TW201623335A - 抗-ＣＤ４０抗體之靜默Ｆｃ變體 - Google Patents

Abstract

本發明係關於抗-CD40抗體之靜默Fc變體，及使用該等抗體治療諸如自體免疫及發炎病症之病理性病症及/或預防移植中之移植物排斥或降低其風險的組合物及方法。

Description

抗-CD40抗體之靜默Fc變體

本發明係關於抗-CD40抗體之靜默恆定片段(Fc)變體及使用該等抗體治療諸如自體免疫及發炎病症之病理性病症及/或預防移植中之移植物排斥或降低其風險的組合物及方法。

儘管若干免疫抑制治療劑可用於自體免疫疾病，但對於在大部分患者群體中更有效及更安全之藥物仍存有較大未滿足之需要。舉例而言，儘管報導B細胞消除/抑制療法(如利妥昔單抗(Rituximab)及貝利單抗(Belimumab))在類風濕性關節炎、全身性紅斑狼瘡症(systemic lupus erythematosus)、休格連氏症候群(Sjögren's syndrome)及多發性硬化症中具有功效，但此等療法僅在一部分患病個體中有效，且就利妥昔單抗而言，伴有進行性多病灶腦白質病(progressive multifocal leukoencephalopathy)之風險。另外，多種其他白血球細胞類型，諸如巨噬細胞、樹突狀細胞及T細胞常涉及此等自體免疫疾病之病變中，因此靶向其他細胞類型或關鍵免疫路徑且將抑制其功能的治療性介入可提供益處。鑒於CD40-CD154在此等細胞類型之活化及功能中之多種免疫相關作用，有可能的是抗-CD40抗體將對罹患以上概述之自體免疫疾病之患者賦予超過當前療法目前所提供之益處的治療性益處。另外，CD40-CD154相互作用在腸發炎病症，諸如克羅恩氏病(Crohn's disease)及潰瘍性結腸炎中之主要作用，及CD40路徑與更罕見病症， 諸如自體免疫血管炎、尋常天疱瘡(pemphigus vulgaris)及ITP中之病變的機制關聯亦強調抗-CD40抗體在此等適應症中之潛力。

實體器官移植之後使用之當前可用免疫抑制劑提供極佳短期功效。在5%-20%接受者(視器官、患者群體及方案而定)中在新生時期(de novo period)內觀測到急性排斥且因新生時期內之急性排斥而喪失之移植物的比例對於任何環境皆低於5%。當前，關鍵未滿足之需要為長期患者免疫抑制耐受性及移植物存活。在腎移植之後，33%患者死亡及/或在5年內喪失其移植物；移植物接受者之平均死亡年齡為58歲。鈣調神經磷酸酶(Calcineurin)抑制劑(CNI)仍為絕大多數移植物患者之免疫抑制療法之支柱。儘管與CNI相關之腎毒性及心血管罹病性為慢性同種異體移植物腎病變以及患者功能性移植物死亡的一種驅動因素，但替代性初始免疫抑制(primary immunosuppression)尚未能夠替代CNI。總之，仍然存有改良長期移植物免疫抑制之餘地。經移植腎之由B細胞介導之免疫損傷可造成不良長期結果且對靶向B細胞排斥之新穎藥劑之需要正愈加由醫學界所認識到。

Chir12.12為一種完全人類化非促效劑抗-CD40抗體(IgG1，κ)，其阻斷CD154(亦稱為CD40配體；CD40L)介導之白血球活化且可活體外介導人類白血球及B細胞淋巴瘤之抗體依賴性細胞細胞毒性(ADCC)(參見WO 2006/073443)。WO 2005/044306亦描述抗-CD40拮抗劑抗體，包括特定言之用於治療自體免疫及發炎病症之Chir12.12。另外，當以單一療法形式在食蟹猴(Macaca fascicularis)中給藥時，Chir12.12有效延遲腎同種異體移植物排斥[Li等人(2008)Transplantation；86(1)：10-15]。然而，Chir12.12亦可介導非人類靈長類動物(NHP)中周邊B細胞之消除。

預測ADCC活性靜默之抗-CD40 mAb相對於親本抗-CD40抗體具 有改良之安全性概況，且特定言之可更適於非腫瘤學適應症(諸如自體免疫疾病)及用於移植物環境中。

因此，本發明提供保留親本抗-CD40抗體Chir12.12之非促效CD40L阻斷屬性之Fc靜默抗-CD40單株抗體。

特定言之，本發明提供一種包含針對目標CD40多肽(SEQ ID NO：28)之抗體之抗原結合部分的經分離抗體或蛋白質，其特徵在於該抗體或蛋白質a)與CD40多肽結合之K_D為10nM或10nM以下，且b)包含靜默IgG Fc區。

在一個實施例中，該抗體或蛋白質抑制CD40L誘導之信號傳導的IC₅₀為50ng/ml或50ng/ml以下。

在另一實施例中，本發明之經分離抗體或蛋白質對於CD40信號傳導不具有或具有較低促效劑活性。

在另一實施例中，本發明抗體或蛋白質包含選自由胺基酸序列SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19組成之群之靜默IgG Fc區。

在另一實施例中，本發明之經分離抗體或蛋白質包含分別與Chir12.12之V_H(SEQ ID NO：9)及Chir12.12抗體之V_L(SEQ ID NO：10)具有至少60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之重鏈(V_H)及輕鏈(V_L)可變區。

本發明抗體之特定實例為：- mAb1，其包含重鏈胺基酸序列SEQ ID NO：11及輕鏈胺基酸序列SEQ ID NO：12，- mAb2，其包含重鏈胺基酸序列SEQ ID NO：13及輕鏈胺基酸序列SEQ ID NO：14，或- mAb3，其包含重鏈胺基酸序列SEQ ID NO：15及輕鏈胺基酸序 列SEQ ID NO：16。

本發明之經分離抗體或蛋白質可用作藥劑。特定言之，其適用於治療自體免疫病症、發炎病症及/或預防移植中之移植物排斥或降低其風險。

本發明之經分離抗體或蛋白質可特定言之用於治療多發性硬化症、全身性紅斑狼瘡症、休格連氏症候群、類風濕性關節炎、移植物排斥及移植物抗宿主疾病。

本發明亦係關於包含本發明之以上抗體或蛋白質與至少一種醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑組合的醫藥組合物。該等醫藥組合物可另外包含其他活性成分。

本發明亦係關於本發明抗體或蛋白質之凍乾物或液體調配物。

本發明另外係關於編碼本發明抗體或蛋白質之經分離核酸及包含至少一種選自由SEQ ID NO：22至27組成之群之核酸的相應選殖或表現載體。

本發明亦係關於一種包含一或多種如上定義之選殖或表現載體之宿主細胞。

本發明另外提供一種產生本發明抗體或蛋白質之方法，其包含培養如上定義之宿主細胞，純化並回收該抗體或蛋白質。

為了使本發明可更容易理解，首先定義某些術語。其他定義貫穿整個[實施方式]加以闡述。

術語「免疫反應」係指例如淋巴細胞、抗原呈現細胞、吞噬細胞、顆粒球及由以上細胞或肝產生之可溶性巨分子(包括抗體、細胞激素及補體)對侵襲性病原體、受病原體感染之細胞或組織、癌細胞或在自體免疫或病理性發炎之情況下正常人類細胞或組織產生選擇性損傷、破壞或使其自人體消除的作用。

「信號轉導路徑」或「信號傳導活性」係指一般由蛋白質-蛋白 質相互作用(諸如生長因子與受體結合)引發，使信號自細胞之一部分傳輸至細胞之另一部分的生物化學因果關係。一般而言，傳輸涉及在引起信號轉導之反應系列中使一或多種蛋白質上之一或多個酪胺酸、絲胺酸或蘇胺酸殘基特異性磷酸化。次末過程(penultimate process)通常包括導致基因表現產生變化之核事件。

除非另外描述，否則術語CD40係指人類CD40，例如如SEQ ID NO：28中定義之人類CD40。

如本文中提及之術語「抗體」包括完整抗體及其任何抗原結合片段(亦即「抗原結合部分」)或單鏈。

天然產生之「抗體」為包含經雙硫鍵相互連接之至少兩條重(H)鏈及兩條輕(L)鏈的醣蛋白。各重鏈包含重鏈可變區(在本文中縮寫為V_H)及重鏈恆定區。重鏈恆定區包含三個域，即CH1、CH2及CH3。各輕鏈包含輕鏈可變區(在本文中縮寫為V_L)及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包含一個域C_L。V_H區及V_L區可進一步再分為高變區(稱為互補決定區(CDR))，其間穿插有較保守區(稱為構架區(FR))。各V_H及V_L由自胺基端至羧基端按下列順序排列之3個CDR及4個FR構成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈及輕鏈之可變區含有與抗原相互作用之結合域。抗體之恆定區可介導免疫球蛋白結合宿主組織或因子，包括免疫系統之各種細胞(例如效應細胞)及經典補體系統之第一組分(C1q)。

如本文所用之術語抗體之「抗原結合部分」(或簡稱為「抗原部分」)係指全長抗體或抗體之保留特異性結合抗原(例如CD40之一部分)之能力之一或多個片段。已顯示抗體之抗原結合功能可由全長抗體之片段執行。術語抗體之「抗原結合部分」內涵蓋之結合片段之實例包括Fab片段，其為由V_L、V_H、C_L及CH1域組成之單價片段；F(ab)₂片段，其為包含經處於鉸鏈區處之二硫橋鍵連接之兩個Fab片段 的二價片段；Fd片段，其由V_H及CH1域組成；Fv片段，其由抗體之單一臂之V_L及V_H域組成；dAb片段(Ward等人，1989 Nature 341：544-546)，其由V_H域組成；及經分離互補決定區(CDR)或包含此抗原結合部分之任何融合蛋白。

此外，儘管Fv片段之兩個域V_L及V_H由各別基因編碼，但其可使用重組方法藉由能使其製備成單鏈蛋白質之合成連接子聯接，在該單鏈蛋白質中，V_L與V_H區配對以形成單價分子(稱為單鏈Fv(scFv)；參見例如Bird等人，1988 Science 242：423-426；及Huston等人，1988 Proc.Natl.Acad.Sci.85：5879-5883)。此等單鏈抗體亦意欲涵蓋於術語抗體之「抗原結合部分」內。此等抗體片段係使用熟習此項技術者已知之習知技術獲得，且以與完整抗體相同之方式針對效用篩檢片段。

如本文所用，術語「IgG Fc區」用於定義免疫球蛋白重鏈之C端區，包括天然序列Fc區及變異Fc區。人類IgG重鏈Fc區一般定義為包含IgG抗體之羧基端之位置C226或P230的胺基酸殘基。Fc區中之殘基之編號為Kabat之EU索引之編號。Fc區之C端離胺酸(殘基K447)可例如在抗體之產生或純化期間移除。因此，本發明抗體之組合物可包含所有K447殘基皆經移除之抗體群體、K447殘基未經移除之抗體群體及含有有及無K447殘基之抗體之混合物的抗體群體。

如本文所用之「經分離抗體」係指實質上不含具有不同抗原特異性之其他抗體的抗體(例如特異性結合CD40之經分離抗體實質上不含特異性結合除CD40以外之其他抗原的抗體)。然而，特異性結合CD40之經分離抗體可與其他抗原，諸如來自其他(非人類)物種之CD40分子具有交叉反應性。此外，經分離抗體可實質上不含其他細胞物質及/或化學物質。

如本文所用之術語「單株抗體」或「單株抗體組合物」係指具 有單一分子組成之抗體分子的製劑。單株抗體組合物對特定抗原決定基顯示單一結合特異性及親和力。

如本文所用之術語「人類化抗體」意欲包括含有源於非人類免疫球蛋白序列之最小序列之抗體。在很大程度上，人類化抗體為人類免疫球蛋白(接受者抗體)，其中來自接受者之高變區(亦稱為互補決定區或CDR)之殘基經來自非人類物種(供者抗體)，諸如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物之高變區之具有所要特異性、親和力及能力的殘基置換。片語「互補決定區」係指同時限定天然免疫球蛋白結合位點之天然Fv區之結合親和力及特異性的胺基酸序列。參見，例如Chothia等人(1987)J.Mol.Biol.196：901-917；Kabat等人(1991)US Dept.of Health and Human Services,NIH出版號91-3242。片語「恆定區」係指抗體分子之賦予效應功能之部分。在針對產生用於人類疾病之療法中之非免疫原性抗體之先前研究中，小鼠恆定區經人類恆定區取代。目標人類化抗體之恆定區源於人類免疫球蛋白。人類化可遵循Winter及同事之方法(Jones等人(1986)Nature 321：522-525；Riechmann等人(1988)Nature 332：323-327；Verhoeyen等人(1988)Science 239：1534-1536)藉由用齧齒動物及突變齧齒動物CDR或CDR序列取代人類抗體之相應序列來進行。在一些情況下，人類免疫球蛋白之一或多個可變區之構架區內的殘基經相應非人類殘基置換(參見例如美國專利第5,585,089號；第5,693,761號；第5,693,762號；及第6,180,370號)。此外，人類化抗體可包含未見於接受者抗體或供者抗體中之殘基。本發明之人類化抗體亦將包含免疫球蛋白恆定區(Fc)之至少一部分。通常，本發明之人類化抗體亦將包含免疫球蛋白恆定區之至少一部分，通常為人類免疫球蛋白恆定區之至少一部分，且在本發明之情況下，包含靜默Fc IgG區。

本發明抗體可包括不由人類序列編碼之胺基酸殘基(例如由活體 外隨機或位點特異性突變誘發或由活體內體細胞突變引入之突變)。特定言之，術語「人類化抗體」包括包含靜默Fc IgG區變體之抗體。

術語「人類化單株抗體」係指顯示單一結合特異性之具有可變區之抗體，其中該等可變區係自非人類序列加以人類化。

如本文所用之術語「重組抗體」包括藉由重組手段製備、表現、產生或分離之所有人類或人類化抗體，諸如自人類免疫球蛋白基因之轉殖基因或轉染色體動物(例如小鼠)或由其製備之融合瘤分離的抗體、自經轉型以表現人類或人類化抗體之宿主細胞，例如自轉染瘤分離之抗體、自重組組合人類抗體文庫分離之抗體，及藉由涉及所有或一部分人類免疫球蛋白基因序列與其他DNA序列拼接之任何其他手段製備、表現、產生或分離之抗體。此等重組人類或人類化抗體具有構架區及CDR區可源於人類生殖系免疫球蛋白序列的可變區。然而，在某些實施例中，此等重組人類或人類化抗體可經受活體外突變誘發(或當使用人類Ig序列轉殖基因動物時，經受活體內體細胞突變誘發)且因此重組抗體之V_H及V_L區之胺基酸序列為儘管源於人類生殖系V_H及V_L序列且與其相關但可能不活體內天然存在於人類抗體生殖系譜系中的序列。

如本文所用，「同型」係指由重鏈恆定區基因提供之抗體類別(例如IgM、IgE、IgG，諸如IgG1或IgG4)。不同同型具有不同效應功能。舉例而言，野生型人類IgG1及IgG3同型介導抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)活性。

片語「識別抗原之抗體」及「對抗原具有特異性之抗體」及「針對抗原之抗體」在本文中可與術語「特異性結合抗原之抗體」互換使用。

如本文所用，「特異性結合CD40多肽」之抗體或蛋白質意欲指代與人類CD40多肽結合之K_D為100nM或100nM以下、10nM或10nM 以下、1nM或1nM以下的抗體或蛋白質。

「與除CD40以外之抗原交叉反應」之抗體意欲指代結合彼抗原之K_D為1μM或1μM以下、100nM或100nM以下、10nM或10nM以下、1nM或1nM以下的抗體。「不與特定抗原交叉反應」之抗體意欲指代結合彼抗原之K_D為100nM或100nM以上、或1μM或1μM以上、或10μM或10μM以上的抗體。在某些實施例中，不與抗原交叉反應之此等抗體在標準結合分析中針對此等蛋白質展現基本上不可偵測之結合。

如本文所用之術語「K_assoc」或「K_a」意欲指代特定抗體-抗原相互作用之締合速率，而如本文所用之術語「K_dis」或「K_d」意欲指代特定抗體-抗原相互作用之解離速率。

如本文所用之術語「K_D」意欲指代解離常數，其由K_d與K_a之比率(亦即K_d/K_a)獲得且表示為莫耳濃度(M)。抗體之K_D值可使用此項技術中充分確立之方法測定。一種測定抗體之K_D之方法係使用表面電漿子共振或使用生物感測器系統，諸如Biacore^®系統。

如本文所用，術語「親和力」係指單一抗原位點處抗體與抗原之間的相互作用強度。在各抗原位點內，抗體「臂」之可變區經由弱非共價力在眾多位點處與抗原相互作用；相互作用愈大，親和力愈強。

如本文所用，術語「親合力」係指抗體-抗原複合物之總穩定性或強度之資訊性量度。其受三個主要因素控制：抗體抗原決定基親和力；抗原與抗體二者之價數；及相互作用部分之結構排列。最終此等因素限定抗體之特異性，亦即特定抗體與確切抗原之抗原決定基結合的可能性。

如本文所用，術語「CD40拮抗劑」意欲指代在人類細胞分析，諸如CD40L介導之PBMC增殖分析中在CD40L存在下，抑制CD40誘導 之信號傳導活性的抗體或蛋白質。此分析更詳細描述於以下實例中。在一些實施例中，本發明抗體或蛋白質抑制CD40L誘導之信號傳導的IC₅₀為500ng/ml或500ng/ml以下、較佳為50ng/ml或50ng/ml以下，例如20ng/ml或20ng/ml以下，如在CD40L介導之PBMC增殖分析中所量測。

如本文所用，「無促效劑活性」之抗體意欲指代在基於細胞之分析，諸如CD40L介導之PBMC增殖分析中在不存在CD40L下，不顯著增加CD40介導之信號傳導活性的抗體。此分析更詳細描述於以下實例中。

如本文所用，術語「ADCC」或「抗體依賴性細胞細胞毒性」活性係指細胞消除活性。ADCC活性可藉由如以下實例中更詳細描述之ADCC分析量測。

如本文所用，術語「靜默」抗體係指不展現或展現較低ADCC活性之抗體，該活性係如在如實例中所述之ADCC分析中所量測。

在一個實施例中，術語「無或較低ADCC活性」意謂靜默抗體展現之ADCC活性低於50%特異性細胞溶解，例如低於10%特異性細胞溶解，如在如實例中所述之ADCC分析中所量測。無ADCC活性意謂靜默抗體展現之ADCC活性(特異性細胞溶解)低於1%。在一特定實施例中，本發明之靜默抗體不展現任何顯著ADCC活性，如在如實例中所述之ADCC分析中所量測。

靜默效應功能可藉由在抗體之Fc區中進行突變獲得且已在此項技術中描述：LALA及N297A(Strohl,W.,2009,Curr.Opin.Biotechnol.第20卷(6)：685-691)；及D265A(Baudino等人，2008,J.Immunol.181：6664-69；Strohl,W.，同上)。靜默Fc IgG1抗體之實例包含在IgG1 Fc胺基酸序列中包含L234A及L235A突變之所謂LALA突變體。靜默IgG1抗體之另一實例包含D265A突變。另一靜默IgG1抗體包含N297A 突變，其產生無糖基化/非糖基化抗體。

