CN110637035A - 经修饰的IgG1 Fc结构域与抗-CD40域抗体的融合 - Google Patents

经修饰的IgG1 Fc结构域与抗-CD40域抗体的融合 Download PDF

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Abstract

提供了与Fcγ受体结合减少的经修饰的IgG1 Fc结构域。还提供了包含经修饰的IgG1 Fc结构域的融合多肽。提供了一种与人CD40特异性结合的抗体多肽，其中所述抗体多肽是包含单一VH结构域的域抗体(dAb)和Fc结构域的融合。所述抗体多肽不显示出CD40激动活性，基本上不活化未成熟的树突状细胞和具有改善的生物物理学性质。

Description

经修饰的IgG1 Fc结构域与抗-CD40域抗体的融合
序列表
本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式电子提交，其全部内容通过引用在此并入。所述ASCII副本创建于2018年05月23日，名称为200896_0014_00_WO_ST25.txt，大小为245,881字节。
发明领域
提供了与Fcγ受体结合减少的经修饰的IgG1 Fc结构域。提供了包含抗-CD40单可变结构域和经修饰的Fc结构域的抗体多肽。抗体多肽结合CD40，不显示CD40激动活性，不活化未成熟的树突状细胞，并具有适于作为治疗剂研发的改善的生物物理性质。提供了包含其的组合物，用于治疗涉及CD40活性的疾病的方法和在制备用于治疗涉及CD40活性的药物中用途。
背景技术
CD40共刺激分子属于肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族，其存在于包括树突状细胞、B细胞和巨噬细胞在内的抗原提呈细胞(APC)上。当CD40与TH细胞上的其配体CD154(CD40L)结合时，APC被活化。CD40-介导的APC活化参与多种免疫应答，包括细胞因子产生、共刺激分子(如CD86)上调以及增强抗原提呈和B细胞增殖。CD40也可以由内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞和上皮细胞表达。
CD40激活也参与多种例如与自身免疫、移植排斥或变态反应相关的不需要的T细胞应答。控制不需要的T细胞应答的一种策略是使用拮抗性抗体靶向CD40。例如，单克隆抗体HCD122(鲁卡木单抗)，以前称为Chiron 1212，目前正在用于治疗某些CD40介导的炎性疾病的临床试验中。参见在因特网超文本传输协议clinicaltrialsfeeds.org/clinical-trials/show/NCT01275209上的临床试验摘要“HCD122(鲁卡木单抗)与苯达莫司汀联合疗法在CD40+利妥昔单-抗难治性滤泡性淋巴瘤中的研究”(最后更新于2011年01月11日)。但是，单克隆抗体可以显示出激动活性。例如，抗-CD40抗体Chi220的实用性受其较弱刺激潜能的限制。参见Adams等，“Development of a chimeric抗-CD40 monoclonal antibodythat synergizes with LEA29Y to prolong islet allograft survival,”J.Immunol.174:542-50(2005)。
对在治疗和/或预防免疫疾病中调节CD40活化的治疗剂具有持续的需求。
发明内容
提供了一种人IgG1 Fc结构域多肽，其包含在Kabat位置238的突变，所述突变减少与FCγ受体的结合，其中脯氨酸238(P238)突变为选自下述的残基之一：赖氨酸、丝氨酸、丙氨酸、精氨酸和色氨酸。IgG1 Fc可以包含SEQ ID NO:65所示的氨基酸序列。
提供了一种人IgG1 Fc结构域多肽，其在Kabat位置238包含赖氨酸取代。人IgG1Fc结构域多肽的示例性氨基酸序列是：
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(IgG1a-P238K(-C-末端Lys)；SEQ ID NO:134)，
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(IgG1a-P238K；SEQ ID NO:66)，
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(IgG1f-P238K(-C-末端Lys)；SEQ ID NO:135)，
和
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(IgG1f-P238K；SEQ ID NO:67)。
提供了一种融合多肽，包含：(a)异源多肽；和(b)Fc结构域，如上文所述。
还提供了一种抗体多肽，包含：(1)单可变结构域，所述单可变结构域包含：(a)CDR1区，其包含：SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1所示的CDR1区最多相差2个氨基酸的氨基酸序列，(b)CDR2区，其包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO:2所示的CDR2区最多相差3个氨基酸的氨基酸序列，和(c)CDR3区，其包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3所示的CDR1区最多相差6个氨基酸的氨基酸序列，和其中所述单可变结构域结合CD40；和(2)Fc结构域，其是人IgG1 Fc结构域多肽，在Kabat位置238包含减少与FCγ受体结合的突变，其中脯氨酸238(P238)突变为选自下述的残基之一：赖氨酸、丝氨酸、丙氨酸、精氨酸和色氨酸。本申请所述抗体多肽的单可变结构域拮抗CD40的至少一种活性。相对于参照多肽，本申请所述的抗体多肽具有增加的稳定性，所述参照多肽具有相同的单可变结构域序列且与野生型IgG1 Fc结构域融合。提供了一种抗体多肽，所述抗体多肽包含：(1)如上文所述的单可变结构域，其中人IgG1 Fc结构域在Kabat位置238具有赖氨酸取代。人IgG1 Fc结构域多肽的示例性氨基酸序列是：
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(IgG1a-P238K(-C-末端Lys)；SEQ ID NO:134)，
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(IgG1a-P238K；SEQ ID NO:66)，
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(IgG1f-P238K(-C-末端Lys)；SEQ ID NO:135)，
和
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(IgG1f-P238K；SEQ ID NO:67)。
还提供了一种如上文所述的抗体多肽，其中(a)CDR1区由X1-Tyr-Glu-Y1-Trp所示的序列(SEQ ID NO:4)组成，其中X1是Asp或Gly，和Y1是Met或Leu；(b)CDR2区由Ala-Ile-Asn-Pro-X2-Gly-Y2-Z2-Thr-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-A2-Gly所示的序列(SEQ ID NO:5)组成，其中X2是Gln、Tyr、His、Trp或Ala，Y2是Thr、Asn、Gly、Ser或Gln，Z2是Arg、Leu、Tyr、His或Phe，和A2是Lys或Met；和(c)CDR3区由X3-Pro-Y3-Z3-A3-B3-C3所示的序列(SEQ ID NO:6)组成，其中X3是Leu、Pro或Glu，Y3是Phe、Gln、Thr、Met或Tyr，Z3是Arg、Tyr、Pro、Leu、Thr、Ile、Phe、Met或Ser，A3是Phe或Tyr，B3是Ser、Gln、His、Asp、Lys、Glu或Gly，和C3是Asp、Tyr、Glu或Ser。
还提供了一种如上文所述的抗体多肽，其中：(a)CDR1区由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成(3h-56-269的CDR1)，(b)CDR2区由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成(3h-56-269的CDR2)，和(c)CDR3区由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列组成(3h-56-269的CDR3)。还提供了一种如上文所述的抗体多肽，其中单可变结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示(＝3h-56-269序列)。
提供了一种抗体多肽，其包含或由下述氨基酸序列组成：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRDYEMWWVRQAPGKGLERVSAINPQGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLPFRFSDRGQGTLVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:136)或
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRDYEMWWVRQAPGKGLERVSAINPQGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLPFRFSDRGQGTLVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:70)。
提供了一种抗体多肽，其包含或由下述氨基酸序列组成：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRDYEMWWVRQAPGKGLERVSAINPQGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLPFRFSDRGQGTLVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:137)或
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRDYEMWWVRQAPGKGLERVSAINPQGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLPFRFSDRGQGTLVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:71)。
还提供了一种编码本公开内容的任意人IgG1 Fc结构域多肽、融合多肽或抗体多肽的核酸。还提供了包含所述核酸的表达载体。提供了使用所述表达载体转化的细胞。
提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含上文所述的抗体多肽和药学上可接受的运载体。
一种在对象中治疗或预防免疫疾病的方法，所述方法包括向所述对象施用上文所述的抗体多肽。免疫疾病可以选自下组：艾迪生氏病、变态反应、过敏反应、强制性脊柱炎、哮喘、动脉粥样硬化、特应性变态反应、耳部自身免疫性疾病、眼部自身免疫性疾病、自身免疫性肝炎、自身免疫性腮腺炎、支气管哮喘、冠心病、克罗恩病、糖尿病、附睾炎、肾小球肾炎、格雷夫斯病、格林-巴利综合征、桥本氏病、溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜、炎性肠病、对重组药品(例如，血友病中的因子VII)的免疫应答、系统性红斑狼疮、多发性硬化、重症肌无力、天疱疮、银屑病、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、干燥综合征，脊柱关节炎、甲状腺炎、移植排斥、血管炎和溃疡性结肠炎。
附图说明
