ES2633817T3 - Variantes de Fc silenciosas de los anticuerpos anti-CD40 - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo aislado dirigido contra un polipéptido CD40 objetivo (SEQ ID NO: 28), caracterizado porque dicho anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 11 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 12.

Description

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DESCRIPCION

Variantes de Fc silenciosas de los anticuerpos anti-CD40

La presente divulgacion se refiere a variantes de un fragmento constante (Fc) silenciosas de anticuerpos anti-CD40, y a composiciones y metodos de uso de estos anticuerpos, para el tratamiento de trastornos patologicos, tales como trastornos autoinmunes e inflamatorios, y/o para prevenir o reducir el riesgo de rechazo de injerto en el trasplante. A pesar de la disponibilidad de varios tratamientos inmunosupresores para las enfermedades autoinmunes, sigue existiendo una gran necesidad insatisfecha de farmacos mas eficaces y mas seguros en una gran fraccion de la poblacion de pacientes. Por ejemplo, a pesar de la eficacia reportada de las terapias consumidoras/inhibidoras de las celulas B, como Rituximab y Belimumab en artritis reumatoide, lupus eritematoso sistemico, slndrome de Sjogren, y esclerosis multiple, estas terapias son solamente efectivas en una porcion de los individuos enfermos, y, con el Rituximab, con un riesgo aunado de leucoencefalopatla multifocal progresiva. Ademas, con frecuencia estan involucrados otros multiples tipos de celulas de leucocitos en la patologla de estas enfermedades autoinmunes, tales como macrofagos, celulas dendrlticas y celulas T; por consiguiente, la intervencion terapeutica que se dirija a tipos de celulas adicionales o a sendas inmunologicas clave que inhiban su funcion, podrla proporcionar un beneficio. Dadas las multiples funciones inmunologicamente relevantes del CD40-CD154 en la activacion y funcion de estos tipos de celulas, es probable que un anticuerpo anti-CD40 conferirla un beneficio terapeutico a los pacientes que padezcan las enfermedades autoinmunes ilustradas anteriormente mas alla de lo que proporcionan en el presente las terapias actuales. Ademas, la funcion central de las interacciones de CD40-CD154 en los trastornos inflamatorios intestinales, tales como enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa, y las vinculaciones mecanicas de la senda de CD40 con la patologla en trastornos mas raros, tales como vasculitis autoinmune, penfigo vulgar, e ITP, tambien realzan el potencial de los anticuerpos anti-CD40 en estas indicaciones.

Los inmunosupresores actualmente disponibles utilizados despues del trasplante de un organo solido, proporcionan una excelente eficacia a corto plazo. Se observan rechazos agudos dentro del perlodo de novo en el 5 % al 20 % de los receptores (dependiendo del organo, de la poblacion de pacientes, y del regimen), y la proporcion de injertos perdidos por el rechazo agudo dentro del perlodo de novo esta por debajo del 5 % para cualquier establecimiento. Actualmente, la necesidad insatisfecha clave es la tolerabilidad de la inmunosupresion con el paciente y la sobrevivencia del injerto a largo plazo. Despues del trasplante renal, el 33 % de los pacientes mueren y/o pierden su injerto dentro de 5 anos; la edad promedio de muerte del receptor del trasplante es de 58 anos. Los inhibidores de calcineurina (CNI) siguen siendo el fundamento de la terapia inmunosupresora para la gran mayorla de los pacientes de trasplante. Aunque la nefrotoxicidad y la patologla cardiovascular asociada con los inhibidores de calcineurina (CNIs) es uno de los impulsores de la nefropatla de aloinjerto cronica, as! como la muerte del paciente con un injerto funcionando, la inmunosupresion primaria alternativa no ha podido reemplazar a los inhibidores de calcineurina (CNIs). Sobre todo, hay todavla espacio para hacer mejoras en la inmunosupresion de trasplantes a largo plazo. El dano inmunologico mediado por las celulas B de los rinones trasplantados puede contribuir a pobres resultados a largo plazo, y la comunidad medica esta reconociendo cada vez mas la necesidad de nuevos agentes para resolver el rechazo de las celulas B.

Chir12.12 es un anticuerpo anti-CD40 no agonista completamente humanizado (IgG1, kappa) que bloquea la activacion de los leucocitos mediada por el CD154 (tambien conocido como ligando CD40; CD40L), y puede mediar la citotoxicidad celular dependiente de los anticuerpos (ADCC) de los leucocitos humanos y los linfomas de celulas B in vitro (vease la Publicacion Internacional Numero WO2006/073443). la Publicacion Internacional Numero WO2005/044306 tambien describe anticuerpos antagonistas anti-CD40, incluyendo Chir12.12, para utilizarse en particular en el tratamiento de los trastornos autoinmunes e inflamatorios. Ademas, Chir12.12 es efectivo para retrasar el rechazo de aloinjerto de rinon cuando se dosifica como una monoterapia en Macaca fascicularis (monos cinomolgos) [Li y colaboradores (2008) Transplantation; 86 (1): 10-15]. Sin embargo, Chir12.12 tambien puede mediar el consumo de las celulas B perifericas en los primates no humanos (NHPs).

Se predice que los mAbs anti-CD40 con actividad de citotoxicidad celular dependiente de los anticuerpos ADCC silenciada, tienen un perfil de seguridad mejorado en relacion con los anticuerpos anti-CD40 progenitores, y en particular, pueden ser mas adecuados para las indicaciones no oncologicas, tales como las enfermedades autoinmunes, y para su uso en una situacion de trasplante.

La presente divulgacion, por consiguiente, proporciona anticuerpos monoclonales anti-CD40 silenciosos Fc que conservan los atributos bloqueadores del CD40L no agonistas del anticuerpo anti-CD40 progenitor Chir12.12.

En particular, la divulgacion proporciona un anticuerpo aislado o una protelna que comprende una porcion de enlace de antlgeno de un anticuerpo dirigida contra el polipeptido de CD40 objetivo (SEQ ID NO: 28), caracterizado porque este anticuerpo o esta protelna:

a) se enlaza al polipeptido de CD40 con una KD de 10 nM o menos, y

b) comprende una region Fc de IgG silenciosa.

En una realization, este anticuerpo o esta protelna inhibe la serialization inducida por CD40L con una IC50 de 50 nanogramos/mililitro o menos.

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En otra realizacion, el anticuerpo aislado o la protelna de acuerdo con la invencion no tiene ninguna actividad agonista, o tiene una baja actividad agonista con respecto a la senalizacion de CD40.

En otra realizacion, el anticuerpo o la protelna de acuerdo con la presente divulgacion comprende una region Fc de IgG silenciosa seleccionada a partir del grupo que consiste en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 19.

En otra realizacion, el anticuerpo aislado o la protelna de la divulgacion comprende regiones variables de cadena pesada (Vh) y de cadena ligera (Vl) que tienen al menos el 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad de secuencia con la Vh del anticuerpo Chir12.12 (SEQ ID NO: 9), y con la Vl del anticuerpo Chir12.12 (SEQ ID NO: 10), respectivamente.

Un ejemplo especlfico del anticuerpo de acuerdo con la invencion es:

- mAb1, el cual comprende la secuencia de aminoacidos de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 11 y la secuencia de aminoacidos de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 12,

El anticuerpo aislado de acuerdo con la invencion se puede utilizar como un medicamento. En particular, son adecuados para utilizarse en el tratamiento de trastornos autoinmunes, trastornos inflamatorios, y/o en la prevencion o reduction del riesgo de rechazo de injerto en el trasplante.

El anticuerpo aislado de acuerdo con la invencion se puede utilizar en particular en el tratamiento de esclerosis multiple, lupus eritematoso sistemico, slndrome de Sjogren, artritis reumatoide, rechazo de trasplante, y la enfermedad del injerto contra el huesped.

La invencion tambien se refiere a composiciones farmaceuticas que comprenden los anticuerpos anteriores de acuerdo con la invencion, en combination con al menos un excipiente, diluyente o vehlculo farmaceuticamente aceptable. Estas composiciones farmaceuticas pueden comprender adicionalmente otros ingredientes activos.

La invencion tambien se refiere a una formulation llquida de un anticuerpo de acuerdo con la invencion.

La invencion se refiere ademas al acido nucleico aislado que codifica el anticuerpo o la protelna de acuerdo con la invencion, y al vector de donation o de expresion correspondiente, el cual comprende los acidos nucleicos de SEQ ID NOs: 22 y 23.

La invencion tambien se refiere a una celula huesped, la cual comprende uno o mas vectores de clonacion o de expresion como se definen anteriormente.

La invencion proporciona ademas un proceso para la production de un anticuerpo de la invencion, el cual comprende cultivar la celula huesped como se define anteriormente, purificar y recuperar este anticuerpo o esta protelna.

Con el objeto de que la presente invencion se pueda entender mas facilmente, primero se definen ciertos terminos. Se estipulan definiciones adicionales a traves de toda la description detallada.

El termino "respuesta inmunitaria" se refiere a la action de, por ejemplo, los linfocitos, las celulas presentadoras de antlgeno, las celulas fagoclticas, los granulocitos, y las macromoleculas solubles producidas por las celulas anteriores o por el hlgado (incluyendo los anticuerpos, las citoquinas, y el complemento), dando como resultado un dano selectivo a, destruction de, o elimination en el cuerpo humano, de patogenos invasores, celulas o tejidos infectados con patogenos, celulas cancerosas, o, en los casos de autoinmunidad o de inflamacion patologica, celulas o tejidos humanos normales.

Una “senda de transduction de senales" o "actividad de senalizacion” se refiere a una relation causal bioqulmica iniciada en terminos generales por una interaction de protelna-protelna, tal como el enlace de un factor de crecimiento a un receptor, que da como resultado la transmision de una senal a partir de una portion de una celula hasta otra porcion de una celula. En general, la transmision involucra la fosforilacion especlfica de uno o mas residuos de tirosina, serina, o treonina sobre una o mas protelnas en la serie de reacciones que causa la transduccion de senales. Los penultimos procesos tlpicamente incluyen eventos nucleares que dan como resultado un cambio en la expresion genetica.

El termino CD40 se refiere al CD40 humano, por ejemplo, como se define en la SEQ ID NO: 28, a menos que se describa de otra manera.

El termino "anticuerpo", como es referido en la presente, incluye los anticuerpos enteros y cualesquiera fragmentos de enlace de antlgeno (es decir, "porcion de enlace de antlgeno"), o las cadenas individuales de los mismos.

Un "anticuerpo" que se presenta naturalmente es una glicoprotelna que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces de disulfuro. Cada cadena pesada esta compuesta de una region variable de cadena pesada (abreviada en la presente como Vh) y una region constante de cadena

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pesada. La region constante de cadena pesada esta compuesta de tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera esta compuesta de una region variable de cadena ligera (abreviada en la presente como Vl) y una region constante de cadena ligera. La region constante de cadena ligera esta compuesta de un dominio, Cl. Las regiones Vh y Vl se pueden subdividir ademas en regiones de hipervariabilidad, denominadas como regiones determinantes de complementariedad (CDRs), intercaladas con regiones que estan mas conservadas, denominadas como regiones de estructura (FRs). Cada Vh y Vl esta compuesta de tres regiones determinantes de complementariedad (CDRs) y cuatro regiones de estructura (FRs) acomodadas desde el termino amino hasta el termino carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de enlace que interactua con un antlgeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar el enlace de la inmunoglobulina a los tejidos o factores del huesped, incluyendo distintas celulas del sistema inmunologico (por ejemplo, las celulas efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema clasico de complementos.

El termino "porcion de enlace de antlgeno" de un anticuerpo (o simplemente "porcion de antlgeno"), como se utiliza en la presente, se refiere a un anticuerpo de longitud completa, o a uno o mas fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad para enlazarse especlficamente a un antlgeno (por ejemplo, una porcion de CD40). Se ha mostrado que la funcion de enlace de antlgeno de un anticuerpo se puede llevar a cabo mediante los fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de los fragmentos de enlace abarcados dentro del termino de "porcion de enlace de antlgeno" de un anticuerpo incluyen un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios Vl, Vh, Cl y CH1; un fragmento F(ab)2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados por un puente de disulfuro en la region de articulacion; un fragmento Fd que consiste en los dominios Vh y CH1; un fragmento Fv que consiste en los dominios Vl y Vh de un solo brazo de un anticuerpo; un fragmento dAb (Ward y colaboradores, 1989, Nature 341: 544-546), que consiste en un dominio Vh; y una region determinante de complementariedad (CDR) aislada, o cualesquiera protelnas de fusion que comprendan esta porcion de enlace de antlgeno.

Adicionalmente, aunque los dos dominios del fragmento Fv, el Vl y el Vh, son codificados por genes separados, se pueden unir, empleando metodos recombinantes, mediante un enlazador sintetico que les permite hacerse como una protelna de una sola cadena, en la cual las regiones Vl y Vh forman pares para formar moleculas monovalentes (conocidas como Fv de una sola cadena (scFv); vease tambien Bird y colaboradores, 1988, Science 242: 423-426; y Huston y colaboradores, 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 5879-5883). Estos anticuerpos de una sola cadena tambien pretenden estar abarcados dentro del termino "porcion de enlace de antlgeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen empleando las tecnicas convencionales conocidas para los expertos en este campo, y los fragmentos son seleccionados por su utilidad de la misma manera que lo son los anticuerpos intactos.

Como se utiliza en la presente, el termino “region Fc de IgG” se utiliza para definir la region C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina, incluyendo la region Fc de la secuencia nativa y las regiones Fc variantes. La region Fc de la cadena pesada de IgG humana se define en general como aquella que comprende el residuo de aminoacido a partir de la posicion C226 o a partir de P230 hasta el termino carboxilo del anticuerpo de IgG. La numeracion de los residuos en la region Fc es aquella del Indice EU de Kabat. La lisina C-terminal (residuo K447) de la region Fc se puede remover, por ejemplo, durante production o purification del anticuerpo. De conformidad con lo anterior, una composition de los anticuerpos de la invention puede comprender poblaciones de anticuerpos con todos los residuos K447 eliminados, poblaciones de anticuerpos in residuos K447 eliminados, y poblaciones de anticuerpos que tengan una mezcla de los anticuerpos con y sin el residuo K447.

Un "anticuerpo aislado", como se utiliza en la presente, se refiere a un anticuerpo que esta sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigenicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se enlaza especlficamente al CD40 esta sustancialmente libre de anticuerpos que se enlacen especlficamente a antlgenos distintos del CD40). Un anticuerpo aislado que se enlaza especlficamente al CD40, sin embargo, tiene reactividad cruzada con otros antlgenos, tales como moleculas de CD40 de otras especies (no humanas). Mas aun, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o productos qulmicos.

Los terminos "anticuerpo monoclonal" o "composicion de anticuerpo monoclonal", como se utilizan en la presente, se refieren a una preparation de moleculas de anticuerpos de una sola composicion molecular. Una composicion de anticuerpo monoclonal exhibe una sola especificidad de enlace y afinidad por un epltopo particular.

El termino "anticuerpo humanizado", como se utiliza en la presente, pretende incluir los anticuerpos que contienen una secuencia minima derivada a partir de las secuencias de inmunoglobulina no humanas. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor), en donde los residuos a partir de una region hipervariable (tambien conocida como region determinante de complementariedad o CDR) del receptor son reemplazados por residuos a partir de una region hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donador), tal como raton, rata, conejo, o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. La expresion “region determinante de complementariedad” se refiere a las secuencias de aminoacidos que definen juntas la afinidad y especificidad de enlace de la region Fv natural de un sitio de enlace de inmunoglobulina nativo. Vease, por ejemplo, Chotia y colaboradores (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917: Kabat y colaboradores (1991) US Dept. of Health and Human Services (Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos), NIH Publication No. 91-3242). La expresion “region constante” se refiere a la porcion de la molecula de anticuerpo que confiere las funciones efectoras. En el trabajo anterior, que se refiere a la produccion de anticuerpos no

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inmunogenicos para utilizarse en la terapia de las enfermedades humanas, las regiones constantes de raton fueron sustituidas por regiones constantes humanas. Las regiones constantes de los presentes anticuerpos humanizados se derivaron a partir de las inmunoglobulinas humanas. La humanizacion se puede llevar a cabo siguiendo el metodo de Winter y colaboradores (Jones y colaboradores (1986) Nature 321: 522-525; Riechmann y colaboradores (1988) Nature 332: 323-327: Verhoeyen y colaboradores (1988) Science 239: 1534-1536), mediante la sustitucion de las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) o de las secuencias de regiones determinantes de complementariedad (CDR) de roedor y de roedor mutante, por las secuencias correspondientes del anticuerpo humano. En algunas instancias, los residuos dentro de las regiones de estructura de una o mas regiones variables de la inmunoglobulina humana son reemplazados por los residuos no humanos correspondientes (veanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos de Norteamerica Numeros 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762; y 6,180,370). Adicionalmente, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentren en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donador. El anticuerpo humanizado de la invencion tambien comprendera al menos una porcion de una region constante de inmunoglobulina (Fc). Tlpicamente, aquella de una inmunoglobulina humana, y en el presente caso, una region Fc de IgG silenciosa.

Los anticuerpos de la divulgacion pueden incluir residuos de aminoacidos no codificados por las secuencias humanas (por ejemplo, las mutaciones introducidas mediante mutagenesis aleatoria o especlfica del sitio in vitro o mediante mutacion somatica in vivo). En particular, el termino “anticuerpo humanizado” incluye los anticuerpos que comprenden una variante silenciosa de la region Fc de IgG.

El termino "anticuerpo monoclonal humanizado" se refiere a los anticuerpos que exhiben una sola especificidad de enlace, los cuales tienen regiones variables, en donde las regiones variables se humanizan a partir de las secuencias no humanas.

El termino "anticuerpo recombinante", como se utiliza en la presente, incluye todos los anticuerpos humanos o humanizados que son preparados, expresados, creados o aislados por medios recombinantes, tales como anticuerpos aislados a partir de un animal (por ejemplo, un raton) que es transgenico o transcromosomico para los genes de inmunoglobulina humana, o un hibridoma preparado a partir de los mismos, anticuerpos aislados a partir de una celula huesped transformada para expresar el anticuerpo humano o humanizado, por ejemplo, de un transfectoma, anticuerpos aislados a partir de una biblioteca de anticuerpos humanos combinatorios, recombinantes, y anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique separar toda o una porcion de un gen de inmunoglobulina humana, secuencias para otras secuencias de aDn. Estos anticuerpos humanos o humanizados recombinantes tienen regiones variables en las cuales las regiones de estructura y las regiones determinantes de complementariedad (CDR) se pueden derivar a partir de las secuencias de inmunoglobulina de la llnea germinal humana. En ciertas realizaciones, sin embargo, estos anticuerpos humanos o humanizados recombinantes se pueden someter a mutagenesis in vitro (o, cuando se usa un animal transgenico para las secuencias de la Ig humana, a mutagenesis somatica in vivo), y de este modo, las secuencias de aminoacidos de las regiones Vh y Vl de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque se derivan a partir de, y se relacionan con, las secuencias Vh y Vl de la llnea germinal humana, pueden no existir naturalmente dentro del repertorio de la llnea germinal de anticuerpos humanos in vivo.

Como se utiliza en la presente, "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpo (por ejemplo, IgM, IgE, IgG, tales como IgG1 o IgG4) que es proporcionado por los genes de region constante de cadena pesada. Diferentes isotipos tienen diferentes funciones efectoras. Por ejemplo, Los isotipos IgG1 e IgG3 humanos de tipo silvestre median la actividad de citotoxicidad mediada por celulas dependiente del anticuerpo (ADCC).

Las expresiones "un anticuerpo que reconoce un antlgeno" y "un anticuerpo especlfico para un antlgeno" y "un anticuerpo dirigido contra un antlgeno”, se utilizan indistintamente en la presente con el termino "un anticuerpo que se enlaza especlficamente a un antlgeno”.

Como se utiliza en la presente, un anticuerpo o una protelna que "se enlaza especlficamente al polipeptido de CD40" pretende referirse a un anticuerpo o una protelna que se enlaza al polipeptido de CD40 humano con una Kd de 100 nM o menos, de 10 nM o menos, o de 1 nM o menos.

Un anticuerpo que "tiene reaccion cruzada con un antlgeno distinto del CD40" pretende referirse a un anticuerpo que se enlaza a este antlgeno con una Kd de 1 pM o menor, de 100 nM o menor, de 10 nM o menor, o de 1 nM o menor. Un anticuerpo que "no tiene reaccion cruzada con un antlgeno particular" pretende referirse a un anticuerpo que se enlaza a ese antlgeno, con una Kd de 100 nM o mayor, o con una Kd de 1 pM o mayor, o una Kd de 10 pM o mayor. En ciertas realizaciones, estos anticuerpos que no tienen reaccion cruzada con el antlgeno exhiben un enlace esencialmente indetectable contra estas protelnas en los ensayos de enlace convencionales.

El termino "Kasoc" o "Ka", como se utiliza en la presente, pretende referirse al Indice de asociacion de una interaction particular de anticuerpo-antlgeno, mientras que el termino "Kdis" o "Kd", como se utiliza en la presente, pretende referirse al Indice de disociacion de una interaccion particular de anticuerpo-antlgeno.

El termino "Kd", como se utiliza en la presente, pretende referirse a la constante de disociacion, la cual se obtiene a partir de la proportion de Kd a Ka (es decir, Kd/Ka), y se expresa como una concentration molar (M). Los valores Kd

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para los anticuerpos se pueden determinar empleando los metodos bien establecidos en este campo. Un metodo para determinar la Kd de un anticuerpo es utilizando resonancia de plasmon superficial, o utilizando un sistema biosensor, tal como un sistema Biacore®.

Como se utiliza en la presente, el termino "Afinidad" se refiere a la fuerza de interaccion entre el anticuerpo y el antlgeno en los sitios antigenicos individuales. Dentro de cada sitio antigenico, la region variable del "brazo" del anticuerpo interactua a traves de fuerzas no covalentes debiles con el antlgeno en numerosos sitios; mientras mas interacciones haya, mas fuerte sera la afinidad.

Como se utiliza en la presente, el termino "Avidez" se refiere a una medida de information de la estabilidad o fuerza global del complejo de anticuerpo-antlgeno. Se controla mediante tres factores principales: la afinidad del epltopo del anticuerpo; la valencia de tanto el antlgeno como del anticuerpo; y la configuration estructural de las partes que interactuan. Por ultimo estos factores definen la especificidad del anticuerpo, es decir, la probabilidad de que el anticuerpo particular se enlace al epltopo preciso del antlgeno.

Como se utiliza en la presente, el termino “antagonista de CD40” pretende referirse a un anticuerpo o a una protelna que inhibe la actividad de serialization inducida por CD40 en la presencia del CD40L en un ensayo de celulas humanas, tal como el ensayo de PBMC mediada por el CD40L. Este ensayo se describe con mayor detalle en los Ejemplos mas adelante. En algunas realizaciones, los anticuerpos o las protelnas de la invention inhiben la senalizacion inducida por CD40L con una IC50 de 500 nanogramos/mililitro o menos, de preferencia con una IC50 de 50 nanogramos/mililitro o menos, por ejemplo, con una IC50 de 20 nanogramos/mililitro o menos, como se mide en el ensayo de proliferation de PBMC mediada por el CD40L.

Como se utiliza en la presente, un anticuerpo con “ninguna actividad agonista" pretende referirse a un anticuerpo que no aumenta de una manera significativa la actividad de senalizacion mediada por CD40 en ausencia del CD40L en un ensayo basado en celulas, tal como el ensayo de proliferacion de PBMC mediada por el CD40L. Este ensayo se describe con mas detalles en los Ejemplos mas adelante.

Como se utiliza en la presente, el termino “ADCC" o actividad de "citotoxicidad celular dependiente de los anticuerpos” se refiere a la actividad de consumo de celulas. La actividad de ADCC se puede medir mediante el ensayo de ADCC como se describe con mas detalles en los Ejemplos mas adelante.

Como se utiliza en la presente, el termino anticuerpo "silencioso" se refiere a un anticuerpo que no exhibe ninguna actividad, o que exhibe una baja actividad de ADCC, como se mide en un ensayo de ADCC como se describe en los Ejemplos.

En una realization, el termino “ninguna o baja actividad de ADCC” significa que el anticuerpo silencioso exhibe una actividad de ADCC que esta por debajo del 50 % de lisis celular especlfica, por ejemplo, por debajo del 10 % de lisis celular especlfica, como se mide en el ensayo de citotoxicidad celular dependiente de los anticuerpos (ADCC), como se describe en los Ejemplos. Ninguna actividad de ADCC significa que el anticuerpo silencioso exhibe una actividad de ADCC (lisis celular especlfica) que esta debajo del 1 %. En una realizacion, especlfica, un anticuerpo silencioso de acuerdo con la invencion no exhibe ninguna actividad significativa de ADCC, como se mide en un ensayo de ADCC como se describe en los Ejemplos.

Las funciones efectoras silenciadas se pueden obtener mediante una mutation en la region Fc de los anticuerpos, y se han descrito en la tecnica: LALA y N297A (Strohl, W., 2009, Curr. Opin. Biotechnol. Volumen 20(6): 685-691); y D265A (Baudino y colaboradores, 2008, J. Immunol. 181: 6664-69; Strohl, W., supra). Los ejemplos de los anticuerpos Fc de IgG1 silenciosos comprenden los denominados como LALA mutante, el cual comprende las mutaciones L234A y L235A en la secuencia de aminoacidos de Fc de IgG1. Otro ejemplo de un anticuerpo de IgG1 silencioso comprende la mutacion D265A. Otro anticuerpo de IgG1 silencioso comprende la mutacion N297A, la cual da como resultado anticuerpos aglicosilados/no glicosilados.

Como se utiliza en la presente, el termino “selectividad” para un anticuerpo o una protelna de la divulgation, se refiere a un anticuerpo o a una protelna que se enlaza a cierto polipeptido objetivo pero no a los polipeptidos estrechamente relacionados.

Como se utiliza en la presente, el termino "alta afinidad" por un anticuerpo, se refiere a un anticuerpo que tiene una Kd de 1 nM o menos para un antlgeno objetivo. Como se utiliza en la presente, el termino "sujeto" incluye a cualquier animal humano o no humano.

El termino "animal no humano" incluye a todos los vertebrados, por ejemplo mamlferos y no mamlferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, caballos, vacas, pollos, anfibios, reptiles, etc.

Como se utiliza en la presente, el termino "optimizada", significa que una secuencia de nucleotidos se ha alterado para codificar una secuencia de aminoacidos que utiliza codones que son preferidos en la celula u organismo de production, en general una celula eucariotica, por ejemplo una celula de Pichia, una celula de Trichoderma, una celula de ovario de hamster chino (CHO), o una celula humana. La secuencia de nucleotidos optimizada se disena para retener completamente, o tanto como sea posible, la secuencia de aminoacidos originalmente codificada por la

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secuencia de nucleotidos inicial, la cual tambien se conoce como la secuencia "progenitora". Las secuencias optimizadas de la presente se han disenado para tener codones que son preferidos en las celulas de mamlfero de ovario de hamster chino; sin embargo, tambien se preve en la presente la expresion optimizada de estas secuencias en otras celulas eucarioticas. Las secuencias de aminoacidos codificadas por las secuencias de nucleotidos optimizadas tambien son referidas como optimizadas.

Como se utiliza en la presente, el porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una funcion del numero de posiciones identicas compartidas por las secuencias (es decir, el porcentaje de identidad = # de posiciones identicas/# total de posiciones x 100), tomando en cuenta el numero de huecos, y la longitud de cada hueco, que se necesiten introducir para una alineacion optima de las dos secuencias. La comparacion de secuencias y la determinacion del porcentaje de identidad entre dos secuencias, se pueden llevar a cabo utilizando un algoritmo matematico, como se describe mas adelante.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoacidos se puede determinar utilizando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4: 11-17, 1988), el cual se ha incorporado en el programa ALIGN (version 2.0), utilizando una tabla de residuos ponderados PAM120, una multa por longitud de hueco de 12, y una multa por hueco de 4. De una manera alternativa, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoacidos se puede determinar utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol, Biol. 48: 444-453, 1970), el cual se ha incorporado en el programa Gap en el paquete de software GCG (disponible en
http://www.gcg.com), utilizando ya sea una matriz Blossom 62 o bien una matriz PAM250, y un peso de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6, o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5, o 6.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoacidos de nucleotidos tambien se puede determinar utilizando, por ejemplo, algoritmos tales como el programa BLASTN para secuencias de acidos nucleicos, utilizando por omision, una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M = 5, N = 4, y una comparacion de ambas cadenas.

Anticuerpos recombinantes

Los anticuerpos de la divulgacion incluyen los anticuerpos recombinantes humanizados mAb1-mAb3, aislados y estructuralmente caracterizados by sus secuencias de aminoacidos de cadena pesada y ligera de longitud completa, como se describen en la siguiente Tabla 1:

Tabla 1

Secuencias de aminoacidos de cadena pesada y ligera de longitud completa de los mAb1-mAb3

Anticuerpo

Secuencia de aminoacidos de cadena pesada de longitud completa Secuencia de aminoacidos de cadena ligera de longitud completa

mAb1

SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 12

mAb2

SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 14

mAb3

SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 16

Las secuencias de aminoacidos de las regiones variables correspondientes Vh y Vl de los anticuerpos aislados mAb1-mAb3 de la divulgacion, se derivan todas a partir del mismo anticuerpo Chir12.12 anteriormente descrito, por ejemplo, en la Publicacion Internacional Numero WO2006/073443, y que consiste en la secuencia de aminoacidos Vh de la SEQ ID NO: 7, y la secuencia de aminoacidos Vl de la SEQ ID NO: 8.

Una diferencia importante de los anticuerpos de la divulgacion, comparandose con el CHIR12.12 original, es que tienen una region Fc, la cual consiste en una region Fc de IgG silenciosa, por ejemplo, la region Fc de IgG1 silenciosa.

En particular, la Tabla 2 resume la modificacion de la region Fc de IgG1 realizada para obtener los anticuerpos mAb1-mAb3, comparandose con el anticuerpo CHIR12.12 original.

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Tabla 2

Modificacion de la region Fc de IgG1 para obtener los mAb1-mAb3

Anticuerpo

Modificacion de la region Fc de IgG1 Secuencia de aminoacidos de la region Fc

mAb1

N297A SEQ ID NO: 17

mAb2

D265A SEQ ID NO: 18

mAb3

L234A/L235A SEQ ID NO: 19

Otros anticuerpos de la divulgacion incluyen aquellos que tienen aminoacidos que se han mutado mediante supresion, insercion o sustitucion de aminoacidos, y no obstante, tienen al menos el 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con las regiones Vh y Vl de Chir12.12, respectivamente, las SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8, y que comprenden una region Fc de IgG silenciosa, por ejemplo, una region Fc de IgG1 silenciosa.