如本文所用，術語本發明抗體或蛋白質之「選擇性」係指抗體或蛋白質與某一目標多肽結合而不與密切相關多肽結合。

如本文所用，術語抗體之「高親和力」係指抗體對目標抗原之K_D為1nM或1nM以下。如本文所用，術語「個體」包括任何人類或非人類動物。

術語「非人類動物」包括所有脊椎動物，例如哺乳動物及非哺乳動物，諸如非人類靈長類動物、綿羊、犬、貓、馬、母牛、雞、兩棲動物、爬行動物等。

如本文所用，術語「最佳化」意謂核苷酸序列已經改變以使用在產生細胞或生物體，通常為真核細胞(例如畢赤酵母(Pichia)細胞、木黴(Trichoderma)細胞、中國倉鼠卵巢細胞(CHO)或人類細胞)中為較佳之密碼子編碼胺基酸序列。最佳化核苷酸序列經工程改造以完全或儘可能多地保留原先由起始核苷酸序列編碼之胺基酸序列，其亦稱為「親本」序列。本文中之最佳化序列已經工程改造以具有在CHO哺乳動物細胞中為較佳的密碼子，然而在本文中亦設想此等序列在其他真核細胞中之最佳化表現。由最佳化核苷酸序列編碼之胺基酸序列亦稱為最佳化胺基酸序列。

如本文所用，兩個序列之間的一致性百分比為由該等序列所共有之相同位置數之函數(亦即一致性%=相同位置數/位置總數×100)，考慮為達成兩個序列之最佳比對所需引入之空隙數及各空隙之長度。可使用如下所述之數學算法比較序列及確定兩個序列之間的一致性百分比。

可使用已併入ALIGN程式(第2.0版)中之E.Meyers及W.Miller(Comput.Appl.Biosci.,4：11-17,1988)之算法確定兩個胺基酸序列之間的一致性百分比，該程式使用PAM120權重殘差表(weight residue table)、空隙長度罰分(gap length penalty)12及空隙罰分(gap penalty)4。或者，可使用已併入GCG套裝軟體(可在http：//www.gcg.com處獲得)中之GAP程式中之Needleman及Wunsch(J.Mol,Biol.48：444-453,1970)算法確定兩個胺基酸序列之間的一致性百分比，該程式使用Blossom 62矩陣或PAM250矩陣及空隙權重16、14、12、10、8、6或4及長度權重1、2、3、4、5或6。

亦可使用例如用於核酸序列之算法，諸如BLASTN程式確定兩個核苷酸胺基酸序列之間的一致性百分比，該程式使用字長(W)11、預期值(E)10、M=5、N=4及兩股之比較作為預設值。

重組抗體

本發明抗體包括經分離且結構特徵在於其具有如下表1中所述之全長重鏈及輕鏈胺基酸序列的人類化重組抗體mAb1-mAb3。

本發明之此等經分離抗體mAb1-mAb3之相應可變區V_H及V_L胺基酸序列皆源於相同抗體Chir12.12，其先前例如在WO 2006/073443中所述且由V_H胺基酸序列SEQ ID NO：7及V_L胺基酸序列SEQ ID NO：8組成。

本發明抗體相較於原始CHIR12.12之一個重要差異在於其具有由靜默Fc IgG區，例如靜默Fc IgG1區組成之Fc區。

特定言之，表2概述相較於原始CHIR12.12抗體，獲得抗體mAb1-mAb3所進行之Fc IgG1區修飾。

本發明之其他抗體包括胺基酸已藉由胺基酸缺失、插入或取代而突變但與CHIR12.12之V_H及V_L區(分別為SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：8)具有至少60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性且包含靜默IgG Fc區，例如靜默IgG1 Fc區的抗體。

在一些實施例中，本發明抗體為mAb1-mAb3中任一種突變變體，其中該突變變異抗體包括的突變胺基酸序列中，當相較於CHIR12.12之V_H及V_L區(分別為SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：8)時，V_H及V_L區中之至多1、2、3、4或5個胺基酸已藉由胺基酸缺失、插入或取代而突變且保留與mAb1、mAb2或mAb3相同之恆定區。

mAb1-mAb3之全長輕鏈及重鏈核苷酸編碼序列展示於下表3中。

編碼本發明抗體之其他核酸包括已藉由核苷酸缺失、插入或取代而突變但與CHIR12.12之V_H及V_L相應編碼區(如例如分別如SEQ ID NO：20及SEQ ID NO：21中所述之序列中所描述)具有至少60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性且包含靜默 IgG Fc區，例如靜默IgG1 Fc區之編碼序列的核酸。

在一些實施例中，其包括變異核酸，其中相較於例如分別如SEQ ID NO：20及SEQ ID NO：21中所述之序列中所描述之V_H及V_L編碼區，V_H及V_L編碼區中之至多1、2、3、4或5個核苷酸已藉由核苷酸缺失、插入或取代而改變，且保留與mAb1、mAb2或mAb3相應編碼序列相同之恆定區編碼序列。

同源抗體

除本發明之重組抗體mAb1-mAb3之外，本發明亦涵蓋保留mAb1-mAb3抗體之所要功能性質之同源抗體或蛋白質。

特定言之，本發明之該等同源抗體或蛋白質為包含針對目標CD40多肽(SEQ ID NO：28)之抗體之抗原結合部分的抗體或蛋白質，其特徵在於該抗體或蛋白質a)與CD40多肽結合之K_D為10nM或10nM以下，且b)包含靜默IgG Fc區且其中該等同源抗體或蛋白質保留原始mAb1-mAb3抗體之所要功能性質。

原始mAb1-mAb3抗體之所要功能性質可選自一或多種下列性質：(i)其特異性結合CD40，例如K_D為100nM或100nM以下、10nM或10nM以下或1nM或1nM以下，如Biacore分析中所量測；(ii)其為CD40拮抗劑，例如其抑制CD40L誘導之信號傳導，如在CD40L介導之PBMC增殖分析中所量測；(iii)其不展現或展現較低促效劑活性，如在CD40L介導之PBMC增殖分析中所量測；(iv)其與食蟹獼猴(Cynomolgus monkey)CD40多肽交叉反應；(v)其不具有或具有較低ADCC活性；且 (vi)其具有適於藥物開發之性質。

在一個特定實施例中，本發明之該等同源抗體或蛋白質包含靜默IgG1 Fc區，例如選自由SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19組成之群之靜默IgG1 Fc區。

在一個特定實施例中，本發明係關於一種抗體或蛋白質，其具有與上述，特定言之表1中所述抗體mAb1-mAb3之相應胺基酸或核苷酸序列同源之可變區重鏈及輕鏈核苷酸序列、或可變區重鏈及輕鏈胺基酸序列、或所有6個CDR胺基酸序列或核苷酸編碼序列，且該抗體或蛋白質包含選自由mAb1之Fc區(SEQ ID NO：17)、mAb2之Fc區(SEQ ID NO：18)及mAb3之Fc區(SEQ ID NO：19)組成之群的靜默IgG Fc區，其中該同源抗體或蛋白質特異性結合CD40，且該抗體或蛋白質展現下列功能性質：其為CD40拮抗劑，其不展現或展現較低促效劑活性，且其不具有或具有較低ADCC活性。

舉例而言，本發明係關於與mAb1-mAb3同源之抗體或蛋白質，其包含選自由mAb1之Fc區(SEQ ID NO：17)、mAb2之Fc區(SEQ ID NO：18)及mAb3之Fc區(SEQ ID NO：19)組成之群的靜默IgG Fc區，且包含可變重鏈(V_H)及可變輕鏈(V_L)序列，其中CDR序列與mAb1-mAb3之相應CDR序列(分別為SEQ ID NO：1-6)共有至少60%、70%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性，其中該同源抗體或蛋白質特異性結合CD40，且該同源抗體或蛋白質展現下列功能性質：其為CD40拮抗劑，其不展現或展現較低促效劑活性，且其不具有或具有較低ADCC活性。

在一相關特定實施例中，同源抗體或蛋白質a)結合CD40之K_D為1nM或1nM以下；b)抑制CD40L誘導之信號傳導之IC₅₀為50ng/ml或50ng/ml以下，如在實例中所述之CD40L介導之PBMC增殖分析中所量測； c)不具有或具有較低促效劑活性，如在生物分析，諸如如實例中所述之CD40L介導之PBMC增殖分析中所量測；且d)不具有或具有較低ADCC活性。

本發明另外係關於與mAb1-mAb3同源之抗體或蛋白質，其包含選自由mAb1之Fc區(SEQ ID NO：17)、mAb2之Fc區(SEQ ID NO：18)及mAb3之Fc區(SEQ ID NO：19)組成之群的靜默IgG Fc區，且包含可變重鏈(V_H)及可變輕鏈(V_L)序列，其與mAb1-mAb3之相應(V_H)及(V_L)序列(分別為SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：8)共有至少80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性，其中該同源抗體或蛋白質特異性結合CD40，且該抗體或蛋白質展現下列功能性質：其為CD40拮抗劑，其不展現或展現較低促效劑活性，且其不具有或具有較低ADCC活性。

在一相關特定實施例中，該同源抗體或蛋白質a)結合CD40之K_D為1nM或1nM以下；b)抑制CD40L誘導之信號傳導之IC₅₀為50ng/ml或50ng/ml以下，如在實例中所述之CD40L介導之PBMC增殖分析中所量測；c)不具有或具有較低促效劑活性，如在生物分析，諸如實例中所述之CD40L介導之PBMC增殖分析中所量測；且d)不具有或具有較低ADCC活性。

在另一實例中，本發明係關於與mAb1-mAb3同源之抗體或蛋白質，其包含選自由mAb1之Fc區(SEQ ID NO：17)、mAb2之Fc區(SEQ ID NO：18)及mAb3之Fc區(SEQ ID NO：19)組成之群的靜默IgG Fc區，且其中：可變重鏈及輕鏈係由與mAb1-mAb3之可變重鏈及輕鏈之相應編碼核苷酸序列至少80%、至少90%、至少95%或100%一致的核苷酸序列編碼，其中該同源抗體或蛋白質特異性結合CD40，且該抗體或蛋白質展現下列功能性質：其為CD40拮抗劑，其不展現或展現較 低促效劑活性，且其不具有或具有較低ADCC活性。

在一相關特定實施例中，該同源抗體或蛋白質a)結合CD40之K_D為1nM或1nM以下；b)抑制CD40L誘導之信號傳導之IC₅₀為50ng/ml或50ng/ml以下，如在實例中所述之CD40L介導之PBMC增殖分析中所量測；c)不具有或具有較低促效劑活性，如在生物分析，諸如實例中所述之CD40L介導之PBMC增殖分析中所量測；且d)不具有或具有較低ADCC活性。

具有突變胺基酸序列之抗體可藉由使編碼核酸分子突變誘發(例如定點或PCR介導之突變誘發)，隨後使用以下實例中所述之功能分析測試所編碼之經改變抗體的保留功能(亦即上述功能)來獲得。

在某些實施例中，如上所述之與mAb1-mAb3同源之抗體或蛋白質具有保守性序列修飾。

如本文所用，術語「保守性序列修飾」意欲指代胺基酸殘基經具有類似側鏈之胺基酸殘基置換之胺基酸取代。此項技術中已定義具有類似側鏈之胺基酸殘基之家族。此等家族包括具有鹼性側鏈之胺基酸(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、具有酸性側鏈之胺基酸(例如天冬胺酸、麩胺酸)、具有不帶電荷之極性側鏈之胺基酸(例如甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸)、具有非極性側鏈之胺基酸(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸)、具有β分支側鏈之胺基酸(例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及具有芳族側鏈之胺基酸(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。因此，本發明抗體之CDR區內之一或多個胺基酸殘基可經同一側鏈家族之其他胺基酸殘基置換，且可使用本文所述之功能分析來測試經改變抗體之保留功能。

可藉由此項技術中已知之標準技術，諸如定點突變誘發及PCR介 導之突變誘發，將修飾引入本發明抗體中。

編碼本發明抗體或蛋白質之核酸分子

本發明之另一態樣係關於編碼如上所述之本發明抗體或蛋白質的核酸分子。

mAb1至mAb3之任一者之輕鏈及重鏈核苷酸序列的實例可源於表3(展示mAb1至mAb3之重鏈及輕鏈之整個核苷酸編碼序列)。

本發明之輕鏈及重鏈核苷酸序列之其他實例為編碼如表1中所述之mAb1、mAb2或mAb3之全長重及/或輕胺基酸序列的任何序列。

本發明亦係關於源於已針對在哺乳動物細胞，例如CHO細胞株中之蛋白質表現加以最佳化之後述序列的核酸分子。

核酸可存在於完整細胞、細胞溶解產物中，或可為呈部分純化或實質上純淨形式之核酸。當核酸藉由標準技術，包括鹼/SDS處理、CsCl顯帶(CsCl banding)、管柱層析、瓊脂糖凝膠電泳及此項技術中熟知之其他技術自其他細胞組分或其他污染物，例如其他細胞核酸或蛋白質純化時，其「經分離」或「致使變得實質上純淨」。參見F.Ausubel，等人編1987 Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley Interscience,New York。本發明核酸可為例如DNA或RNA且可含有或可不含有內含子序列。在一實施例中，核酸為cDNA分子。核酸可存在於諸如噬菌體呈現載體之載體，或重組質體載體中。

本發明核酸可使用標準分子生物學技術獲得。一旦獲得編碼例如V_H及V_L區段之DNA片段，此等DNA片段即可進一步藉由標準重組DNA技術操作，例如：將可變區基因轉變成全長抗體鏈基因、Fab片段基因或scFv基因。在此等操作中，V_L或V_H編碼DNA片段以操作方式連接於另一DNA分子或編碼包含如SEQ ID NO：17-19中定義之Fc區之mAb1-mAb3抗體恆定區的片段。

本文中所用之術語「以操作方式連接」意謂兩個DNA片段以功能方式聯接，例如以使由兩個DNA片段所編碼之胺基酸序列保持在同一個讀碼框內，或以使蛋白質在所要啟動子之控制下表現。

可藉由使編碼V_H之DNA以操作方式連接於編碼重鏈恆定區(CH1、CH2及CH3)之另一DNA分子，將編碼V_H區之經分離DNA轉變成全長重鏈基因。人類重鏈恆定區基因之序列係此項技術中已知者(參見例如Kabat,E.A.等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH出版號91-3242)，且涵蓋此等區之DNA片段可藉由標準PCR擴增獲得。重鏈恆定區可選自包含如SEQ ID NO：17-19中所定義之Fc區之IgG1同型中。

可藉由使編碼V_L之DNA以操作方式連接於編碼輕鏈恆定區CL之另一DNA分子，將編碼V_L區之經分離DNA轉變成全長輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)。人類輕鏈恆定區基因之序列係此項技術中已知者(參見例如Kabat,E.A.等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH出版號91-3242)，且涵蓋此等區之DNA片段可藉由標準PCR擴增獲得。輕鏈恆定區可為κ或λ恆定區。

產生單株抗體之轉染瘤之產生

本發明抗體或蛋白質亦可使用例如此項技術中所熟知之重組DNA技術與基因轉染方法之組合，在宿主細胞轉染瘤中產生(例如Morrison,S.(1985)Science 229：1202)。

舉例而言，為表現抗體，編碼部分或全長輕鏈及重鏈之DNA可藉由標準分子生物學或生物化學技術(例如DNA化學合成、PCR擴增或使用表現相關抗體之融合瘤進行之cDNA選殖)獲得且DNA可插入表現載體中以使基因以操作方式連接於轉錄及轉譯控制序列。在此情形 下，術語「以操作方式連接」意欲意謂抗體基因接合於載體中以使該載體內之轉錄及轉譯控制序列發揮其調控抗體基因之轉錄及轉譯的預定功能。表現載體及表現控制序列經選擇以與所用表現宿主細胞相容。可將抗體輕鏈基因及抗體重鏈基因插入各別載體中，或更通常，將兩種基因插入同一表現載體中。

藉由標準方法(例如抗體基因片段及載體上之互補限制位點之接合，或若不存在限制位點，則進行鈍端接合(blunt end ligation))將抗體基因插入表現載體中。本文所述抗體之輕鏈及重鏈可變區可用於藉由以下方式來產生全長抗體基因：將其插入已編碼所要序列之對應於mAb1、mAb2或mAb3之重鏈恆定區及輕鏈恆定區之該等恆定區的表現載體中以使V_H區段以操作方式連接於載體內之C_H區段且V_L區段以操作方式連接於載體內之C_L區段。或者或另外，重組表現載體可編碼促進抗體鏈自宿主細胞分泌之信號肽。抗體鏈基因可選殖入載體中以使信號肽在同一個讀碼框內連接於抗體鏈基因之胺基端。信號肽可為免疫球蛋白信號肽或異源信號肽(亦即非免疫球蛋白之信號肽)。

除抗體鏈基因之外，本發明之重組表現載體攜帶控制抗體鏈基因在宿主細胞中表現之調控序列。術語「調控序列」意欲包括啟動子、增強子及控制抗體鏈基因轉錄或轉譯之其他表現控制元件(例如聚腺苷酸化信號)。此等調控序列描述於例如Goeddel(Gene Expression Technology.Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CA 1990)中。熟習此項技術者應瞭解，表現載體之設計，包括調控序列之選擇可視諸如欲轉型之宿主細胞之選擇、所要蛋白質之表現量等因素而定。用於哺乳動物宿主細胞表現之調控序列包括引導蛋白質在哺乳動物細胞中高量表現之病毒元件，諸如源於細胞巨大病毒(cytomegalovirus，CMV)、猿猴病毒40(Simian Virus 40，SV40)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))及多瘤之啟動子及/或增強 子。或者，可使用非病毒調控序列，諸如泛素(ubiquitin)啟動子或P-血球蛋白啟動子。更進一步，調控元件由來自不同來源之序列構成，諸如SRa啟動子系統，其含有SV40早期啟動子之序列及1型人類T細胞白血病病毒之長末端重複序列(Takebe,Y.等人，1988 Mol.Cell.Biol.8：466-472)。

除抗體鏈基因及調控序列之外，本發明之重組表現載體亦可攜帶其他序列，諸如調控載體在宿主細胞中複製之序列(例如複製起點)及可選擇標記基因。可選擇標記基因有助於對內部已引入載體之宿主細胞進行選擇(參見例如美國專利第4,399,216號、第4,634,665號及第5,179,017號，皆屬於Axel等人)。舉例而言，通常可選擇標記基因賦予內部已引入載體之宿主細胞對藥物，諸如G418、潮黴素(hygromycin)或甲胺喋呤(methotrexate)之抗性。可選標記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(用於以甲胺喋呤選擇/擴增之dhfr-宿主細胞中)及neo基因(用於G418選擇)。

對於輕鏈及重鏈之表現，藉由標準技術將編碼重鏈及輕鏈之表現載體轉染入宿主細胞中。術語「轉染」之各種形式意欲涵蓋通常用於將外源DNA引入原核或真核宿主細胞中之廣泛多種技術，例如電穿孔、磷酸鈣沈澱、DEAE-葡聚糖轉染及其類似技術。理論上有可能在原核或真核宿主細胞中表現本發明抗體。論述抗體在真核細胞，例如哺乳動物宿主細胞、酵母或絲狀真菌中之表現，因為此等真核細胞且特定言之哺乳動物細胞比原核細胞更可能裝配及分泌經適當摺疊且具有免疫活性之抗體。

在一個特定實施例中，本發明之選殖或表現載體包含下列編碼序列(a)-(c)中之任一至少一者以操作方式連接於適合啟動子序列：(a)分別編碼mAb1之全長重鏈及輕鏈之SEQ ID NO：22及SEQ ID NO：23； (b)分別編碼mAb2之全長重鏈及輕鏈之SEQ ID NO：24及SEQ ID NO：25；或(c)分別編碼mAb3之全長重鏈及輕鏈之SEQ ID NO：26及SEQ ID NO：27。