图1包括图1A和1B，描述了本公开内容使用的代表性抗体多肽的氨基酸序列。图1A描述了单可变结构域抗体BMS 3h-56-269(SEQ ID NO:41)和Fc结构域(IgG1a-P238K；SEQID NO:66)的抗体多肽融合的氨基酸序列(SEQ ID NO:70)。Fc结构域的氨基酸序列(SEQ IDNO:66)用斜体表示；带下划线且用斜体表示的残基23(对应于Kabat位置238)是脯氨酸至赖氨酸突变。图1B描述了单可变结构域抗体BMS 3h-56-269(SEQ ID NO:41)和另一Fc结构域(IgG1f-P238K；SEQ ID NO:67)的抗体多肽融合的氨基酸序列(SEQ ID NO:71)。Fc结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:67)用斜体表示。在图1A和1B中，单可变结构域的三个互补性决定区CDR1(SEQ ID NO:1)，CDR2(SEQ ID NO:2)和CDR3(SEQ ID NO:3)用下划线表示。四个框架区FR1(SEQ ID NO:42)，FR2(SEQ ID NO:44)，FR3(SEQ ID NO:47)和FR4(SEQ ID NO:54)的氨基酸没有下划线。接头的氨基酸序列AST(SEQ ID NO:57)用双下划线表示。
图2包括图2A-2E，描述了不同浓度的dAb-Fc融合针对多达9个iDC供体的iDC活化数据。图2A-2D：BMS-986090(与IgG4 Fc融合的抗-CD40 dAb)、CD40L(可溶性CD40三聚体(通过异亮氨酸拉链三聚化基序))和mAb134-2141(激动性抗-CD40抗体)针对CD86表达(图2A)、ICAM-1表达(图2B)、IL-6释放(图2C)和TNF-α释放(图2D)的剂量应答。ChiL6-IgG4(对照-L6)：阴性对照。未经刺激：仅iDC(未经刺激的)。浓度以μg/ml表示。图2E描述了对使用100μg/ml处理来自多达9个供体的iDC的BMS-986090与3h-59-269-aba(dAb-IgG1融合)的比较。
图3包括图3A-3D，描述了通过CD86表达(图3A)、ICAM表达(图3B)和细胞因子释放(在图3C中的IL-6和在图3D中的TNF-α)测量的3h-59-269-IgG4导致的CD32介导的交联/成簇使iDC活化的增加情况。显示了在溶液中或在交联(‘x-连接’)条件下使用所示浓度(以μg/ml计)处理的iDC；交联指加入表达CD32的CHO细胞。将ChiL6-IgG4作为阴性对照。
图4描述了来自使用具有IgG4、IgG1.1f、IgG1.3f和CT Fc尾的抗-CD40 dAb的iDC活化测定的数据。将L6-IgG4(ChiL6-IgG4)作为阴性对照；将激动性抗-CD40 mAb1234-2141作为阳性对照。使用所示浓度(μg/ml)处理iDC。对于除了3h-59-269-CT以外的所有融合蛋白而言，向iDC培养物中加入表达CD32的CHO细胞(右图)导致细胞因子释放的大幅增加和活化标记物的上调。
图5包括图5A-5E，描述了dAb-Fc分子的DSC热分析图数据。图5A)3h56-269-IgG4.1。图5B)3h56-269-CT。图5C)3h56-269-IgG1-D265A。图5D)3h56-269-IgG1.1f。图5E)3h56-269-IgG1.3f。在每幅图中，粗线表示热分析图数据和细线表示最简最佳拟合。
图6包括图6A-6F，描述了dAb-Fc分子的icIEF数据。图6A)3h56-269-IgG4.1。图6B)3h56-269-CT。图6C)3h56-269-CT(由UCOE-CHO细胞产生)。图6D)3h56-269-IgG1-D265A。图6E)3h56-269-IgG1.1f。图6F)3h56-269-IgG1.3f。在图A中的pI标记物如pI 5.85和pI10.10所示。
图7描述使用1μM的4种1F4抗体结合捕获7μg/ml hCD64-His的SPR传感图数据。
图8描述了标记pI值的具有不同Fc结构域的13种1F4单克隆抗体的icIEF数据。
图9描述了3h-59-269-IgG1-P238K和3h-59-269-IgG1-N297A的iDC活化数据。将L6-IgG4(ChiL6-IgG4)作为阴性对照；将BMS-986090(3h-59-269-IgG4)作为阳性对照。使用所示浓度(μg/ml)的抗体处理iDC。对于阳性对照3h-59-269-IgG4而言，向iDC培养物中加入表达CD32的CHO细胞(数据在每幅图左侧，用“+CD32 CHO”表示)导致细胞因子释放大量增加和活化标记物上调，而与在位置P238或位置N297具有单一突变的IgG1 Fc尾融合的dAb则不具有上述结果。
图10描述了具有不同Fc尾的抗-CD40域抗体-Fc融合蛋白的iDC活化。将L6-IgG4(ChiL6-IgG4)作为阴性对照；将激动性mAb1234-2141和BMS-986090(3h-59-269-IgG4)作为阳性对照。使用所示浓度(μg/ml)的抗体处理iDC。除了含有P238K或N297A突变的融合以外，使用所有融合蛋白均观察到了iDC活化，并且其随着加入表达CD32的CHO而增加(数据在每幅图左侧，用“+CD32 CHO”表示)。
图11包括图11A-11D，描述了dAb-Fc分子的DSC热分析图数据。图11A)3h56-269-IgG1a-C220S、C226A、C229A、P238S。图11B)3h56-269-IgG1a-C220S、C226A、C229A、P238K。图11C)3h56-269-IgG1a-C220S、P238K。图11D)3h56-269-IgG1f-C220S、N297A。
具体实施方式
根据该详细描述，下述缩写和定义适用。必须注意的是，除非在上下文中另有明确规定，否则如在本申请中所使用的单数形式的“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数指代。因而，例如，提及“一个抗体”时包括多个此类抗体和提及“该剂量”时包括一个或多个剂量以及本领域技术人员公知的等同物等等。
如本文中所使用的，术语“约”是本领域普通技术人员所理解的，并且将在使用其的上下文中在一定程度上变化。在通常情况下，除非在说明书中另外明示，否则“约”包括参照值正/负10％范围的值。
应当理解的是，本申请所述范围之间的任何和所有整数或部分整数都包括在内。
在本申请中使用的术语：
APC 抗原提呈细胞
CD54 也称为ICAM-1
CDR 互补性决定区
CH或CH 恒定重链
CL或CL 恒定轻链
CHO细胞 中国仓鼠卵巢细胞
dAb 域抗体
DSC 差示扫描量热法
FcgR Fcγ受体(可与FcγR互换使用)
FR 框架区
FSB 胎牛血清
GM-CSF 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子
iDC 未成熟树突状细胞
icIEF 成像毛细管等电聚焦
IFN 干扰素
IgG 免疫球蛋白G
IL-4 白介素-4
IL-6 白介素-6
mAb 单克隆抗体
mg 毫克
ml或mL 毫升
ng 纳克
nM 纳摩
pI 等电点
SPR 表面等离子体共振
TNF 肿瘤坏死因子
μg 微克
VL 可变轻链
VH 可变重链
本申请提供了进一步的缩写和定义。
1.Fc结构域
使用重链羧基末端“一半”定义恒定区(FC)并且其主要负责效应功能。如在本申请中所使用的，术语“Fc结构域”指包含根据Kabat等，Sequences of ImmunologicalInterest,5th ed.,U.S.Dept.Health&Human Services,Washington,D.C.(1991)所限定的CH2和CH3恒定结构域的恒定区抗体序列。本申请中公开的Fc结构域来源于人IgG，更具体地说是人IgG1 Fc区。人IgG1 Fc结构域包含在Kabat位置238的突变。该突变用选自下述的氨基酸取代脯氨酸238(P238)：赖氨酸(K)、丝氨酸(S)、丙氨酸(A)、精氨酸(R)和色氨酸(W)；或者选自赖氨酸和丝氨酸；或者选自赖氨酸。
IgG1 Fc结构域的示例性共有序列是：
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGXSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR(D/E)E(L/M)TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGZ(SEQ ID NO:65)，其中X是K、S、A、R或W，和Z是K或缺乏。在该序列中，位置23(带下划线的X)对应于Kabat位置238。
示例性的IgG Fc结构域序列如表1中所示。突变的残基用下划线表示。SEQ IDNOS:134和135是附加的示例性IgG Fc结构域序列。
表1
尽管人IgG重链基因编码C-末端赖氨酸，但是由于血液循环的裂解导致内源性抗体通常不存在赖氨酸。具有包含C-末端赖氨酸的IgG重链的抗体，当在哺乳动物细胞培养物中表达时，也可能具有可变水平的C-末端赖氨酸存在(Cai等，2011,BiotechnolBioeng.108(2):404-12)。因此，可以将本申请公开的任意IgG重链Fc结构域的C-末端赖氨酸省去。参见例如，SEQ ID NO：66和134，SEQ ID NO：67和135。类似地，可以任选地将SEQ IDNO:68和SEQ ID NO:69的C-末端的赖氨酸缺失。
突变的IgG1 Fc结构域显示出与Fcγ受体减少的结合。有利的是，如通过下述中的至少一种所测量的，与Fcγ受体结合减少降低或消除iDC活化：1)细胞因子IL-6和/或TNF-α的释放；和2)CD86和/或CD54细胞表面表达的上调。据信，与Fcγ受体结合减少还降低或消除未成熟树突状细胞上FcgR的成簇/交联。此外，突变的IgG1 Fc结构域能够有助于包含突变的IgG1 Fc结构域的抗体多肽的热稳定性和同质性。
2.包含突变的IgG1 Fc结构域的抗体多肽
本公开内容包括包含突变的IgG1 Fc结构域的融合多肽。
2.1.异源多肽
本公开内容包括异源多肽和本公开内容的突变IgG1 Fc结构域的融合多肽。异源多肽可以包含或由重链可变结构域组成。重链可变结构域的羧基末端可以与Fc结构域的氨基末端连接或融合。或者，重链可变结构域的羧基末端可以与接头氨基酸序列的氨基末端连接或融合，接头氨基酸序列本身与Fc结构域的氨基末端融合。或者，重链可变结构域的羧基末端可以与CH1结构域的氨基末端连接或融合，CH1结构域本身与Fc结构域融合。融合多肽可以包含全部或部分在CH1与CH2结构域之间的铰链区。任选地，接头氨基酸序列存在于重链可变结构域与Fc结构域之间。
2.2.域抗体
本公开内容还包括与Fc结构域融合的单可变结构域(域抗体)。“域抗体”(dAb)包括单可变结构域(VL或VH)，其能够与抗原(如CD40)特异性和单价结合。单可变结构域的羧基末端可以与Fc CH2结构域的氨基末端连接或融合。或者，单可变结构域的羧基末端可以与接头氨基酸序列的氨基末端连接或融合，接头氨基酸序列本身与Fc结构域的氨基末端融合。或者，可变结构域的羧基末端可以与CH1结构域的氨基末端连接或融合，CH1结构域本身与Fc CH2结构域融合。所述蛋白可以包含全部或部分在CH1和CH2结构域之间的铰链区。任选地，接头氨基酸序列存在于单可变结构域与Fc结构域之间。还提供了抗体多肽，其是包含抗-人CD40域抗体和经修饰的人Fc结构域的融合多肽。任选地，抗体多肽还包含插入域抗体与Fc结构域之间的氨基酸接头。示例性的抗体多肽如图1中所示。
2.2.1.抗-CD40域抗体
本公开内容的抗体多肽包含与人CD40特异性结合并且不显示出CD40激动活性的域抗体。“域抗体”(dAb)包括能够与抗原(如CD40)特异性结合和单价结合的单可变结构域(VL或VH)。域抗体含有“VH结构域”并且是人的。据信，二价抗-CD40抗体显示出激动活性，因为其能够细胞表面上结合的CD40分子交联。尽管不希望受到任何特定理论的束缚，但是据信单价dAb不活化CD40，因为dAb不交联CD40。
CD40也称为B-细胞表面抗原CD40、Bp50、CD40L受体、CDw40、CDW40、MGC9013、p50、TNFRSF5和肿瘤坏死因子受体超家族成员5。“人CD40”指包含下述氨基酸序列的CD40：:
如在本申请中所使用的，术语“可变结构域”指由Kabat等，Sequences ofImmunological Interest,5th ed.,U.S.Dept.Health&Human Services,Washington,D.C.(1991)定义的免疫球蛋白可变结构域。可变结构域内的CDR氨基酸残基的编号和位置是根据本领域熟知的Kabat编号确定的。例如，在表2中将BMS3h-56-269的Kabat编号(SEQ IDNO:41)与相同序列进行比较，其中氨基酸顺序编号。在Kabat编号中，BMS3h-56-269具有插入残基52A、82A、82B、82C，并缺少残基100。
表2
当应用于抗体多肽时，术语“人”指具有来源于人免疫球蛋白序列(例如，FR和/或CH结构域)的抗体多肽。