En algunas realizaciones, el anticuerpo de la divulgacion es una variante mutante de cualquiera de los mAb1-mAb3, en donde el anticuerpo variante mutante incluye secuencias de aminoacidos mutantes, en donde no mas de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoacidos se han mutado mediante supresion, insercion o sustitucion de aminoacidos en las regiones Vh y Vl, cuando se comparan con las regiones Vh y Vl de Chir12.12, respectivamente, las SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8, y que conservan las mismas regiones constantes que mAb1, mAb2 o mAb3.

Las secuencias de codificacion de nucleotidos de cadena ligera y pesada de longitud completa de los mAb1-mAb3 se muestran en la siguiente Tabla 3.

Tabla 3

Secuencias de codificacion de ADN de cadena pesada y ligera de longitud completa

Anticuerpo

Secuencia de codificacion de ADN de cadena pesada de longitud completa Secuencia de codificacion de ADN de cadena ligera de longitud completa

mAb1

SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 23

mAb2

SEQ ID NO: 24 SEQ ID NO: 25

mAb3

SEQ ID NO: 26 SEQ ID NO: 27

Otros acidos nucleicos que codifican los anticuerpos de la divulgacion incluyen los acidos nucleicos que se han mutado mediante supresion, insercion o sustitucion de nucleotidos, y no obstante, tienen al menos el 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con las regiones codificantes correspondientes Vh y Vl de Chir12.12, como se ilustran en las secuencias descritas, por ejemplo, en las SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 21, respectivamente, y que comprenden una secuencia de codificacion de una region Fc de IgG silenciosa, por ejemplo, una region Fc de IgG1 silenciosa.

En algunas realizaciones, incluye acidos nucleicos variantes, en donde no mas de 1, 2, 3, 4 o 5 nucleotidos han sido cambiados mediante supresion, insercion o sustitucion de nucleotidos in las regiones codificantes Vh y Vl con las regiones codificantes Vh y Vl ilustradas en las secuencias descritas, por ejemplo, en las SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 21, respectivamente, y que conservan las mismas secuencias de codificacion de las regiones constantes que las secuencias de codificacion correspondientes de los mAb1, mAb2 o mAb3.

Anticuerpos homologos

En adicion a los anticuerpos recombinantes de la divulgacion, mAb1-mAb3, la invencion tambien abarca anticuerpos o protelnas homologas que conservan las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos mAb1-mAb3.

En particular, los anticuerpos o las protelnas homologas de acuerdo con la divulgacion son los anticuerpos o las 5 protelnas que comprenden una porcion de enlace de antlgeno de un anticuerpo dirigido contra un polipeptido de CD40 objetivo (SEQ ID NO: 28), caracterizados porque este anticuerpo o esta protelna:

a) se enlaza al polipeptido de CD40 con una KD de 10 nM o menos, y

b) comprende una region Fc de IgG silenciosa,

y en donde los anticuerpos o las protelnas homologas conservan las propiedades funcionales deseadas de los 10 anticuerpos mAb1-mAb3 originales.

Las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos mAb1-mAb3 originales se pueden seleccionar a partir de una o mas de las siguientes propiedades:

(i) se enlaza especlficamente al CD40, por ejemplo, con una KD que es de 100 nM o menos, de 10 nM o menos, o de 1 nM o menos, como se mide en el ensayo Biacore;

15 (ii) es un antagonista de CD40, por ejemplo, inhibe la senalizacion inducida por CD40L, como se mide en el ensayo de PBMC mediada por el CD40L;

(iii) no exhibe ninguna actividad agonista o exhibe una baja actividad agonista, como se mide en un ensayo de PBMC mediada por el CD40L;

(iv) reacciona de manera cruzada con el polipeptido de CD40 de mono cinomolgo;

20 (v) no tiene ninguna o tiene una baja actividad de ADCC; y,

(vi) tiene propiedades adecuadas para el desarrollo de farmacos.

En una realizacion especlfica, los anticuerpos o las protelnas homologas de acuerdo con la invencion, comprenden una region Fc de IgG1 silenciosa, por ejemplo, una region Fc de IgG1 silenciosa seleccionada a partir del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 19.

25 En una realizacion especlfica, la divulgacion se refiere a un anticuerpo o a una protelna que tiene secuencias de nucleotidos de cadena pesada y ligera de region variable, o secuencias de aminoacidos de cadena pesada y ligera de region variable, o las secuencias de aminoacidos o las secuencias de codificacion de nucleotidos de las 6 regiones determinantes de complementariedad (CDRs) que son homologas a las secuencias de aminoacidos o de nucleotidos correspondientes de los anticuerpos mAb1-mAb3 descritos anteriormente, en particular, en la Tabla 1, y 30 este anticuerpo o esta protelna comprende una region Fc de IgG silenciosa seleccionada a partir del grupo que consiste en la region Fc del mAb1 (SEQ ID NO: 17), la region Fc del mAb2 (SEQ ID NO: 18), y la region Fc del mAb3 (SEQ ID NO: 19), en donde el anticuerpo o la protelna homologa se enlaza especlficamente al CD40, y el anticuerpo o la protelna exhibe las siguientes propiedades funcionales: es un antagonista de CD40, no exhibe ninguna actividad agonista o exhibe una baja actividad agonista, y no tiene ninguna o tiene una baja actividad de ADCC.

35 Por ejemplo, la divulgacion se refiere a anticuerpos o protelnas homologas a los mAb1-mAb3, las cuales comprenden una region Fc de IgG silenciosa seleccionada a partir del grupo que consiste en la region Fc del mAb1 (SEQ ID NO: 17), la region Fc del mAb2 (SEQ ID NO: 18), y la region Fc del mAb3 (SEQ ID NO: 19), y que comprenden una secuencia de cadena pesada variable (Vh), y una secuencia de cadena ligera variable (Vl), en donde las secuencias de region determinante de complementariedad (CDR) comparten al menos el 60, 70, 90, 95, 40 96, 97, 98, 99 o 100 por ciento de identidad de secuencia con las secuencias de region determinante de

complementariedad (CDR) correspondientes de los mAb1-mAb3, respectivamente, las SEQ ID NOs:1-6, en donde el anticuerpo o la protelna homologa se enlaza especlficamente al CD40, y el anticuerpo o la protelna homologa exhibe las siguientes propiedades funcionales: es un antagonista de CD40, no exhibe ninguna actividad agonista o exhibe una baja actividad agonista, y no tiene ninguna o tiene una baja actividad de ADCC.

45 En una realizacion especlfica relacionada, el anticuerpo o la protelna homologa:

a) se enlaza a CD40 con una KD de 1 nM o menos;

b) inhibe la senalizacion inducida por CD40L con una IC50 de 50 nanogramos/mililitro o menos, como se mide en el ensayo de PBMC mediada por el CD40L descrito en los Ejemplos;

c) no tiene ninguna actividad agonista o tiene una baja actividad agonista, como se mide en un bioensayo, tal como 50 el ensayo de PBMC mediada por el CD40L, como se describe en los Ejemplos; y

d) no tiene ninguna actividad o tiene una baja actividad de ADCC.

La divulgacion se refiere ademas a anticuerpos o protelnas homologas a los mAb1-mAb3, las cuales comprenden una region Fc de IgG silenciosa seleccionada a partir del grupo que consiste en la region Fc del mAb1 (SEQ ID NO: 17), la region Fc del mAb2 (SEQ ID NO: 18), y la region Fc del mAb3 (SEQ ID NO: 19), y que comprenden una 5 secuencia de cadena pesada variable (Vh), y una secuencia de cadena ligera variable (Vl), las cuales comparten al menos el 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad de secuencia con las secuencias (Vh) y (Vl) correspondientes de los mAb1-mAb3, respectivamente, las SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8, en donde el anticuerpo o la protelna homologa se enlaza especlficamente al CD40, y el anticuerpo o la protelna exhibe las siguientes propiedades funcionales: es un antagonista de CD40, no exhibe ninguna actividad agonista o exhibe una baja 10 actividad agonista, y no tiene ninguna o tiene una baja actividad de ADCC.

En una realizacion especlfica relacionada, el anticuerpo o la protelna homologa:

a) se enlaza a CD40 con una KD de 1 nM o menos;

b) inhibe la serialization inducida por CD40L con una IC50 de 50 nanogramos/mililitro o menos, como se mide en el ensayo de PBMC mediada por el CD40L descrito en los Ejemplos;

15 c) no tiene ninguna actividad agonista o tiene una baja actividad agonista, como se mide en un bioensayo, tal como el ensayo de PBMC mediada por el CD40L descrito en los Ejemplos; y

d) no tiene ninguna actividad o tiene una baja actividad de ADCC.

En otro ejemplo, la divulgacion se refiere a anticuerpos o protelnas homologas a los mAb1-mAb3, las cuales comprenden una region Fc de IgG silenciosa seleccionada a partir del grupo que consiste en la region Fc del mAb1 20 (SEQ ID NO: 17), la region Fc del mAb2 (SEQ ID NO: 18), y la region Fc del mAb3 (SEQ ID NO: 19), y en donde: las cadenas pesadas y ligeras variables son codificadas por una secuencia de nucleotidos que es al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, o el 100 % identica a la secuencia de codification de nucleotidos correspondiente de las cadenas pesadas y ligeras variables de los mAb1-mAb3, en donde el anticuerpo o la protelna homologa se enlaza especlficamente al CD40, y el anticuerpo o la protelna exhibe las siguientes propiedades funcionales: es un 25 antagonista de CD40, no exhibe ninguna actividad agonista o exhibe una baja actividad agonista, y no tiene ninguna o tiene una baja actividad de ADCC.

En una realizacion especlfica relacionada, el anticuerpo o la protelna homologa:

a) se enlaza a CD40 con una KD de 1 nM o menos;

b) inhibe la senalizacion inducida por CD40L con una IC50 de 50 nanogramos/mililitro o menos, como se mide en el 30 ensayo de PBMC mediada por el CD40L descrito en los Ejemplos;

c) no tiene ninguna actividad agonista o tiene una baja actividad agonista, como se mide en un bioensayo, tal como el ensayo de PBMC mediada por el CD40L descrito en los Ejemplos; y

d) no tiene ninguna actividad o tiene una baja actividad de ADCC.

Los anticuerpos con secuencias de aminoacidos mutantes se pueden obtener mediante mutagenesis (por ejemplo, 35 mutagenesis dirigida al sitio o mediada por la reaction en cadena de la polimerasa (PCR)) de las moleculas de acidos nucleicos codificantes, seguida por la prueba del anticuerpo alterado codificado para determinar la funcion conservada (es decir, las funciones estipuladas anteriormente), utilizando los ensayos funcionales descritos en los Ejemplos mas adelante.

En ciertas realizaciones, los anticuerpos o las protelnas homologas a los mAb1-mAb3, como se describen 40 anteriormente, tienen modificaciones de secuencias conservadoras.

Como se utiliza en la presente, el termino "modificaciones de secuencias conservadoras" pretende referirse a las sustituciones de aminoacidos en donde el residuo de aminoacido es reemplazado con un residuo de aminoacido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de los residuos de aminoacidos que tiene cadenas laterales similares se han definido en este campo. Estas familias incluyen los aminoacidos con cadenas laterales basicas (por ejemplo, 45 lisina, arginina, histidina), cadenas laterales acidas (por ejemplo, acido aspartico, acido glutamico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cistelna, triptofano), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales con ramification beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina), y cadenas laterales aromaticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Por consiguiente, uno o mas residuos de aminoacidos dentro 50 de las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de un anticuerpo de la divulgacion, pueden ser reemplazados con otros residuos de aminoacidos a partir de la misma familia de la cadena lateral, y el anticuerpo alterado se puede probar para determinar la funcion conservada utilizando los ensayos funcionales descritos en la presente.

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Se pueden introducir modificaciones en un anticuerpo de la divulgacion mediante las tecnicas convencionales conocidas en la tecnica, tales como mutagenesis dirigida al sitio y mutagenesis mediada por la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR).

Moleculas de acidos nucleicos que codifican los anticuerpos o las protelnas de la divulgacion

Otro aspecto de la divulgacion pertenece a moleculas de acidos nucleicos que codifican los anticuerpos o las protelnas de la divulgacion, como se describen anteriormente.

Los ejemplos de las secuencias de nucleotidos de cadena ligera y pesada de cualquiera de los mAbl a mAb3 se pueden derivar a partir de la Tabla 3 (que muestra las secuencias de codificacion de nucleotidos enteras de las cadenas pesadas y ligeras de los mAbl a mAb3).

Otros ejemplos de las secuencias de nucleotidos de cadena ligera y pesada de acuerdo con la divulgacion son cualquier secuencia que codifique para las secuencias de aminoacidos pesadas y/o ligeras de longitud completa de los mAbl, mAb2 o mAb3, como se describen en la Tabla 1.

La divulgacion tambien pertenece a moleculas de acidos nucleicos que se derivan a partir de las ultimas secuencias que se han optimizado para la expresion de la protelna en celulas de mamlfero, por ejemplo, las llneas celulares CHO.

Los acidos nucleicos pueden estar presentes en las celulas enteras, en un lisado celular, o pueden ser acidos nucleicos en una forma parcialmente purificada o sustancialmente pura. Un acido nucleico esta "aislado" o "se hace sustancialmente puro" cuando se purifica de otros componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo, otros acidos nucleicos o protelnas celulares, mediante tecnicas convencionales, incluyendo tratamiento alcalino/SDS, formacion de bandas de CsCl, cromatografla en columna, electroforesis en gel de agarosa, y otras bien conocidas en este campo. Vease F. Ausubel, y colaboradores, Editores, 1987 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, Nueva York. Un acido nucleico de la divulgacion puede ser, por ejemplo, ADN o ARN, y puede o no contener secuencias intronicas. En una realizacion, el acido nucleico es una molecula de ADNc. El acido nucleico puede estar presente en un vector, tal como un vector de exhibicion de fago, o en un vector de plasmido recombinante.

Los acidos nucleicos de la divulgacion se pueden obtener empleando tecnicas de biologla molecular convencionales. Una vez que se obtienen los fragmentos de ADN que codifican, por ejemplo, los segmentos Vh y Vl, estos fragmentos de ADN se pueden manipular adicionalmente mediante tecnicas de ADN recombinante convencionales, por ejemplo, para convertir los genes de region variable hasta genes de cadena de anticuerpo de longitud completa, hasta genes de fragmentos Fab, o hasta un gen de scFv. En estas manipulaciones, un fragmento de ADN que codifique Vl o Vh se enlaza operativamente a otra molecula de ADN, o a un fragmento que codifique la region constante de anticuerpo de los mAb1-mAb3 que comprenden la region Fc como se definen en las SEQ ID NOs: 17-19.

El termino "operativamente enlazado", como se utiliza en este contexto, pretende significar que los dos fragmentos de ADN se unen de una manera funcional, por ejemplo, de tal manera que las secuencias de aminoacidos codificadas por los dos fragmentos de ADN permanecen dentro del marco, o de tal manera que la protelna se expresa bajo el control de un promotor deseado.

El ADN aislado que codifica la region Vh se puede convertir hasta un gen de cadena pesada de longitud completa mediante el enlace operativo del ADN que codifique Vh a otra molecula de ADN que codifique las regiones constantes de cadena pesada (CH1, CH2, y CH3). Las secuencias de los genes de region constante de cadena pesada humanos son conocidas en este campo (vease, por ejemplo, Kabat, E. A., y colaboradores, 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edicion, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos, NIH Publicacion Numero 91-3242), y los fragmentos de ADN que abarcan estas regiones se pueden obtener mediante una amplificacion convencional con reaccion en cadena de la polimerasa (PCR). La region constante de cadena pesada se puede seleccionar entre los isotipos IgG1 que comprenden la region Fc, como se definen en las SEQ ID NOs: 17-19.

El ADN aislado que codifica la region Vl se puede convertir hasta un gen de cadena ligera de longitud completa (as! como hasta un gen de cadena ligera de Fab), mediante el enlace operativo del ADN que codifique Vl a otra molecula de ADN que codifique la region constante de cadena ligera, CL. Las secuencias de los genes de region constante de cadena ligera humanos son conocidas en la tecnica (vease, por ejemplo, Kabat, E. A., y colaboradores, 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edicion, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos, NIH Publicacion Numero 91-3242), y los fragmentos de ADN que abarcan estas regiones se pueden obtener mediante una amplificacion convencional con reaccion en cadena de la polimerasa. La region constante de cadena ligera puede ser una region constante kappa o lambda.

Generacion de transfectomas que producen anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos o las protelnas de la divulgacion tambien se pueden producir en un transfectoma de celulas

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huesped utilizando, por ejemplo, una combinacion de tecnicas de ADN recombinante y metodos de transfeccion de genes, como es bien conocido en este campo (por ejemplo, Morrison, S. (1985) Science 229:1202).

Por ejemplo, con el fin de expresar los anticuerpos, se pueden obtener los ADNs que codifiquen las cadenas ligera y pesada de longitud parcial o completa mediante las tecnicas de biologla molecular o de bioqulmica convencionales (por ejemplo, slntesis qulmica del ADN, amplificacion con reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), o clonacion del ADNc utilizando un hibridoma que exprese el anticuerpo de interes), y los ADNs se pueden insertar en los vectores de expresion, de tal manera que los genes se enlacen operativamente a las secuencias de control de transcripcion y de traduccion. En este contexto, el termino "enlazado operativamente" pretende significar que un gen de anticuerpo se liga en un vector, de tal manera que las secuencias de control de transcripcion y de traduccion dentro del vector sirven para su funcion pretendida de regular la transcripcion y la traduccion del gen del anticuerpo. El vector de expresion y las secuencias de control de expresion se seleccionan para ser compatibles con la celula huesped de expresion utilizada. El gen de cadena ligera del anticuerpo y el gen de cadena pesada del anticuerpo se pueden insertar en un vector separado, o mas tlpicamente, ambos genes se insertan en el mismo vector de expresion.

Los genes de anticuerpo se insertan en el vector de expresion mediante metodos convencionales (por ejemplo, ligamiento de los sitios de restriccion complementarios sobre el fragmento del gen de anticuerpo y el vector, o ligamiento de extremos romos si no hay sitios de restriccion presentes). Las regiones variables de cadena ligera y pesada de los anticuerpos descritos en la presente se pueden utilizar para crear genes de anticuerpo de longitud completa, mediante su insercion en los vectores de expresion que ya codifiquen las regiones constantes de cadena pesada y constantes de cadena ligera de la secuencia deseada correspondiente a dichas regiones constantes de los mAb1, mAb2 o mAb3, de tal manera que el segmento Vh se enlace operativamente a los segmentos Vh dentro del vector, y el segmento Vl se enlace operativamente al segmento CL dentro del vector. Adicionalmente o de una manera alternativa, el vector de expresion recombinante puede codificar un peptido de senal que facilite la secrecion de la cadena de anticuerpo a partir de una celula huesped. El gen de la cadena de anticuerpo se puede clonar en el vector, de tal manera que el peptido de senal se enlace dentro del marco al termino amino del gen de la cadena de anticuerpo. El peptido de senal puede ser un peptido de senal de inmunoglobulina o un peptido de senal heterologo (es decir, un peptido de senal a partir de una protelna que no es inmunoglobulina).

En adicion a los genes de cadenas de anticuerpos, los vectores de expresion recombinante de la divulgacion llevan secuencias reguladoras que controlan la expresion de los genes de la cadena del anticuerpo en una celula huesped. El termino "secuencia reguladora" pretende incluir los promotores, los potenciadores, y otros elementos de control de expresion (por ejemplo, las senales de poliadenilacion) que controlan la transcripcion o la traduccion de los genes de la cadena del anticuerpo. Estas secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA 1990). Sera apreciado por los expertos en este campo que el diseno del vector de expresion, incluyendo la seleccion de las secuencias reguladoras, puede depender de factores tales como la eleccion de la celula huesped que se vaya a transformar, del nivel de expresion de protelna deseado, etc. Las secuencias reguladoras para la expresion de celulas huesped de mamlfero incluyen los elementos virales que dirigen altos niveles de expresion de protelna en las celulas de mamlfero, tales como los promotores y/o los potenciadores derivados a partir de citomegalovirus (CMV), virus de simio 40 (SV40), adenovirus (por ejemplo, el promotor tardlo mayor de adenovirus (AdMLP)), y polioma. De una manera alternativa, se pueden utilizar las secuencias reguladoras no virales, tales como el promotor de ubiquitina o el promotor de P-globina. Todavla adicionalmente, se pueden utilizar los elementos reguladores que estan compuestos de secuencias de diferentes fuentes, tales como el sistema promotor SRa, que contiene las secuencias a partir del promotor temprano de SV40, y la repeticion terminal larga del virus de leucemia de celulas T humanas tipo 1 (Takabe, Y. y colaboradores, 1988 Mol. Cell. Biol. 8:466-472).

En adicion a los genes de cadena de anticuerpo y a las secuencias reguladoras, los vectores de expresion recombinante de la divulgacion pueden llevar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulen la replica del vector en las celulas huesped (por ejemplo, orlgenes de replica), y genes marcadores seleccionables. El gen marcador seleccionable facilita la seleccion de las celulas huesped en donde se haya introducido el vector (veanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos de Norteamerica Numeros 4,399,216, 4,634,665 y 5,179,017, todas por Axel y colaboradores). Por ejemplo, tlpicamente, el gen marcador seleccionable confiere resistencia a farmacos, tales como a G418, higromicina, o metotrexato, a una celula huesped en donde se haya introducido el vector. Los genes marcadores seleccionables incluyen el gen de reductasa de dihidrofolato (DHFR) (para utilizarse en las celulas huesped de DHFR con seleccion/amplificacion de metotrexato), y el gen neo (para la seleccion de G418).

Para la expresion de las cadenas ligera y pesada, los vectores de expresion que codifiquen las cadenas pesada y ligera, se transfectan en una celula huesped mediante tecnicas convencionales. Las diferentes formas del termino "transfeccion" pretenden abarcar una amplia variedad de tecnicas comunmente empleadas para la introduccion de ADN exogeno en una celula huesped procariotica o eucariotica, por ejemplo, electroporacion, precipitacion con fosfato de calcio, transfeccion con DEAE-dextrano, y similares. Teoricamente, es posible expresar los anticuerpos de la divulgacion en celulas huesped ya sean procarioticas o bien eucarioticas. La expresion de los anticuerpos en las celulas eucarioticas, por ejemplo, en las celulas huesped de mamlfero, en levadura, o en hongos filamentosos, se discute debido a que estas celulas eucarioticas, y en particular las celulas de mamlfero, tienen mas probabilidades que las celulas procarioticas para ensamblarse y secretar un anticuerpo apropiadamente plegado e

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inmunologicamente activo.

En una realizacion especlfica, un vector de clonacion o de expresion de acuerdo con la divulgacion comprende cualquiera de al menos una de las siguientes secuencias de codificacion (a)-(c), operativamente enlazada a las secuencias promotoras adecuadas:

(a) SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 23 que codifican respectivamente las cadenas pesadas y ligeras de longitud completa del mAb1;

(b) SEQ ID NO: 24 y SEQ ID NO: 25 que codifican respectivamente las cadenas pesadas y ligeras de longitud completa del mAb2; o

(c) SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 27 que codifican respectivamente las cadenas pesadas y ligeras de longitud completa del mAb3.

Las celulas huesped de mamlfero para expresar los anticuerpos recombinantes de la divulgacion incluyen las celulas de ovario de hamster chino (celulas CHO) (incluyendo las celulas CHO de DHFR, descritas por Urlaub y Chasin, 1980 Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 77: 4216-4220, utilizadas con un marcador seleccionable de DH FR, por ejemplo, como se describe en R. J. Kaufman y P. A. Sharp, 1982 Mol. Biol. 159: 601-621), las llneas celulares ChOk1 dhfr+, las celulas de mieloma NSO, las celulas COS, y las celulas SP2). En particular, para utilizarse con las celulas de mieloma NSO, otro sistema de expresion es el sistema de expresion genetica GS mostrado en las Publicaciones Internacionales del TCP Numeros WO 87/04462 y WO89/01036, y en la Patente Europea Numero EP 0,338,841.

Cuando se introducen vectores de expresion recombinante que codifican genes de anticuerpos en las celulas huesped de mamlfero, los anticuerpos se producen mediante el cultivo de las celulas huesped durante un perlodo de tiempo suficiente para permitir la expresion del anticuerpo en las celulas huesped, o la secrecion del anticuerpo en el medio de cultivo en donde se hagan crecer las celulas huesped. Los anticuerpos se pueden recuperar a partir del medio de cultivo empleando metodos de purificacion de protelnas convencionales. (Vease, por ejemplo, Abhinav y colaboradores, 2007, Journal of Chromatography 848: 28-37).

En una realizacion especlfica, la celula huesped de la divulgacion es una celula huesped transfectada con un vector de expresion que tiene las secuencias de codificacion seleccionadas a partir del grupo que consiste en (a)-(c) adecuadas para la expresion de los mAb1-mAb3, respectivamente, operativamente enlazadas a las secuencias promotoras adecuadas:

(a) SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 23;

(b) SEQ ID NO: 24 y SEQ ID NO: 25; y

(c) SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 27.

Estas ultimas celulas huesped se pueden cultivar entonces adicionalmente bajo condiciones adecuadas para la expresion y produccion de un anticuerpo de la divulgacion seleccionado a partir del grupo que consiste en los mAb1- mAb3, respectivamente.

Moleculas biespeclficas

En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona moleculas biespeclficas o multiespeclficas que comprenden un anticuerpo o una protelna anti-CD40 de la divulgacion. Un anticuerpo o una protelna de la divulgacion se puede derivar o enlazar a otra molecula funcional, por ejemplo a otro peptido o a otra protelna (por ejemplo, a otro anticuerpo o ligando para un receptor), con el fin de generar una molecula biespeclfica que se enlace a al menos dos sitios de enlace o moleculas objetivo diferentes. El anticuerpo de la divulgacion, de hecho, se puede derivar o enlazar a mas de una molecula funcional diferente para generar moleculas multiespeclficas que se enlacen a mas de dos sitios de enlace y/o moleculas objetivo diferentes; estas moleculas multiespeclficas tambien pretenden ser abarcadas por el termino "molecula biespeclfica", como se utiliza en la presente. Con el fin de crear una molecula biespeclfica de la divulgacion, un anticuerpo o una protelna de la divulgacion se puede enlazar funcionalmente (por ejemplo, mediante acoplamiento qulmico, fusion genetica, asociacion no covalente, o de otra manera), a una o mas moleculas de enlace diferentes, tales como otro anticuerpo, fragmento de anticuerpo, peptido o mimetico de enlace, de tal manera que resulte una molecula biespeclfica.

De conformidad con lo anterior, la presente divulgacion incluye las moleculas biespeclficas que comprenden al menos una primera especificidad de enlace para CD40, por ejemplo, una porcion de enlace de antlgeno de cualquiera de los mAb1-mAb3, y una segunda especificidad de enlace para un segundo epltopo objetivo. Por ejemplo, el segundo epltopo objetivo es otro epltopo de CD40 diferente del primer epltopo objetivo. Otro ejemplo es una molecula biespeclfica que comprende al menos una primera especificidad de enlace para CD40, por ejemplo, una porcion de enlace de antlgeno de cualquiera de los mAb1-mAb3, y una segunda especificidad de enlace para un epltopo dentro de CD40.

Adicionalmente, para la divulgacion en donde la molecula biespeclfica es multiespeclfica, la molecula puede incluir

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ademas una tercera especificidad de enlace, en adicion a los primero y segundo epltopos objetivo.

Las moleculas biespeclficas de la presente divulgacion se pueden preparar mediante la conjugacion de las especificidades de enlace constituyentes, empleando los metodos conocidos en este campo. Por ejemplo, cada especificidad de enlace de la molecula biespeclfica se puede generar por separado, y luego se pueden conjugar unas con otras. Cuando las especificidades de enlace son protelnas o peptidos, se puede utilizar una variedad de agentes de acoplamiento o de reticulacion para la conjugacion covalente. Los ejemplos de los agentes de reticulacion incluyen Protelna A, carbodi-imida, tioacetato de N-succinimidil-S-acetilo (SATA), 5,5'-ditiobis-(acido 2- nitro-benzoico) (DTNB), o-fenilen-dimaleimida (oPDM), 3-(2-ditiopiridil)-propionato de N-succinimidilo (SPDP), y 4-(N- maleimido-metil)-ciclohexan-1-carboxilato de sulfo-succinimidilo (sulfo-SMcC) (veanse, por ejemplo, Karpovsky y colaboradores, 1984 J. Exp. Med. 160: 1686; Liu, MA y colaboradores, 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 82: 8648). Otros metodos incluyen aquellos descritos en Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan y colaboradores, 1985 Science 229: 81-83); y Glennie y colaboradores, 1987 J. Immunol. 139: 2367-2375). Los agentes de conjugacion son SATA y sulfo-SMcC, estando ambos disponibles en Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).

Cuando las especificidades de enlace son anticuerpos, estos se pueden conjugar mediante el enlace con sulfhidrilo de las regiones de articulacion del termino C de las dos cadenas pesadas. En una realizacion particular, la region de articulacion se modifica para contener un numero non de residuos de sulfhidrilo, por ejemplo, uno, antes de la conjugacion.

De una manera alternativa, ambas especificidades de enlace se pueden codificar en el mismo vector, y se pueden expresar y ensamblar en la misma celula huesped. Este metodo es particularmente util cuando la molecula biespeclfica es una protelna de fusion de mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2, o ligando x Fab. Una molecula biespeclfica de la divulgacion puede ser una molecula de una sola cadena que comprenda un anticuerpo de una sola cadena y un determinante de enlace, o una molecula biespeclfica de una sola cadena que comprenda dos determinantes de enlace. Las moleculas biespeclficas pueden comprender al menos dos moleculas de una sola cadena. Los metodos para la preparacion de las moleculas biespeclficas se describen, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos de Norteamerica Numero 5,260,203; en la Patente de los Estados Unidos de Norteamerica Numero 5,455,030; en la Patente de los Estados Unidos de Norteamerica Numero 4,881,175; en la Patente de los Estados Unidos de Norteamerica Numero 5,132,405; en la Patente de los Estados Unidos de Norteamerica Numero 5,091,513; en la Patente de los Estados Unidos de Norteamerica Numero 5,476,786; en la Patente de los Estados Unidos de Norteamerica Numero 5,013,653; en la Patente de los Estados Unidos de Norteamerica Numero 5,258,498; y en la Patente de los Estados Unidos de Norteamerica Numero 5,482,858.

El enlace de las moleculas biespeclficas a sus objetivos especlficos se puede confirmar, por ejemplo, mediante el ensayo inmunosorbente enlazado con enzimas (ELISA), el radio-inmunoensayo (RIA), el analisis FACS, un bioensayo (por ejemplo, inhibicion del crecimiento), o el ensayo Western blot. Cada uno de estos ensayos detecta en general la presencia de los complejos de protelna-anticuerpo de interes particular, mediante el empleo de un reactivo marcado (por ejemplo, un anticuerpo) especlfico para el complejo de interes.

