de ADN de cadena pesada y ligera de longitud completa Otros ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos de la invención incluyen los ácidos nucleicos que se han mutado mediante supresión, inserción o sustitución de nucleótidos, y no obstante, tienen cuando menos el 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 ó 100 por ciento de identidad con las regiones codificantes correspondientes VH y VL de Chir12.12, como se ilustran en las secuencias descritas, por ejemplo, en las SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 21, respectivamente, y que comprenden una secuencia de codificación de una región Fe de IgG silenciosa, por ejemplo, una región Fe |de IgG 1 silenciosa.

En algunas modalidades, incluye ácidos nucleicos variantes, ¡en donde no más de 1, 2, 3, 4 ó 5 nucleótidos han sido cambiados mediante supresión, inserción o sustitución de nucleótidos in las regiones codificantes VH y VL con las regiones codificantes VH y ! VL ¡lustradas en las secuencias descritas, por ejemplo, en las SEo lD NO: 20 y SEQ ID NO: 21, respectivamente, y que conservan jlas mismas secuencias de codificación de las regiones constantes que las secuencias de codificación correspondientes de los mAb1, m b2 i o mAb3. j Anticuerpos Homólogos j En adición a los anticuerpos recombinantes de la invención, mAb1-mAb3, la invención también abarca anticuerpos o proteínas homologas que conservan las propiedades funcionales deseadasjde los anticuerpos mAb1-mAb3.

En particular, los anticuerpos o las proteínas homologas de acuerdo con la invención son los anticuerpos o las proteínas <t|ue comprenden una porción de enlace de antígeno de un anticuerpo dirigido contra un polipéptido de CD40 objetivo (SEQ ID NO: 28), i caracterizados porque este anticuerpo o esta proteína: j a) se enlaza al polipéptido de CD40 con una KD de 10 n o menos, y b) comprende una región Fe de IgG silenciosa, y en donde los anticuerpos o las proteínas conservan las propiedades funcionales deseadas de los mAb1-mAb3 originales.

Las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos mAb1-mAb3 originales se pueden seleccionar a partir de una o más i de las siguientes propiedades: j (i) se enlaza específicamente al CD40, por ejemplo, con a KD que es de 100 nM o menos, de 10 nM o menos, o de 1 n o menos, como se mide en el ensayo Biacore; (¡i) es un antagonista de CD40, por ejemplo, inhibe la i señalización inducida por CD40L, como se mide en el ensayo de proliferación de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) mediada por el CD40L; (iii) no exhibe ninguna actividad agonista o exhibe una bjaja actividad agonista, como se mide en un ensayo de proliferación | de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) mediada poj el CD40L; (iv) reacciona cruzadamente con el polipéptido de CD40 de mono cinomolgo; (v) no tiene ninguna o tiene una baja actividad i de citotoxicidad celular dependiente de los anticuerpos (ADCC); y, (vi) tiene propiedades adecuadas para el desarrollo; ¡ de fármacos. i En una modalidad específica, los anticuerpos o las proteínas homologas de acuerdo con la invención, comprenden una región Fe de I g G 1 silenciosa, por ejemplo, una región Fe de I g G 1 silenciosa seleccionada a partir del grupo que consiste en la SEQ ID NO: jl7, SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 19. j En una modalidad específica, la invención se refiere a un anticuerpo o a una proteína que tiene secuencias de nucleótidos ! de i cadena pesada y ligera de región variable, o secuencias ¡de aminoácidos de cadena pesada y ligera de región variable, o las secuencias de aminoácidos o las secuencias de codificación j de i nucleótidos de las 6 regiones determinantes de complementariedad (CDRs) que son homologas a las secuencias de aminoácidos ojde nucleótidos correspondientes de los anticuerpos mAb1-mÁb3 descritos anteriormente, en particular, en la Tabla 1, y e!ste J anticuerpo o esta proteína comprende una región Fe de Ig G silenciosa seleccionada a partir del grupo que consiste en la reg|ión Fe del mAb1 (SEQ ID NO: 17), la región Fe del mAb2 (SEQ ID iflO: i 18), y la región Fe del mAb3 (SEQ ID NO: 19), en dondej el anticuerpo o la proteína homologa se enlaza específicamente! al CD40, y el anticuerpo o la proteína exhibe las siguientes propiedades funcionales: es un antagonista de CD40, no exhibe i ninguna actividad agonista o exhibe una baja actividad agonista, yj no tiene ninguna o tiene una baja actividad de citotoxicidad celúlar dependiente de los anticuerpos (ADCC). i Por ejemplo, la invención se refiere a anticuerpos o proteínas I 29 homologas a los mAb1-mAb3, las cuales comprenden una región Fe de IgG silenciosa seleccionada a partir del grupo que consiste en la región Fe del mAb1 (SEQ ID NO: 17), la región Fe del mAb2 (SEQ ID NO: 18), y la región Fe del mAb3 (SEQ ID NO: 19), y que I comprenden una secuencia de cadena pesada variable secuencia de cadena ligera variable (VL), en donde las de región determinante de complementariedad (CDR) comparten i ¦ cuando menos el 60, 70, 90, 95, 96, 97, 98, 99 ó 100 por cientó|de identidad de secuencia con las secuencias de región determinantélde i complementariedad (CDR) correspondientes de los mAb1-mAb3, respectivamente, las SEQ ID NOs:1-6, en donde el anticuerpo oj la proteína homóloga se enlaza específicamente al CD40, y el anticuerpo o la proteína homóloga exhibe las siguientes propiedades funcionales: es un antagonista de CD40, no exhibe ninguna actividad agonista o exhibe una baja actividad agonista, y no tiene ninguna o tiene una baja actividad de citotoxicidad celular dependiente de líos anticuerpos (ADCC). j En una modalidad específica relacionada, el anticuerpo o la proteína homóloga: a) se enlaza a CD40 con una KD de 1 nM o menos; b) inhibe la señalización inducida por CD40L con una l¡C50 i de 50 nanogramos/mililitro o menos, como se mide en el ensayo' de proliferación de células mononucleares de sangre periférica (P C) mediada por el CD40L descrito en los Ejemplos; j i c) no tiene ninguna actividad agonista o tiene una baja I actividad agonista, como se mide en un bioensayo, tal como el ¡ ensayo de proliferación de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) mediada por el CD40L, como se describe en los Ejemplos; y d) no tiene ninguna actividad o tiene una baja actividad ¡de citotoxicidad celular dependiente de los anticuerpos (ADCC).

La invención se refiere además a anticuerpos o proteínas homólogas a los mAb1-mAb3, las cuales comprenden una región Fe de IgG silenciosa seleccionada a partir del grupo que consiste en la región Fe del mAb1 (SEQ ID NO: 17), la región Fe del mAb2 (SEQ ¡ID NO: 18), y la región Fe del mAb3 (SEQ ID NO: 19), y que comprenden una secuencia de cadena pesada variable (VH), y una secuencia de cadena ligera variable (VL), las cuales compartjen cuando menos el 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 ó 100 por ciento de identidad de secuencia con las secuencias correspondientes de los mAb1-mAb3, respectivamente, las SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8, en donde el anticuerpo o la proteína homóloga se enlaza específicamente al CD40, y el anticuerpo o ¡ I a proteína exhibe las siguientes propiedades funcionales: es un antagonista de CD40, no exhibe ninguna actividad agonista o exhibe i una baja actividad agonista, y no tiene ninguna o tiene una baja actividad de citotoxicidad celular dependiente de los anticuerpos (ADCC). j En una modalidad específica relacionada, el anticuerpo o |la proteína homóloga: a) se enlaza a CD40 con una KD de 1 nM o menos; ¡ b) inhibe la señalización inducida por CD40L con una IC50 de 50 nanogramos/mililitro o menos, como se mide en el ensayo jde i proliferación de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) mediada por el CD40L descrito en los Ejemplos; c) no tiene ninguna actividad agonista o tiene una bája actividad agonista, como se mide en un bioensayo, tal como el ensayo de proliferación de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) mediada por el CD40L descrito en los Ejemplos; |y d) no tiene ninguna actividad o tiene una baja actividad ¡de citotoxicidad celular dependiente de los anticuerpos (ADCC).

En otro ejemplo, la invención se refiere a anticuerpos proteínas homólogas a los mAb1-mAb3, las cuales comprenden una región Fe de IgG silenciosa seleccionada a partir del grupo que consiste en la región Fe del mAb1 (SEQ ID NO: 17), la región Fe del j mAb2 (SEQ ID NO: 18), y la región Fe del mAb3 (SEQ ID NO: 19)¡. y i en donde: las cadenas pesadas y ligeras variables son codificadjas por una secuencia de nucleótidos que es cuando menos el 80 ^or ciento, cuando menos el 90 por ciento, cuando menos el 95 por ciento, o el 100 por ciento idéntica a la secuencia de codificación ¡de antagonista de CD40, no exhibe ninguna actividad agonista o exhijbe una baja actividad agonista, y no tiene ninguna o tiene una baja actividad de citotoxicidad celular dependiente de los anticuerpos (ADCC). I En una modalidad específica relacionada, el anticuerpo o| la proteína homologa: ^ a) se enlaza a CD40 con una K0 de 1 nM o menos; ¦ b) inhibe la señalización inducida por CD40L con una IC50 de 50 nanogramos/mililitro o menos, como se mide en el ensayo de proliferación de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) mediada por el CD40L descrito en los Ejemplos; c) no tiene ninguna actividad agonista o tiene una baja actividad agonista, como se mide en un bioensayo, tal como el ensayo de proliferación de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) mediada por el CD40L descrito en los Ejemplos; y d) no tiene ninguna actividad o tiene una baja actividad de citotoxicidad celular dependiente de los anticuerpos (ADCC). ¡ ! Los anticuerpos con secuencias de aminoácidos mutantesj se pueden obtener mediante mutagénesis (por ejemplo, mutagénésis dirigida al sitio o mediada por la reacción en cadena de la polimera isa (PCR)) de las moléculas de ácidos nucleicos codificantes, seguida por la prueba del anticuerpo alterado codificado para determinar la ¡ función conservada (es decir, las funciones estipuladas anteriormente), utilizando los ensayos funcionales descritos en los Ejemplos más adelante.

En ciertas modalidades, los anticuerpos o las proteínas homologas a los mAb1-mAb3, como se describen anteriormente, tienen modificaciones de secuencias conservadoras.

Como se utiliza en la presente, el término "modificaciones de secuencias conservadoras" pretende referirse a las sustituciones de aminoácidos en donde el residuo de aminoácido es reemplazado un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. familias de los residuos de aminoácidos que tiene cadenas laterales i similares se han definido en este campo. Estas familias incluyen los aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargad'as (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonína, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales con ramificación beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina), y cadenas laterales aromáticas (p¡or I ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). P¡or consiguiente, uno o más residuos de aminoácidos dentro de lás regiones determinantes de com plementariedad (CDRs) de un j anticuerpo de la invención, pueden ser reemplazados con otros residuos de aminoácidos a partir de la misma familia d lateral, y el anticuerpo alterado se puede probar para d función conservada utilizando los ensayos funcionales descritos en la presente.

Se pueden introducir modificaciones en un anticuerpo de la invención mediante las técnicas convencionales conocidas en la materia, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Moléculas de ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos o las proteínas de la invención Otro aspecto de la invención pertenece a moléculas de ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos o las proteínas de la invención, como se describen anteriormente. | I Los ejemplos de las secuencias de nucleótidos de cadena ligera y pesada de cualquiera de los mAb1 a mAb3 se pueden deriv|ar a partir de la Tabla 3 (que muestra las secuencias de codificación de nucleótidos enteras de las cadenas pesadas y ligeras de los mAblj a i mAb3).

Otros ejemplos de las secuencias de nucleótidos de cadena ligera y pesada de acuerdo con la invención son cualquier secuencia que codifique para las secuencias de aminoácidos pesadas y/o ligeras de longitud completa de los mAb1, mAb2 o mAb3, como se describen en la Tabla 1.

La invención también pertenece a moléculas de ácidos nucleicos que se derivan a partir de las últimas secuencias que se han optimizado para la expresión de la proteína en células de mamífero, por ejemplo, las líneas celulares CHO.

Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en las célulás enteras, en un Usado celular, o pueden ser ácidos nucleicos en una forma parcialmente purificada o sustancialmente pura. Un ácido nucleico está "aislado" o "se hace sustancialmente puro" cuando se purifica de otros componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo, otros ácidos nucleicos o proteínas celulares, mediante técnicas convencionales, incluyendo tratamiento alcalino/ScJs, formación de bandas de CsCI, cromatografía en columrjia, electroforesis en gel de agarosa, y otras bien conocidas en este campo. Véase F. Ausubel, y colaboradores, Editores, 1987 Current i Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, Nueva York. Un ácido nucleico de la invención puede ser, por ejemplo, ADN ó ARN, y puede o no contener secuenc as intrónicas. En una modalidad, el ácido nucleico es una molécula de ADNc. El ácido nucleico puede estar presente en un vector, tal como un vector de exhibición de fago, o en un vector de plásm do recombinante.

Los ácidos nucleicos de la invención se pueden obtener empleando técnicas de biología molecular convencionales. Una vez que se obtienen los fragmentos de ADN que codifican, por ejempjlo, los segmentos VH y VL, estos fragmentos manipular adicionalmente mediante técnicas convencionales, por ejemplo, para convertir variable hasta genes de cadena de anticuerpo de longitud completa, hasta genes de fragmentos Fab, o hasta un gen de scFv. En es|tas manipulaciones, un fragmento de ADN que codifique VL ó VH se enlaza operativamente a otra molécula de ADN, o a un fragmento que codifique la región constante de anticuerpo de los mAb1-mÁb3 que comprenden la región Fe como se definen en las SEQ ID NOs: 17-19.

El término "operativamente enlazado", como se utiliza en este contexto, pretende significar que los dos fragmentos de ADN se unen i de una manera funcional, por ejemplo, de tal manera que l|as Kabat, E. A., y colaboradores, 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, Departamento de Salud! y Servicios Humanos de los Estados Unidos, NIH Publicación Núm ro 91-3242), y los fragmentos de ADN que abarcan estas regiones 'se pueden obtener mediante una amplificación convencional ejon reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La región constante 'de i cadena pesada se puede seleccionar entre los ¡sotipos lgG1 comprenden la región Fe, como se definen en las SEQ ID NOs: 19.

El ADN aislado que codifica la región VL se puede convertir hasta un gen de cadena ligera de longitud completa (así como hasta un gen de cadena ligera de Fab), mediante el enlace operativo del ! ADN que codifique VL a otra molécula de ADN que codifique la regipn constante de cadena ligera, CL. Las secuencias de los genes de región constante de cadena ligera humanos son conocidas en la materia (véase, por ejemplo, Kabat, E. A., y colaboradores, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edi Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos, NIH Publicación Número 91-3242), y los fragmentos de ADN qjue abarcan estas regiones se pueden obtener mediante Una amplificación convencional con reacción en cadena de la polimerasa. La región constante de cadena ligera puede ser una región constante kappa o lambda.

Generación de transfectomas que producen anticuerpos monoclonales Los anticuerpos o las proteínas de la invención también se pueden producir en un transfectoma de células huésped utilizando, por ejemplo, una combinación de técnicas de ADN recombinante| y métodos de transfección de genes, como es bien conocido en este i campo (por ejemplo, Morrison, S. (1985) Science 229:1202). j Por ejemplo, con el fin de expresar los anticuerpos, se pueden obtener los ADNs que codifiquen las cadenas ligera y pesada ele longitud parcial o completa mediante las técnicas de biología molecular o de bioquímica convencionales (por ejemplo, síntesis química del ADN, amplificación con reacción en cadena la polimerasa (PCR), o clonación del ADNc utilizando un hibridoma qüe exprese el anticuerpo de Interés), y los ADNs se pueden insertar los vectores de expresión, de tal manera que los genes se enlacen operativamente a las secuencias de control de transcripción y de traducción. En este contexto, el término "enlazado operativamente" pretende significar que un gen de anticuerpo se liga en un vector, tal manera que las secuencias de control de transcripción y traducción dentro del vector sirven para su función pretendida de regular la transcripción y la traducción del gen del anticuerpo. jEI vector de expresión y las secuencias de control de expresión ¡se I seleccionan para ser compatibles con la célula huésped de expresión utilizada. El gen de cadena ligera del anticuerpo y el gen de cadejna pesada del anticuerpo se pueden insertar en un vector separadó,| o más típicamente, ambos genes se insertan en el mismo vector 'de expresión.

Los genes de anticuerpo se insertan en el vector de expresijón mediante métodos convencionales (por ejemplo, ligamiento de (os sitios de restricción complementarios sobre el fragmento del gen :de anticuerpo y el vector, o ligamiento de extremos romos si no Hay sitios de restricción presentes). Las regiones variables de cadejna ligera y pesada de los anticuerpos descritos en la presente ise pueden utilizar para crear genes de anticuerpo de longitud completa, mediante su inserción en los vectores de expresión que ya codifiqujen las regiones constantes de cadena pesada y constantes de cadejna ligera de la secuencia deseada correspondiente a dichas regiones constantes de los mAb1, mAb2 o mAb3, de tal manera que ! el segmento VH se enlace operativamente a los segmentos VH den ro del vector, y el segmento VL se enlace operativamente al segmento i CL dentro del vector. Adicionalmente o de una manera alternativa,! el vector de expresión recombinante puede codificar un péptido jde señal que facilite la secreción de la cadena de anticuerpo a partir jde una célula huésped. El gen de la cadena de anticuerpo se puede i clonar en el vector, de tal manera que el péptido de señal se enlace dentro del marco al término amino del gen de la cadena jde anticuerpo. El péptido de señal puede ser un péptido de señal jde inmunoglobulina o un péptido de señal heterólogo (es decir, un péptido de señal a partir de una proteína que no jes inmunoglobulina). J i En adición a los genes de cadenas de anticuerpos, los vectores de expresión recombinante de la invención llevan secuencias reguladoras que controlan la expresión de los genes de la cadena Leí anticuerpo en una célula huésped. El término "secuencia reguladora" pretende incluir los promotores, los potenciadores, y de control de expresión (por ejemplo, las señales de que controlan la transcripción o la traducción de los genes de; la cadena del anticuerpo. Estas secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel (Gene Expression Technology. Methods ¡n I Enzymology 185, Academlc Press, San Diego, CA 1990). Será apreciado por los expertos en este campo que el diseño del vectorjde expresión, incluyendo la selección de las secuencias reguladoras, puede depender de factores tales como la elección de la céliula huésped que se vaya a transformar, del nivel de expresión jde proteína deseado, etc. Las secuencias reguladoras para la expresión ? de células huésped de mamífero incluyen los elementos virales que dirigen altos niveles de expresión de proteína en las células !de SV40, y la repetición terminal larga del virus de leucemia de células-T humanas tipo 1 (Takabe, Y. y colaboradores, 1988 Mol. Cell. Biol. i 8:466-472). \ En adición a los genes de cadena de anticuerpo y a l|as i secuencias reguladoras, los vectores de expresión recombinante ¡de I la invención pueden llevar secuencias adicionales, tales corprio i secuencias que regulen la réplica del vector en las células huéspjed (por ejemplo, orígenes de réplica), y genes marcadorjes i seleccionables. El gen marcador seleccionable facilita la selección de las células huésped en donde se haya introducido el vecjor (véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos p"e Norteamérica Números 4,399,216, 4,634,665 y 5,179,017, todas por Axel y colaboradores). Por ejemplo, típicamente, el gen marcador seleccionable confiere resistencia a fármacos, tales como a G418, higromicina, o metotrexato, a una célula huésped en donde se ha!ya introducido el vector. Los genes marcadores seleccionares incluyjen el gen de reductasa de dihidrofolato (DHFR) (para utilizarse en las células huésped de DHFR con selección/amplificación ¡de metotrexato), y el gen neo (para la selección de G418). | i Para la expresión de las cadenas ligera y pesada, los vectores de expresión que codifiquen las cadenas pesada y ligera, se transfectan en una célula huésped mediante técniC|as i convencionales. Las diferentes formas del término "transfección" pretenden abarcar una amplia variedad de técnicas comúnmente empleadas para la introducción de ADN exógeno en una célula huésped procariótica o eucariótica, por ejemplo, electroporación, precipitación con fosfato de calcio, transfección con DEAE-dextrarjio, y similares. Teóricamente, es posible expresar los anticuerpos de! la i invención en células huésped ya sean procarióticas o bien eucarióticas. La expresión de los anticuerpos en las células eucarióticas, por ejemplo, en las células huésped de mamífero, ¡en levadura, o en hongos filamentosos, se discute debido a que estas células eucarióticas, y en particular las células de mamífero, tienen más probabilidades que las células procarióticas para ensamblarse y i secretar un anticuerpo apropiadamente plegado e inmunológicameñte activo.

En una modalidad específica, un vector de clonación o ¡de expresión de acuerdo con la invención comprende cualquiera de cuando menos una de las siguientes secuencias de codificación (a)-(c), operativamente enlazada a las secuencias promotoras adecuadas: (a) SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 23 que codifican respectivamente las cadenas pesadas y ligeras de longitud completa del mAb1; j (b) SEQ ID NO: 24 y SEQ ID NO: 25 que codificán respectivamente las cadenas pesadas y ligeras de longitud complejta del mAb2; o (c) SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 27 que codifican respectivamente las cadenas pesadas y ligeras de longitud complejta del mAb3.

Las células huésped de mamífero para expresar los anticuerpos recom binantes de la invención incluyen las células de ovario de hámster chino (células CHO) (incluyendo las células CHO de DHFR, descritas por Urlaub y Chasin, 1980 Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 77: 4216-4220, utilizadas con un marcador seleccionable de DH FR, por ejemplo, como se describe en R. J. Kaufman y P. A. Sharp, 1982 Mol. Biol. 159: 601-621), las líneas celulares CHOK1 dhfr+, las células de mieloma NSO, las células COS, y las células SP2). En particular, para utilizarse con las células de mieloma NSO, otro | sistema de expresión es el sistema de expresión genética GS mostrado en las Publicaciones Internacionales del TCP Números WfO 87/04462 y WO89/01036, y en la Patente Europea Número ÉP 0,338,841. ¡ Cuando se introducen vectores de recombinante que codifican genes de anticuerpos en huésped de mamífero, los anticuerpos se producen cultivo de las células huésped durante un período suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en huésped, o la secreción del anticuerpo en el medio d donde se hagan crecer las células huésped. Los anticuerpos se pueden recuperar a partir del medio de cultivo empleando métodos de purificación de proteínas convencionales. (Véase, por ejemplo, Abhinav y colaboradores, 2007, Journal of C h rom atog ra p h y 848: 28-37). ' En una modalidad específica, la célula huésped de la invención í es una célula huésped transfectada con un vector de expresión que tiene las secuencias de codificación seleccionadas a partir del grupo que consiste en (a)-(c) adecuadas para la expresión de los mAbjl-mAb3, respectivamente, operativamente enlazadas a las secuencias promotoras adecuadas: ' (a) SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 23; (b) SEQ ID NO: 24 y SEQ ID NO: 25; y (c) SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 27.

Estas últimas células huésped se pueden cultivar entonces i adicionalmente bajo condiciones adecuadas para la expresión !y I producción de un anticuerpo de la invención seleccionado a partir del grupo que consiste en los mAb1-mAb3, respectivamente.