用於表現本發明之重組抗體之哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢(CHO細胞)(包括dhfr- CHO細胞，描述於Urlaub及Chasin,1980 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220中，與例如如R.J.Kaufman及P.A.Sharp,1982 Mol.Biol.159：601-621中所述之DH FR可選擇標記一起使用)、CHOK1 dhfr+細胞株、NSO骨髓瘤細胞、COS細胞及SP2細胞。特定言之，對於與NSO骨髓瘤細胞一起使用，另一表現系統為PCT公開案WO 87/04462、WO 89/01036及EP 0 338 841中所示之GS基因表現系統。

當編碼抗體基因之重組表現載體引入哺乳動物宿主細胞中時，藉由培養宿主細胞一段足以使抗體在宿主細胞中表現或使抗體分泌入宿主細胞生長之培養基中的時期來產生抗體。抗體可使用標準蛋白質純化方法自培養基回收(參見例如Abhinav等人2007,Journal of Chromatography 848：28-37)。

在一個特定實施例中，本發明之宿主細胞為用具有選自由分別適於表現mAb1-mAb3之(a)-(c)組成之群的編碼序列且以操作方式連接於適合啟動子序列之表現載體轉染的宿主細胞：(a)SEQ ID NO：22及SEQ ID NO：23；(b)SEQ ID NO：24及SEQ ID NO：25；及(c)SEQ ID NO：26及SEQ ID NO：27。

後述宿主細胞可接著進一步在適於表現及產生分別選自由mAb1-mAb3組成之群之本發明抗體的條件下培養。

雙特異性分子

在另一態樣中，本發明特徵在於包含本發明抗-CD40抗體或蛋白質之雙特異性或多特異性分子。本發明抗體或蛋白質可衍生於或連接於另一功能分子，例如另一肽或蛋白質(例如另一抗體或受體之配體)以產生結合至少兩個不同結合位點或目標分子之雙特異性分子。事實上，本發明抗體可衍生於或連接於一個以上其他功能分子以產生結合兩個以上不同結合位點及/或目標分子之多特異性分子；此等多特異性分子亦意欲由如本文所用之術語「雙特異性分子」涵蓋。為產生本發明之雙特異性分子，本發明抗體或蛋白質可功能性連接(例如藉由化學偶合、基因融合、非共價締合或以其他方式)於一或多個其他結合分子，諸如另一抗體、抗體片段、肽或結合模擬物以便產生雙特異性分子。

因此，本發明包括雙特異性分子，其包含至少一個針對CD40之第一結合特異性部分(specificity)，例如mAb1-mAb3之任一者之一個抗原結合部分；及針對第二目標抗原決定基之第二結合特異性部分。舉例而言，第二目標抗原決定基為CD40之不同於第一目標抗原決定基之另一抗原決定基。另一實例為雙特異性分子，其包含至少一種針對CD40之第一結合特異性部分，例如mAb1-mAb3之任一者之一個抗原結合部分；及針對CD40內之抗原決定基之第二結合特異性部分。

另外，對於雙特異性分子具有多特異性之本發明而言，除第一及第二目標抗原決定基之外，該分子亦可另外包括第三結合特異性部分。

本發明之雙特異性分子可藉由使用此項技術中已知之方法將構成性結合特異性部分結合來製備。舉例而言，可單獨產生雙特異性分子之各結合特異性部分且接著將其彼此結合。當結合特異性部分為蛋白質或肽時，多種偶合劑或交聯劑可用於共價結合。交聯劑之實例包括蛋白A、碳化二亞胺、N-丁二醯亞胺基-S-乙醯基-硫乙酸酯 (SATA)、5,5'-二硫基雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、鄰伸苯基二順丁烯二醯亞胺(oPDM)、N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)及4-(N-順丁烯二醯亞胺甲基)環己烷-1-甲酸磺酸基丁二醯亞胺酯(磺酸基-SMCC)(參見例如Karpovsky等人，1984 J.Exp.Med.160：1686；Liu,MA等人，1985 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：8648)。其他方法包括描述於Paulus,1985 Behring Ins.Mitt.第78期，118-132；Brennan等人，1985 Science 229：81-83及Glennie等人，1987 J.Immunol.139：2367-2375中之方法。結合劑為SATA及磺酸基-SMCC，均可購自Pierce Chemical Co.(Rockford,IL)。

當結合特異性部分為抗體時，其可藉由兩條重鏈之C端鉸鏈區之硫氫基鍵結而結合。在一特定實施例中，在結合之前，鉸鏈區經修飾以含有奇數個硫氫基殘基，例如一個硫氫基殘基。

或者，兩種結合特異性部分可在同一載體中編碼且在同一宿主細胞中表現及裝配。當雙特異性分子為mAb×mAb、mAb×Fab、Fab×F(ab')₂或配體×Fab融合蛋白時，此方法尤其適用。本發明之雙特異性分子可為包含一個單鏈抗體及一個結合決定子之單鏈分子、或包含兩個結合決定子之單鏈雙特異性分子。雙特異性分子可包含至少兩個單鏈分子。例如在美國專利第5,260,203號、美國專利第5,455,030號、美國專利第4,881,175號、美國專利第5,132,405號、美國專利第5,091,513號、美國專利第5,476,786號、美國專利第5,013,653號、美國專利第5,258,498號及美國專利第5,482,858號中描述製備雙特異性分子之方法。

雙特異性分子與其特定目標之結合可藉由例如酶聯免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(REA)、FACS分析、生物分析(例如生長抑制)或西方墨點分析來確認。每一此等分析通常藉由採用對特定相關蛋白質-抗體複合物具有特異性之經標記試劑(例如抗體)來偵測相關複 合物的存在。

多價抗體

在另一態樣中，本發明提供多價抗體，其包含本發明抗體之至少兩個與CD40結合之相同或不同抗原結合部分，例如選自mAb1-mAb3之任一者之抗原結合部分。在一個實施例中，多價抗體提供抗體之至少兩個、三個或四個抗原結合部分。抗原結合部分可經由蛋白質融合或共價或非共價鍵聯連接在一起。或者，已描述雙特異性分子之鍵聯方法。可例如藉由使本發明抗體與結合本發明抗體之恆定區(例如Fc或鉸鏈區)之抗體交聯來獲得四價化合物。

使用本發明之拮抗劑抗-CD40抗體之療法

本發明方法係有關本發明抗-CD40抗體或蛋白質治療患有自體免疫疾病及/或發炎疾病或傾向於感染自體免疫疾病及/或發炎疾病之個體(亦即患者)的用途，其中該疾病及/或發炎係由表現CD40抗原之細胞上之由CD40L介導之CD40信號傳導介導。

偵測細胞中之CD40表現之方法在此項技術中為熟知的且包括(但不限於)PCR技術、免疫組織化學、流動式細胞測量術、西方墨點法、ELISA及其類似方法。

本發明方法尤其適用於治療涉及CD40L介導之CD40刺激之發炎疾病及/或自體免疫疾病。

發炎疾病之特徵在於發炎及組織破壞或其組合。「發炎疾病」包括任何發炎性免疫介導之過程，其中免疫反應之起始事件或目標涉及非自體抗原，包括例如同種異體抗原、異種抗原、病毒抗原、細菌抗原、未知抗原或過敏原。

另外，出於本發明之目的，術語「發炎疾病」包括「自體免疫疾病」。如本文所用，術語「自體免疫性」通常理解為涵蓋涉及「自體抗原」之發炎性免疫介導之過程。在自體免疫疾病中，自體抗原引 發宿主免疫反應。

此外，本發明包括治療與組織移植物排斥相關之發炎。「移植排斥(Transplant rejection)」或「移植物排斥(graft rejection)」係指對抗移植物，包括(但不限於)HLA抗原、血型抗原及其類似物之任何由宿主發動之免疫反應。

本發明亦可用於治療移植物抗宿主疾病，諸如與例如骨髓移植相關之移植物抗宿主疾病。在此移植物抗宿主疾病中，供者骨髓包括淋巴細胞及成熟為淋巴細胞之細胞。供者之淋巴細胞識別接受者之抗原為非自體抗原且發動發炎性免疫反應。因此，如本文所用，「移植物抗宿主疾病」或「移植物抗宿主反應」係指任何T細胞介導之免疫反應，其中供者淋巴細胞與宿主之抗原反應。

本文所述之拮抗劑抗-CD40抗體或蛋白質，例如mAb1、mAb2或mAb3可根據本發明方法使用來治療自體免疫病症及/或發炎病症，包括(但不限於)全身性紅斑狼瘡症(SLE)、盤狀狼瘡、狼瘡腎炎、類肉瘤病(sarcoidosis)、發炎性關節炎(包括青少年關節炎、類風濕性關節炎、牛皮癬性關節炎、萊特氏症候群(Reiter's syndrome)、僵直性脊椎炎及痛風性關節炎)、器官或組織移植物排斥、超急性、急性或慢性排斥及/或移植物抗宿主疾病、多發性硬化症、高IgE症候群、結節性多動脈炎(polyarteritis nodosa)、原發性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis)、發炎性腸病、克羅恩氏病、乳糜瀉(celiac's disease)(麩質敏感性腸病)、原發性休格連氏症候群(pSS)、自體免疫肝炎、惡性貧血、自體免疫溶血性貧血、牛皮癬、硬皮病(scleroderma)、重症肌無力、自體免疫血小板減少性紫癜(autoimmune thrombocytopenic purpura)、自體免疫甲狀腺炎、格雷氏病(Grave's disease)、橋本氏甲狀腺炎(Hasimoto's thyroiditis)、免疫複合性疾病(immune complex disease)、慢性疲勞、免疫功能障礙症候群(CFIDS)、多發性肌炎及皮 肌炎、冷球蛋白血症(cryoglobulinemia)、血栓溶解、心肌病、尋常天疱瘡(pemphigus vulgaris)、肺間質纖維化(pulmonary interstitial fibrosis)、第I型及第II型糖尿病、第1、2、3及4型延遲型過敏、過敏或過敏性病症、對治療蛋白質之非所要/非意欲免疫反應(參見例如美國專利申請案第US 2002/0119151號及Koren，等人(2002)Curr.Pharm.Biotechnol.3：349-60)、哮喘、謝格-司托司症候群(Churg-Strauss syndrome)(過敏性肉芽腫(allergic granulomatosis))、異位性皮膚炎、過敏性及刺激性接觸性皮炎、蕁麻疹(urtecaria)、IgE介導之過敏、動脈粥樣硬化、ANCA相關血管炎、血管炎、特發性發炎性肌病、溶血性疾病、阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)、慢性發炎性脫髓鞘多發性神經病(chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy)及其類似病症。

先前已顯示遺傳切除或藥理學抑制CD40-CD154路徑在SLE、pSS、ITP、MS、克羅恩氏病、尋常天疱瘡、自體免疫血管炎及RA之臨床或臨床前模型中具有治療性益處(Law CL,Grewal IS.(2009).Adv.Exp.Med.Biol.2009；647：8-36)；以下詳述此舉之醫學需要。

在較佳實施例中，本發明抗-CD40抗體或蛋白質適用於治療：(i)全身性紅斑狼瘡症(狼瘡腎炎)，較佳提供有效誘導並維持緩解、及預防末期腎病之類固醇減量療法(steroid-sparing therapy)；(ii)原發性休格連氏症候群，較佳預防唾液腺及淚腺破壞及誘導並維持腺體外表現之緩解；(iii)自體免疫血小板減少性紫癜，較佳治療照護標準物難治癒之患者；(iv)ANCA相關血管炎，較佳在皮質類固醇及類固醇減量治療難治癒之患者中誘導並維持緩解；(v)尋常天疱瘡，較佳在皮質類固醇及類固醇減量治療難治癒之患者中誘導並維持緩解；(vi)多發性硬化症，較佳提供更有效防止復發及失能進展且達成無疾病狀態之治療；及(vii)克羅恩氏病，較佳提供更有效維持緩解及治療抗-TNF難 治癒之患者之療法。

在一些其他實施例中，本發明抗-CD40抗體或蛋白質適用於治療肺發炎，包括(但不限於)肺移植物排斥、哮喘、類肉瘤病、氣腫、囊腫性纖維化、特發性肺纖維化、慢性支氣管炎、過敏性鼻炎及肺之過敏性疾病(諸如過敏性肺炎)、嗜伊紅血球肺炎、歸因於骨髓及/或肺移植或其他原因之阻塞性細支氣管炎、移植物動脈粥樣硬化/移植物靜脈硬化、以及由膠原蛋白(collagen)疾病、血管疾病及自體免疫疾病(諸如類風濕性關節炎、硬皮病及紅斑狼瘡)引起之肺纖維化。

「治療」在本文中定義為向個體施用或投與本發明抗-CD40抗體或蛋白質，例如mAb1、mAb2或mAb3抗體，或向自個體分離之組織或細胞株施用或投與包含本發明之該抗-CD40抗體或蛋白質之醫藥組合物，其中該個體患有自體免疫疾病及/或發炎疾病、與自體免疫疾病及/或發炎疾病相關之症狀、或具有感染自體免疫疾病及/或發炎疾病之傾向，其中目的在於治癒、癒合、減輕、解除、改變、醫冶、改善、改良或影響該自體免疫疾病及/或發炎疾病、該自體免疫疾病及/或發炎疾病之任何相關症狀或感染該自體免疫疾病及/或發炎疾病之傾向。

就「治療」而言，其亦意欲向個體施用或投與包含本發明抗-CD40抗體或蛋白質，例如mAb1、mAb2或mAb3抗體之醫藥組合物，或向自個體分離之組織或細胞株施用或投與包含本發明之該抗-CD40抗體或蛋白質之醫藥組合物，其中該個體患有自體免疫疾病及/或發炎疾病、與自體免疫疾病及/或發炎疾病相關之症狀、或具有感染自體免疫疾病及/或發炎疾病之傾向，其中目的在於治癒、癒合、減輕、解除、改變、醫冶、改善、改良或影響該自體免疫疾病及/或發炎疾病、該自體免疫疾病及/或發炎疾病之任何相關症狀、或感染該自體免疫疾病及/或發炎疾病之傾向。

就「消炎活性」而言，其意欲減輕或預防發炎。使用至少一種本發明抗-CD40抗體或蛋白質之療法會引起就自體免疫疾病及/或發炎疾病之治療而言有益的生理反應，其中該疾病涉及表現CD40抗原之細胞。應認識到本發明方法可適用於防止細胞表型變化，諸如增殖、活化及其類似變化。

根據本發明方法，至少一種如本文在以上定義之本發明抗-CD40抗體或蛋白質用於促進就自體免疫疾病及/或發炎疾病之治療或預防而言為正性的治療性反應。

就自體免疫疾病及/或發炎疾病之「正性治療性反應」而言，其意欲與此等抗體或蛋白質之消炎活性相關之疾病改良、及/或與疾病相關之症狀之改良。亦即可觀測到抗增生效應；阻止CD40表現細胞進一步增殖；減輕發炎反應，包括(但不限於)減少發炎性細胞激素、黏著分子、蛋白酶、免疫球蛋白(在CD40攜帶細胞為B細胞之情況下)、其組合及其類似物分泌；增加消炎蛋白質產生；減少自體反應性細胞數目；增加免疫耐受性；抑制自體反應性細胞存活及/或減輕一或多種藉由刺激CD40表現細胞所介導之症狀。此等正性治療性反應不受投藥途徑限制且可包含向供者、供者組織(諸如器官灌注)、宿主、其任何組合及其類似物投藥。

臨床反應可使用篩檢技術評估，該等技術諸如磁共振成像(MRI)掃描、x射線成像、電腦斷層(CT)掃描、流動式細胞測量術或螢光活化之細胞揀選器(FACS)分析、組織學、宏觀病理學及血液化學，包括(但不限於)可藉由ELISA、RIA、層析及其類似方法偵測之變化。除此等正性治療性反應之外，經受使用本發明之拮抗劑抗-CD40抗體或蛋白質之療法的個體可體驗與疾病相關之症狀得以改良之有益效應。

就「治療有效劑量或量」或「有效量」而言，其意欲為當投與 本發明抗-CD40抗體或蛋白質時產生就治療患有自體免疫疾病及/或發炎疾病之個體而言為正性之治療性反應的量。

在本發明之一些實施例中，本發明抗-CD40抗體或蛋白質，例如mAb1、mAb2或mAb3之治療有效劑量在0.01mg/kg至40mg/kg、3mg/kg至20mg/kg，或7mg/kg至12mg/kg之範圍內。應認識到治療方法可包含單次投與治療有效劑量或多次投與治療有效劑量之本發明之拮抗劑抗-CD40抗體或蛋白質。

本發明之另一實施例為使用本發明抗-CD40抗體或蛋白質診斷性監測組織中之蛋白質含量作為臨床測試程序之一部分例如以確定既定治療方案之功效。可藉由使抗體偶合於可偵測物質來便於偵測。可偵測物質之實例包括各種酶、輔基、螢光物質、發光物質、生物發光物質及放射性物質。適合酶之實例包括辣根過氧化酶(horseradish peroxidase)、鹼性磷酸酯酶、P-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶；適合輔基複合物之實例包括抗生蛋白鏈菌素(streptavidin)/生物素及抗生物素蛋白(avidin)/生物素；適合螢光物質之實例包括傘酮(umbelliferone)、螢光素、異硫氰酸螢光素、若丹明(rhodamine)、二氯三嗪基胺螢光素、丹磺醯氯(dansyl chloride)或藻紅素(phycoerythrin)；發光物質之一實例包括魯米諾(luminol)；生物發光物質之實例包括螢光素酶(luciferase)、螢光素及水母素(aequorin)；且適合放射性物質之實例包括¹²⁵I、¹³¹I、³⁵S或³H。

本發明抗-CD40抗體或蛋白質，例如mAb1、mAb2或mAb3可與用於自體免疫及發炎疾病之任何已知療法組合使用，該等療法包括已知適用於或已用於或當前正用於治療自體免疫及發炎疾病之任何藥劑或藥劑組合。此等療法及治療劑包括(但不限於)手術或手術程序(例如脾切除術、淋巴結切除術、甲狀腺切除術、血漿去除術、白血球去除術、細胞、組織或器官移植、腸程序、器官灌注及其類似程序)、放 射療法、諸如類固醇療法及非類固醇療法之療法、激素療法、細胞激素療法、使用皮膚學藥劑(例如用於治療皮膚病狀，諸如過敏、接觸性皮炎及牛皮癬之表面藥劑)之療法、免疫抑制療法及其他消炎單株抗體療法及其類似療法。以此方式，本文所述之拮抗劑抗-CD40抗體或蛋白質與至少一種其他療法組合投與，該療法包括(但不限於)手術、器官灌注、放射療法、類固醇療法、非類固醇療法、抗生素療法、抗真菌療法、激素療法、細胞激素療法、使用皮膚學藥劑(例如用於治療皮膚病狀，諸如過敏、接觸性皮炎及牛皮癬之表面藥劑)之療法、免疫抑制療法、其他消炎單株抗體療法、其組合及其類似療法。

因此，當組合療法包含與投與另一治療劑組合投與(作為一實例，如與類固醇組合投與)本發明抗-CD40抗體或蛋白質，諸如mAb1、mAb2或mAb3抗體時，本發明方法涵蓋使用各別調配物或單一醫藥調配物進行共投與及以任一順序相繼投與。當本發明方法包含組合治療方案時，此等療法可同時給與，亦即本發明抗-CD40抗體或蛋白質並行投與或在與其他療法相同之時間範圍內投與(亦即該等療法並行進行，但本發明抗-CD40抗體或蛋白質不在與其他療法精確相同之時間投與)。或者，本發明抗-CD40抗體或本發明之蛋白質亦可在其他療法之前或之後投與。無論所治療個體對第一療法過程之反應是否有降低緩解或復發之可能性，皆可依序投與不同療法。