当序列(a)从人个体或来自人个体的细胞或细胞系分离；(b)从克隆的人抗体基因序列或人抗体可变结构域序列文库分离；或者(c)通过对一种或多种上述多肽突变和选择而多样化时，则序列“来自”人免疫球蛋白编码序列。
如在本申请中所使用的，“分离的”化合物指将所述化合物从与所述化合物天然结合的至少一种组分中除去。
如在本申请中所使用的，“特异性结合”指例如通过表面等离子体共振所测量的抗体以约1μM或更低的解离常数(Kd)与抗原的结合。适宜的测定系统包括BIAcoreTM表面等离子体共振(SPR)系统和BIAcoreTM动力学评价软件(例如，2.1版)。
本申请所述抗体多肽与CD40的结合拮抗CD40活性。“CD40活性”包括但不限于T细胞活化(例如，诱导T细胞增殖或细胞因子分泌)，巨噬细胞活化(例如，在巨噬细胞中诱导活性氧和一氧化氮)和B细胞活化(例如，B细胞增殖、抗体同种型转换或分化为浆细胞)。可以通过与其他分子相互作用介导CD40活性。“CD40活性”包括CD40与下述分子之间的功能性相互作用，括号中是由其Uniprot登录号标识的这些分子：
CALR (P27797)；
ERP44 (Q9BS26)；
FBL (P22087)；
POLR2H (P52434)；
RFC5 (P40937)；
SGK1 (O00141)；
SLC30A7 (Q8NEW0)；
SLC39A7 (Q92504)；
TRAF2 (Q5T1L5)；
TRAF3 (Q13114)；
TRAF6 (Q9Y4K3)；
TXN (Q5T937)；
UGGT1 (Q9NYU2)；和
USP15 (Q9Y4E8)。
例如，CD40“活性”包括与TRAF2的相互作用。CD40/TRAF2相互作用活化NF-κB和JNK。参见Davies等，Mol.Cell Biol.25:9806-19(2005)。因此，这种CD40活性可以由相对于参照的CD40依赖性细胞NF-κB和JNK活化确定。如在本申请中所使用的，术语“活化(activate)”、“活化(activates)”和“活化的(activated)”指与参照相比给定可测量的CD40活性增加至少10％，例如，至少10％、25％、50％、75％、或甚至100％或者更多。如果CD40活性降低至少10％，则CD40活性被“拮抗”，并且在一个示例性实施方式中，与不存在拮抗剂相比，降低至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％或甚至100％(即，检测不到活性)。例如，抗体多肽可以拮抗一些或全部CD40活性，但不活化CD40。在一个实施方式中，抗体多肽可以不活化B细胞增殖。在另一个实施方式中，抗体多肽不活化T细胞分泌细胞因子，其中所述细胞因子是选自下组的至少一种细胞因子：IL-2、IL-6、IL-10、IL-13、TNF-α、IFN-γ。
本公开内容的抗体多肽可以向人类患者施用，同时极大地避免了通常由施用来自其他物种(例如，小鼠)的抗体所激发的抗-抗体免疫应答。例如，可以根据本领域熟知的程序通过移植小鼠CDR到人可变结构域FR将小鼠抗体“人源化”。然而，可以生产如本申请所述的人抗体而无需对小鼠抗体序列进行基因操纵。
在本公开内容中使用的抗-CD40域抗体包含三个互补性决定区(CDR)和四个框架区(FR)，其从氨基末端到羧基末端按照以下顺序排布：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。这3个CDR含有与抗原特异性相互作用的大部分残基并且主要负责抗原识别。
在2014年04月10日公开的，发明名称为“拮抗CD40的抗体多肽”的美国公开号2014/0099317中描述了特异性结合单一CD40表位的单可变结构域抗体多肽的种类，其全部内容通过引用并入本申请。在结构上和功能上对抗体多肽进行了表征，还在2014年04月10日公开的美国公开号2014/0099317中对数据进行了描述。BMS3h-56-269是示例性单可变结构域抗体多肽，其与人CD40特异性结合，但不激动人CD40，如在美国公开号2014/0099317中所公开的。
CDR含有与抗原形成特异性相互作用的大部分残基。本公开内容的抗体多肽的单可变结构域含有CDR1、CDR2和CDR3区，其具有与BMS3h-56-269(SEQ ID NO:41)的CDR1、CDR2和CDR3区相同的氨基酸序列，或者与BMS3h-56-269的每个CDR1、CDR2和CDR3区有1个、2个、3个、4个、5个或6个氨基酸不同的氨基酸序列。
BMS3h-56-269(SEQ ID NO:41)的氨基酸序列如下所示。
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRDYEMWWVRQAPGKGLERVSAINPQGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLPFRFSDRGQGTLVTVSS
3个互补性决定区的氨基酸用下划线表示。CDR1的氨基酸序列是DYEMW(SEQ IDNO:1)。CDR2的氨基酸序列是AINPQGTRTYYADSVKG(SEQ ID NO:2)，和CDR3的氨基酸序列是LPFRFSD(SEQ ID NO:3)。编码BMS3h-56-269氨基酸序列的示例性核酸序列是：
本公开内容提供的抗体多肽的可变结构域包含与BMS3h-56-269的CDR1、CDR2和CDR3区(分别为SEQ ID NO:1-3)具有相同氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3，或者与BMS3h-56-269的每个CDR1、CDR2和CDR3区有1个、2个、3个、4个、5个或6个氨基酸不同的氨基酸序列。CDR1区可以最多有2个氨基酸与SEQ ID NO:1不同。CDR2区可以最多有3个氨基酸与SEQID NO:2不同。CDR3区可以最多有6个氨基酸与SEQ ID NO:3不同。因而，抗体多肽的可变结构域可以包含：(a)CDR1区，其含有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1的CDR1区最多具有2个氨基酸不同的氨基酸序列，(b)CDR2区，其含有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2的CDR2区最多具有3个氨基酸不同的氨基酸序列，和(c)CDR3区，其含有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3的CDR3区最多具有6个氨基酸不同的氨基酸序列，并且其中所述单可变结构域结合CD40。抗体多肽的可变结构域可以包含：(a)CDR1区，其由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成，或者由与SEQ ID NO:1的CDR1区最多具有2个氨基酸不同的氨基酸序列组成，(b)CDR2区，其由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成，或者由与SEQ ID NO:2的CDR1区最多具有3个氨基酸不同的氨基酸序列组成，和(c)CDR3区，其由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列组成，或者由与SEQ ID NO:3的CDR3区最多具有6个氨基酸不同的氨基酸序列组成，并且其中所述单可变结构域结合CD40。
在第2.5节描述了示例性的抗体多肽。这里描述了其他示例性抗体。
本申请所公开的抗体多肽的可变结构域可以包含(a)CDR1区，其由序列X1-Tyr-Glu-Y1-Trp(SEQ ID NO:4)组成，其中X1是Asp或Gly，和Y1和Met或Leu；(b)CDR2区，其由序列Ala-Ile-Asn-Pro-X2-Gly-Y2-Z2-Thr-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-A2-Gly(SEQ ID NO:5)组成，其中X2是Gln、Tyr、His、Trp或Ala，Y2是Thr、Asn、Gly、Ser或Gln，Z2是Arg、Leu、Tyr、His或Phe，和A2是Lys或Met；和(c)CDR3区，其由序列X3-Pro-Y3-Z3-A3-B3-C3(SEQ ID NO:6)组成，其中X3是Leu、Pro或Glu，Y3是Phe、Gln、Thr、Met或Tyr，Z3是Arg、Tyr、Pro、Leu、Thr、Ile、Phe、Met或Ser，A3是Phe或Tyr，B3是Ser、Gln、His、Asp、Lys、Glu或Gly，和C3是Asp、Tyr、Glu或Ser。
本申请公开的抗体多肽的可变结构域可以包含(a)CDR1区，其由序列X1-Tyr-Glu-Y1-Trp(SEQ ID NO:4)组成，其中X1是Asp，和Y1是Met；(b)CDR2区，其由序列Ala-Ile-Asn-Pro-X2-Gly-Y2-Z2-Thr-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-A2-Gly(SEQ ID NO:5)组成，其中X2是Gln、Tyr、His、Trp或Ala，Y2是Thr、Asn、Gly、Ser或Gln，Z2是Arg、Leu、Tyr、His或Phe，和A2是Lys；和(c)CDR3区，其由序列X3-Pro-Y3-Z3-A3-B3-C3(SEQ ID NO:6)组成，其中X3是Leu，Y3是Phe、Gln、Thr或Met，Z3是Arg、Tyr、Leu、Thr或Phe，A3是Phe，B3是Ser、Gln、His、Asp或Glu，和C3是Asp或Glu。
本申请公开的抗体多肽的可变结构域可以包含(a)CDR1区，其由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成；(b)CDR2区，其由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成；和(c)CDR3区，其由选自下组的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO；16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:22和SEQ ID NO:23。
本申请公开的抗体多肽的可变结构域可以包含(a)CDR1区，其由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成；(b)CDR2区，其由SEQ ID NO:27的氨基酸序列组成；和(c)CDR3区，其由选自下组的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQID NO:26。
本申请公开的抗体多肽的可变结构域可以包含(a)CDR1区，其由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成；(b)CDR2区，其由选自下组的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:37；和(c)CDR3区，其由SEQ ID NO:7的氨基酸序列组成。
本申请公开的抗体多肽的可变结构域可以包含(a)a CDR1区，其由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成；(b)CDR2区，其由选自下组的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:38；和(c)CDR3区，其由SEQID NO:8的氨基酸序列组成。
本申请公开的抗体多肽的可变结构域可以包含(a)CDR1区，其由选自下组的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40；(b)CDR2区，其由SEQ ID NO:27的氨基酸序列组成；和(c)CDR3区，其由选自下组的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:24。
本申请公开的抗体多肽的可变结构域可以包含(a)CDR1区，其由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成；(b)CDR2区，其由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成；和(c)CDR3区，其由SEQ IDNO:3的氨基酸序列组成。本申请公开的抗体多肽的可变结构域可以包含或由SEQ ID NO:41的氨基酸序列(3h-56-269序列)组成。
本申请公开的抗体多肽的可变结构域可以包含CDR1区、CDR2区和CDR3区，其中CDR1区的氨基酸序列、CDR2区的氨基酸序列和CDR3区的氨基酸序列选自下组：