Anticuerpos multivalentes

En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona anticuerpos multivalentes que comprenden al menos dos porciones de enlace de antlgeno identicas o diferentes de los anticuerpos de la divulgacion, que se enlazan al CD40, por ejemplo, seleccionadas a partir de las porciones de enlace de antlgeno de cualquiera de los mAb1-mAb3. En una realizacion, los anticuerpos multivalentes proporcionan al menos dos, tres, o cuatro porciones de enlace de antlgeno de los anticuerpos. Las porciones de enlace de antlgeno se pueden enlazar entre si por medio de fusion de protelna o de un enlace covalente o no covalente. De una manera alternativa, se han descrito los metodos de enlace para las moleculas biespeclficas. Los compuestos tetravalentes se pueden obtener, por ejemplo, mediante la reticulacion de los anticuerpos de la divulgacion con un anticuerpo que se enlace a las regiones constantes de los anticuerpos de la divulgacion, por ejemplo, la region Fc o de articulacion.

Metodos de terapia utilizando los anticuerpos antagonistas anti-CD40 de la divulgacion

Los metodos de la divulgacion se refieren al uso de los anticuerpos o de las protelnas anti-CD40 de la divulgacion para tratar sujetos (es decir, pacientes) que tengan una enfermedad autoinmune y/o una enfermedad inflamatoria, o una predisposicion a desarrollar una enfermedad autoinmune y/o una enfermedad inflamatoria, en donde la enfermedad y/o inflamacion sea mediada por la senalizacion de CD40 mediada por el CD40L en las celulas que expresen el antlgeno de CD40.

Los metodos para detectar la expresion de CD40 en las celulas son bien conocidos en la tecnica e incluyen, pero no se limitan a, las tecnicas de reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), la inmunohistoqulmica, la citometrla de flujo, Western blot, ELISA, y similares.

Los metodos de la divulgacion son en especial utiles para el tratamiento de enfermedades inflamatorias y/o autoinmunes en donde este involucrada la estimulacion de CD40 mediada por el CD40L.

Las enfermedades inflamatorias se caracterizan por inflamacion y destruction del tejido, o una combination de las

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mismas. "Una enfermedad inflamatoria" incluye cualquier proceso inflamatorio inmunologicamente mediado en donde el suceso iniciador o el objetivo de la respuesta inmunitaria involucra antigenos no propios, incluyendo, por ejemplo, aloantigenos, xenoantigenos, antigenos virales, antigenos bacterianos, antigenos desconocidos, o alergenos.

Ademas, para los propositos de la presente divulgacion, el termino "enfermedades inflamatorias" incluye "enfermedades autoinmunes". Como se utiliza en la presente, el termino "autoinmunidad" se entiende en general para abarcar los procesos inflamatorios inmunologicamente mediados que involucran a los antigenos "propios" (auto-antigenos). En las enfermedades autoinmunes, los antigenos propios (auto-antigenos) desencadenan las respuestas inmunitarias del huesped.

Tambien, la presente divulgacion incluye el tratamiento de la inflamacion asociada con un rechazo de trasplante de tejido. "Rechazo de trasplante" o "rechazo de injerto" se refiere a cualquier respuesta inmunitaria montada por el huesped contra un injerto, incluyendo, pero no limitandose a, antigenos de HLA, antigenos de grupo sanguineo, y similares.

La divulgacion tambien se puede utilizar para tratar la enfermedad del injerto contra el huesped, tal como aquella asociada con trasplante de medula osea, por ejemplo. En esta enfermedad del injerto contra el huesped, la medula osea del donador incluye linfocitos y celulas que maduran hasta linfocitos. Los linfocitos del donador reconocen los antigenos del receptor como no propios, y montan una respuesta inmunitaria inflamatoria. Por consiguiente, como se utiliza en la presente, la "enfermedad del injerto contra el huesped" o la "reaccion del injerto contra el huesped" se refiere a cualquier respuesta inmunitaria mediada por las celulas T, en donde los linfocitos del donador reaccionan a los antigenos del huesped.

Los anticuerpos o las proteinas antagonistas anti-CD40 descritos en la presente, por ejemplo, mAbl, mAb2 o mAb3, se pueden utilizar de acuerdo con los metodos de la divulgacion para tratar trastornos autoinmunes y/o inflamatorios, incluyendo, pero no limitandose a, lupus eritematoso sistemico (SLE), lupus discoide, nefritis por lupus, sarcoidosis, artritis inflamatoria, incluyendo artritis juvenil, artritis reumatoide, artritis soriatica, sindrome de Reiter, espondilitis anquilosante, y artritis gotosa, rechazo de un trasplante de un organo o tejido, rechazo hiper-agudo, agudo, o cronico y/o enfermedad del injerto contra el huesped, esclerosis multiple, hiper-sindrome de IgE, poliarteritis nodosa, cirrosis biliar primaria, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, enfermedad celiaca (enteropatia sensible al gluten), sindrome de Sjogren primario (pSS), hepatitis autoinmune, anemia perniciosa, anemia hemolitica autoinmune, soriasis, esclerodermia, miastenia grave, purpura trombocitopenica autoinmune, tiroiditis autoinmune, enfermedad de Graves, tiroiditis de Hashimoto, enfermedad inmunocompleja, fatiga cronica, sindrome de disfuncion inmune (CFIDS), polimiositis y dermatomiositis, crioglobulinemia, trombolisis, cardiomiopatia, penfigo vulgar, fibrosis pulmonar intersticial, diabetes mellitus tipo I y tipo II, hipersensibilidad de tipo retardado tipo 1, 2, 3, y 4, alergia o trastornos alergicos, respuestas inmunitarias indeseadas/no pretendidas a las proteinas terapeuticas (vease, por ejemplo, la Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamerica Numero US 2002/0119151 y Koren y colaboradores, (2002) Curr. Pharm. Biotechnol. 3: 349-60), asma, sindrome de Churg-Strauss (granulomatosis alergica), dermatitis atopica, dermatitis alergica y por contacto irritante, urticaria, alergia mediada por IgE, ateroesclerosis, vasculitidas asociadas con ANCA, vasculitis, miopatias inflamatorias idiopaticas, enfermedad hemolitica, enfermedad de Alzheimer, polineuropatia desmielinizante inflamatoria cronica, y similares.

La ablacion genetica o la inhibicion farmacologica de la senda de CD40-CD154 ha demostrado anteriormente un beneficio terapeutico ya sea en modelos clinicos o pre-clinicos de SLE, pSS, ITP, MS, enfermedad de Crohn, penfigo vulgar, vasculitis autoinmune y RA (Law CL, Grewal IS. (2009). Adv. Exp. Med. Biol. 2009; 647: 8-36); cuya necesidad medica se detalla mas adelante.

En las realizaciones preferidas, los anticuerpos o las proteinas anti-CD40 de la divulgacion son utiles en el tratamiento de: (i) lupus eritematoso sistemico (nefritis por lupus), de preferencia para proporcionar terapias efectivas de dispersion de esteroides para la induction y el mantenimiento de la remision, y para la prevention de enfermedad renal en etapa terminal; (ii) sindrome de Sjogren primario, de preferencia para la prevencion de destruction de glandulas salivales y lagrimales, y para la induccion y el mantenimiento de la remision de las manifestaciones extraglandulares; (iii) purpura trombocitopenica autoinmune, de preferencia, el tratamiento de los pacientes refractarios al estandar de cuidado; (iv) vasculitidas asociadas con ANCA, de preferencia para la induccion y el mantenimiento de la remision en los pacientes refractarios a corticosteroides, y para el tratamiento de dispersion de esteroides; (v) penfigo vulgar, de preferencia para la induccion y el mantenimiento de la remision en los pacientes refractarios a corticosteroides, y para el tratamiento de dispersion de esteroides; (vi) esclerosis multiple, de preferencia para proporcionar tratamientos mas efectivos para la prevencion de recurrencias y del progreso de la discapacidad, y para lograr el estado libre de la enfermedad; y (vii) enfermedad de Crohn, de preferencia para proporcionar terapias mas efectivas para el mantenimiento de la remision, y el tratamiento de los pacientes refractarios a anti-TNF.

En algunas otras realizaciones, los anticuerpos o las proteinas anti-CD40 de la divulgacion son utiles en el tratamiento de inflamacion pulmonar, incluyendo, pero no limitandose a, rechazo de injerto de pulmon, asma, sarcoidosis, enfisema, fibrosis quistica, fibrosis pulmonar idiopatica, bronquitis cronica, rinitis alergica y enfermedades alergicas del pulmon, tales como neumonitis por hipersensibilidad, neumonia eosinofilica,

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bronquiolitis obliterante debida a trasplante de medula osea y/o de pulmon o a otras causas, ateroesclerosis de injerto/fleboesclerosis de injerto, as! como fibrosis pulmonar resultante de enfermedades por colageno, vasculares, y autoinmunes, tales como artritis reumatoide, esclerodermia y lupus eritematoso.

"Tratamiento" se define en la presente como la aplicacion o administracion de un anticuerpo o de una protelna anti- 0040 de acuerdo con la divulgacion, por ejemplo, anticuerpo mAbl, mAb2 o mAb3, a un sujeto, o la aplicacion o administracion de una composition farmaceutica, la cual comprende el anticuerpo o la protelna anti-CD40 de la divulgacion a un tejido aislado o a una llnea celular de un sujeto, en donde el sujeto tiene una enfermedad autoinmune y/o una enfermedad inflamatoria, un slntoma asociado con una enfermedad autoinmune y/o con una enfermedad inflamatoria, o una predisposition al desarrollo de una enfermedad autoinmune y/o de una enfermedad inflamatoria, en donde el proposito es curar, sanar, aliviar, liberar, alterar, remediar, mitigar, mejorar, o afectar la enfermedad autoinmune y/o la enfermedad inflamatoria, cualesquiera slntomas asociados con la enfermedad autoinmune y/o con la enfermedad inflamatoria, o la predisposicion al desarrollo de la enfermedad autoinmune y/o de la enfermedad inflamatoria.

"Tratamiento" tambien significa la aplicacion o administracion de una composicion farmaceutica, la cual comprende un anticuerpo o una protelna anti-CD40 de la divulgacion, por ejemplo, un anticuerpo mAbl, mAb2 o mAb3, a un sujeto, o la aplicacion o administracion de una composicion farmaceutica, la cual comprende el anticuerpo o la protelna anti-CD40 de la divulgacion, a un tejido aislado o a una llnea celular de un sujeto, en donde el sujeto tiene una enfermedad autoinmune y/o una enfermedad inflamatoria, un slntoma asociado con una enfermedad autoinmune y/o con una enfermedad inflamatoria, o una predisposicion al desarrollo de una enfermedad autoinmune y/o de una enfermedad inflamatoria, en donde el proposito es curar, sanar, aliviar, liberar, alterar, remediar, mitigar, mejorar, o afectar la enfermedad autoinmune y/o la enfermedad inflamatoria, cualesquiera slntomas asociados con la enfermedad autoinmune y/o con la enfermedad inflamatoria, o la predisposicion al desarrollo de la enfermedad autoinmune y/o de la enfermedad inflamatoria.

"Actividad anti-inflamatoria" significa una reduction o prevention de la inflamacion. La terapia con al menos un anticuerpo o una protelna anti-CD40 de acuerdo con la divulgacion, provoca una respuesta fisiologica que es benefica con respecto al tratamiento de una enfermedad autoinmune y/o de una enfermedad inflamatoria, en donde la enfermedad involucra celulas que expresan el antlgeno de CD40. Se reconoce que los metodos de la divulgacion pueden ser utiles en la prevencion del cambio fenotlpico en las celulas, tal como proliferation, activation, y similares.

De acuerdo con los metodos de la presente divulgacion, al menos un anticuerpo o una protelna anti-CD40 de la divulgacion, como se define anteriormente en la presente, se utiliza para promover una respuesta terapeutica positiva con respecto al tratamiento o a la prevencion de una enfermedad autoinmune y/o de una enfermedad inflamatoria.

"Respuesta terapeutica positiva" con respecto a una enfermedad autoinmune y/o a una enfermedad inflamatoria significa una mejora en la enfermedad en asociacion con la actividad anti-inflamatoria de estos anticuerpos o de estas protelnas, y/o una mejora en los slntomas asociados con la enfermedad. Es decir, se puede observar un efecto anti-proliferativo, la prevencion de una proliferacion adicional de las celulas que expresan CD40, una reduccion en la respuesta inflamatoria, incluyendo, pero no limitandose a, una secretion reducida de citoquinas inflamatorias, moleculas de adhesion, proteasas, inmunoglobulinas (en las instancias en donde la celula portadora de CD40 es una celula-B), combinaciones de las mismas, y similares, un aumento en la production de protelnas anti-inflamatorias, una reduccion en el numero de celulas auto-reactivas, un aumento en la tolerancia inmunologica, la inhibition de la sobrevivencia de celulas auto-reactivas, y/o una disminucion en uno o mas slntomas mediados por la estimulacion de las celulas que expresan CD40. Estas respuestas terapeuticas positivas no estan limitadas a la via de administracion, y pueden comprender la administracion al donador, al tejido del donador (tal como, por ejemplo, perfusion de organo), al huesped, o a cualquier combination de los mismos, y similares.

La respuesta cllnica se puede evaluar utilizando tecnicas de rastreo, tales como exploration de toma de imagenes de resonancia magnetica (MRI), toma de imagenes radiograficas-X, exploracion tomografica computarizada (CT), citometrla de flujo o analisis del clasificador de celulas activado por fluorescencia (FACS), histologla, patologla general, y qulmica sangulnea, incluyendo, pero no limitandose a, cambios detectables mediante ELISA, RIA, cromatografla, y similares. En adicion a estas respuestas terapeuticas positivas, el sujeto que se someta a terapia con el anticuerpo o con la protelna antagonista anti-CD40 de la divulgacion puede experimentar el efecto benefico de una mejora en los slntomas asociados con la enfermedad.

"Dosis o cantidad terapeuticamente efectiva" o "cantidad efectiva" significa una cantidad de anticuerpo o protelna anti-CD40 de la divulgacion que, cuando se administra provoca una respuesta terapeutica positiva con respecto al tratamiento de un sujeto con una enfermedad autoinmune y/o con una enfermedad inflamatoria.

En algunas realizaciones de la divulgacion, una dosis terapeuticamente efectiva del anticuerpo o de la protelna anti- CD40 de la divulgacion, por ejemplo, mAbl, mAb2 o mAb3, esta en el intervalo de 0. 01 mg/kg a 40 mg/kg, de 3 mg/kg a 20 mg/kg, o de 7 mg/kg a 12 mg/kg. Se reconoce que el metodo de tratamiento puede comprender una sola administracion de una dosis terapeuticamente efectiva, o multiples administraciones de una dosis terapeuticamente efectiva del anticuerpo o de la protelna antagonista anti-CD40 de la divulgacion.

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Una realization adicional de la divulgation es el uso de los anticuerpos o de las protelnas anti-CD40 de la divulgation para la monitorizacion de diagnostico de los niveles de protelna en el tejido como parte de un procedimiento de prueba cllnica, por ejemplo, para determinar la eficacia de un regimen de tratamiento dado. La detection se puede facilitar mediante el acoplamiento del anticuerpo a una sustancia detectable. Los ejemplos de las sustancias detectables incluyen diferentes enzimas, grupos protesicos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, biomateriales luminiscentes, y materiales radiactivos. Los ejemplos de las enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de radlcula roja, fosfatasa alcalina, P-galactosidasa, o acetilcolinesterasa; los ejemplos de los complejos de grupos protesicos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos de los materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluorescelna, isotiocianato de fluorescelna, rodamina, dicloro-triazinil-amina fluorescelna, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; los ejemplos de los biomateriales luminiscentes incluyen luciferasa, luciferina, y acuorina; y los ejemplos del material radiactivo adecuado incluyen l25I, 131I, 35S, o 3H.

Los anticuerpos o las protelnas anti-CD40 de la divulgation, por ejemplo, mAb1, mAb2 o mAb3, se pueden utilizar en combination con cualesquiera terapias conocidas para las enfermedades autoinmunes e inflamatorias, incluyendo cualquier agente o combination de agentes que se sepa que son utiles, o los cuales se hayan utilizado o se utilicen actualmente, para el tratamiento de las enfermedades autoinmunes e inflamatorias. Estas terapias y agentes terapeuticos incluyen, pero no se limitan a, cirugla o procedimientos quirurgicos (por ejemplo, esplenectomla, linfadenectomla, tiroidectomla, plasmaforesis, leucoforesis, trasplante de celulas, tejidos, u organos, procedimientos intestinales, perfusion de organo, y similares), terapia de radiation, terapia tal como terapia esteroidea y terapia no esteroidea, terapia de hormonas, terapia de citoquina, terapia con agentes dermatologicos (por ejemplo, agentes topicos utilizados para tratar condiciones de la piel, tales como alergias, dermatitis por contacto, y soriasis), terapia inmunosupresora, y otra terapia anti-inflamatoria con anticuerpos monoclonales, y similares. De esta manera, los anticuerpos o las protelnas antagonistas anti-CD40 descritas en la presente se administran en combination con al menos otra terapia, incluyendo, pero no limitandose a, cirugla, perfusion de organo, terapia de radiation, terapia esteroidea, terapia no esteroidea, terapia con antibioticos, terapia anti-fungica, terapia de hormonas, terapia de citoquina, terapia con agentes dermatologicos (por ejemplo, agentes topicos utilizados para tratar condiciones de la piel, tales como alergias, dermatitis por contacto, y soriasis), terapia inmunosupresora, otra terapia anti-inflamatoria con anticuerpos monoclonales, combinaciones de las mismas, y similares.

Por consiguiente, cuando las terapias combinadas comprenden la administration de un anticuerpo o de una protelna anti-CD40 de la divulgation, tal como un anticuerpo mAb1, mAb2 o mAb3, en combination con la administration de otro agente terapeutico, como con esteroides como un ejemplo, los metodos de la divulgation abarcan la co- administracion, utilizando formulaciones separadas o una sola formulation farmaceutica, y la administration consecutiva en cualquier orden. Cuando los metodos de la presente divulgation comprenden reglmenes terapeuticos combinados, estas terapias se pueden dar de una manera simultanea, es decir, el anticuerpo o la protelna anti-CD40 de la divulgation se administra de una manera concurrente o dentro del mismo marco de tiempo que la otra terapia (es decir, las terapias continuan de una manera concurrente, pero el anticuerpo o la protelna anti- CD40 de la divulgation no se administra precisamente al mismo tiempo que la otra terapia). De una manera alternativa, el anticuerpo anti-CD40 de la presente divulgation o la protelna de la divulgation tambien se puede administrar antes o despues de la otra terapia.

La administration en secuencia de las diferentes terapias se puede llevar a cabo independientemente de si el sujeto tratado responde al primer curso de la terapia para disminuir la posibilidad de la remision o de la recurrencia.

En algunas realizaciones de la divulgation, los anticuerpos o las protelnas anti-CD40 de la divulgation, por ejemplo, el anticuerpo mAb1, mAb2 o mAb3, se administran en combination con farmacos inmunosupresores o farmacos anti-inflamatorios, en donde el anticuerpo o la protelna y los agentes terapeuticos se pueden administrar en secuencia, en cualquier orden, o simultaneamente (es decir, de una manera concurrente o dentro del mismo marco de tiempo). Los ejemplos de los farmacos inmunosupresores adecuados que se pueden administrar en combination con los anticuerpos o las protelnas antagonistas anti-CD40 de la divulgation, por ejemplo, el anticuerpo mAb1, mAb2 o mAb3, incluyen, pero no se limitan a, metotrexato, ciclofosfamida, mizoribina, clorambucil, ciclosporina, tal como, por ejemplo, ciclosporina aerosolizada (vease, la Publication de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamerica Numero US 2002/0006901), tacrolimus (FK506; ProGrafrM), micofenolato-mofetil, y azatioprina (6- mercaptopurina), sirolimus (rapamicina), desoxiespergualina, leflunomida y sus analogos de malono-nitrilo-amida; y protelnas inmunosupresoras, incluyendo, por ejemplo, anticuerpos y fusiones de Ig anti-CTLA4, anticuerpos estimulantes anti-linfocitos-B (por ejemplo, LYMPHOSTAT-BTM), y fusiones de Ig (BLyS-Ig), anticuerpos anti-CD80 y etanorcept (Enbrel (RTM)), as! como anticuerpos anti-celulas T, tales como anti-CD3 (OKT3), anti-CD4, y similares. Los ejemplos de los agentes anti-inflamatorios adecuados incluyen, pero no se limitan a, corticosteroides, tales como, por ejemplo, clobetasol, halobetasol, hidrocortisona, triamcinolona, betametasona, fluocinol, fluocinonida, prednisona, prednisolona, metil-prednisolona; farmacos anti-inflamatorios no esteroideos (NSAIDs), tales como, por ejemplo, sulfasalazina, medicamentos que contienen mesalamina (conocidos como agentes 5-ASA), celecoxib, diclofenaco, etodolaco, fenprofeno, flurbiprofeno, ibuprofeno, quetoprofeno, meclofamato, meloxicam, nabumetona, naproxeno, oxaprozina, piroxicam, rofecoxib, salicilatos, sulindaco, y tolmetina; inhibidores de fosfodiesterasa-4, anticuerpos anti-inflamatorios, tales como adalimumab (HUMERA (RTM), un antagonista de TNF-a), e infliximab (Remicade, un antagonista de TNF-a), y similares. Tambien se incluyen agentes inmunomoduladores de un uso

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actual o potencial en el tratamiento de enfermedad autoinmune, tales como talidomida o sus analogos, tales como lenalidomida.

El rechazo de trasplante y la enfermedad del injerto contra el huesped pueden ser hlper-agudos (humorales), agudos (mediados por celulas T), o cronicos (de etiologla desconocida), o una combinacion de los mismos. Por consiguiente, los anticuerpos o las protelnas anti-CD40 de la divulgacion, por ejemplo, el anticuerpo mAbl, mAb2 o mAb3, se utilizan en algunas realizaciones para prevenir y/o mitigar el rechazo y/o los slntomas asociados con rechazo hlper-agudo, agudo, y/o cronico de trasplante de cualquier tejido, incluyendo, pero no limitandose a, hlgado, rinon, pancreas, celulas de islotes pancreaticos, intestino delgado, pulmon, corazon, corneas, piel, vasos sangulneos, hueso, medula osea heterologa o autologa, y similares. Los tejidos de injerto se pueden obtener a partir de cualquier donador y se pueden trasplantar en cualquier huesped receptor, y, por consiguiente, el procedimiento de trasplante puede comprender trasplantar tejido animal a seres humanos (por ejemplo, xenoinjertos), trasplantar tejido a partir de un ser humano a otro ser humano (por ejemplo, aloinjertos), y/o trasplantar tejido a partir de una parte de un cuerpo humano a otro (por ejemplo, autoinjertos).

El tratamiento con los anticuerpos o con las protelnas de la divulgacion tambien puede reducir las secuelas de los trasplantes, tales como fiebre, anorexia, anormalidades hemodinamicas, leucopenia, infiltracion de globulos blancos del organo/tejido trasplantado, as! como las infecciones oportunistas.

En algunas realizaciones, los anticuerpos o las protelnas anti-CD40 de la divulgacion, por ejemplo, el anticuerpo mAbl, mAb2 o mAb3, se pueden utilizar solos o en combinacion con farmacos inmunosupresores para tratar y/o prevenir rechazo de trasplante, tal como rechazo hlper-agudo, agudo, y/o cronico y/o enfermedad del injerto contra el huesped.

Por consiguiente, en algunas realizaciones en donde los anticuerpos o las protelnas anti-CD40 de la divulgacion se utilizan para tratar rechazo de injerto, los anticuerpos, por ejemplo, el anticuerpo mAbl, mAb2 o mAb3, se pueden utilizar en combinacion con los farmacos inmunosupresores adecuados, incluyendo, pero no limitandose a, metotrexato; ciclofosfamida; mizoribina; clorambucil; ciclosporina, tal como, por ejemplo, ciclosporina aerosolizada (vease, la Publicacion de Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamerica Numero US20020006901), tacrolimus (FK506; ProGrafm), micofenolato-mofetil, y azatioprina (6-mercaptopurina), sirolimus (rapamicina), desoxiespergualina, leflunomida y sus analogos de malono-nitrilo-amida; inmuno-moduladores, incluyendo, por ejemplo, talidomida y sus analogos; y protelnas inmunosupresoras, incluyendo, por ejemplo, anticuerpos y fusiones de Ig anti-CTLA, anticuerpos estimulantes anti-linfocitos-B (por ejemplo, LYMPHOSTAT-BTM), y fusiones de Ig (BLyS-Ig), anticuerpos anti-CD80 y etanorcept (Enbrel (RTM)), as! como anticuerpos anti-celulas T, tales como anti- Cd3 (OKT3), anti-CD4, y similares.

Como tales, se contempla especlficamente que las composiciones y los metodos de la divulgacion se utilizan en combinacion con otros farmacos para mejorar adicionalmente los slntomas y los resultados en los receptores de trasplantes, tales como aquellos que reciben injertos de pulmon o rinon, por ejemplo. Por consiguiente, en algunas realizaciones, los anticuerpos o las protelnas anti-CD40 de la divulgacion, por ejemplo, el anticuerpo mAbl, mAb2 o mAb3, se utilizan para tratar rechazo de trasplante (tal como, por ejemplo, rechazo hlper-agudo, agudo, y/o cronico o enfermedad del injerto contra el huesped en los receptores de trasplante de pulmon o de rinon), solos o en combinacion con ciclosporina parenteralmente y/o no parenteralmente administrada, incluyendo, por ejemplo, ciclosporina oral, ciclosporina inyectable, ciclosporina aerosolizada (por ejemplo, inhalada), y combinaciones de las mismas. En algunas realizaciones en donde al menos un componente de la terapia es ciclosporina aerosolizada, la ciclosporina se suministra al pulmon del receptor mediante la inhalacion de ciclosporina en una forma de aspersion en aerosol utilizando, por ejemplo, un dispositivo de suministro presurizado o un nebulizador. La ciclosporina se puede administrar ya sea en forma de polvo seco o en una forma humeda. La ciclosporina se puede administrar como una dosis sub-terapeutica.

En algunas otras realizaciones, los anticuerpos o las protelnas anti-CD40 de la divulgacion, por ejemplo, el anticuerpo mAbl, mAb2 o mAb3, se pueden utilizar solos o en combinacion con farmacos inmunosupresores para tratar y/o prevenir la artritis reumatoide. Por consiguiente, en algunas realizaciones en donde los anticuerpos o las protelnas anti-CD40 de la divulgacion; por ejemplo, el anticuerpo mAbl, mAb2 o mAb3, se utilizan para tratar la artritis reumatoide, los anticuerpos o las protelnas se pueden utilizar en combinacion con los farmacos inmunosupresores adecuados, incluyendo, pero no limitandose a, metotrexato, ciclofosfamida, mizoribina, clorambucil, ciclosporina, tacrolimus (FK506; PROGRAFTM), micofenolato-mofetil, y azatioprina (6-mercaptopurina), sirolimus (rapamicina), desoxiespergualina, leflunomida y sus analogos de malono-nitrilo-amida; y protelnas inmunosupresoras, incluyendo, por ejemplo, anticuerpos y fusiones de Ig anti-CTLA, anticuerpos estimulantes anti- linfocitos-B (por ejemplo, LYMPHOSTAT-BTM), y fusiones de Ig (BLyS-Ig), anticuerpos anti-CD20 (por ejemplo, RITUXAN (g)); el anticuerpo completamente humano HuMax-CD20, R-1594, IMMU-106, TRU-0l5, AME-133, tositumomab/1-131, tositumomab (Bexxar (D), ibritumomab-tiuxetano (Zevalin (RTM)); anticuerpos anti-CD80, y etanorcept (ENBREL), as! como anticuerpos anti-celulas T, tales como anti-CD3 (OKT3), anti-CD4, y similares. Como se discute anteriormente, la efectividad del tratamiento se puede evaluar utilizando cualquier medio, e incluye, pero no se limita a, la efectividad como se mide por las respuestas cllnicas definidas por los criterios del American College of Rheumatology, los criterios de la European League of Rheumatism, o cualesquiera otros criterios. Vease, por ejemplo, Felson y colaboradores (1995)] Arthritis Rheum. 38 : 727-35 y van Gestel y colaboradores (1996)

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Arthritis Rheum. 39: 34-40.

En todavla otras realizaciones, los anticuerpos o las protelnas anti-CD40 de la divulgacion, por ejemplo, el anticuerpo mAb1, mAb2 o mAb3, se pueden utilizar solos o en combinacion con farmacos inmunosupresores para tratar y/o prevenir esclerosis multiple. Por consiguiente, en algunas realizaciones en donde los anticuerpos o las protelnas anti-CD40 de la divulgacion, por ejemplo, el anticuerpo mAbl, mAb2 o mAb3, se utilizan para tratar esclerosis multiple, los anticuerpos se pueden utilizar en combinacion con los farmacos inmunosupresores adecuados, incluyendo, pero no limitandose a, metotrexato, ciclofosfamida, mizoribina, clorambucil, ciclosporina, tacrolimus (FK506; PROGRAFTM), micofenolato-mofetil, y azatioprina (6-mercaptopurina), sirolimus (rapamicina), desoxiespergualina, leflunomida y sus analogos de malono-nitrilo-amida; y protelnas inmunosupresoras, incluyendo, por ejemplo, anticuerpos y fusiones de Ig anti-CTLA, anticuerpos estimulantes anti-linfocitos-B (por ejemplo, LYMPHOSTAT-BTM), y fusiones de Ig (BLyS-Ig), anticuerpos anti-CD20 (por ejemplo, RITUXAN (D); el anticuerpo completamente humano HuMax-CD20, R-1594, IMMIJ-106, TRU-015, aMe-133, tositumomab/1-131, tositumomab (Bexxar (RTM)), ibritumomab-tiuxetano (Zevalin (RTM)); anticuerpos anti-CD80, y etanorcept (ENBREL), as! como anticuerpos anti-celulas T, tales como anti-CD3 (OKT3), anti-CD4, los agentes involucrados en la modulacion de los receptores S1P, incluyendo, por ejemplo, fingolimod; y similares.

Formulaciones farmaceuticas y modos de administracion

Los anticuerpos o las protelnas anti-CD40 de esta divulgacion se administran en una concentracion que es terapeuticamente efectiva para prevenir o tratar las enfermedades autoinmunes y/o las enfermedades inflamatorias, y/o para prevenir o reducir los riesgos asociados con rechazo de injerto en el trasplante.

Para alcanzar esta meta, los anticuerpos se pueden formular utilizando una variedad de excipientes aceptables conocidos en la tecnica. Tlpicamente, los anticuerpos o las protelnas se administran mediante inyeccion, por ejemplo, ya sea intravenosamente, intraperitonealmente, o subcutaneamente. Los metodos para llevar a cabo esta administracion son conocidos por aquellos de una experiencia ordinaria en este campo. Tambien es posible obtener composiciones que se puedan administrar topicamente u oralmente, o las cuales se puedan transmitir a traves de las membranas mucosas.