在本發明之一些實施例中，本發明抗-CD40抗體或蛋白質，例如mAb1、mAb2或mAb3抗體與免疫抑制藥物或消炎藥物組合投與，其中抗體或蛋白質及治療劑可以任一順序依序投與或同時(亦即並行或在相同時間範圍內)投與。可與本發明之拮抗性抗-CD40抗體或蛋白質，例如mAb1、mAb2或mAb3抗體組合投與之適合免疫抑制藥物之實例包括(但不限於)甲胺喋呤(methotrexate)、環磷醯胺 (cyclophosphamide)、咪唑立賓(mizoribine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、環孢素(cyclosporine)(諸如氣霧化環孢素(參見美國專利申請公開案第US 2002/0006901號))、他克莫司(tacrolimus)(FK506；ProGrafrM)、黴酚酸嗎啉乙酯(mycophenolate mofetil)及硫唑嘌呤(azathioprine)(6-巰基嘌呤)、西羅莫司(sirolimus)(雷帕黴素(rapamycin))、去氧斯匹胍素(deoxyspergualin)、來氟米特(leflunomide)及其丙二腈醯胺類似物；及免疫抑制蛋白質(包括例如抗-CTLA4抗體及Ig融合物、抗-B淋巴細胞刺激物抗體(例如LYMPHOSTAT-BTM)及Ig融合物(BLyS-Ig)、抗-CD80抗體及依那西普(etanercept)(Enbrel(RTM))，以及抗-T細胞抗體，諸如抗-CD3(OKT3)、抗-CD4及其類似物。適合消炎劑之實例包括(但不限於)皮質類固醇，諸如氯倍他索(clobetasol)、氯倍他索(halobetasol)、氫皮質酮(hydrocortisone)、曲安西龍(triamcinolone)、倍他米松(betamethasone)、氟新諾龍(fluocinole)、氟西奈德(fluocinonide)、潑尼松(prednisone)、潑尼龍(prednisolone)、甲潑尼龍(methylprednisolone)；非類固醇消炎藥物(NSAID)，諸如柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、含有美沙胺(mesalamine)之醫藥(稱為5-ASA藥劑)、塞內昔布(celecoxib)、雙氯芬酸(diclofenac)、依託度酸(etodolac)、非諾洛芬(fenprofen)、氟比洛芬(flurbiprofen)、布洛芬(ibuprofen)、酮洛芬(ketoprofen)、甲氯滅酸(meclofamate)、美洛昔康(meloxicam)、萘丁美酮(nabumetone)、萘普生(naproxen)、奧沙普嗪(oxaprozin)、吡羅昔康(piroxicam)、羅非昔布(rofecoxib)、水楊酸酯(salicylate)、舒林酸(sulindac)及托美丁(tolmetin)；磷酸二酯酶-4抑制劑；消炎抗體，諸如阿達木單抗(adalimumab)(HUMERA(RTM)，一種TNF-α拮抗劑)及英利昔單抗(infliximab)(雷米卡德(Remicade)，一種TNF-α拮抗劑)及其類似物。亦包括當前或可能用於治療自體免疫疾病之免疫調節劑，諸如沙 立度胺(thalidomide)或其類似物，諸如來那度胺(lenalidomide)。

移植物排斥及移植物抗宿主疾病可為超急性(體液性)、急性(T細胞介導)或慢性(未知病因)或其組合。因此，在一些實施例中，本發明抗-CD40抗體或蛋白質，例如mAb1、mAb2或mAb3抗體用於預防及/或改善排斥及/或與任何組織(包括(但不限於)肝、腎、胰臟、胰島細胞、小腸、肺、心臟、角膜、皮膚、血管、骨、異源或自體骨髓及其類似組織)之超急性、急性及/或慢性移植物排斥相關之症狀。移植物組織可自任何供者獲得且移植入任何接受宿主中，且因此移植程序可包含將動物組織移植至人類中(例如異種移植物)、將來自一人之組織移植至另一人中(例如同種異體移植物)，及/或將來自人體之一部分之組織移植至另一部分中(例如自體移植物)。

用本發明抗體或蛋白質進行治療亦可減少移植後遺症，諸如發熱、厭食症、血液動力學異常、白血球減少症、白血球浸潤經移植器官/組織以及機會性感染。

在一些實施例中，本發明抗-CD40抗體或蛋白質，例如mAb1、mAb2或mAb3抗體可單獨或與免疫抑制藥物組合使用來治療及/或預防移植物排斥，諸如超急性、急性及/或慢性排斥及/或移植物抗宿主疾病。

因此，在本發明抗-CD40抗體或蛋白質用於治療移植物排斥之一些實施例中，例如mAb1、mAb2或mAb3抗體之抗體可與適合免疫抑制藥物組合使用，該等免疫抑制藥物包括(但不限於)甲胺喋呤；環磷醯胺；咪唑立賓；苯丁酸氮芥；環孢素，諸如氣霧化環孢素(參見美國專利申請公開案第US 20020006901號)；他克莫司(FK506；ProGrafm)；黴酚酸嗎啉乙酯；及硫唑嘌呤(6-巰基嘌呤)；西羅莫司(雷帕黴素)；去氧斯匹胍素；來氟米特及其丙二腈醯胺類似物；免疫調節劑，包括例如沙立度胺及其類似物；及免疫抑制蛋白質(包括例 如抗-CTLA抗體及Ig融合物、抗-B淋巴細胞刺激物抗體(例如LYMPHOSTAT-BTM)及Ig融合物(BLyS-Ig)、抗-CD80抗體及依那西普(Enbrel(RTM))，以及抗-T細胞抗體，諸如抗-CD3(OKT3)、抗-CD4及其類似物。

因而，特定涵蓋的是本發明之組合物及方法與其他藥物組合使用以進一步改良移植物接受者，諸如接受例如肺或腎移植物之接受者中之症狀及結果。因此，在一些實施例中，本發明抗-CD40抗體或蛋白質，例如mAb1、mAb2或mAb3抗體單獨或與非經腸及/或經腸投與之環孢素，包括例如經口環孢素、可注射環孢素、氣霧化(例如吸入)環孢素及其組合組合用於治療移植物排斥(諸如肺或腎移植物接受者中之超急性、急性及/或慢性排斥或移植物抗宿主疾病)。在療法之至少一種組分為氣霧化環孢素之一些實施例中，環孢素係藉由使用例如加壓傳遞裝置或噴霧器，吸入呈氣霧劑噴霧形式之環孢素而傳遞至接受者之肺中。環孢素可以乾燥粉末或濕潤形式投與。環孢素可以次治療劑量投與。

在一些其他實施例中，本發明抗-CD40抗體或蛋白質，例如mAb1、mAb2或mAb3抗體可單獨或與免疫抑制藥物組合使用來治療及/或預防類風濕性關節炎。因此，在本發明抗-CD40抗體或蛋白質，例如mAb1、mAb2或mAb3抗體用於治療類風濕性關節炎之一些實施例中，該等抗體或蛋白質可與適合免疫抑制藥物組合使用，該等藥物包括(但不限於)甲胺喋呤、環磷醯胺、咪唑立賓、苯丁酸氮芥、環孢素、他克莫司(FK506；PROGRAFTM)、黴酚酸嗎啉乙酯及硫唑嘌呤(6-巰基嘌呤)、西羅莫司(雷帕黴素)、去氧斯匹胍素、來氟米特及其丙二腈醯胺類似物；及免疫抑制蛋白質(包括例如抗-CTLA抗體及Ig融合物、抗-B淋巴細胞刺激物抗體(例如LYMPHOSTAT-BTM)及Ig融合物(BLyS-Ig)、抗-CD20抗體(例如RITUXAN(g))；完全人類抗體 HuMax-CD20、R-1594、IMMU-106、TRU-015、AME-133、托西莫單抗(tositumomab)/1-131、托西莫單抗(Bexxar(D))，替伊莫單抗(ibritumomab tituxetan)(Zcvalin(RTM))；抗-CD80抗體及依那西普(ENBREL)，以及抗-T細胞抗體，諸如抗-CD3(OKT3)、抗-CD4及其類似物。如上所論述，治療有效性可使用任何手段評估且包括(但不限於)如藉由美國風濕病學學會(American College of Rheumatology)準則、歐洲風濕病聯合會(European League of Rheumatism)準則或任何其他準則規定之臨床反應量測之有效性。參見例如Felson等人(1995)Arthritis.Rheum.38：727-35及van Gestel等人(1996)Arthritis Rheum.39：34-40。

在其他實施例中，本發明抗-CD40抗體或蛋白質，例如mAb1、mAb2或mAb3抗體可單獨或與免疫抑制藥物組合使用來治療及/或預防多發性硬化症。因此，在本發明抗-CD40抗體或蛋白質，例如mAb1、mAb2或mAb3抗體用於治療多發性硬化症之一些實施例中，抗體可與適合免疫抑制藥物組合使用，該等藥物包括(但不限於)甲胺喋呤、環磷醯胺、咪唑立賓、苯丁酸氮芥、環孢素、他克莫司(FK506；PROGRAFTM)、黴酚酸嗎啉乙酯及硫唑嘌呤(6-巰基嘌呤)、西羅莫司(雷帕黴素)、去氧斯匹胍素、來氟米特及其丙二腈醯胺類似物；及免疫抑制蛋白質(包括例如抗-CTLA抗體及Ig融合物、抗-B淋巴細胞刺激物抗體(例如LYMPHOSTAT-BTM)及Ig融合物(BLyS-Ig)、抗-CD20抗體(例如RITUXAN(D))；完全人類抗體HuMax-CD20、R-1594、IMMIJ-106、TRU-015、AME-133、托西莫單抗/1-131、托西莫單抗(Bexxar(RTM))，替伊莫單抗(Zevalin(RTM))；抗-CD80抗體及依那西普(ENBREL)，以及抗-T細胞抗體，諸如抗-CD3(OKT3)、抗-CD4，S1P受體調節中所涉及之藥劑(包括例如芬戈莫德(fingolimod))及其類似物。

醫藥調配物及投藥模式

本發明抗-CD40抗體或蛋白質係在治療上有效預防或治療自體免疫疾病及/或發炎疾病及/或預防移植中之移植物排斥或降低與其相關之風險的濃度下投與。

為達成此目的，抗體可使用此項技術中已知之多種可接受之賦形劑加以調配。通常，抗體或蛋白質係藉由注射，例如靜脈內、腹膜內或皮下注射投與。達成此投藥之方法為一般技術者所知。亦有可能獲得可表面或經口投與或可能夠跨越黏膜傳送之組合物。

視所投與之抗-CD40抗體或蛋白質而定，靜脈內投藥較佳藉由歷經約1小時至約10小時、更佳歷經約1小時至約8小時、甚至更佳歷經約2小時至約7小時、還要更佳歷經約4小時至約6小時之時期輸注進行。用醫藥組合物進行之初始輸注可歷經約4至約6小時之時期提供，隨後輸注傳遞更快。隨後輸注可歷經約1至約6小時，包括例如約1至約4小時、約1至約3小時或約1至約2小時之時期投與。

本發明之醫藥組合物經調配以與其預定投藥途徑相容。可能之投藥途徑之實例包括非經腸(例如靜脈內(IV)、肌肉內(IM)、皮內、皮下(SC)或輸注)、經口及經肺(例如吸入)、經鼻、經皮(表面)、經黏膜及經直腸投藥。用於非經腸、皮內或皮下用藥之溶液或懸浮液可包括下列組分：無菌稀釋劑，諸如注射用水、生理鹽水溶液、不揮發性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶液；抗細菌劑，諸如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，諸如乙二胺四乙酸；緩衝劑，諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；及張力調整劑，諸如氯化鈉或右旋糖。pH值可用諸如鹽酸或氫氧化鈉之酸或鹼來調整。非經腸製劑可密封在由玻璃或塑料製成之安瓿、拋棄式注射器或多劑量小瓶中。

本發明抗-CD40抗體或蛋白質通常藉由標準技術在醫藥學上可接 受之緩衝液，例如無菌生理鹽水、無菌緩衝水、丙二醇、以上各物之組合等內提供。製備可非經腸投與之藥劑之方法描述於Remington's Pharmaceutical Sciences(第18版；Mack Publishing Company,Eaton,Pennsylvania,1990)中。亦參見例如WO 98/56418，其描述適用於本發明方法中之穩定化抗體醫藥調配物。

一般技術者容易確定欲投與之至少一種本發明拮抗劑抗-CD40抗體或蛋白質的量。影響至少一種拮抗劑抗-CD40抗體或蛋白質之投藥模式及各別量之因素包括(但不限於)經受療法之特定疾病、疾病之嚴重性、疾病之病史及經受療法之個體之年齡、身高、體重、健康及身體狀況。類似地，欲投與之拮抗劑抗-CD40抗體或蛋白質之量將取決於投藥模式及個體將經受單次劑量抑或多次劑量之此藥劑。一般而言，較佳的是抗-CD40抗體或蛋白質之劑量隨經受療法之患者之體重增加而增大。欲投與之抗-CD40抗體或蛋白質之劑量在約0.003mg/kg至約50mg/kg之範圍內，較佳在0.01mg/kg至約40mg/kg之範圍內。

因此，舉例而言，劑量可為0.01mg/kg、0.03mg/kg、0.1mg/kg、0.3mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、5mg/kg、7mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg或50mg/kg。

在本發明之另一實施例中，方法包含投與多次劑量之拮抗劑抗-CD40抗體或其片段。方法可包含投與1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40次或40次以上治療有效劑量之包含拮抗劑抗-CD40抗體或其片段之醫藥組合物。熟習此項技術者容易確定投與多次劑量之包含抗-CD40抗體或蛋白質之醫藥組合物的頻率及持續時間。此外，用治療有效量之抗體或蛋白質治療個體可包括單次治療，或較佳地，可包括一系列治療。在一較佳實例中，用在每公斤體 重介於約0.1至20mg之間之範圍內的本發明之拮抗劑抗-CD40抗體或蛋白質，每週一次持續介於約1至10週之間、較佳介於約2至8週之間、更佳介於約3至7週之間、且甚至更佳持續約4、5或6週來治療個體。治療可每年進行一次以防止復發或一旦有復發跡象即進行。亦應瞭解用於治療之抗體或其抗原結合片段之有效劑量可在特定治療過程中增加或減小。劑量變化可起於如本文所述之診斷性分析之結果且根據如本文所述之診斷性分析之結果而變得顯而易知。

因此，在一個實施例中，給藥方案包括在治療期之第1、7、14及21天進行治療有效劑量之至少一種本發明抗-CD40抗體或蛋白質的第一投藥。在另一實施例中，給藥方案包括在治療期中一週之第1、2、3、4、5、6及7天進行治療有效劑量之至少一種本發明抗-CD40抗體或蛋白質的第一投藥。其他實施例包括在治療期中一週之第1、3、5及7天進行治療有效劑量之至少一種本發明抗-CD40抗體或蛋白質的第一投藥之給藥方案；包括在治療期中一週之第1及3天進行治療有效劑量之至少一種本發明抗-CD40抗體或蛋白質的第一投藥之給藥方案；及包括在治療期中一週之第1天進行治療有效劑量之至少一種本發明抗-CD40抗體或蛋白質的第一投藥之較佳給藥方案。治療期可包含1週、2週、3週、1個月、3個月、6個月或1年。治療期可彼此相繼或相隔1天、1週、2週、1個月、3個月、6個月或1年。範圍為0.003mg/kg至50mg/kg、0.01mg/kg至40mg/kg、0.01mg/kg至30mg/kg、0.1mg/kg至30mg/kg、0.5mg/kg至30mg/kg、1mg/kg至30mg/kg、3mg/kg至30mg/kg、3mg/kg至25mg/kg、3mg/kg至20mg/kg、5mg/kg至15mg/kg或7mg/kg至12mg/kg。因此，舉例而言，任一拮抗劑抗-CD40抗體或其抗原結合片段，例如本發明之抗-CD40單株抗體或蛋白質之劑量可為0.003mg/kg、0.01mg/kg、0.03mg/kg、0.1mg/kg、0.3mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kg、3 mg/kg、5mg/kg、7mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、或屬於0.003mg/kg至50mg/kg之範圍之其他此等劑量。在抗體給藥之各週可始終投與相同治療有效劑量之本發明抗-CD40抗體或蛋白質。

或者，可在治療期之過程中使用不同治療有效劑量之本發明拮抗劑抗-CD40抗體或蛋白質。

在一些實施例中，如本文中別處定義之拮抗劑抗-CD40抗體或其抗原結合片段的初始治療有效劑量可在較低劑量範圍(亦即0.003mg/kg至20mg/kg)內，隨後劑量屬於較高劑量範圍(亦即20mg/kg至50mg/kg)。

在替代性實施例中，如本文中別處定義之拮抗劑抗-CD40抗體或其抗原結合片段的初始治療有效劑量可在較高劑量範圍(亦即20mg/kg至50mg/kg)內，隨後劑量屬於較低劑量範圍(亦即0.003mg/kg至20mg/kg)。因此，在一個實施例中，拮抗劑抗-CD40抗體或其抗原結合片段之初始治療有效劑量為20mg/kg至35mg/kg，包括約20mg/kg、約25mg/kg、約30mg/kg及約35mg/kg，且本發明拮抗劑抗-CD40抗體或蛋白質之隨後治療有效劑量為約5mg/kg至約15mg/kg，包括約5mg/kg、8mg/kg、10mg/kg、12mg/kg及約15mg/kg。

在本發明之一些實施例中，抗-CD40療法藉由向需要抗-CD40療法之個體投與「起始劑量」之本發明抗體或蛋白質起始。就「起始劑量」而言，其意欲為向個體投與之本發明抗-CD40抗體或蛋白質的初始劑量，其中投與之本發明抗體或蛋白質的劑量屬於較高劑量範圍(亦即約20mg/kg至約50mg/kg)。「起始劑量」可以單次投藥形式，例如抗體或其抗原結合片段係IV投與之單次輸注投與，或以多次投藥形式，例如抗體或其抗原結合片段係IV投與之多次輸注投與，只要在約24小時時期內投與全部「起始劑量」即可。在投與「起始劑量」之 後，個體接著被投與一或多次其他治療有效劑量之本發明抗-CD40抗體或蛋白質。隨後治療有效劑量可例如根據每週一次給藥時程，或每兩週一次、每三週一次或每四週一次加以投與。在此等實施例中，隨後治療有效劑量通常屬於較低劑量範圍(亦即0.003mg/kg至20mg/kg)。

或者，在一些實施例中，在「起始劑量」之後，根據「維持時程」投與隨後治療有效劑量之本發明抗-CD40抗體或蛋白質，其中本發明抗體或蛋白質之治療有效劑量一月一次、每6週一次、每兩個月一次、每10週一次、每3個月一次、每14週一次、每4個月一次、每18週一次、每5個月一次、每22週一次、每6個月一次、每7個月一次、每8個月一次、每9個月一次、每10個月一次、每11個月一次或每12個月一次加以投與。在此等實施例中，本發明抗-CD40抗體或蛋白質之治療有效劑量屬於較低劑量範圍(亦即0.003mg/kg至約20mg/kg)，特別當隨後劑量在較為頻繁的間隔，例如每兩週一次至每月一次下投與時；或屬於較高劑量範圍(亦即20mg/kg至50mg/kg)，特別當隨後劑量在不太頻繁的間隔下投與時，例如當隨後劑量相隔1個月至12個月投與時。

包含具有本文所述之所要功能性質之本發明抗-CD40抗體或蛋白質作為治療活性組分之任何醫藥組合物可用於本發明方法中。因此，包含一或多種本發明抗-CD40抗體或蛋白質，例如mAb1、mAb2或mAb3抗體之液體、凍乾或噴霧乾燥組合物可製備成水性或非水性溶液或懸浮液以供隨後根據本發明方法向個體投與。