Moléculas biespecíficas ¡ En otro aspecto, la presente invención proporciona moléculas biespecíficas o multiespecíficas que comprenden un anticuerpo o na proteína anti-CD40 de la invención. Un anticuerpo o una proteína ele la invención se puede derivar o enlazar a otra molécula funcional, por ejemplo a otro péptido o a otra proteína (por ejemplo, a otro anticuerpo o ligando para un receptor), con el fin de generar una molécula biespecífica que se enlace a cuando menos dos sitios de enlace o moléculas objetivo diferentes. El anticuerpo de la invención, de hecho, se puede derivar o enlazar a más de una molécula funcional diferente para generar moléculas multiespecíficas que se enlacen a más de dos sitios de enlace y/o moléculas objetivo diferentes; estas moléculas multiespecíficas también pretenden ser abarcadas por el término "molécula biespecífica", como se utiliza en la presente. Con el fin de crear una molécula biespecífica de la invención, un anticuerpo o una proteína de la invención se puede enlazar funcionalmente (por ejemplo, mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente, o de otra manera), a una o más moléculas de enlace diferentes, tales como i otro anticuerpo, fragmento de anticuerpo, péptido o mimético de enlace, de tal manera que resulte una molécula biespecífica.

De conformidad con lo anterior, la presente invención incluye i las moléculas biespecíficas que comprenden cuando menos urjia primera especificidad de enlace para CD40, por ejemplo, una porción de enlace de antígeno de cualquiera de los mAb1-mAb3, y una i segunda especificidad de enlace para un segundo epítopo objetivo. Por ejemplo, el segundo epítopo objetivo es otro epítopo de CD40 diferente del primer epítopo objetivo. Otro ejemplo es una molécula biespecífica que comprende cuando menos una primera especificidad de enlace para CD40, por ejemplo, una porción de enlace de i i antígeno de cualquiera de los mAb1-mAb3, y una segunda I especificidad de enlace para un epítopo dentro de CD40. | i Adicionalmente, para la invención en donde la moléciila I biespecífica es multiespecífica, la molécula puede incluir ademjás una tercera especificidad de enlace, en adición a los primero| y í segundo epítopos objetivo. j Las moléculas biespecíficas de la presente invención se pueden preparar mediante la conjugación de las especificidades de enlace constituyentes, empleando los métodos conocidos en este campo. Por ejemplo, cada especificidad de enlace de la molécula biespecífica se puede generar por separado, y luego se pueden conjugar unas con otras. Cuando las especificidades de enlace sjon i proteínas o péptidos, se puede utilizar una variedad de agentes de acoplamiento o de reticulación para la conjugación covalente. Ljos ejemplos de los agentes de reticulación incluyen Proteína A, carbodi-imida, tioacetato de N-succinimidil-S-acetilo (SATA), 5 , 5 '-d it i o b i s-(ácido 2-nitro-benzoico) (DTNB), o-fenilen-dimaleimida (oPDM), 3-(2-ditiopiridil)-propionato de N-succinimidilo (SPDP), y 4-(N-maleimido-metil)-ciclohexan-1-carboxilato de sulfo-succinimidilo (sulfo-SMc|c) i (véanse, por ejemplo, Karpovsky y colaboradores, 1984 J. Exp. Méd. 160: 1686; Liu, MA y colaboradores, 1985 Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 82: 8648). Otros métodos incluyen aquéllos descritos en Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan y colaboradores, 1985 Science 229: 81-83); y Glennie y colaboradores, 1987 Immunol. 139: 2367-2375). Los agentes de conjugación son SATA sulfo-SMCC, estando ambos disponibles en Pierce Chemical Cp (Rockford, IL). ! Cuando las especificidades de enlace son anticuerpos, éstos se pueden conjugar mediante el enlace con sulfhidrilo de lis regiones de articulación del término C de las dos cadenas pesadas.

En una modalidad particular, la región de articulación se modifica para contener un número non de residuos de sulfhidrilo, por ejemplo, uno, antes de la conjugación.

De una manera alternativa, ambas especificidades de enlace se pueden codificar en el mismo vector, y se pueden expres ensamblar en la misma célula huésped. Este método particularmente útil cuando la molécula biespecífica es una proteíha de fusión de mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2, o ligando x Fab. Una molécula biespecífica de la invención puede ser una molécula de una sola cadena que comprenda un anticuerpo de una sola cadena y un determinante de enlace, o una molécula biespecífica de una sola cadena que comprenda dos determinantes de enlace. Las moléculas biespecíficas pueden comprender cuando menos dos moléculas de una sola cadena. Los métodos para la preparación de ' i las moléculas biespecíficas se describen, por ejemplo, en la Patenté de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,260,203; en la i Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,455,030; en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,881,175; en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,132,405; en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,091,513; en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,476,786; en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,013,653; en la Patente de i j los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,258,498; y en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,482,858.1 El enlace de las moléculas biespecíficas a sus objetivos i específicos se puede confirmar, por ejemplo, mediante el ensayo ¡nmunosorbente enlazado con enzimas (ELISA), el radi'o- I inmunoensayo (RIA), el análisis FACS, un bioensayo (por ejemplo, inhibición del crecimiento), o el ensayo Western blot. Cada uno ¿Je estos ensayos detecta en general las presencia de los complejos ¿le i proteína-anticuerpo de interés particular, mediante el empleo de un I reactivo marcado (por ejemplo, un anticuerpo) específico para ¡el complejo de interés.

Anticuerpos multivalentes ¡ En otro aspecto, la presente invención proporciona anticuerpos multivalentes que comprenden cuando menos dos porciones de enlace de antígeno idénticas o diferentes de los anticuerpos de jla invención, que se enlazan al CD40, por ejemplo, seleccionadas j a partir de las porciones de enlace de antígeno de cualquiera de lós i mAb1-mAb3. En una modalidad, los anticuerpos multivalentés proporcionan cuando menos dos, tres, o cuatro porciones de enlace ¡ de antígeno de los anticuerpos. Las porciones de enlace de antígeno se pueden enlazar entre sí por medio de fusión de proteína o de un enlace covalente o no covalente. De una manera alternativa, se han descrito los métodos de enlace para las moléculas biespecíficas. Los compuestos tetravalentes se pueden obtener, por ejemplo, mediante la reticulación de los anticuerpos de la invención con un anticuerpo que se enlace a las regiones constantes de los anticuerpos de lia invención, por ejemplo, la región Fe o de articulación.

Métodos de terapia utilizando los anticuerpos antagonistas anti- CD40 de la invención Los métodos de la invención se refieren al uso de los anticuerpos o de las proteínas anti-CD40 de la invención para tratar sujetos (es decir, pacientes) que tengan una enfermedad autoinmune y/o una enfermedad inflamatoria, o una predisposición a desarrollar una enfermedad autoinmune y/o una enfermedad inflamatoria, én donde la enfermedad y/o inflamación sea mediada por la señalización de CD40 mediada por el CD40L en las células que expresen el antígeno de CD40. i Los métodos para detectar la expresión de CD40 en las células son bien conocidos en la materia e incluyen, pero no se limitan a, las técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), jla inmunohistoquímica, la citometría de flujo, Western blot, ELISA,! y similares.

Los métodos de la invención son en especial útiles para tratamiento de enfermedades inflamatorias y/o autoinmunes donde esté involucrada la estimulación de CD40 mediada por CD40L.

Las enfermedades inflamatorias se caracterizan por inflamación y destrucción del tejido, o una combinación de las mismas. "Una enfermedad inflamatoria" incluye cualquier proceso inflamatorio inmunológicamente mediado en donde el suceso iniciador o el objetivo de la respuesta inmunitaria involucra antígenos no propios, incluyendo, por ejemplo, aloantígenos, xenoantígenos, antígenos virales, antígenos bacterianos, antígenos desconocidos, alérgenos.

Además, para los propósitos de la presente invención, [el término "enfermedades inflamatorias" incluye "enfermedades autoinmunes". Como se utiliza en la presente, el término "autoinmunidad" se entiende en general para abarcar los procesos inflamatorios inmunológicamente mediados que involucran a los antígenos "propios" (auto-antígenos). En las enfermedades autoinmunes, los antígenos propios (auto-antígenos) desencadenan i las respuestas ¡nmunitarias del huésped. ' También, la presente invención incluye el tratamiento de la inflamación asociada con un rechazo de trasplante de tejido.

"Rechazo de trasplante" o "rechazo de injerto" se refiere a cualquier I respuesta inmunitaria montada por el huésped contra un injertó, incluyendo, pero no limitándose a, antígenos de HLA, antígenos dje grupo sanguíneo, y similares.

La invención también se puede utilizar para tratar la enfermedad del injerto contra el huésped, tal como aquélla asociada con trasplante de médula ósea, por ejemplo. En esta enfermedad djel injerto contra el huésped, la médula ósea del donador incluye linfocitos y células que maduran hasta linfocitos. Los linfocitos djel donador reconocen los antígenos del receptor como no propios,] y montan una respuesta inmunitaria inflamatoria. Por consiguiente, como se utiliza en la presente, la "enfermedad del injerto contra el huésped" o la "reacción del injerto contra el huésped" se refiere a cualquier respuesta inmunitaria mediada por las células-T, en donde los linfocitos del donador reaccionan a los antígenos del huésped.

Los anticuerpos o las proteínas antagonistas anti-CD40 descritos en la presente, por ejemplo, mAb1, mAb2 o mAb3, se pueden utilizar de acuerdo con los métodos de la invención paja tratar trastornos autoinmunes y/o inflamatorios, incluyendo, pero no limitándose a, lupus eritematoso sistémico (SLE), lupus nefritis por lupus, sarcoidosis, artritis inflamatoria, incluyen juvenil, artritis reumatoide, artritis soriática, síndrome de Reiter, espondilitis anquilosante, y artritis gotosa, rechazo de un trasplante de un órgano o tejido, rechazo híper-agudo, agudo, o crónico y /jo enfermedad del injerto contra el huésped, esclerosis síndrome de IgE, poliarteritis nodosa, cirrosis enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohñ, enfermedad celíaca (enteropatía sensible al gluten), síndrome de Sjógren primario (pSS), hepatitis autoinmune, anemia perniciosa, anemia hemolítica autoinmune, soriasis, esclerodermia, miasteniia grave, púrpura trombocitopénica autoinmune, tiroiditis autoi enfermedad de Graves, tiroiditis de Hashimoto, enfe inmunocompleja, fatiga crónica, síndrome de disfunción I (CFIDS), p o I i m ios iti s y dermatomiositis, crioglobulinemia, trombólisis, cardiomiopatía, pénfigo vulgar, fibrosis pulmonar intersticial, I diabetes mellitus tipo I y tipo II, hipersensibilidad de tipo retardado tipo 1, 2, 3, y 4, alergia o trastornos alérgicos, respuestas inmunitarias indeseadas/no pretendidas a las proteínas terapéuticas (véase, por ejemplo, la Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número US 2002/0119151 y Koren y colaboradores, (2002) Curr. Pharm. Biotechnol. 3: 349-60), asma, síndrome ele Churg-Strauss (granulomatosís alérgica), dermatitis atópica, dermatitis alérgica y por contacto irritante, urticaria, alergia mediada por I g E , ateroesclerosis, vasculitidas asociadas con ANCÁ, vasculitis, miopatías inflamatorias idiopáticas, enfermedad hemolítica, enfermedad de Alzheimer, polineuropatía desmielinizahte inflamatoria crónica, y similares.

La ablación genética o la inhibición farmacológica de la senda de CD40-CD154 ha demostrado anteriormente un beneficio I terapéutico ya sea en modelos clínicos o pre-clínicos de SLE, psjs, ITP, MS, enfermedad de Crohn, pénfigo vulgar, vasculitis autoinmuhe y RA (Law CL, Grewal IS. (2009). Adv. Exp. Med. Biol. 2009; 647; |8- ! 36); cuya necesidad médica se detalla más adelante. ' En las modalidades preferidas, los anticuerpos o las proteínas anti-CD40 de la invención son útiles en el tratamiento de: (i) lupús eritematoso sistémico (nefritis por lupus), de preferencia para ! I proporcionar terapias efectivas de dispersión de esferoides para jla inducción y el mantenimiento de la remisión, y para la prevención de enfermedad renal en etapa terminal; (ii) síndrome de Sjógren primario, de preferencia para la prevención de destrucción cié glándulas salivales y lagrimales, y para la inducción y ¡el mantenimiento de la remisión de las manifestaci extraglandulares; (iii) púrpura trom bocitopénica autoinmune, ele preferencia, el tratamiento de los pacientes refractarios al estándlar de cuidado; (iv) vasculitidas asociadas con ANCA, de preferencia para la inducción y el mantenimiento de la remisión en los pacientes refractarios a corticosteroides, y para el tratamiento de dispersión de esteroides; (v) pénfigo vulgar, de preferencia para la inducción y el mantenimiento de la remisión en los pacientes refractarios I a I corticosteroides, y para el tratamiento de dispersión de esteroidejs; i (vi) esclerosis múltiple, de preferencia para proporcionjar tratamientos más efectivos para la prevención de recurrencias y del progreso de la discapacidad, y para lograr el estado libre de la enfermedad; y (vii) enfermedad de Crohn, de preferencia para proporcionar terapias más efectivas para el mantenimiento de jla remisión, y el tratamiento de los pacientes refractarios a anti-TNF. \ En algunas otras modalidades, los anticuerpos o las proteínas anti-CD40 de la invención son útiles en el tratamiento de inflamación pulmonar, incluyendo, pero no limitándose a, rechazo de injerto de pulmón, asma, sarcoidosis, enfisema, fibrosis quística, fibrosis pulmonar idiopática, bronquitis crónica, rinitis alérgica enfermedades alérgicas del pulmón, tales como neumonitis por hipersensibilidad, neumonía eosinofilica, bronquiolitis obliterante debida a trasplante de médula ósea y/o de pulmón o a otras causas, ateroesclerosis de injerto/fleboesclerosis de injerto, así como fibro'sis i pulmonar resultante de enfermedades por colágeno, vasculares, y autoinmunes, tales como artritis reumatoide, esclerodermia y lupus eritematoso.

"Tratamiento" se define en la presente como la aplicación o administración de un anticuerpo o de una proteína anti-CD40 de acuerdo con la invención, por ejemplo, anticuerpo mAb1, mAb2 o mAb3, a un sujeto, o la aplicación o administración de Ina composición farmacéutica, la cual comprende el anticuerpo o la proteína anti-CD40 de la invención a un tejido aislado o a una línea celular de un sujeto, en donde el sujeto tiene una enfermedad autoinmune y/o una enfermedad inflamatoria, un síntoma asociado con una enfermedad autoinmune y/o con una enfermedad i I inflamatoria, o una predisposición al desarrollo de una enfermedad autoinmune y/o de una enfermedad inflamatoria, en donde j el propósito es curar, sanar, aliviar, liberar, alterar, remediar, mitigjar, mejorar, o afectar la enfermedad autoinmune y/o la enfermedad inflamatoria, cualesquiera síntomas asociados con la enfermedad i autoinmune y/o con la enfermedad inflamatoria, o la predisposición al desarrollo de la enfermedad autoinmune y/o de la enfermedad inflamatoria.

"Tratamiento" también significa la aplicación o administración de una composición farmacéutica, la cual comprende un anticuerpo o una proteína anti-CD40 de la invención, por ejemplo, un anticuerpo mAb1, mAb2 o mAb3, a un sujeto, o la aplicación o administración de una composición farmacéutica, la cual comprende el anticuerpo 9 la proteína anti-CD40 de la invención, a un tejido aislado o a una línea celular de un sujeto, en donde el sujeto tiene una enfermedad autoinmune y/o una enfermedad inflamatoria, un síntoma asociado con una enfermedad autoinmune y/o con una enfermedad inflamatoria, o una predisposición al desarrollo de una enfermedad autoinmune y/o de una enfermedad inflamatoria, en donde el propósito es curar, sanar, aliviar, liberar, alterar, remediar, mitigar, mejorar, o afectar la enfermedad autoinmune y/o la enfermedad inflamatoria, cualesquiera síntomas asociados con la enfermedad autoinmune y/o con la enfermedad inflamatoria, o la predisposición al desarrollo de la enfermedad autoinmune y/o de la enfermedad inflamatoria. ¡ "Actividad anti-inflamatoria" significa una reducción j o prevención de la inflamación. La terapia con cuando menos) un anticuerpo o una proteína anti-CD40 de acuerdo con la invenc ón, provoca una respuesta fisiológica que es benéfica con respecto al tratamiento de una enfermedad autoinmune y/o de una enfermedad inflamatoria, en donde la enfermedad involucra células que expresan el antígeno de CD40. Se reconoce que los métodos de la ¡nvenc¡¡ón pueden ser útiles en la prevención del cambio fenotípico en |i as células, tal como proliferación, activación, y similares.

De acuerdo con los métodos de la presente invención, cuando menos un anticuerpo o una proteína anti-CD40 de la invención, como se define anteriormente en la presente, se utiliza para promover una respuesta terapéutica positiva con respecto al tratamiento o a| la prevención de una enfermedad autoinmune y/o de una enfermedad inflamatoria "Respuesta terapéutica positiva" con respecto a una enfermedad autoinmune y/o a una enfermedad inflamatoria significa una mejora en la enfermedad en asociación con la actividad antiinflamatoria de estos anticuerpos o de estas proteínas, y/o una mejora en los síntomas asociados con la enfermedad. Es decir, se puede observar un efecto anti-proliferativo, la prevención de una proliferación adicional de las células que expresan CD40, üjna reducción en la respuesta inflamatoria, incluyendo, no limitándose a, una secreción reducida de citoquinas inflamatorias, moléculas de adhesión, proteasas, inmunoglobulinas (en I as instancias en donde la célula portadora de CD40 es una célula-B), combinaciones de las mismas, y similares, un aumento producción de proteínas anti-inflamatorias, una reducción número de células auto-reactivas, un aumento en la tole inmunológica, la inhibición de la sobrevivencia de células reactivas, y/o una disminución en uno o más síntomas mediados pior la estimulación de las células que expresan CD40. Estas respuestas terapéuticas positivas no están limitadas a la vía de administración, y pueden comprender la administración al donador, al tejido del donador (tal como, por ejemplo, perfusión de órgano), al huésped, o a cualquier combinación de los mismos, y similares. ¡ La respuesta clínica se puede evaluar utilizando técnicas ¡de rastreo, tales como exploración de toma de imágenes de resonancia i magnética ( RI), toma de imágenes radiográficas-X, exploración tomográfica computarizada (CT), citometría de flujo o análisis del clasificador de células activado por fluorescencia (FACS), histología, patología general, y química sanguínea, incluyendo, pero no limitándose a, cambios detectables mediante ELISA, RIA, i cromatografía, y similares. En adición a estas respuestas terapéuticas positivas, el sujeto que se someta a terapia con i el anticuerpo o con la proteína antagonista anti-CD40 de la in puede experimentar el efecto benéfico de una mejora síntomas asociados con la enfermedad.

"Dosis o cantidad terapéuticamente efectiva" o "cantidjad efectiva" significa una cantidad de anticuerpo o proteína ant¡-CDÍ40 de la invención que, cuando se administra provoca una respuesta terapéutica positiva con respecto al tratamiento de un sujeto con una enfermedad autoinmune y/o con una enfermedad inflamatoria.

En algunas modalidades de la invención, una dosis terapéuticamente efectiva del anticuerpo o de la proteína anti-CD!40 de la invención, por ejemplo, mAb1, mAb2 o mAb3, está en : el intervalo de 0. 01 miligramos/kilogramo a 40 miligramos/kilogramp, de 3 miligramos/kilogramo a 20 miligramos/kilogramo, o de 7 miligramos/kilogramo a 12 miligramos/kilogramo. Se reconoce que Ll método de tratamiento puede comprender una sola administración de una dosis terapéuticamente efectiva, o múltiples administraciones de una dosis terapéuticamente efectiva del anticuerpo o de la proteína antagonista anti-CD40 de la invención.

Una modalidad adicional de la invención es el uso de los anticuerpos o de las proteínas anti-CD40 de la invención para ¡el monitoreo de diagnóstico de los niveles de proteína en el tejido como parte de un procedimiento de prueba clínica, por ejemplo, para determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado. La detección se puede facilitar mediante el acoplamiento del anticuerpo a una sustancia detectable. Los ejemplos de las sustancias detectables incluyen diferentes enzimas, grupos protésicos, I materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, biomaterialés luminiscentes, y materiales radiactivos. Los ejemplos de las enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de radícula roja, fosfatasa alcalina, P-galactosidasa , o acetilcolinesterasa ; los ejemplos de los complejos i de grupos protésicos adecuados incluyen estreptavidina/biotina ¡y avidina/biotina; los ejemplos de los materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato Je i fluoresceína, rodamina, dicloro-triaziníl-amina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; los ejemplos de los biomaterialés luminiscentes i incluyen luciferasa, luciferina, y acuorina; y los ejemplos del materijal radiactivo adecuado incluyen l25l, 131l, 35S, ó 3H j Los anticuerpos o las proteínas anti-CD40 de la invención, por ejemplo, mAb1, mAb2 o mAb3, se pueden utilizar en combinación con cualesquiera terapias conocidas para las enfermedades autoinmunes e inflamatorias, incluyendo cualquier agente combinación de agentes que se sepa que son útiles, o los cuales se hayan utilizado o se utilicen actualmente, para el tratamiento de las enfermedades autoinmunes e inflamatorias. Estas terapias y agentes terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, cirugía o procedimientos quirúrgicos (por ejemplo, esplenectomía, linfadenectomía, tiroidectomía , plasmaforesis, leucoforesis, trasplante de células, tejidos, u órganos, procedimientos intestinales, perfusión de órgano, I y similares), terapia de radiación, terapia tal como terapia esteroidea y terapia no esteroidea, terapia de hormonas, terapia de citoquina, terapia con agentes dermatológicos (por ejemplo, agentes tópicos utilizados para tratar condiciones de la piel, tales como alergias, i dermatitis por contacto, y soriasis), terapia inmunosupresora, y otra terapia anti-inflamatoria con anticuerpos monoclonales, y similares. De esta manera, los anticuerpos o las proteínas antagonistas ant'i- CD40 descritas en la presente se administran en combinación co¡n cuando menos otra terapia, incluyendo, pero no limitándose a, cirugía, perfusión de órgano, terapia de radiación, terapia esteroidea, terapia no esteroidea, terapia con antibióticos, terapija anti-fúngica, terapia de hormonas, terapia de citoquina, terapia co¡n agentes dermatológicos (por ejemplo, agentes tópicos utilizados p tratar condiciones de la piel, tales como alergias, dermatitis por contacto, y soriasis), terapia inmunosupresora, otra terapia anti-inflamatoria con anticuerpos monoclonales, combinaciones de las mismas, y similares. | Por consiguiente, cuando las terapias combinadas comprenden abarcan la co-administración, utilizando formulaciones separadasj o una sola formulación farmacéutica, y la administración consecutiia en cualquier orden. Cuando los métodos de la presente invención comprenden regímenes terapéuticos combinados, estas terapias se pueden dar de una manera simultánea, es decir, el anticuerpo o la proteína anti-CD40 de la invención se administra de una mane a concurrente o dentro del mismo marco de tiempo que la otra terapia (es decir, las terapias continúan de una manera concurrente, pero |el anticuerpo o la proteína anti-CD40 de la invención no se administra precisamente al mismo tiempo que la otra terapia). De una manera alternativa, el anticuerpo anti-CD40 de la presente invención o la proteína de la invención también se puede administrar antes jo después de la otra terapia. La administración en secuencia de las diferentes terapias se puede llevar a cabo independientemente de si el sujeto tratado responde al primer curso de la terapia pai<a i disminuir la posibilidad de la remisión o de la recurrencia.