La administracion intravenosa se presenta de preferencia mediante infusion durante un perlodo de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 horas, mas preferiblemente durante aproximadamente 1 a aproximadamente 8 horas, todavla mas preferiblemente durante aproximadamente 2 a aproximadamente 7 horas, todavla mas preferiblemente durante aproximadamente 4 a aproximadamente 6 horas, dependiendo del anticuerpo o de la protelna anti-CD40 que se este administrando. La infusion inicial con la composicion farmaceutica se puede dar durante un perlodo de aproximadamente 4 a aproximadamente 6 horas, suministrandose las siguientes infusiones mas rapidamente. Las siguientes infusiones se pueden administrar durante un perlodo de aproximadamente 1 a aproximadamente 6 horas, incluyendo, por ejemplo, de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 horas, de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 horas, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 2 horas.

Una composicion farmaceutica de la divulgacion se formula para ser compatible con su via de administracion pretendida. Los ejemplos de las posibles vlas de administracion incluyen administracion parenteral, (por ejemplo, intravenosa (IV), intramuscular (IM), intradermica, subcutanea (SC), o infusion), oral y pulmonar (por ejemplo, inhalacion), nasal, transdermica (topica), transmucosal, y rectal. Las soluciones o suspensiones utilizadas para aplicacion parenteral, intradermica, o subcutanea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente esteril, tal como agua para inyecciones, solucion salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros solventes sinteticos; agentes antibacterianos, tales como alcohol bencllico o metil-parabenos; antioxidantes, tales como acido ascorbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes, tales como acido etilen-diamina-tetra-acetico; reguladores, tales como acetatos, citratos o fosfatos, y agentes para el ajuste de la tonicidad, tales como cloruro de sodio o dextrosa. El pH se puede ajustar con acidos o bases, tales como acido clorhldrico o hidroxido de sodio. La preparacion parenteral se puede alojar en ampolletas, jeringas desechables, o frascos de multiples dosis hechos de vidrio o de plastico.

Los anticuerpos o las protelnas anti-CD40 de la divulgacion se proporcionan tlpicamente mediante las tecnicas convencionales dentro de un regulador farmaceuticamente aceptable, por ejemplo, solucion salina esteril, agua regulada esteril, propilenglicol, combinaciones de los anteriores, etc. Los metodos para la preparacion de los agentes parenteralmente administrables se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences (18a Edicion; Mack Publishing Company, Easton, Pensilvania, 1990). Vease tambien, por ejemplo, la Publicacion Internacional Numero WO 98/56418, la cual describe formulaciones farmaceuticas de anticuerpos estabilizados adecuadas para utilizarse en los metodos de la presente divulgacion.

La cantidad de al menos un anticuerpo o una protelna antagonista anti-CD40 de la divulgacion para administrarse es facilmente determinada por un experto ordinario en este campo. Los factores que tienen influencia sobre el modo de administracion y la cantidad respectiva de al menos un anticuerpo o una protelna antagonista anti-CD40 incluyen, pero no se limitan a, la enfermedad particular que se someta a terapia, la gravedad de la enfermedad, la historia de la enfermedad, y la edad, altura, peso, salud, y condicion flsica del individuo que se someta a terapia. De una

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manera similar, la cantidad de anticuerpo o protelna antagonista anti-CD40 para administrarse dependera del modo de administracion y si el sujeto se sometera a una sola dosis o multiples dosis de este agente. En terminos generales, se prefiere una dosificacion mas alta del anticuerpo o de la protelna anti-CD40 con un peso creciente del paciente que se someta a terapia. La dosis del anticuerpo o de la protelna anti-CD40 para administrarse esta en el intervalo de aproximadamente 0.003 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, de preferencia en el intervalo de 0.01 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg.

Por consiguiente, por ejemplo, la dosis puede ser de 0.01 mg/kg, de 0.03 mg/kg, de 0.1 mg/kg, de 0.3 mg/kg, de 0.5 mg/kg, de 1 mg/kg, de 1.5 mg/kg, de 2 mg/kg, de 2.5 mg/kg, de 3 mg/kg, de 5 mg/kg, de 7 mg/kg, de 10 mg/kg, de 15 mg/kg, de 20 mg/kg, de 25 mg/kg, de 30 mg/kg, de 35 mg/kg, de 40 mg/kg, de 45 mg/kg, o de 50 mg/kg.

En otra realizacion de la divulgacion, el metodo comprende la administracion de multiples dosis del anticuerpo antagonista anti-CD40, o de un fragmento del mismo. El metodo puede comprender la administracion de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, o mas dosis terapeuticamente efectivas de una composicion farmaceutica, las cuales comprenden un anticuerpo antagonista anti-CD40, o un fragmento del mismo. La frecuencia y la duracion de administracion de multiples dosis de las composiciones farmaceuticas que comprenden el anticuerpo o la protelna anti-CD40 pueden ser facilmente determinadas por un experto en la tecnica. Mas aun, el tratamiento de un sujeto con una cantidad terapeuticamente efectiva de un anticuerpo o de una protelna puede incluir un solo tratamiento o, de preferencia, puede incluir una serie de tratamientos. En un ejemplo preferido, un sujeto se trata con el anticuerpo o la protelna antagonista anti-CD40 de la divulgacion, en el intervalo de entre aproximadamente 0.1 a 20 mg/kg de peso corporal, una vez por semana durante entre aproximadamente 1 y 10 semanas, de preferencia de entre aproximadamente 2 y 8 semanas, mas preferiblemente de entre aproximadamente 3 y 7 semanas, y todavla mas preferiblemente durante aproximadamente 4, 5, o 6 semanas. El tratamiento se puede presentar anualmente para prevenir la recurrencia o al indicarse la recurrencia. Tambien se apreciara que la dosificacion efectiva del anticuerpo o del fragmento de enlace de antlgeno del mismo utilizada para el tratamiento, puede aumentar o disminuir durante el transcurso de un tratamiento particular. Los cambios en la dosificacion pueden resultar y llegar a ser evidentes a partir de los resultados de los ensayos de diagnostico, como se describen en la presente.

Por consiguiente, en una realizacion, el regimen de dosificacion incluye una primera administracion de una dosis terapeuticamente efectiva de al menos un anticuerpo o una protelna anti-CD40 de la divulgacion en los dlas 1, 7, 14, y 21 del perlodo de tratamiento. En otra realizacion, el regimen de dosificacion incluye una primera administracion de una dosis terapeuticamente efectiva de al menos un anticuerpo o una protelna anti-CD40 de la divulgacion en los dlas 1, 2, 3, 4, 5, 6, y 7 de una semana en el perlodo de tratamiento. Otras realizaciones incluyen un regimen de dosificacion que tiene una primera administracion de una dosis terapeuticamente efectiva de al menos un anticuerpo o una protelna anti-CD40 de la divulgacion en los dlas 1, 3, 5, y 7 de una semana en el perlodo de tratamiento; un regimen de dosificacion que incluye una primera administracion de una dosis terapeuticamente efectiva de al menos un anticuerpo o una protelna anti-CD40 de la divulgacion en los dlas 1 y 3 de una semana en el perlodo de tratamiento; y un regimen de dosificacion preferido que incluye una primera administracion de una dosis terapeuticamente efectiva de al menos un anticuerpo o una protelna anti-CD40 de la divulgacion en el dla 1 de una semana en el perlodo de tratamiento. El perlodo de tratamiento puede comprender 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, un mes, 3 meses, 6 meses, o un ano. Los perlodos de tratamiento pueden ser subsiguientes o se pueden separar unos de otros por un dla, una semana, 2 semanas, un mes, 3 meses, 6 meses, o un ano, en intervalos de 0.003 mg/kg a 50 mg/kg, de 0.01 mg/kg a 40 mg/kg, de 0.01 mg/kg a 30 mg/kg, de 0.1 mg/kg a 30 mg/kg, de 0.5 mg/kg a 30 mg/kg, de 1 mg/kg a 30 mg/kg, de 3 mg/kg a 30 mg/kg, de 3 mg/kg a 25 mg/kg, de 3 mg/kg a 20 mg/kg, de 5 mg/kg a 15 mg/kg, o de 7 mg/kg a 12 mg/kg. Por consiguiente, por ejemplo, la dosis de cualquier anticuerpo antagonista anti-CD40, o fragmento de enlace de antlgeno del mismo, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal o la protelna anti-CD40 de la divulgacion, puede ser de 0.003 mg/kg, de 0.01 mg/kg, de 0.03 mg/kg, de 0.1 mg/kg, de 0.3 mg/kg, de 0.5 mg/kg, de 1 miligramo/ kilogramo, de 1.5 mg/kg, de 2 mg/kg, de 2.5 mg/kg, de 3 mg/kg, de 5 mg/kg, de 7 mg/kg, de 10 mg/kg, de 15 mg/kg, de 20 mg/kg, de 25 mg/kg, de 30 mg/kg, de 35 mg/kg, de 40 mg/kg, de 45 mg/kg, de 50 mg/kg, u otras dosis que caigan dentro del intervalo de 0.003 mg/kg a 50 mg/kg. Se puede administrar la misma dosis terapeuticamente efectiva de un anticuerpo o de una protelna anti-CD40 de la divulgacion a traves de cada semana de dosificacion del anticuerpo.

De una manera alternativa, se pueden utilizar diferentes dosis terapeuticamente efectivas de un anticuerpo o de una protelna antagonista anti-CD40 de la divulgacion durante el transcurso del perlodo de tratamiento.

En algunas realizaciones, la dosis terapeuticamente efectiva inicial de un anticuerpo antagonista anti-CD40, o de un fragmento de enlace de antlgeno del mismo, como se define en cualquier otra parte en la presente, puede estar en el intervalo de dosificacion mas bajo (es decir, de 0.003 mg/kg a 20 mg/kg), cayendo las siguientes dosis dentro del intervalo de dosificacion mas alto (es decir, de 20 mg/kg a 50 mg/kg).

En las realizaciones alternativas, la dosis terapeuticamente efectiva inicial de un anticuerpo antagonista anti-CD40, o de un fragmento de enlace de antlgeno del mismo, como se define en cualquier otra parte en la presente, puede estar en el intervalo de dosificacion superior (es decir, de 20 mg/kg a 50 mg/kg), cayendo las siguientes dosis dentro del intervalo de dosificacion mas bajo (es decir, de 0.003 mg/kg a 20 mg/kg). Por consiguiente, en una realizacion, la dosis terapeuticamente efectiva inicial del anticuerpo antagonista anti-CD40, o fragmento de enlace de antlgeno del mismo, es de 20 mg/kg a 35 mg/kg, incluyendo aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 25 mg/kg,

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aproximadamente 30 mg/kg, y aproximadamente 35 mg/kg, y las siguientes dosis terapeuticamente efectivas del anticuerpo o de la proteina antagonista anti-CD40 de la divulgacion son de aproximadamente 5 mg/kg a aproximadamente 15 mg/kg, incluyendo aproximadamente 5 mg/kg, 8 mg/kg, 10 mg/kg, 12 mg/kg, y aproximadamente 15 mg/kg.

En algunas realizaciones de la divulgacion, la terapia anti-CD40 se inicia mediante la administration de una "dosis de carga" del anticuerpo o de la proteina de la divulgacion al sujeto que necesite la terapia anti-CD40. "Dosis de carga" significa una dosis inicial del anticuerpo o de la proteina anti-CD40 de la divulgacion que se administra al sujeto, en donde la dosis del anticuerpo o de la proteina de la divulgacion administrada cae dentro del intervalo de dosificacion mas alto (es decir, de aproximadamente 20 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg). La "dosis de carga" se puede administrar como una sola administracion, por ejemplo, una sola infusion, en donde el anticuerpo o el fragmento de enlace de antigeno del mismo, se administra intravenosamente (iv), o como multiples administraciones, por ejemplo, multiples infusiones, en donde el anticuerpo o el fragmento de enlace de antigeno del mismo se administra intravenosamente (iv), siempre que se administre la "dosis de carga" completa dentro de un periodo de aproximadamente 24 horas. En seguida de la administracion de la "dosis de carga", se administra entonces al sujeto una o mas dosis terapeuticamente efectivas adicionales del anticuerpo o de la proteina anti-CD40 de la divulgacion. Las siguientes dosis terapeuticamente efectivas se pueden administrar, por ejemplo, de acuerdo con un programa de dosificacion semanal, o una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, o una vez cada cuatro semanas. En estas realizaciones, las siguientes dosis terapeuticamente efectivas caen en general dentro del intervalo de dosificacion mas bajo (es decir, de 0.003 mg/kg a 20 mg/kg).

De una manera alternativa, en algunas realizaciones, en seguida de la "dosis de carga", se administran las siguientes dosis terapeuticamente efectivas del anticuerpo o de la proteina anti-CD40 de la divulgacion, de acuerdo con un "programa de mantenimiento", en donde la dosis terapeuticamente efectiva del anticuerpo o de la proteina de la divulgacion se administra una vez al mes, una vez cada 6 semanas, una vez cada dos meses, una vez cada 10 semanas, una vez cada tres meses, una vez cada 14 semanas, una vez cada cuatro meses, una vez cada 18 semanas, una vez cada cinco meses, una vez cada 22 semanas, una vez cada 6 meses, una vez cada 7 meses, una vez cada 8 meses, una vez cada 9 meses, una vez cada 10 meses, una vez cada 11 meses, o una vez cada 12 meses. En estas realizaciones, las dosis terapeuticamente efectivas del anticuerpo o de la proteina anti-CD40 de la divulgacion caen dentro del intervalo de dosificacion mas bajo (es decir, de 0.003 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg), en particular, cuando las siguientes dosis se administran a intervalos mas frecuentes, por ejemplo, desde una vez cada dos semanas hasta una vez cada mes, o dentro del intervalo de dosificacion mas alto (es decir, de 20 mg/kg a 50 mg/kg), en particular, cuando las siguientes dosis se administran a intervalos menos frecuentes, por ejemplo, en donde las siguientes dosis se administran con una separation de un mes a 12 meses.

En los metodos de la divulgacion se puede utilizar cualquier composition farmaceutica que comprenda un anticuerpo o una proteina anti-CD40 de la divulgacion, que tenga las propiedades funcionales deseadas descritas en la presente, como el componente terapeuticamente activo. Por consiguiente, las composiciones liquidas, liofilizadas, o secadas por aspersion que comprendan uno o mas de los anticuerpos o de las proteinas anti-CD40 de la divulgacion, por ejemplo, el anticuerpo mAb1, mAb2 o mAb3s, se pueden preparar como una solution o suspension acuosa o no acuosa para su administracion subsiguiente a un sujeto de acuerdo con los metodos de la divulgacion.

Cada una de estas composiciones comprendera al menos uno de los anticuerpos o de las proteinas anti-CD40 de la presente divulgacion como un componente terapeuticamente o profilacticamente activo.

"Componente terapeuticamente o profilacticamente activo" significa que el anticuerpo o la proteina anti-CD40 de la divulgacion se incorpora especificamente dentro de la composicion para provocar una respuesta terapeutica o profilactica deseada con respecto al tratamiento, la prevention, o el diagnostico de una enfermedad o condition en un sujeto, cuando la composicion farmaceutica se administra a ese sujeto. De preferencia, las composiciones farmaceuticas comprenden agentes estabilizantes apropiados, agentes de volumen, o ambos, para minimizar los problemas asociados con la perdida de estabilidad y actividad biologica de la proteina durante su preparation y almacenamiento.

Se pueden agregar formulantes a las composiciones farmaceuticas que comprenden un anticuerpo o una proteina anti-CD40 de la divulgacion. Estos formulantes pueden incluir, pero no se limitan a, aceites, polimeros, vitaminas, carbohidratos, aminoacidos, sales, reguladores, albumina, tensoactivos, o agentes de volumen. De preferencia, los carbohidratos incluyen azucar o alcoholes de azucar, tales como mono-, di-, o poli-sacaridos, o glucanos solubles en agua. Los sacaridos o glucanos pueden incluir fructosa, glucosa, manosa, sorbosa, xilosa, maltosa, sacarosa, dextrano, pululano, dextrina, a- y 13-ciclodextrina, almidon soluble, almidon de hidroxi-etilo, y carboxi-metil-celulosa, o mezclas de los mismos.

"Alcohol de azucar" se define como un hidrocarburo de 4 a 8 atomos de carbono que tiene un grupo hidroxilo e incluye galactitol, inositol, manitol, xilitol, sorbitol, glicerol, y arabitol. Estos azucares o alcoholes de azucar se pueden utilizar individualmente o en combination. La concentration de azucar o de alcohol de azucar puede ser de entre el 1.0 % y el 7 % en peso/volumen, mas preferiblemente de entre el 2.0 % y el 6.0 % en peso/volumen. Por ejemplo, los aminoacidos incluyen las formas levogiras (L) de carnitina, arginina, y betaina; sin embargo, se pueden agregar otros aminoacidos. Los polimeros preferidos incluyen polivinil-pirrolidona (PVP) con un peso molecular

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promedio de entre 2,000 y 3,000, o polietilenglicol (PEG) con un peso molecular promedio de entre 3,000 y 5,000. Los tensoactivos que se pueden agregar a la formulacion se muestran en las Patentes Europeas Numeros 270,799 y 268,110.

Adicionalmente, los anticuerpos se pueden modificar qulmicamente mediante la conjugation covalente con un pollmero para aumentar su vida media circulante, por ejemplo. Los pollmeros preferidos, y los metodos para unirlos a los peptidos, se muestran en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamerica Numeros 4,766,106; 4,179,337; 4,495,285; y 4,609,546. Los pollmeros preferidos son los polioles polioxietilados y polietilenglicol (PEG). El PEG es soluble en agua a temperatura ambiente, y tiene la formula general: R (O--CH2--CH2)nO--R, en donde R puede ser hidrogeno, o un grupo protector, tal como un grupo alquilo o alcanol. De preferencia, el grupo protector tiene entre 1 y 8 atomos de carbono, mas preferiblemente es metilo. El slmbolo n es un entero positivo, de preferencia de entre 1 y 1,000, mas preferiblemente de entre 2 y 500. El PEG tiene un peso molecular promedio preferido de entre 1,000 y 40,000, mas preferiblemente de entre 2,000 y 20,000, mas preferiblemente de entre 3,000 y 12,000. De preferencia, el PEG tiene al menos un grupo hidroxilo, mas preferiblemente es un grupo hidroxilo terminal. Es este grupo hidroxilo el que se activa de preferencia para reaccionar con un grupo amino libre sobre el inhibidor. Sin embargo, se entendera que el tipo y la cantidad de los grupos reactivos se pueden variar para lograr un PEG/anticuerpo covalentemente conjugado de la presente divulgation.

Los polioles polioxietilados solubles en agua tambien son utiles en la presente divulgacion.

Incluyen sorbitol polioxietilado, glucosa polioxietilada, glicerol polioxietilado (POG), y similares. Se prefiere el glicerol polioxietilado (POG). Una razon es debido a que la estructura base de glicerol del glicerol polioxietilado es la misma estructura base que se presenta naturalmente, por ejemplo, en los animales y en los seres humanos, en los mono-, di-, tri-gliceridos. Por consiguiente, esta ramification no se verla necesariamente como un agente extrano en el cuerpo. El glicerol polioxietilado (POG) tiene un peso molecular preferido en el mismo intervalo que el PEG. La estructura para el glicerol polioxietilado (POG) se muestra en Knauf y colaboradores (1988, J. Bio. Chem. 263: 15064-15070), y se encuentra una discusion de los conjugados de POG/lL-2 en la Patente de los Estados Unidos de Norteamerica Numero 4,766, 106.

Otro sistema de suministro de farmacos para aumentar la vida media circulante es el liposoma.

Los metodos para la preparation de sistemas de suministro de liposomas se discuten en Gabizon y colaboradores (1982) Cancer Research 42: 4734; Cafiso (1981) Biochem Biophys Acta 649: 129; y Szoka (1980) Ann. Rev. Bioplays. Eng. 9: 467. Otros sistemas de suministro de farmacos se conocen en la tecnica, y se describen, por ejemplo, en Poznansky y colaboradores (1980) Drug Delivery Systems (R. L. Juliano, Editor, Oxford, N. Y.) paginas 253-315; Poznansky (1984) Pharm Revs 36: 277.

El formulante para incorporarse en una composition farmaceutica debe proporcionar la estabilidad del anticuerpo o de la protelna antagonista anti-CD40 de la divulgacion. Es decir, el anticuerpo o la protelna anti-CD40 de la divulgacion debe conservar su estabilidad flsica y/o qulmica, y debe tener las propiedades funcionales deseadas, es decir, una o mas de las propiedades funcionales deseadas definidas anteriormente en la presente.

Los metodos para monitorizar la estabilidad de la protelna son bien conocidos en la tecnica. Vease, por ejemplo, Jones (1993) Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90; Lee, Editor, (1991) Peptide and Protein Drug Delivery (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, Nueva York); y los ensayos de estabilidad que se dan a conocer en la presente mas adelante. En terminos generales, la estabilidad de la protelna se mide a una temperatura seleccionada durante un perlodo de tiempo especificado. En las realizaciones preferidas, una formulacion farmaceutica de anticuerpo estable proporciona la estabilidad del anticuerpo o de la protelna antagonista anti-CD40 de la divulgacion cuando se almacena a temperatura ambiente (a aproximadamente 25 °C) durante al menos 1 mes, al menos 3 meses, o al menos 6 meses, y/o es estable a aproximadamente 2-8 °C durante al menos 6 meses, al menos 9 meses, al menos 12 meses, al menos 18 meses, o al menos 24 meses.

Una protelna, tal como un anticuerpo, cuando se formula en una composicion farmaceutica, se considera que conserva su estabilidad flsica en un punto del tiempo dado si no muestra signos visuales (es decir, decoloration o perdida de claridad) o muestra signos mensurables (por ejemplo, utilizando cromatografla por exclusion de tamanos (SEC) o dispersion de luz ultravioleta (UV)) de precipitation, aglomeracion, y/o desnaturalizacion en esa composicion farmaceutica. Con respecto a la estabilidad qulmica, una protelna, tal como un anticuerpo, cuando se formula en una composicion farmaceutica, se considera que conserva su estabilidad qulmica en un punto del tiempo dado si las mediciones de la estabilidad qulmica indican que la protelna (es decir, el anticuerpo) conserva la actividad biologica de interes en esa composicion farmaceutica. Los metodos para monitorizar los cambios en la estabilidad qulmica son bien conocidos en la tecnica, e incluyen, pero no se limitan a, los metodos para detectar las formas qulmicamente alteradas de la protelna, tales como resultan de la sujecion, utilizando, por ejemplo, SDS- PAGE, SEC, y/o ionization con desorcion de laser asistida por matriz/espectrometrla de masas con tiempo de vuelo; y la degradation asociada con los cambios en la carga molecular (por ejemplo, asociada con la desamidacion), utilizando, por ejemplo, cromatografla de intercambio de iones. Veanse, por ejemplo, los metodos que se dan a conocer en la presente mas adelante.

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Un anticuerpo o una protelna anti-CD40 de la divulgacion, cuando se formula en una composicion farmaceutica, se considera que conserva una actividad biologica deseada en un punto del tiempo dado, si la actividad biologica deseada en ese tiempo esta dentro de aproximadamente el 30 %, de preferencia dentro de aproximadamente el 20 % de la actividad biologica deseada exhibida en el momento en que se preparo la composicion farmaceutica, como se determine en un ensayo adecuado para determinar la actividad biologica deseada. Los ensayos para medir la actividad biologica deseada de los anticuerpos o protelnas antagonistas anti-CD40 que se dan a conocer en la presente, se pueden llevar a cabo como se describe en los Ejemplos en la presente. Veanse tambien los ensayos descritos en Schutze y colaboradores (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 92: 8200-8204; Denton y colaboradores (1998) Pediatr Transplant. 2: 6-15; Evans y colaboradores (2000) J : Immunol. 164: 688-697; Noelle (1998) Agents Actions, Suplemento 49: 17-22; Lederman y colaboradores (1996) Curr Opin. Hematol. 3: 77-86; Coligan y colaboradores (1991) Current Protocols in Immunology 13: 12; Kwekkeboom y colaboradores (1993) Immunology 79: 439-444; y Patentes de los Estados Unidos de Norteamerica Numeros 5,674, 492 y 5,847, 082.

En algunas realizaciones de la divulgacion, el anticuerpo anti-CD40, por ejemplo, seleccionado entre los anticuerpos recombinantes mAb1-mAb3, se formula en una formulacion farmaceutica llquida. El anticuerpo o la protelna anti- CD40 de la divulgacion se puede preparar empleando cualquier metodo conocido en la tecnica, incluyendo los metodos que se dan a conocer anteriormente en la presente. En una realizacion, el anticuerpo anti-CD40, por ejemplo, seleccionado entre los anticuerpos mAb1-mAb3, se produce de una manera recombinante en una llnea celular CHO.

En seguida de su preparation y purification, el anticuerpo anti-CD40 se puede formular como una formulacion farmaceutica llquida en la manera estipulada en la presente. Cuando el anticuerpo antagonista anti-CD40 se va a almacenar antes de su formulacion, se puede congelar, por ejemplo, a -20 °C, y entonces se descongela a temperatura ambiente para su formulacion adicional.

La formulacion farmaceutica llquida comprende una cantidad terapeuticamente efectiva del anticuerpo o de la protelna anti-CD40 de la divulgacion, por ejemplo, el anticuerpo mAb1, mAb2 o mAb3. La cantidad de anticuerpo presente en la formulacion toma en consideration la via de administration y el volumen de dosis deseado.

De esta manera, la composicion farmaceutica llquida comprende el anticuerpo anti-CD40, por ejemplo, el anticuerpo mAb1, mAb2 o mAb3, en una concentration de 0.1 miligramos/mililitro a 300.0 miligramos/mililitro, de 1.0 miligramos/ mililitro a 200 miligramos/mililitro, de 5.0 miligramos/mililitro a 100.0 miligramos/mililitro, de 7.5 miligramos/mililitro a 50 miligramos/ mililitro, o de 15.0 miligramos/mililitro a 25.0 miligramos/mililitro.

La composicion farmaceutica llquida comprende el anticuerpo anti-CD40, por ejemplo, el anticuerpo mAb1, mAb2 o mAb3, y un regulador que mantenga el pH de la formulacion en el intervalo de un pH de 5.0 a un pH de 7.0.

En la formulacion se puede utilizar cualquier regulador adecuado que mantenga el pH de la formulacion de anticuerpo anti-CD40 llquida en el intervalo de aproximadamente un pH de 5.0 a aproximadamente un pH de 7.0, siempre que se conserven la estabilidad flsico-qulmica y la actividad biologica deseadas del anticuerpo, como se observa anteriormente en la presente. Los reguladores adecuados incluyen, pero no se limitan a, los acidos convencionales y las sales de los mismos, en donde el contra-ion puede ser, por ejemplo, sodio, potasio, amonio, calcio, o magnesio. Los ejemplos de los acidos convencionales y las sales de los mismos que se pueden utilizar para regular la formulacion farmaceutica llquida incluyen, pero no se limitan a, los reguladores de acido succlnico o succinato, histidina o clorhidrato de histidina, acido cltrico o citrato, acido acetico o acetato, acido tartarico o tartrato, acido fosforico o fosfato, acido gluconico o gluconato, acido glutamico o glutamato, acido aspartico o aspartato, acido maleico o maleato, y acido malico o malato. La concentracion del regulador dentro de la formulacion puede ser de 1 mM a 50 mM, incluyendo de aproximadamente 1 mM, 2 mM, 5 mM, 8 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, u otros valores dentro del intervalo de 1 mM a 50 mM.

En algunas realizaciones de la divulgacion, la formulacion farmaceutica llquida comprende una cantidad terapeuticamente efectiva del anticuerpo anti-CD40, por ejemplo, el anticuerpo mAb1, mAb2 o mAb3, y regulador de succinato o regulador de citrato o regulador de histidina o regulador de clorhidrato de histidina, en una concentracion que mantenga el pH de la formulacion en el intervalo de aproximadamente un pH de 5.0 a un pH de 7.0. "Regulador de succinato" o "regulador de citrato" significa un regulador que comprende una sal de acido succlnico o una sal de acido cltrico, respectivamente. "Regulador de histidina" significa un regulador que comprende una sal del aminoacido histidina.

En una realizacion preferida, el regulador es un regulador de histidina, por ejemplo, clorhidrato de histidina. Como se observa anteriormente, la concentracion del regulador de histidina dentro de la formulacion puede ser de 1 mM a 50 mM, incluyendo de aproximadamente 1 mM, 2 mM, 5 mM, 8 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, u otros valores dentro del intervalo de 1 mM a 50 mM.

En una realizacion preferida, el contra-ion de succinato o citrato es el cation de sodio, y, por consiguiente, el regulador es succinato de sodio o citrato de sodio, respectivamente. Sin embargo, se espera que sea efectivo cualquier cation. Otros posibles cationes de succinato o citrato incluyen, pero no se limitan a, potasio, amonio, calcio, y magnesio. Como se observa anteriormente, la concentracion del regulador de succinato o citrato dentro de la

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formulacion puede ser de 1 mM a 50 mM, incluyendo de aproximadamente 1 mM, 2 mM, 5 mM, 8 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, u otros valores dentro del intervalo de 1 mM a 50 mM.

En otras realizaciones, la formulacion farmaceutica llquida comprende el anticuerpo antagonista anti-CD40, por ejemplo, el anticuerpo mAb1, mAb2 o mAb3, en una concentracion de 0.1 miligramos/mililitro a 300.0 miligramos/mililitro, o de 1.0 miligramos/ mililitro a 200 miligramos/mililitro, de 5.0 miligramos/mililitro a 100.0 miligramos/mililitro, de 7.5 miligramos/mililitro a 50 miligramos/ mililitro, o de 15.0 miligramos/mililitro a 25.0 miligramos/mililitro, y el regulador de histidina o succinato o citrato, por ejemplo, el regulador de succinato de sodio o citrato de sodio o clorhidrato de histidina, en una concentracion de 1 mM a 50 mM, de 5 mM a 40 mM, de 10mM a 35 mM, de preferencia de aproximadamente 30 mM.

Cuando sea deseable que la formulacion farmaceutica llquida sea casi isotonica, la formulacion farmaceutica llquida que comprende una cantidad terapeuticamente efectiva del anticuerpo o de la protelna anti-CD40 de la divulgacion, por ejemplo, el anticuerpo mAb1, mAb2 o mAb3, y un regulador para mantener el pH de la formulacion dentro del intervalo de aproximadamente un pH de 5.0 a aproximadamente un pH de 7.0, puede comprender ademas una cantidad de un agente isotonizante suficiente para hacer que la formulacion sea casi isotonica. "Casi isotonica" significa que la formulacion acuosa tiene una osmolaridad de 240 mmol/kg a 800 mmol/kg, de preferencia de aproximadamente 240 a aproximadamente 600 mmol/kg, mas preferiblemente de aproximadamente 240 a aproximadamente 440 mmol/kg, mas preferiblemente de aproximadamente 250 a aproximadamente 330 mmol/kg, todavla mas preferiblemente de aproximadamente 260 a aproximadamente 320 mmol/kg, todavla mas preferiblemente de aproximadamente 270 a aproximadamente 310 mmol/kg.