每一此等組合物將包含至少一種本發明抗-CD40抗體或蛋白質作為治療或防治活性組分。

就「治療或防治活性組分」而言，其意欲本發明抗-CD40抗體或蛋白質特定併入組合物中以當向個體投與醫藥組合物時產生為治療、 預防或診斷彼個體內之疾病或病狀所要之治療性或防治性反應。較佳地，醫藥組合物包含適當穩定劑、增積劑或兩者以使與在製備及儲存期間蛋白質穩定性及生物活性喪失相關之問題最少。

調配劑可添加至包含本發明抗-CD40抗體或蛋白質之醫藥組合物中。此等調配劑可包括(但不限於)油、聚合物、維生素、碳水化合物、胺酸、鹽、緩衝劑、白蛋白、界面活性劑或增積劑。較佳地，碳水化合物包括糖或糖醇，諸如單醣、雙醣或多醣，或水溶性葡聚糖。醣或葡聚糖可包括果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麥芽糖、蔗糖、葡聚糖、普魯蘭(pullulan)、糊精、α及β環糊精、可溶性澱粉、羥乙基澱粉及羧甲基纖維素或其混合物。

「糖醇」定義為具有羥基之C₄至C₈烴且包括半乳糖醇、肌醇、甘露糖醇、木糖醇、山梨糖醇、甘油及阿拉伯糖醇。此等糖或糖醇可個別使用或組合使用。糖或糖醇濃度可介於1.0%與7% w/v之間、更佳介於2.0%與6.0% w/v之間。舉例而言，胺基酸包括左旋(L)形式之肉鹼、精胺酸及甜菜鹼；然而，可添加其他胺基酸。較佳聚合物包括平均分子量介於2,000與3,000之間的聚乙烯吡咯啶酮(PVP)，或平均分子量介於3,000與5,000之間的聚乙二醇(PEG)。可添加至調配物中之界面活性劑展示於EP第270,799號及第268,110號中。

另外，抗體可藉由共價結合於聚合物而經化學修飾以例如增加其循環半衰期。較佳聚合物及使其連接於肽之方法展示於美國專利第4,766,106號；第4,179,337號；第4,495,285號；及第4,609,546號中。較佳聚合物為聚氧乙烯化多元醇及聚乙二醇(PEG)。PEG在室溫下可溶於水中且具有通式：R(O--CH2--CH2)n O--R，其中R可為氫或保護基，諸如烷基或烷醇基。較佳地，保護基具有介於1個與8個之間的碳，更佳地，其為甲基。符號n為正整數，較佳介於1與1,000之間、更佳介於2與500之間。PEG具有介於1,000與40,000之間、更佳介於 2,000與20,000之間、最佳介於3,000與12,000之間的較佳平均分子量。較佳地，PEG具有至少一個羥基，更佳地，其為末端羥基。此羥基較佳經活化以與抑制劑上之游離胺基反應。然而，應瞭解反應性基團之類型及量可變化以獲得共價結合之PEG/本發明抗體。

水溶性聚氧乙烯化多元醇亦適用於本發明中。

其包括聚氧乙烯化山梨糖醇、聚氧乙烯化葡萄糖、聚氧乙烯化甘油(POG)及其類似物。POG較佳。一個原因係因為聚氧乙烯化甘油之甘油骨架為單酸甘油酯、二酸甘油酯、三酸甘油酯中之天然產生於例如動物及人類中的相同骨架。因此，此分支部分在體內未必會被視為外來介質(foreign agent)。POG較佳分子量與PEG在相同範圍內。POG之結構展示於Knauf等人(1988,J.Bio.Chem.263：15064-15070)中且POG/IL-2結合物之論述可見於美國專利第4,766,106號中。

用於增加循環半衰期之另一藥物傳遞系統為脂質體。

製備脂質體傳遞系統之方法論述於Gabizon等人(1982)Cancer Research 42：4734；Cafiso(1981)Biochem Biophys Acta 649：129；及Szoka(1980)Ann.Rev.Bioplays.Eng.9：467中。其他藥物傳遞系統在此項技術中為已知的且描述於例如Poznansky等人(1980)Drug Delivery Systems(R.L.Juliano編，Oxford,N.Y.)第253-315頁；Poznansky(1984)Pharm Revs 36：277中。

欲併入醫藥組合物中之調配劑應供給本發明拮抗劑抗-CD40抗體或蛋白質穩定性。亦即本發明抗-CD40抗體或蛋白質應保留其物理及/或化學穩定性且具有所要功能性質，亦即一或多種上文定義之所要功能性質。

監測蛋白質穩定性之方法在此項技術中為熟知的。參見例如Jones(1993)Adv.Drug Delivery Rev.10：29-90；Lee編(1991)Peptide and Protein Drug Delivery(Marcel Dekker,Inc.,New York,New York)；且穩定性分析揭示於下文中。一般而言，在所選溫度下持續一段指定時期量測蛋白質穩定性。在較佳實施例中，當在室溫(約25℃)下儲存至少1個月、至少3個月或至少6個月時，穩定抗體醫藥調配物供給本發明拮抗劑抗-CD40抗體或蛋白質穩定性，及/或在約2-8℃下持續至少6個月、至少9個月、至少12個月、至少18個月、至少24個月穩定。

當諸如抗體之蛋白質調配於醫藥組合物中時，若其不展示目視跡象(亦即變色或澄清度損失)或可測得之沈澱、聚集及/或變性跡象(例如使用尺寸排阻層析(SEC)或紫外光散射量測)，則該蛋白質視為在既定時間點保留其物理穩定性。就化學穩定性而言，當諸如抗體之蛋白質調配於醫藥組合物中時，若化學穩定性之量測結果指示蛋白質(亦即抗體)在彼醫藥組合物中保留相關生物活性，則該蛋白質視為在既定時間點保留其化學穩定性。監測化學穩定性變化之方法在此項技術中為熟知的且包括(但不限於)使用例如SDS-PAGE、SEC及/或基質輔助雷射脫附離子化法/飛行時間質譜分析來偵測蛋白質諸如由剪短產生之化學形式改變的方法；及使用例如離子交換層析偵測與分子電荷變化相關(例如與脫醯胺作用相關)之降解的方法。參見例如下文揭示之方法。

當本發明抗-CD40抗體或蛋白質調配於醫藥組合物中時，若如在所要生物活性之適合分析中所測定，既定時間點之所要生物活性在製備醫藥組合物時所展現之所要生物活性的約30%、較佳約20%內，則本發明抗-CD40抗體或蛋白質視為在彼時間保留所要生物活性。量測本文揭示之拮抗劑抗-CD40抗體或蛋白質之所要生物活性的分析可如本文實例中所述進行。亦參見Schutze等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：8200-8204；Denton等人(1998)Pediatr Transplant.2：6-15；Evans等人(2000)J：Immunol.164：688-697；Noelle(1998) Agents Actions增刊49：17-22；Lederman等人(1996)Curr Opin.Hematol.3：77-86；Coligan等人(1991)CurrentProtocols in Immunology 13：12；Kwekkeboom等人(1993)Immunology 79：439-444；及美國專利第5,674,492號及第5,847,082號中所述之分析。

在本發明之一些實施例中，將例如在mAb1-mAb3重組抗體中選擇之抗-CD40抗體調配於液體醫藥調配物中。本發明抗-CD40抗體或蛋白質可使用此項技術中已知之任何方法，包括上文揭示之彼等方法製備。在一個實施例中，例如在mAb1-mAb3抗體中選擇之抗-CD40抗體係在CHO細胞株中重組產生。

在製備並純化抗-CD40抗體之後，其可以本文闡述之方式調配成液體醫藥調配物。當拮抗劑抗-CD40抗體欲在其調配之前儲存時，其可例如在-20℃下冷凍，且接著在室溫下解凍以進一步調配。

液體醫藥調配物包含治療有效量之本發明抗-CD40抗體或蛋白質，例如mAb1、mAb2或mAb3抗體。抗體存在於調配物中之量需考慮投藥途徑及所要劑量體積。

以此方式，液體醫藥組合物包含濃度為0.1mg/ml至300.0mg/ml、1.0mg/ml至200mg/ml、5.0mg/ml至100.0mg/ml、7.5mg/ml至50mg/ml、或15.0mg/ml至25.0mg/ml之抗-CD40抗體，例如mAb1、mAb2或mAb3抗體。

液體醫藥組合物包含抗-CD40抗體(例如mAb1、mAb2或mAb3抗體)及維持調配物之pH值在pH 5.0至pH 7.0之範圍內的緩衝劑。

維持液體抗-CD40抗體調配物之pH值在約pH 5.0至約pH 7.0之範圍內之任何適合緩衝劑皆可用於調配物中，只要如上文指示之抗體之物理化學穩定性及所要生物活性得以保留即可。適合緩衝劑包括(但不限於)習知酸及其鹽，其中相對離子可為例如鈉、鉀、銨、鈣或鎂。可用於緩衝醫藥液體調配物之習知酸及其鹽之實例包括(但不限 於)丁二酸或丁二酸鹽、組胺酸或組胺酸鹽酸鹽、檸檬酸或檸檬酸鹽、乙酸或乙酸鹽、酒石酸或酒石酸鹽、磷酸或磷酸鹽、葡萄糖酸或葡萄糖酸鹽、麩胺酸或麩胺酸鹽、天冬胺酸或天冬胺酸鹽、順丁烯二酸或順丁烯二酸鹽，及蘋果酸或蘋果酸鹽緩衝劑。調配物內之緩衝劑濃度可為1mM至50mM，包括約1mM、2mM、5mM、8mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM，或為在1mM至50mM之範圍內之其他此等值。

在本發明之一些實施例中，液體醫藥調配物包含治療有效量之抗-CD40抗體(例如mAb1、mAb2或mAb3抗體)及濃度可維持調配物之pH值在約pH 5.0至pH 7.0之範圍內的丁二酸鹽緩衝劑或檸檬酸鹽緩衝劑或組胺酸緩衝劑或組胺酸鹽酸鹽緩衝劑。就「丁二酸鹽緩衝劑」或「檸檬酸鹽緩衝劑」而言，其意欲為分別包含丁二酸之鹽或檸檬酸之鹽的緩衝劑。就「組胺酸緩衝劑」而言，其意欲為包含胺基酸組胺酸之鹽的緩衝劑。

在一較佳實施例中，緩衝劑為組胺酸緩衝劑，例如組胺酸鹽酸鹽。如上所指示，調配物內之組胺酸緩衝劑濃度可為1mM至50mM，包括約1mM、2mM、5mM、8mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM，或為在1mM至50mM之範圍內之其他此等值。

在一較佳實施例中，丁二酸鹽或檸檬酸鹽相對離子為鈉陽離子，且因此緩衝劑分別為丁二酸鈉或檸檬酸鈉。然而，預期任何陽離子皆有效。其他可能之丁二酸鹽或檸檬酸鹽陽離子包括(但不限於)鉀、銨、鈣及鎂。如上所指示，調配物內之丁二酸鹽或檸檬酸鹽緩衝劑濃度可為1mM至50mM，包括約1mM、2mM、5mM、8mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM，或為在1mM至50mM之範圍內之其他此等值。

在其他實施例中，液體醫藥調配物包含濃度為0.1mg/ml至300.0mg/ml、或1.0mg/ml至200mg/ml、5.0mg/ml至100.0mg/ml、7.5mg/ml至50mg/ml或15.0mg/ml至25.0mg/ml之拮抗劑抗-CD40抗體，例如mAb1、mAb2或mAb3抗體；及濃度為1mM至50mM、5mM至40mM、10mM至35mM、較佳約30mM之組胺酸或丁二酸鹽或檸檬酸鹽緩衝劑，例如丁二酸鈉或檸檬酸鈉緩衝劑或組胺酸鹽酸鹽。

當需要液體醫藥調配物接近等張時，包含治療有效量之本發明抗-CD40抗體或蛋白質(例如mAb1、mAb2或mAb3抗體)及欲維持調配物之pH值在約pH 5.0至約pH 7.0之範圍內之緩衝劑的液體醫藥調配物可另外包含足以致使調配物接近等張之一定量之等張劑。就「接近等張」而言，其意欲水性調配物之容積莫耳滲透濃度為240mmol/kg至800mmol/kg、較佳約240至約600mmol/kg、更佳約240至約440mmol/kg、更佳約250至約330mmol/kg、甚至更佳約260至約320mmol/kg、還要更佳約270至約310mmol/kg。

測定溶液等張性之方法為熟習此項技術者所知。參見例如Setnikar等人(1959)J.Am.Pharm.Assoc.48：628。熟習此項技術者熟悉多種醫藥學上可接受之適用於在醫藥組合物中提供等張性的溶質。等張劑可為能夠調整本發明之液體醫藥調配物之滲透壓至近乎等於體液滲透壓之值的任何試劑。需要使用生理學上可接受之等張劑。

因此，包含治療有效量之拮抗劑抗-CD40抗體(例如mAb1、mAb2或mAb3抗體)及欲維持調配物之pH值在約pH 5.0至約pH 7.0之範圍內之緩衝劑的液體醫藥調配物可另外包含可用於提供等張性之組分，例如氯化鈉；胺基酸，諸如丙胺酸、纈胺酸及甘胺酸；糖及糖醇(多元醇)，包括(但不限於)葡萄糖、右旋糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、甘露糖醇、海藻糖、甘油、山梨糖醇及木糖醇；乙酸；其他有機酸或其鹽，及相對少量之檸檬酸鹽或磷酸鹽。一般技術者將瞭解適於供給液體調 配物最佳張力之其他試劑。

在一些較佳實施例中，包含治療有效量之抗-CD40抗體(例如mAb1、mAb2或mAb3抗體)及欲維持調配物之pH值在約pH 5.0至約pH 7.0之範圍內之緩衝劑的液體醫藥調配物另外包含氯化鈉作為等張劑。

調配物中氯化鈉之濃度將視其他組分對張力之貢獻而定。在一些實施例中，氯化鈉之濃度為50mM至300mM。在一個此實施例中，氯化鈉之濃度為約150mM。在其他此等實施例中，氯化鈉之濃度為約150mM，緩衝劑為濃度為5mM至15mM之丁二酸鈉或檸檬酸鈉緩衝劑，液體醫藥調配物包含治療有效量之本發明抗-CD40抗體或蛋白質，例如mAb1、mAb2或mAb3抗體，且調配物之pH值為5.0至7.0。

在其他實施例中，液體醫藥調配物包含濃度為0.1mg/ml至50.0mg/ml或5.0mg/ml至25.0mg/ml之本發明抗-CD40抗體或蛋白質(例如mAb1、mAb2或mAb3抗體)、約150mM氯化鈉，及約10mM、20mM、30mM、40mM或50mM丁二酸鈉或檸檬酸鈉，pH值為約pH 5.5。

歸因於本發明之液體醫藥調配物加工期間凍融或機械剪切之蛋白質降解可藉由將界面活性劑併入調配物中以降低溶液-空氣界面處之表面張力來加以抑制。因此，在一些實施例中，液體醫藥調配物包含治療有效量之本發明抗-CD40抗體或蛋白質(例如mAb1、mAb2或mAb3抗體)、欲維持調配物之pH值在約pH 5.0至約pH 7.0之範圍內之緩衝劑，且另外包含界面活性劑。在其他實施例中，液體醫藥調配物包含治療有效量之本發明抗-CD40抗體或蛋白質(例如mAb1、mAb2或mAb3抗體)、欲維持調配物之pH值在約pH 5.0至約pH 7.0之範圍內之緩衝劑、濃度為約50mM至約300mM之等張劑(諸如氯化鈉)，且另外 包含界面活性劑。

所採用之典型界面活性劑為非離子界面活性劑，包括聚氧乙烯山梨糖醇酯，諸如聚山梨醇酯80(吐溫80(Tween 80))及聚山梨醇酯20(吐溫20)；聚氧丙烯-聚氧乙烯酯，諸如普洛尼克F68(Pluronic F68)；聚氧乙烯醇(polyoxyethylene alcohol)，諸如Brij 35；聚二甲矽氧烷；聚乙二醇，諸如PEG400；溶血磷脂醯膽鹼；及聚氧乙烯-對第三辛基苯酚，諸如曲通X-100(Triton X-100)。

界面活性劑或乳化劑對醫藥的經典穩定化描述於例如Levine等人(1991)J.Parenteral Sci.Technol.45(3)：160-165中，其以引用的方式併入本文中。用於本發明之實踐中之一較佳界面活性劑為聚山梨醇酯80。當包括界面活性劑時，其通常以0.001%至1.0%(w/v)之量添加。

因此，在一些實施例中，液體醫藥調配物包含治療有效量之本發明抗-CD40抗體或蛋白質，例如mAb1、mAb2或mAb3抗體，緩衝劑為濃度為1mM至50mM、3mM至40mM、或5mM至35mM、或7.5mM至30mM之丁二酸鈉或檸檬酸鈉或組胺酸緩衝劑或組胺酸鹽酸鹽緩衝劑；調配物具有pH 5.0至pH 7.0之pH值；且調配物另外以0.001%至1.0%或0.001%至0.5%之量包含界面活性劑，例如聚山梨醇酯80。此等調配物可視情況包含濃度為50mM至300mM、50mM至200mM，或50mM至150mM之等張劑，諸如氯化鈉。

在其他實施例中，液體醫藥調配物包含濃度為0.1mg/ml至200.0mg/ml或1mg/ml至100.0mg/ml或2mg/ml至50.0mg/ml或5.0mg/ml至25.0mg/ml，包括約20.0mg/ml之本發明抗-CD40抗體或蛋白質，例如mAb1、mAb2或mAb3抗體；50mM至200mM氯化鈉，包括約150mM氯化鈉；5mM至20mM之丁二酸鈉或檸檬酸鈉，包括約10mM丁二酸鈉或檸檬酸鈉；濃度為50mM至200mM之氯化鈉，包括約150mM氯化鈉；濃度為5mM至50mM之組胺酸或組胺酸鹽酸鹽，包括約30mM 組胺酸或組胺酸鹽酸鹽；及視情況量為0.001%至1.0%，包括0.001%至0.5%之界面活性劑，例如聚山梨醇酯80；其中液體醫藥調配物具有約pH 5.0至約pH 7.0之pH值。

液體醫藥調配物可基本上不含任何防腐劑及上文指示之其他載劑、賦形劑或穩定劑。或者，調配物可包括一或多種防腐劑(例如抗細菌劑)、上文所述之醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑，其限制條件為其不會不利影響拮抗劑抗-CD40抗體或其抗原結合片段之物理化學穩定性。可接受之載劑、賦形劑及穩定劑之實例包括(但不限於)其他緩衝劑、共溶劑、界面活性劑、抗氧化劑(包括抗壞血酸及甲硫胺酸)、螯合劑(諸如EDTA)、金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)及生物可降解聚合物(諸如聚酯)。醫藥學上可接受之載劑、穩定劑及滲透溶質(isomolyte)之調配及選擇的全面論述可見於Remington's Pharmaceutical Sciences(第18版；Mack Publishing Company,Eaton,Pennsylvania,1990)中。

在製備本文所述之液體醫藥調配物或其他醫藥組合物之後，其可經凍乾以防止降解。凍乾液體組合物之方法為一般技術者所知。在即將使用之前，組合物可用可包括其他成分之無菌稀釋劑(例如林格氏溶液(Ringer's solution)、蒸餾水或無菌生理鹽水)復原。