En algunas modalidades de la invención, los anticuerpos o las proteínas anti-CD40 de la invención, por ejemplo, el anticuerpo mAb1, mAb2 o mAb3, se administran en combinación con fármacos inmunosupresores o fármacos anti-inflamatorios, en donde leí metotrexato, ciclofosfamida, mlzoribina, clorambucil, ciclosporina, tjal como, por ejemplo, ciclosporina aerosolizada (véase, de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Número US 2002/0006901), tacrolimus (FK506; ProGrafrM), micofenolato-mofetil, y azatioprina (6-mercaptopurina), sirolimiLs (rapamicina), desoxiespergualina, leflunomida y sus análogos de malono-nitrilo-amida; y proteínas inmunosupresoras, incluyendo, p r ejemplo, anticuerpos y fusiones de Ig anti-CTLA4, anticuerpos estimulantes anti-linfocitos-B (por ejemplo, LYMPHOSTAT-BTM), | y fusiones de Ig (BLyS-lg), anticuerpos anti-CD80 y etanorcept (RTM)), así como anticuerpos anti-células-T, tales como a (OKT3), anti-CD4, y similares. Los ejemplos de los agentes anti-inflamatorios adecuados incluyen, pero no se limitan ' a, corticosteroides, tales como, por ejemplo, clobetasol, halobetasol, hidrocortisona, triamcinolona, betametasona, fluocinol, fluocinonida, prednisona, prednisolona, metil-prednisolona; fármacos antiinflamatorios no esteroideos (NSAIDs), tales como, por ejempl!o, sulfasalazina, medicamentos que contienen mesalamina (conocidos i como agentes 5-ASA), celecoxib, diclofenaco, etodolaco, fenprofenjo, flurbiprofeno, ibuprofeno, quetoprofeno, meclofamato, meloxicám, nabumetona, naproxeno, oxaprozina, piroxicam, rofecoxib, i salicilatos, sulindaco, y tolmetina; inhibidores de fosfodiesterasa-!4, i anticuerpos anti-inflamatorios, tales como adalimumab (HUMERA (RTM), un antagonista de TNF-a), e infliximab (Remicade, Un antagonista de TNF-a), y similares. También se incluyen agentes inmunomoduladores de un uso actual o potencial en el tratamiento de enfermedad autoinmune, tales como talidomida o sus análogos, tales como lenalidomida. i El rechazo de trasplante y la enfermedad del injerto contra él huésped pueden ser híper-agudos (humorales), agudos (med por células-T), o crónicos (de etiología desconocida), o combinación de los mismos. Por consiguiente, los anticuerpos proteínas anti-CD40 de la invención, por ejemplo, el antic mAb1, mAb2 o mAb3, se utilizan en algunas modalidades prevenir y/o mitigar el rechazo y/o los síntomas asociados rechazo híper-agudo, agudo, y/o crónico de trasplante de cual tejido, incluyendo, pero no limitándose a, hígado, riñon, pánc células de islotes pancreáticos, intestino delgado, pulmón, corazón, córneas, piel, vasos sanguíneos, hueso, médula ósea heterólogal o autóloga, y similares. Los tejidos de injerto se pueden obtenerl a partir de cualquier donador y se pueden trasplantar en cualquier huésped receptor, y, por consiguiente, el procedimiento de trasplante puede comprender trasplantar tejido animal a seres humanos (por ejemplo, xenoinjertos), trasplantar tejido a partir de un ser humano! a otro ser humano (por ejemplo, aloinjertos), y/o trasplantar tejido! a partir de una parte de un cuerpo humano a otro (por ejemplo, autoinjertos).

El tratamiento con los anticuerpos o con las proteínas de la invención también puede reducir las secuelas de los trasplantéis, tales como fiebre, anorexia, anormalidades hemodinám icajs, leucopenia, infiltración de glóbulos blancos del órgano/tejido trasplantado, así como las infecciones oportunistas.

En algunas modalidades, los anticuerpos o las proteínas anti- CD40 de la invención, por ejemplo, el anticuerpo mAb1, mAb2 ¡o mAb3, se pueden utilizar solos o en combinación con fármacc s inmunosupresores para tratar y/o prevenir rechazo de trasplante, tjal como rechazo híper-agudo, agudo, y/o crónico y/o enfermedad d'el i injerto contra el huésped.

Por consiguiente, en algunas modalidades en donde anticuerpos o las proteínas anti-CD40 de la invención se util para tratar rechazo de injerto, los anticuerpos, por ejemplo, ¡el anticuerpo mAb1, mAb2 o mAb3, se pueden utilizar en combinación i con los fármacos inmunosupresores adecuados, incluyendo, pero rio limitándose a, metotrexato; ciclofosfamida; mizoribina; clorambucjil; ciclosporina, tal como, por ejemplo, ciclosporina aerosolizacla (véase, la Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número US20020006901 ), tacrolimus (FK506; ProGrafm), micofenolato-mofetil, y azatioprina (6-mercaptopurina), sirolimus (rapamicina), desoxiespergualina, leflunomida y s†s análogos de malono-nitrilo-amida; inmuno-moduladores, incluyendo, i por ejemplo, talidomida y sus análogos; y proteínas inmunosupresoras, incluyendo, por ejemplo, anticuerpos y fusiones de Ig anti-CTLA, anticuerpos estimulantes anti-linfocitos-B (por ejemplo, LYMPHOSTAT-BTM), y fusiones de Ig (BLyS-lg), anticuerpos anti-CD80 y etanorcept (Enbrel (RTM)), asi como anticuerpos anti-células-T, tales como anti-CD3 (OKT3), anti-CD4, ¡y similares. j Como tales, se contempla específicamente que las composiciones y los métodos de la invención se utilizan én combinación con otros fármacos para mejorar adicionalmente los síntomas y los resultados en los receptores de trasplantes, tal'ejs como aquéllos que reciben injertos de pulmón o riñon, por ejemplo. Por consiguiente, en algunas modalidades, los anticuerpos o iJs proteínas anti-CD40 de la invención, por ejemplo, el anticuerpo mAb1, mAb2 o mAb3, se utilizan para tratar rechazo de trasplante I (tal como, por ejemplo, rechazo híper-agudo, agudo, y/o crónico ¡o enfermedad del injerto contra el huésped en los receptores de trasplante de pulmón o de riñon), solos o en combinación con ciclosporina parenteralmente y/o no parenteralmente administrada, incluyendo, por ejemplo, ciclosporina o ciclosporina aerosolizada (por ejemplo, de las mismas. En algunas modalidades componente de la terapia es ciclosporina aerosolizada, la ciclosporina se suministra al pulmón del receptor mediante la inhalación de ciclosporina en una forma de aspersión en aerosol utilizando, por ejemplo, un dispositivo de suministro presurizado o un nebulizador. La ciclosporina se puede administrar ya sea en forma de polvo seco o en una forma húmeda. La ciclosporina se puede administrar como una dosis sub-terapéutica .

En algunas otras modalidades, los anticuerpos o las proteínas anti-CD40 de la invención, por ejemplo, el anticuerpo mAb1, mAb2 mAb3, se pueden utilizar solos o en combinación con fármacojs inmunosupresores para tratar y/o prevenir la artritis reumatoide. Por consiguiente, en algunas modalidades en donde los anticuerpos o las proteínas anti-CD40 de la invención; por ejemplo, el anticuerpo mAb1, mAb2 o mAb3, se utilizan para tratar la artritis reumatoide, los anticuerpos o las proteínas se pueden utilizar en combinación con los fármacos inmunosupresores adecuados, incluyendo, pero hó limitándose a, metotrexato, ciclofosfamida, mizoribina, clorambucilj, ciclosporina, tacrolimus (FK506; PROGRAFTM), micofenolato-mofetilj, y azatioprina (6-mercaptopurina), sirolimus (rapartiicina)j, desoxiespergualina, leflunomida y sus análogos de malono-nitriloí-amida; y proteínas inmunosupresoras, incluyendo, por ejemplo!, anticuerpos y fusiones de Ig anti-CTLA, anticuerpos estimulantes anti-linfocitos-B (por ejemplo, LYMPHOSTAT-BTM), y fusiones de Ig (BLyS-lg), anticuerpos anti-CD20 (por ejemplo, RITUXAN (g)); el anticuerpo completamente humano HuMax-CD20, R-1594, I MU-106, TRU-015, AME-133, tositumomab/1 -131 , tositumomab (Bexxar (Q), ibritumomab-tiuxetano (Zevalin (RTM)); anticuerpos anti-CD80 etanorcept (ENBREL), así como anticuerpos anti-células-T, tales i como anti-CD3 (OKT3), anti-CD4, y similares. Como se discute i anteriormente, la efectividad del tratamiento se puede evaluar utilizando cualquier medio, e incluye, pero no se limita a, la efectividad como se mide por las respuestas clínicas definidas p!or los criterios del American College of Rheumatology, los criterios ele la European League of Rheumatism, o cualesquiera otros criterios. Véase, por ejemplo, Felson y colaboradores (1995)] Arthritis RheúL. 38 : 727-35 y van Gestel y colaboradores (1996) Arthritis Rheum. 39: i 34-40. | En todavía otras modalidades, los anticuerpos o las proteínas anti-CD40 de la invención, por ejemplo, el anticuerpo mAb1, mAb2 o i mAb3, se pueden utilizar solos o en combinación con fármaejos inmunosupresores para tratar y/o prevenir esclerosis múltiple. Por i consiguiente, en algunas modalidades en donde los anticuerpos o Ijas proteínas anti-CD40 de la invención, por ejemplo, el anticuerpo i mAb1, mAb2 o mAb3, se utilizan para tratar esclerosis múltiple, ijos anticuerpos se pueden utilizar en combinación con los fármacos inmunosupresores adecuados, incluyendo, pero no limitándose ja, metotrexato, ciclofosfamida, mizoribina, clorambucil, ciclosporin|a tacrolimus (FK506; PROGRAFTM), micofenolato-mofetil, azatioprina (6-mercaptopurina), sirolimus (rapamiciná), desoxiespergualina, leflunomida y sus análogos de malono-nitrilo-amida; y proteínas inmunosupresoras, incluyendo, por ejemplo, anticuerpos y fusiones de Ig anti-CTLA, anticuerpos estimulantes anti-linfocitos-B (por ejemplo, LYM PHOSTAT-BTM), y fusiones de Ig (BLyS-lg), anticuerpos anti-CD20 (por ejemplo, RITUXAN (D); el anticuerpo completamente humano HuMax-CD20, R-1594, IMMIJ-106, TRU-015, AME-133, tositumomab/1 -131 , tositumomab (Bexxar (RTM)), ibritumomab-tiuxetano (Zevalin (RTM)); anticuerpos anti-CD80, y etanorcept (ENBREL), así como anticuerpos anti-células-T, tales como anti-CD3 (OKT3), anti-CD4, los agentes involucrados en la modulación de los receptores S1P, incluyendo, por ejemplo, fingolimod; y similares.

Formulaciones farmacéuticas y modos de administración : Los anticuerpos o las proteínas anti-CD40 de esta invención se administran en una concentración que es terapéuticamente efectiva para prevenir o tratar las enfermedades autoinmunes y/o las enfermedades inflamatorias, y/o para prevenir o reducir los riesgos asociados con rechazo de injerto en el trasplante. | i Para alcanzar esta meta, los anticuerpos se pueden formular utilizando una variedad de excipientes aceptables conocidos en la materia. Típicamente, los anticuerpos o las proteínas se administrajn mediante inyección, por ejemplo, ya sea intravenosamente, intraperitonealmente, o subcutáneamente. Los métodos para llevar1 a I cabo esta administración son conocidos por aquéllos de u†a experiencia ordinaria en este campo. También es posible obtener composiciones que se puedan administrar tópicamente u oralmentje, o las cuales se puedan transmitir a través de las membranas mucosas. I i La administración intravenosa se presenta de preferencia i mediante infusión durante un período de aproximadamente 1 'a aproximadamente 10 horas, más preferiblemente durante aproximadamente 1 a aproximadamente 8 horas, todavía más preferiblemente durante aproximadamente 2 a aproximadamente horas, todavía más preferiblemente durante aproximadamente 4 ja aproximadamente 6 horas, dependiendo del anticuerpo o de la proteína anti-CD40 que se esté administrando. La infusión inicial co¡n la composición farmacéutica se puede dar durante un período d|e aproximadamente 4 a aproximadamente 6 horas, suministrándose la¡s siguientes infusiones más rápidamente. Las siguientes infusiones s¡e pueden administrar durante un período de aproximadamente 1 a i aproximadamente 6 horas, incluyendo, por ejemplo, de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 horas, de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 horas, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 2 horas. j Una composición farmacéutica de la invención se formula para ser compatible con su vía de administración pretendida. Los ejemplos de las posibles vías de administración incluyen administración parenteral, (por ejemplo, intravenosa (IV), intramuscular (IM), intradérmica, subcutánea (SC), o infusión), oral y pulmonar (por ejemplo, inhalación), nasal, transdérmica (tópica), transmucosal, y rectal. Las soluciones o suspensiones utilizadas para aplicación parenteral, intradérmica, o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril, tal como agua para inyecciones, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros solventes sintéticos; agentés antibacterianos, tales como alcohol bencílico o metil-parabenos; antioxidantes, tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes, tales como ácido etilen-diamina-tetra-acético; reguladores, tales como acetatos, citratos o fosfatos, y agentes paja el ajuste de la tonicidad, tales como cloruro de sodio o dextrosa. El pH se puede ajustar con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación parenteral se puede alojar en ampolletas, jeringas desechables, o frascos de múltiples dosi hechos de vidrio o de plástico.

Los anticuerpos o las proteínas anti-CD40 de la invención sje proporcionan típicamente mediante las técnicas convencionales dentro de un regulador farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, solución salina estéril, agua regulada estéril, propilenglicol, combinaciones de los anteriores, etc. Los métodos para Ija preparación de los agentes parenteralmente administrables sé describen en Remington's Pharmaceutical Sciences (18a Edición; ack Publishing Company, Easton, Pensilvania, 1990). Véase también, por ejemplo, la Publicación Internacional Número WO 98/56418, la cual describe formulaciones farmacéuticas de anticuerpos estabilizados adecuadas para utilizarse en los métodjas de la presente invención.

La cantidad de cuando menos un anticuerpo o una proteína antagonista anti-CD40 de la invención para administrarse es fácilmente determinada por un experto ordinario en este campo. Los I factores que tienen influencia sobre el modo de administración yjla cantidad respectiva de cuando menos un anticuerpo o una proteína antagonista anti-CD40 incluyen, pero no se limitan a, la enfermedad particular que se someta a terapia, la gravedad de la enfermedad.J la historia de la enfermedad, y la edad, altura, física del individuo que se someta a terapia. la cantidad de anticuerpo o proteína anta administrarse dependerá del modo de administración y si el sujeto Jse ! I someterá a una sola dosis o múltiples dosis de este agente. En términos generales, se prefiere una dosificación más alta ¿el anticuerpo o de la proteína anti-CD40 con un peso creciente del paciente que se someta a terapia. La dosis del anticuerpo o déjla proteína anti-CD40 para administrarse está en el intervalo 'de í aproximadamente 0.003 miligramos/kilogramo a aproximadamente ¡50 miligramos/kilogramo, de preferencia en el intervalo de 0.j01 miligramos/kilogramo a aproximadamente 40 miligramos/kilogramo. J Por consiguiente, por ejemplo, la dosis puede ser de 0.01 miligramos/kilogramo, de 0.03 miligramos/kilogramo, de Ó.1 miligramos/kilogramo, de 0.3 miligramos/kilogramo, de ?'.5 I miligramos/kilogramo, de 1 miligramo/kilogramo, de 1.5 miligramo|s/ kilogramo, de 2 miligramos/kilogramo, de 2.5 miligramos/kilogramo, de 3 miligramos/kilogramo, de 5 miligramos/kilogramo, de 7 I miligramos/kilogramo, de 10 miligramos/kilogramo, de 15 miligramos/ kilogramo, de 20 miligramos/kilogramo, de 25 miligramos/kilogramo, de 30 miligramos/kilogramo, de 35 miligramos/kilogramo, de 40 miligramos/kilogramo, de 45 miligramos/kilogramo, o de s|o miligramos/kilogramo. | En otra modalidad de la invención, el método comprende la I administración de múltiples dosis del anticuerpo antagonista anti-CD40, o de un fragmento del mismo. El método puede comprender la administración de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, o más dosis terapéuticamente efectivas de una composición farmacéutica, las cuales comprenden un anticuerpo antagonista antí-CD40, o un fragmento del mismo. La frecuencia y la duración de administración de múltiples dosis de las composiciones farmacéuticas que comprenden el anticuerpo o la proteína anti-CD40 pueden ser fácilmente determinadas por un experto en la materia!. Más aún, el tratamiento de un sujeto con una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo o de una proteína puede incluir un solo tratamiento o, de preferencia, puede incluir una se de tratamientos. En un ejemplo preferido, un sujeto se trata con el i anticuerpo o la proteína antagonista anti-CD40 de la invención, en eí intervalo de entre aproximadamente 0.1 a 20 miligramos/kilogramo! de peso corporal, una vez por semana durante entjre aproximadamente 1 y 10 semanas, de preferencia de entjre aproximadamente 2 y 8 semanas, más preferiblemente de entre aproximadamente 3 y 7 semanas, y todavía más preferiblemenjte durante aproximadamente 4, 5, ó 6 semanas. El tratamiento se puede presentar anualmente para prevenir la recurrencia o al indicarse jla recurrencia. También se apreciará que la dosificación efectiva del I anticuerpo o del fragmento de enlace de antígeno del mismo utilizada para el tratamiento, puede aumentar o disminuir durante el transcurso de un tratamiento particular. Los cambios en ja dosificación pueden resultar y llegar a ser evidentes a partir de Icjs resultados de los ensayos de diagnóstico, como se describen en ja presente. i Por consiguiente, en una modalidad, el régimen de dosificación incluye una primera administración de una dosis terapéuticamente efectiva de cuando menos un anticuerpo o una proteína anti-CD40 de la invención en los días 1, 7, 14, y 21 del período de tratamiento. En otra modalidad, el régimen de dosificación incluye una primera administración de una dosis terapéuticamente efectiva de cuando menos un anticuerpo o una proteína anti-CD40 de la invención en los días 1, 2, 3, 4, 5, 6, y 7 de una semana en el período de Otras modalidades incluyen un régimen de dosificación que tiene una primera administración de una dosis terapéuticamente efectiva de cuando menos un anticuerpo o una proteína anti-CD40 de lá invención en los días 1, 3, 5, y 7 de una semana en el período de I tratamiento; un régimen de dosificación que incluye una primejra administración de una dosis terapéuticamente efectiva de cuando menos un anticuerpo o una proteína anti-CD40 de la invención en los i días 1 y 3 de una semana en el período de tratamiento; y un régimen de dosificación preferido que incluye una primera administración de una dosis terapéuticamente efectiva de cuando menos un anticuerpo o una proteína anti-CD40 de la invención en el día 1 de una semana en el período de tratamiento. El período de tratamiento puécie comprender 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, un mes, 3 meses, ¡6 I meses, o un año. Los períodos de tratamiento pueden ser subsiguientes o se pueden separar unos de otros por un día, uijia semana, 2 semanas, un mes, 3 meses, 6 meses, o un año, en intervalos de 0.003 miligramos/kilogramo a 50 m iligramos/kilogramj}, de 0.01 miligramos/kilogramo a 40 miligramos/kilogramo, de 0.01 miligramos/kilogramo a 30 miligramos/kilogramo, de 0.1 miligramol/ kilogramo a 30 miligramos/kilogramo, de 0.5 miligramos/kilogramoja 30 miligramos/kilogramo, de 1 miligramo/kilogramo a 30 miligramos/ kilogramo, de 3 miligramos/kilogramo a 30 miligramos/kilogramo, de 3 miligramos/kilogramo a 25 miligramos/kilogramo, de 3 miligramos/ kilogramo a 20 miligramos/kilogramo, de 5 miligramos/kilogramo a 1|5 miligramos/kilogramo, o de 7 miligramos/kilogramo a 12 miligramos/ i kilogramo. Por consiguiente, por ejemplo, la dosis de cualquier anticuerpo antagonista anti-CD40, o fragmento de enlace de antígeno del mismo, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal o ta proteína anti-CD40 de la invención, puede ser de 0.003 i I miligramos/kilogramo, de 0.01 miligramos/kilogramo, de 0.03 miligramos/kilogramo, de 0.1 miligramos/kilogramo, de 0.3 miligramos/kilogramo, de 0.5 miligramos/kilogramo, de 1 miligramo/ kilogramo, de 1.5 miligramos/kilogramo, de 2 miligramos/kilogramo, i de 2.5 miligramos/kilogramo, de 3 miligramos/kilogramo, de j 5 miligramos/kilogramo, de 7 miligramos/kilogramo, de 10 miligramos/ kilogramo, de 15 miligramos/kilogramo, de 20 miligramos/kilogramo, de 25 miligramos/kilogramo, de 30 miligramos/kilogramo, de 35 miligramos/kilogramo, de 40 miligramos/kilogramo, de 45 miligramos/ kilogramo, de 50 miligramos/kilogramo, u otras dosis que caigan dentro del intervalo de 0.003 miligramos/kilogramo a 50 miligramos/ kilogramo. Se puede administrar la misma dosis terapéuticamente efectiva de un anticuerpo o de una proteína anti-CD40 de la invención a través de cada semana de dosificación del anticuerpo.

De una manera alternativa, se pueden utilizar diferentes dosis terapéuticamente efectivas de un anticuerpo o de una proteíña ! antagonista anti-CD40 de la invención durante el transcurso del período de tratamiento.

En algunas modalidades, la dosis terapéuticamente efectiya inicial de un anticuerpo antagonista anti-CD40, o de un fragmento de enlace de antígeno del mismo, como se define en cualquier ot!ra parte en la presente, puede estar en el intervalo de dosificación mas bajo (es decir, de 0.003 miligramos/kilogramo a 20 miligramos/ kilogramo), cayendo las siguientes dosis dentro del intervalo de dosificación más alto (es decir, de 20 miligramos/kilogramo a 50 miligramos/kilogramo). 1 En las modalidades alternativas, la dosis terapéuticamente efectiva inicial de un anticuerpo antagonista anti-CD40, o de un fragmento de enlace de antigeno del mismo, como se define en cualquier otra parte en la presente, puede estar en el intervalo lie kilogramo, incluyendo aproximadamente 20 miligramos/kilogramo, aproximadamente 25 miligramos/kilogramo, aproximadamente 30 miligramos/kilogramo, y aproximadamente 35 miligramos/kilogramo, las siguientes dosis terapéuticamente efectivas del anticuerpo o de la proteina antagonista anti-CD40 de la invención son dje aproximadamente 5 miligramos/kilogramo a aproximadamente miligramos/kilogramo, incluyendo aproximadamente 5 miligram kilogramo, 8 miligramos/kilogramo, 10 miligramos/kilogramo, 12 I miligramos/kilogramo, y aproximadamente 15 miligramos/kilogramo.