(1)分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3；
(2)分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:7；
(3)分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:8；
(4)分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:9；
(5)分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:10；
(6)分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:11；
(7)分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:12；
(8)分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:13；
(9)分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:14；
(10)分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:15；
(11)分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:16；
(12)分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:17；
(13)分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:18；
(14)分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:19；
(15)分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:20；
(16)分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:21；
(17)分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:22；
(18)分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:23；
(19)分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:7；
(20)分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:8；
(21)分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:24；
(22)分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:25；
(23)分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:26；
(24)分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:7；
(25)分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:8；
(26)分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:7；
(27)分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:8；
(28)分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:7；
(29)分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:8；
(30)分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:8；
(31)分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:7；
(32)分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:8；
(33)分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:7；
(34)分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:8；
(35)分别为SEQ ID NO:39,SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:8；
(36)分别为SEQ ID NO:39,SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:24；
(37)分别为SEQ ID NO:40,SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:8；和
(38)分别为SEQ ID NO:40,SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:24。
在抗体多肽中的可变结构域可能有至多10个氨基酸或其间任意整数值的氨基酸不同于BMS3h-56-269的可变结构域，其中所述变体的可变结构域与CD40特异性结合。或者，所述变体的可变结构域与BMS3h-56-269的序列可以具有至少90％的序列同一性(例如，至少92％、95％或98％的序列同一性)。在两条序列之间不同的氨基酸残基或氨基酸可以代表氨基酸取代、添加或缺失。当通过任意适宜的氨基酸序列比对算法(如BLAST)对两条序列进行比对时，两条序列之间不同的残基显示为不同位置。
可变结构域可以包含一个或多个框架区(FR)，其具有与由人种系抗体基因区段编码的相应框架区相同的氨基酸序列。例如，域抗体可以包含VH种系基因区段DP47、DP45或DP38，Vκ种系基因区段DPK9，JH区段JH4b或Jκ区段Jκ1。
示例性的框架区包括来自3h-56-269的框架区：FR1＝EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFR(3h-56-269的氨基酸1-30)；FR2＝WVRQAPGKGLERVS(3h-56-269的氨基酸36-49)；FR3＝RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK(3h-56-269的氨基酸67-98)；FR4＝RGQGTLVTVSS(3h-56-269的氨基酸106-116)。这些序列分别对应于表3中的SEQ ID NO：42、44、47和54。其他示例性框架区如表3中所示。
表3
其他示例性框架区是美国专利公开号2014-0099317中公开的3h-56-269谱系克隆的那些。
包含突变的IgG1 Fc结构域的抗-CD40抗体多肽在免疫疾病的治疗或预防中具有治疗性价值。将蛋白质治疗剂推向市场需要该分子具有适当的物理和化学性质以进行开发，通常将其称为化学生产和控制(CMC)。还将分子的物理和化学性质，包括稳定性、溶解性和同质性统称为“可开发性”。有利的是，与同其他IgF1和IgF4 Fc结构域连接的相同抗-CD40可变结构域相比，包含突变的IgG1 Fc结构域的抗-CD40抗体多肽显示出改善的可开发性。包含突变的IgG1 Fc结构域的抗-CD40抗体多肽显示出与Fcγ受体结合减少，如通过SPR所测量的，并且显示出降低的或无法检测到的iDC活化，如通过下述中的至少一种所测量的：1)细胞因子IL-6和/或TNF-α的释放；和2)CD86和/或CD54细胞表面表达的上调。此外，包含突变的IgG1 Fc结构域的抗-CD40抗体多肽具有改善的热稳定性，如通过DSC所测量的，以及改善的物理稳定性，如在加速稳定性试验条件下所测量的。包含突变的IgG1 Fc结构域的抗-CD40抗体多肽具有改善的同质性。
2.3.接头
在一个实施方式中。融合抗体多肽的抗体多肽可以通过“氨基酸接头”或“接头”连接。例如，dAb可以与氨基酸接头的N-末端融合，和Fc结构域可以与接头的C-末端融合。尽管氨基酸接头可以是任何长度并且可以由氨基酸的任何组合构成，但是接头的长度可以相对较短(例如，5个或更少的氨基酸)，以减少所连接结构域之间的相互作用。还可以对接头的氨基酸组成进行调整以减少具有大侧链的氨基酸或可能引入二级结构的氨基酸的数量。适宜的氨基酸接头包括但不限于长度可达3、4、5、6、7、10、15、20或25个氨基酸的那些。可以将接头AST(SEQ ID NO:57)用于融合多肽中。其他代表性的氨基酸接头序列包含GGGGS(SEQID NO:58)，以及接头包含GGGGS的2、3、4或5个拷贝(分别为SEQ ID NO：59-62)。表4列出了用于本公开内容的示例性的接头序列。
表4
AST SEQ ID NO:57
GGGGS SEQ ID NO:58
(GGGGS)<sub>2</sub> SEQ ID NO:59
(GGGGS)<sub>3</sub> SEQ ID NO:60
(GGGGS)<sub>4</sub> SEQ ID NO:61
(GGGGS)<sub>5</sub> SEQ ID NO:62
TVAAPS SEQ ID NO:63
TVA SEQ ID NO:73
ASTSGPS SEQ ID NO:74
2.4示例性的抗体多肽
示例性的抗体多肽包含：(1)单可变结构域，所述单可变结构域包含：(a)CDR1区，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1的CDR1区具有至多2个氨基酸不同的氨基酸序列，(b)CDR2区，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2的CDR2区具有至多3个氨基酸不同的氨基酸序列，和(c)CDR3区，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与SEQID NO:3的CDR3区具有至多6个氨基酸不同的氨基酸序列，并且其中所述单可变结构域结合CD40；和(2)Fc结构域，其是包含在Kabat位置238的突变的人IgG1 Fc结构域多肽，所述突变减少与FCγ受体的结合，其中脯氨酸238(P238)突变为选自下述的残基之一：赖氨酸、丝氨酸、丙氨酸、精氨酸和色氨酸。本申请所述的抗体多肽的单可变结构域拮抗CD40的至少一种活性。相对于具有与野生型IgG1 Fc结构域融合的相同单可变结构域的参照多肽，如本申请所述的抗体多肽具有增加的稳定性。提供了一种抗体多肽，其包含：(1)如上文所述的单可变结构域，其中人IgG1 Fc结构域在Kabat位置238具有赖氨酸取代。
人IgG1 Fc结构域多肽的示例性氨基酸序列为：
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(IgG1a-P238K；SEQ ID NO:134)，
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(IgG1a-P238K；SEQ ID NO:66)，
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(IgG1f-P238K；SEQ ID NO:135)，
和
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(IgG1f-P238K；SEQ ID NO:67)。
示例性的抗体多肽是如上文所述的，其中(a)CDR1区由序列X1-Tyr-Glu-Y1-Trp(SEQ ID NO:4)组成，其中X1是Asp或Gly，和Y1是Met或Leu；(b)CDR2区由序列Ala-Ile-Asn-Pro-X2-Gly-Y2-Z2-Thr-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-A2-Gly(SEQ ID NO:5)组成，其中X2是Gln、Tyr、His、Trp或Ala，Y2是Thr、Asn、Gly、Ser或Gln，Z2是Arg、Leu、Tyr、His或Phe，和A2是Lys或Met；和(c)CDR3区由序列X3-Pro-Y3-Z3-A3-B3-C3(SEQ ID NO:6)组成，其中X3是Leu、Pro或Glu，Y3是Phe、Gln、Thr、Met或Tyr，Z3是Arg、Tyr、Pro、Leu、Thr、Ile、Phe、Met或Ser，A3是Phe或Tyr，B3是Ser、Gln、His、Asp、Lys、Glu或Gly，和C3是Asp、Tyr、Glu或Ser。