在復原之後，較佳使用熟習此項技術者已知之彼等方法向個體投與組合物。

拮抗劑抗-CD40抗體用於製造藥劑之用途

本發明亦提供一種用於治療個體自體免疫疾病及/或發炎疾病的本發明拮抗劑抗-CD40抗體或蛋白質，其中藥劑與用至少一種其他療法進行之治療配合。

就「配合」而言，其意欲藥劑欲在用至少一種其他療法治療個體之前、期間或之後使用。其他療法之實例包括(但不限於)上文所述 之療法，亦即手術或手術程序(例如脾切除術、淋巴結切除術、甲狀腺切除術、血漿去除術、白血球去除術、細胞、組織或器官移植、器官灌注、腸程序及其類似程序)、放射療法、諸如類固醇療法及非類固醇療法之療法、激素療法、細胞激素療法、使用皮膚學藥劑(例如用於治療皮膚病狀，諸如過敏、接觸性皮炎及牛皮癬之表面藥劑)之療法、免疫抑制療法及其他消炎單株抗體療法及其類似療法，其中用一或多種其他療法進行治療在用包含如上文指示之本發明拮抗劑抗-CD40抗體或蛋白質的藥劑治療個體之前、期間或之後進行。

在一個此實施例中，本發明提供用於治療個體自體免疫疾病及/或發炎疾病之mAb1、mAb2或mAb3抗體，其中藥劑與用至少一種如上文指示之其他療法進行的治療配合。

在一些實施例中，包含拮抗劑抗-CD40抗體(例如本文揭示之單株抗體mAb1、mAb2或mAb3)或其抗原結合片段之藥劑與用兩種其他療法進行之治療配合。

當包含拮抗劑抗-CD40抗體之藥劑與兩種其他療法配合時，藥劑之使用可在用任一或兩種其他療法治療個體之前、期間或之後。

本發明亦提供一種用於治療個體自體免疫疾病及/或發炎疾病的拮抗劑抗-CD40抗體，例如本文揭示之抗體mAb1、mAb2或mAb3，其中藥劑用於已用至少一種其他療法預治療之個體中。

就「經預治療(pretreated)」或「預治療(pretreatment)」而言，其意欲個體在接受包含本發明拮抗劑抗-CD40抗體或蛋白質之藥劑之前已用一或多種其他療法治療。

下列實例藉由說明方式而非藉由限制方式提供。

圖1展示在用劑量反應方式以Chir12.12(空心圓圈)、mAb1(實心圓圈)、mAb2(實心方塊)、mAb3(實心三角)或人類CD40L(空心方塊) 刺激人類PBMC培養物72小時之後，³H-胸苷之併入。

圖2展示在用劑量反應方式以Chir12.12(空心圓圈)、mAb1(實心圓圈)、mAb2(實心方塊)、mAb3(實心三角)，人類CD40L(空心方塊)、同型對照(實心菱形)刺激且在5μg/ml抗-IgM F(ab')₂或1μM CpG2006存在下共刺激人類PBMC培養物72小時之後，³H-胸苷之併入。

圖3展示在用劑量反應方式以Chir12.12(空心圓圈)、mAb1(實心圓圈)、mAb2(實心方塊)、mAb3(黑色三角)，人類CD40L(空心方塊)、同型對照(實心菱形)刺激且在75ng/ml IL-4存在下共刺激人類PBMC培養物72小時之後，³H-胸苷之併入。

圖4展示在用20μg/ml CD40L及一定劑量反應濃度之Chir12.12(空心圓圈)、mAb1(實心圓圈)、mAb2(實心方塊)、mAb3(黑色三角)或人類CD40L(空心方塊)刺激人類PBMC培養物72小時之後，³H-胸苷之併入。

圖5展示抗-人類CD40抗體與BJAB細胞株之劑量依賴性結合，分別為Chir12.12(實心圓圈)、mAb1(空心方塊)、mAb2(空心三角)、mAb3(實心三角)。

實例 材料 1. 單株抗體

Chir12.12(1.9mg/ml)、mAb1(0.88mg/ml)、mAb2(1.9mg/ml)及mAb3(1.9mg/ml)提供於50mM檸檬酸鹽(pH 7.0)、140mM NaCl中。IgG同型對照亦用於選擇實驗(Sigma,St.Louis,USA)。

2. B細胞活化刺激物

親和純F(ab')2片段兔抗-人類IgM係自Jackson Immuno Research(Suffolk,UK)獲得，且CpG2006係自Microsynth(Balgach,Switzerland)獲得。重組人類CD40L係使用一般技術者已知之標準程序產生。含有人類IL-4之上清液係使用一般技術者已知之標準程序產生。

3.活體外組織培養試劑

PBMC培養基：RPMI-1640、10% FBS、1%青黴素/鏈黴素(Streptomycin)、1%非必需胺基酸、1%丙酮酸鈉、5mM β-巰基乙醇(皆來自Invitrogen,San Diego,USA)。

方法 1. CD40L介導之PBMC增殖分析 1.1 純化人類周邊血液單核細胞(PBMC)

初級PBMC係自得自健康志願者之全血白血球層(Blutspendezentrum,Basel)純化。白血球層用含有5mM EDTA之不含Ca2+及Mg2+之PBS稀釋4倍且25ml等分入50ml Falcon管中。每Falcon管用14ml Ficoll-Plaque Plus(GE Healthcare)鋪在經稀釋白血球層下面且在室溫下在2250rpm下離心20分鐘(不間斷)。在離心之後，相間層轉移至單一50ml Falcon管中。組合來自多個管之相間層(來自單一供者)直至達到30ml體積。添加補充有5mM EDTA之PBS且細胞在室溫下在2250rpm下離心5分鐘。丟棄上清液，隨後添加15ml紅血球(RBC)溶解緩衝液且在室溫下培育5分鐘。隨後，添加20ml PBS/5mM EDTA且再次離心細胞(在2250rpm下，室溫/5分鐘)。細胞於PBS/5mM EDTA中洗滌兩次(插有離心步驟)且再懸浮於35ml PBMC培養基中，隨後使用錐蟲藍(Trypan Blue)染料排除法測定活細胞數。不即刻用於活體外刺激之細胞經冷凍保藏。

1.2 活體外PBMC刺激分析

在存在或不存在恆定劑量之5μg/ml抗-IgM F(ab')2、1μM CpG2006、含有人類IL-4(75ng/ml)之上清液或40μg/ml重組huCD40L(所指示的為最終濃度)下於Costar 96孔盤中一式三份製備各抗-CD40或同型對照mAb之七點兩倍稀釋系列。視實驗而定，各抗-CD40 mAb之起始濃度在20μg/ml至100μg/ml之範圍內。CD40L用作所有實驗之劑量反應中之陽性對照。基於以劑量反應方式評估此等試劑(單獨或組合)誘導PBMC或B細胞增殖之能力(資料未展示)的先前實驗選擇抗-IgM、CpG2006、IL-4及CD40L之劑量。PBMC(最終密度為每孔8×10⁴個)隨後添加至各孔中，隨後在37℃/5% CO₂下培育3天。³H-胸苷(1μCi/50μl/孔)添加至各孔中最後培養6小時，隨後收集並使用MicroBetaTrilux閃爍計數器測定胸苷併入。應注意細胞加培養基及細胞加培養基加抗-IgM、IL-4、CpG2006或CD40L對照培養物(在不存在抗-CD40 mAb下)包括在各實驗中。

使用Excel及GraphPad Prism軟體分析閃爍資料。結果呈現為平均每分鐘計數(cpm)(+/-平均值標準誤差)相對於抗-CD40mAb濃度之對數變換。陽性對照及細胞加培養基背景水準指示在各圖上。在藉由Prism對資料成功進行曲線擬合之條件下，計算IC₅₀或EC₅₀值。

PBMC如上指示在存在或不存在一定劑量反應濃度之測試抗-CD40 mAb下用20μg/ml CD40L刺激3天。在培養72小時之後，藉由³H-胸苷併入評估增殖。結果呈現為一式三份培養物之平均值及SEM且代表4個供者(獨立實驗)。抗-CD40 mAb介導之抑制的IC₅₀值係以μg/ml加以表列。

2. 活體外PBMC促效劑分析

人類PBMC如以上段落1.2中所指示在不存在共刺激下或在5μg/ml抗-IgM F(ab')2或1μM CpG2006存在下用產生劑量反應之Chir12.12、mAb1、mAb2或mAb3刺激3天。在培養72小時之後，藉由³H-胸苷併入評估增殖。結果呈現為一式三份培養物之平均值及SEM 且代表4個供者(獨立實驗)。

3. ADCC分析

50μl PBMC懸浮液(10×10⁶個細胞/毫升)添加至圓底孔(Corning Incorporated-Costar #3790)中，添加50μl經鈣黃綠素(calcein)染色之Raji細胞(2×10⁵個細胞/毫升)及100μl抗體稀釋液或對照。在2%曲通100中測定最大溶解。

在盤底部收集細胞(在250g下3分鐘)且在37℃下在含濕氣CO₂氛圍(5%)中培育1小時。藉由離心(在750g下3分鐘)使細胞與培養基分離且100μl上清液轉移入透明底部黑色盤(Corning Incorporated-Costar #3904)中以進行量測。

在485nm下激發之後用SpectraMax Gemini光譜儀(Molecular Devices)在535nm下測定螢光。使用下列公式計算特異性溶解：(實驗釋放-自發釋放)/(最大釋放-自發釋放)×100。

4. 抗-人類CD40抗體變體與人類BJAB細胞株之結合

使用流動式細胞測量術以比較不同抗-CD40抗體Fc變體與人類BJAB細胞之結合。因此，於96孔V形底盤中每孔接種2×10⁵個細胞。各盤在4℃下，在1350×g下持續2分鐘用200μL FACS緩衝液(PBS、5% FCS、2mM EDTA)洗滌兩次。丟棄上清液且細胞再懸浮於100mL含有8%人類血清(InVitromex，目錄號S4190)之FACS緩衝液中並培育10分鐘。在兩次洗滌之後，添加含抗-人類CD40 Fc變體之50μL含1%人類血清之FACS緩衝液，該等變體係以10μg/mL之濃度起始，以2倍進行稀釋。細胞在冰上培育30分鐘，隨後進行兩步洗滌。50μL多株兔抗-人類IgG FITC F(ab')2(DAKO，目錄號F 0315)添加至各孔中且在冰上培育30分鐘。在培育結束時，細胞經洗滌兩次，再懸浮於100μL FACS緩衝液中並在FACS CantoII上獲得。

在獲得之後，在FloJo中獲得FITC通道之平均螢光強度。用 GraphPad Prism 5.0進行繪圖及曲線擬合。由於個別實驗之間的強度會發生變化，對值進行校正。因此，各抗體測試系列之最大值等於100%。以百分比值進行非線性曲線擬合。

5. 用單核細胞源性樹突狀細胞(MoDC)進行之CD40L介導之細胞激素產生分析 5.1 製備人類單核細胞源性樹突狀細胞

人類PBMC係自由瑞士紅十字會(Swiss Red Cross)提供之人類白血球層製備。白血球層於PBS(Invitrogen，目錄號20012019)中稀釋5倍且以35mL等分試樣分配至50mL falcon管中。隨後，13mL Ficoll(GE Healthcare，目錄號17 1440-02)在各管中鋪在下面。細胞在室溫下在1680×g下不間斷離心20分鐘。收集含有PBMC之層且在1000×g下於較大體積之PBS中持續5分鐘洗滌兩次。最終，細胞再懸浮於10mL PBS中並計數。

人類單核細胞係使用來自Miltenyi之人類單核細胞分離套組II(Miltenyi,Germany，目錄號130-091-153)根據製造商說明書在AutoMACS儀器上自100×10⁷個PBMC負性分離。在分離之後，細胞在4℃下在1000×g下持續5分鐘於培養基(RPMI1640(Invitrogen，目錄號61870010)、10% FCS(Invitrogen，目錄號16000044，美國來源)、1mM丙酮酸鈉(Invitrogen，目錄號11360039)、1×NEAA(Invitrogen，目錄號11140035)、1×青黴素/鏈黴素(Invitrogen，目錄號15140122))中洗滌兩次。計數經分離單核細胞，以0.4×10⁶個/mL之密度塗於6孔盤中且在37℃、5% CO2下培養七天。為使單核細胞分化成樹突狀細胞，重組人類IL-4[80ng/mL]及人類GM-CSF[100ng/mL](兩者均為自製)在培養開始時添加至培養基中。

5.2 刺激樹突狀細胞(DC)以釋放細胞激素

在培養7天之後藉由沖洗6孔盤，匯合細胞且在1400×g下持續5分 鐘於培養基中將其洗滌兩次來收集不成熟DC。隨後，2×10⁵個iDC以100μL接種於96孔平底盤(Becton Dickinson，目錄號353072)中。對於陽性對照，細胞用1μg/mL濃度之MegaCD40L(Alexis，目錄號ALX-522-110-C010)刺激，陰性對照由僅含iDC之培養基組成。在拮抗分析中，抗-人類CD40抗體Fc變體在10μg/mL下，以1：2稀釋度連同1μg/mL MegaCD40L一起添加以達成劑量-反應。在24小時後收集經刺激細胞之上清液以量測TNFα。在促效分析中，僅以1：2稀釋度在10μg/mL下添加抗-人類CD40抗體Fc變體且在48小時之後收集上清液以量測TNFα。對於所有分析，細胞經接種且一式三份進行刺激。

5.3 藉由ELISA量測TNFα

為量測上清液中之TNFα之量，如下進行ELISA。抗-TNFα捕捉抗體(BD Pharmingen，目錄號551220)在4℃下在5μg/mL下以每孔50μL在ELISA盤(Greiner，Nunc F96 Maxisorp，目錄號442404)上塗佈隔夜。對於每一洗滌步驟，各盤用250μL於BioTek ELx 405盤洗滌器中洗滌3次。在首次洗滌之後，在37℃下培育200μL Superblock TBS(Thermo Scientific,Pierce，目錄號37535)1小時。接著，添加25μl TNFα標準物(重組人類TNFα，R&D Systems，目錄號210-TA)或樣品。標準物以20ng/mL之最終濃度起始，進行2倍連續稀釋。此外，以1：500稀釋度添加25μL偵測抗體(抗-人類TNFα生物素，BD Pharmingen，目錄號554511)。各盤在4℃下培育隔夜。在洗滌之後，抗生物素蛋白-POD結合物(ExtrAV鹼性磷酸酯酶，Sigma，目錄號E-2636)於Superblock TBS中稀釋5000倍，以50μL添加且在室溫下培育1小時。洗滌各盤且添加50μL受質對硝基苯基磷酸酯(Sigma，目錄號C-3041)以顯色15分鐘。用軟體SoftMax Pro在450nm下在SpectraMax M5(Molecular Devices)上讀取ELISA盤。

6. 毒理學研究

毒理學研究之主要初始目的在於研究高劑量(100mg/kg)mAb1相較於Chir12.12之潛在毒性。

30隻毛里求斯(Mauritian)來源之食蟹獼猴用於此研究。在給藥初始，動物約4至5歲且雄性稱重4.5至6.6kg且雌性稱重3.1至4.3kg。

在100mg/kg之劑量含量及2mL/kg之劑量體積下每週一次持續5週(在第1、8、15、22、29及36天施用測試項目(test item))向一組食蟹獼猴(5隻雄性/5隻雌性；第2組)靜脈內投與mAb1(50mg/mL)。另一組食蟹獼猴(5隻雄性/5隻雌性；第3組)藉由在100mg/kg之劑量含量及5mL/kg之劑量體積下緩慢團式輸注來靜脈內接受親本抗體Chir12.12。在2mL/kg之劑量體積下對充當對照之另一組食蟹獼猴(5隻雄性/5隻雌性；第1組)給與mAb1安慰劑。所有動物皆在末次給藥之後一或兩天經受驗屍。

決定併入匙孔螺血氰蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin，KLH)免疫以評估兩種抗-CD40 Ab之功效。在第2天，動物用含1mg KLH之礬免疫，隨後在第23天加強注射含0.5mg KLH之礬。在免疫/增強免疫前以及分別在免疫及增強免疫之後第7及14天對血清取樣。使用食蟹獼猴抗KLH IgM/IgG參照血清作為標準物，用ELISA測定KLH特異性IgM/IgG效價。在給藥前3個時刻及在第15、29天及在驗屍(第37/38天)時對血液取樣以測定天然B細胞之免疫表型(CD20+CD21+CD27-)。絕對天然CD20 B細胞計數係藉由流動式細胞測量術自每個血液樣品之總淋巴細胞計數及相對天然CD20 B細胞計數計算。

*基於最新近個體體重

毒性之評估係基於死亡率、臨床觀測(臨床徵象，包括給藥後觀測、糞便評估、毛皮檢查及食物消耗)、體重、眼檢查、心血管研究、臨床病理學(包括凝血、外部血小板活化檢查、血液學、臨床化學及尿分析)、器官重量及肉眼及顯微驗屍研究結果。在給藥前、在給藥期之第15及29天以及在驗屍當天進行三次血液免疫表型分析。此外，在驗屍時進行匙孔螺血氰蛋白(KLH)注射部位之脾組織及引流淋巴結之免疫表型分析。此外，檢查對KLH之T細胞依賴性抗體反應(TDAR)以直接比較能夠具有完全ADCC之Chir12.12之影響與mAb1之影響。自所有動物收集血液以進行毒物動力學評估及可能之抗-藥物抗體(ADA)評估。

7. mAb1之其他活體外概況分析 7.1 PBMC純化

人類周邊血液單核細胞係如先前於章節1.1中所述製備。

7.2 人類扁桃體B細胞純化

移除扁桃體囊及結締組織且在移除扁桃體物質之後，將扁桃體切成約5mm大片，隨後經由金屬細胞過濾器搗碎，且用B細胞培養基進行常規洗滌。扁桃體細胞接著經70μM細胞過濾器過濾兩次以移除細胞碎片。使用EasySep負性選擇人類B細胞富集套組(Stemcell Technologies,Vancouver,BC,Canada)自新鮮PBMC分離B細胞。根據製造商說明書使用EasySep負性選擇人類B細胞富集套組(Stemcell Technologies,Vancouver,BC,Canada)純化B細胞。

7.3 使用人類及非人類靈長類動物PBMC或B細胞評估CD40結合EC ₅₀ 值

PBMC(恆河猴(rhesus)、食蟹獼猴或人類)或扁桃體B細胞(僅人類)在4℃下與經純化之經標記mAb1或同型對照抗體(最終濃度範圍2.5μg/ml-0.00125μg/ml)一起以劑量反應方式培育30分鐘。隨後洗滌細胞，接著與對NHP具有最小交叉反應性之抗-人類(非人類靈長類動物交叉反應性)及經生物素標記之抗-人類IgG抗體(R10；應注意有可能藉由包括抗-IgM染色劑或經由FACS染色之差異強度區分表現膜IgG之人類B細胞)一起培育。細胞再次在4℃下培育30分鐘，隨後洗滌並在4℃下經受用抗生蛋白鏈菌素-FITC最後染色20分鐘。隨後洗滌細胞且藉由流動式細胞測量術對CD40在CD20+細胞上之表現進行評估。

7.4 評估對CD154誘導之人類及非人類靈長類動物PBMC或B細胞增殖之抑制

在EC₈₀濃度之人類重組CD154及IL-4存在下於96孔盤中一式三份製備各抗-CD40或同型對照mAb之七點兩倍稀釋系列。視實驗而定，各抗-CD40 mAb之起始濃度在20μg/ml至100μg/ml之範圍內。細胞及培養基對照用作所有實驗之陰性對照。PBMC(恆河猴、食蟹獼猴或人類)或扁桃體B細胞(僅人類)隨後添加至各孔中，隨後在37℃/5% CO₂下培育3天。³H-胸苷(1μCi/50μl/孔)添加至各孔中最後培養6小時，隨後收集並使用閃爍計數器測定胸苷併入。