En algunas modalidades de la invención, la terapia anti-CD4Ó se inicia mediante la administración de una "dosis de carga" del anticuerpo o de la proteína de la invención al sujeto que necesite la terapia anti-CD40. "Dosis de carga" significa una dosis inicial del anticuerpo o de la proteína anti-CD40 de la invención que 'se carga" se puede administrar como una sola administración, p¡or ejemplo, una sola infusión, en donde el anticuerpo o el fragmento ele enlace de antígeno del mismo, se administra intravenosamente (iv), o como múltiples administraciones, por ejemplo, múltiples infusiones, en donde el anticuerpo o el fragmento de enlace de antígeno d|el mismo se administra intravenosamente (¡v), siempre que administre la "dosis de carga" completa dentro de un período aproximadamente 24 horas. En seguida de la administración de la "dosis de carga", se administra entonces al sujeto una o más doJis terapéuticamente efectivas adicionales del anticuerpo o de !la proteína anti-CD40 de la invención. Las siguientes dosjis terapéuticamente efectivas se pueden administrar, por ejemplo, de acuerdo con un programa de dosificación semanal, o una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, o una vez cada cuatro semanas. En estas modalidades, las siguientes dosis ¡ terapéuticamente efectivas caen en general dentro del intervalo de ¡ dosificación más bajo (es decir, de 0.003 miligramos/kilogramo a 20 miligramos/kilogramo). I De una manera alternativa, en algunas modalidades, e'n seguida de la "dosis de carga", se administran las siguientes dosis terapéuticamente efectivas del anticuerpo o de la proteína anti-CD40 de la invención, de acuerdo con un "programa de mantenimiento", en donde la dosis terapéuticamente efectiva del anticuerpo o de la proteína de la invención se administra una vez al mes, una vez cada 6 semanas, una vez cada dos meses, una vez cada 10 semanas, una vez cada tres meses, una vez cada 14 semanas, una vez cada cuatro meses, una vez cada 18 semanas, una vez cada cinco meses, vez cada 22 semanas, una vez cada 6 meses, una vez cada 7 meses, una vez cada 8 meses, una vez cada 9 meses, una vez cada 10 i meses, una vez cada 11 meses, o una vez cada 12 meses. Én estas modalidades, las dosis terapéuticamente efectivas del anticuerpo j o de la proteína anti-CD40 de la invención caen dentro del intervalo de dosificación más bajo (es decir, de 0.003 miligramos/kilogramo a aproximadamente 20 miligramos/kilogramo), en particular, cuando lás siguientes dosis se administran a intervalos más frecuentes, por ejemplo, desde una vez cada dos semanas hasta una vez cada mejs, o dentro del intervalo de dosificación más alto (es decir, de 20 miligramos/kilogramo a 50 miligramos/kilogramo), en particulajr, i cuando las siguientes dosis se administran a intervalos mencjs frecuentes, por ejemplo, en donde las siguientes dosis s'e administran con una separación de un mes a 12 meses. j En los métodos de la invención se puede utilizar cualquier composición farmacéutica que comprenda un anticuerpo o unía proteína anti-CD40 de la invención, que tenga las propiedades funcionales deseadas descritas en la presente, como el componente terapéuticamente activo. Por consiguiente, las composiciones líquidas, Mofilizadas, o secadas por aspersión que comprendan uno! o í más de los anticuerpos o de las proteínas anti-CD40 de la ¡nvenc¡ó¡n, por ejemplo, el anticuerpo mAb1, mAb2 o mAb3s, se pueden prepariar como una solución o suspensión acuosa o no acuosa para su administración subsiguiente a un sujeto de acuerdo con los métodos í de la invención.

Cada una de estas composiciones comprenderá cuando menos uno de los anticuerpos o de las proteínas anti-CD40 de la presente invención como un componente terapéuticamente o profilácticamente activo.

"Componente terapéuticamente o profilácticamente activo" significa que el anticuerpo o la proteína anti-CD40 de la invención se incorpora específicamente dentro de la composición para provocar una respuesta terapéutica o profiláctica deseada con respecto .al tratamiento, la prevención, o el diagnóstico de una enfermedad i o condición en un sujeto, cuando la composición farmacéutica se administra a ese sujeto. De preferencia, las composiciones farmacéuticas comprenden agentes estabilizantes apropiado!s, agentes de volumen, o ambos, para minimizar los problemas ¡ asociados con la pérdida de estabilidad y actividad biológica de ila j proteína durante su preparación y almacenamiento.

Se pueden agregar formulantes a las farmacéuticas que comprenden un anticuerpo o una CD40 de la invención. Estos formulantes pueden incluir, pero no se limitan a, aceites, polímeros, vitaminas, carbohidratos, aminoácidos, sales, reguladores, albúmina, tensoactivos, o agentes de volumen. De preferencia, los carbohidratos incluyen azúcar o alcoholes de azúcar, tales como mono-, di-, o poli-sacáridos, o glucanos solubles en agua. Los sacáridos o glucanos pueden incluir fructosa mañosa, sorbosa, xilosa, maltosa, sacarosa, dextrano, dextrina, a- y ß-ciclodextrina, almidón soluble, almidón d etilo, y carboxi-metil-celulosa, o mezclas de los mismos. [ "Alcohol de azúcar" se define como un hidrocarburo de 4 a 8 átomos de carbono que tiene un grupo hidroxilo e incluye galactitol, inositol, manitol, xilitol, sorbitol, glicerol, y arabitol. Estos azúcares o alcoholes de azúcar se pueden utilizar individualmente o en combinación. La concentración de azúcar o de alcohol de azúcar puede ser de entre el 1.0 por ciento y el 7 por ciento en peso/volumen, más preferiblemente de entre el 2.0 por ciento y el 6.0 promedio de entre 2,000 y 3,000, o polietilenglicol (PEG) con iln peso molecular promedio de entre 3,000 y 5,000. Los tensoactivos que se pueden agregar a la formulación se muestran en las Patentes i Europeas Números 270,799 y 268,110. ¡ Adicionalmente, los anticuerpos se pueden modificar químicamente mediante la conjugación covalente con un polímero para aumentar su vida media circulante, por ejemplo. Los polímeros preferidos, y los métodos para unirlos a los péptidos, se muestran en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 4,766,106; 4,179,337; 4,495,285; y 4,609,546. Los polímeros preferidos son los polioles polioxietilados y polietilenglicol (PEG). El PEG es soluble en agua a temperatura ambiente, y tiene la fórmula general: R (0--CH2--CH2)nO--R, en donde R puede ser hidrógeno,] o 500. El PEG tiene un peso molecular promedio preferido de entre 1,000 y 40,000, más preferiblemente de entre 2,000 y 20,000, mas preferiblemente de entre 3,000 y 12,000. De preferencia, el PEG tiene cuando menos un grupo hidroxilo, más preferiblemente es un grupo hidroxilo terminal. Es este grupo hidroxilo el que se activa de preferencia para reaccionar con un grupo amino libre sobre ¡el I inhibidor. Sin embargo, se entenderá que el tipo y la cantidad de los grupos reactivos se pueden variar para lograr un PEG/ant¡cuer|i>o covalentemente conjugado de la presente invención. | Los polioles polioxietilados solubles en agua también son útiles en la presente invención. j Incluyen sorbitol polioxietilado, glucosa polioxietilada, glicer¡ol i polioxietilado (POG), y similares. Se prefiere el glicerol polioxietilado (POG). Una razón es debido a que la estructura base de glicerol del i glicerol polioxietilado es la misma estructura base que se presenta naturalmente, por ejemplo, en los animales y en los seres humanos, en los mono-, di-, tri-glicéridos. Por consiguiente, esta ramificación no se vería necesariamente como un agente extraño en el cuerpo. ¡El glicerol polioxietilado (POG) tiene un peso molecular preferido en el mismo intervalo que el PEG. La estructura para el glice ol polioxietilado (POG) se muestra en Knauf y colaboradores (1988, |J. Bio. Chem. 263: 15064-15070), y se encuentra una discusión de los conjugados de POG/IL-2 en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,766, 106.

Otro sistema de suministro de fármacos para aumentar la vida media circulante es el liposoma. ¡ Los métodos para la preparación de sistemas de suministro de liposomas se discuten en Gabizon y colaboradores (1982) Cáncer Research 42: 4734; Cafiso (1981) Biochem Biophys Acta 649: 129;!y Szoka (1980) Ann. Rev. Bioplays. Eng. 9: 467. Otros sist suministro de fármacos se conocen en la técnica, y se descr ejemplo, en Poznansky y colaboradores (1980) Drug Systems (R. L. Juliano, Editor, Oxford, N. Y.) páginas Poznansky (1984) Pharm Revs 36: 277.

El formulante para incorporarse en una composición farmacéutica debe proporcionar la estabilidad del anticuerpo o de la proteína antagonista anti-CD40 de la invención. Es decir, él anticuerpo o la proteína anti-CD40 de la invención debe conservar su estabilidad física y/o química, y debe tener las propiedades funcionales deseadas, es decir, una o más de funcionales deseadas definidas anteriormente en la Los métodos para monitorear la estabilidad d bien conocidos en la materia. Véase, por ejemplo, Jones (1993) Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90; Lee, Editor, (1991) Peptide a'nd Protein Drug Delivery (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, Nuejva i York); y los ensayos de estabilidad que se dan a conocer en ¡la I presente más adelante. En términos generales, la estabilidad de la proteína se mide a una temperatura seleccionada durante un período de tiempo especificado. En las modalidades preferidas, Lina formulación farmacéutica de anticuerpo estable proporciona la estabilidad del anticuerpo o de la proteína antagonista anti-CD40 de la invención cuando se almacena a temperatura ambiente ¡(a ! o cuando menos 24 meses.

Una proteína, tal como un anticuerpo, cuando se formula en una composición farmacéutica, se considera que conserva su estabilidad física en un punto del tiempo dado si no muestra signos i visuales (es decir, decoloración o pérdida de claridad) o muestjra signos mensurables (por ejemplo, utilizando cromatografía pior j exclusión de tamaños (SEC) o dispersión de luz ultravioleta (UV)) ele i precipitación, aglomeración, y/o desnaturalización en ésa composición farmacéutica. Con respecto a la estabilidad química, una proteína, tal como un anticuerpo, cuando se formula en una composición farmacéutica, se considera que conserva su estabilidad química en un punto del tiempo dado si las mediciones de la estabilidad química indican que la proteína (es decir, el anticuefpo) conserva la actividad biológica de interés en esa composición farmacéutica. Los métodos para monitorear los cambios en la estabilidad química son bien conocidos en la materia, e incluyen, pero no se limitan a, los métodos para detectar las formjas químicamente alteradas de la proteína, tales como resultan de la sujeción, utilizando, por ejemplo, SDS-PAGE, SEC, y/o ionización con desorción de láser asistida por matriz/espectrometría de masas con tiempo de vuelo; y la degradación asociada con los cambios en la carga molecular (por ejemplo, asociada con la desamidación), utilizando, por ejemplo, cromatografía de intercambio de iones. Véanse, por ejemplo, los métodos que se dan a conocer en lia presente más adelante. ! Un anticuerpo o una proteína anti-CD40 de la cuando se formula en una composición farmacéutica, se que conserva una actividad biológica deseada en un punto del tiempo dado, si la actividad biológica deseada en ese tiempo está dentro de aproximadamente el 30 por ciento, de preferencia dent!ro de aproximadamente el 20 por ciento de la actividad biológica deseada exhibida en el momento en que se preparó la composición farmacéutica, como se determine en un ensayo adecuado paira determinar la actividad biológica deseada. Los ensayos para medir la actividad biológica deseada de los anticuerpos o proteínias antagonistas anti-CD40 que se dan a conocer en la presente, se pueden llevar a cabo como se describe en los Ejemplos en la presente. Véanse también los ensayos descritos en Schutze y colaboradores (1998) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 92: 8200-8204; Dentón y colaboradores (1998) Pediatr Transplant. 2: 6-15; Evans, y i colaboradores (2000) J : Immunol. 164: 688-697; Noelle (199¡8) I Agents Actions, Suplemento 49: 17-22; Lederman y colaboradores (1996) Curr Opin. Hematol. 3: 77-86; Coligan y colaboradores (1991) Current Protocols ¡n Immunology 13: 12; Kwekkeboom colaboradores (1993) Immunology 79: 439-444; y Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,674, 492 y 5,847, 082. j En algunas modalidades de la invención, el anticuerpo anti-CD40, por ejemplo, seleccionado entre los anticuerpos recombinantes mAb1-mAb3, se formula en una formulación farmacéutica líquida. El anticuerpo o la proteína anti-CD40 de la invención se puede preparar empleando cualquier método conocido en la materia, incluyendo los métodos que se dan a conocer anteriormente en la presente. En una modalidad, el ant CD40, por ejemplo, seleccionado entre los anticuerpos se produce de una manera recombinante en una línea celular CHO. ¦ En seguida de su preparación y purificación, el anticuerpo anti-CD40 se puede formular como una formulación farmacéutica líquidja en la manera estipulada en la presente. Cuando el anticuerp'o I antagonista anti-CD40 se va a almacenar antes de su formulación, se puede congelar, por ejemplo, a -20°C, y entonces se descongela! a temperatura ambiente para su formulación adicional.

La formulación farmacéutica líquida comprende una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo o de la proteína anti-CD40 de la invención, por ejemplo, el anticuerpo mAb1, mAb2 o mAb3. La cantidad de anticuerpo presente en la formulación toma en i consideración la vía de administración y el volumen de dosis deseado. ¡ De esta manera, la composición farmacéutica líquida comprende el anticuerpo anti-CD40, por ejemplo, el anticuerpo mAb1, mAb2 o mAb3, en una concentración de ?!.1 miligramos/mililitro a 300.0 miligramos/mililitro, de 1.0 miligramcjs/ i mililitro a 200 miligramos/mililitro, de 5.0 miligramos/mililitro a 100.0 miligramos/mililitro, de 7.5 miligramos/mililitro a 50 miligramos/ mililitro, o de 15.0 miligramos/mililitro a 25.0 miligramos/mililitro. j La composición farmacéutica líquida comprende el anticuerpo anti-CD40, por ejemplo, el anticuerpo mAb1, mAb2 o mAb3, y ijin regulador que mantenga el pH de la formulación en el intervalo de pH de 5.0 a un pH de 7.0. En la formulación se puede utilizar cualquier regulador adecuado que mantenga el pH de la formulación de anticuerpo anti-CD40 líquida en el intervalo de aproximadamente un pH de 5.0 ¡a aproximadamente un pH de 7.0, siempre que se conserven ja estabilidad físico-química y la actividad biológica deseadas del i anticuerpo, como se observa anteriormente en la presente. Ljos reguladores adecuados incluyen, pero no se limitan a, los ácidos convencionales y las sales de los mismos, en donde el contra-ion puede ser, por ejemplo, sodio, potasio, amonio, calcio, o magnesiio.

Los ejemplos de los ácidos convencionales y las sales de los mismlos que se pueden utilizar para regular la formulación farmacéutica líquida incluyen, pero no se limitan a, los reguladores de ácido succínico o succinato, histidina o clorhidrato de histidina, ácido cítrico o citrato, ácido acético o acetato, ácido tartárico o tartrato, ácido fosfórico o fosfato, ácido glucónico o gluconato, ácildo glutámico o glutamato, ácido aspártico o aspartato, ácido maleico o maleato, y ácido málico o malato. La concentración dentro de la formulación puede ser de 1 mM a 50 mM, aproximadamente 1 mM, 2 mM, 5 mM, 8 mM, 10 mM, 1 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, u dentro del intervalo de 1 mM a 50 mM. j En algunas modalidades de la invención, la formulacüón i farmacéutica líquida comprende una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo anti-CD40, por ejemplo, el anticuerpo mA¿1, mAb2 o mAb3, y regulador de succinato o regulador de citratoj o regulador de histidina o regulador de clorhidrato de histidina, en una concentración que mantenga el pH de la formulación en el Intervalo de aproximadamente un pH de 5.0 a un pH de 7.0. "Regulador de succinato" o "regulador de citrato" significa un regulador que i comprende una sal de ácido succínico o una sal de ácido cítrico, respectivamente. "Regulador de histidina" significa un regulador qjue comprende una sal del aminoácido histidina.

En una modalidad preferida, el regulador es un regulador de histidina, por ejemplo, clorhidrato de histidina. Como se observa anteriormente, la concentración del regulador de histidina dentro de la formulación puede ser de 1 mM a 50 mM, incluyendo de aproximadamente 1 mM, 2 mM, 5 mM, 8 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, u otros valores dentro del intervalo de 1 mM a 50 mM.

En una modalidad preferida, el contra-ion de succinato o citrato es el catión de sodio, y, por consiguiente, el regulador es succinato de sodio o citrato de sodio, respectivamente. Sin embargo, se esp que sea efectivo cualquier catión. Otros posibles cationes succinato o citrato incluyen, pero no se limitan a, potasio, amonijo, calcio, y magnesio. Como se observa anteriormente, la concentración del regulador de succinato o citrato dentro de la formulación pu e ser de 1 mM a 50 mM, incluyendo de aproximadamente 1 mM, 2 mfj/l, i 5 mM, 8 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mtyl, 45 mM, 50 mM, u otros valores dentro del intervalo de 1 mM a 50 I m M . | En otras modalidades, la formulación farmacéutica líquida comprende el anticuerpo antagonista anti-CD40, por ejemplo, él anticuerpo mAb1, mAb2 o mAb3, en una concentrac miligramos/mililitro a 300.0 miligramos/mililitro, o de 1.0 mililitro a 200 miligramos/mililitro, de 5.0 miligramos/milil miligramos/mililitro, de 7.5 miligramos/mililitro a 50 miligramos/ mililitro, o de 15.0 miligramos/mililitro a 25.0 miligramos/mililitro, y el regulador de histidina o succinato o citrato, por ejemplo, el regulador de succinato de sodio o citrato de sodio o clorhidrato de histidina, ^n una concentración de 1 mM a 50 mM, de 5 mM a 40 mM, de 10mlVl' a 35 mM, de preferencia de aproximadamente 30 mM. j Cuando sea deseable que la formulación farmacéutica líquida sea casi isotónica, la formulación farmacéutica líquida que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo¡ o de la proteína anti-CD40 de la invención, por ejemplo, el antic mAb1 , mAb2 o mAb3, y un regulador para mantener el pH formulación dentro del intervalo de aproximadamente un pH de aproximadamente un pH de 7.0, puede comprender además u†a cantidad de un agente isotonizante suficiente para hacer que ¡la formulación sea casi isotónica. "Casi isotónica" significa que jla formulación acuosa tiene una osmolaridad de 240 milimole's/ kilogramo a 800 milimoles/kilogramo, de preferencia de aproximadamente 240 a aproximadamente 600 milimoles/kilogramo, más preferiblemente de aproximadamente 240 a aproximadamenje 440 milimoles/kilogramo, más preferiblemente de aproximadamente 250 a aproximadamente 330 milimoles/kilogramo, todavía más preferiblemente de aproximadamente 260 a aproximadamente 32¡0 milimoles/kilogramo, todavía más preferiblemente dje aproximadamente 270 a aproximadamente 310 milimoles/kilogramo. j Los métodos para determinar la isotonicidad de una soluciójn son conocidos por los expertos en este campo. Véase, por ejemplo, i Setnikar y colaboradores (1959) J. Am. Pharm. Assoc. 48: 628. Los expertos en este campo están familiarizados con una variedad de solutos farmacéuticamente aceptables útiles para proporcionar isotonicidad a las composiciones farmacéuticas. El agente isotonizante puede ser cualquier reactivo capaz de ajustar la presijón osmótica de la formulación farmacéutica líquida de la presente invención, hasta un valor casi igual a aquél de un fluido corporal. Es deseable utilizar un agente isotonizante fisiológicamente aceptable Por consiguiente, la formulación farmacéutica líquida que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo antagonista anti-CD40, por ejemplo, el anticuerpo mAb1, mAb2 o mAb3, y un regulador para mantener el pH de la formulación dent o del intervalo de aproximadamente un pH de 5.0 a aproximadame Jte ¡ un pH de 7.0, puede comprender además componentes que se puedan utilizar para proporcionar isotonicidad, por ejemplo, cloru'ro de sodio; aminoácidos, tales como alanina, valina, y glicinja; azúcares y alcoholes de azúcar (polioles), incluyendo, pero no limitándose a, glucosa, dextrosa, fructosa, sacarosa, maltosia, manitol, trehalosa, glicerol, sorbitol, y xilitol; ácido acético, otros ácidos orgánicos o sus sales, y cantidades relativamente menores ele citratos o fosfatos. La persona experta ordinaria sabría de agentes i adicionales que sean adecuados para proporcionar la tonicidad óptima a la formulación líquida. ¡ En algunas modalidades preferidas, la formulación farmacéutica líquida que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo anti-CD40, por ejemplo, el anticuerpo mAb1 mAb2 o mAb3, y un regulador para mantener el pH de la formulación dentro del intervalo de aproximadamente un pH de 5.0 aproximadamente un pH de 7.0, comprende además cloruro de sodio como el agente isotonizante. j La concentración de cloruro de sodio en la formulacijón líquida comprende una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo o de la proteína anti-CD40 de la invención, po el anticuerpo mAb1, mAb2 o mAb3, y la formulación tiene 5.0 a un pH de 7.0.

En otras modalidades, la formulación farmacéutica líquijda comprende el anticuerpo o la proteína anti-CD40 de la invención, por ejemplo, el anticuerpo mAb1, mAb2 o mAb3, en una concentración jde 0.1 miligramos/mililitro a 50.0 miligramos/mililitro o de 5.0 miligramos/mililitro a 25.0 miligramos/mililitro, aproximadamente 1 mM de cloruro de sodio, y aproximadamente 10 mM, 20 mM 30 m 40 mM ó 50 mM de succinato de sodio o citrato de sodio, a un pH de aproximadamente un pH de 5.5.

La degradación de la proteína debido a la congelación/ descongelación o al desgarre mecánico durante el procesamiento de una formulación farmacéutica líquida de la presente invención, se puede inhibir mediante la incorporación de tensoactivos dentro de la formulación, con el objeto de bajar la tensión superficial en la interfase de solución-aire. Por consiguiente, en algunas modalidades, la formulación farmacéutica líquida comprende una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo o de la proteína anti-CD40 de la invención, por ejemplo, el anticuerpo mAb1, mAbJ o mAb3, un regulador para mantener el pH de la formulación dentro cel intervalo de aproximadamente un pH de 5.0 a aproximadamente un pH de 7.0, y comprende además un tensoactivo. En otras modalidades, la formulación farmacéutica líquida comprende una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo o de la proteína anti-CD40 de la invención, por ejemplo, el anticuerpo mAb1, mAb2¡ o mAb3, un regulador para mantener el pH de la formulación dentro del intervalo de aproximadamente un pH de 5.0 a aproximadamente Un pH de 7.0, un agente isotonizante, tal como cloruro de sodio, en una concentración de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 300 mM, y comprende además un tensoactivo.

Los tensoactivos típicos empleados son tensoactivos rjio iónicos, incluyendo ésteres de sorbitol de polioxietileno, tales conjio polisorbato 80 (Tween 80), y polisorbato 20 (Tween 20); ésteres ¿e polioxipropileno-polioxietileno, tales como Pluronic F68; alcoholes de polioxietileno, tales como Brij 35; simeticona; polietilenglicol, ¡tal como PEG400; lisofosfatidil-colina; y polioxietileno-p-t-octilfenol, Ital como Tritón X-100.