示例性的抗体多肽是如上文所述的，其中：(a)CDR1区由SEQ ID NO:1所示的序列组成(3h-56-269的CDR1)，(b)CDR2区由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成(3h-56-269的CDR2)，和(c)CDR3区由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列组成(3h-56-269的CDR3)。还提供了如上文所述的抗体多肽，其中单可变结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:41中所示(＝3h-56-269序列)。
示例性的抗体多肽包含或由下述氨基酸序列组成：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRDYEMWWVRQAPGKGLERVSAINPQGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLPFRFSDRGQGTLVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:70)。
示例性的抗体多肽包含或由下述氨基酸序列组成：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRDYEMWWVRQAPGKGLERVSAINPQGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLPFRFSDRGQGTLVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:136)。
示例性的抗体多肽包含或由下述氨基酸序列组成：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRDYEMWWVRQAPGKGLERVSAINPQGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLPFRFSDRGQGTLVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:71)。
示例性的抗体多肽包含或由下述氨基酸序列组成：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRDYEMWWVRQAPGKGLERVSAINPQGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLPFRFSDRGQGTLVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:137)。
2.5.抗体多肽的制备
可以仅使用常规技术在任意适宜哺乳动物宿主细胞系(如CHO、HEK293、COS、NSO等)中生产和纯化本公开内容的抗体多肽，随后使用一种或多种方法进行纯化，包括蛋白A亲和层析、离子交换、反相技术等。
本公开内容还提供了编码本公开内容的抗体多肽的核酸。可以将核酸插入载体，如适宜的表达载体，例如pHEN-1(Hoogenboom等，(1991)Nucleic Acids Res.19:4133-4137)。还提供了一种分离的宿主细胞，所述分离的宿主细胞包含编码所公开的抗体多肽的载体和/或核酸。
3.药物组合物和治疗方法
药物组合物包含治疗有效量的一种或多种抗体多肽和任选地药学上可接受的运载体。药学上可接受的运载体包括例如水、盐水、磷酸盐缓冲液、右旋糖、甘油、乙醇等及其组合。药学上可接受的运载体可以进一步包含少量辅助物质，如润湿剂或乳化剂、防腐剂或者增加融合蛋白半衰期或有效性的缓冲剂。可以将组合物制剂，以便在施用后提供活性成分的快速、持续或延迟释放。适宜的药物组合物以及用于制备其的方法是本领域熟知的。参见例如，Remington,The Science and Practice of Pharmacy,A.Gennaro等编著，21sted.,Mack Publishing Co.(2005)。
药物组合物可以进一步包含免疫抑制剂/免疫调节剂和/或抗炎剂。
一种在需要此类治疗的患者中治疗免疫疾病的方法可以包括向患者施用治疗有效量的药物组合物。拮抗CD40-介导的T细胞活化能够抑制例如在自身免疫、移植排斥或变态反应期间出现的不利T细胞应答。抑制CD40-介导的T细胞活化能够调节这些疾病的进展和/或严重程度。
还提供了使用本公开内容的抗体多肽或其药学上可接受的盐在制备用于在需要此类治疗的患者中治疗免疫疾病的药物中的用途。例如，可以将所述药物与免疫抑制剂/免疫调节剂和/或抗炎剂联合施用。
如在本申请中所使用的，“患者”指动物，例如哺乳动物，包括人。患者可以被诊断为患有免疫疾病。“治疗(treatment)”或“治疗(treat)”或“治疗(treating)”指涉及减轻症状、病症、病况或疾病的进展或严重程度的方法。“免疫疾病”指与个体中的免疫反应进展相关的任何疾病，包括细胞和/或体液免疫反应。免疫疾病的实例包括但不限于炎症、变态反应、自身免疫性疾病或移植相关疾病。“自身免疫性疾病”指与个体中的自身免疫反应进展相关的任何疾病，包括细胞和/或体液免疫反应。自身免疫性疾病的实例是炎性肠病(IBD)，包括但不限于溃疡性结肠炎和克罗恩病。其他自身免疫性疾病包括系统性红斑狼疮、多发性硬化症、类风湿性关节炎、糖尿病、银屑病、硬皮病和动脉粥样硬化。移植相关疾病包括移植物抗宿主病(GVHD)、急性移植排斥和慢性移植排斥。
能够通过施用本公开内容的抗体治疗的疾病可以选自下组：艾迪生氏病、变态反应、过敏反应、强制性脊柱炎、哮喘、动脉粥样硬化、特应性变态反应、耳部自身免疫性疾病、眼部自身免疫性疾病、自身免疫性肝炎、自身免疫性腮腺炎、支气管哮喘、冠心病、克罗恩病、糖尿病、附睾炎、肾小球肾炎、格雷夫斯病、格林-巴利综合征、桥本氏病、溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜、炎性肠病、对重组药品(例如，血友病中的因子VII)的免疫应答、系统性红斑狼疮、多发性硬化、重症肌无力、天疱疮、银屑病、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、干燥综合征，脊柱关节炎、甲状腺炎、移植排斥、血管炎和溃疡性结肠炎。
药物组合物可以单独施用，或者作为与免疫抑制剂/免疫调节剂和/或抗炎剂的联合疗法(即，同时或顺序)施用。不同免疫疾病可能需要使用用于治疗免疫疾病的特定辅助化合物，其取决于患者的具体情况。例如，可以将药物组合物与一种或多种适宜的佐剂(例如，细胞因子(例如，IL-10和IL-13))或他免疫刺激剂(例如，趋化因子、肿瘤相关抗原和肽)联合施用。适宜的佐剂是本领域公知的。
可以将任何适宜的方法或途径用于施用抗体多肽或药物组合物。施用途径包括例如口服、静脉内、腹膜内、皮下或肌内施用。所施用抗体的治疗有效剂量取决于很多因素，例如包括所治疗的免疫疾病的类型和严重程度，联合疗法的使用，抗体或药物组合物的施用途径以及患者的体重。相对于患者的体重，域抗体治疗有效量的非限制性范围是0.1-20mg/kg以及在一个方面中是1-10mg/kg。
4.试剂盒
提供了用于在人类患者中治疗免疫疾病的试剂盒。在一个实施方式中，试剂盒可以包含(a)一剂本公开内容的抗体多肽和(b)在治疗本申请所公开的人类患者免疫疾病的方法中使用所述抗体多肽的说明性材料。
作为在本申请中使用的术语，“说明性材料”包括出版物、记录、图表或任何其他表达媒介，可以将其用于传达试剂盒中本发明组合物和/或化合物的有用性。例如，可以将试剂盒的说明性材料固定在含有本发明化合物和/或组合物的容器上，或者与装有所述化合物和/或组合物的容器一起运输。或者，可以将说明性材料与容器分开运输，其目的是使接收者协同使用说明性材料和化合物。例如，可以通过出版物的实际交付或传达试剂盒有用性的其他表达媒介，或者可以通过电子传输(例如，通过计算机，如通过电子邮件)或从网站下载来实现传递说明性材料。
实施例
材料和方法：在本章节中描述了在下述实施例中使用的材料和方法。在实施例中公开了其他方法。
蛋白：在HEK293(人胚肾细胞来源的细胞系)或Expi 293细胞中表达抗体和dAb-Fc蛋白，并且先使用标准蛋白A亲和层析，再使用制备级体积排阻色谱进行纯化。在从UCOE-CHO细胞中表达和纯化了一些选定的样品(用“UCOE-CHO”标记的样品)。
CD40结合动力学和亲和性：在通过在BIAcoreTM T100或T200仪器(GE HealthcareLife Sciences,Marlborough,MA)上进行SPR测量dAb-Fc和抗体分子的CD40结合亲和性，其在固化的蛋白A传感器芯片表面上捕获dAb-Fc或抗体，然后结合人-CD40-单体蛋白(内部制备)，该测定使用的结合时间为180秒，解离时间为360秒，以30微升每分钟(μl/min)在pH7.1的PBS-T中进行。为了表征结合亲和力，将人-CD40-Fc(内部制备)固化在CM5传感器芯片上，并对Ab-Fc或抗体分析物的结合情况进行检测，使用的结合时间为180秒，解离时间为240秒，以30μl/min进行。
实施例1：在存在或不存在FcγR交联的条件下使用dAb-Fc分子处理iDC
3h56-269-IgG4.1是抗-CD40 dAb-FC(IgG4)融合蛋白(SEQ ID NO:75)。如WO2012/145673中所述的，在B细胞或T细胞耗竭的外周血单核细胞(PBMC)中未观察到3h56-269-IgG4.1的直接激动剂活性。为了进一步表征3h56-269-IgG4.1的生物活性和安全性性质，测定了3h56-269-IgG4.1对未成熟树突状细胞(iDC)的作用。
在本实施例中使用的材料和方法包括下述：
原代细胞的分离和培养：从正常健康人供体收集外周血。通过Ficoll密度梯度分离法从肝素化的人血液中分离外周血单核细胞(PBMC)。按照Manual EasySep方案(STEMCELL,Vancouver,Canada)从PBMC中分离单核细胞。在6孔板的每个孔中接种一百万个分离的单核细胞，每孔含6ml完全培养基(RPMI-1640，10％热灭活胎牛血清，100单位/ml青霉素-链霉素)，还含有人IL-4(100纳克每毫升(ng/ml))和人GM-CSF(100ng/ml)，在37℃和5％CO2下孵育6天。隔日更换培养基并更换为含有相同浓度细胞因子的新鲜培养基。在第6天通过离心收集未成熟的树突状细胞(iDC)，彻底洗涤，并在完全培养基中重悬。
未成熟树突状细胞活化测定：通过评估特定细胞因子的释放和特定细胞表面分子的表达测定未成熟树突状细胞(iDC)的活化情况。在完全培养基中制备各种生物试剂的滴定，并加入96孔板中(双复孔)。在交联的情况下(通过加入表达CD32a的CHO细胞)，在加入表达CD32a的CHO细胞之前30分钟向iDC中加入待测抗体。表达CD32a的CHO细胞与iDC之比为1:6。
为评估细胞因子，将细胞在37℃和5％CO2中孵育约18-20小时；从每孔中移出150微升(μL)上清液，按照1:5稀释并根据生产厂商的说明书使用市售ELISA试剂盒(R&DSystems,Minneapolis,MN)评价IL-6、TNFα和IL-12的蛋白浓度。
为评估CD86、ICAM-1(也称为CD54)和CD83的表达，将收集了上清液后仍留在板中的细胞合并成每个双复管1个样品，将其转移至新的96孔圆底(RB)培养板中，并置于4℃下。使用无Ca++和Mg++的D-PBS洗涤细胞，并使用可固定的近红外死细胞染色试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA)在冰上染色30min，以测定细胞活力。洗涤细胞并将其重悬于不含Ca++和Mg++，含2％FBS，0.1％NaN3(染色缓冲液)的D-PBS中，并且使用含人TruStainFcXTM(Fc受体封闭溶液，Biolegend,San Diego,CA)的染色缓冲液进行封闭(5μl/孔)。使用下述对DC进行免疫染色：PerCpCy5.5-缀合的αCD3、αCD19、αCD14(Lin-)，BUV395-缀合的αCD11c(BD Biosciences,San Diego,CA)，APC-缀合的αCD86(Biolegend,San Diego,CA)，PE-缀合的αCD83(eBioscience,San Diego,CA)，FITC-缀合的αCD54(Biolegend,SanDiego,CA)，并在4℃下孵育45分钟。在染色缓冲液中洗涤细胞两次，并通过加入100μl BDCytofix固定缓冲液(BD Bioscience,San Diego,CA)固定(在室温下(RT)15min，避光)。使用LSRII-FortessaTM流式细胞仪(BD Biosciences,San Diego,CA)和分析软件(Treestar,Ashland,OR)针对CD86、ICAM-1和CD83的表达情况对iDC进行评价。