Los metodos para determinar la isotonicidad de una solucion son conocidos por los expertos en este campo. Vease, por ejemplo, Setnikar y colaboradores (1959) J. Am. Pharm. Assoc. 48: 628. Los expertos en este campo estan familiarizados con una variedad de solutos farmaceuticamente aceptables utiles para proporcionar isotonicidad a las composiciones farmaceuticas. El agente isotonizante puede ser cualquier reactivo capaz de ajustar la presion osmotica de la formulacion farmaceutica llquida de la presente divulgacion, hasta un valor casi igual a aquel de un fluido corporal. Es deseable utilizar un agente isotonizante fisiologicamente aceptable.

Por consiguiente, la formulacion farmaceutica llquida que comprende una cantidad terapeuticamente efectiva del anticuerpo antagonista anti-CD40, por ejemplo, el anticuerpo mAb1, mAb2 o mAb3, y un regulador para mantener el pH de la formulacion dentro del intervalo de aproximadamente un pH de 5.0 a aproximadamente un pH de 7.0, puede comprender ademas componentes que se puedan utilizar para proporcionar isotonicidad, por ejemplo, cloruro de sodio; aminoacidos, tales como alanina, valina, y glicina; azucares y alcoholes de azucar (polioles), incluyendo, pero no limitandose a, glucosa, dextrosa, fructosa, sacarosa, maltosa, manitol, trehalosa, glicerol, sorbitol, y xilitol; acido acetico, otros acidos organicos o sus sales, y cantidades relativamente menores de citratos o fosfatos. La persona experta ordinaria sabrla de agentes adicionales que sean adecuados para proporcionar la tonicidad optima a la formulacion llquida.

En algunas realizaciones preferidas, la formulacion farmaceutica llquida que comprende una cantidad terapeuticamente efectiva del anticuerpo anti-CD40, por ejemplo, el anticuerpo mAb1, mAb2 o mAb3, y un regulador para mantener el pH de la formulacion dentro del intervalo de aproximadamente un pH de 5.0 a aproximadamente un pH de 7.0, comprende ademas cloruro de sodio como el agente isotonizante.

La concentracion de cloruro de sodio en la formulacion dependera de la contribucion de otros componentes a la tonicidad. En algunas realizaciones, la concentracion de cloruro de sodio es de 50 mM a 300 mM. En una realizacion, la concentracion de cloruro de sodio es de aproximadamente 150 mM. En otras realizaciones, la concentracion de cloruro de sodio es de aproximadamente 150 mM, el regulador es el regulador de succinato de sodio o citrato de sodio en una concentracion de 5 mM a 15 mM, la formulacion farmaceutica llquida comprende una cantidad terapeuticamente efectiva del anticuerpo o de la protelna anti-CD40 de la divulgacion, por ejemplo, el anticuerpo mAb1, mAb2 o mAb3, y la formulacion tiene un pH de 5.0 a un pH de 7.0.

En otras realizaciones, la formulacion farmaceutica llquida comprende el anticuerpo o la protelna anti-CD40 de la divulgacion, por ejemplo, el anticuerpo mAb1, mAb2 o mAb3, en una concentracion de 0.1 miligramos/mililitro a 50.0 miligramos/mililitro o de 5.0 miligramos/mililitro a 25.0 miligramos/mililitro, aproximadamente 150 mM de cloruro de sodio, y aproximadamente 10 mM, 20 mM 30 mM, 40 mM o 50 mM de succinato de sodio o citrato de sodio, a un pH de aproximadamente un pH de 5.5.

La degradacion de la protelna debido a la congelacion/ descongelacion o al desgarre mecanico durante el procesamiento de una formulacion farmaceutica llquida de la presente divulgacion, se puede inhibir mediante la incorporacion de tensoactivos dentro de la formulacion, con el objeto de bajar la tension superficial en la interfase de solucion-aire. Por consiguiente, en algunas realizaciones, la formulacion farmaceutica llquida comprende una cantidad terapeuticamente efectiva del anticuerpo o de la protelna anti-CD40 de la divulgacion, por ejemplo, el anticuerpo mAb1, mAb2 o mAb3, un regulador para mantener el pH de la formulacion dentro del intervalo de aproximadamente un pH de 5.0 a aproximadamente un pH de 7.0, y comprende ademas un tensoactivo. En otras realizaciones, la formulacion farmaceutica llquida comprende una cantidad terapeuticamente efectiva del anticuerpo o de la protelna anti-CD40 de la divulgacion, por ejemplo, el anticuerpo mAb1, mAb2 o mAb3, un regulador para

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mantener el pH de la formulacion dentro del intervalo de aproximadamente un pH de 5.0 a aproximadamente un pH de 7.0, un agente isotonizante, tal como cloruro de sodio, en una concentracion de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 300 mM, y comprende ademas un tensoactivo.

Los tensoactivos tlpicos empleados son tensoactivos no ionicos, incluyendo esteres de sorbitol de polioxietileno, tales como polisorbato 80 (Tween 80), y polisorbato 20 (Tween 20); esteres de polioxipropileno-polioxietileno, tales como Pluronic F68; alcoholes de polioxietileno, tales como Brij 35; simeticona; polietilenglicol, tal como PEG400; lisofosfatidil-colina; y polioxietileno-p-t-octilfenol, tal como Triton X-100.

La estabilizacion clasica de los productos farmaceuticos mediante tensoactivos o emulsionantes se describe, por ejemplo, en Levine y colaboradores (1991) J. Parenteral Sci. Technol. 45 (3): 160-165, incorporado a la presente como referencia. Un tensoactivo preferido empleado en la practica de la presente divulgacion es polisorbato 80. Cuando se incluye un tensoactivo, tlpicamente se agrega en una cantidad del 0.001 % al 1.0 % (peso/volumen).

Por consiguiente, en algunas realizaciones, la formulacion farmaceutica llquida comprende una cantidad terapeuticamente efectiva del anticuerpo o de la protelna anti-CD40 de la divulgacion, por ejemplo, el anticuerpo mAb1, mAb2 o mAb3, el regulador es succinato de sodio o citrato de sodio o regulador de histidina o regulador de clorhidrato de histidina, en una concentracion de 1 mM a 50 mM, de 3 mM a 40 mM, o de 5 mM a 35 mM; o de 7.5 mM a 30mM; la formulacion tiene un pH de un pH de 5.0 a un pH de 7.0; y la formulacion comprende ademas un tensoactivo, por ejemplo, polisorbato 80, en una cantidad del 0.001 % al 1.0 %, o del 0.001 % al 0.5 %. Estas formulaciones opcionalmente pueden comprender un agente isotonizante, tal como cloruro de sodio, en una concentracion de 50 mM a 300 mM, de 50mM a 200 mM, o de 50 mM a 150 mM.

En otras realizaciones, la formulacion farmaceutica llquida comprende el anticuerpo o la protelna anti-CD40 de la divulgacion, por ejemplo, el anticuerpo mAb1, mAb2 o mAb3, en una concentracion de 0.1 miligramos/mililitro a 200.0 miligramos/mililitro, o de 1 miligramo/mililitro a 100.0 miligramos/mililitro, o de 2 miligramos/ mililitro a 50.0 miligramos/mililitro, o de 5.0 miligramos/mililitro a 25.0 miligramos/mililitro, incluyendo de aproximadamente 20.0 miligramos/mililitro; de 50 mM a 200 mM de cloruro de sodio, incluyendo aproximadamente 150 mM de cloruro de sodio; succinato de sodio o citrato de sodio de 5 mM a 20 mM, incluyendo aproximadamente 10 mM de succinato de sodio o citrato de sodio; cloruro de sodio en una concentracion de 50 mM a 200 mM, incluyendo aproximadamente 150 mM; histidina o cloruro de histidina de 5 mM a 50 mM, incluyendo aproximadamente 30 mM de histidina o cloruro de histidina; y opcionalmente un tensoactivo, por ejemplo, polisorbato 80, en una cantidad del 0.001 % al 1.0 %, incluyendo del 0.001 % al 0.5 %; en donde la formulacion farmaceutica llquida tiene un pH de aproximadamente un pH de 5.0 a aproximadamente un pH de 7.0.

La formulacion farmaceutica llquida puede estar esencialmente libre de cualesquiera conservadores y otros vehlculos, excipientes, o estabilizantes observados anteriormente en la presente. De una manera alternativa, la formulacion puede incluir uno o mas conservadores, por ejemplo, agentes antibacterianos, vehlculos farmaceuticamente aceptables, excipientes, o estabilizantes descritos anteriormente en la presente, en el entendido de que no afecten adversamente la estabilidad flsico-qulmica del anticuerpo antagonista anti-CD40 o fragmento de enlace de antlgeno del mismo. Los ejemplos de los vehlculos, excipientes, y estabilizantes aceptables incluyen, pero no se limitan a, agentes reguladores adicionales, co-solventes, tensoactivos, antioxidantes, incluyendo acido ascorbico y metionina, agentes quelantes, tales como EDTA, complejos de metales (por ejemplo, complejos de Zn- protelna), y pollmeros biodegradables, tales como poliesteres. Se puede encontrar una discusion completa de la formulacion y seleccion de los vehlculos, estabilizantes, e isotonizantes farmaceuticamente aceptables, en Remington's Pharmaceutical Sciences (18a Edicion; Mack Publishing Company, Easton, Pensilvania, 1990).

Despues de que se prepara la formulacion farmaceutica llquida u otra composition farmaceutica descrita en la presente, se puede liofilizar para prevenir la degradation. Los metodos para liofilizar las composiciones llquidas son conocidos por aquellos de una experiencia ordinaria en este campo. Justo antes de usarse, la composicion se puede reconstituir con un diluyente esteril (solution de Ringer, agua destilada, o solution salina esteril, por ejemplo), el cual puede incluir ingredientes adicionales.

Despues de la reconstitution, la composicion de preferencia se administra a los sujetos empleando los metodos que son conocidos por los expertos en este campo.

Uso de los anticuerpos antagonistas anti-CD40 en la elaboration de medicamentos

La presente divulgacion tambien proporciona los anticuerpos o las protelnas antagonistas anti-CD40 de la divulgacion, para utilizarse en el tratamiento de una enfermedad autoinmune y/o de una enfermedad inflamatoria en un sujeto, en donde el medicamento se coordina con un tratamiento con al menos otra terapia.

"Se coordina" significa que el medicamento es para utilizarse ya sea antes, durante, o despues del tratamiento del sujeto con al menos otra terapia. Los ejemplos de otras terapias incluyen, pero no se limitan a, aquellas descritas anteriormente en la presente, es decir, cirugla o procedimientos quirurgicos (por ejemplo, esplenectomla, linfadenectomla, tiroidectomla, plasmaforesis, leucoforesis, trasplante de celulas, tejidos, u organos, perfusion de organo, procedimientos intestinales, y similares), terapia de radiation, terapia tal como terapia esteroidea y terapia no esteroidea, terapia de hormonas, terapia de citoquina, terapia con agentes dermatologicos (por ejemplo, agentes

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topicos utilizados para tratar condiciones de la piel, tales como alergias, dermatitis por contacto, y soriasis), terapia inmunosupresora, y otra terapia anti-inflamatoria con anticuerpos monoclonales, y similares, en donde el tratamiento con la terapia adicional o con las terapias adicionales, se presenta antes, durante, o despues del tratamiento del sujeto con el medicamento, el cual comprende los anticuerpos antagonistas o las protelnas anti-CD40 de la divulgacion, como se observa anteriormente en la presente.

En una realizacion, la presente divulgacion proporciona el anticuerpo mAbl, mAb2 o mAb3 para utilizarse en el tratamiento de una enfermedad autoinmune y/o de una enfermedad inflamatoria en un sujeto, en donde el medicamento se coordina con el tratamiento con al menos otra terapia, como se observa anteriormente en la presente.

En algunas realizaciones, el medicamento que comprende el anticuerpo antagonista anti-CD40, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal mAbl, mAb2 o mAb3, que se da a conocer en la presente, o un fragmento de enlace de antlgeno del mismo, se coordina con el tratamiento con otras dos terapias.

Cuando el medicamento que comprende el anticuerpo antagonista anti-CD40 se coordina con otras dos terapias, el uso del medicamento puede ser antes, durante, o despues del tratamiento del sujeto con cualquiera o ambas de las otras terapias.

La divulgacion tambien proporciona un anticuerpo antagonista anti-CD40, por ejemplo, el anticuerpo mAbl, mAb2 o mAb3 que se da a conocer en la presente, para utilizarse en el tratamiento de una enfermedad autoinmune y/o de una enfermedad inflamatoria en un sujeto, en donde el medicamento se utiliza en un sujeto que se ha tratado previamente con al menos otra terapia.

"Previamente tratado" o "tratamiento previo" significa que el sujeto ha sido tratado con una o mas terapias distintas antes de recibir el medicamento que comprende el anticuerpo antagonista o la protelna anti-CD40 de la divulgacion.

Los siguientes ejemplos se ofrecen a manera de ilustracion y no a manera de limitacion.

Leyendas de las figuras

La Figura 1 muestra la incorporation de 3H-timidina despues de 72 horas de cultivo de celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) humanas estimuladas con una respuesta a la dosis de Chir12.12 (clrculo hueco), mAbl (clrculo negro), mAb2 (cuadro negro), mAb3 (triangulo negro) o el CD40L humano (cuadro hueco).

La Figura 2 muestra la incorporacion de 3H-timidina despues de 72 horas de cultivo de celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) humanas estimuladas con una respuesta a la dosis de Chir12.12 (clrculo hueco), mAb1 (clrculo negro), mAb2 (cuadro negro), mAb3 (triangulo negro), el CD40L humano (cuadro hueco), control de isotipo (rombo negro) co-estimulados en la presencia de ya sea 5 microgramos/mililitro de F(ab')2 anti-IgM o CpG2006 1 pM.

La Figura 3 muestra la incorporacion de 3H-timidina despues de 72 horas de cultivo de celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) humanas estimuladas con una respuesta a la dosis de Chir12.12 (clrculo hueco), mAb1 (clrculo negro), mAb2 (cuadro negro), mAb3 (triangulo negro), el CD40L humano (cuadro hueco), control de isotipo (rombo negro) co-estimulados en la presencia de 75 nanogramos/mililitro de IL-4.

La Figura 4 muestra la incorporacion de 3H-timidina despues de 72 horas de cultivo de celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) humanas estimuladas con 20 microgramos/mililitro de CD40L con una respuesta a la dosis de Chir12.12 (clrculo hueco), mAb1 (clrculo negro), mAb2 (cuadro negro), mAb3 (triangulo negro) o el CD40L humano (cuadro hueco).

La Figura 5 muestra el enlace dependiente de la dosis del anticuerpo anti-CD40 humano para las llneas celulares BJAB, respectivamente, Chir12.12 (clrculo negro), mAb1 (cuadro hueco), mAb2 (triangulo hueco), mAb3 (triangulo negro).

EJEMPLOS

Materiales

1. Anticuerpos monoclonales

Se proporcionaron Chir12.12 (1.9 miligramos/mililitro), mAb1 (0.88 miligramos/mililitro), mAb2 (1.9

miligramos/mililitro), y mAb3 (1.9 miligramos/mililitro) en Citrato 50 mM, pH de 7.0, NaCl 140 mM. Tambien se utilizo un control de isotipo de IgG para los experimentos de selection (Sigma, St. Louis, EUA).

2. Estlmulos de activation de celulas B

El fragmento F(ab')2 AfiniPure de IgM de conejo anti-humano se obtuvo en Jackson Immuno Research (Suffolk, Reino Unido), y el CpG2006 se obtuvo en Microsynth (Balgach, Suiza). El CD40L humano recombinante se genero

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empleando los procedimientos convencionales conocidos por aquellos de una experiencia ordinaria en este campo. El sobrenadante que contenia la IL-4 humana se genero empleando los procedimientos convencionales conocidos por aquellos de una experiencia ordinaria en este campo.

3. Reactivos de cultivo de tejido in vitro

Medio de cultivo de celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC): RPMI-1640, suero bovino fetal (FBS) al 10 %, Penicilina/Estreptomicina al 1 %, aminoacidos no esenciales al 1 %, piruvato de sodio al 1 %, 13-mercaptoetanol 5 mM (todos de Invitrogen, San Diego, EUA).

Metodos

1. Ensayo de proliferacion de celulas mononucleares de sangre periferica (PBMCs) mediada por CD40L

1.1 Purificacion de celulas mononucleares de sangre periferica (PBMCs) humanas

Las celulas mononucleares de sangre periferica (PBMCs) se purificaron a partir de recubrimientos esponjosos de sangre entera obtenidos a partir de voluntarios sanos (Blutspendezentrum, Basilea). Los recubrimientos esponjosos se diluyeron a 1:4 con suero regulado con fosfato (PBS) sin Ca2+ y Mg2+ que contenia EDTA 5 mM, y se hicieron alicuotas de 25 mililitros en tubos Falcon de 50 mililitros. Los recubrimientos esponjosos diluidos se respaldaron con 14 mililitros de Ficoll-Plaque mas (GE Healthcare) por tubo Falcon, y se centrifugaron a temperatura ambiente durante 20 minutos a 2,250 revoluciones por minuto (sin frenar). En seguida de la centrifugacion, la capa de interfase se transfirio a un solo tubo Falcon de 50 mililitros. Las capas de interfase a partir de multiples tubos (a partir de un solo donador) se combinaron hasta un volumen de 30 mililitros. Se agrego suero regulado con fosfato (PBS) complementado con EDTA 5 mM, y las celulas se centrifugaron a temperatura ambiente durante 5 minutos a 2,250 revoluciones por minuto. El sobrenadante se desecho antes de la adicion de 15 mililitros de regulador de lisis de globulos rojos sanguineos (RBC), y de la incubacion a temperatura ambiente durante 5 minutos. Subsiguientemente, se agregaron 20 mililitros de suero regulado con fosfato (PBS)/EDTA5 mM, y las celulas se centrifugaron nuevamente (a temperatura ambiente/5 minutos, a 2,250 revoluciones por minuto). Las celulas se lavaron dos veces en suero regulado con fosfato(PBS)/EDTA 5 mM (con interviniendo pasos de centrifugacion), y se volvieron a suspender en 35 mililitros del medio de celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) antes de la determinacion del numero de celulas viables utilizando exclusion con tinte Trypan Blue. Las celulas que no se usaron inmediatamente para la estimulacion in vitro se crioconservaron.

1.2 Ensayo de estimulacion de celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) in vitro

Se hicieron series de dilucion dobles de siete puntos de cada mAb anti-CD40 o de control de isotipo por triplicado en placas Costar de 96 pozos en la presencia o en ausencia de una dosis constante de 5 microgramos/mililitro de F(ab')2 anti-IgM, CpG2006 1 pM, el sobrenadante que contenia la IL-4 humana (75 nanogramos/mililitro), o 40 microgramos/mililitro de huCD40L recombinante (las concentraciones finales indicadas). Las concentraciones iniciales de cada mAb anti-CD40 estuvieron en el intervalo de 20 microgramos/ mililitro a 100 microgramos/mililitro, dependiendo del experimento. Se utilizo el CD40L en la respuesta a la dosis como un control positivo para todos los experimentos. Las dosis de anti-IgM, CpG2006, IL-4 y CD40L se seleccionaron basandose en los experimentos anteriores, en donde se evaluo la capacidad de estos reactivos (solos o en combination) para inducir las celulas mononucleares de sangre periferica (PBMCs) o la proliferacion de celulas B, en la respuesta a la dosis (no se muestran los datos). Las celulas mononucleares de sangre periferica (PBMCs) (densidad final de 8x104 por pozo) se agregaron subsiguientemente a cada pozo antes de la incubacion durante 3 dias a 37 °C/CO2 al 5 %. Se agrego 3H- timidina (1 pCi/50 microlitros/pozo) a cada pozo durante las 6 horas de cultivo finales antes de la cosecha, y la determinacion de la incorporation de timidina utilizando un contador de centelleo MicroBetaTrilux. Observe que se incluyeron las celulas mas el medio, y las celulas mas el medio mas los cultivos de control anti-IgM, IL-4, CpG2006 o CD40L (en ausencia de los mAbs anti-CD40) en cada experimento.

Los datos de centelleo se analizaron utilizando Excel y el software GraphPad Prism. Los resultados se presentan como los recuentos promedio por minuto (cpm) (+/- error estandar del promedio) contra una transformation log de la concentration del mAb anti-CD40. En cada grafica se indican los niveles del fondo de los controles positivos y de las celulas mas el medio. Los valores IC50 o EC50 se calcularon sujetos a un ajuste de la curva de exito de los datos mediante Prism.

Las celulas mononucleares de sangre periferica (PBMCs) se estimularon como se indica anteriormente, con 20 microgramos/ mililitro de CD40L en la presencia o en ausencia de una respuesta a la dosis del mAb anti-CD40 de prueba durante 3 dias. La proliferacion se evaluo por la incorporacion de 3H-timidina despues de 72 horas de cultivo. Los resultados se presentan como el promedio de los cultivos triplicados con el SEM, y son representativos de 4 donadores (experimentos independientes). Los valores IC50 para la inhibition mediada por el mAb anti-CD40 se tabulan en microgramos/mililitro.

2. Ensayo de agonista de celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) in vitro

Las celulas mononucleares de sangre periferica (PBMCs) humanas se estimularon como se indica en el parrafo 1.2

anterior, con una respuesta a la dosis de Chir12.12, mAbl, mAb2 o mAb3 durante 3 dlas, ya sea en ausencia de co- estimulacion o bien en la presencia de cualquiera de 5 microgramos/mililitro de F(ab')2 anti-IgM o CpG2006 1 pM. La proliferacion se evaluo por la incorporation de 3H-timidina despues de 72 horas de cultivo. Los resultados se presentan como el promedio de los cultivos triplicados con el SEM y son representativos de 4 donadores 5 (experimentos independientes).

3. Ensayo de ADCC

Se agregaron 50 microlitros de una suspension de celulas mononucleares de sangre periferica (PBMCs) (10 x 106 celulas/mililitro) a los pozos de fondo redondo (Corning Incorporated - Costar #3790), y se agregaron 50 microlitros de celulas Raji tenidas con calcelna a (2 x 105 celulas/mililitro), y 100 microlitros de dilution de anticuerpo o los 10 controles. La maxima lisis se determino en Triton 100 al 2 %.

Las celulas se recolectaron en el fondo de la placa (3 minutos a 250 g), y se incubaron a 37 °C en una atmosfera de CO2 (al 5 %) humidificada durante 1 hora. Las celulas se separaron del medio mediante centrifugation (3 minutos a 750 g), y se transfirieron 100 microlitros del sobrenadante a una placa negra de fondo transparente (Corning Incorporated - Costar #3904) para la medicion.

15 La fluorescencia se determino a 535 nanometros despues de la excitation a 485 nanometros con un espectrometro SpectraMax Gemini (Molecular Devices). La lisis especlfica se calculo utilizando la siguiente formula:

(liberation experimental - liberation espontanea)/(maxima liberation - liberation espontanea) x 100.

4. Enlace de variantes de anticuerpos anti-CD40 humanos para la llnea celular BJAB humana

Se utilizo citometrla de flujo, con el objeto de comparar el enlace de las diferentes variantes de Fc de anticuerpos 20 anti-CD40 con su enlace a las celulas BJAB humanas. Por consiguiente, se sembraron 2 x 105 celulas por pozo en una placa de fondo en V de 96 pozos. Las placas se lavaron dos veces con 200 microlitros de regulador FACS (suero regulado con fosfato (PBS), suero fetal de becerro (FCS) al 5 %, EDTA 2 mM) durante 2 minutos a 4 °C a 1,350 x g. Los sobrenadantes se desecharon, y las celulas se volvieron a suspender en 100 mililitros de regulador FACS que contenla suero humano al 8 % (InVitromex, Cat. No. S4190), y se incubaron durante 10 minutos. 25 Despues de dos lavados, se agregaron las variantes de Fc anti-CD40 humano en 50 microlitros de regulador FACS con suero humano al 1 %, empezando con una concentration de 10 microgramos/mililitro en una dilucion a 1:2. Las celulas se incubaron durante 30 minutos sobre hielo, seguido por dos pasos de lavado. A cada pozo se le agregaron 50 microlitros de FITC de conejo policlonal anti-IgG humana, F(ab')2 (DAKO, Cat. No. F 0315), y se incubaron durante 30 minutos sobre hielo. Al final de la incubation, las celulas se lavaron dos veces, se volvieron a suspender 30 en 100 microlitros de regulador FACS, y se adquirieron en un FACS CantoII.

Despues de la adquisicion, se adquirio la intensidad de fluorescencia promedio del canal de FITC en FloJo. La graficacion y el ajuste de la curva se llevaron a cabo con GraphPad Prism 5.0. Debido a las intensidades cambiantes entre los experimentos individuales, se normalizaron los valores. Por consiguiente, el valor mas alto de cada serie de prueba de anticuerpo se igualo al 100 %. Los ajustes de curva no lineales se llevaron a cabo con los valores de 35 porcentaje.

5. Ensayo de production de citoquina mediada por CD40L en celulas dendrlticas derivadas de monocitos (MoDCs)

5.1 Preparation de celulas dendrlticas derivadas de monocitos humanos

Las celulas mononucleares de sangre periferica (PBMCs) humanas se prepararon a partir de los recubrimientos esponjosos humanos proporcionados por la Cruz Roja Suiza. El recubrimiento esponjoso se diluyo a 1:5 en suero 40 regulado con fosfato (PBS) (Invitrogen, Cat. No. 20012019), y se distribuyo en allcuotas de 35 mililitros en tubos Falcon de 50 mililitros. Subsiguientemente, se aplicaron 13 mililitros de Ficoll (GE Healthcare, Cat. No. 17 1440-02) a cada tubo. Las celulas se centrifugaron a 1,680 x g a temperatura ambiente durante 20 minutos sin romperse. La capa que contenla las celulas mononucleares de sangre periferica (PBMCs) se recolecto y se lavo dos veces en un volumen grande de suero regulado con fosfato (PBS) durante 5 minutos a 1,000 x g. Finalmente, las celulas se 45 volvieron a suspender en 10 mililitros de suero regulado con fosfato (PBS) y se contaron.

Los monocitos humanos se aislaron negativamente a partir de 100 x 107 celulas mononucleares de sangre periferica (PBMCs) utilizando el kit II de aislamiento de monocitos humanos de Miltenyi (Miltenyi, Alemania, Cat. No. 130-091153) en un instrumento AutoMACS de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Despues del aislamiento, celulas se lavaron dos veces durante 5 minutos a 1,000 x g a 4 °C en el medio de cultivo (RPMI1640 (Invitrogen, Cat. No. 50 61870010), suero fetal de becerro (FCS) al 10 % (Invitrogen, Cat. No.16000044, origen de los Estados Unidos),

piruvato de sodio 1 mM (Invitrogen, Cat. No. 11360039), 1 x NEAA (Invitrogen, Cat. No. 11140035) 1 x Penicilina/Estreptomicina (Invitrogen, Cat. No. 15140122)). Los monocitos aislados se contaron, se aplicaron en placas de 6 pozos a una densidad de 0.4 x 106/mililitro, y se cultivaron durante siete dlas a 37 °C, con CO2 al 5 %. Para diferenciar los monocitos para las celulas dendrlticas, se agregaron, IL-4 humana [80 nanogramos/mililitro] y 55 GM-CSF humano [100 nanogramos/mililitro] recombinantes (ambos producidos internamente en la empresa) al medio de cultivo al inicio del cultivo.

5.2 Estimulacion de celulas dendrlticas (DCs) para la liberacion de citoquina

Las celulas dendrlticas (DCs) inmaduras se cosecharon despues de 7 dlas de cultivo enjuagando las placas de 6 pozos, reservando las celulas, y lavandolas dos veces durante 5 minutos a 1,400 x g en el medio de cultivo. Subsiguientemente, se sembraron 2 x 105 celulas dendrlticas inmaduras (iDCs) en placas de fondo plano de 96 5 pozos (Becton Dickinson, Cat. No. 353072) a 100 microlitros. Para el control positivo, las celulas se estimularon con MegaCD40L (Alexis, Cat. No. ALX-522-110-C010) en una concentracion de 1 microgramo/mililitro, el control negativo consistio en las celulas dendrlticas inmaduras (iDCs) en el medio solamente. En el ensayo de antagonismo, se agregaron las variantes Fc del anticuerpo anti-CD40 humano a 10 microgramos/mililitro en una dilucion a 1:2, junto con 1 microgramo/mililitro de MegaCD40L para una respuesta a la dosis. Los sobrenadantes de las celulas 10 estimuladas se recolectaron 24 horas despues para la medicion del TNFa. En el ensayo de agonismo, se agregaron las variantes Fc del anticuerpo anti-CD40 humano a 10 microgramos/mililitro en una dilucion a 1:2 solamente, y los sobrenadantes se recolectaron despues de 48 horas para la medicion del TNFa. Las celulas se sembraron y se estimularon por triplicado para todos los ensayos.

5.3 Medicion del TNF-alfa mediante ELISA

15 Con el fin de medir la cantidad de TNFa en los sobrenadantes, se llevo a cabo el ELISA como sigue. Se recubrio el anticuerpo de captura anti-TNFa (BD Pharmingen, Cat. No. 551220) en las placas ELISA (Greiner, Nunc F96 Maxisorp, Cat. No. 442404) a 5 microgramos/mililitro, en 50 microlitros por pozo, durante la noche a 4 °C. Por cada paso de lavado, las placas se lavaron 3 veces con 250 microlitros en una lavadora de placas BioTek ELx 405. Despues del primer lavado, se incubaron 200 microlitros de Superblock TBS (Thermo Scientific, Pierce, Cat. No. 20 37535) durante 1 hora a 37 °C. En seguida, se agrego el estandar de TNFa (TNFa humano recombinante, R&D

Systems, Cat. No. 210-TA) o la muestra, en 25 microlitros. El estandar empezo en una concentracion final de 20 nanogramos/mililitro en una serie de dilucion a 1:2. En adicion, se agregaron 25 microlitros del anticuerpo de deteccion (TNFa-biotina anti-humano, BD Pharmingen, Cat. No. 554511), en una dilucion a 1:500. Las placas se incubaron durante la noche a 4 °C. Despues de lavar, se agrego el conjugado de Avidina-POD (fosfatasa alcalina 25 ExtrAV, Sigma, Cat. No. E-2636) diluido a 1:5000 en Superblock TBS, en 50 microlitros, y se incubo durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron, y se agregaron 50 microlitros del sustrato de fosfato de p-nitro-fenilo (Sigma, Cat. No. C-3041), para revelar durante 15 minutos. Las placas ELISA se leyeron a 450 nanometros con el software SoftMax Pro en un SpectraMax M5 (Molecular Devices).