La estabilización clásica de los productos farmacéuticos mediante tensoactivos o emulsionantes se describe, por ejemplo, en Levine y colaboradores (1991) J. Parenteral Sci. Technol. 45 (j3): 160-165, incorporado a la presente como referencia. Un tensoactivo preferido empleado en la práctica de la presente invención es polisorbato 80. Cuando se incluye un tensoactivo, típicamente se agrega en una cantidad del 0.001 por ciento al 1.0 por cierjito (peso/volumen). j Por consiguiente, en algunas modalidades, la fo farmacéutica líquida comprende una cantidad terapéu efectiva del anticuerpo o de la proteína anti-CD40 de la i por ejemplo, el anticuerpo mAb1, mAb2 o mAb3, el reg succinato de sodio o cítrato de sodio o regulador de histidina o regulador de clorhidrato de histidina, en una concentración de 1 mM a 50 mM, de 3 mM a 40 mM, o de 5 mM a 35 mM; o de 7.5 mM¡ a 30mM; la formulación tiene un pH de un pH de 5.0 a un pH de 7.?| y I la formulación comprende además un tensoactivo, por ejemplo, polisorbato 80, en una cantidad del 0.001 por ciento al 1.0 por ciento, o del 0.001 por ciento al 0.5 por ciento. Estas formulaciones i opcionalmente pueden comprender un agente isotonizante, tal coijio cloruro de sodio, en una concentración de 50 mM a 300 mM, de 50mM a 200 mM, o de 50 mM a 150 mM. i 92 En otras modalidades, la formulación farmacéutica líqui|da comprende el anticuerpo o la proteína ant¡-CD40 de la invención, por ejemplo, el anticuerpo mAb1, mAb2 o mAb3, en una co 0.1 miligramos/mililitro a 200.0 miligramos/mililit miligramo/mililitro a 100.0 miligramos/mililitro, o de mililitro a 50.0 miligramos/mililitro, o de 5.0 miligra 25.0 miligramos/mililitro, incluyendo de aproximadamente 20.0 miligramos/mililitro; de 50 mM a 200 mM de cloruro de sodio, incluyendo aproximadamente 150 mM de cloruro de sodio; succinato de sodio o citrato de sodio de 5 mM a 20 mM, incluyen jd o aproximadamente 10 mM de succinato de sodio o citrato de sodio; cloruro de sodio en una concentración de 50 mM a 200 mM, incluyendo aproximadamente 150 mM; histidina o cloruro de histidina de 5 mM a 50 mM, incluyendo aproximadamente 30 mM de histidina o cloruro de histidina; y opcionalmente un tensoactivo, por ejemplo, polisorbato 80, en una cantidad del 0.001 por ciento al 1.0 pjor I ciento, incluyendo del 0.001 por ciento al 0.5 por ciento; en dondejla formulación farmacéutica líquida tiene un pH de aproximadamente un pH de 5.0 a aproximadamente un pH de 7.0. i La formulación farmacéutica líquida puede estar esencialmenjte libre de cualesquiera conservadores y otros vehículos, excipientes,; o estabilizantes observados anteriormente en la presente. De u manera alternativa, la formulación puede incluir uno o m conservadores, por ejemplo, agentes antibacterianos, vehículos farmacéuticamente aceptables, excipientes, o estabilizantes descritos anteriormente en la presente, en el entendido de que no afecten adversamente la estabilidad físico-química del anticuerpo antagonista anti-CD40 o fragmento de enlace de antígeno del mismo. Los ejemplos de los vehículos, excipientes, y estabilizantes aceptables incluyen, pero no se limitan a, agentes reguladores adicionales, co-solventes, tensoactivos, antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico y metionina, agentes quelantes, tales como EDT|A, complejos de metales (por ejemplo, complejos de Zn-proteína),¡ y polímeros biodegradables, tales como poliésteres. Se puejde encontrar una discusión completa de la formulación y selección los vehículos, estabilizantes, e isotonizantes farmacéuticame aceptables, en Remington's Pharmaceutical Sciences (18a Edición; i Mack Publishing Company, Easton, Pensilvania, 1990).

Después de que se prepara la formulación farmacéutica líquida u otra composición farmacéutica descrita en la presente, se puede llofilizar para prevenir la degradación. Los métodos para liofilizar i ja s composiciones líquidas son conocidos por aquéllos de una experiencia ordinaria en este campo. Justo antes de usarse, ¡la composición se puede reconstituir con un diluyente estéril (solución de Ringer, agua destilada, o solución salina estéril, por ejemplo), jel cual puede incluir ingredientes adicionales.

Después de la reconstitución, la composición de preferencia ke administra a los sujetos empleando los métodos que son conocidos por los expertos en este campo. 1 Uso de los anticuerpos antagonistas anti-CD40 en la elaboración de medicamentos La presente invención también proporciona los anticuerpos o las proteínas antagonistas anti-CD40 de la invención, para utilizarse en el tratamiento de una enfermedad autoinmune y/o de una enfermedad inflamatoria en un sujeto, en donde el medicamento se coordina con un tratamiento con cuando menos otra terapia. i "Se coordina" significa que el medicamento es ya sea antes, durante, o después del tratamiento cuando menos otra terapia. Los ejemplos de otras terapias incluyen, pero no se limitan a, aquéllas descritas anteriormente en la presente, es decir, cirugía o procedimientos quirúrgicos (por ejemplo, esplenectomía, linfadenectomía, tiroidectomía, plasmafores'is, leucoforesis, trasplante de células, tejidos, u órganos, perfusión de órgano, procedimientos intestinales, y similares), terapia de radiación, terapia tal como terapia esteroidea y terapia ¡no esteroidea, terapia de hormonas, terapia de citoquina, terapia cjon agentes dermatológicos (por ejemplo, agentes tópicos utilizados para tratar condiciones de la piel, tales como alergias, dermatitis por contacto, y soriasis), terapia inmunosupresora, y otra terapia anti- i inflamatoria con anticuerpos monoclonales, y similares, en dondejel i tratamiento con la terapia adicional o con las terapias adicionales, 'se presenta antes, durante, o después del tratamiento del sujeto conjel medicamento, el cual comprende los anticuerpos antagonistas o l'as proteínas anti-CD40 de la invención, como se observa anteriormente en la presente. ¡ En una modalidad, la presente invención proporciona e| anticuerpo mAb1, mAb2 o mAb3 para utilizarse en el tratamiento de una enfermedad autoinmune y/o de una enfermedad inflamatoria en un sujeto, en donde el medicamento se coordina con el tratamiento con cuando menos otra terapia, como se observa anteriormente en] la presente. j En algunas modalidades, el medicamento que comprende el anticuerpo antagonista anti-CD40, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal mAb1, mAb2 o mAb3, que se da a conocer en la presente, o un fragmento de enlace de antígeno del mismo, se coordina con el tratamiento con otras dos terapias. j Cuando el medicamento que comprende el anticuerjpo antagonista anti-CD40 se coordina con otras dos terapias, el uso ¿el medicamento puede ser antes, durante, o después del tratamiento del sujeto con cualquiera o ambas de la otra terapias. j La invención también proporciona un anticuerpo antagonista anti-CD40, por ejemplo, el anticuerpo mAb1, mAb2 o mAb3 que se da a conocer en la presente, para utilizarse en el tratamiento de una enfermedad autoinmune y/o de una enfermedad inflamatoria en ??? sujeto, en donde el medicamento se utiliza en un sujeto que se ha tratado previamente con cuando menos otra terapia. ¡ i "Previamente tratado" o "tratamiento previo" significa que ¡el sujeto ha sido tratado con una o más terapias distintas antes de recibir el medicamento que comprende el anticuerpo antagonista o la proteína anti-CD40 de la invención.

Los siguientes ejemplos se ofrecen a manera de ilustración y no a manera de limitación.

LEYENDAS DE LAS FIGURAS j La Figura 1 muestra la incorporación de 3H-timidina después |de 72 horas de cultivo de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas estimuladas con una respuesta a la dosis de Chirl 2.12 (círculo hueco), mAb1 (círculo negro), mAb2 (cuadro negro), mAb3 (triángulo negro) o el CD40L humano (cuadro hueco) La Figura 2 muestra la incorporación de 3H-timidina después ele 72 horas de cultivo de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas estimuladas con una respuesta a la dosis cié Chir12.12 (círculo hueco), mAb1 (círculo negro), mAb2 (cuadro negro), mAb3 (triángulo negro), el CD40L humano (cuadro hueco), i control de isotipo (rombo negro) co-estimulados en la presencia ¿le ya sea 5 microgramos/mililitro de F(ab')2 anti-lgM o CpG2006 1 µ?.| , i La Figura 3 muestra la incorporación de H-timidina después de 72 horas de cultivo de células mononucleares de sangre periférica I (PBMC) humanas estimuladas con una respuesta a la dosis ele Chirl 2.12 (círculo hueco), mAb1 (círculo negro), mAb2 (cuadro negro), mAb3 (triángulo negro), el CD40L humano control de isotipo (rombo negro) co-estimulados en 75 nanogramos/mililitro de IL-4. i i La Figura 4 muestra la incorporación de 3H-timidina después de 72 horas de cultivo de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas estimuladas con 20 microgramos/mililitro de CD40L con una respuesta a la dosis de C h i r 12.12 (círculo hueco), mA'bl (círculo negro), mAb2 (cuadro negro), mAb3 (triángulo negro) ó el CD40L humano (cuadro hueco).

La Figura 5 muestra el enlace dependiente de la dosis el e I anticuerpo anti-CD40 humano para las líneas celulares BJÁB, respectivamente, Chir12.12 (círculo negro), mAb1 (cuadro hueco), mAb2 (triángulo hueco), mAb3 (triángulo negro).

EJEMPLOS Materiales j 1. Anticuerpos monoclonales I Se proporcionaron Chir12.12 (1.9 miligramos/mililitro), mAb1 (0.88 miligramos/mililitro), mAb2 (1.9 miligramos/mililitro), y mAb3 (1.9 miligramos/mililitro) en Citrato 50 mM, pH de 7.0, NaCI 140 rhM. También se utilizó un control de isotipo de IgG para los experimentos de selección (Sigma, St. Louis, EUA). 2. Estímulos de activación de células-B ¡ El fragmento F(ab')2 AfiniPure de IgM de conejo anti-humaho se obtuvo en Jackson Immuno Research (Suffolk, Reino Unido), y ¡el CpG2006 se obtuvo en Microsynth (Balgach, Suiza). El CD40L humano recombinante se generó empleando los procedimientos convencionales conocidos por aquéllos de una experiencia ordinaria en este campo. El sobrenadante que contenía la IL-4 humana se generó empleando los procedimientos convencionales conocidos por aquéllos de una experiencia ordinaria en este campo. 3. Reactivos de cultivo de tejido in vitro Medio de cultivo de células mononucleares de sangre periférica (PBMC): RPMI-1640, suero bovino fetal (FBS) al 10 por ciento, Penicilina/Estreptomicina al 1 por ciento, aminoácidos no esencia es al 1 por ciento, piruvato de sodio al 1 por ciento, ß-mercaptoetanol 5 mM (todos de Invitrogen, San Diego, EUA).

Métodos 1. Ensayo de proliferación de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) mediada por CD40L 1.1 Purificación de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) humanas Las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) se purificaron a partir de recubrimientos esponjosos de sangre entejra obtenidos a partir de voluntarios sanos (Blutspendezentrum, i Basilea). Los recubrimientos esponjosos se diluyeron a 1:4 con suejro regulado con fosfato (PBS) sin Ca2+ y Mg2+ que contenía EDTA mM, y se hicieron alícuotas de 25 mililitros en tubos Falcon de 50 mililitros. Los recubrimientos esponjosos diluidos se respaldaron con 14 mililitros de Ficoll-Plaque más (GE Healthcare) por tubo Falcon, y se centrifugaron a temperatura ambiente durante 20 minutos a 2,250 revoluciones por minuto (sin frenar). En seguida de la centrifugación, la capa de interfase se transfirió a un solo tubo Falcon de 50 j mililitros. Las capas de interfase a partir de múltiples tubos (a partir i de un solo donador) se combinaron hasta un volumen de 30 mililitros.

Se agregó suero regulado con fosfato (PBS) complementado con i EDTA 5 mM, y las células se centrifugaron a temperatura ambiente durante 5 minutos a 2,250 revoluciones por minuto. El sobrenadante se desechó antes de la adición de 15 mililitros de regulador de is de glóbulos rojos sanguíneos (RBC), y de la incubación a temperatura ambiente durante 5 minutos. Subsiguientemente, se agregaron 20 mililitros de suero regulado con fosfato (PBS)/EDTA5 mM, y las células se centrifugaron nuevamente (a temperatura ambiente/5 minutos, a 2,250 revoluciones por minuto). Las células se lavaron dos veces en suero regulado con fosfato(P BS)/E DTA 5 m M (con interviniendo pasos de centrifugación), y se volvieron suspender en 35 mililitros del medio de células mononucleares be sangre periférica (PBMC) antes de la determinación del número Le células viables utilizando exclusión con tinte Trypan Blue. Las células que no se usaron inmediatamente para la estimulación ¡n vitro se crioconservaron. ¡ I 1.2 Ensayo de estimulación de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) in vitro de 5 microgramos/mililitro de F(ab')2 anti-lgM, CpG2006 1 µ?, ¡el ! sobrenadante que contenía la IL-4 humana (75 nanogramos/mililitro), ó 40 microgramos/mililitro de huCD40L recombinante (las ? concentraciones finales indicadas). Las concentraciones iniciales de cada mAb anti-CD40 estuvieron en el intervalo de 20 microgranios/ mililitro a 100 microgramos/mililitro, dependiendo del experimento.

Se utilizó el CD40L en la respuesta a la dosis como un control positivo para todos los experimentos. Las dosis de anti-lg|M, CpG2006, IL-4 y CD40L se seleccionaron basándose en líos experimentos anteriores, en donde se evaluó la capacidad de estíos reactivos (solos o en combinación) para inducir las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) o la proliferación de células-B, en la respuesta a la dosis (no se muestran los datos). Las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) (densidad final de 8x104 por pozo) se agregaron subsiguientemente a cada pozo antes de la incubación durante 3 días a 37°C / C02 al 5 por ciento. Se agregó 3H-timidina (1 µ??/50 microlitros/pozo) a cada pozo I durante las 6 horas de cultivo finales antes de la cosecha, y la i determinación de la incorporación de timidina utilizando un contador i de centelleo MicroBetaTrilux. Observe que se incluyeron las células más el medio, y las células más el medio más los cultivos de control anti-lgM, IL-4, CpG2006 o CD40L (en ausencia de los mAbs CD40) en cada experimento.

Los datos de centelleo se analizaron utilizando Excel software GraphPad Prism. Los resultados se presentan como los recuentos promedio por minuto (cpm) (+/- error estándar del promedio) contra una transformación log de la concentración del mAb anti-CD40. En cada gráfica se indican los niveles del fondo de los controles positivos y de las células más el medio. Los valores IC50 ó EC50 se calcularon sujetos a un ajuste de la curva de éxito de los datos mediante Prism. 1 2. Ensayo de agonista de células mononucleares de sangre periférica (PB C) in vitro Las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) humanas se estimularon como se indica en el párrafo 1.2 antefi!or, con una respuesta a la dosis de Chir12.12, mAb1, mAb2 o mAb3 j durante 3 días, ya sea en ausencia de co-estimulación o bien en la presencia de cualquiera de 5 microgramos/mililitro de F(ab')2 arnti-IgM o CpG2006 1 µ?. La proliferación se evaluó por la incorporac ón de 3H-timidina después de 72 horas de cultivo. Los resultados se presentan como el promedio de los cultivos triplicados con el SEl† y son representativos de 4 donadores (experimentos independientes). 3. Ensayo de ADCC Se agregaron 50 microlitros de una suspensión de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) (10 x 106 células/mililitro) a los pozos de fondo redondo (Corning Incorporated - Costar #3790), y se agregaron 50 microlitros de células Raji teñidas con calceína a (2 x 105 células/mililitro), y 100 microlitros de dilución de anticuerpo o los controles. La máxima lisis se determinó en Tritón 100 al 2 por ciento.

Las células se recolectaron en el fondo de la placa (3 minutos a 250 g), y se incubaron a 37°C en una atmósfera de C02 (al 5 por ciento) humidificada durante 1 hora. Las células se separaron del medio mediante centrifugación (3 minutos a 750 g), y se transfirieron 100 microlitros del sobrenadante a una placa negra de fondo transparente (Corning Incorporated - Costar #3904) para la mediciójn.

! ! I La fluorescencia se determinó a 535 nanómetros después de¡la i excitación a 485 nanómetros con un espectrómetro SpectraMax ! Gemini (Molecular Devices). La lisis específica se calculó utilizando i la siguiente fórmula: (liberación experimental - liberación espontánea) / (máxima j liberación - liberación espontánea) x 100. 4. Enlace de variantes de anticuerpos anti-CD40 humanos la línea celular BJAB humana ¡ Se utilizó citometría de flujo, con el objeto de comparar ¡el enlace de las diferentes variantes de Fe de anticuerpos anti-CD40 con su enlace a las células BJAB humanas. Por consiguiente, 'se I sembraron 2 x 105 células por pozo en una placa de fondo en V de 96 pozos. Las placas se lavaron dos veces con 200 microlitros de regulador FACS (suero regulado con fosfato (PBS), suero fetal de becerro (FCS) al 5 por ciento, EDTA 2 mM) durante 2 minutos a 4°C a 1,350 x g. Los sobrenadantes se desecharon, y las células se volvieron a suspender en 100 mililitros de regulador FACS que contenía suero humano al 8 por ciento (InVitromex, Cat. No. S4190), y se incubaron durante 10 minutos. Después de dos lavados, se agregaron las variantes de Fe anti-CD40 humano en 50 microlitros Le regulador FACS con suero humano al 1 por ciento, empezando cón una concentración de 10 microgramos/mililitro en una dilución a 1:2. Las células se incubaron durante 30 minutos sobre hielo, seguido por dos pasos de lavado. A cada pozo se le agregaron 50 microlitros de FITC de conejo policlonal anti-lgG humana, F(ab')2 (DAKO, Cat. tJp.

F 0315), y se incubaron durante 30 minutos sobre hielo. Al final de )a incubación, las células se lavaron dos veces, se volvieron ja suspender en 100 microlitros de regulador FACS, y se adquirieron én un FACS Cantoll. ! i Después de la adquisición, se adquirió la intensidad de fluorescencia promedio del canal de FITC en FloJo. La graficacióh |y el ajuste de la curva se llevaron a cabo con GraphPad Prism 5.0. Debido a las intensidades cambiantes entre los experimento¡s individuales, se normalizaron los valores. Por consiguiente, el valor más alto de cada serie de prueba de anticuerpo se igualó al 100 pdr I ciento. Los ajustes de curva no lineales se llevaron a cabo con los valores de porcentaje. 5. Ensayo de producción de citoquina mediada por CD40L en células dendríticas derivadas de monocitos (MoDCs) 5.1 Preparación de células dendríticas derivadas de monocitos humanos Las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) humanas se prepararon a partir de los recubrimientos esponjosos humanos proporcionados por la Cruz Roja Suiza. El recubrimiento esponjoso se diluyó a 1:5 en suero regulado con fosfato (PBS) (Invitrogen, Cat. No. 20012019), y se distribuyó en alícuotas de mililitros en tubos Falcon de 50 mililitros. Subsiguientemente, se aplicaron 13 mililitros de Ficoll (GE Healthcare, Cat. No. 17 1440-02) I a cada tubo. Las células se centrifugaron a 1,680 x g a temperatura i ambiente durante 20 minutos sin romperse. La capa que contenía las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) se recolectó y se lavó dos veces en un volumen grande de suero regulado cjon fosfato (PBS) durante 5 minutos a 1,000 x g. Finalmente, las células se volvieron a suspender en 10 mililitros de suero regulado don fosfato (PBS) y se contaron. ¡ Los monocitos humanos se aislaron negativamente a partir :de 100 x 107 células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) utilizando el kit II de aislamiento de monocitos humanos de Miltényi (Miltényi, Alemania, Cat. No. 130-091-153) en un instrumento AutoMACS de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Despulés i ? 105 del aislamiento, células se lavaron dos veces durante 5 minutos a 1,000 x g a 4°C en el medio de cultivo (RPMI1640 (Invitrogen, Cat. No. 61870010), suero fetal de becerro (FCS) al 10 por ciento (Invitrogen, Cat. No.16000044, origen de los Estados Unidos), piruvato de sodio 1 mM (Invitrogen, Cat. No. 11360039), 1 x NEAA (Invitrogen, Cat. No. 11140035) 1 x Penicilina/Estreptomicina (Invitrogen, Cat. No. 15140122)). Los monocitos aislados ¡se contaron, se 106/mililitro, por ciento. dendríticas, GM-CSF humano [100 nanogramos/mililitro] recombinantes (ambos producidos internamente en la empresa) al medio de cultivo al i n i |c i o del cultivo. j 5.2 Estimulación de células dendríticas (DCs) para la liberación i de citoquina j Las células dendríticas (DCs) inmaduras se cosecharon ! después de 7 días de cultivo enjuagando las placas de 6 pozos, reservando las células, y lavándolas dos veces durante 5 minutos a i 1,400 x g en el medio de cultivo. Subsiguientemente, se sembraron 2 x 105 células dendríticas inmaduras (¡DCs) en placas de fondo plano i de 96 pozos (Becton Dickinson, Cat. No. 353072) a 100 microlitrós Para el control positivo, las células se estimularon con MegaCD4:0L (Alexis, Cat. No. ALX-522-110-C010) en una concentración de! 1 microgramo/mililitro, el control negativo consistió en las células ? ? dendriticas inmaduras (¡DCs) en el medio solamente. En el ensayo de antagonismo, se agregaron las variantes Fe del anticuerpo anti-CD40 humano a 10 microgramos/mililitro en una dilución a 1:2, ju nto con 1 microgramo/mililitro de MegaCD40L para una respuesta a la dosis. Los sobrenadantes de las células estimuladas se recolectaron 24 horas después para la medición del TNFa. En el ensayo de agonismo, se agregaron las variantes Fe del anticuerpo anti-CD^O humano a 10 microgramos/mililitro en una dilución a 1:2 solamentej, y los sobrenadantes se recolectaron después de 48 horas para la medición del TNFa. Las células se sembraron y se estimularon por triplicado para todos los ensayos. 5.3 Medición del TNF-alfa mediante ELISA Con el fin de medir la cantidad de TNFa en los sobrenadantes se llevó a cabo el ELISA como sigue. Se recubrió el anticuerpo de captura anti-TNFa (BD Pharmingen, Cat. No. 551220) en las placjas ELISA (Greiner, Nunc F96 axisorp, Cat. No. microgramos/mililitro, en 50 microlitros por pozo, dura 4°C. Por cada paso de lavado, las placas se lavaron 3 microlitros en una lavadora de placas BioTek ELx 405. Después del primer lavado, se incubaron 200 microlitros de Superblock TBS i (Thermo Scientific, Pierce, Cat. No. 37535) durante 1 hora a 37° .

En seguida, se agregó el estándar de TNFa (TNFa humaho i recombinante, R&D Systems, Cat. No. 210-TA) o la muestra, en 25 microlitros. El estándar empezó en una concentración final de 20 nanogramos/mililitro en una serie de dilución a 1:2. En adición, se agregaron 25 microlitros del anticuerpo de detección (TN Fa-biotina anti-humano, BD Pharmingen, Cat. No. 554511), en una dilución a 1:500. Las placas se incubaron durante la noche a 4°C. Después de i lavar, se agregó el conjugado de Avidina-POD (fosfatasa alcalina ExtrAV, Sigma, Cat. No. E-2636) diluido a 1:5000 en Superblock TBS, en 50 microlitros, y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron, y se agregaron 50 microlitros Leí sustrato de fosfato de p-nitro-fenilo (Sigma, Cat. No. C-3041), pára revelar durante 15 minutos. Las placas ELISA se leyeron a 450 nanómetros con el software SoftMax Pro en un SpectraMax M5 (Molecular Devices). 6. Estudio de toxicología El propósito inicial primario del estudio de toxicología f|ue investigar la toxicidad potencial del mAb1 en una dosis alta (?|?? miligramos/kilogramo) en comparación con el Chir12.12. j Se utilizaron treinta monos cinomolgos de origen de Mauritania para este estudio. Al inicio de la dosificación, los animales eran de I aproximadamente 4 a 5 años de edad, y pesaban de 4.5 a 6.6 kilogramos los machos, y de 3.1 a 4.3 kilogramos las hembras. ! El mAb1 (50 miligramos/mililitro) se administró intravenosamente a un grupo de monos cinomolgos (5 machos75 hembras; grupo 2) en un nivel de dosis de 100 miligramos/kilogramo y en un volumen de dosis de 2 mililitros/kilogramo una vez pjor semana durante 5 semanas (aplicaciones del artículo de prueba en los días 1, 8, 15, 22, 29, y 36). Un grupo adicional de monos ? cinomolgos (5 machos/5 hembras; grupo 3) recibió el anticuerpo progenitor Chir12.12 intravenosamente mediante infusión lenta de bolo en un nivel de dosis de 100 miligramos/kilogramo y en un volumen de dosis de 5 mililitros/kilogramo. Se dio el placebo del mAb1 en un volumen de dosis de 2 mililitros/kilogramo po de monos cinomolgos, los cuales sirvieron como (5 machos/5 hembras; grupo 1). Todos los animales se sometieron a i necropsia uno o dos días después de la última dosificación. ' i Se decidió incorporar una inmunización con hemocianiná | dé lapa californiana (KLH) con el objeto de evaluar la eficacia de arnlos I i Abs ant¡-CD40. En el día 2, los animales se inmunizaron cori 1 miligramo de KLH in Alum seguida por una inyección de refuerzo de 0.5 miligramos de hemocianiná de lapa californiana (KLH) en Alum en el día 23. El suero se muestreó antes de la inmunizació así como en los días 7 y 14 después de la inmuniza refuerzo, respectivamente. Se determinaron las titulaciones |de Ig /lgG específicas de la hemocianiná de lapa californiana (KÜH) con el ELISA utilizando el suero de referencia de IgM/lgG anti- H de mono cinomolgo como estándar. La sangre se muestreó enj 3 ocasiones antes de la dosis y en el día 15, 29 y en la necropsia (día i 37/38) para la inmunofenotipificación de las células-B pu^as (CD20+CD21 +CD27-). Los recuentos absolutos de las células-B CD20 puras se calcularon a partir del recuento total de linfocitos por muestra de sangre, y el recuento relativo de células-B CD20 purjas mediante citometría de flujo. í Tabla 4 Compendio del Estudio de Toxicología Basándose en el peso corporal individual más reciente.