CP-870,893mAb是众所周知的激动性CD mAb(参见例如，Vonderheide等，2007,J.Clin.Oncol.25(7):876-883)。在这些研究中，将CP-870,893mAb(在本申请中称为mAb134-2141；内部制备)作为阳性对照。另一个阳性对照是可溶性CD40L三聚体分子(内部制备)，其由异亮氨酸拉链三聚化基序三聚化。在一些实验中，将CHI-L6 IgG4(内部制备)作为阴性对照，其是非-CD40结合蛋白与IgG4.1 Fc尾之间的融合蛋白。
dAb-Fc：在本实验中研究的dAb-Fc的氨基酸序列如表5中所示。在这些序列中，单可变结构域3h56-269残基是氨基酸1-118(用下划线表示)。接头AST(SEQ ID NO:57)用双下划线表示。无格式的C-末端残基为Fc结构域。
表5
结果：测定了3h56-269-IgG4.1对未成熟树突状细胞(iDC)的作用。评价了CD86和ICAM-1(CD54)的表达上调以及细胞因子(例如，IL-6、TNF)释放情况。在来自9个不同供体的iDC上进行测定。在9个供体的1个中使用30μg/ml 3h56-269-IgG4.1和在9个供体的2个中使用100μg/ml 3h56-269-IgG4.1观察到iDC上CD86表达的适度增加，在9个供体的1个中观察到类似的细胞因子释放的适度增加。参见图2A-D。因而，结论是，Fc-抗-CD40 dAb融合3h56-269-IgG4.1在一小部分供体中活化未成熟树突状细胞(iDC)。
未成熟DC表达FcgR和CD40并对CD40活化敏感。因此，探索了FcgR介导的成簇或交联能够负责所观察到的3h56-269-IgG4.1活化iDC的可能性。3h-56-269-CT(SEQ ID NO:76)是相同的抗-CD40 dAb(3h-56-269)与IgG1 Fc尾的融合，其具有降低的FcgR结合，在本申请中将其称为“CT”或“aba”。CT Fc结构域是(阿巴西普，Bristol-Myers SquibbCompany,New York,NY)中存在的Fc结构域。阿巴西普是CTLA-4的胞外域与IgG1 Fc结构域的融合，对IgG1 Fc结构域进行了修饰以降低Fc结构域的效应功能并消除了IgG1铰链区中的链间二硫键。3h-56-269-CT具有降低的FcgR结合。
检测了100μg/ml 3h-59-269-CT对来自9个供体的iDC的作用。当与阴性对照CHI-L6 IgG4(非-CD40蛋白与IgG F4尾之间的融合蛋白)进行比较时，9个供体iDC未显示出细胞因子释放，也未显示出CD86或CD54上调。而相反的是，在9个供体中的3个的子集中，3h56-269-IgG4.1显示出活化iDC，其中观察到至少一个iDC活化指标高于对照。在所有供体中检测到CD40激动剂mAb 134-214刺激CD86和ICAM表达以及细胞因子释放。参见图2E。
这些数据表明融合蛋白的Fc部分在iDC活化中的作用。具体而言，这些观察结果表明在iDC表面上3h56-269-IgG4.1的IgG4.1 Fc结构域导致的FcgR成簇或交联可能负责在供体子集中观察到的活化。3h-59-269-CT融合蛋白iDC活化减少与通过表面等离子体共振(SPR)评估得到的与FcgR受体(包括CD32(FcgRII)和CD16(FcgRIII))结合减少一致。
为了进一步探索FcgR介导的dAb交联对iDC的细胞表面标记物表达和细胞因子释放的影响，在8个血液供体中进行了另外的实验，其中将过表达CD32a且对FcgR具有较低亲和性的CHO细胞用于成簇/交联3h56-269-IgG4.1。应当注意的是，在这些实验中CHO细胞与iDC之比是1:6。该比例是极高的成簇/交联水平，并且可能高于预期在正常生理条件下出现的水平。与在此前的iDC研究中(图2)观察到的结果类似，在不存在交联的条件下，当与CHI-L6 IgG4对照比较时，通过在一些供体中CD86和IL-6产生情况所测量的，3h56-269-IgG4.1引起适量的iDC活化。而相反的是，当掺入过表达CD32的CHO细胞时，通过细胞表面标记物和细胞因子释放所测量的，浓度≥10μg/ml的3h56-269-IgG4.1导致与交联激动剂CD40抗体类似的iDC活化(图3)。
实施例2：FcgR结合受损的dAB-Fc分子
为了确定是否其他Fc突变能够降低由FcgR成簇或交联介导的间接iDC活化，产生了其他dAb-Fc分子，其在Fc结构域具有减少FcgR结合的突变。通过SPR表征了FcgR结合亲和性。在本实施例中使用的材料和方法包括下述：
FcgR结合SPR：可以使用BiacoreTM表面等离子体共振(SPR)利用纯化的FcgR在体外测量FcgR结合情况。在本申请中使用了两种方法。
一种方法检测纯化抗体或dAb-Fc蛋白与His-标记的FcgR蛋白(FcgR-His)的结合，所述蛋白被捕获在固化的抗-His抗体的Fab片段上。这些实验在25℃下在BIAcoreTMT100或BIAcoreTM T200仪器(GE Healthcare)上进行。使用标准的乙基(二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)化学试剂和乙醇胺阻断剂，将鼠抗-6xHis抗体(内部制备)的Fab片段固化在CM5传感器芯片上，以使其在10毫摩(mM)HEPES pH 7.4、150mM NaCl、3mMEDTA、0.05％表面活性剂p20(HBS-EP+)的运行缓冲液中的密度为～3000RU。使用运行缓冲液10mM NaPO4、130mM NaCl、0.05％p20(PBS-T)pH 7.1进行其余所有研究。使用30秒接触时间以10μl/min将含有C-末端6x多聚组氨酸标签的各种FcγR蛋白(内部制备)捕获在该表面上(通常使用的FcgR-his蛋白浓度为～7μg/ml)。例如，使用120秒结合时间以30μl/min以及120秒解离时间以30μl/min对各种浓度纯化抗体或dAb-Fc蛋白的结合情况进行检测。在这些研究中检测的FcgR蛋白包括“高亲和性”FcgR CD64(hFcgRI)，以及“低亲和性”FcgRCD32a-H131(FcgRIIa-H131)、CD32a-R131(FcgRIIa-R131)、CD32b(FcgRIIb)、CD16a-V158(FcgRIIIa-V158)和CD16b-NA2(FcgRIIIb-NA2)。
为了对结合应答进行定量分析并对不同分子的FcgR结合进行比较，可以通过计算最大结合应答(以占理论最大结合应答的百分比(％Rmax)表示)对SPR结合数据进行分析，通常如公式1中所示：
％Rmax＝(所观察到的分析物的结合应答)/(理论上最大的分析物的结合应答)公式1
具体而言，使用下述公式计算％Rmax：
％Rmax＝(分析物的结合应答)/[((分析物Mw)/(配体Mw))x(配体应答)x(分析物：配体的化学计量)] 公式2
其中“分析物”是抗体或和dAb-Fc以及“配体”是捕获的FcgR蛋白。该分析未考虑抗体、dAb-Fc或FcgR糖基化的质量，并假设捕获配体的部分活性为100％。
对于评价“低亲和性”FcgR(例如，hCD32a-H131、hCD32a-R131、hCD32b、hCD16a-V158、hCD16a-F158、hCD16b-NA1和CD16b-NA2的结合，“％Rmax分析”是特别有用的，其具有相对迅速的结合和解离速率并且亲和性接近或低于所检测的分析物浓度(1微摩(μM))，这样在这些条件下通常无法达到表面的饱和。而相反的是，与其他FcgR相比，“高亲和性”FcgRCD64以更高的亲和性和更缓慢的解离动力学结合，特别是与IgG1和IgG4的结合，因而这些同种型通常确实会在微摩尔分析物浓度下使CD64表面饱和，并且使用％Rmax很难区分结合亲和性。对于这些相互作用，可以通过比较传感图数据中的解离速率容易地观察到抗体之间的差异。
用于检测抗体或dAb-Fc蛋白与FcgR蛋白之间相互作用的另一种SPR测定是蛋白A捕获法。也在25℃下在BIAcoreTM T100或T200仪器(GE Healthcare)上进行这些实验。对于这些研究而言，使用标准的乙基(二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)化学试剂和乙醇胺阻断剂，将蛋白A固化在CM5传感器芯片的流动池1-4上，以使其在10mM HEPES pH 7.4、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05％表面活性剂p20的运行缓冲液中的密度为～3000RU。将抗体或dAb-Fc蛋白(通常为～3-10μg/ml)捕获到蛋白A表面上，并在运行缓冲液中检测FcgR分析物的结合情况，运行缓冲液由含有10mM NaPO4、130mM NaCl、0.05％p20的缓冲液(PBS-T)pH7.1组成，例如，使用120秒结合时间和180秒解离时间以30μl/min的流速进行。
蛋白A捕获测定还可以用于分析含有抗体或dAb-Fc分子的未经纯化的上清液。对于该分析而言，可以从未经稀释的上清液或使用运行缓冲液稀释的上清液中捕获抗体或dAb-Fc蛋白。为了对结合应答进行定量分析以及对不同分子的FcgR结合进行比较，可以使用上文所述的公式1通过计算％Rmax对SPR结合数据进行分析，其中分析物是纯化的FcgR蛋白，和配体是捕获的抗体或dAb-Fc蛋白。
除了％Rmax分析以外，可以通过检测FcgR分析物针对与蛋白A捕获抗体或dAb-Fc蛋白结合的滴定情况对结合的动力学和亲和性进行定量。例如，可以将3:1系列稀释的FcgR从10μM向下滴定至0.15nM(hCD64)或1.5nM(所有其他FcgR)。使用BiacoreTM T200评价软件，可以将这些动力学数据拟合至1:1Langmuir模型或稳态结合模型，以获得动力学和亲和性的值。
dAb-Fc：在本实施例中研究的dAb-Fc包括如表5中所示的那些。在本实验中研究的其他dAb-Fc的氨基酸序列如表6中所示。在这些序列中，单可变结构域3h56-269残基是氨基酸1-118(用下划线表示)：接头AST(SEQ ID NO:57)用双下划线表示。C-末端残基是Fc结构域。
表6
对照mAb：对照单克隆抗体(1F4)也具有类似的Fc结构域突变。所述抗体不与CD40结合。在表7中的SEQ ID NO:80是对照抗体重链可变区(用下划线表示)和CH1的序列，以及SEQ ID NO:81是轻链可变区(用下划线表示)和CL的序列。各种形式的重链在表7中如SEQID NO:82-87所示。IF4重链可变区和CH1区序列在SEQ ID NO:82-87中用下划线表示。每个1F4mAb变体的重链和轻链序列对如表8中所示。
表7
表8
mAb名称 HC LC
1F4-IgG1f SEQ#:82 SEQ#:81
1F4-IgG4.1 SEQ#:83 SEQ#:81
1F4-IgG1.1f SEQ#:84 SEQ#:81
1F4-IgG1.3f SEQ#:85 SEQ#:81
1F4-D265A SEQ#:86 SEQ#:81
1F4-CT SEQ#:87 SEQ#:81
结果：产生了在Fc结构域中具有减少FcgR结合的突变的dAb-Fc分子。具体而言，形成具有下述Fc结构域变体的抗-CD40域抗体3h56-269：IgG1.1f、IgG1.3f和IgG1-D265A。在3h-56-269-IgG1.1f(SEQ ID NO:77)、3h-56-269-IgG1.3f(SEQ ID NO:78)和3h-56-269-IgG1-D265A(SEQ ID NO:79)的每一个中，氨基酸1-116是3h-56-269dAb，氨基酸117-119是接头和氨基酸120-351是Fc结构域。
如通过BiacoreTM SPR所测量的，证实了每个这些dAb-Fc融合蛋白，以及每个3h56-269-IgG4.1和3h56-269-CT以较高的亲和性与纯化的人-CD40单体(hCD40单体，内部制备)结合。如表9中所示，不同Fc变体的KD值范围在7.3nM至11.5nM之间。如通过使用在传感器芯片表面上的hCD40-Fc和作为在溶液中的可溶性分析物的dAb-Fc分子的SPR所测量的，每个dAb-Fc分子也以较高的亲和力与人CD40结合，将250nM和25nM dAb-Fc分析物进样的数据拟合至1:1Langmuir模型，以评价所有dAb-Fc的受亲和力影响的表观KD值(KD表观)均<1nM。见表9。