8. mAb1與環孢素A組合在食蟹獼猴腎同種異體移植模型中之功效8.1 動物

所用所有食蟹獼猴(食蟹猴)皆為7.5-9歲雄性(5529號/5533號、5523號/5524號及5536號/5538號)，經圈飼育種，7.7±0.9kg且來源於菲律賓(Philippines)(Siconbrec,Makati City,Philippines)。在移植時，動物呈現正常血液學、血清/尿化學且對結核病、沙門氏菌屬(Salmonella)/志賀桿菌屬(Shigella)為陰性、針對病毒介質(B型疱疹病毒、猴T細胞白血病病毒、猴免疫缺乏病毒、猴D型反轉錄病毒、B型 肝炎病毒)之抗體陰性，且對相關外寄生蟲/內寄生蟲為陰性。然而，所有動物皆呈現針對細胞巨大病毒及A型肝炎病毒(HAV)之抗體(在2010年測試；5536號動物為HAV陰性)。在2010年12月，5523號動物之糞便學經測試為對大腸纖毛蟲(Balantidium coli)陽性。

在手術後第一週的期間，動物舍飼於單一遙測籠中，允許其與其他動物視覺接觸。在其餘時間，5536號/5538號舍飼在一起且其餘4個動物在整個實驗期間保持隔離(不相容動物)。所有動物皆舍飼在經維持溫度(20-24℃)、至少40%濕度及自然光循環下。所有動物皆每日至少兩次用水果與蔬菜之混合物餵養。水及及Kliba Nafag 3446丸粒(Kaiseraugst,Germany)任意採食。

所有實驗皆根據瑞士動物福利規定且依據許可證BS1555進行。

8.2 實驗條件 8.2.1 腎移植及手術後監測

根據ABO匹配、DRB外顯子2錯配(Blancher A,Tisseyre P,Dutaur M，等人(2006)Immunogenetics；58(4)：269-82)及單向混合淋巴細胞反應(MLR)中MLR刺激指數(MLR-SI)>7且<47之反應(Bigaud M,Maurer C,Vedrine等人(2004)J.Pharmacol.Toxicol.Methods；50(2)：153-9)選擇供者/接受者對。此選擇之結果展示於表6中且在於二重移植物(duo-transplant)(2個供者之間的交換移植物)。各接受者植入遙測探針(Data Sciences Inc,USA)以監測動脈血壓、心跳速率及動作活動(motor activity)。

對於手術，藉由氯胺酮(ketamine)(10mg/kg，肌肉內(i.m.))連同阿托品(atropine)(0.05mg/kg i.m.)誘導全身麻醉且藉由用N₂O/O₂(50：50)通風及靜脈內(i.v.)丙泊酚(propofol)(4-10mg/kg/h；每當需要時補充5-10mg大丸劑)加以維持。收集供者腎，用冷(4℃)威斯康星大學(University of Wisconsin)溶液(冷藏時間4小時)沖洗且使用標準微血管技術加以異位移植以在移植物腎靜脈與接受者腔靜脈之間及在移植物腎動脈與接受者遠端主動脈之間產生端對側吻合口(吻合時間40分鐘)。在尿自移植物出現後進行輸尿管膀胱造口術(uretero-cystoneostomy)。移除原生腎。手術後痛覺缺失係由丁丙諾啡(buprenorphine)(0.01-0.02mg/kg，i.m.，每日三次)；抗生素(頭孢噻肟(cefotaxime)，25mg/kg，i.m.，每日兩次或頭孢曲松(ceftriaxon)，50mg/kg，i.m.，於1%利多卡因(lidocaine)中，每日四次)提供。在5天期間提供痛覺缺失及抗生素。每當血小板計數經受顯著增加或減小時，在5mg/kg之劑量下每日肌肉內投與阿司匹靈(aspirin)(Aspegic,Sanofi-Aventis,Meyrin,Switzerland)。

監測接受者之臨床及心血管狀況、體重、食物及水攝取(補充至最多100-150ml/kg/天)、尿排出、血液學(使用Beckmann Coulter ACT5Diff)、血清及尿化學(使用Vetscan分析儀以每日測定SCrea/SUrea/SAmylase及Beckmann Synchron CX5分析儀以最終確認血清及尿樣品)之變化。血清肌酐(SCrea)及尿素(SUrea)含量用作移植物功能之指標。如先前所述(Gaschen L,Kunkler A,Menninger K，等人(2001)Vet.Radiol.Ultrasound；42(3)：259-64)，在全身麻醉下在第30天(僅5529號及5533號動物)用16G針進行經皮超音波引導之生檢。此外，亦在移植之前及之後特別監測5529號/5533號及5523號/5524號動物中之血液凝固性及血小板凝集。

在以下情況下最終使接受者安樂死：(i)與或不與超音波計分增 加相關之重度移植物衰竭(例如Screa>500μmol/l或Surea>20mmol/l)；或(ii)綜合健康問題及/或明顯臨床痛苦徵象。在驗屍時，收集腎同種異體移植物(包括輸尿管及吻合口)以及所有其他主要器官，且處理以進行隨後組織學分析。

8.2.2 mAb1及環孢素A(CsA)治療

mAb1係以在輸注當天自-80℃新鮮解凍之液體形式提供。每週一次施用30mg/kg/i.v.，在第-1、0及1天(移植前及移植後)之前三次劑量除外。用於經口投藥(p.o.)之CsA為微乳液預濃縮物(Sandimmun Neoral(RTM)飲用溶液，100mg/ml，Novartis Pharma AG)。CsA在20mg/kg/p.o.之每日劑量(在第-1天開始)下與mAb1組合加以施用(參見表6)。

8.2.3 監測mAb1藥物動力學(PK)、免疫原性(靈長類動物抗-人類抗體)及藥力學(PD)

收集(在靜脈內給藥之前)血液樣品(500μl血清)以測定在第-1、3、7(基線及15分鐘)、14、28、42、56、70、84及100天之mAb1暴露。對於CsA測定，在經口給藥或CsA之前(C0/C24)及在施藥之後2小時(C2)收集血液樣品。C2對應於CsA吸收之峰值水準。所有材料皆儲 存在-80℃下直至進一步處理(CsA偵測套組，Hot Star Taq Master混合物，Qiagen Minnesota,US)。在第-1、7、14、28、42、56、70、84及100天收集用於測定mAb1免疫原性之樣品(50μl血清)，保持冷凍在-80℃下。簡言之，96孔微量滴定盤用重組人類CD40塗佈。此等盤在標稱4℃下儲存隔夜。在阻斷之後，校正器標準物(Cs)、品質控制(QC)樣品及含有mAb1之樣品試樣添加至盤中。盤在標稱+25℃下在攪拌下培育120分鐘。在洗滌盤之後，依次添加小鼠抗人類κ輕鏈抗體及HRP山羊抗小鼠(H+L)結合物至盤中以偵測與重組CD40結合之任何mAb1。此藉由添加顯色受質(TMB)加以觀測且產生之顏色強度(吸光度)與存在之mAb1濃度成正比。樣品中mAb1之濃度接著根據校正曲線進行反算。在移植之前2-3天獲得PD樣品作為基線(0.5ml於肝素中)。此後，遵循與PK樣品相同之時程進行收集。用根據製造商說明書使用之含有抗-人類CD40-APC mAb(純系5C3，Becton Dickinson，目錄號555591)、抗-人類CD3-PerCP(純系SP34-2，Becton Dickinson，目錄號552851)及抗-人類CD20-FITC mAb(純系LT20，Immunotools，目錄號21279203X2)之TruCount管(Becton Dickinson，目錄號340334)計數CD20+及CD3+細胞。使用DIVA(第6.1.1版)軟體在LSRII流式細胞儀(Becton Dickinson Biosciences)上獲得資料。在FSC/SSC點漬墨法中根據尺寸及粒度閘控淋巴細胞及珠粒且進一步分析CD20及CD3之表現。

8.2.4 組織學

所有經收集組織(移植物生檢體或在驗屍時收集之組織)皆肉眼檢查且固定於4%緩衝福馬林(formalin)中。在脫水之後，其包埋於石蠟中。自石蠟塊切割3μm厚切片且用蘇木精及伊紅(eosin)(HE)染色。對腎切片進行額外三種染色(過碘酸希夫(Schiff)染色、三色染色及凡爾霍夫(Verhoeff)染色)。生檢及驗屍樣品由有經驗之病理學家檢查且根 據腎同種異體移植物病變之班夫07分類法(Solez K,Colvin RB,Racusen LC等人(2008)Am.J.Transplant；8(4)：753-60)計分。亦由外部專家進行同儕評審。

此外，使用適於染色石蠟切片之多價抗-C4d抗體進行補體蛋白質C4d之免疫組織化學分析(Regele H,Exner M,Watschinger B，等人2001,Nephrol.Dial.Transplant；16：2058-2066)。C4b視為急性體液性排斥(AHR)之穩定及可靠標誌物。在固定及石蠟包埋之後，製備具有3μm厚切片之玻璃載片(SuperFrostPlus,RTM,Menzel-Glaeser,Germany)且在烘箱中在37℃下乾燥隔夜以最佳黏著於載片。添加人類排斥腎切片作為陽性對照。在使用之前，載片於二甲苯中去石蠟(10分鐘)，經由梯度乙醇(graded ethanol)再水合並置放於蒸餾水中。藉由如先前所述(Segerer S,Mack M,Regele H,Kerjaschki D,Schlöndorff D.Kidney Int.1999；56：52-64)在1巴(bar)下於檸檬酸鹽緩衝液(pH 6.0)中進行壓力蒸煮10分鐘來進行抗原復活(antigen retrieval)。對於免疫染色，使用下列程序：(i)在室溫下用含0.5% H₂O₂之絕對甲醇使內源性過氧化酶不活化20分鐘；(ii)於0.01M PBS(pH 7.4)(Sigma-Aldrich Chemie GmbH,Germany)中洗滌載片；(iii)在室溫下將載片與含4%脫脂奶粉「Rapilait」之PBS(Migros Genossenschaftsbund,Switzerland)一起培育60分鐘；排出，不洗滌；(iv)在+4℃下將一個載片與40倍稀釋於含有1% NGtS之PBS中之pAb兔抗-人類C4d(Biomedica Medizinprodukte,Vienna,Austria)一起培育隔夜。第二載片藉由替代一次抗體施用兔同型對照(Zymed Laboratories Inc,USA)而充當陰性對照；(v)於0.01M PBS(pH 7.4)中洗滌載片；(vi)在室溫下將所有載片與200倍稀釋於含有1% NGtS之PBS中之經生物素標記之山羊抗-兔IgG(Vector Laboratories,Inc.USA)一起培育30分鐘；(vii)於0.01M PBS(pH 7.4)中洗滌載片；(viii)在室溫下與含抗生蛋白鏈菌素 /HRP(Vector Laboratories,Inc.USA)之PBS一起培育30分鐘；(ix)用AEC+(DakoCytomation Corp.,Carpenteria,USA)使HRP活性顯現8-10分鐘，顯微控制染色強度，於蒸餾水中洗滌；(x)用Dako(RTM)自動化蘇木精(DakoCytomation Corp.,Carpenteria,USA)對比染色2分鐘且於流動自來水中成藍色5分鐘；(xi)用水性封固劑(Medite Medizintechnik AG,Switzerland)封固。

實例1：評估mAb1、mAb2及mAb3之促效活性

實驗資料係基於使用經分離之未分化初級人類PBMC。完全PBMC製備物(而非經分離B細胞或單核細胞)更密切模擬抗-CD40 mAb可對不同白血球細胞類型具有多種直接及間接作用之活體內情形。使用此PBMC增殖分析，確定保留未自親本Chir12.12抗體產生變化之抗原結合部分之胺基酸序列的無糖基化抗-CD40 mAb mAb1(N297A)及mAb2(D265A)保留親本Chir12.12 mAb之非促效CD40L阻斷性質。抗體mAb3(LALA突變體)在IL-4存在下具有微弱促效性。

特定言之，實驗結果顯示無Fc靜默抗-CD40 mAb能夠刺激人類PBMC進行細胞分裂(n=4個供者)，結果與用親本Chir12.12 mAb觀測到之結果類似(參見圖1)。PBMC對CD40L起反應而進行增殖。mAb1或mAb2皆不可增強CpG2006或抗-IgM F(ab')₂誘導之PBMC增殖(圖2)。另外，Chir12.12未能增強抗-IgM F(ab')₂誘導之PBMC增殖，然而不同於mAb1及mAb2，其完全抑制CpG誘導之PBMC增殖。

在IL-4存在下，觀測到mAb3(LALA突變)誘導較低但可再現(n=4個供者)之胸苷併入程度(其高於單獨IL-4所誘導之胸苷併入程度)，而mAb1、mAb2及Chir12.12並非如此(圖3)。總之，此等結果指示除mAb3(在IL-4存在下)之外，無抗-CD40 mAb具有促效活性。

以上結果亦明確說明mAb1及mAb2在共刺激信號存在下不具有促效劑活性。此為一個重要研究結果，因為有可能患有慢性自體免疫疾 病之患者中之白血球可具有活化或部分活化表型且因此對經由CD40或其他刺激物之信號傳導敏感。應注意Chir12.12(但並非Fc靜默mAb或CD40L)完全抑制CpG2006誘導之PBMC增殖。CpG2006為一種Toll樣受體9(TLR9)之合成配體，該受體為一種經證明結合病原體及宿主源性ssDNA之受體。在人類中，TLR9係由周邊血液中之B細胞及(在較小程度上)單核細胞表現。因為含有CpG之ODN先前已顯示會增強ADCC(Moga，等人2008)，所以可推測CpG2006能夠增強由親本Chir12.12 mAb之生殖系IgG1 Fc部分介導之ADCC。

實例2：評估Fc靜默抗-CD40 mAb阻斷CD40L介導之PBMC增殖之能力

先前資料指示Chir12.12可阻斷CD40L介導之初級人類B細胞及人類B細胞淋巴瘤細胞株增殖。吾人量測Chir12.12及本發明之三種抗體mAb1、mAb2、mAb3對CD40L介導之PBMC增殖的抑制。下表7呈現此等抑制之以mg/ml表列之IC₅₀值(結果呈現為一式三份培養物之平均值及SEM且代表4個供者，獨立實驗)。結果說明Chir12.12亦可抑制CD40L介導之PBMC增殖。另外，mAb1、mAb2及mAb3亦以與Chir12.12類似之效能完全阻斷CD40L介導之PBMC分裂。無抗-CD40 mAb阻斷抗-IgM+IL-2誘導之PBMC增殖(資料未展示)，表明抗-CD40 mAb之阻斷活性具有目標依賴性(且不與Fc功能相關)。

實例3：抗-人類CD40抗體變體與人類BJAB細胞株之結合

為排除與CD40之特異性結合之可能的變化，用組成性表現CD40之B細胞株BJAB，相較於親本Chir12.12測試三種變體mAb1、mAb2及mAb3之結合。結合係以劑量-滴定方式測試，以10μg/mL起始，以2倍進行稀釋。

為比較不同實驗之曲線，各個劑量-滴定之最高中值螢光強度設置為100%結合且應用非線性曲線擬合。在兩個單獨實驗中，所有四種抗體變體Chir12.12、mAb1、mAb2及mAb3皆顯示關於BJAB細胞之等效結合曲線(圖5)。未觀測到具有Chir12.12之Fc結合區之不同突變的變體之結合能力變化。

因此，以上結果說明Fc結合位點之突變不影響親本Chir12.12之可變區之CD40結合位點。mAb1、mAb2及mAb3保留對BJAB細胞上之CD40之等效結合。

實例4：抗-CD40 Fc變體對TNFα自人類單核細胞源性樹突狀細胞釋放之刺激/抑制 抗-CD40 Fc變體對TNFα自人類MoDC釋放之刺激

一些抗-人類CD40抗體已顯示對不同細胞群體具有促效效應(Gruber 1989)。為排除Fc變體mAb1、mAb2、mAb3及Chir12.12導致MoDC活化，吾人研究該等抗體在與細胞一起培育48小時時是否獨立誘導TNFα釋放。與拮抗性分析不同，七天大之人類MoDC僅在所有四種抗-CD40變體存在下以起始於10μg/mL之劑量-反應曲線方式培養48小時。隨後，藉由ELISA測試上清液中TNFα之量。相較於作為陽性對照之CD40L刺激，所有抗-CD40變體mAb1、mAb2、mAb3及Chir12.12皆不誘導TNFα自MoDC釋放(資料未展示)。未觀測到所有四種抗體變體之劑量依賴性。TNFα之量不顯著上升至未經刺激之MoDC之水準以上(資料未展示)。因此，可排除此等四種抗體之促效活性。

抗-CD40 Fc變體對TNFα自人類MoDC釋放之抑制

親本Chir12.12抗體阻斷CD40-CD40L之相互作用且因此亦應阻斷細胞活化。用CD40L三聚體刺激人類單核細胞源性樹突狀細胞上之CD40會導致例如如TNFα之促炎性細胞激素之釋放(Ma 2009)。此外，Fc區之變化不應影響變體相較於Chir12.12之阻斷功能。所有四種抗體抑制CD40L介導之TNFα自人類MoDC之釋放的IC₅₀皆應等效。

因此，七天大之人類MoDC在所有四種阻斷性抗-CD40變體存在下用雙重三聚重組構築體MegaCD40L刺激24小時。隨後，藉由ELISA測試上清液中TNFα之量。在三個單獨實驗中，所有Fc突變變體mAb1、mAb2及mAb3皆展示與Chir12.12相同之劑量-反應抑制(資料未展示)。初步結果亦展示對IL-23自人類MoDC釋放之類似抑制(資料未展示)。

應用非線性曲線擬合來估計所有四種抗體之IC₅₀且計算實驗之平均IC₅₀。四種變體對TNFα自人類MoDC釋放之平均IC₅₀介於32ng/mL與40ng/mL之間的範圍(表8)。總之，Fc區中之突變不影響抗體變體之拮抗效應。

不同抗-人類CD40 Fc變體之以ng/mL計之IC₅₀來自於三個獨立實驗。1號中對於Chir12.12之非線性曲線擬合不允許有效估計IC₅₀(n.c.=未算出)。

因此，以上結果顯示所有四種變體在誘導TNFα自MoDC釋放方面皆為非活性的。更重要的是，相較於Chir12.12，所有變體mAb1、mAb2及mAb3皆以類似功效活體外抑制CD40L介導之人類MoDC產生細胞激素。

實例5：資料概述

下表9概述本發明之抗體mAb1、mAb2及mAb3相較於親本Chir12.12抗體之一些重要性質。

實例6：適用於實施本發明之胺基酸及核苷酸序列之簡要描述

實例7：適用於實施本發明之胺基酸及核苷酸序列

實例8：毒理學結果

毒理學研究之主要目標在於在每週一次持續5週向食蟹獼猴靜脈內投藥(6次測試項目用藥)之後確定mAb1之毒性。亦使用此抗體(Chir12.12)之非靜默(ADCC)形式以比較ADCC活性抗體之效應與ADCC靜默形式(mAb1)之效應。

此外，動物用KLH免疫以評估兩種抗-CD40 Ab之功效。

不存在可歸因於用mAb1或Chir12.12治療之死亡或體重、臨床徵象及所估計之食物消耗的變化。所有組中之在KLH注射部位處之局部反應皆類似。

此外，在眼及心血管研究中不存在測試項目相關之研究結果。

在血液學中，觀測到mAb1及Chir12.12治療動物中嗜鹼性血球之百分比及絕對數目之略微但統計顯著減小：不可排除與測試項目治療有關。尿分析揭示1/5 mAb1治療雌性及2/5 Chir12.12治療雌性之尿中之酮與給藥的關係不明確。在臨床化學中，觀測到Chir12.12治療雄性以及一個用Chir12.12治療之雌性之脂肪酶濃度略微升高的趨勢，然而此視為具有有限毒理學相關性。