6. Estudio de toxicologla

30 El proposito inicial primario del estudio de toxicologla fue investigar la toxicidad potencial del mAb1 en una dosis alta (100 mg/kg) en comparacion con el Chir12.12.

Se utilizaron treinta monos cinomolgos de origen de Mauritania para este estudio. Al inicio de la dosificacion, los animales eran de aproximadamente 4 a 5 anos de edad, y pesaban de 4.5 a 6.6 kilogramos los machos, y de 3.1 a

4.3 kilogramos las hembras.

35 El mAb1 (50 miligramos/mililitro) se administro intravenosamente a un grupo de monos cinomolgos (5 machos/5 hembras; grupo 2) en un nivel de dosis de 100 mg/kg y en un volumen de dosis de 2 mililitros/kilogramo una vez por semana durante 5 semanas (aplicaciones del artlculo de prueba en los dlas 1, 8, 15, 22, 29, y 36). Un grupo adicional de monos cinomolgos (5 machos/5 hembras; grupo 3) recibio el anticuerpo progenitor Chir12.12 intravenosamente mediante infusion lenta de bolo en un nivel de dosis de 100 mg/kg y en un volumen de dosis de 5 40 mililitros/kilogramo. Se dio el placebo del mAb1 en un volumen de dosis de 2 mililitros/kilogramo a otro grupo de monos cinomolgos, los cuales sirvieron como controles (5 machos/5 hembras; grupo 1). Todos los animales se sometieron a necropsia uno o dos dlas despues de la ultima dosificacion.

Se decidio incorporar una inmunizacion con hemocianina de lapa californiana (KLH) con el objeto de evaluar la eficacia de ambos Abs anti-CD40. En el dla 2, los animales se inmunizaron con 1 miligramo de KLH in Alum seguida 45 por una inyeccion de refuerzo de 0.5 miligramos de hemocianina de lapa californiana (KLH) en Alum en el dla 23. El suero se muestreo antes de la inmunizacion/refuerzo, as! como en los dlas 7 y 14 despues de la inmunizacion y del refuerzo, respectivamente. Se determinaron las titulaciones de IgM/IgG especlficas de la hemocianina de lapa californiana (KLH) con el ELISA utilizando el suero de referencia de IgM/IgG anti-KLH de mono cinomolgo como estandar. La sangre se muestreo en 3 ocasiones antes de la dosis y en el dla 15, 29 y en la necropsia (dla 37/38) 50 para la inmunofenotipificacion de las celulas B puras (CD20+CD21+CD27-). Los recuentos absolutos de las celulas B CD20 puras se calcularon a partir del recuento total de linfocitos por muestra de sangre, y el recuento relativo de celulas B CD20 puras mediante citometrla de flujo.

5

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20

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40

Tabla 4

Compendio del Estudio de Toxicologla

# de Grupo

Description del Grupo Nivel de dosis (mg/kg/ dosis) Volumen de Dosis* (ml/kg) Animales/grupo Necropsia despues de 5 semanas

Macho

Hembra

1

Control 0 2 5 5 5 M/5 F

2

mAb1 100 2 5 5 5 M/5 F

3

Chir12.12 100 5 5 5 5 M/5 F

* Basandose en el peso corporal individual mas reciente.

La evaluacion de la toxicidad se baso en la mortalidad, en las observaciones cllnicas (signos cllnicos, incluyendo las observaciones despues de la dosificacion, la evaluacion de las heces, la inspeccion de la piel, y el consumo de alimento), los pesos corporales, los examenes oftalmicos, las investigaciones cardiovasculares la patologla cllnica (incluyendo coagulacion, examenes externos de activacion de plaquetas, hematologla, qulmica cllnica, y analisis de orina), los pesos de los organos, y los descubrimientos macroscopicos y microscopicos de la necropsia. La inmunofenotipificacion de la sangre se llevo a cabo tres veces antes de la dosis, en los dlas 15 y 29 de la fase de dosificacion, as! como en el dla de la necropsia. Adicionalmente, se llevo a cabo la inmunofenotipificacion del tejido del bazo y el drenado de los ganglios linfaticos del sitio de inyeccion de la hemocianina de lapa californiana (KLH) en la necropsia. En adicion, se examino la respuesta del anticuerpo dependiente de las celulas T (TDAR) a la hemocianina de lapa californiana (KLH), para comparar directamente la influencia del Chir12.12 completamente capaz de tener ADCc con el mAb1. Se recolecto la sangre de todos los animales para la evaluacion toxicocinetica, y para una posible evaluacion del anticuerpo anti-farmaco (ADA).

7. Perfilacion adicional in vitro del mAb1

7.1 Purification de las celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC)

Las celulas mononucleares de sangre periferica (PBMCs) humanas se prepararon como se describe anteriormente en la section 1.1.

7.2 Purificacion de celulas B de amlgdalas humanas

Se removio la capsula de la amlgdala y el tejido conectivo, y despues se corto el material de la amlgdala en pedazos grandes de aproximadamente 5 millmetros antes de machacarse a traves de un cernidor de celulas metalico, lavando regularmente con el medio de celulas B. Las celulas de las amlgdalas se filtraron entonces dos veces a traves de un cernidor de celulas de 70 micras, con el objeto de remover el desecho celular. Las celulas B se aislaron de las celulas mononucleares de sangre periferica (PBMCs) frescas utilizando un Kit de Enriquecimiento de Celulas B Humanas de Selection Negativa EasySep (Stemcell Technologies, Vancouver, BC, Canada). Las celulas B se purificaron utilizando un Kit de Enriquecimiento de Celulas B Humanas de Seleccion Negativa EasySep de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Stemcell Technologies, Vancouver, BC, Canada).

7.3 Evaluacion de los valores EC50 del enlace de CD40 utilizando celulas mononucleares de sangre periferica (PBMCs) humanas y de primate no humano o celulas B

Las celulas mononucleares de sangre periferica (PBMCs) (de mono rhesus, de mono cinomolgo, o humanas) o las celulas B de las amlgdalas (humanas solamente) se incubaron a 4 °C durante 30 minutos con el mAb1 marcado purificado o con los anticuerpos de control de isotipo en la respuesta a la dosis (intervalo de concentration final de 2.5 microgramos/mililitro - 0.00125 microgramos/mililitro). Las celulas subsiguientemente se lavaron antes de incubarse con un anticuerpo de IgG anti-humano (que reacciona cruzadamente con primate no humano), y anti- humano biotinilado con una reactividad cruzada minima con las NHPs (R10; observe que fue posible distinguir las celulas B humanas que expresaban la IgG de membrana, ya sea incluyendo una cepa anti-IgM, o bien por medio de la intensidad diferencial del tenido con FACS). Las celulas nuevamente se incubaron a 4 °C durante 30 minutos antes de lavarse, y se sometieron a un tenido final con estreptavidina-FITC durante 20 minutos a 4 °C. Las celulas subsiguientemente se lavaron, y se llevo a cabo la evaluacion de la expresion de CD40 en las celulas CD20+

mediante citometrla de flujo.

7.4 Evaluacion de la inhibicion de la proliferacion inducida por CD154 de las celulas mononucleares de sangre periferica (PBMCs) humanas y de primate no humano o de las celulas B

Se hicieron series de dilucion dobles de siete puntos de cada mAb anti-CD40 o de control de isotipo por triplicado en 5 placas de 96 pozos en la presencia de concentraciones EC80 de CD154 e IL-4 humanas recombinantes. Las concentraciones iniciales de cada mAb anti-CD40 estuvieron en el intervalo de 20 microgramos/mililitro a 100 microgramos/mililitro, dependiendo del experimento. Las celulas y los controles del medio se utilizaron como controles negativos para todos los experimentos. Subsiguientemente se agregaron a cada pozo las celulas mononucleares de sangre periferica (PBMCs) (de mono rhesus, de mono cinomolgo, o humanas) o las celulas B de 10 las amlgdalas (humanas solamente) antes de la incubacion durante 3 dlas a 37 °C/CO2 al 5 %. A cada pozo se le agrego 3H-timidina (1 pCi/50 microlitros/ pozo), durante las 6 horas finales del cultivo antes de de la cosecha y de la determinacion de la incorporacion de timidina utilizando un contador de centelleo.

8. Eficacia del mAb1 combinado con ciclosporina A en un modelo de alo-trasplante de rinon en mono cinomolgo 8.1 Animales

15 Todos los monos cinomolgos (Macaca fascicularis) utilizados fueron machos de 7.5-9 anos de edad (#5529/#5533, #5523/#5524 y #5536/#5538), criados en cautividad, de 7.7 ± 0.9 kilogramos, y originarios de las Filipinas (Siconbrec, Makati City, Filipinas). En el momento del trasplante, los animales presentaron analisis normales de hematologla y de qulmica de suero/orina, y fueron negativos para tuberculosis, Salmonela/Shigella, para anticuerpos contra agentes virales (HerpesB, virus de leucemia de celulas T de simio, virus de inmunodeficiencia de simio, 20 retrovirus tipo D de simio, Hepatitis B), y para los ecto/endoparasitos relevantes. Sin embargo, todos los animales presentaron anticuerpos contra Citomegalovirus y Virus de Hepatitis A (HAV) (probados en el 2010; el animal #5536 fue negativo para hAv). La coprologla del animal #5523 probo ser positiva para Balantidium coli en Diciembre de 2010.

Durante la primera semana despues de la cirugla, los animales se alojaron en jaulas individuales de telemetrla, 25 permitiendo el contacto visual entre ellos. El resto del tiempo, los animales #5536/#5538 se alojaron juntos, y los 4 animales restantes se mantuvieron aislados durante todo el experimento (animales incompatibles). Todos los animales se alojaron bajo una temperatura sostenida (20-24 °C), con al menos el 40 % de humedad, y con un ciclo de luz natural. Todos se alimentaron al menos dos veces al dla con mezcla de frutas y verduras. Se proporcionaron agua y granulos Kliba Nafag 3446 (Kaiseraugst, Alemania) al gusto.

30 Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con los Reglamentos Suizos de Bienestar Animal y bajo la licencia BS1555.

Tabla 5

Caracterlsticas del animal

Especie

Raza Categorla Vendedor Genero Peso Edad

Cinomolgo (Macaca fascicularis)

Cualquier raza Sin especificar BioPRIM M/F 7.7±0.9 7.5-9

35 8.2 Condiciones experimentales

8.2.1 Trasplante de rinon, y monitorizacion post-operatoria

Los pares de donador/receptor se seleccionaron de acuerdo con el emparejamiento ABO, mal emparejamiento exon2 DRB (Blancher A, Tisseyre P, Dutaur M y colaboradores (2006) Immunogenetics; 58(4): 269-82), y las respuestas en la reaccion de linfocitos mixtos de una via (MLR), con Indices de estimulacion de MLR (MLR-SIs) >7 y 40 <47 (Bigaud M, Maurer C, Vedrina y colaboradores (2004) J. Pharmacol. Toxicol. Methods; 50(2): 153-9). Los

resultados de esta seleccion se muestran en la Tabla 6, y consistieron en duo-trasplante (trasplante intercambiado entre 2 donadores). A cada receptor se le implanto una sonda telemetrica (Data Sciences Inc, EUA) para monitorizar la presion sangulnea arterial, la frecuencia cardlaca, y la actividad motora.

Para la cirugla, se indujo anestesia general mediante quetamina; 10 mg/kg, intramuscularmente (i.m.), asociada con 45 atropina (0.05 mg/kg intramuscularmente (i.m.)), y se mantuvo mediante ventilacion con N2O/O2 (50:50), y propofol intravenosamente (i.v.) (de 4 a 10 mg/kg/hora; complementado por 5 a 10 miligramos de bolo siempre que se requiriera). Los rinones de los donadores se cosecharon, se inundaron con solucion de la Universidad de Wisconsin

5

10

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30

35

frla (4 °C) (tiempo de conservacion frla < 4 horas), y se trasplantaron heterotopicamente, empleando tecnicas microvasculares convencionales para crear una anastomosis de extremo a costado entre la vena renal de injerto y la vena cava del receptor, y entre la arteria renal de injerto y la aorta distal del receptor (tiempo de anastomosis < 40 minutos). Se llevo a cabo una uretero-cistoneostomla despues de la aparicion de orina a partir del injerto. Los rinones nativos se removieron. Se proporciono analgesia post-operatoria mediante buprenorfina, de 0.0l a 0.02 mg/kg, intramuscularmente (i.m.), tres veces al dla); antibioticos (cefotaxima, 25 mg/kg, intramuscularmente (i.m.), dos veces al dla; o ceftriaxon, 50 mg/kg, intramuscularmente (i.m.) en lidocalna al 1 %, cuatro veces al dla). La analgesia y los antibioticos se proporcionaron durante 5 dlas. Siempre que los recuentos de plaquetas experimentaban un aumento notorio o disminulan, se administraba aspirina en una dosis de 5 mg/kg intramuscularmente (i.m.) al dla (Aspegic, Sanofi-Aventis, Meyrin, Suiza).

Los receptores se monitorizaron para detectar los cambios en las condiciones cllnicas y cardiovasculares, el peso corporal, la ingestion de alimento y agua (complementado con max. de 100 a 150 mililitros/kilogramo/dla), la produccion de orina, la hematologla (usando el Beckmann Coulter ACT5Diff), la qulmica en suero y orina (usando un analizador Vetscan para la determinacion diaria de SCrea/SUrea/SAmilasa y un analizador Beckmann Synchron CX5 para la confirmation final de las muestras de suero y orina). Se utilizaron los niveles en suero de creatinina (SCrea) y urea (SUrea) como marcadores de la funcion del injerto. Se llevaron a cabo biopsias transcutaneas guiadas por ultrasonido, con una aguja calibre 16g, como se describe anteriormente (Gaschen L, Kunkler A, Menninger K y colaboradores (2001) Vet. Radiol. Ultrasound; 42(3): 259-64), bajo anestesia general en el dla 30 (animales #5529 y #5533, solamente). En adicion, tambien se llevo a cabo una monitorizacion especial para la coagulabilidad de la sangre y la acumulacion de plaquetas en los animales #5529/#5533 y #5523/#5524 antes y despues del trasplante.

Los receptores finalmente se eutanizaron en el caso de: (i) falla grave del injerto (por ejemplo, SCrea >500 micromoles/litro o SUrea >20 milimoles/litro) asociada o no con un aumento en el puntaje del ultrasonido; o (ii) problemas de salud general y/o signos cllnicos evidentes de malestar. En la necropsia, se recolectaron los aloinjertos de rinon (incluyendo ureter y anastomosis), junto con todos los otros organos mayores, y se procesaron para el siguiente analisis histologico.

Tabla 6

Information general acerca de las combinaciones de donador/receptor y reglmenes de tratamiento empleados

Receptor

Peso corporal (kg) Donador ABO MLR-SI (una via) mAb1/CsA (ml/kg, i.v./p.o.) Fecha del trasplante

5529 S

7.35 5533 S B/B 16 30/20 21.09.10

5533 S

6.1 5529 S B/B 9 30/20 21.09.10

5523 S

8.2 5524 S B/B 7 30/20 18.01.11

5524 S

8.3 5523 S B/B 18 30/20 18.01.11

5536 S

8 5538 S B/B 47 30/20 07.06.11

5538 S

8.45 5536 S B/B 11 30/20 07.06.11

8.2.2 Tratamientos con mAb1 y ciclosporina A (CsA)

El mAb1 se proporciono en una forma llquida recien descongelada en el dla de la infusion desde -80 °C. Se hizo la aplicacion de 30 mg/kg/intravenosamente (i.v.) una vez por semana, exceptuando las primeras tres dosis en el dla - 1, 0 y 1 (antes y despues del trasplante). La CsA para administration oral (p.o.) fue una solution para beber de un pre-concentrado en microemulsion (Sandimmun Neoral (RTM), 100 miligramos/mililitro, Novartis Pharma AG). La CsA se aplico en una dosis diaria (empezando en el dla -1) de 20 mg/kg/oralmente (p.o.), en combination con el mAb1 (vease la Tabla 6).

8.2.3 Monitorizacion de la farmacocinetica (PK), la inmunogenicidad (anticuerpo de primate anti-humano), y la

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farmacodinamia (PD) del mAbl

Se recolectaron muestras de sangre (500 microlitros de suero) (antes de la dosificacion intravenosa (i.v.)) para la determinacion de las exposiciones al mAbl en el dla -1, 3, 7 (llnea basal y 15 minutos), 14, 28, 42, 56, 70, 84 y 100. Para las determinaciones de la CsA, se recolectaron muestras de sangre antes de la dosificacion oral de la CsA (C0/C24), y 2 horas despues de la aplicacion (C2). C2 corresponde a los niveles pico de absorcion de CsA. Todo el material se almaceno a -80 °C hasta su procesamiento adicional (kit de deteccion de CsA, Hot Star Taq Master Mix, Qiagen Minnesota, US). Las muestras para la inmunogenicidad del mAb1 se recolectaron (50 microlitros de suero) en los dlas -1, 7, 14, 28, 42, 56, 70, 84 y 100 y se mantuvieron congeladas a -80 °C. Dicho de una manera breve, las placas de microtitulacion de 96 pozos se recubrieron con el CD40 humano recombinante. Estas se almacenaron a una temperatura nominal de 4 °C durante la noche. En seguida del bloqueo, se agregaron a la placa estandares calibradores (Cs), muestras de control de calidad (QC), y especlmenes de muestra que contenlan el mAb1. La placa se incubo a una temperatura nominal de +25 °C durante 120 minutos con agitacion. En seguida del lavado de la placa, se agrego a la placa el anticuerpo de cadena ligera kappa de raton anti-humano, seguido por el conjugado de cabra anti-raton/HRP (H+L), para detectar cualquier mAb1 enlazado al CD40 recombinante. Este se visualizo mediante la adicion de un sustrato cromogenico (TMB), y la intensidad del color producido (absorbencia) fue directamente proporcional a la concentracion del mAb1 presente. La concentracion del mAb1 en las muestras se retro-calculo entonces a partir de una curva de calibration. Las muestras farmacodinamicas (PD) se obtuvieron de 2 a 3 dlas antes del trasplante como las llneas basales (0.5 mililitros en heparina). Despues de la recoleccion, se siguio el mismo programa que para las muestras farmacocineticas (PK). Las celulas CD20+ y CD3+ se contaron con Tubos TruCount (Becton Dickinson, cat# 340334) utilizados de acuerdo con las instrucciones del fabricante con un mAb APC anti-CD40 humano (Clon 5C3, Becton Dickinson, cat# 555591), un PerCP anti-CD3 humano (Clon SP34- 2, Becton Dickinson, cat# 552851), y un mAb FITC anti-CD20 humano (Clon LT20, Immunotools, cat# 21279203X2). Los datos se adquirieron en un citometro de flujo LSRII (Becton Dickinson Biosciences) utilizando el software DIVA (version 6.1.1). Los linfocitos y las perlas se pasaron a la grafica de puntos de FSC/SSC de acuerdo con los tamanos y la granularidad, y se analizaron adicionalmente para la expresion de CD20 y CD3.

8.2.4 Histologla

Todos los tejidos recolectados (biopsias de injerto o en la necropsia) se examinaron macroscopicamente y se fijaron en formalina regulada al 4 %. Despues de la deshidratacion, se embebieron en cera de parafina.

Se cortaron secciones de 3 micras de espesor a partir de los bloques de parafina, y se tineron con hematoxilina y eosina (HE). Se llevaron a cabo tres tenidos adicionales (acido peryodico de Schiff, tricromo, y Verhoeff) en las secciones de rinon. Las muestras de la biopsia y de la necropsia fueron examinadas por un patologo experimentado, y se calificaron de acuerdo con la clasificacion de patologla de aloinjerto renal 07 de Banff (Solez K, Colvin RB, Racusen LC y colaboradores (2008) Am. J. Transplant; 8(4): 753-60). Los expertos externos tambien llevaron a cabo la revision del companero.

En adicion, se llevo a cabo la inmunohistoqulmica para la protelna de complemento C4d utilizando un anticuerpo polivalente anti-C4d adecuado para tenir las secciones de parafina (Regele H, Exner M, Watschinger B y colaboradores, 2001, Nephrol. Dial. Transplant; 16: 2058-2066). C4b se considera como un marcador estable y confiable del rechazo humoral agudo (AHR). Despues de la fijacion y la incrustation en cera de parafina, se prepararon portaobjetos (SuperFrostPlus, RTM, Menzel-Glaeser, Alemania) con las secciones de 3 micras de espesor, y se secaron durante la noche en un horno a 37 °C para la adhesion optima a los portaobjetos. Se agregaron las secciones de rinon humano rechazadas como un control positivo. Antes de usarse, los portaobjetos se desparafinizaron en Xileno (10 minutos), se rehidrataron a traves de etanol graduado, y se colocaron en agua destilada. La recuperation del antlgeno se llevo a cabo cocimiento a presion durante 10 minutos a 1 bar el regulador de citrato (pH de 6.0), como se describio anteriormente (Segerer S, Mack M, Regele H, Kerjaschki D, Schlondorff D. Kidney Int. 1999; 56: 52-64). Para el inmunotenido, se empleo el siguiente procedimiento: (i) se inactiva la peroxidasa endogena con H2O2 al 0.5 % en metanol absoluto durante 20 minutos a temperatura ambiente; (ii) se lavan los portaobjetos en suero regulado con fosfato (PBS) 0.01 M, pH de 7.4 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Alemania); (iii) se incuban los portaobjetos con leche descremada en polvo al 4 % “Rapilait” en suero regulado con fosfato (PBS) (Migros Genossenschaftsbund, Suiza) durante 60 minutos a temperatura ambiente; se destara, no se lava; (iv) se incuba un portaobjetos con el pAb C4d de conejo anti-humano (Biomedica Medizinprodukte, Viena, Austria), 1:40, en suero regulado con fosfato (PBS) que contiene NGtS al 1 % durante la noche a +4 °C. El segundo portaobjetos sirve como un control negativo mediante la aplicacion de control de isotipo de conejo (Zymed Laboratories Inc, EUA) en lugar del anticuerpo primario; (v) se lavan los portaobjetos en suero regulado con fosfato (PBS) 0.01 M, pH de 7.4; (vi) se incuban todos los portaobjetos con IgG biotinilada de cabra anti-conejo (Vector Laboratories, Inc. EUA), 1:200, en suero regulado con fosfato (PBS) que contiene NGtS al 1 % durante 30 minutos a temperatura ambiente; (vii) se lavan los portaobjetos en suero regulado con fosfato (PBS) 0.01 M, pH de 7.4; (viii) se incuban con estreptavidina/HRP (Vector Laboratories, Inc. EUA) en suero regulado con fosfato (PBS) durante 30 minutos a temperatura ambiente, (ix) se revela la actividad de HRP con AEC+ (DakoCytomation Corp., Carpenteria, EUA) durante 8 a 10 minutos, controlando la intensidad del tenido microscopicamente, se lava en agua destilada, (x) se contra-tine con Dako (RTM) Automation Hematoxilina (DakoCytomation Corp., Carpenteria, EUA) durante 2 minutos y de azul en agua del grifo corriente durante 5 minutos; (xi) se monta con un medio de montaje acuoso (Medite Medizintechnik AG, Suiza).

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Ejemplo 1: Evaluation de la actividad agonista de los mAbl, mAb2 y mAb3

Los datos experimentales se basan en el uso de las celulas mononucleares de sangre periferica (PBMCs) humanas primarias no fraccionadas aisladas. Las preparaciones de las celulas mononucleares de sangre periferica (PBMCs) enteras (en lugar de las celulas B aisladas o los monocitos) imitan mas estrechamente la situation in vivo en donde un mAb anti-CD40 podrla tener multiples efectos directos e indirectos sobre diferentes tipos de celulas de leucocitos. Utilizando este ensayo de proliferation de celulas mononucleares de sangre periferica (PBMCs), se determino que los mAbs aglicosilados mAbl anti-CD40 (N297A) y mAb2 (D265A), los cuales conservaron la secuencia de aminoacidos de la portion de enlace de antlgeno sin cambios a partir del anticuerpo progenitor Chir12.12, conservaron las propiedades de bloqueo de CD40L no agonistas del mAb Chir12.12 progenitor. El anticuerpo mAb3 (LALA mutante) fue debilmente agonista en la presencia de la IL-4.

En particular, los resultados experimentales muestran que ninguno de los mAbs anti-CD40 de Fc silencioso fue capaz de estimular la division celular mediante las celulas mononucleares de sangre periferica (PBMCs) humanas (n = 4 donadores), un resultado similar a aquel observado con el mAb Chir12.12 progenitor (Vease la Figura 1). Las celulas mononucleares de sangre periferica (PBMCs) proliferaron en respuesta al CD40L. Cualquiera del mAb1 o el mAb2 pudo mejorar la proliferation inducida por CpG2006 o por el F(ab')2 anti-IgM de las celulas mononucleares de sangre periferica (PBMCs) (Figura 2). Ademas el Chir12.12 fracaso para mejorar la proliferation inducida por el F(ab')2 anti-IgM de las celulas mononucleares de sangre periferica (PBMCs); sin embargo a diferencia de mAb1 y mAb2, inhibio completamente la proliferation de las celulas mononucleares de sangre periferica (PBMCs) inducida por CpG.

En la presencia de IL-4, se observo el mAb3 (mutation LALA) con el objeto de inducir niveles bajos pero reproducibles (n = 4 donadores) de incorporation de timidina por encima de aquel inducido por la IL-4 sola, mientras que mAb1, mAb2 y Chir12.12 no lo hicieron (Figura 3). Colectivamente, estos resultados indicaron que, con la exception del mAb3 (en la presencia de IL-4), ninguno de los mAbs anti-CD40 tuvo actividad agonista alguna.

Los resultados anteriores tambien demostraron claramente que los mAb1 y mAb2 no tuvieron actividad agonista en la presencia de senales co-estimulantes. Este es un hallazgo importante, debido a que es probable que los leucocitos en un paciente con enfermedad autoinmune cronica tengan un fenotipo activado o parcialmente activado y, por consiguiente, sean sensibilizados a la serialization por medio de CD40 u otros estlmulos. Se observo que el Chir12.12 (pero no los mAbs de Fc silenciosos o el CD40L) inhibio completamente la proliferation de las celulas mononucleares de sangre periferica (PBMCs) inducida por CpG2006. CpG2006 es un ligando sintetico para el receptor 9 tipo-Toll (TLR9), un receptor que ha demostrado que se enlaza al ssADN patogeno y derivado del huesped. En los seres humanos, TLR9 es expresado por las celulas B y (hasta un menor grado) por los monocitos de la sangre periferica. Debido a que anteriormente se ha demostrado que los ODNs que contienen CpG mejoran la ADCC (Moga y colaboradores, 2008), se puede especular que el CpG2006 es capaz de mejorar la ADCC mediada por la portion Fc de IgG1 de la llnea germinal del mAb Chir12.12 progenitor.

Ejemplo 2: Evaluation de la capacidad de los mAbs anti-CD40 de Fc silenciosos para bloquear la proliferation de las celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) mediada por el CD40L

Los datos anteriores indicaron que el Chir12.12 podrla bloquear la proliferation mediada por el CD40L de las celulas B primarias humanas y de las llneas celulares de linfoma de celulas B humanas. Medimos la inhibition de la proliferation de celulas mononucleares de sangre periferica (PBMCs) mediada por el CD40L mediante Chir12.12 y los tres anticuerpos de acuerdo con la invention mAb1, mAb2, mAb3. La Tabla 7 mas adelante presenta los valores IC50 para esta inhibition, tabulados en miligramos/mililitro (los resultados se presentan como el promedio de los cultivos triplicados con el SEM, y son representativos de 4 donadores, en experimentos independientes). Los resultados demuestran que Chir12.12 tambien puede inhibir la proliferation de las celulas mononucleares de sangre periferica (PBMCs) mediada por el CD40L. Adicionalmente, los mAb1, mAb2 y mAb3 tambien bloquearon completamente la division de las celulas mononucleares de sangre periferica (PBMCs) mediada por el CD40L con una potencia similar a la del Chir12.12. Ninguno de los mAbs anti-CD40 bloqueo la proliferation de las celulas mononucleares de sangre periferica (PBMCs) inducida por anti-IgM + IL-2 (no se muestran los datos), sugiriendo que la actividad de bloqueo de los mAbs anti-CD40 era dependiente del objetivo (y no estaba relacionada con la funcion del Fc).

Tabla 7

Valores IC50 para la inhibition mediada por el mAb anti-CD40 de la proliferation de las celulas mononucleares de

sangre periferica (PBMCs) (microgramos/mililitro)

Anticuerpo

IC50

Chir12.12 (wt Fc)

0.176

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25

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35

40

45

Anticuerpo

IC50

mAb1 (N297A)

0.058

mAb2 (D265A)

0.146

mAb3 (LALA)

0.118

Ejemplo 3: Enlace de las variantes del anticuerpo anti-CD40 humano a la llnea celular BJAB humana

Con el fin de excluir los posibles cambios en el enlace especlfico al CD40, se probo el enlace de las tres variantes mAbl, mAb2 y mAb3 en comparacion con el Chir12.12 progenitor sobre una llnea de celulas B, BJAB, la cual expresa constitutivamente el CD40. El enlace se probo en una titulacion de la dosis empezando en 10 microgramos/mililitro a una dilucion de 1:2.

Con el objeto de comparar las curvas de los diferentes experimentos, la intensidad de fluorescencia mas alta promedio de cada titulacion de dosis individual se establecio en el 100 % de enlace, y se aplico un ajuste de curva no lineal. En dos experimentos separados, las cuatro variantes de anticuerpos Chir12.12, mAb1, mAb2 y mAb3 mostraron curvas de enlace equivalentes sobre las celulas BJAB (Figura 5). No se pudieron observar cambios en las capacidades de enlace de las variantes con las diferentes mutaciones de la region de enlace Fc del Chir12.12.

Los resultados anteriores, por consiguiente, demostraron que la mutacion del sitio de enlace Fc no tuvo impacto alguno sobre el sitio de enlace del CD40 de las regiones variables del Chir12.12 progenitor. Los mAb1, mAb2 y mAb3 conservaron un enlace equivalente de CD40 sobre las celulas BJAB.