La evaluación de la toxicidad se basó en la mortalidad, en lás i observaciones clínicas (signos clínicos, incluyendo las observaciones después de la dosificación, la evaluación de lás heces, la inspección de la piel, y el consumo de alimento), los pesos i corporales, los exámenes oftálmicos, las investigaciones i cardiovasculares la patología clínica (incluyendo coagulación, exámenes externos de activación de plaquetas, hematología, química i clínica, y análisis de orina), los pesos de los órganos, y los i descubrimientos macroscópicos y microscópicos de la necropsia, lia inmunofenotipificación de la sangre se llevó a cabo tres veces antis de la dosis, en los días 15 y 29 de la fase de dosificación, así corrió i en el día de la necropsia. Adicionalmente, se llevó a cabo ía inm unofenotipificación del tejido del bazo y el drenado de los ganglios linfáticos del sitio de inyección de la hemocianina de lapa californiana (KLH) en la necropsia. En adición, se examinó la respuesta del anticuerpo dependiente de las células-T (TDAR) a la hemocianina de lapa californiana (KLH), para comparar directamente la influencia del C h i r 12.12 completamente capaz de tener ADCC con el mAbl. Se recolectó la sangre de todos los animales para la evaluación toxicocinética, y para una posible evaluación del anticuerpo anti-fármaco (ADA). ¡ 7. Perfilación adicional in vitro del mAbl 7.1 Purificación de las células monon ucleares de sangre periférica (PBMC) Las células mononucleares de sangre periférica (PBMCjs) humanas se prepararon como se describe anteriormente en jla sección 1.1. ¡ 7.2 Purificación de células-B de amígdalas humanas ¡ Se removió la cápsula de la amígdala y el tejido conectivo, j y después se cortó el material de la amígdala en pedazos grandes ele i aproximadamente 5 milímetros antes de machacarse a través de un cernidor de células metálico, lavando regularmente con el medio de células-B. Las células de las amígdalas se filtraron entonces dos i veces a través de un cernidor de células de 70 mieras, con el objeto de remover el desecho celular. Las células-B se aislaron de las I j células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) frescas i utilizando un Kit de Enriquecimiento de Células-B Humanas d¡e Selección Negativa EasySep (Stemcell Technologies, Vancouver, BC, Canadá). Las células-B se purificaron utilizando un Kit de j Enriquecimiento de Células-B Humanas de Selección Negativa EasySep de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Stemcell Technologies, Vancouver, BC, Canadá). 7.3 Evaluación de los valores EC50 del enlace de CD40 utilizando células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) i humanas y de primate no humano o células-B j Las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) (de mono rhesus, de mono cinomolgo, o humanas) o las células-B de las amígdalas (humanas solamente) se incubaron a 4°C durante j30 minutos con el mAb1 marcado purificado o con los anticuerpos de control de ¡sotipo en la respuesta a la dosis (intervalo de concentración final de 2.5 microgramos / mililitro - 0.00125 j microgramos / mililitro). Las células subsiguientemente se lavaron antes de incubarse con un anticuerpo de IgG anti-humano (que i reacciona cruzadamente con primate no humano), y anti-hum no biotinilado con una reactividad cruzada mínima con las NHPs (RIO; observe que fue posible distinguir las células-B humanas qíue expresaban la IgG de membrana, ya sea incluyendo una cepa anti-IgM, o bien por medio de la intensidad diferencial del teñido con FACS). Las células nuevamente se incubaron a 4°C durante 30 minutos antes de lavarse, y se sometieron a un teñido final con estreptavídina-FITC durante 20 minutos a 4°C. Las células subsiguientemente se lavaron, y se llevó a cabo la evaluación de'j la ¡ I i expresión de CD40 en las células CD20+ mediante citometría ¡de flujo. 7.4 Evaluación de la inhibición de la proliferación inducida por CD154 de las células mononucleares ca (PBMCs) humanas y de primate no humano Se hicieron series de dilución dobles de siete puntos de cada mAb anti-CD40 o de control de isotipo por triplicado en placas de 96 pozos en la presencia de concentraciones EC80 de CD154 e lí-4 humanas recombinantes. Las concentraciones iniciales de cada m|Ab anti-CD40 estuvieron en el intervalo de 20 microgramos/mililitro^ a 100 microgramos/mililitro y los controles del medio todos los experimentos. pozo las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) (¡de mono rhesus, de mono cinomolgo, o humanas) o las células-B de las amígdalas (humanas solamente) antes de la incubac días a 37°C / C02 al 5 por ciento. A cada pozo se timidina (1 pCi/50 microlitros/ pozo), durante las 6 horas finales del cultivo antes de de la cosecha y de la determinación de ¡la incorporación de timidina utilizando un contador de centelleo. i 8. Eficacia del mAb1 combinado con ciclosporina A en un modelo de alo-trasplante de riñon en mono cinomolgo 8.1 Animales ¡ Todos los monos cinomolgos (Macaca fascicularis) utilizados fueron machos de 7.5 a 9 años de edad (#5529/#5533, #5523/#5524 y #5536/#5538), criados en cautividad, de 7.7 ± 0.9 kilogramos1, y originados de las Filipinas (Siconbrec, Makati City, Filipinas). En el momento del trasplante, los animales presentaron análisis norma es de hematología y de química de suero/orina, y fueron negativos para tuberculosis, Salmonela/Shigella, para anticuerpos contra agentes virales (HerpesB, virus de leucemia de células-T de simio, virus de inmunodeficiencia de simio, retrovirus tipo D de simio, Hepatitis B) , y para los ecto/endoparásitos relevantes. Sin embargo, todos líos animales presentaron anticuerpos contra Citomegalovirus y Virus Hepatitis A (HAV) (probados en el 2010; el animal #5536 fue negativo para HAV). La coprología del animal #5523 probó ser i positiva para Balantidium coli en Diciembre de 2010. | Durante la primera semana después de la cirugía, los animales se alojaron en jaulas individuales de telemetría, permitiendo !el contacto visual entre ellos. El resto del tiempo, los animales #5536/#5538 se alojaron juntos, y los 4 animales restantes se mantuvieron aislados durante todo el experimento (animales incompatibles). Todos los animales se alojaron bajo una temperatura sostenida (20-24°C), con cuando menos el 40 por ciento de humedad, y con un ciclo de luz natural. Todos se alimentaron cuando menos dos veces al día con mezcla de frutas y verduras. Se I proporcionaron agua y gránulos Kliba Nafag 3446 (Kaiseraugst, i Alemania) al gusto.

Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con los Reglamentos Suizos de Bienestar Animal y bajo la licencia BS1555.¡ Tabla 5 Características del animal 8.2 Condiciones experimentales 8.2.1 Trasplante de riñón, y monitoreo post-operatorio Los pares de donador/receptor se seleccionaron de acuerjdo con el emparejamiento ABO, mal emparejamiento exón2 Dlj¾B (Blancher A, Tisseyre P, Dutaur M y colaboradores (2006) Immunogenetics; 58(4): 269-82), y las respuestas en la reacción 'de i linfocitos mixtos de una vía (MLR), con índices de estimulación de MLR (MLR-SIs) >7 y <47 (Bigaud M, Maurer C, Vedrina colaboradores (2004) J. Pharmacol. Toxicol. Methods; 50(2): 153-9). Los resultados de esta selección se muestran en la Tabla 6 , 1 y consistieron en duo-trasplante (trasplante intercambiado entre ¡ 2 donadores). A cada receptor se le implantó una sonda telemétrica (Data Sciences Inc, EUA) para monitorear la presión sanguínea arterial, la frecuencia cardíaca, y la actividad motora.

Para la cirugía, se indujo anestesia general mediante quetamina; 10 miligramos/kilogramo, intramuscularmente (i.t i ), i asociada con atropina (0.05 miligramos/kilogramo intramuscularmente (i.m.)). y se mantuvo mediante ventilación con i N20/02 (50:50), y propofol intravenosamente (i.v.) (de 4 a j10 I miligramos/kilogramo/hora; complementado por 5 a 10 miligramos |de bolo siempre que se requiriera). Los ríñones de los donadores se cosecharon, se inundaron con solución de la Universidad de Wisconsin fría (4°C) (tiempo de conservación fría < 4 horas), y se trasplantaron heterotópicamente, empleando técnicas i microvasculares convencionales para crear una anastomosis jde extremo a costado entre la vena renal de injerto y la vena cava del receptor, y entre la arteria renal de injerto y la aorta distal del receptor (tiempo de anastomosis < 40 minutos). Se llevó a cabo una uretero-cistoneostomía después de la aparición de orina a partir del injerto. Los ríñones nativos se removieron. Se proporcionó analgesia post-operatoria mediante buprenorfina, de 0.01 a 0.02 miligramos/ kilogramo, intramuscularmente (i.m.), tres veces al día); antibióticos (cefotaxima, 25 miligramos/kilogramo, intramuscularmente (i.m.), dos veces al día; o ceftriaxón, 50 intramuscularmente (i.m.) en lidocaína al 1 po al día). La analgesia y los antibióticos se proporcionaron durante! 5 i días. Siempre que los recuentos de plaquetas experimentaban †n aumento notorio o disminuían, se administraba aspirina en una dosjis de 5 miligramos/kilogramo intramuscularmente (i.m.) al día (Aspegijc, Sanofi-Aventis, Meyrin, Suiza). j Los receptores se monitorearon para detectar los cambios en las condiciones clínicas y cardiovasculares, el peso corporal, , la ingestión de alimento y agua (complementado con max. de 100 a 150 mililitros/kilogramo/día), la producción de orina, la hematología (usando el Beckmann Coulter ACT5Diff), la química en suero y oJna (usando un analizador Vetscan para la determinación diaria :de SCrea/SUrea/SAmilasa y un analizador Beckmann Synchron CX5 i para la confirmación final de las muestras de suero y orina). Se utilizaron los niveles en suero de creatinina (SCrea) y urea (SUrea) i como marcadores de la función del injerto. Se llevaron a cabo biopsias transcutáneas guiadas por ultrasonido, con una aguja calibre 16g, como se describe anteriormente (Gaschen L, Kunkler L , Menninger K y colaboradores (2001) Vet. Radiol. Ultrasound; 42(3): 259-64), bajo anestesia general en el día 30 (animales #5529 #5533, solamente). En adición, también se llevó a cabo un monitoréo especial para la coagulabilidad de la sangre y la acumulación de plaquetas en los animales #5529/#5533 y #5523/#5524 antes !y después del trasplante. J Los receptores finalmente se eutanizaron en el caso de: (¡i) i falla grave del injerto (por ejemplo, SCrea >500 micromoles/litro 'o i SUrea >20 milimoles/litro) asociada o no con un aumento en él puntaje del ultrasonido; o (ii) problemas de salud general y/o signos clínicos evidentes de malestar. En la necropsia, se recolectaron lo¡s i aloinjertos de riñon (incluyendo uréter y anastomosis), junto co i ! todos los otros órganos mayores, y se procesaron para el siguiente análisis histológico. j Tabla 6 Información general acerca de las combinaciones de donador/receptor y regímenes de tratamiento empleados 8.2.2 Tratamientos con mAb1 y ciclosporina A (CsA) .

El mAb1 se proporcionó en una forma líquida recién descongelada en el día de la infusión desde -80°C. Se hizo ¡ la aplicación de 30 miligramos/kilogramo/intravenosamente (i.v.) una vez por semana, exceptuando las primeras tres dosis en el día -l[ 0 y 1 (antes y después del trasplante). La CsA para administración o!ral (p.o.) fue una solución para beber de un pre-concentrado en microemulsión (Sandimmun Neoral (RTM), 100 miligramos/mililitro, Novartis Pharma AG). La CsA se aplicó en una dosis diaria (empezando en el día -1) de 20 miligramos/kilogramo/oralmente (p.o.), en combinación con el mAb1 (véase la Tabla 6). 8.2.3 Monitoreo de la farmacocinética (PK), la inmunogenic (anticuerpo de primate anti-humano), y la farmacodinamia del mAb1 Se recolectaron muestras de sangre (500 microlitros de suero) (antes de la dosificación intravenosa (i.v.)) para la determinación !de las exposiciones al mAb1 en el día -1, 3, 7 (línea basal y 15 minutos), 14, 28, 42, 56, 70, 84 y 100. Para las determinaciones 'de la CsA, se recolectaron muestras de sangre antes de la dosificación I oral de la CsA (C0/C24), y 2 horas después de la aplicación (C2). C2 corresponde a los niveles pico de absorción de CsA. Todo el material se almacenó a -80°C hasta su procesamiento adicional (kit ele detección de CsA, Hot Star Taq Master Mix, Qiagen Minnesota, US). i Las muestras para la inmunogenicidad del mAb1 se recolectaron (50 microlitros de suero) en los días -1, 7, 14, 28, 42, 56, 70, 84 y 100|y se mantuvieron congeladas a -80°C. Dicho de una manera breve, las i placas de microtitulación de 96 pozos se recubrieron con el CD40 humano recombinante. Éstas se almacenaron a una temperatura nominal de 4°C durante la noche. En seguida del bloqueo, se agregaron a control de ca mAbl. La pl durante 120 minutos con agitación. En seguida del lavado de ía placa, se agregó a la placa el anticuerpo de cadena ligera kappa de ratón anti-humano, seguido por el conjugado de cabra anti-ratón/H (H + L), para detectar cualquier mAb1 enlazado al CD40 recombinante. Éste se visualizó mediante la adición de un sustra Ito cromogénico (TMB), y la intensidad del color producido (absorbencia) fue directamente proporcional a la concentración del mAb1 presente.

La concentración del mAb1 en las muestras se retro-calculó entonces I a partir de una curva de calibración. Las muestras farmacodinámicjas (PD) se obtuvieron de 2 a 3 días antes del trasplante como las líneas básales (0.5 mililitros en heparina). Después de la recolección, se siguió el mismo programa que para las muestras farmacocinéticas (PK). Las células CD20+ y CD3+ se contaron con Tubos TruCount (Becton Dickinson, cat# 340334) utilizados de acuerdo con las instrucciones del fabricante con un mAb APC anti-CD40 humaijio (Clon 5C3, Becton Dickinson, cat# 555591), un PerCP anti-CD3 ¡ humano (Clon SP34-2, Becton Dickinson, cat# 552851), y un mAb FITC anti-CD20 humano (Clon LT20, Immunotools, cat# I 21279203X2). Los datos se adquirieron en un citómetro de flujo LSRII (Becton Dickinson Biosciences) utilizando el software DIV'A (versión 6.1.1). Los linfocitos y las perlas se pasaron a la gráfica d'e puntos de FSC/SSC de acuerdo con los tamaños y la granularidad, jy i se analizaron adicionalmente para la expresión de CD20 y CD3. j 8.2.4 Histología ! Todos los tejidos recolectados (biopsias de injerto o en la necropsia) se examinaron macroscópicamente y se fijaron formalina regulada al 4 por ciento. Después de la deshidratación , i se empotraron en cera de parafina. Se cortaron secciones de 3 mieras de espesor a partir de los bloques de parafina, y se tiñeron c|on hematoxilina y eosina (HE). Se llevaron a cabo tres teñidos adicionales (ácido peryódico de Schiff, tricromo, y Verhoeff) en las secciones de riñon. Las muestras de la biopsia y de la necropsia i fueron examinadas por un patólogo experimentado, y se calificar!on de acuerdo con la clasificación de patología de aloinjerto renal 07 de Banff (Solez K, Colvin RB, Racusen LC y colaboradores (2008) Am. J. Transplant; 8(4): 753-60). Los expertos externos también llevaron a cabo la revisión del compañero.

En adición, se llevó a cabo la ¡nmunohistoquímica para proteína de complemento C4d utilizando un anticuerpo polivalente anti-C4d adecuado para teñir las secciones de parafina (Régele H, Exner M, Watschinger B y colaboradores, 2001, Nephrol. Dial. Transplant; 16: 2058-2066). C4b se considera como un marcadpr estable y confiable del rechazo humoral agudo (AHR). Después de lia fijación y del empotramiento en cera de parafina, se prepararon portaobjetos (SuperFrostPIus, RTM, Menzel-Glaeser, Alemania) con las secciones de 3 mieras de espesor, y se secaron durante la noche en un horno a 37°C para la adhesión óptima a los portaobjetos. Se i agregaron las secciones de riñon humano rechazadas como un control positivo. "¡ i Antes de usarse, los portaobjetos se desparafinizaron ejn Xileno (10 minutos), se rehidrataron a través de etanol graduado, jy se colocaron en agua destilada. La recuperación del antígeno se llevó a cabo cocimiento a presión durante 10 minutos a 1 bar| el regulador de citrato (pH de 6.0), como se describió anteriormente (Segerer S, Mack M, Régele H, Kerjaschki D, Schlóndorff D. Kidrjey Int. 1999; 56: 52-64). Para el inmunoteñido, se empleó el siguiejite procedimiento: (i) se inactiva la peroxidasa endógena por ciento en metanol absoluto durante 20 minutos ambiente; (ii) se lavan los portaobjetos en suero regul (PBS) 0.01 M, pH de 7.4 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Alemania); (iü) se incuban los portaobjetos con leche descremada en polvo ai 4 por ciento " apilait" en suero regulado con fosfato (PBS) (Migrjos Genossenschaftsbund, Suiza) durante 60 minutos a temperatura ambiente; se destara, no se lava; (iv) se incuba un portaobjetos cjon el pAb C4d de conejo anti-humano (Biomedica Medizinprodukje, Viena, Austria), 1:40, en suero regulado con fosfato (PBS) que i contiene NGtS al 1 por ciento durante la noche a +4°C. El segundo portaobjetos sirve como un control negativo mediante la aplicación de control de isotipo de conejo (Zymed Laboratories Inc, ÉUA) en i lugar del anticuerpo primario; (v) se lavan los portaobjetos en suero regulado con fosfato (PBS) 0.01 M, pH de 7.4; (vi) se incuban todós los portaobjetos con IgG biotinilada de cabra anti-conejo (Vect'pr Laboratories, Inc. EUA), 1:200, en suero regulado con fosfato (PBS) i I que contiene NGtS al 1 por ciento durante 30 minutos a temperatura ambiente; (vii) se lavan los portaobjetos en suero regulado con i fosfato (PBS) 0.01 M, pH de 7.4; (viii) se incuban cón i i estreptavidina/HRP (Vector Laboratories, Inc. EUA) en su regulado con fosfato (PBS) durante 30 minutos a temperat ambiente, (ix) se revela la actividad de HRP con AEC + (DakoCytomation Corp., Carpenteria, EUA) durante 8 a 10 minutos, controlando la intensidad del teñido microscópicamente, se lava en agua destilada, (x) se contra-tiñe con Dako (RTM) Automation Hematoxilina (DakoCytomation Corp., Carpenteria, EUA) durantej 2 minutos y de azul en agua del grifo corriente durante 5 minutos; (jxi) se monta con un medio de montaje acuoso (Medite Medizintechijiik I AG, Suiza). | Ejemplo 1: Evaluación de la actividad agonista de los mAb1, I mAb2 y mAb3 | Los datos experimentales se basan en el uso de las células mononucieares de sangre periférica (PBMCs) humanas primarias no fraccionadas aisladas. Las preparaciones de las células mononucieares de sangre periférica (PBMCs), se determinó que los mAbs aglicosilados mAb1 anti-CD40 (N297A) y mAb2 (D265A), lojs cuales conservaron la secuencia de aminoácidos de la porción d!e enlace de antígeno sin cambios a partir del anticuerpo progenitor Chir12.12, conservaron las propiedades de bloqueo de CD40L n'o agonistas del mAb Chir12.12 progenitor. El anticuerpo mAb3 (LÁLA muíante) fue débilmente agonista en la presencia de la IL-4.

En particular, los resultados experimentales muestran que ninguno de los mAbs anti-CD40 de Fe silencioso fue capaz de estimular la división celular mediante las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) humanas (n = 4 donadores), un resultcido similar a aquél observado con el mAb Chir 12.12 progenitor (Véase la Figura 1). Las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) proliferaron en respuesta al CD40L. Cualquiera del mAb1 o el mAb2 pudo mejorar la proliferación inducida por CpG2006 o por el F(ab')2 anti-lgM de las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) (Figura 2). Además el Chir12.12 fracasó para mejorar la proliferación inducida por el F(ab')2 anti-lgM de las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs); sin embargo a diferencia de mAblj y mAb2, inhibió completamente la proliferación de las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) inducida por CpG. I hicieron (Figura 3). Colectivamente, estos resultados indicaron qdie, con la excepción del mAb3 (en la presencia de IL-4), ninguno de ijos mAbs anti-CD40 tuvo actividad agonista alguna. j Los resultados anteriores también demostraron claramente qíue los mAb1 y mAb2 no tuvieron actividad agonista en la presencia de señales co-est¡mulantes. Éste es un hallazgo importante, debido a que es probable que los leucocitos en un paciente con enfermedad autoinmune crónica tengan un fenotipo activado o parcialmente activado y, por consiguiente, sean sensibilizados a la señalización por medio de CD40 u otros estímulos. Se observó que el Chir12 12 (pero no los mAbs de Fe silenciosos o el CD40L) inhibió completamente la proliferación de las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) inducida por CpG2006. CpG2006 es un ligando sintético para el receptor 9 tipo-Toll (TLR9), un receptor cue ha demostrado que se enlaza al ssADN patógeno y derivado {del huésped. En los seres humanos, TL 9 es expresado por las células-B y (hasta un menor grado) por los monocitos de la sangre periférica.

Debido a que anteriormente se ha demostrado que los ODNs que I contienen CpG mejoran la ADCC (Moga y colaboradores, 2008), ¡se puede especular que el CpG2006 es capaz de mejorar la ADCC mediada por la porción Fe de IgG 1 de la línea germinal del mAb C h i r 12.12 progenitor. ¡ i Ejemplo 2: Evaluación de la capacidad de los mAbs aríti- CD40 de Fe silenciosos para bloquear la proliferación de las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) mediada por el CD40L Los datos anteriores indicaron que el Chir12.12 podría bloquear la proliferación mediada por el CD40L de las células-B primarias humanas y de las líneas celulares de linfoma de células!-B humanas. Medimos la inhibición de la proliferación de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) mediada por el CD40L mediante Chir12.12 y los tres anticuerpos de acuerdo con la invención mAb1, mAb2, mAb3. La Tabla 7 más adelante presenta jlos valores IC50 para esta inhibición, tabulados en miligramos/mililitro (los resultados se presentan como el promedio de los cultivos triplicados con el SEM, y son representativos de 4 donadores, en experimentos independientes). Los resultados demuestran que C h ir 12.12 también puede inhibir la proliferación de las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) mediada por el CD40L. i Adicionalmente, los mAb1, mAb2 y mAb3 también bloquearon completamente la división de las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) mediada por el CD40L con una potencia similar a la del C hir12.12. Ninguno de los mAbs anti-CD40 bloqueó | la proliferación de las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) inducida por anti-lgM + IL-2 (no se muestran los dato;s), I sugiriendo que la actividad de bloqueo de los mAbs anti-CD40 éra i dependiente del objetivo (y no estaba relacionada con la función del Fe).