血液凝固不受用mAb1或Chir12.12治療影響，如藉由凝血酶原時 間、活化部分凝血酶原時間及血纖維蛋白原所評估。血小板計數出現於正常範圍內。血漿中之P-選擇素(P-selectin)或sCD40L濃度不指示血小板活化。

在Chir12.12治療動物中，血液免疫表型分析顯示CD20⁺ B細胞顯著減少，預期其為此抗體之藥理學作用。尤其CD20^低CD21⁺ B細胞(其視為CD40^高)經Chir12.12消除。然而，CD20^高CD21^- B細胞亦實質上減少，尤其至研究結束時。CD20⁺CD21⁺CD27^-原始B細胞優先經ADCC活性抗體Chir12.12消除，而CD20⁺CD21⁺CD27⁺記憶B細胞幾乎不受影響。Chir12.12治療動物中之CD16⁺ NK細胞之絕對數目亦大約減小50%。如所預期，在用mAb1(其為ADCC靜默抗體)治療之後，未觀測到CD20⁺ B細胞顯著減少，亦未觀測到CD16⁺ NK細胞絕對數目之任何減小。顯示給藥期間適度減少之唯一B細胞為CD20^高CD21^- B細胞。已知此等細胞具有獼猴特異性且來源於發生中心(germinal center)，因此此研究結果不視為與轉換至人類相關。

在驗屍時對脾及KLH引流淋巴結之免疫表型分析揭示類似狀況。Chir12.12治療動物中CD20⁺ B細胞之相對數目減小，然而未觀測到CD21^- B細胞略微至適度減少(兩種性別之淋巴結，僅雄性之脾)之mAb1治療動物之CD20⁺ B細胞的相關減少。在KLH注射部位引流之右淋巴結及左淋巴結之免疫表型分析結果不存在差異。

T細胞依賴性抗體反應(TDAR)顯示相較於對照組，未觀測到mAb1或Chir12.12治療動物中之對KLH之IgG及IgM反應。因為藉由抑制CD40-CD40配體相互作用阻斷B細胞活化為mAb1之預期藥理學作用，且因為Chir12.12意欲消除B細胞，所以此研究結果不視為具有毒理學相關性。

毒物動力學評估揭示谷濃度在研究過程期間增加，從而指示mAb1及Chir12.12之累積。在第4及第5劑量之後的平均谷濃度類似， 從而指示在第5劑量之後mAb1及Chir12.12之接近穩態條件。在第4及第5劑量之後歷經給藥間隔之平均暴露(兩種性別)(AUC_τ)對於mAb1而言分別為906及990h.mg/mL，且對於Chir12.12而言分別為757及751h.mg/mL。AUC_τ值亦指示在第5劑量之後接近穩態條件。

肉眼檢查不顯示目標器官毒性之任何證據，且器官重量亦在此物種之正常範圍內。

就顯微而言，兩種抗體之測試項目相關之研究結果見於所有淋巴器官(脾及淋巴結(腸系膜、下頜、腋及腹股溝))中，其中mAb1及Chir12.12導致皮質B細胞區域中之發生中心發育完全抑制。脾及KLH引流及對側淋巴結組織之CD20免疫染色顯示脾中之淋巴濾泡(lymphoid follicle)之尺寸減小以及脾及淋巴結中之B細胞消除，相較於用mAb1治療，效果在Chir12.12治療動物中明顯得多。mAb1治療動物中之發生中心研究結果對應於在免疫表型分析時所見之CD21^- B細胞減少。CD40免疫染色顯示在用mAb1或Chir12.12治療之後，淋巴結及脾中之CD40染色顯著降低。

總之，基於此研究之結果，每週一次持續5週(6次投藥)以100mg/kg之濃度向雄性及雌性食蟹獼猴靜脈內投與mAb1或Chir12.12耐受良好。免疫表型分析顯示Chir12.12治療動物而非mAb1治療動物(除CD21^- B細胞之外)中之B細胞消除，然而TDAR顯示在KLH免疫之後在mAb1治療動物與Chir12.12治療動物兩者中均不存在IgG及IgM反應。組織病理學揭示在來自mAb1及Chir12.12治療動物之脾及淋巴結中缺乏發生中心。對B細胞之效應為所要藥理學作用且因此不應視為不利的。在此研究之條件下，mAb1與Chir12.12兩者之未觀察到毒性的最高劑量(no-observable-adverse-effect level，NOAEL)視為100mg/kg之劑量。

實例9：mAb1之其他活體外概況分析

測定mAb1在人類、恆河猴及食蟹獼猴白血球之間的結合及功能交叉反應性。表10展示mAb1在所有三個物種中之結合EC₅₀的直接比較。

mAb1結合所有三個物種之CD20+細胞(B細胞)之EC₅₀類似。另外，mAb1可抑制CD154+IL-4誘導之人類扁桃體B細胞以及來自食蟹獼猴及恆河猴之PBMC增殖。總之，此等結果指示mAb1結合CD40及抑制CD154誘導之人類B細胞或非人類靈長類動物PBMC增殖的能力極類似。活體外受體佔有率(RO)資料及功能性抑制之可用性使得能夠確定各物種之此兩個變數之間的關係(表11)。

^a可溶性CD154+IL4誘導之恆河猴PBMC及人類扁桃體B細胞增殖。

^b假定恆河猴及人類中之活體內KD與於食蟹獼猴中進行之PK/PD研究中所計算出的KD相同。

^c假定mAb1遠超過[目標]，希爾-朗繆爾方程(Hill-Langmuir equation)適用。

結果指示相較於人類B細胞，為mAb1恆河猴PBMC抑制50%PBMC增殖所需之RO小約2倍。在人類中，完全抑制可在約75%(活體內預測)RO下獲得。

實例10：移植研究 移植物存活

在同種異體移植物腎移植期間用mAb1(30mg/kg i.v.)及環孢素A(20mg/kg，經口)組合治療導致研究中涉及之6個動物之存活顯著延長。在5529號、5533號、5523號、5524號、5536號及5538號動物中，移植物分別在>91*、31、>92*、>92*、>98*及>98*天(平均值：>83.6天)期間具有功能性(*方案結束時)。未經治療之動物(或用次治療IS劑量治療之動物)中之存活在7-10天(歷史資料)之範圍內。

歸因於急性腎衰竭及無尿症，使5533號動物在移植後31天安樂死。此病變在高血壓維持時期及用於生檢體收集之麻醉之後出現。

移植後監測 (a)肌酐(SCrea)及尿素(SUrea)血清濃度

SCrea為用於評估腎功能之主要參數。在所有6個動物中，SCrea含量在移植之後一天增加至基線含量以上(自81.8±14.6至221.5±37.1μmol/l)。此SCrea上升為移植後第一週期間之共有特徵(表12)。

在第一週期間，SUrea濃度經歷快速上升至在第0天量測之基線(4.5±1.3mmol/l)以上(表13)。在5529號/5533號及5536號/5538號動物中，SUrea含量為16-20mmol/l(第3-5天)，而在5523號及5524號動物中分別為9或8mmol/l(第7天)。

在移植之後一週，腎功能傾向於正常且SCrea/Surea變得接近於基線水準。然而，5533號、5523號及5524號(而非5529號、5536號及5538號)動物在移植後第7天與第19-25天之間呈現SCrea/SUrea之額外增加，從而指示腎功能失調。在此時期期間，可觀測到如劇渴症(polidipsia)/多尿症(poliuria)(5523號及5524號)、血清鈣(SCa)維持較高(5533號)或移植物體積增加(5523號及5524號)之徵象。

在第20-25天之後，5529號、5523號、5524號、5536號及5538號動物改良且顯示極佳腎功能直至研究結束。然而，在第31天，5533號動物顯示SCrea/SUrea含量明顯增加，確認為急性腎衰竭(SCrea；629μmol/l及SUrea；18mmol/l)。此病變出現在高血壓維持時期及安樂死前一天之生檢程序之後。在此期間，記錄高血壓峰值(約170mmgHg 收縮壓)及低血壓發作(約40mmgHg收縮壓)。

(b)血清澱粉酶、脂肪酶濃度、體重及血小板計數

在移植之後第1-7天所有動物中之血清澱粉酶濃度皆略微增加約1.3倍(第0天311±53U/L且移植後第7天418±66.8U/L)(表14)。5533號動物呈現在移植後第1天之研究中所觀測到的最高澱粉酶濃度(1050U/L)。在移植之前，在第一mAb1劑量之前所觀測到之澱粉酶含量與之後24小時所觀測到之澱粉酶含量之間不存在差異(第-1天及第0天)。

平均而言，脂肪酶血清濃度在移植前後經歷較小變化(表15)。僅在實驗方案結束時，可見較小增加(第84天；2.18倍)。5533號動物展示在第1天量測到之最高脂肪酶濃度(284.4U/L)。5536號及5538號動物之脂肪酶資料不可得。澱粉酶及脂肪酶濃度之變化與使用不同抗體或低分子量化合物進行之其他移植實驗中得知之程度(資料未展示)類似。

表15：用30mg/kg i.v.mAb1與20mg/kg p.o.CsA之組合治療之四個腎移植動物中的血清脂肪酶濃度(U/L)

主要可觀測到5529號、5533號及5536號動物之快速及顯著體重減輕。在所有六個移植動物中，移植後首個21天期間的體重減輕在-4至-18%之範圍內。然而，在彼時間點之後及至研究結束，體重減輕傾向於恢復。

血小板計數為正常(300-400個細胞×10³/μl)或在移植後時期期間增加至600-800個細胞×10³/μl。5529號動物歸因於血小板計數快速增加而在3天(第7-9天)期間接受阿司匹靈治療。5533號動物呈現長期血小板增多(>1000個細胞×10³/μl)且在第7-26天之間接受阿司匹靈治療。

(c)mAb1血液含量及B細胞計數

先前進行參照PK/PD研究及分析，其中對食蟹獼猴提供單次靜脈內劑量之10mg/kg抗體(資料未展示)。在此研究中，濃度對時間概況展現明確目標介導之處置(TMD)，由於目標表現量可能較高，一個動物相較於另一動物顯示更快速清除，從而強調目標表現量在控管PK中之作用。根據此研究，亦確定當mAb1血清濃度超過約5μg/mL時，此轉化為幾乎100% CD40受體佔有率。

移植研究之設計(每週一次及高mAb1劑量含量-30mg/kg，且無恢復/清除期)不允許進行程度與先前進行之PK/PD研究相同的分析及模型化。然而，取得下列觀測結果(概述於表16中)；i)在第一劑量之前 收集到之樣品中未偵測到mAb1，ii)在整個所有劑量給藥期偵測到mAb1，及iii)在所有收集樣品中及個體間，谷濃度可變(食蟹獼猴5524：1200-2500μg/mL，食蟹獼猴5523：1000-2000μg/mL且食蟹獼猴5529：850-2400μg/mL)。所有暴露值皆遠超過(170至500倍)在食蟹獼猴中獲得完全受體佔有率所需之濃度。

亦在此研究中評估免疫原性測試(猴抗-mAb1抗體)。所有樣品皆顯現陰性，但此等樣品中之高mAb1含量會由於藥物干擾而可能阻止其之偵測。

可觀測到所有經治療動物中CD20+細胞隨時間部分消除。類似觀測結果可見於先前進行之PK/PD研究中(資料未展示)。

組織學結果

腎同種異體移植物之組織病理學評估揭示達到實驗結束在5523號、5524號、5529號及5538號移植物中無急性及慢性排斥，及在5536號移植物中的邊界變化(borderline change)，亦即(結果概述於表17中)。觀測到5523號、5524號及5538號動物中之最小血管周或間質性浸潤及5529號動物中之最小腎絲球細胞過多。

在移植後第31天安樂死之5533號動物展示腎小管擴張、間質性浸潤及纖維化，但僅有最小腎小管炎。此外，可見在輸尿管附近之顯著嗜伊紅血球浸潤及緊挨吻合口之膿腫。所有此等研究結果指示長期不良腎功能但不可確認排斥。

在所有情況下，C4d免疫染色皆為陰性。

觀測到所有動物中之淋巴器官中缺乏發生中心發育，伴有或不伴有濾泡性萎縮。在5529號及5533號動物中診斷出由大腸纖毛蟲感染引起之盲腸結腸炎。

未遇到其他治療相關變化。

移植研究-論述

移植研究之目的在於評估當mAb1以與次治療劑量之環孢素A之組合療法形式提供時在非人類靈長類動物腎同種異體移植物排斥模型中之有益效應。此外，評估在誘導全身性發炎之模型中不存在副作用亦相關。

當mAb1以與次治療劑量之CsA(20mg/kg p.o.)之組合療法施用時，其顯示在NHP中增加腎同種異體移植物之存活之功效。平均移植物存活為>83.6天且6個動物中有5個動物達到實驗方案(以91-98天確立)之結束。

使用非促效劑阻斷抗-CD40抗體(mAb1)靶向CD40導致腎或胰島移植NHP中之移植物存活延長。此外，相較於先前報導之Chir12.12(具有B細胞消除及共刺激阻斷性質之具有IgG1/κ同型的完全人類單株抗-CD40抗體)，吾人可藉由使用mAb1(其為Fc靜默抗體)評估較佳功效及安全性。

在整個移植後時期期間，不存在任何相關臨床病理學事件(例如澱粉酶/脂肪酶含量歸因於移植之後典型腎功能損害而較小增加)。然而，5333號、5523號及5524號動物在第7-19天之間呈現腎功能降低。此時期之特徵通常在於移植後動物中之SCrea/Surea含量、血壓及移植物體積恢復。在此等動物中，可見腎功能損害之徵象，諸如SCrea/SUrea增加(所有3個動物)、移植物體積短暫增加(5523號、5524號)或劇渴症/多尿症(5523號、5524號)。一種假設在於彼等動物產生早期排斥過程，其在3週mAb1治療之後變得得到控制。移植後早期中之此異常可歸因於由靶向CD40路徑之分子(Fc靜默)之免疫作用模式所誘導的差異。

一個動物(5533號)歸因於急性腎衰竭(無排斥)在第31天安樂死。此結果由移植程序之後腎功能之不完全恢復引起。指示不良腎功能之徵象為高SUrea含量(11-19mmol/l)或維持高SCa濃度(>2.8mmol/l)。 末期移植物喪失由在生檢體收集程序期間施用之麻醉期間觀測到的維持高血壓(>140mmHg收縮壓)與低血壓組合加速，且高血壓高峰值記錄於安樂死前夜(約170mmHg收縮壓)(Palmer BF(2002)N.Engl.J.Med；347(16)：1256-1261)。所有彼等事件皆不可歸因於mAb1治療且僅可歸因於移植後時期中之個體差異。

組合療法之較高功效亦可在組織學上得以證明。在實驗結束時，六個移植物中有五個移植物展示極佳移植物品質。亦在用Chir12.12進行之移植實驗中觀測到缺乏發生中心發育。未觀測到其他治療相關之組織變化。

一個長期存活者(5529號)感染由大腸纖毛蟲引起之盲腸結腸炎。儘管感染常見於獼猴中且常常無征狀，但免疫抑制可導致急性疾病發作(Schuster FL,Ramirez-Avila L,(2008)Clin.Microbiol.Rev；21(4)：626-38)。在此動物中，未觀測到諸如腹瀉或體重減輕之臨床徵象。

關於B細胞計數監測，可觀測到所有經治療動物中隨時間之部分消除。此部分消除可能不歸因於活性Fc受體介導之消除，因為mAb1為一種靜默抗體，其不結合FcR，亦不活體外介導ADCC。部分消除可反映缺乏發生中心，此在實驗結束時在組織學中被觀測到。此部分消除可能歸因於缺乏存活信號。

總之，移植研究之結果支持使用mAb1(且延伸而言，本發明之其他抗體及蛋白質)作為有效目標來以組合療法以極佳安全性概況治療腎排斥。極佳安全性概況及功效進一步支持使用本發明抗體治療自體免疫病症及/或發炎病症及預防由表現CD40抗原之細胞上之由CD40L介導之CD40信號傳導所介導的移植排斥。

概述

尚未報導抗-CD40抗體會誘導患者中之止血事件，然而，出於安全性原因，接受抗-CD40 Ab Chir12.12之B細胞淋巴瘤患者中之胰臟 酶升高及可能之胰臟炎風險阻止在慢性自體免疫疾病及移植中使用此Fc勝任抗-CD40抗體。因此，吾人產生在活體外及在活體內均不能介導抗體依賴性細胞細胞毒性(ADCC)或補體依賴性細胞毒性(CDC)之Fc靜默IgG1抗-CD40抗體(mAb1、mAb2及mAb3)。mAb1與次治療劑量之環孢素組合能夠延長非人類靈長類動物腎同種異體移植物存活。此外，mAb1能夠完全抑制對用T細胞依賴性抗原進行免疫所產生的一次及二次抗體反應。至關重要的是，在移植或免疫研究中不存在止血事件或異常胰臟組織學之證據。總之，此等結果表明mAb1將為一種安全且有效之治療劑，且可用於治療罹患B淋巴細胞及抗原呈現細胞驅動之自體免疫疾病或經受CD40-CD154相互作用涉及促進病變之同種異體移植物移植的患者。

<110> 瑞士商諾華公司

<120> 抗-CD40抗體之靜默Fc變體

<130> PAT54423

<140> 100141481

<141> 2011-11-14

<150> 61/413,567

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<170> PatentIn version 3.5

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Claims (14)

1. 一種針對目標CD40多肽(SEQ ID NO：28)之經分離抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或抗原結合部分包含：a. HCDR1(SEQ ID NO：1)、HCDR2(SEQ ID NO：2)、HCDR3(SEQ ID NO：3)、LCDR1(SEQ ID NO：4)、LCDR2(SEQ ID NO：5)及LCDR3(SEQ ID NO：6)，及b. 包含N297A胺基酸修飾之IgG1 Fc區。
2. 如請求項1之經分離抗體或抗原結合部分，其中該抗體或抗原結合部分展現低於10%之特異性細胞溶解，如在ADCC分析中所量測。
3. 如請求項2之經分離抗體或抗原結合部分，其中該抗體或抗原結合部分展現低於1%之特異性細胞溶解，如在ADCC分析中所量測。
4. 如請求項1之經分離抗體或抗原結合部分，其中該IgG1 Fc區為靜默IgG1 Fc區，其包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列。
5. 如請求項4之經分離抗體或抗原結合部分，其包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列，及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列。
6. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至5中任一項之抗體或抗原結合部分，與至少一種醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑組合。
7. 一種液體醫藥調配物，其包含如請求項1至5中任一項之抗體或抗原結合部分及至少一種緩衝劑。
8. 一種如請求項1至5中任一項之經分離抗體或抗原結合部分或如請求項6之組合物或如請求項7之調配物之用途，其係用於製備 抑制個體中之CD40L介導之CD40信號傳導之藥劑。
9. 如請求項8之用途，其中該個體患有自體免疫或發炎病症。
10. 如請求項9之用途，其中該自體免疫或發炎病症係多發性硬化症、全身性紅斑狼瘡症(Systemic Lupus Erythematosus)、狼瘡腎炎、發炎性腸病、克羅恩氏病(Crohn's disease)、休格連氏症候群(Sjögren's syndrome)、重症肌無力、類風濕性關節炎、動脈粥樣硬化或移植物排斥或移植物抗宿主疾病。
11. 一種經分離核酸，其編碼如請求項1至5中任一項之抗體或抗原結合部分。
12. 一種選殖或表現載體，其包含一或多種如請求項11之核酸。
13. 一種宿主細胞，其包含一或多種如請求項12之選殖或表現載體。
14. 一種產生如請求項1至5中任一項之抗體或抗原結合部分之方法，其包括培養如請求項13之宿主細胞，純化並回收該抗體或抗原結合部分。