Ejemplo 4: Estimulacion/Inhibicion de la liberacion del TNF-alfa a partir de las celulas dendrlticas derivadas de monocitos humanos, mediante las variantes de Fc anti-CD40

Estimulacion de la liberacion del TNF-alfa a partir de las MoDCs humanas, mediante las variantes de Fc anti-CD40

Se ha demostrado que algunos anticuerpos anti-CD40 humano tienen efectos agonistas sobre diferentes poblaciones de celulas (Gruber 1989). Con el fin de excluir que las variantes de Fc mAb1, mAb2, mAb3 y Chir12.12 conducen a la activacion de las MoDCs, investigamos si los anticuerpos por si mismos inducen la liberacion del TNFa cuando se incuban durante 48 horas con las celulas. En contraste con el ensayo de antagonista, se cultivaron las MoDCs humanas de siete dlas de edad durante 48 horas solamente en la presencia de las cuatro variantes anti- CD40, en una curva de respuesta a la dosis, empezando en 10 microgramos/mililitro. Subsiguientemente, se probaron los sobrenadantes para determinar la cantidad de TNFa mediante un ELISA. Ninguna de las cuatro variantes anti-CD40 mAb1, mAb2, mAb3 y Chir12.12j indujo la liberacion del TNFa a partir de las MoDCs, comparandose con la estimulacion con el CD40L como un control positivo (no se muestran los datos). No se pudo observar ninguna dependencia de la dosis con ninguna de las cuatro variantes de anticuerpos. Las cantidades del TNFa no se elevaron de una manera significativa por encima del nivel de las MoDCs no estimuladas (no se muestran los datos). Por consiguiente, se pudo excluir una actividad agonista de estos cuatro anticuerpos.

Inhibicion de la liberacion del TNF-alfa a partir de las MoDCs humanas mediante las variantes de Fc anti-CD40

El anticuerpo Chir12.12 progenitor bloquea la interaccion de CD40-CD40L y, por consiguiente, tambien debe bloquear la activacion celular. La estimulacion de CD40 sobre las celulas dendrlticas derivadas de monocitos humanos con los trlmeros de CD40L conduce, por ejemplo, a la liberacion de las citoquinas pro-inflamatorias como TNFa (Ma 2009). Nuevamente, el cambio en la region Fc no debe impactar la funcion de bloqueo de las variantes en comparacion con el Chir12.12. Los cuatro anticuerpos deben inhibir la liberacion del TNFa mediada por el CD40L a partir de las MoDCs humanas con una IC50 equivalente.

Por consiguiente, las MoDCs humanas de siete dlas de edad se estimularon durante 24 horas con MegaCD40L, una doble construccion recombinante trimerica, en la presencia de las cuatro variantes anti-CD40 bloqueadoras. Subsiguientemente, se probaron los sobrenadantes para determinar la cantidad de TNFa mediante un ELISA. Las variantes mAb1, mAb2 y mAb3 mutadas por Fc mostraron la misma inhibicion de respuesta a la dosis que el Chir12.12 en tres experimentos separados (no se muestran los datos). Los resultados preliminares tambien muestran una inhibicion similar de la liberacion de IL-23 a partir de las MoDCs humanas (no se muestran los datos).

Se aplico un ajuste de curva no lineal para estimar la IC50 de los cuatro anticuerpos y se calculo la IC50 promedio a partir de los experimentos. La IC50 promedio de las cuatro variantes para la liberacion del TNFa a partir de las MoDCs humanas, esta en el intervalo de entre 32 nanogramos/mililitro y 40 nanogramos/mililitro (Tabla 8). En

resumen, las mutaciones en la region Fc no tuvieron impacto alguno sobre los efectos antagonistas de las variantes de anticuerpos.

Tabla 8

IC50 de las diferentes variantes de Fc para la inhibicion del TNF-alfa

#1 #2 #3 Promedio SEM

Chir12.12

n.c. 41 30 36 4

mAb1

23 44 58 40 10

mAb2

41 12 42 33 10

mAb3

39 8 47 32 12

5

IC50 en nanogramos/mililitro para las diferentes variantes de Fc del CD40 anti-humano a partir de tres experimentos independientes. El ajuste de curva no lineal en el #1 para el Chir12.12 no permitio hacer una estimacion valida de la IC50 (n. c. = no calculado).

Por consiguiente, los resultados anteriores muestran que las cuatro variantes fueron inactivas para inducir la 10 liberacion del TNFa a partir de las MoDCs. Mas importante, todas las variantes mAbl, mAb2 y mAb3 inhibieron la produccion de citoquina mediada por el CD40L por parte de las MoDCs humanas, con una eficacia similar in vitro comparandose con el Chir12.12.

Ejemplo 5: Compendio de los datos

La siguiente Tabla 9 resume algunas de las propiedades importantes de los anticuerpos mAb1, mAb2 y mAb3 de la 15 divulgacion, en comparacion con el anticuerpo Chir12.12 progenitor.

Tabla 9

Datos Comparativos

Criterio de Seleccion

Chir 12.12 mAb1 mAb2 mAb3

Enlace de Abs anti CD40 humano (Biacore, Kd nM)

0.55 0.69 0.49 0.33

Actividad de ADCC (lisis especlfica normalizada)

100 % <1 % <1 % 40 %

Actividad agonista sobre las huPBMCs (EC50, ng/ml)

>10000 >10000 >10000 >10000

Inhibicion de CD40L - huPBMCs (IC50, ng/ml)

13 15 17 15

T1/2 (dlas) - PK de Rata (10 ml/kg)

9.3+/-0.90 8.8+/-0.49 11.6+/-2.3 n.d

Ejemplo 6: Breve descripcion de las secuencias de aminoacidos y de nucleotidos utiles para la practica de la 20 invencion

SEQ ID NO:

Descripcion de la secuencia

1

Secuencia de aminoacidos HCDR1 de Chir-12.12, mAb1, mAb2, mAb3

2

Secuencia de aminoacidos HCDR2 de Chir-12.12, mAb1, mAb2, mAb3

3

Secuencia de aminoacidos HCDR3 de Chir-12.12, mAb1, mAb2, mAb3

4

Secuencia de aminoacidos LCDR1 de Chir-12.12, mAb1, mAb2, mAb3

5

Secuencia de aminoacidos LCDR2 de Chir-12.12, mAb1, mAb2, mAb3

6

Secuencia de aminoacidos de LCDR3 Chir-12.12, mAb1, mAb2, mAb3

7

Secuencia de aminoacidos VH de Chir-12.12, mAb1, mAb2, mAb3

8

Secuencia de aminoacidos VL de Chir-12.12, mAb1, mAb2, mAb3

9

Secuencia de aminoacidos de cadena pesada de longitud completa de Chir-12.12

10

Secuencia de aminoacidos de cadena ligera de longitud completa de Chir-12.12

11

Secuencia de aminoacidos de cadena pesada de longitud completa del mAb1

12

Secuencia de aminoacidos de cadena ligera de longitud completa del mAb1

13

Secuencia de aminoacidos de cadena pesada de longitud completa del mAb2

14

Secuencia de aminoacidos de cadena ligera de longitud completa del mAb2

15

Secuencia de aminoacidos de cadena pesada de longitud completa del mAb3

16

Secuencia de aminoacidos de cadena ligera de longitud completa del mAb3

17

Secuencia de aminoacidos de region Fc del mAb1

18

Secuencia de aminoacidos de region Fc del mAb2

19

Secuencia de aminoacidos de region Fc del mAb3

20

ADN que codifica a la cadena pesada de longitud completa de Chir-12.12

21

ADN que codifica a la cadena ligera de longitud completa de Chir-12.12

SEQ ID NO:

Descripcion de la secuencia

22

ADN que codifica a la cadena pesada de longitud completa del mAbl

23

ADN que codifica a la cadena ligera de longitud completa del mAbl

24

ADN que codifica a la cadena pesada de longitud completa del mAb2

25

ADN que codifica a la cadena ligera de longitud completa del mAb2

26

ADN que codifica a la cadena pesada de longitud completa del mAb3

27

ADN que codifica a la cadena ligera de longitud completa del mAb3

28

Secuencia de aminoacidos del CD40 humano

Ejemplo 7: Secuencias de aminoacido y de nucleotidos utiles para la practica de la invencion

SEQ ID NO:

Secuencias detalladas de aminoacidos o de nucleotidos

1

SYGMH

2

VISYEESNRYHADSVKG

3

DGGIAAPGPDY

4

RSSQSLLYSNGYNYLD

5

LGSNRAS

6

MQARQTPFT

7

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAV ISYEESNRYHADSVKGRFTISRDNSKITLYLQMNSLRTEDTAVYYCARDGGIAA PGPDYWGQGTLVTVSS

8

DIVMTQSPLSLTVTPGEPASISCRSSQSLLYSNGYNYLDWYLQKPGQSPQVLI SLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQARQTPFTFG PGTKVDIR

9

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAV ISYEESNRYHADSVKGRFTISRDNSKITLYLQMNSLRTEDTAVYYCARDGGIAA PGPDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPASKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHK PSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:

Secuencias detalladas de aminoacidos o de nucleotidos

10

DIVMTQSPLSLTVTPGEPASISCRSSQSLLYSNGYNYLDWYLQKPGQSPQVLI SLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQARQTPFTFG PGTKVDIRRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDN ALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP VTKSFNRGEC

11

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAV ISYEESNRYH ADSVKGRFTI SRDNSKITLY LQMNSLRTED TAVYYCARDGGIAAPGPDYW GQGTLVTVSS ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQTYICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTP EVTCVWDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYASTYRWSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSREE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPVLDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK

12

DIVMTQSPLS LTVTPGEPAS ISCRSSQSLL YSNGYNYLDW YLQKPGQSPQVLISLGSNRA SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCMQARQTPFTFGPGTKVD IRRTVAAPSV FIFPPSDEQL KSGTASWCL LNNFYPREAKVQWKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL SSTLTLSKAD YEKHKVYACEVTHQGLSSPV TKSFNRGEC

13

QVQLVESGGG WQPGRSLRL SCAASGFTFS SYGMHWVRQA PGKGLEWVAVISYEESNRYH ADSVKGRFTI SRDNSKITLY LQMNSLRTED TAVYYCARDGGIAAPGPDYW GQGTLVTVSS ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG

GTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQTYICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTP EVTCVWAVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYNSTYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSREE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPVLDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK

14

DIVMTQSPLS LTVTPGEPAS ISCRSSQSLL YSNGYNYLDW YLQKPGQSPQVLISLGSNRA SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCMQARQTPFTFGPGTKVD IRRTVAAPSV FIFPPSDEQL KSGTASWCL LNNFYPREAKVQWKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL SSTLTLSKAD YEKHKVYACEVTHQGLSSPV TKSFNRGEC

15

QVQLVESGGG WQPGRSLRL SCAASGFTFS SYGMHWVRQA PGKGLEWVAVISYEESNRYH ADSVKGRFTI SRDNSKITLY LQMNSLRTED TAVYYCARDGGIAAPGPDYW GQGTLVTVSS ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQTYICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTP EVTCVWDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYNSTYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSREE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPVLDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK

SEQ ID NO:

Secuencias detalladas de aminoacidos o de nucleotidos

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DIVMTQSPLS LTVTPGEPAS ISCRSSQSLL YSNGYNYLDW YLQKPGQSPQVLISLGSNRA SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCMQARQTPFTFGPGTKVD IRRTVAAPSV FIFPPSDEQL KSGTASWCL LNNFYPREAKVQWKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL SSTLTLSKAD YEKHKVYACEVTHQGLSSPV TKSFNRGEC

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APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGV EVHNAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK TISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK

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APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVAVSHEDPEVKFNWYVDGV EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK TISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK

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APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGV EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK TISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK

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CAGGTGCAGTTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGG TCCCT GAGACT CT CCT GT GCAGCCT CT GGATT CACCTT CAGT AGCT ATGG CATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGC AGTTATATCATATGAGGAAAGTAATAGATACCATGCAGACTCCGTGAAGGG CCGATT CACCAT CT CCAGAGACAATT CCAAGAT CACGCT GT AT CTGCAAAT GAACAGCCT CAGAACT GAGGACACGGCT GT GTATTACT GTGCGAGAGAT G GGGGTATAGCAGCACCTGGGCCTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGT CACCGTCTCCTCAGCAAGTACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGC CCGCTAGCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGT CAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCC CT GACCAGCGGCGT GCA CACCTT CCCGGCTGTCCT ACAGT CCT CAGGACT

SEQ ID NO:

Secuencias detalladas de aminoacidos o de nucleotidos

CTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACC CAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGA CAAGAGAGTTGGTGAGAGGCCAGCACAGGGAGGGAGGGTGTCTGCTGGA AGCCAGGCTCAGCGCTCCTGCCTGGACGCATCCCGGCTATGCAGTCCCA GTCCAGGGCAGCAAGGCAGGCCCCGTCTGCCTCTTCACCCGGAGGCCTC TGCCCGCCCCACTCATGCTCAGGGAGAGGGTCTTCTGGCTTTTTCCCCAG GCTCTGGGCAGGCACAGGCTAGGTGCCCCTAACCCAGGCCCTGCACACA AAGGGGCAGGTGCTGGGCTCAGACCTGCCAAGAGCCATATCCGGGAGGA CCCTGCCCCTGACCTAAGCCCACCCCAAAGGCCAAACTCTCCACTCCCTC AGCT CGGACACCTT CT CT CCT CCCAGATT CCAGT AACT CCCAAT CTT CT CT CTGCAGAGCCCAAAT CTT GT GACAAAACT CACACAT GCCCACCGT GCCCA GGTAAGCCAGCCCAGGCCTCGCCCTCCAGCTCAAGGCGGGACAGGTGCC CTAGAGTAGCCTGCATCCAGGGACAGGCCCCAGCCGGGTGCTGACACGT CCACCTCCATCTCTTCCTCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTC TT CCT CTT CCCCCCAAAACCCAAGGACACCCT CAT GAT CT CCCGGACCCC TGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTC AAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAA GCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTC ACCGT CCTGCACCAGGACT GGCT GAATGGCAAGGAGT ACAAGT GCAAGG T CT CCAACAAAGCCCT CCCAGCCCCCAT CGAGAAAACCAT CT CCAAAGCC AAAGGTGGGACCCGTGGGGTGCGAGGGCCACATGGACAGAGGCCGGCT CGGCCCACCCTCTGCCCTGAGAGTGACCGCTGTACCAACCTCTGTCCCTA CAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGA GGAGAT GACCAAGAACCAGGT CAGCCT GACCT GCCTGGT CAAAGGCTT CT ATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAA CAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCC TCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGT CTT CT CAT GCT CCGT GATGCAT GAGGCT CTGCACAACCACT ACACGCAGA AGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA

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GAT ATT GT GAT GACT CAGT CT CCACT CTCCCT GACCGT CACCCCT GGAGA GCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCCAGTCAGAGCCTCCTGTATAGTAATG GAT ACAACT ATTT G GATT G GT ACCT G CAGAAG CCAGG G CAGT CT CCACAG GTCCTGATCTCTTTGGGTTCTAATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTT CAGTG G CAGT GG AT CAG G CACAGATTTT ACACT G AAAAT CAG CAGAGT GG AG G CT GAG GAT GTT G G G GTTT ATT ACTG CAT G C AAG CT C G AC AAACT CCA TTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAGACGAACTGTGGCTGC AC CAT CTGT CTT CAT CTT CCCGCCAT CT GAT GAGCAGTT GAAAT CTGGAAC TGCCTCT GTT GT GTGCCTGCT GAAT AACTT CT AT CCCAGAGAGGCCAAAGT ACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGT GTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCC T GACGCT GAGCAAAGCAGACT ACGAGAAACACAAAGT CTACGCCTGCGAA GTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGG GAGAGTGT

SEQ ID NO:

Secuencias detalladas de aminoacidos o de nucleotidos

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CAGGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGCGGAGTGGTGCAGCCTGGCCGG TCCCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCAGCTACGG CATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGCAAGGGACTGGAATGGGTGGCC GT GAT CT CCT ACGAGGAAT CCAACAGAT ACCACGCT GACT CCGT GAAGGG CCGGTT CACAAT CT CCCGGGACAACT CCAAGAT CACCCT GT ACCTGCAGA TGAACTCCCTGCGGACCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGA CGGAGGAATCGCCGCTCCTGGACCTGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTG GTGACAGTGTCCTCCGCTAGCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCTCTGG CCCCCTCCAGCAAGTCCACCTCTGGCGGCACCGCCGCTCTGGGCTGCCT GGTGAAAGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGC

GCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTTCCAGCCGTGCTGCAGTCCTCCG GCCTGTACTCCCTGTCCTCCGTGGTGACCGTGCCCTCTAGCTCTCTGGGC ACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGT GGACAAGCGGGT GGAACCCAAGT CCTGCGACAAGACCCACACCT GTCCC CCCTGCCCTGCCCCTGAACTGCTGGGCGGACCTTCCGTGTTCCTGTTCCC CCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCCGAAGTGACC TGCGTGGTGGT GGACGT GT CCCACGAGGACCCT GAAGT GAAGTT CAATT G GTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAG GAACAGTACGCCTCCACCTACCGGGTGGTGTCTGTGCTGACCGTGCTGC ACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAG GCCCTGCCTGCCCCCATCGAAAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGC CCCGCGAGCCACAGGTGTACACACTGCCCCCCAGCCGGGAAGAGATGAC CAAGAACCAGGT GTCCCT GACCT GT CTGGT CAAAGGCTT CT ACCCCT CCG ATATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGACAGCCCGAGAACAACTACAA GACCACCCCCCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCATTCTTCCTGTACTCCA AGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTG CTCCGT GAT GCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCA GAAGT CCCTGT CCCTGAGCCCCGGCAAG

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GACAT CGT GAT GACCCAGT CCCCCCTGTCCCT GACCGT GACACCT GGCG AGCCTGCCT CT AT CT CCT GCAGAT CCTCCCAGT CCCTGCTGT ACT CCAAC GGCT ACAACT ACCT GGACT GGT AT CT GCAGAAGCCCGGCCAGT CCCCACA GGTGCTGATCTCCCTGGGCTCCAACAGAGCCTCTGGCGTGCCCGACCGG TTCTCCGGCTCTGGCT CTGGCACCGACTT CACACT GAAGAT CT CACGGGT GGAAGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGCATGCAGGCCCGGCAGACC CCCTTCACCTTCGGCCCTGGCACCAAGGTGGACATCCGGCGTACGGTGG CCGCTCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGACGAGCAGCTGAAGAG CGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAG GCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCC AGGAGAGCGTCACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAG CAGCACCCT GACCCT GAGCAAGGCCGACT ACGAGAAGCAT AAGGT GT AC GCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCT TCAACAGGGGCGAGTGC

SEQ ID NO:

Secuencias detalladas de aminoacidos o de nucleotidos

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CAGGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGCGGAGTGGTGCAGCCTGGCCGG TCCCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCAGCTACGG CATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGCAAGGGACTGGAATGGGTGGCC GT GAT CT CCT ACGAGGAAT CCAACAGAT ACCACGCT GACT CCGT GAAGGG CCGGTT CACAAT CT CCCGGGACAACT CCAAGAT CACCCT GT ACCTGCAGA TGAACTCCCTGCGGACCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGA CGGAGGAATCGCCGCTCCTGGACCTGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTG GTGACAGTGTCCTCCGCTAGCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCTCTGG CCCCCTCCAGCAAGTCCACCTCTGGCGGCACCGCCGCTCTGGGCTGCCT GGTGAAAGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGC GCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTTCCAGCCGTGCTGCAGTCCTCCG GCCTGTACTCCCTGTCCTCCGTGGTGACCGTGCCCTCTAGCTCTCTGGGC ACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGT GGACAAGCGGGT GGAACCCAAGT CCTGCGACAAGACCCACACCT GTCCC CCCTGCCCTGCCCCTGAACTGCTGGGCGGACCTTCCGTGTTCCTGTTCCC CCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCCGAAGTGACC TGCGTGGTGGTGGCCGTGTCCCACGAGGACCCTGAAGTGAAGTTCAATT GGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGA GGAACAGTACAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCTGTGCTGACCGTGCTGC ACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAG GCCCTGCCTGCCCCCATCGAAAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGC

CCCGCGAGCCACAGGTGTACACACTGCCCCCCAGCCGGGAAGAGATGAC CAAGAACCAGGT GTCCCT GACCT GT CTGGT CAAAGGCTT CT ACCCCT CCG ATATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGACAGCCCGAGAACAACTACAA GACCACCCCCCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCATTCTTCCTGTACTCCA AGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTG CTCCGT GAT GCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGT CCCTGT CCCTGAGCCCCGGCAAG

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GACAT CGT GAT GACCCAGT CCCCCCTGTCCCT GACCGT GACACCT GGCG AGCCTGCCT CT AT CT CCT GCAGAT CCTCCCAGT CCCTGCTGT ACT CCAAC GGCT ACAACT ACCT GGACT GGT AT CT GCAGAAGCCCGGCCAGT CCCCACA GGTGCTGATCTCCCTGGGCTCCAACAGAGCCTCTGGCGTGCCCGACCGG TTCTCCGGCTCTGGCT CTGGCACCGACTT CACACT GAAGAT CT CACGGGT GGAAGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGCATGCAGGCCCGGCAGACC CCCTTCACCTTCGGCCCTGGCACCAAGGTGGACATCCGGCGTACGGTGG CCGCTCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGACGAGCAGCTGAAGAG CGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAG GCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCC AGGAGAGCGTCACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAG CAGCACCCT GACCCT GAGCAAGGCCGACT ACGAGAAGCAT AAGGT GT AC GCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCT TCAACAGGGGCGAGTGC

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Secuencias detalladas de aminoacidos o de nucleotidos

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CAGGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGCGGAGTGGTGCAGCCTGGCCGG TCCCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCAGCTACGG CATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGCAAGGGACTGGAATGGGTGGCC GT GAT CT CCT ACGAGGAAT CCAACAGAT ACCACGCT GACT CCGT GAAGGG CCGGTT CACAAT CT CCCGGGACAACT CCAAGAT CACCCT GT ACCTGCAGA TGAACTCCCTGCGGACCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGA CGGAGGAATCGCCGCTCCTGGACCTGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTG GTGACAGTGTCCTCCGCTAGCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCTCTGG CCCCTTCCAGCAAGTCTACCTCCGGCGGCACAGCTGCTCTGGGCTGCCT GGT CAAGGACT ACTT CCCT GAGCCT GT GACAGT GT CCT GGAACT CTGGCG CCCTGACCTCTGGCGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCTGCAGTCCTCCGG CCTGTACTCCCTGTCCTCCGTGGTCACAGTGCCTTCAAGCAGCCTGGGCA CCCAGACCT AT AT CTGCAACGT GAACCACAAGCCTT CCAACACCAAGGT G GACAAGCGGGT GGAGCCT AAGTCCTGCGACAAGACCCACACCT GTCCTC CCTGCCCTGCTCCTGAAGCTGCTGGCGGCCCTTCTGTGTTCCTGTTCCCT CCAAAGCCCAAGGA CACCCT GAT GAT CT CCCGGACCCCT GAAGT GACCT G CGT GGTGGTGGACGT GT CCCACGAGGAT CCT GAAGT GAAGTT CAATT GGT ACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTCGGGAGG AACAGTACAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCAC CAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAAGTCTCCAACAAGGC CCTGCCTGCCCCTATCGAAAAGACAATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCTA GGGAACCCCAGGTGTACACCCTGCCACCCAGCCGGGAGGAAATGACCAA GAACCAGGT GTCCCT GACCT GT CT GGT CAAGGGCTT CT ACCCTT CCGAT A TCGCCGTGGAGTGGGAGTCTAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGAC CACCCCT CCT GT GCT GGACT CCGACGGCT CCTT CTT CCT GT ACT CCAAAC TGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTC CGT GAT GCACGAGGCCCT GCACAACCACT ACACCCAGAAGT CCCTGTCCC TGTCTCCCGGCAAG

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GACAT CGT GAT GACCCAGT CCCCCCTGTCCCT GACCGT GACACCT GGCG AGCCTGCCT CT AT CT CCT GCAGAT CCTCCCAGT CCCTGCTGT ACT CCAAC GGCT ACAACT ACCT GGACT GGT AT CT GCAGAAGCCCGGCCAGT CCCCACA GGTGCTGATCTCCCTGGGCTCCAACAGAGCCTCTGGCGTGCCCGACCGG

TTCTCCGGCTCTGGCT CTGGCACCGACTT CACACT GAAGAT CT CACGGGT GGAAGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGCATGCAGGCCCGGCAGACC CCCTTCACCTTCGGCCCTGGCACCAAGGTGGACATCCGGCGTACGGTGG CCGCTCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGACGAGCAGCTGAAGAG CGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAG GCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCC AGGAGAGCGTCACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAG CAGCACCCT GACCCT GAGCAAGGCCGACT ACGAGAAGCAT AAGGT GT AC GCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCT TCAACAGGGGCGAGTGC

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MVRLPLQCVLWGCLLTAVHPEPPTACREKQYLINSQCCSLCQPGQKLVSDCT EFTETECLPCGESEFLDT WNRETHCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTICTCEEGWHCTSEACESCVL HRSCSPGFGVKQIATGVSD TICEPCPVGFFSNVSSAFEKCHPWTSCETKDLWQQAGTNKTDVVCGPQDRL RALVVIPIIFGILFAILL VLVFIKKVAKKPTNKAPHPKQEPQEINFPDDLPGSNTAAPVQETLHGCQPVTQ EDGKESRISVQERQ

Ejemplo 8: Resultados de toxicologla

El objetivo primario del estudio de toxicologla fue determinar la toxicidad del mAbl, en seguida de la administration intravenosa una vez por semana al mono cinomolgo durante 5 semanas (6 aplicaciones del artlculo de prueba). Tambien se utilizo la version no silenciosa (ADCC) de este anticuerpo (Chirl2.12), con el objeto de comparar los efectos de un anticuerpo con actividad ADCC con la version silenciosa de ADCC (mAbl).

En adicion, los animales se inmunizaron con KLH con el objeto de evaluar la eficacia de ambos Abs anti-CD40.

No hubo mortalidades o cambios en los pesos corporales, en los signos cllnicos, ni en el consumo de alimento estimado atribuible al tratamiento con mAbl o Chir12.12. Las reacciones locales en los sitios de inyeccion de KLH fueron comparables en todos los grupos.

Tambien, no hubo hallazgos relacionados con los artlculos de prueba en las investigaciones oftalmicas y cardiovasculares.

En la hematologla, se observo una disminucion ligera pero estadlsticamente significativa en el porcentaje y en los numeros absolutos de los basofilos en los animales tratados con el mAb1 y el Chir12.12: no se puede excluir una relation con el tratamiento con el artlculo de prueba. El analisis de orina revelo cetonas en la orina de 1/5 hembras tratadas con el mAb1 y de 2/5 hembras tratadas con el Chir12.12, con una relacion poco clara con la dosificacion. En la qulmica cllnica, se observo una ligera tendencia a tener concentraciones elevadas de lipasa para los machos tratados con el Chir12.12, as! como para una hembra tratada con el Chir12.12; sin embargo, esto se considero como de una relevancia toxicologica limitada.

La coagulation sangulnea no fue afectada por el tratamiento con mAb1 o Chir12.12, como fue evaluado por el tiempo de protrombina, el tiempo de protrombina parcial activada, y el fibrinogeno. Los recuentos de plaquetas parecieron estar en el intervalo normal. Las concentraciones de P-selectina o sCD40L en plasma no indicaron ninguna activation de plaquetas.

En los animales tratados con el Chir12.12, la inmunofenotipificacion mostro una disminucion prominente en las celulas B CD20+, que era la action farmacologica esperada de este anticuerpo. En especial las celulas B CD20bajaCD21 + (las cuales se consideran como CD40alta) fueron consumidas por el Chir12.12. Sin embargo, tambien las celulas B CD20altaCD21- disminuyeron sustancialmente, en especial hacia el final del estudio. De preferencia, las celulas B puras CD20+CD21+CD27- fueron consumidas por el anticuerpo Chir12.12 con actividad de ADCC, mientras que las celulas B de memoria CD20+CD21+CD27+ diflcilmente fueron afectadas. Tambien hubo una disminucion aproximada del 50 % en el numero absoluto de celulas-NK CD16+ en los animales tratados con el Chir12.12. Como se esperaba, en seguida del tratamiento con el mAb1 (el cual es ADCC-silencioso), no se observo la disminucion prominente en las celulas B CD20+, ni hubo disminucion alguna en los numeros absolutos de celulas-NK CD16+. Las unicas celulas B que mostraron una reduction moderada durante la dosificacion fueron las celulas B CD20alta CD21-. Estas celulas son conocidas como especlficas de macaco, y de un origen germinal central y, por consiguiente, este hallazgo no se considera relevante para su transition a los seres humanos.

La inmunofenotipificacion del bazo y de los ganglios linfaticos que drenan KLH en la necropsia, revelo un cuadro similar. Hubo una disminucion en el numero relativo de celulas B CD20+ en los animales tratados con el Chi r12.12; sin embargo no se observo ninguna reduccion relevante de las celulas B CD20+ para los animales tratados con el mAb1, con una reduccion ligera a moderada de las celulas B CD21- (ganglios linfaticos de ambos sexos, bazo de machos solamente). No hubo diferencias en los resultados de la inmunofenotipificacion para el drenado de los ganglios linfaticos derecho e izquierdo en el sitio de inyeccion de KLH.

La reaction de los anticuerpos dependiente de las celulas T (TDAR) mostro que, en comparacion con el grupo de control, no se observo respuesta alguna de IgG e IgM a la KLH en los animales tratados con mAb1 o Chir12.12. Debido a que el bloqueo de la activacion de las celulas B mediante la inhibition de la interaction de ligandos CD40 -

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CD40 es la accion farmacologica pretendida del mAbl, y debido a que el Chir12.12 pretende consumir las celulas B, este hallazgo o se considera como toxicologicamente relevante.

La evaluation toxicocinetica revelo que las concentraciones de artesa aumentaron durante el transcurso del estudio, indicando la acumulacion de mAb1 y Chir12.12. Las concentraciones de artesa promedio despues de la 4a y 5a dosis fueron similares, indicando condiciones de estado casi continuo despues de la 5a dosis para el mAb1 y el Chi r12.12. Las exposiciones promedio (ambos generos) durante el intervalo de dosificacion (AUCt) despues de la 4a y 5a dosis, fueron de 906 y 990 h.mg/mL, respectivamente para el mAb1, y de 757 y 751 h.mg/mL, respectivamente para el Chir12.12. Los valores de AUCt tambien indicaron condiciones de estado casi continuo despues de la 5a dosis.

Los examenes macroscopicos no mostraron evidencia alguna de la toxicidad del organo objetivo, y los pesos de los organos tambien estuvieron dentro del intervalo normal para esta especie.

Microscopicamente, se vieron hallazgos relacionados con el artlculo de prueba de ambos anticuerpos en todos los organos linfaticos (bazo y ganglios linfaticos (mesentericos, mandibulares, axilares, e inguinales)), en donde el mAb1 y el Chir12.12 provocaron una supresion completa del desarrollo del centro germinal en las areas de las celulas B corticales. El inmunotenido de cD20 del bazo y el drenado de KLH, y el tejido del ganglio linfatico contralateral, mostraron un tamano reducido de los follculos linfoides en el bazo, as! como un agotamiento de celulas B en el bazo y en los ganglios linfaticos, un efecto que fue mucho mas pronunciado en los animales tratados con el Chir12.12, comparandose con el tratamiento con el mAb1. Los hallazgos de centros germinales en los animales tratados con el mAb1 corresponden a la reduction de las celulas B CD21- que se ve en la inmunofenotipificacion. El inmunotenido de CD40 mostro una reduccion significativa en el tenido de CD40 en los ganglios linfaticos y en el bazo en seguida del tratamiento con cualquiera de mAb1 o Chir12.12.