Tabla 7 Valores IC50 para la inhibición mediada por el mAb anti-CD40 la proliferación de las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) (microgramos/mililitro) Ejemplo 3: Enlace de las variantes del anticuerpo anti-CD40 humano a la línea celular BJAB humana Con el fin de excluir los posibles cambios en el enlace específico al CD40, se probó el enlace de las tres variantes mAíl, mAb2 y mAb3 en comparación con el Chir12.12 progenitor sobre ina línea de células-B, BJAB, la cual expresa constitutivamente el CD40. El enlace se probó en una titulación de la dosis empezando en j10 I microgramos/mililitro a una dilución de 1:2. ! Con el objeto de comparar las curvas de los diferen es experimentos, la intensidad de fluorescencia más alta promedio de cada titulación de dosis individual se estableció en el 100 por ciento de enlace, y se aplicó un ajuste de curva no lineal. En dos ! experimentos separados, las cuatro variantes de anticuerpos Chir12.12, mAb1, mAb2 y mAb3 mostraron curvas equivalentes sobre las células BJAB (Figura 5). No observar cambios en las capacidades de enlace de las variantes c¡on las diferentes mutaciones de la región de enlace Fe del Chirl 2.12.

Los resultados anteriores, por consiguiente, demostraron q'ue la mutación del sitio de enlace Fe no tuvo impacto alguno sobré el sitio de enlace del CD40 de las regiones variables del C h i r 12.12 progenitor. Los mAb1, mAb2 y mAb3 conservaron un enlace equivalente de CD40 sobre las células BJAB. I Ejemplo 4: Estimulación/Inhibición de la liberación del TNF-alfa a partir de las células dendríticas derivadas de monocitos humanos, mediante las variantes de Fe anti-CD40 | Estimulación de la liberación del TNF-alfa a partir de las MoDjCs humanas, mediante las variantes de Fe anti-CD40 I Se ha demostrado que algunos anticuerpos anti-CD40 huma'no tienen efectos agonistas sobre diferentes poblaciones de células (Gruber 1989). Con el fin de excluir que las variantes de Fe mAb1, mAb2, mAb3 y Chi r 12.12 conducen a la activación de las MoDC ís, investigamos si los anticuerpos por sí mismos inducen la liberacijón del TNFa cuando se incuban durante 48 horas con las células. En contraste con el ensayo de antagonista, se cultivaron las MoDCs humanas de siete días de edad durante 48 horas solamente en jla presencia de las- cuatro variantes anti-CD40, en una curva ele respuesta a la dosis, empezando en 10 microgramos/mililitrjo. Subsiguientemente, se probaron los sobrenadantes para determinar la cantidad de TNFa mediante un ELISA. Ninguna de las variantes anti-CD40 mAb1, mAb2, mAb3 y Chir 12.12j indujo ¡la liberación del TNFa a partir de las MoDCs, comparándose con jla estimulación con el CD40L como un control positivo (no se muestran los datos). No se pudo observar ninguna dependencia de la dosis con ninguna de las cuatro variantes de anticuerpos. Las cantidades del TNFa no se elevaron de una manera significativa por encima jd el nivel de las MoDCs no estimuladas (no se muestran los datos). Por consiguiente, se pudo excluir una actividad agonista de estos cuatro anticuerpos.

Inhibición de la liberación del TNF-alfa a partir de las M s humanas mediante las variantes de Fe anti-CD40 El anticuerpo Chir12.12 progenitor bloquea la interacción de CD40-CD40L y, por consiguiente, también debe bloquear la activación celular. La estimulación de CD40 sobre las células dendríticas derivadas de monocitos humanos con los trímeros |de i CD40L conduce, por ejemplo, a la liberación de las citoquinas pro-inflamatorias como TNFa (Ma 2009). Nuevamente, el cambio en|la región Fe no debe impactar la función de bloqueo de las variantes jen comparación con el Chirl 2.12. Los cuatro anticuerpos deben inhibir la liberación del TNFa mediada por el CD40L a partir de las MoDCs humanas con una IC50 equivalente. \ Por consiguiente, las MoDCs humanas de siete días de edad se estimularon durante 24 horas con MegaCD40L, una doble construcción recombinante trimérica, en la presencia de las cuatro variantes anti-CD40 bloqueadoras. Subsiguientemente, se probarón los sobrenadantes para determinar la cantidad de TNFa mediante lin I I ELISA. Las variantes mAb1, mAb2 y mAb3 mutadas por Fe mostraron la misma inhibición de respuesta a la dosis que el Chir12.12 en tres experimentos separados (no se muestran los datos). Los resultados i preliminares también muestran una inhibición similar de la liberación de IL-23 a partir de las MoDCs humanas (no se muestran los datoíi)- Se aplicó un ajuste de curva no lineal para estimar la IC50 de los cuatro anticuerpos y se calculó la IC50 promedio a partir de los experimentos. La IC50 promedio de las cuatro variantes para la liberación del TNFa a partir de las MoDCs humanas, está en el intervalo de entre 32 nanogramos/mililitro y 40 nanogramos/mililjtro (Tabla 8). En resumen, las mutaciones en la región Fe no tuvieron impacto alguno sobre los efectos antagonistas de las variantes de anticuerpos.

Tabla 8 IC50 de las diferentes variantes de Fe para la inhibición del TNF-alfa IC50 en nanogramos/mililitro para las diferentes variantes ;de Fe del CD40 anti-humano a partir de tres experimenjos independientes. El ajuste de curva no lineal en el #1 para ¡ el C h ir 12.12 no permitió hacer una estimación válida de la IC50 (n. c. = no calculado).

Por consiguiente, los resultados anteriores muestran que las cuatro variantes fueron inactivas para inducir la liberación del TNFa a partir de las MoDCs. Más importante, todas las variantes mAb1, mAb2 y mAb3 inhibieron la producción de citoquina mediada porj el CD40L por parte de las MoDCs humanas, con una eficacia similarj in vitro comparándose con el Chir12.12.

Ejemplo 5: Compendio de los datos La siguiente Tabla 9 resume algunas de las propiedades importantes de los anticuerpos mAb1, mAb2 y mAb3 de la invención, en comparación con el anticuerpo Chir12.12 progenitor.

Tabla 9 Datos Comparativos I Ejemplo 6: Breve descripción de las secuencias de aminoácidos y de nucleótidos útiles para la práctica de la I i I ? I Ejemplo 7: Secuencias de aminoácido y de nucleótidos útiles para la práctica de la invención | i i SEQ Secuencias detalladas de aminoácidos o de nucleótidós ID NO: VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 10 DIVMTQSPLSLTVTPGEPASISCRSSQSLLYSNGYNYLDWYIL QKPGQSPQVLISLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISR|E AEDVGVYYCMQARQTPFTFGPGTKVDIRRTVAAPSVFIFPRS DEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQES VTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP VTKSFNRGEC 11 QVQLVESGGGVVQPG SLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQjA PGKGLEWVAVISYEESNRYH ADSVKGRFTI SRDNSKITLY j LQMNSLRTED TAVYYCARDGGIAAPGPDYW GQGTLVTVSS ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT ¡ VPSSSLGTQTYICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCFj PCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTP EVTCVVVDVS ¡ I HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYASTYRVVSVLjT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSREE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPVLDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK 12 DIVMTQSPLS LTVTPGEPAS ISCRSSQSLL YSNGYNYLDW: SEQ Secuencias detalladas de aminoácidos o de nucleótidos NO: YLQKPGQSPQVLISLGSNRA SGVPDRFSGS GSGTDFTLK SRVEAEDVGV YYCMQARQTPFTFGPGTKVD IRRTVAAPS|V FIFPPSDEQL KSGTASVVCL LNNFYPREAKVQWKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL SSTLTLSKAD ¡ YEKH KVYACEVTHQGLSSPV TKSFNRGEC I 13 QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS SYGMHWVRQA PGKGLEWVAVISYEESNRYH ADSVKGRFTI SRDNSKITLY LQMNSLRTED TAVYYCARDGGIAAPGPDYW GQGTLVTVSS ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQTYICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTP i EVTCVVVAVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA I KTKPREEQYNSTYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA i LPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSREE MTKNQVSLTC ! LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPVLDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK 14 DIVMTQSPLS LTVTPGEPAS ISCRSSQSLL YSNGYNYLDW, i YLQKPGQSPQVLISLGSNRA SGVPDRFSGS GSGTDFTLKl! SRVEAEDVGV YYCMQARQTPFTFGPGTKVD IRRTVAAPSV SEQ Secuencias detalladas de aminoácidos o de nucleótido NO: FIFPPSDEQL KSGTASVVCL LNNFYPREAKVQWKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL SSTLTLSKAD YEKHKVYACEVTHQGLSSPV TKSFNRGEC 15 QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS I I SYGMHWVRQA PGKGLEWVAVISYEESNRYH ADSVKGRFTI SRDNSKITLY LQMNSLRTED TAVYYCARDGGIAAPGPDYW GQGTLVTVSS ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQTYICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYNSTYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSREE MTKNQVSLTC j LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPVLDSDGSFFLYj i SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT ! QKSLSLSPGK ¡ 16 DIVMTQSPLS LTVTPGEPAS ISCRSSQSLL YSNGYNYLDWj YLQKPGQSPQVLISLGSNRA SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI ¡ SRVEAEDVGV YYCMQARQTPFTFGPGTKVD IRRTVAAPsI FIFPPSDEQL KSGTASVVCL LNNFYPREAKVQWKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL SSTLTLSKAD SEQ Secuencias detalladas de aminoácidos o de nucleótidos ID NO: YEKHKVYACEVTHQGLSSPV TKSFNRGEC 17 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDP VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYR VVSVLTVLHQD PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY TQKSLSLSPGK 18 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPf VKFNWYVDGVEVH AKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD| WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS REEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY TQKSLSLSPGK 19 WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS REEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN YKTTP PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH¡Y TQKSLSLSPGK i 20 CAGGTGCAGTTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAG SEQ Secuencias detalladas de aminoácidos o de nucleótidps ID NO: CCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGAT TCACCTTCAGTAGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGC TCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCAT T GAGGAAAGTAATAGATACCATGCAGACTCCGTGAAGGGG|C GATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGATCACGCTGTÁT CTGCAAATGAACAGCCTCAGAACTGAGGACACGGCTGTG¡T I ATTACTGTGCGAGAGATGGGGGTATAGCAGCACCTGGGC I I CTGACTACTGGGGCCAGGG AACCCTGGTCACCGTCTCCTC AGCAAGTACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCJ CGCTAGCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGG CTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTJG TCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACG I TTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCA1 I GCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCC i AGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACAC I CAAGGTGGACAAGAGAGTTGGTGAGAGGCCAGCACAGGG AGGGAGGGTGTCTGCTGGAAGCCAGGCTCAGCGCTCCTGJ CCTGGACGCATCCCGGCTATGCAGTCCCAGTCCAGGGCAÍ GCAAGGCAGGCCCCGTCTGCCTCTTCACCCGGAGGCCTC¡ I TGCCCGCCCCACTCATGCTCAGGGAGAGGGTCTTCTGGCT TTTTCCCCAGGCTCTGGGCAGGCACAGGCTAGGTGCCCCT AACCCAGGCCCTGCACACAAAGGGGCAGGTGCTGGGCTCi i SEQ Secuencias detal ladas de aminoácidos o de nucleótidos I D NO : CAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGG CTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGC AGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGC ATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTÍC I CCTGTCTCCGGGTAAA 21 GATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGACCGTCA CCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCCAGTC AGAGCCTCCTGTATAGTAATGGATACAACTATTTGGATTG iG TACCTG CTTTGG CAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGATTTTACACTGAAAATC AGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCA TGCAAGCTCGACAAACTCCATTCACTTTCGGCCCTGGGAC í CAAAGTGGATATCAGACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTC TTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAAC TGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAG AGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATC GGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCA i GGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAG I I CAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAA GTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCT I 144 I I ¡ SEQ Secuencias detalladas de aminoácidos o de nucleótidós ID NO: CTCACGGGTGGAAGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTG CATGCAGGCCCGGCAGACCCCCTTCACCTTCGGCCCTGG CACCAAGGTGGACATCCGGCGTACGGTGGCCGCTCCCAG CGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGACGAGCAGCTGAAGAGC GGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTAGC CCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCC i TGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTCACCGAGCAGjG ACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGC AGCACCCTGAC CCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCATAAGGTGTACGC CTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGAL CAAGAGCTTCAACAGGGGCGAGTGC I 24 CAGGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGCGGAGTGGTGCAG CCTGGCCGGTCCCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCTCCGGC TTCACCTTCTCCAGCTACGGCATGCACTGGGTGCGACAG¡G I CCCCTGGCAAGGGACTGGAATGGGTGGCCGTGATCTCCT ACGAGGAATCCAACAGATACCACGCTGACTCCGTGAAGG!G CCGGTTCACAATCTCCCGGGACAACTCCAAGATCACCCTG I TACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGACCGAGGACACCGCC GTGTACTACTGCGCCAGGGACGGAGGAATCGCCGCTCCT GGACCTGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTG TCCTCCGCTAGCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCTCTGG SEQ Secuencias detalladas de aminoácidos o de nucleótidos ID NO: GGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCC GCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGAGCCGC GGCAAG 25 GACATCGTGATGACCCAGTCCCCCCTGTCCCTGACCGTGjA CACCTGGCGAGCCTGCCTCTATCTCCTGCAGATCCTCCck ¦ i GTCCCTGCTGTACTCCAACGGCTACAACTACCTGGACTGG TATCTGCAGAAGCCCGGCCAGTCCCCACAGGTGCTGATCT CCCTGGGCTCCAACAGAGCCTCTGGCGTGCCCGACCGG" TCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGACTTCACACTGAAGA" CTCACGGGTGGAAGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTG CATGCAGGCCCGGCAGACCCCCTTCACCTTCGGCCCTGG; CACCAAGGTGGACATCCGGCGTACGGTGGCCGCTCCCAG CGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGACGAGCAGCTGAAGAGC I GGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACC CCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCG TGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTCACCGAGCAGG ACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGAC CCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCATAAGGTGTACGC CTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGAC! i I CAAGAGCTTCAACAGGGGCGAGTGC ¡ 26 CAGGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGCGGAGTGGTGCAG SEQ Secuencias detalladas de aminoácidos o de nucleótidos ID NO: CCTGGCCGGTCCCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCTCCGGÍ: TTCACCTTCTCCAGCTACGGCATGCACTGGGTGCGACAGG I CCCCTGGCAAGGGACTGGAATGGGTGGCCGTGATCTCCF ACGAGGAATCCAACAGATACCACGCTGACTCCGTGAAGGG CCGGTTCACAATCTCCCGGGACAACTCCAAGATCACCCT^p TACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGACCGAGGACACCGCG I GTGTACTACTGCGCCAGGGACGGAGGAATCGCCGCTCCT GGACCTGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTG TCCTCCGCTAGCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCTCTGG CCCCTTCCAGCAAGTCTACCTCCGGCGGCACAGCTGCTCT GGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCTGAGCCTGTGACjA i GTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCTCTGGCGTGCACjA CCTTCCCTGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCjT GTCCTCCGTGGTCACAGTGCCTTCAAGCAGCCTGGGCAc I CAGACCTATATCTGCAACGTGAACCACAAGCCTTCCAACAi I CCAAGGTGGACAAGCGGGTGGAGCCTAAGTCCTGCGACA! AGACCCACACCTGTCCTCCCTGCCCTGCTCCTGAAGCTGC TGGCGGCCCTTCTGTGTTCCTGTTCCCTCCAAAGCCCAAG GACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAAGTGACCTGCG TGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGATCCTGAAGTGAAGTT í CAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAI GACCAAGCCTCGGGAGGAACAGTACAACTCCACCTACCG SEQ Secuencias detalladas de aminoácidos o de nucleótidos ID NO: GGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCT GAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAAGTCTCCAACAAGGCC CTGCCTGCCCCTATCGAAAAGACAATCTCCAAGGCCAAG^ GCCAGCCTAGGGAACCCCAGGTGTACACCCTGCCACCC† GCCGGGAGGAAATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCT GTCTGGTCAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGL GTGGGAGTCTAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGA^C ACCCCTCCTGTGCTGG ACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTG G ACTCCAAACTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGG GCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCA CAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCTCCCGGC AAG 27 GACATCGTGATGACCCAGTCCCCCCTGTCCCTGACCGTGA CACCTGGCGAGCCTGCCTCTATCTCCTGCAGATCCTCCC/j\ TCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGACTTCACACTGAAGAT CTCACGGGTGGAAGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTG I CATGCAGGCCCGGCAGACCCCCTTCACCTTCGGCCCTGGj CACCAAGGTGGACATCCGGCGTACGGTGGCCGCTCCCAG SEQ Secuencias detalladas de aminoácidos o de nucleótidos ID NO: CGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGACGAGCAGCTGAAGAGC GGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACC CCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCpC TGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTCACCGAGCAGG ACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAG CCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCATAAGGTGTACGC CTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTG C CAAGAGCTTCAACAGGGGCGAGTGC 28 MVRLPLQCVLWGCLLTAVHPEPPTACREKQYLINSQCCSLC QPGQKLVSDCTEFTETECLPCGESEFLDT WN RETHCHQH KYCDPN LGLRVQQKGTSETDTICTCEEGV\|H CTSEACESCVLHRSCSPGFGVKQIATGVSD ¡ TICEPCPVGFFSNVSSAFEKCHPWTSCETKDLVVQQAGTNjK TDVVCGPQDRLRALVVIPI I FGI LFAILL ! VLVFIKKVAKKPTNKAPHP QEPQEINFPDDLPGSNTAAPVb i ETLHGCQPVTQEDGKESRISVQERQ Ejemplo 8: Resultados de toxicología El objetivo primario del estudio de toxicología fue determinar la toxicidad del mAb1, en seguida de la administración intravenosa una I vez por semana al mono cinomolgo durante 5 semanas (6 aplicaciones del artículo de prueba). También se utilizó la versión no silenciosa (ADCC) de este anticuerpo (Chirl 2.12), con el objeto de comparar los efectos de un anticuerpo con actividad ADCC con la versión silenciosa de ADCC (mAb1). ! En adición, los animales se inmunizaron con KLH corí el ob'jeto i de evaluar la eficacia de ambos Abs anti-CD40. ¡ i No hubo mortalidades o cambios en los pesos corporales] en los signos clínicos, ni en el consumo de alimento estimado atribu!ible al tratamiento con mAb1 o Chirl 2.12. Las reacciones locales enj los sitios de inyección de KLH fueron comparables en todos los grupojs.

También, no hubo hallazgos relacionados con los artículos de prueba en las investigaciones oftálmicas y cardiovasculares.

En la hematología, se observó una disminución ligera ero estadísticamente significativa en el porcentaje y en los números absolutos de los basófilos en los animales tratados con el mAb1 y el Chir12.12: no se puede excluir una relación con el tratamiento con el artículo de prueba. El análisis de orina reveló cetonas en la orinaj de 1/5 hembras tratadas con el mAb1 y de 2/5 hembras tratadas con i el C h i r 12.12 , con una relación poco clara con la dosificación. En la química clínica, se observó una ligera tendencia a te'ner concentraciones elevadas de lipasa para los machos tratados con el C hir 12.12 , así como para una hembra tratada con el Chirl 2.12; ¡sin embargo, esto se consideró como de una relevancia toxicológ'ica limitada . 1 i plasma no indicaron ninguna activación de plaquetas.

En los animales tratados con el C h ir 12.12 , la inmunofenotipificación mostró una disminución prominente en las células-B CD20+, que era la acción farmacológica esperada de este anticuerpo. En especial las células-B CD20baiaCD21+ (las cuales se consideran como CD40alta) fueron consumidas por el Ch¡r12.12. Sin embargo, también las células-B CD20 CD21" disminuyeron sustancialmente, en especial hacia el final del estudio. De preferencia, las células-B puras CD20+CD21 +CD27" fueron consumidas por el anticuerpo Chirl 2.12 con actividad de ADCC, mientras que las células-B de memoria CD20+CD21 +CD27 + difícilmente fueron afectadas. También hubo una disminución aproximada del 50 por ciento en el CD16+ en los animales tratados con en seguida del tratamiento con silencioso), no se observó la dismin B CD20+, ni hubo disminución alguna en los números absolutos! de células-NK CD16+. Las únicas células-B que mostraron una i reducción moderada durante la dosificación fueron las células-B CD20alta CD21". Estas células son conocidas como específicas; de macaco, y de un origen germinal central y, por consiguiente, ¡este hallazgo no se considera relevante para su transición a los s res humanos. j La inmunofenotipificación del bazo y de los ganglios linfáticos que drenan KLH en la necropsia, reveló un cuadro similar. Hubo|una disminución en el número relativo de células-B CD20+ en| los i animales tratados con el Chir12.12; sin embargo no se observó í ninguna reducción relevante de las células-B CD20+ para | los animales tratados con el mAb1, con una reducción ligera a moderada de las células-B CD21" (ganglios linfáticos de ambos sexos, bazo de machos solamente). No hubo diferencias en los resultados de la inmunofenotipificación para el drenado de los ganglios linfáticos derecho e izquierdo en el sitio de inyección de KLH.