表9：dAb-Fc分子与人CD40结合的SPR数据
*由UCOE-CHO细胞表达和纯化的3h-56-269-CT。
通过SPR表征了dAb-Fc分子和各种对照单克隆1F4抗体的FcgR结合性质。第一项测定涉及1μM或10μM dAb-Fc或人-IgG1f抗体对照(1F4-IgG1f)与FcgR-His表面捕获的抗-HisFab的结合。这些数据如表10中所示。
表10：与hFcgR-His蛋白捕获的抗-His Fab结合的1μM或10μM dAb-Fc或1F4-IgG1f抗体对照的％Rmax数据
在另一项测定中，针对与捕获蛋白A的dAb-Fc表面的结合(数据如表11中所示)和针对与抗体表面的结合(数据如表12中所示)，对FcgR分析物(1μM或10μM)进行了检测。
表11：与捕获蛋白A的dAb-Fc蛋白结合的1μM或10μM FcgR的％RMax数据
表12：与捕获蛋白A的抗体结合的1μM或10μM FcgR的％RMax数据
根据在这些实验中是否存在或缺乏结合应答，使用分析物滴定(与捕获蛋白A的抗体或dAb-Fc结合的FcgR分析物)，选择具有最强结合应答的一组高亲和性dAb-Fc/FcgR或Ab/FcgR相互作用进行动力学/亲和性表征。这些数据如表13中所示。
表13：与捕获蛋白A的抗体或dAb-Fc结合的纯化FcgR分析物的KD值(以nM计)
总得来说，与经修饰的Fc变体IgG1-D265A、IgG1.1f、IgG1.3f或CT分子相比，这些FcgR结合SPR数据显示出IgG1f和IgG4.1同种型分子在所有FcgR中具有显著更高的FcgR亲和性。在经修饰的Fc变体中，hCD64的结合亲和性3h56-269-CT最强(KD＝4.6nM)，3h56-269-IgG1-D265A较弱(KD＝62nM)，以及3h56-269-IgG1.1f和3h56-269-IgG1.3f最弱，其亲和性太弱而无法在检测条件下进行定量(KD>5μM，是所检测的最高分析物浓度的一半)。针对IgG1-D265A、IgG1.1f、IgG1.3f和CT变体的所有其他FcgR相互作用(hCD32a-H131、hCD32a-R131、hCD32b、hCD16a-V158、hCD16b-NA2)也太弱而无法获得可靠的KD值(KD>5μM)。然而，在％Rmax数据中可以观察到相对结合应答的差异。例如，与IgG1.1f、IgG1.3f或CT变体相比，IgG1-D265A变体针对hCD32a-H131具有较强的结合应答(表11)。而相反的是，与IgG1-D265A和CT变体相比，IgG1.1f和IgG1.3f变体针对hCD32a-R131具有较强的结合应答(表11)。
在具有或不具有过表达CD32的CHO细胞交联的iDC测定中(如实施例1中所述)，对dAb-Fc分子进行了检测。这些数据如图4中所示。即使使用表达CD32的CHO细胞交联时(图4的右图)，在浓度高达100μg/ml的情况下(图4中的左图)，3h-59-269-CT分子也不产生高于对照水平的iDC活化。但是，具有设计为最小化FcgR结合改变的域抗体的Fc-融合(3h-59-269-IgG1.1f和3h-59-269-IgG1.3f)显示出降低、但仍可检测的iDC活化，如通过在所检测的最高浓度100μg/ml下检测的4个供体的至少1个中CD54(也称为ICAM 1)和CD86的表达上调和细胞因子释放的增加所测量的。如通过CD86和CD54的表达上调所测量的，在全部4个供体中，使用表达CD32的CHO细胞以引入交联导致较强的iDC活化。这些数据表明观察到FcgR依赖性的iDC活化。
实施例3：dAb-Fc蛋白的可开发性评估
将蛋白质治疗剂推向市场需要该分子具有适当的物理和化学性质以进行开发，通常将其称为化学生产和控制(CMC)。还将分子的物理和化学性质，包括稳定性、溶解性和同质性统称为“可开发性”。已经开发出很多技术和测定以评估蛋白质治疗性候选分子的可开发性，其中的一些包括差示扫描量热法(DSC)、成像毛细管等电聚焦(icIEF)、质谱法(MS或mass spec)和加速稳定性研究。
通过DSC、icIEF和质谱法评估各dAb-Fc蛋白的可开发性。材料和方法如下文所述。
差示扫描量热法：在MicroCal VP-毛细管DSC仪器(Malvern Instruments,Malvern,UK)上在10mM NaPO4、130mM NaCl pH 7.1中进行DSC实验。使用10-110℃的扫描范围和90℃/hr的扫描速率检测1mg/ml dAb-Fc或抗体样品。使用MicroCal-Origin 7.0软件分析数据。
成像毛细管等电聚焦：在ProteinSimple iCE3TM系统(ProteinSimple,San Jose,CA)上进行icIEF实验。对于这些研究而言，将通常浓度为2mg/ml的dAb-Fc或抗体样品与运载体两性电解质混合物(由2M尿素、0.25％甲基纤维素、1％Pharmalyte 5-8、3％Pharmalyte 8-10.5以及PI标记物5.85和10.10组成)混合物使其最终蛋白浓度为0.20mg/mL，并使用1.5kV下预聚焦时间1min和3kV下聚焦时间10min进行分析。
质谱：对于质谱(mass spec)分析而言，使用100mM DTT还原样品，并使用肽：N-糖苷酶(FPNGaseF)进行N-去糖基化。使用的液相-质谱联用(LC/MS)仪器为WatersG2(Waters Corporation,Milford,MA)和WatersUPLC(超高效液相色谱)。UPLC柱是WatersBEH(乙烯桥杂化颗粒)C4(2.1x 150mm,1.7um颗粒)。梯度为在10min以200μL/min的流速从10％至38％(流动相B)。流动相A为10％的甲酸水溶液。流动相B为0.1％的甲酸乙腈溶液。柱温为60℃。借助Waters MassLynxTM软件手动进行数据分析；使用MaxEnt1算法进行谱图反卷积。
加速稳定性研究：通过首先在4℃下在目标制剂缓冲液中广泛透析dAb-Fc分子来进行加速稳定性研究。使用超离心过滤器(Merck KgaA,Germany)回收并浓缩样品，并在透析缓冲液中制成不同目标浓度。将这些样品在不同温度下(通常是4℃、25℃、32C和/或40℃)孵育几周，取出等分试样并通过分析体积排阻色谱进行分析。在Agilent1260HPLC上进行分析体积排阻色谱，使用ShodexTM K403-4F柱(Showa Denko America,Inc.,New York,NY)，在100mM磷酸钠，150mM氯化钠，pH 7.3的流动相中，流速为0.3ml/min。
结果——差示扫描量热法：可以将DSC用于测量蛋白的热稳定性。图5显示了使用不同Fc结构域的3h56-269 dAb的DSC数据。最佳拟合Tm值总结在表14中。
表14：通过DSC确定的dAb-Fc分子的热解链温度(Tm)值
基于IgG Fc结构域的特征性热变性曲线，将3h56-269-IgG4.1的Fc CH3结构域转变归属为中点(Tm)值为69.6℃的转变；和将各IgG1分子的Fc CH3结构域归属为Tm接近～82-83℃的转变。将dAb-Fc的dAb结构域和CH2结构域的变性归属为低于65℃的转变，其在不同构建体之间是不同的，包括热变性的开始(T开始)、展开转变的形状和最佳拟合Tm值。例如，3h56-269-IgG4.1的dAb和CH2结构域的热转变表现为单一重叠或协同转变，其Tm值为62.8℃。3h56-269-IgG1-D265A、3h56-269-IgG1.1f和3h56-269-IgG1.3f的dAb和CH2结构域的变性曲线均与更不对称的转变一致，这最好用具有～56-63℃之间的Tm值的两个转变描述。3h56-269-CT具有最低的T开始，在40℃附近开始展开，具有较宽的热转变，最低拟合Tm值为Tm1＝55.4℃和m2＝60.4℃。
结果——成像毛细管等电聚焦(icIEF)：可以将成像毛细管等电聚焦(icIEF)用于表征样品的均质性和异质性。产生均质性产品的能力是另一个重要的可开发性标准。因此，在新型蛋白质治疗剂的发现和优化过程中，将各种分析方法用于表征和定量样品的异质性，并选择最均一的分子。
通过icIEF表征了dAb-Fc分子的电荷分布曲线。数据如图6中所示。3h56-269-IgG4.1(图6A)、3h56-269-IgG1.1f(图6E)和3h56-269-IgG1.3f(图6F)的icIEF曲线均相对简单，每个均由面积为69-86％的独特主峰构成，并且有具有较低丰度的2至4个电荷变体。该icIEF曲线与从抗体获得的典型曲线类似。3h56-269-IgG1-D265A(图6D)主峰丰度略低(49％)，而具有知识6个可检测物质的酸性变体的水平相应较高。而相反的是，3h56-269-CT的曲线(图6B)具有较高异质性，由至少16种不同物质组成并且无明确的主峰。在不同细胞系(UCOE-CHO)中表达的3h56-269-CT的icIEF曲线同样是异质性的(图6C)，但是电荷变体的分布与HEK293表达的物质显著不同。
结果——质谱：IgG或含Fc蛋白的Fc结构域上的典型糖基化是G0F、G1F和一些G2F物质的混合物。其他糖型(如唾液酸化或非岩藻糖化形式)通常以非常低的丰度或无法检测到的水平存在。
为了表征dAb-Fc蛋白的糖基化性质，以及为了对dAb-Fc蛋白与具有类似Fc突变的对照抗体进行比较，进行了质谱实验。数据如表15中所示。
表15：通过质谱确定的在dAb-Fc和抗体分子中可检测的糖型
样品 G0F G1F G2F G2FS1 G2FS2
3h56-269-IgG4.1 67％ 29％ 4％
3h56-269-IgG1.1f 32％ 58％ 9％
3h56-269-IgG1.3f 42％ 55％ 3％
3h56-269-IgG1-D265A 4％ 37％ 43％ 13％ 2％
1F4-IgG1f 68％ 32％
1F4-IgG1.3f 26％ 64％ 10％
1F4-D265A 27％ 40％ 27％ 4％ 2％
对照抗体1F4-IgG1f和1F4-IgG1.3f以及dAb-Fc抗体3h56-269-IgG4.1、3h56-269-IgG1.1f、3h56-269-IgG1.3f的质谱数据表明这些蛋白通常由G0F、G1F糖型的混合物组成，其具有较低丰度的G2F物质。
dAb-Fc和含有D265A突变的抗体分子两者在Fc结构域中也含有G0F、G1F和G2F物质的混合物，但是此外其具有更高水平的唾液酸化糖型。使用标准PNGase酶处理方案可以将所有这些D265分子去糖基化；该数据与D265A分子的聚糖被N-连接并且占据Fc结构域中的常见Asn297残基一致。
而相反的是，在HEK293或UCOE-CHO细胞中表达的3h56-269-CT或对照1F4-CT抗体的质谱数据揭示了这些蛋白具有非常高的异质性，有很多不同复杂糖基化物质(包括高度唾液酸化物质)的证据。3h56-269-CT的数据如标16中所示。
表16：通过质谱确定的在3h56-269-CT分子中可检测的糖型
对照1F4-CT抗体的质谱数据如表17中所示。
表17：通过质谱确定的在1F4-CT中可检测的糖型
此外，通过使用PNGase处理不能有效地将3h56-269-CT和1F4-CT分子去糖基化；这些结果表明至少一些复合聚糖在Ser或Thr残基上是O-连接的。这些数据与阿巴西普已知的糖基化一致，其具有含有C220S、C226S、C229S和P238S突变的相同经修饰的IgG1 Fc结构域。在阿巴西普中，已发现这些引入的Ser突变在铰链区O-连接糖基化的位置，其是异质性糖基化并且在唾液酸物质中较高。
结果——加速稳定性研究：选择3h56-269-CT进行其他研究，包括其他可开发性评估，因为3h56-269-CT是在缺乏或存在CD32过表达CHO细胞交联的条件下在iDC测定中均未显示出应答的唯一的dAb-Fc分子。特别地，在32℃和40℃的加速稳定性试验条件下，以及在4℃和25℃的较低温度下进行稳定性研究。根据使用Unit平台(Unchained Labs,Woburn,MA)筛选分子的热稳定性，选择了针对这些研究的制剂缓冲液(20mM磷酸钾、250mM蔗糖、50μM DTPA和0.05％PS80，pH7.0)，以确定产生有利的热稳定性(Tm)和开始聚集(Tagg)的条件。通过透析将纯化的3h56-269-CT蛋白交换进入该制剂缓冲液，然后浓缩和制备成终浓度50mg/ml或150mg/ml，并且在不同温度下孵育4周。为评价蛋白的物理稳定性，在开始不同温度下孵育后的0时刻(t0)、1周(1w)和4周(4w)取出等分试样。通过分析体积排阻色谱(aSEC)对样品进行分析，以确定单体蛋白、高分子量聚集体(HMW)和低分子量(LMW)物质的水平。HMW数据如表18中所示。