En conclusion, basandose en los resultados de este estudio, la administration intravenosa una vez por semana del mAb1 o del Chir12.12 durante 5 semanas (6 administraciones) en una concentration de 100 mg/kg, a los monos cinomolgos machos y hembras, fue bien tolerada. La inmunofenotipificacion mostro un consumo de celulas B en los animales tratados con el Chir12.12 pero no en los animales tratados con el mAb1, con la exception de las celulas B CD21-; sin embargo, el TDAR mostro una ausencia de reaction de IgG e IgM despues de la inmunizacion con KLH tanto en los animales tratados con el mAb1 como con el Chir12.12. La histopatologla revelo la falta de centros germinales en el bazo y en los ganglios linfaticos a partir de los animales tratados con el mAb1 y con el Chi r12.12. Los efectos sobre las celulas B son las acciones farmacologicas deseadas y, por consiguiente, no se consideran adversos. Se considera que el nivel del efecto adverso no observable (NOAEL) esta en la dosis de 100 mg/kg tanto para el mAb1 como para el Chir12.12, bajo las condiciones de este estudio.

Ejemplo 9: Perfilacion adicional in vitro del mAb1

Se determino el enlace y la reactividad funcional cruzada del mAb1 entre los leucocitos humanos, y de monos rhesus y cinomolgos. La Tabla 10 muestra una comparacion directa de las EC50s de enlace para el mAb1 en las tres especies.

Tabla 10

Reactividad cruzada del mAb1 humano y de NHP

Ensayo

Humano Rhesus Cinomolgo

Enlace de CD40 (celulas B CD20+ - FACS) (EC50, pg/ml)

0.26, 0.28 0.22+/-0.033 (n=6) 0.3, 0.24

Inhibition de CD154 (celulas B humanas y PBMCs) (IC50, pg/ml)

0.058, 0.075 (celulas B de amlgdalas humanas) 0.03+/-0.017 (n = 6) (PBMCs) 0.015, 0.02 (PBMCs)

El mAb1 se enlaza a las celulas CD20+ (celulas B) de las tres especies con una EC50 comparable. Adicionalmente, el mAb1 pudo inhibir la proliferation de las celulas B de amlgdalas humanas inducida por CD154+IL-4, as! como las celulas mononucleares de sangre periferica (PBMCs) a partir de mono cinomolgo y rhesus. Colectivamente, estos resultados indicaron que la capacidad del mAb1 para enlazarse a CD40 y para inhibir la proliferacion de las celulas B humanas o las celulas mononucleares de sangre periferica (PBMCs) de primate no humano, fue muy similar. Los

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datos de la disponibilidad de la ocupacion in vitro del receptor (RO) y la inhibicion funcional, hicieron posible determinar la relacion entre estas dos variables para cada especie (Tabla 11).

Tabla 11

Relacion entre el RO de mAb1 y la inhibicion funcional

IC50 en la prueba de inhibicion funcional3 (pg/mL) RO in vivo correspondienteb c (%)

Rhesus

0.02551 22.9

Humano

0.067 43.8

a Proliferacion inducida por CD154 Soluble + IL4 en mono rhesus con celulas mononucleares de sangre periferica (PBMCs) y en el ser humano con celulas B de amlgdalas.

b asumiendo la farmacodinamia (KD) in vivo en mono rhesus y en el ser humano, es la misma que la calculada en el estudio de farmacocinetica (PK)/farmacodinamia (PD) en el mono cinomolgo.

c asumiendo que el mAb1 esta bien por encima del [objetivo], es aplicable la ecuacion de Hill-Langmuir.

Los resultados indican que las celulas mononucleares de sangre periferica (PBMCs) de mono rhesus con el mAb1 requieren aproximadamente 2 veces menos RO para inhibir la proliferacion de las celulas mononucleares de sangre periferica (PBMCs) por el 50 % en comparacion con las celulas B humanas. En el ser humano, se pudo obtener la inhibicion completa con aproximadamente el 75 % (predicho in vivo) de RO.

Ejemplo 10: Estudio de Trasplante

Sobrevivencia del injerto

El tratamiento de combinacion con el mAb1 (30 mg/kg intravenosamente (i.v.)), y ciclosporina A (20 mg/kg oralmente) durante el trasplante de aloinjerto de rinon, dio como resultado una prolongacion significativa de la sobrevivencia de los 6 animales involucrados en el estudio. Los injertos fueron funcionales durante >91*, 31, >92*, >92*, >98* y >98* dlas (promedio: >83.6 dlas) en los animales #5529, #5533, #5523, #5524, #5536 y #5538, respectivamente (* final del protocolo). La sobrevivencia en los animales no tratados (o tratados con dosis IS sub- terapeuticas) estuvo en el intervalo de 7 a 10 dlas (datos historicos).

El animal #5533 se sometio a eutanasia 31 dlas despues del trasplante, debido a falla aguda del rinon y anuria. Esta patologla aparecio despues de un perlodo de hipertension mantenida y de la anestesia para la recoleccion de la biopsia.

Monitorizacion despues del trasplante

(a) Concentraciones en suero de creatinina (SCrea) y urea (SUrea)

SCrea fue el parametro principal utilizado para la evaluacion de la funcion renal. En los 6 animales, los niveles de SCrea aumentaron por encima del valor de los niveles iniciales un dla despues del trasplante (de 81.8 ± 14.6 a 221.5 ± 37.1 micromoles/litro). Esta elevacion en la SCrea es una caracterlstica comun durante la primera semana despues del trasplante (Tabla 12).

Tabla 12

Cambios en la SCrea observada en los receptores de aloinjerto de rinon NHP tratados con el mAbl y con la terapia

de combinacion con CsA a 30 y 20 mg/kg, respectivamente

Dias despues del trasplante

Nivel de SCrea (pmol/l)

#5536

#5538 #5523 #5524 #5529 #5533

-4

101 109 85 73 81 86

-1

106 89 80 71 95 76

0

95 105 74 72 76 69

1

234 238 213 198 277 169

3

190 261 148 155 243 191

7

112 189 136 141 110 110

10

111 172 193 206 102 139

14

101 166 209 165 103 156

17

113 181 277 157 94 175

21

114 162 192 117 111 206

24

112 156 155 124 111 191

28

95 133 119 111 100 170

31

95 139 119 106 122 629

35

103 135 110 100 104

38

104 128 111 109 108

Dias despues del trasplante

Nivel de SCrea (pmol/l)

#5536

#5538 #5523 #5524 #5529 #5533

42

107 113 110 101 114

45

95 124 108 115 113

49

103 118 104 106 101

52

107 129 105 111 102

56

122 103 112 95 101

59

112 105 94 97 99

63

110 120 115 115 99

66

103 132 110 104 107

70

101 116 91 100 105

73

103 124 105 120 109

77

103 109 98 121 105

80

103 101 102 113 109

84

101 104 120 126 110

87

107 103 111 112 108

91

100 112 119 112 105

94

117 133

Durante la primera semana, las concentraciones de SUrea experimentaron rapidas elevaciones por encima del valor

inicial medido en el dla 0 (4.5 ± 1.3 milimoles/litro) (Tabla 13). En los animales #5529/#5533 y #5536/#5538, los niveles de SUrea fueron de 16 a 20 milimoles/litro (dlas 3 a 5), mientras que en los animales #5523 y #5524 fueron de 9 u 8 milimoles/litro (dla 7), respectivamente.

Tabla 13

5 Cambios en la SUrea observados en los receptores de aloinjerto de rinon NHP tratados con el mAb1 y con la terapia

de combinacion con CsA a 30 y 20 mg/kg, respectivamente

Dias despues del trasplante

Nivel de SUrea (mmol/l)

#5536

#5538 #5523 #5524 #5529 #5533

-4

7 5 4 4 8 5

-1

7 6 5 6 9 5

0

6 4 3 4 6 5

1

14 12 7 8 13 9

3

20 17 5 6 16 15

7

9 14 9 8 9 11

10

5 10 17 14 6 11

14

6 8 18 13 5 18

17

7 10 16 8 5 15

21

7 10 14 7 4 19

24

6 9 8 6 4 17

28

8 10 11 8 4 12

31

6 9 11 8 4 18

35

7 10 8 7 6

38

7 8 6 5 6

42

7 9 10 7 6

45

7 9 10 8 6

Dlas despues del trasplante

Nivel de SUrea (mmol/l)

#5536

#5538 #5523 #5524 #5529 #5533

49

9 9 8 6 8

52

6 8 6 6 7

56

8 9 9 9 6

59

4 8 9 10 8

63

6 9 8 7 7

66

7 11 7 7 7

70

6 9 10 9 7

73

7 9 9 10 5

77

11 14 8 10 7

80

6 7 7 8 7

84

6 7 9 9 6

87

6 8 8 8 6

91

7 8 10 10 5

94

7 8

Una semana despues del trasplante, la funcion renal tiende a normalizarse y SCrea/SUrea llegan a estar mas cerca de los niveles de la llnea basal. Sin embargo, los animales #5533, #5523 y #5524 (pero no #5529, #5536 y #5538) presentaron un aumento adicional en SCrea/SUrea entre los dlas 7 y 19 a 25 despues del trasplante, indicando un 5 mal funcionamiento renal. Durante este perlodo, se pudieron observar signos como polidipsia/poliuria (#5523 y #5524), calcio en suero alto sostenido (SCa) (#5533), o un aumento en el volumen del injerto (#5523 y #5524).

Despues del dla 20-25, los animales #5529, #5523, #5524, #5536 y #5538 mejoraron y mostraron una excelente funcion renal hasta el final del estudio. Sin embargo, en el dla 31, el animal #5533 exhibio un aumento pronunciado en los niveles de SCrea/SUrea, confirmando una falla aguda del rinon (SCrea; 629 micromoles/litro, y SUrea; 18 10 milimoles/litro). Esta patologla se presento despues de un perlodo de hipertension sostenida y del procedimiento de la biopsia un dla antes de la eutanasia. Durante este perlodo, se registraron picos de hipertension (aproximadamente 170 mm Hg, sistolica), y un episodio de hipotension (aproximadamente 40 mmHg, sistolica).

(b) Concentraciones de amilasa y lipasa en suero, peso corporal, y recuentos de plaquetas

Las concentraciones de amilasa en suero aumentaron ligeramente en todos los animales por aproximadamente 1.3 15 veces en los dlas 1-7 despues del trasplante (311 ± 53 Unidades/litro en el dla 0, y 418 ± 66.8 Unidades/litro en el

10

15

dla 7 despues del trasplante) (Tabla 14). El animal #5533 presento la concentracion de amilasa mas alta observada en el estudio en el dla 1 despues del trasplante (1,050 Unidades/litro). Antes del trasplante, no hubo diferencia alguna entre los niveles de amilasa observados antes de la primera dosis del mAb1 y 24 horas despues de (dla -1 y dla 0).

Tabla 14

Concentraciones de amilasa en suero (Unidades/litro (U/L)) en los animales con trasplante de rinon tratados con una combinacion de mAb1 a 30 mg/kg intravenosamente (i.v.) y CsA a 20 mg/kg oralmente (p.o.)

Tiempo despues del trasplante

Amilasa promedio (U/L) Desviacion Estandar Veces de aumento

Dla 0

311 52.95

Dla 7

418.2 66.8 1.34

Dla 14

459.2 71.5 1.48

Dla 56

526.6 121.5 1.69

Dla 84

460.4 66.8 1.48

Las concentraciones de lipasa en suero experimentaron, en promedio, cambios menores antes y despues del trasplante (Tabla 15). Solamente al final del protocolo experimental, se pudo ver un incremento menor (dla 84; 2.18 veces). El animal #5533 mostro la concentracion de lipasa mas alta medida en el dla 1 (284.4 Unidades/litro). Los datos de lipasa a partir de los animales #5536 y #5538 no estuvieron disponibles. Los cambios en las concentraciones de amilasa y lipasa fueron similares a los niveles encontrados en otros experimentos de trasplante utilizando diferentes anticuerpos o compuestos de bajo peso molecular (no se muestran los datos).

Tabla 15

Concentraciones de lipasa en suero (U/L) en cuatro de los animales con trasplante de rinon tratados con una combinacion de mAb1 a 30 mg/kg intravenosamente (i.v.) y CsA a 20 mg/kg oralmente (p.o.)

Tiempo despues del trasplante

Lipasa promedio (U/L) Desviacion Estandar Veces de aumento

Dla 0

12 1.3

Dla 7

13.05 2.26 1.09

Dla 14

12.9 1.25 1.08

Dla 56

16.6 3.41 1.38

Dla 84

26.2 21.06 2.18

Se pudo observar una rapida y notoria perdida del peso corporal principalmente en los animales #5529, #5533 y #5536. En los seis animales trasplantados, estuvo en el intervalo del -4 al -18 % durante los primeros 21 dlas en seguida del trasplante. Sin embargo, la perdida del peso corporal tendio a recuperarse despues de este punto del tiempo y hacia el final del estudio.

5

10

15

20

25

Los recuentos de plaquetas fueron normales (de 300 a 400 celulas x 103/microlitro), o aumentaron durante el perlodo despues del trasplante a 600-800 celulas x 103/microlitro. El animal #5529 recibio un tratamiento con aspirina durante 3 dlas (dlas 7-9) debido al rapido aumento en los recuentos de plaquetas. El animal #5533 presento una trombocitosis de largo plazo (>1000 celulas x 103/microlitro), y recibio el tratamiento con aspirina entre los dlas 7 y 26.

(c) Niveles en sangre del mAb1 y recuentos de celulas B

Previamente se condujo un estudio y analisis farmacocinetico (PK)/farmacodinamico (PD) de referencia, en donde se dio a los monos cinomolgos una sola dosis intravenosa del anticuerpo a 10 mg/kg (no se muestran los datos). En este estudio, los perfiles de concentracion contra el tiempo exhibieron una clara disposicion mediada por el objetivo (TMD), demostrando un animal una eliminacion mas rapida comparandose con otro animal, como una consecuencia de un nivel de expresion del objetivo probablemente mas alto, enfatizando la funcion de los niveles de expresion del objetivo en la farmacocinetica (PK) reguladora. A partir de este estudio, tambien se establecio que, cuando las concentraciones en suero del mAb1 estuvieron por encima de aproximadamente 5 microgramos/mililitro, esto se tradujo en casi el 100 % de ocupacion del receptor de CD40.

El diseno del estudio del trasplante (semanalmente y altos niveles de dosis del mAb1 - 30 mg/kg, y sin fase de recuperacion/lavado) no permitio tener el mismo nivel de analisis y modelacion que el estudio de farmacocinetica/farmacodinamia (PK/PD) previamente conducido. No obstante, se hicieron las siguientes observaciones (resumidas en la Tabla 16); i) no se detecto el mAb1 en las muestras recolectadas antes de la primera dosis, ii) se detecto el mAb1 a traves de toda la fase de dosificacion, y iii) en todas las muestras recolectadas e inter-individuos, las concentraciones de artesa fueron variables (de 1,200 a 2,500 microgramos/mililitro para el cinomolgo 5524, de 1,000 a 2,000 microgramos/mililitro para el cinomolgo 5523, y de 850 a 2,400 microgramos/mililitro para el cinomolgo 5529). Todos los valores de exposicion estuvieron bien por encima (de 170 a 500 veces) de la concentracion necesaria para obtener la ocupacion completa del receptor en el mono cinomolgo.

Tabla 16

Concentracion en suero del mAb1 para el mono cinomolgo #5533, #5529, #5523 y #5524

mAb1 (microg/mL)

Tiempo (dlas)

Cino_5533 Cino_5529 Cino_5523 Cino_5524

-1

0 0 0 0

3

591 618 1315 1384

7

682 1003 1033 1135

7.01

1557 1553 2452 2669

14

925 1037 1463 1744

28

654 896 1672 1965

42

851 1770 1259

56

1896 1991 1283

70

2385 1641 2534

mAb1 (microg/mL)

Tiempo (dlas)

Cino_5533 Cino_5529 Cino_5523 Cino_5524

84

2191 1266 2402

91

2069 1066 2071

En este estudio tambien se evaluo la prueba de inmunogenicidad (anticuerpos anti-mAbl de mono). Todas las muestras resultaron negativas, pero los altos niveles de mAb1 en estas muestras pudieron impedir potencialmente su deteccion debido a las interferencias del farmaco.

5 Se pudo observar un consumo parcial de las celulas CD20+ con el tiempo en todos los animales tratados. Se vieron observaciones similares en el estudio farmacocinetico/farmacodinamico (PK/PD) previamente conducido (no se muestran los datos).

Resultados de Histologla

La evaluacion histopatologica de los aloinjertos de rinon no revelo ningun rechazo agudo y cronico en los injertos 10 #5523, #5524, #5529 y #5538, y los cambios del llmite en el injerto #5536 que llegaron al final del experimento, es

decir (los resultados resumidos en la Tabla 17). Se observaron infiltrados perivasculares o intersticiales mlnimos en los animales #5523 #5524 y #5538, y una hlpercelularidad glomerular minima en el animal #5529.

Tabla 17: Resultados de Histologla

No. de Animal

Muestra Dias despues del trasplante Crea/Urea Diagnostico

#5529

Biopsia 30 100/4 Banff: ningun rechazo

10-0001

Necropsia 91 105/5 Banff: ningun rechazo (hlper-celularidad glomerular minima, fibrosis de intima minima)

Otro: Falta de formacion de GC en los organos linfoides secundarios. Cecocolitis (B. coli).

Ningun otro cambio relacionado con el tratamiento.

#5533

Biopsia 30 170/12 Banff: IA, fibrosis intersticial temprana difusa, vacuolizacion tubular.

No. de Animal

Muestra Dias despues del trasplante Crea/Urea Diagnostico

10-0002

Necropsia 31 629/18 Banff: Otro (dilatacion tubular, infiltrados intersticiales, y fibrosis, tubulitis minima, absceso alrededor de anastomosis, eosinofilos alrededor de ureter).

Otro: Falta de formacion de GC en los organos linfoides secundarios. Cecocolitis (B. coli).

Ningun otro cambio relacionado con el tratamiento.

#5523

Biopsia No No

11-0001

Necropsia 92 119/10 Banff: Sin rechazo (infiltrados perivasculares mlnimos, material mucoide en una vena).

Falta de formacion de GC en los organos linfoides secundarios. Ningun otro cambio relacionado con el tratamiento.

#5524

Biopsia No No

11-0002

Necropsia 92 112/10 Banff: ningun rechazo (infiltrados intersticiales multifocales mlnimos),

Falta de formacion de GC en los organos linfoides secundarios. Ningun otro cambio relacionado con el tratamiento.

#5536

Biopsia No No

11-0002

Necropsia 98 104/8 Banff: Cambios del llmite (infiltrados intersticiales multifocales mlnimos con tubulitis focal minima), celulas de plasma focal.

5

10

15

20

25

30

No. de Animal

Muestra Dias despues del trasplante Crea/Urea Diagnostico

Falta de formacion de GC en los organos linfoides secundarios. Ningun otro cambio relacionado con el tratamiento.

#5538

Biopsia No No

11-0002

Necropsia 98 114/9 Banff: ningun rechazo (infiltrados intersticiales multifocales minimos presentes)

Falta de formacion de GC en los organos linfoides secundarios. Inflamacion linfo- histiocitica focal unilateral en el pulmon. Ningun otro cambio relacionado con el tratamiento.

El animal #5533 que se sometio a eutanasia en el dla 31 despues del trasplante, mostro dilatacion tubular, infiltrados intersticiales, y fibrosis, pero solamente una tubulitis minima. En adicion, se encontro una infiltracion eosinofllica prominente en la vecindad del ureter, y un absceso en seguida de la anastomosis. Todos estos hallazgos indicaron una mala funcion renal durante mucho tiempo, pero no se pudo confirmar el rechazo.

El inmunotenido de C4d fue negativo en todos los casos.

Se observo una falta de desarrollo del centro germinal con o sin atrofia folicular en los organos linfoides en todos los animales. Se diagnostico cecocolitis causada por infeccion con Balantidium coli en los animales #5529 y #5533.

No se encontraron otros cambios relacionados con el tratamiento.

Estudio de Trasplante - discusion

La meta del estudio de trasplante fue para evaluar, en un modelo de primate no humano de rechazo de aloinjerto de rinon, los efectos beneficos del mAbl cuando se da como una terapia de combinacion con una dosis sub-terapeutica de Ciclosporina A. En adicion, fue relevante para evaluar la ausencia de efectos secundarios en un modelo en el que se induce inflamacion sistemica.

Cuando se aplico como terapia de combinacion con una dosis subterapeutica de CsA (20 mg/kg oralmente (p.o.)), el mAbl demostro eficacia para incrementar la sobrevivencia de los aloinjertos de rinon en NHPs. La sobrevivencia promedio del injerto fue de >83.6 dlas, y 5 de 6 animales llegaron al final del protocolo experimental (establecido en 91 a 98 dlas).

La direccion de CD40 utilizando un anticuerpo anti-CD40 (mAb1) bloqueador no agonista, dio como resultado la prolongacion de la sobrevivencia del injerto en los NHPs con trasplante de rinon o de islotes. En adicion, pudimos evaluar una mejor eficacia y seguridad utilizando el mAb1 (el cual es de Fc silencioso), comparandose con el Chir12.12 anteriormente reportado (anticuerpo monoclonal anti-CD40 completamente humano del isotipo IgG1/kappa con propiedades de bloqueo del consumo y de la coestimulacion de celulas B).

Durante todo el perlodo despues del trasplante, hubo una ausencia de cualesquiera sucesos de patologla cllnica relevantes (por ejemplo, un aumento menor en los niveles de amilasa/lipasa atribuido a la funcion renal deteriorada tlpica despues del trasplante). Sin embargo, los animales #5333, #5523 y #5524 presentaron una funcion renal reducida entre los dlas 7 y 19. Este periodo de tiempo se caracteriza tipicamente por una recuperacion de los niveles de SCrea/SUrea, de la presion sanguinea, y del volumen del injerto en los animales despues del trasplante. En estos animales, se vieron signos de una funcion renal deteriorada, tal como un aumento en SCrea/SUrea (en los 3 animales), un aumento transitorio en el volumen del injerto (#5523, #5524), o polidipsia/ poliuria (#5523, #5524). Una hipotesis podria ser que estos animales desarrollaron un proceso de rechazo temprano, el cual llego a ser

5

10

15

20

25

30

35

40

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50

controlado despues de 3 semanas de tratamiento con el mAbl. Esta anormalidad en la fase temprana despues del trasplante pudo haberse debido a las diferencias inducidas por el modo de accion inmunologico de una molecula (Fc silencioso) dirigida a la senda del CD40.

Un animal (#5533) se sometio a eutanasia en el dla 31 debido a falla aguda del rinon (ningun rechazo). Este resultado fue causado por una recuperacion incompleta de la funcion renal despues del procedimiento del trasplante. Los signos que indicaron una mala funcion renal fueron altos niveles de SUrea (de 11 a 19 milimoles/ litro), o concentraciones altas sostenidas de SCa (>2.8 milimoles/ litro). La perdida del injerto terminal se acelero por una hipertension sostenida (>140 mmHg, sistolica) combinada con la hipotension observada durante la anestesia aplicada durante el procedimiento de recoleccion de la biopsia, y los altos picos de hipertension registrados la noche anterior a la eutanasia (aproximadamente 170 mmHg, sistolica) (Palmer BF (2002) N. Engl. J. Med; 347(16): 12561261). Todos estos sucesos no se podrlan atribuir al tratamiento con el mAb1, y solamente a las diferencias individuales en la fase despues del trasplante.

La alta eficacia de la terapia de combinacion se pudo demostrar tambien histologicamente. Cinco de seis injertos mostraron una excelente calidad del injerto al final del experimento. Se observo una falta de desarrollo del centro germinal tambien en un experimento de trasplante con el Chir12.12. No se observaron otros cambios del tejido relacionados con el tratamiento.

Uno de los sobrevivientes a largo plazo (#5529) desarrollo cecocolitis causada por Balantidium coli. Aunque la infeccion es comun en los macacos, y con frecuencia asintomatica, la inmunosupresion puede conducir a un establecimiento de la enfermedad aguda (Schuster FL, Ramirez-Avila L, (2008) Clin. Microbiol. Rev; 21(4): 626-38). En este animal, no se observaron signos cllnicos, tales como diarrea o perdida de peso corporal.

Con respecto al monitorizacion de los recuentos de celulas B, se pudo observar un consumo parcial con el tiempo en todos los animales tratados. Este consumo parcial probablemente no se deba al consumo mediado por Fc activo, debido a que el mAb1 es un anticuerpo silenciado que no se enlaza al FcR ni media la ADCC in vitro. El consumo parcial puede ser un espejo de la falta de centros germinales, lo cual se observa en la histologla al final del experimento. Este consumo parcial puede ser debido a la falta de senales de sobrevivencia.

En conclusion, los resultados del estudio de trasplante apoyan el uso del mAb1 como objetivos validos para el tratamiento de rechazo de rinon en una terapia de combinacion con un excelente perfil de seguridad. El excelente perfil de seguridad y la eficacia apoyan ademas el uso de los anticuerpos de la invencion en el tratamiento de los trastornos autoinmunes y/o de los trastornos inflamatorios, y en la prevencion de rechazo de trasplante mediado por la senalizacion de CD40 mediada por el CD40L en las celulas que expresan el antlgeno de CD40.

Compendio

No se han reportado anticuerpos anti-CD40 para inducir sucesos hemostaticos en los pacientes; sin embargo, las elevaciones en las enzimas pancreaticas en los pacientes con linfoma de celulas B que reciben el Ab Chir12.12 anti- CD40, y el posible riesgo de pancreatitis, precluyen el uso de este anticuerpo competente en Fc anti-CD40 en la enfermedad autoinmune cronica y en el trasplante por razones de seguridad. Por consiguiente, generamos los anticuerpos de IgG1 con Fc silencioso anti-CD40 (mAb1, mAb2, y mAb3), que son incapaces de mediar la citotoxicidad celular dependiente de los anticuerpos (ADCC) o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), tanto in vitro como in vivo. El mAb1 fue capaz de prolongar la sobrevivencia del aloinjerto renal de primate no humano en combinacion con dosis sub-terapeuticas de ciclosporina. En adicion, el mAb1 fue capaz de suprimir completamente las respuestas primarias y secundarias del anticuerpo a la inmunizacion con un antlgeno dependiente de las celulas T. Crucialmente, no hubo evidencia alguna de sucesos hemostaticos o de una histologla pancreatica anormal en el estudio ya fuera de trasplante o bien de inmunizacion. Colectivamente, estos resultados sugieren que el mAb1 serla un producto terapeutico seguro y eficaz, y se podrla utilizar para tratar a los pacientes que padezcan de una enfermedad autoinmune impulsada por los linfocitos-B y por las celulas presentadoras de antlgeno, o que se sometan a trasplante de aloinjerto en donde esten involucradas las interacciones de CD40- CD154 en la contribucion a la patologla.

Listado de secuencias

<110> Novartis AG

<120> Variantes de Fc silenciosas de los anticuerpos anti-CD40

<130> PAT54423

<150> US 61/413567

<151 > 2010-11-15

<160> 28

<170> PatentIn version 3.5

5

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25

<210> 1 <211>5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1

Ser Tyr Gly Met His 1 5

<210>2 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Val lie Ser Tyr Glu Glu Ser Asn Arg Tyr His Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210>3 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3

Asp Gly Gly lie Ala Ala Pro Gly Pro Asp Tyr 15 10

<210>4 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4

Arg Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp

15 10 15

<210>5 <211>7

<212> PRT <213> Homo sapiens <400>5

imagen1

5 <210>6

<211>9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6

10

Met Gin Ala Arg Gin Thr Pro Phe Thr 1 5

<210>7

<211> 120 <212> PRT

<213> Homo sapiens 15 <400> 7

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Val lie Ser Tyr Glu Glu Ser Asn Arg Tyr His Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys lie Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asp Gly Gly He Ala Ala Pro Gly Pro Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120

5

<210>8 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>8

Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Thr Val Thr Pro Gly 15 10 15

Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30

Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Val Leu lie Ser Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gin Ala

85 90 95

Arg Gin Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp lie Arg

100 105 110

<210>9 <211> 450 <212> PRT

5 <213> Homo sapiens

<400> 9

Claims (15)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   1. Un anticuerpo aislado dirigido contra un polipeptido CD40 objetivo (SEQ ID NO: 28), caracterizado porque dicho anticuerpo comprende una secuencia de aminoacidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 11 y una secuencia de aminoacidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 12.
2. 2. El anticuerpo aislado de la reivindicacion 1, en donde dicho anticuerpo inhibe la senalizacion inducida por CD40L con una IC50 de 50 ng/ml o menos.
3. 3. El anticuerpo aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde dicho anticuerpo no tiene ninguna actividad agonista, o tiene una baja actividad agonista con respecto a la senalizacion de CD40.
4. 4. El anticuerpo aislado acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para uso como un medicamento.
5. 5. El anticuerpo aislado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para uso en el tratamiento de trastornos autoinmunes y/o trastornos inflamatorios.
6. 6. El anticuerpo aislado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para uso en la prevencion o reduccion del riesgo de rechazo de injerto en el trasplante.
7. 7. El anticuerpo aislado para uso de acuerdo con la reivindicacion 5, en donde el uso es el tratamiento de esclerosis multiple, lupus eritematoso sistemico, nefritis por lupus, slndrome de Sjogren, artritis reumatoide, y la enfermedad del injerto contra el huesped.
8. 8. Una composicion farmaceutica, que comprende un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en combination con al menos un excipiente, diluyente o vehlculo farmaceuticamente aceptable.
9. 9. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 8, que comprende adicionalmente otros ingredientes activos.
10. 10. Una formulation farmaceutica llquida que comprende un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, con al menos un regulador.
11. 11. Un acido nucleico aislado que codifica el anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
12. 12. Un vector de donation o de expresion, que comprende uno o mas acidos nucleicos de acuerdo con la reivindicacion 11.
13. 13. Un vector de clonacion o de expresion de acuerdo con la reivindicacion 12, que comprende las secuencias de codification SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 23 operativamente enlazadas a las secuencias promotoras adecuadas:
14. 14. Una celula huesped, que comprende uno o mas vectores de clonacion o de expresion de acuerdo con las reivindicaciones 12 a 13.
15. 15. Un proceso para la production de un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende cultivar la celula huesped de la reivindicacion 14, purificar y recuperar dicho anticuerpo.

    imagen1

    imagen2

    imagen3

    cpm

    Figura 4

    imagen4

    -2-10 1 2 Concentracion [pg/mL]

    Promedio Normalizado [%]

    Figura 5

    Experimento 68_09

    imagen5

    Concentracion log [|jg/mL]

    Experimento 72_09

    imagen6

    Concentracion log [pg/rrL]