La reacción de los anticuerpos dependiente de las células-T (TDAR) mostró que, en comparación con el grupo de control, no se observó respuesta alguna de IgG e IgM a la KLH en los animales tratados con mAb1 o Chir12.12. Debido a que el bloqueo de la activación de las células-B mediante la inhibición de la interacción de ligandos CD40 - CD40 es la acción farmacológica pretendida del mAb1, y debido a que el Chir12.12 pretende consumir las células-B, este hallazgo o se considera como toxicológicamente relevante. ¡ La evaluación toxicocinética reveló que las concentraciones de artesa aumentaron durante el transcurso del estudio, indicando la acumulación de mAb1 y Chir12.12. Las concentraciones de artjesa promedio después de la 4a y 5a dosis fueron similares, indicando condiciones de estado casi continuo después de la 5a dosis pátja el mAb1 y el Chirl 2.12. Las exposiciones promedio (ambos génejros) durante el intervalo de dosificación (AUCT) después dosis, fueron de 906 y 990 h.mg/mL, respectivamente y de 757 y 751 h.mg/mL, respectivamente para el Chirl 2.12. jLos valores de AUCT también indicaron condiciones de estado casi i continuo después de la 5a dosis. ! Los exámenes macroscópicos no mostraron evidencia alguna de la toxicidad del órgano objetivo, y los pesos de los órganos también estuvieron dentro del intervalo normal para esta especie, Microscópicamente, se vieron hallazgos relacionados con el artículo de prueba de ambos anticuerpos en todos los órganos linfáticos (bazo y ganglios linfáticos (mesentéricos, mandibulares, axilares, e inguinales)), en donde el mAb1 y el Chir12.12 provocajron una supresión completa del desarrollo del centro germinal en jlas áreas de las células-B corticales. El inmunoteñido de CD20 del bazo i y el drenado de KLH, y el tejido del ganglio linfático contralateral, mostraron un tamaño reducido de los folículos linfoides en el bazo, I así como un agotamiento de células-B en el bazo y en los gangl'ios linfáticos, un efecto que fue mucho más pronunciado en los animales tratados con el Chir12.12, comparándose con el tratamiento con el mAbl. Los hallazgos de centros germinales en los animales tratados con el mAbl corresponden a la reducción de las células-B CD21" q!ue se ve en la inmunofenotipificación. El inmunoteñido de CD40 mostró una reducción significativa en el teñido de CD40 en los ganglios linfáticos y en el bazo en seguida del tratamiento con cualquiera de mAbl o Chirl 2.12. I En conclusión, basándose en los resultados de este estudio, la administración intravenosa una vez por semana del mAbl o| del C h i r 12.12 durante 5 semanas (6 administraciones) en juna concentración de 100 miligramos/kilogramo, a los monos cinomoilgos machos y hembras, fue bien tolerada. La inmunofenotipificajción mostró un consumo de células-B en los animales tratados con el C hi r 12.12 pero no en los animales tratados con el mAbl, con la I excepción de las células-B CD21"; sin embargo, el TDAR mostrójuna ausencia de reacción de IgG e IgM después de la inmunización con KLH tanto en los animales tratados con el mAbl como cón el Chir12.12. La histopatología reveló la falta de centros germinales en el bazo y en los ganglios linfáticos a partir de los animales tratados con el mAbl y con el Chi r 12.12. Los efectos sobre las células-B son las acciones farmacológicas deseadas y, por consiguiente, se consideran adversos. Se considera que el nivel del efecto adve no observable (NOAEL) está en la dosis de 100 miligramos/kilogramo tanto para el mAbl como para el Chir12.12, bajo las condiciones de i i este estudio. ; Ejemplo 9: Perfilación adicional in vitro del mAbl ! Se determinó el enlace y la reactividad funcional cruzada del mAbl entre los leucocitos humanos, y de monos rhesus y ! cinomolgos. La Tabla 10 muestra una comparación directa de jlas EC50s de enlace para el mAbl en las tres especies.

Tabla 10 Reactividad cruzada del mAb1 humano y de NHP Ensayo Humano Rhesus Cinomolgo Enlace de CD40 (células-B 0.22 + /-0.033 0.26, 0.28 0.3, 0.24 CD20+ - FACS) (n = 6) (EC50, pg/ml) Inhibición de 0.058, 0.075 CD154 (células- 0.03 + /-0.017 (n (células-B de 0.015, 0.02 B humanas y = 6) amígdalas (PBMCs) PBMCs) (PBMCs) humanas) (ICso. Mg/ml) El mAb1 se enlaza a las células CD20+ (células-B) de las ¡tres especies con una EC50 comparable. Adicionalmente, el mAb1 p!udo inhibir la proliferación de las células-B de amígdalas huma!nas inducida por CD154+IL-4, así como las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) a partir de mono cinomolgo y rhésus. Colectivamente, estos resultados indicaron que la capacidad del mAb1 para enlazarse a CD40 y para inhibir la células-B humanas o las células mononucleares (PBMCs) de primate no humano, fue muy similar. Los datos dé la disponibilidad de la ocupación in vitro del receptor (RO) y la I inhibición funcional, hicieron posible determinar la relación e¡ntre estas dos variables para cada especie (Tabla 11).

Tabla 11 Relación entre el RO de mAb1 y la inhibición funcional a Proliferación inducida por CD154 Soluble + IL4 en mono rhesus con células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) y en el iser humano con células-B de amígdalas. b asumiendo la farmacodinamia (KD) in vivo en mono rhesus y eiji el ser humano, es la misma que la calculada en el estudio J de farmacocinética (PK)/farmacodinamia (PD) en el mono cinomolgo. I c asumiendo que el mAb1 está bien por encima del [objetivo], j es aplicable la ecuación de Hill-Langmuir.

Los resultados indican que las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de mono rhesus con el mAb1 requieren j aproximadamente 2 veces menos RO para inhibir la proliferación jde j las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) por el ¡50 por ciento en comparación con las células-B humanas. En el ser humano, se pudo obtener la inhibición completa con aproximadamente el 75 por ciento (predicho in vivo) de RO. ! Ejemplo 10: Estudio de Trasplante I Sobrevivencia del injerto El tratamiento de combinación con el mAb1 (30 miligramos/ kilogramo intravenosamente (i.v.)), y ciclosporina A (20 miligramos/ kilogramo oralmente) durante el trasplante de aloinjerto de riñon, dio como resultado una prolongación significativa de la sobrevivencia de los 6 animales involucrados en el estudio. Los injertos fueron funcionales durante >91*, 31, >92*, >92*, >98* y >98* días (promedio: >83.6 días) en los animales #5529, #5533, #5523, #5 J524¦ , #5536 y #5538, respectivamente (* final del protocolo). La sobrevivencia en los animales no tratados (o tratados con dosis IS sub-terapéuticas) estuvo en el intervalo de 7 a 10 días (datos históricos).

El animal #5533 se eutanizó 31 días después del trasplante, debido a falla aguda del riñon y anuria. Esta patología apareció después de un período de hipertensión mantenida y de la anestesia para la recolección de la biopsia. I Monitoreo después del trasplante j (a) Concentraciones en suero de creatinina (SCrea) y urea (SUrea) í SCrea fue el parámetro principal utilizado para la evaluación de la función renal. En los 6 animales, los niveles de SCrea aumentaron ( < ) por encima del valor de los niveles iniciales un día después Idel trasplante (de 81.8 ± 14.6 a 221.5 ± 37.1 micromoles/litro). Esta elevación en la SCrea es una característica común durante la primera semana después del trasplante (Tabla 12).

Tabla 12 Cambios en la SCrea observada en los receptores de aloinjerto de riñon NHP tratados con el mAb1 y con la terapia de combinación con CsA a 30 y 20 miligramos/kilogramo, respectivamente Durante la primera semana, las concentraciones de SUrea experimentaron rápidas elevaciones por encima del valor inicial medido en el día 0 (4.5 ± 1.3 milimoles/litro) (Tabla 13). En los animales #5529/#5533 y #5536/#5538, los niveles de SUrea fueron de 16 a 20 milimoles/litro (días 3 a 5), mientras que en los animales #5523 y #5524 fueron de 9 u 8 milimoles/litro (día ¡ 7), respectivamente.

Tabla 13 Cambios en la SUrea observados en los receptores de aloinjerto de riñón NHP tratados con el mAb1 y con la terapia de combinación con CsA a 30 y 20 miligramos/kilogramo, respectivamente I i Una semana después del trasplante, la función ren normalizarse y SCrea/SUrea llegan a estar más cerca de de la línea basal. Sin embargo, los animales #5533, #5523 y #55j24 (pero no #5529, #5536 y #5538) presentaron un aumento adicio al en SCrea/SUrea entre los días 7 y 19 a 25 después del trasplante, indicando un mal funcionamiento renal. Durante este período, jse pudieron observar signos como polidipsia/poliuria (#5523 y #55¡24), calcio en suero alto sostenido (SCa) (#5533), o un aumento en el I volumen del injerto (#5523 y #5524).

Después del día 20-25, los animales #5529, #5523, #5524, #5536 y #5538 mejoraron y mostraron una excelente función renal hasta el final del estudio. Sin embargo, en el día 31, el animal # 5: 533 exhibió un aumento pronunciado en los niveles de SCrea/SUrea, i confirmando una falla aguda del riñon (SCrea; 629 micromoles/litro, y SUrea; 18 milimoles/litro). Esta patología se presentó después de un período de hipertensión sostenida y del procedimiento de la biopsia un día antes de la eutanasia. Durante este período, se registraron picos de hipertensión (aproximadamente 170 mm Hg, sistólica), y un episodio de hipotensión (aproximadamente 40 mm Hg, sistólica). j (b) Concentraciones de amilasa y lipasa en suero, peso corporal, y recuentos de plaquetas Las concentraciones de amilasa en suero aumentaron ligeramente en todos los animales por aproximadamente 1.3 veces en los días 1-7 después del trasplante (311 ± 53 Unidades/litro en el día 0, y 418 ± 66.8 Unidades/litro en el día 7 después del trasplante) (Tabla 14). El animal #5533 presentó la concentración de amil'asa i más alta observada en el estudio en el día 1 después del trasplante (1,050 Unidades/litro). Antes del trasplante, no hubo diferencia alguna entre los niveles de amilasa observados antes de la primera dosis del mAb1 y 24 horas después de (día -1 y día 0). ? 166 Tabla 14 | Concentraciones de amilasa en suero (Unidades/litro (U/L)) en los animales con trasplante de riñon tratados con una combinación de mAb1 a 30 miligramos/kilogramo intravenosamente (i.v.) y CsA a 20 miligramos/kilogramo oralmente (p.o.) Las concentraciones de lipasa en suero experimentaron, en promedio, cambios menores antes y después del trasplante (Tabla 15). Solamente al final del protocolo experimental, se pudo verlun incremento menor (día 84; 2.18 veces). El animal #5533 mostrój la I concentración de lipasa más alta medida en el día 1 (28^.4 Unidades/litro). Los datos de lipasa a partir de los animales #5536 y #5538 no estuvieron disponibles. Los cambios en las ? concentraciones de amilasa y lipasa fueron similares a los niveles encontrados en otros experimentos de trasplante utilizando diferentes anticuerpos o compuestos de bajo peso molecular (no se muestran los datos).

Tabla 15 Concentraciones de lipasa en suero (U/L) en cuatro de los animales con trasplante de riñon tratados con una combinación de mAb1 a 30 miligramos/kilogramo intravenosamente (i.v.) y Se pudo observar una rápida y notoria pérdida del peso corporal principalmente en los animales #5529, #5533 y #5536. En los seis animales trasplantados, estuvo en el intervalo del -4 al -18 por ciento durante los primeros 21 días en seguida del trasplanté. ? Sin embargo, la pérdida del peso corporal tendió a recuperarse después de este punto del tiempo y hacia el final del estudio.

Los recuentos de plaquetas fueron normales (de 300 a '400 células x 103/microlitro), o aumentaron durante el período despjués del trasplante a 600-800 células x 103/microlitro. El animal #5¡529 recibió un tratamiento con aspirina durante 3 días (días 7-9) debido al rápido aumento en los recuentos de plaquetas. El animal #5533 presentó una trom bocitosis de largo plazo (>1000 células x 103/microlitro), y recibió el tratamiento con aspirina entre los días 7 y 26. (c) Niveles en sangre del mAb1 y recuentos de células-B j Previamente se condujo un estudio y análisis farmacocinético (PK)/farmacodinámico (PD) de referencia, en donde se dio a los monos cinomolgos una sola dosis intravenosa del anticuerpo a 10 miligramos/kilogramo (no se muestran los datos). En este estudio, los perfiles de concentración contra el tiempo exhibieron una cl;ara disposición mediada por el objetivo (TMD), demostrando un una eliminación más rápida comparándose con otro animal una consecuencia de un nivel de expresión del objetivo í probablemente más alto, enfatizando la función de los niveles ¡de expresión del objetivo en la farmacocinética (PK) reguladora. A partir de este estudio, también se estableció que, cuando ¡las concentraciones en suero del mAb1 estuvieron por encima ¡de aproximadamente 5 microgramos/mililitro, esto se tradujo en casi el 100 por ciento de ocupación del receptor de CD40.

El diseño del estudio del trasplante (semanalmente y altos niveles de dosis del mAb1 - 30 miligramos/kilogramo, y sin fase de recuperación/lavado) no permitió tener el mismo nivel de análisjis y modelación que el estudio de farmacocinética/farmacodinamia (PK/PD) previamente conducido. No obstante, se hicieron i las siguientes observaciones (resumidas en la Tabla 16); i) no se detectó el mAb1 en las muestras recolectadas antes de la primera i dosis, ii) se detectó el mAb1 a través de toda la fase de dosificacjión , y iii) en todas las muestras recolectadas e inter-individuos, ¡ las concentraciones de artesa fueron variables (de 1,200 a 2,500 microgramos/mililitro para el cinomolgo 5524, de 1,000 a 2,000 microgramos/mililitro para el cinomolgo 5523, y de 850 a 2,400 microgramos/mililitro para el cinomolgo 5529). Todos los valores de exposición estuvieron bien por encima (de 170 a 500 veces) de la concentración necesaria para obtener la ocupación completa Idel receptor en el mono cinomolgo. j En este estudio también se evaluó la prueba jde inmunogenicidad (anticuerpos anti-mAb1 de mono). Todas Jas muestras resultaron negativas, pero los altos niveles de mAb1 |en estas muestras pudieron impedir potencialmente su detección debido a las interferencias del fármaco. | Se pudo observar un consumo parcial de las células CD20+ con el tiempo en todos los animales tratados. Se vieron observaciones similares en el estudio farmacocinético/farmacodinámico (PK/PD) previamente conducido (no se muestran los datos).

Resultados de Histología La evaluación histopatológica de los aloinjertos de riñón no reveló ningún rechazo agudo y crónico en los injertos #5523, #5524, #5529 y #5538, y los cambios del límite en el injerto #5536 que llegaron al final del experimento, es decir (los resultados resumidos i en la Tabla 17). Se observaron infiltrados perivasculares o intersticiales mínimos en los animales #5523 #5524 y #5538, y una híper-celularidad glomerular mínima en el animal #5529.

Tabla 17 Resultados de Histología #5536 Biopsia No No Banff: Cambios del límite (infiltrados intersticiales 11- Necropsia 98 104/8 multifocales mínimos con 0002 (tubulitis focal mínima), célul|as de plasma focal.

Falta de formación de GC los órganos linfoides secundarios. Ningún otro cambio relacionado con el tratamiento.

Días No. de Crea/ Muestra después del Diagnóstico Animal Urea trasplante 0002 (infiltrados intersticiales multifocales mínimos presentes) Falta de formación de GC en los órganos linfoides secundarios. Inflamación linfo- histiocítica focal unilateral en el pulmón. Ningún otro cambio relacionado con el tratamien El animal #5533 que se eutanizó en el día 31 después ; del trasplante, mostró dilatación tubular, infiltrados intersticiales! y fibrosis, pero solamente una tubulitis mínima. En adición, se encontró una infiltración eosinofílica prominente en la vecindad del uréter, y un absceso en seguida de la anastomosis. Todos estos hallazgos indicaron una mala función renal durante mucho tiernlpo, pero no se pudo confirmar el rechazo.

El inmunoteñido de C4d fue negativo en todos los casos.

Se observó una falta de desarrollo del centro germinal coh o sin atrofia folicular en los órganos linfoides en todos los animálies.

Se diagnosticó cecocolitis causada por infección con Balantidium col i en los animales #5529 y #5533.

No se encontraron otros cambios relacionados con el tratamiento.

Estudio de Trasplante - discusión La meta del estudio de trasplante fue para evaluar, e un modelo de primate no humano de rechazo de aloinjerto de riñórij los efectos benéficos del mAb1 cuando se da como una tera pial de combinación con una dosis sub-terapéutica de Ciclosporina A. En adición, fue relevante para evaluar la ausencia de efectos secundarios en un modelo en el que se induce inflamación sistémica.

Cuando se aplicó como terapia de combinación con una dosis subterapéutica de CsA (20 miligramos/kilogramo oralmente (p.o.)), el mAb1 demostró eficacia para incrementar la sobrevivencia de los aloinjertos de riñón en NHPs. La sobrevivencia promedio del injerto fue de >83.6 días, y 5 de 6 animales llegaron al final del protocolo experimental (establecido en 91 a 98 días).

La dirección de CD40 utilizando un anticuerpo anti-CD40 (mAb1) bloqueador no agonista, dio como resultado la prolongación de la sobrevivencia del injerto en los NHPs con trasplante de riñon o de islotes. En adición, pudimos evaluar una mejor eficacia y seguridad utilizando el mAb1 (el cual es de Fe silencioso), comparándose con el Chirl 2.12 anteriormente reportado (anticuerpo monoclonal anti-CD40 completamente humano del isotipo lgG1/kappa i con propiedades de bloqueo del consumo y de la co-estimulac¡ón: de células-B).

Durante todo el período después del trasplante, hubo una ausencia de cualesquiera sucesos de patología clínica relevantes (por ejemplo, un aumento menor en los niveles de amilasa/lipasa atribuido a la función renal deteriorada típica después del i trasplante). Sin embargo, los animales #5333, #5523 y #5524 presentaron una función renal reducida entre los días 7 y 19. Este período de tiempo se caracteriza típicamente por una recuperación de los niveles de SCrea/SUrea, de la presión sanguínea, y del volumen del injerto en los animales después del trasplante. En estos animales, se vieron signos de una función renal deteriorada! tal .

I Un animal (#5533) se eutanizó en el día 31 debido a jfalla aguda del riñón (ningún rechazo). Este resultado fue causadoj por una recuperación incompleta de la función renal después | del procedimiento del trasplante. Los signos que indicaron una rjnala función renal fueron altos niveles de SUrea (de 11 a 19 milimóles/ litro), o concentraciones altas sostenidas de SCa (>2.8 milimoles/ litro). La pérdida del injerto terminal se aceleró por una hipertensión sostenida (>140 mmHg, sistólica) combinada con la hipotensión observada durante la anestesia aplicada durante el procedimiento de recolección de la biopsia, y los altos picos de hipertensión registrados la noche anterior a la eutanasia (aproximadamente 170 mmHg, sistólica) (Palmer BF (2002) N. Engl. J. Med; 347(16): 1256- 1261). Todos estos sucesos no se podrían atribuir al tratamiento ¡con i i el mAb1, y solamente a las diferencias individuales en la f|ase después del trasplante.

La alta eficacia de la terapia de combinación se pudo demostrar también histológicamente. Cinco de seis injerios mostraron una excelente calidad del injerto al final del experimento.

Se observó una falta de desarrollo del centro germinal también en un experimento de trasplante con el C h i r 12.12. No se observaron otros cambios del tejido relacionados con el tratamiento. ¡ Uno de los sobrevivientes a largo plazo (#5529) desarrolló cecocolitis causada por Balantidium coli. Aunque la infección | es I común en los macacos, y con frecuencia asintomática, j la inmunosupresión puede conducir a un establecimiento de la enfermedad aguda (Schuster FL, Ramirez-Avila L, (2008) Clin.

Microbiol. Rev; 21(4): 626-38). En este animal, no se observajon signos clínicos, tales como diarrea o pérdida de peso corporal.

Con respecto al monitoreo de los recuentos de células-B, se pudo observar un consumo parcial con el tiempo en todos los animales tratados. Este consumo parcial probablemente no se deba al consumo mediado por Fe activo, debido a que el mAb1 es un anticuerpo silenciado que no se enlaza al FcR ni media la ADCC in vitro. El consumo parcial puede ser un espejo de la falta de centros germinales, lo cual se observa en la histología al final del experimento. Este consumo parcial puede ser debido a la falta de señales de sobrevivencia.

Compendio | ! No se han reportado anticuerpos anti-CD40 para inducir sucesos hemostáticos en los pacientes; sin embargo, las elevaciones en las enzimas pancreáticas en los pacientes con linfoma de célújlas-B que reciben el Ab Chir12.12 anti-CD40, y el posible riesgo de pancreatitis, precluyen el uso de este anticuerpo competente en Fe j anti-CD40 en la enfermedad autoinmune crónica y en el trasplante i por razones de seguridad. Por consiguiente, generamos ¡ los anticuerpos de I g G 1 con Fe silencioso anti-CD40 (mAb1, y mAb3), que son incapaces de mediar la citotoxicidad cejlular dependiente de los anticuerpos (ADCC) o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), tanto in vitro como in vivo. El mAb1 fue capaz de prolongar la sobrevivencia del aloinjerto renal de primate no humano en combinación con dosis sub-terapéuticas de ciclosporina. En adición, el mAb1 fue capaz de suprimir completamente las respuestas primarias y secundarias del anticuerpo a la inmunización con un antígeno dependiente de las células-T. Crucialmente, no hubo evidencia alguna de sucesos hemostáticos o de una histología pancreática anormal en el estudio ya fuera de trasplante o bien de inmunización. Colectivamente, estos resultados sugieren que el mAb1 sería un producto terapéutico seguro y eficaz, y se podría utilizar para tratar a los pacientes que padezcan de una enfermedad autoinmune impulsada por los se las i

Claims (18)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo aislado o una proteína que comprende una porción de enlace de antígeno de un anticuerpo dirigido contra un polipéptido de CD40 objetivo (SEQ ID NO: 28), caracterizado porque este anticuerpo o esta proteína: a. se enlaza al polipéptido de CD40 con una KD de 10 nM o menos, y b. comprende una región Fe de IgG silenciosa.

2. El anticuerpo aislado o la proteína de la reivindicación' 1 en donde este anticuerpo o esta proteína inhibe la señalización inducida por CD40L con una IC50 de 50 nanogramos/mililitro menos.

3. El anticuerpo aislado o la proteína de cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en donde este anticuerpo o proteína no tiene ninguna actividad agonista, o tiene una baja actividad agonista con respecto a la señalización de CD40.

4. El anticuerpo aislado o la proteína de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde este anticuerpo o esta protena comprende una regiqn Fe de IgG silenciosa seleccionada a partir del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ D NO: 17, SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 19.

5. El anticuerpo aislado o la proteína de acuerdo c†n cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, el cual comprende regiones variables de cadena pesada (VH) y de cadena ligera (VL) que tienen cuando menos el 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 ó 100 por ciento de identidad de secuencia con la VH de la SEQ ID NO: 9 y con la VL de la SEQ ID NO: 10, respectivamente.

6. El anticuerpo aislado o la proteína de acuerdo |con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, seleccionado a pa rtir | del grupo que consiste en: a. el anticuerpo mAb1, el cual comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 11 y la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 12, b. el anticuerpo mAb2, el cual comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de la SEQ ID NO; 13 y¡ la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de la SEQ ID NO: |14, y. c. el anticuerpo mAb3, el cual comprende la secuen'cia de aminoácidos de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 15 y la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 16.

7. El anticuerpo aislado o la proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para utilizarse como |un medicamento.

8. El anticuerpo aislado o la proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para utilizarse en el tratamiento de trastornos autoinmunes y/o trastornos inflamatorios.

9. El anticuerpo aislado o la proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para utilizarse en ! la prevención o reducción del riesgo de rechazo de injerto el I trasplante.

10. El anticuerpo aislado o la proteína de acuerdo con la reivindicación 7, para utilizarse en el tratamiento de esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, síndrome de Sjógren, artritis reumatoide, rechazo de trasplante, y la enfermedad del injerto contra el huésped.

11. Una composición farmacéutica, la cual comprende un anticuerpo o una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en combinación con cuando rnenosi un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

12. La composición farmacéutica de la reivindicación 11, el cual comprende adicionalmente otros ingredientes activos.

13. Una formulación farmacéutica líquida que comprende! un anticuerpo o una proteína de acuerdo con cualquiera de lias reivindicaciones 1 a 6, con cuando menos un regulador.

14. Un ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo o la proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6

15. Un vector de clonación o de expresión, el cual comprende uno o más ácidos nucleicos de acuerdo con la reivindicación 14.

16. Un vector de clonación o de expresión de acuerdo con la reivindicación 15, el cual comprende cuando menos una de las siguientes secuencias de codificación (a)-(c), operativamente enlazada a las secuencias promotoras adecuadas: (a) SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 23; (b) SEQ ID NO: 24 y SEQ ID NO: 25; o 184 (c) SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 27.

17. Una célula huésped, la cual comprende uno mas vectores de clonación o de expresión de acuerdo las reivindicaciones 15 a 16.

18. Un proceso para la producción de un anticuerpo una proteína de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, el cual comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 17, purificar y recuperar este anticuerpo o esta proteína.