表18：在不同温度下孵育4周的3h56-269-CT样品中通过分析体积排阻色谱确定的高分子量(HMW)物质的百分比
aSEC数据表明3h56-269-CT形成了较高水平的HMW，特别是在较高蛋白浓度和较高温度下。
实施例4：变体Fc结构域
如实施例1和2中所示，有利地，发现3h56-269-CT分子具有有利的弱FcgR结合，特别是对低亲和性FcgR(hCD32a、hCD32b、hCD16a、hCD16b)，并且其还显示出在iDC测定中缺乏应答，包括使用过表达CD32的CHO细胞交联时。然而，如实施例3中所示，对3h56-269-CT的生物物理学表征表明该分子具有较低的热稳定性、较高的异质性和较差的物理稳定性。因此，开始努力对3h56-269-CT分子进行改进，其目的是减少或消除O-连接的聚糖、减少或消除唾液酸含量、减少异质性并改善热和物理稳定性，同时保持有利的弱FcgR结合和在iDC测定中缺乏信号。
为了尝试改善3h56-269-CT的生物物理特征，设计了一系列突变的dAb-Fc分子以尝试了解每个C220S、C226S、C229S和P238S突变对3h56-269-CT性质的作用，并且尝试使对可开发性不利的挑战与所需的弱FcgR结合和缺乏Fc介导的信号传导之间脱钩。突变策略涉及在位置220、226、229和238(Kabat编号)上设计几种变体。设计了下述变体：
a)一组位于位置220、226、229和238的单一和组合Ser突变体，以检测单个和组合的这些突变的作用。参见表19中的SEQ ID NO:88-96。带有下划线的序列是抗-CD40单可变结构域。
表19
b)一组位于位置226、229和238的单一和组合Ala或者Ala和Ser组合突变体，以鉴定O-连接糖基化和影响分子性质的主要位点。与Ser突变一样，在C220、C226和C229的Ala突变预计阻止二硫键形成。然而，与Ser不同的是，Ala残基不是O-连接糖基化位点。参见表20中的SEQ ID NO:97-109。
表20
c)设计P238突变为赖氨酸(P238K)的一组突变，以检测FcgR结合亲和性是否能够被该较低铰链区中该位置的非保守性带正电的残基降低。参见表21中的SEQ ID NO:110-116。
表21
d)在IgG1a和IgG1f同种异型的背景下，还产生了具有L234A、L235A突变的dAb-Fc分子(缩写为“LALA”)。参见表22中的SEQ ID NO:117-118。
表22
e)在IgG1a和IgG1f同种异型的背景下，还产生了含有单一N297A突变的dAb-Fc分子。参见表23中的SEQ ID NO:119-120。
表23
除了dAb-Fc变体以外，设计较少的一组相关Fc突变，以确定是否在全IgG背景下相似的突变对性质具有与dAb-Fc形式类似的影响。使用对照1F4抗体的可变结构域生产所有IgG变体。这些变体的重链序列如表24中所示。包含可变区和CH1区的1F4重链部分的序列(SEQ ID NO:80)用斜体表示。对于这些变体1F4单克隆抗体的每一个而言，轻链序列为SEQID NO:81(见表7)。变体包括：
a)单一和双C226S和C229S变体。参见表24中的SEQ ID NO:121-123。
b)单一和双C226A和C229A变体。参见表24中的SEQ ID NO:124-126。
c)P238S和P238K变体。参见表24中的SEQ ID NO:127-128。
d)在IgG1f同种异型背景下，检测了C226S、C229S、P238S三重突变。
参见表24中的SEQ ID NO:129。
e)在IgG1f同种异型背景下，检测了N297A突变。参见表24中的SEQ ID NO:130。
表24
每个1F4 mAb变体的重链和轻链序列对如表25中所示。
表25
产生的所有1F4-IgG变体均具有完整的野生型Cys220残基，可与抗体轻链的C-末端Cys残基配对。
实施例5：具有变体Fc结构域的1F4对照抗体的表征
为了表征Fc工程化改造的1F4抗体分子的FcgR结合性质，如实施例2中所述，通过检测与抗-His捕获FcgR表面结合的1μM或10μM纯化的抗体分析物进行SPR实验。对结合应答进行分析并以％Rmax值表示；结果如表26中所示。
表26：与抗-His Fab捕获hFcgR-His蛋白结合的1μM或10μM 1F4-IgG1f抗体的％Rmax数据
这些数据表明，与野生型IgG1f抗体(1F4-IgG1f)相比，在铰链区中的位置226(1F4-IgG1a-C226S)或位置229(1F4-IgG1a-C229S)的单一Cys→Ser突变，其对FcgR结合的影响微乎其微。双重C226S,C229S突变(1F4-IgG1a-C226S-C229S)对所有低亲和性FcgR蛋白均具有显著较弱的结合应答；但是，结合应答仍显著强于1F4-CT分子。这些数据表明在1F4-CT分子中附加的P238S突变进一步有助于减少FcgR结合。
单一C226A(1F4-IgG1a-C226A)或C229A(1F4-IgG1a-C229A)突变体与FcgR的结合类似于单一C226S或C229S变体；并且同样地，C226A、C229A双重突变(1F4-IgG1a-C226A-C229A)与FcgR的结合类似于C226S、C229S双重突变(1F4-IgG1a-C226S-C229S)。与在这些位点的Ser突变类似，在这些位点的Ala突变将阻止重链间二硫键的形成。然而，与Ser突变不同的，Ala突变将不是O-糖基化位点。因此，这些数据表明在S226和/或S229的O-糖基化对FcgR结合没有显著影响。
P238K和N297A变体(分别为1F4-IgG1a-P238K和1F4-N297A)显示出了对低亲和性FcgR具有最弱的结合应答，这表明hCD32a-H131、hCD32a-R131、hCD32b、hCD16a-V158或hCD16b-NA2基本上无可检测的结合信号。1F4-IgG1a-P238K变体还显示出与1F4-IgG1a-P238S变体相比更弱的FcgR结合，这表明在位置238的Lys在破坏FcgR结合方面比在该位置的Ser更有效。此外，SPR传感图数据表明与hCD64结合的1F4-IgG1f-N297A和1F4-IgG1a-P238K的解离速率显著高于1F4-IgG1f或1F4-CT。见图7。
通过DSC表征了Fc变体1F4抗体的热稳定性，如实施例3中所述。根据IgG分子公认的热变性曲线，将热转变归属为CH2结构域、CH3结构域或Fab结构域，并且将最佳拟合Tm值汇总在表27中。
表27：通过DSC确定的1F4抗体的热解链温度(Tm)值
1F4抗体Fab结构域的拟合Tm为71.6℃至74.7℃之间。所有分子的CH3结构域在82.1℃至83.1℃之间熔化，这是野生型(未经修饰的)IgG1CH3结构域的典型特征。CH2结构域是抗体最稳定的结构域，并且不同突变体具有不同的解链温度，这表明在铰链/CH2区的突变影响了CH2的热稳定性。1F4-CTf(54.3℃)和1F4-CT(55.1℃)的CH2结构域Tm值的差异小于1℃，表明IgG1同种异型对CH2结构域热稳定性的影响微乎其微。然而，相对于1F4-IgG1f(72.2℃)的野生型CH2结构域，这些CH2结构域的显著不稳定程度约为17-18℃。这些数据与观察到的3h56-269-CT的CH2/dAb结构域具有较低的热稳定性一致。
与具有CH2结构域的野生型IgG1f相比，具有单一Cys→Ser突变的Fc突变体CH2结构域的稳定性略低，1F4-IgG1a-C226S和1F4-IgG1a-C229S的CH2结构域Tm值分别为70.3℃和69.9℃。对于1F4-IgG1a-C226S,C229S而言，两个铰链Cys残基向Ser的突变进一步将CH2结构域Tm降至64.8℃。与野生型1F4-IgG1f相比，单一P238S突变也降低了CH2结构域的稳定性(62.4℃)。因此，这些数据表明1F4-CT中的三个单独的突变都不是CH2结构域稳定性降低的唯一原因，而是所有三个突变(C226S、C229S、P238S)的组合导致CH2结构域的大幅失稳。
在铰链1F4-IgG1a-C226A和1F4-IgG1a-C229A单一Cys→Ala突变体具有与在这些位置的Cys→Ser突变体几乎相同的CH2结构域Tm值，并且双重突变体1F4-C226A,C229A的CH2结构域Tm比双重Cys→Ser突变体1F4-C226S,C229S略微更加稳定(1.2℃)。1F4-IgG1a-P238K的CH2结构域(Tm＝64.0℃)比在该位置的Ser突变体1F4-IgG1a-P238S(Tm＝62.4℃)更稳定1.6℃。
为了确定铰链/Fc突变对样品异质性的影响，通过icIEF对1F4-IgG分子进行表征，如实施例3中所述。1F4-IgG1f蛋白的icIEF图谱是单克隆IgG1抗体的典型特征，其主峰的丰度为79.7％，并且具有丰度低得多的～2-4个酸性或碱性变体。参见图8。与具有CT Fc结构域的域抗体一样(3h56-269-CT)，1F4-CT分子的icIEF曲线具有异质性，其由至少8个不同的电荷变体组成，并且没有明显的优势物质。如上所述，这种异质性可能与通过质谱法(表17)观察到的聚糖异质性相关。
双Cys→Ser变体1F4-IgG1a-C226S,C229S的icIEF数据与1F4-CT分子类似，显示出存在很多不同的电荷变体，但没有明显的主峰，而单一突变体C226S、C229S和P238S的数据均与1F4-IgG1f具有相似的复杂性。这些数据表明在铰链/Fc区中较高水平的O-连接唾液酸化糖基化需要C226S和C229S突变，这会破坏重链间铰链二硫键。
1F4-IgG1.3f、1F4-N297A、1F4-IgG1a-P238K以及每个单一和双Ala突变的icIEF数据显示出与1F4-IgG1f具有相似的同质性，其均由丰度为62-80％的主峰组成，且具有丰度较小的～2-3个酸性或碱性变体。
总得来说，icIEF数据表明，与其他变体相比，两个铰链Cys226和Cys229残基突变为Ser的所有分子均具有显著更高的异质性。
对照抗体数据总结：
1F4-IgG分子的SPR、DSC、icIEF和质谱数据洞悉了C226、C229和P238突变的作用对CT Fc结构域的FcgR结合、热稳定性和异质性的影响。
单一铰链C226S和C229S突变体仅适度降低了热稳定性，其具有与1F4-IgG1f类似的异质性和类似的FcgR结合，而双C226S,C229S铰链突变与1F4-IgG1f相比具有显著更低的热稳定性、增加的异质性和降低的FcgR结合。单一P238S突变与双C226S,C229S突变体对热稳定性和FcgR结合降低的影响类似，但是前者不增加异质性。C226S,C229S铰链突变与P238S的组合可产生完整的1F4-CT分子，其异质性与单独的C226S,C229S相似，但进一步降低了热稳定性和FcgR结合。总得来说，这些数据表明与野生型Fc相比，组合的C226S,C229S突变加上P238S均对热稳定性降低和FcgR结合降低做出了贡献，并且O-连接糖基化的主要位点在突变的铰链S226和Ser229残基上。
在铰链区的位置226和229上单一和双Cys→Ala突变与在那些位点上的Cys→Ser突变体具有相似的热稳定性和FcR结合。然而，C226A,C229A突变体缺乏在Ser残基上的O-连接糖基化位点，并且不具有在C226S,C229S突变体中观察到的高度异质性。这表明在铰链区中的O-连接糖基化对FcgR结合不具有显著影响。
1F4-IgG1a-P238K突变体与1F4-IgG1a-P238S相比显示出更弱的FcgR结合，而与1F4-IgG1a-P238S相比具有相似的异质性和更优异的热稳定性。与1F4-CT分子相比，1F4-IgG1a-P238K显示出更弱的FcgR结合、改善的热稳定性和更优异的均质性。因此，当设计这组铰链/Fc变体时(与1F4-CT相比具有相当或更弱的FcgR结合、更优异的热稳定性和降低的异质性)，单一P238K突变出乎意料地提供了全部这三个所需的性质。
与1F4-IgG1f相比，1F4-N297A分子显示出更低的CH2结构域热稳定性和更弱的FcgR结合，其性质与其他含有N297A突变的IgG1抗体的文献报道一致。1F4-N297A的同质性与1F4-IgG1f相似。
总的来说，显示出最弱FcgR结合的1F4-IgG分子为1F4-IgG1a-P238K、1F4-N297A和1F4-CT分子。其中，与1F4-CT相比，1F4-IgG1a-P238K和1F4-N297A具有更优异的稳定性和同质性，1F4-IgG1a-P238K具有比1F4-N297A更好的热稳定性。因此，选择P238K和N297A同种型作为进一步表征的先导。
实施例6：具有变体Fc结构域的dAb-Fc抗体的表征
如实施例5中所讨论的，针对1F4-IgG分子的FcgR结合SPR、DSC、icIEF和MS数据，提供了对有助于FcgR结合、稳定性和异质性的CT同种型的区域和突变的深入了解。因此，将这些数据用于区分一组dAb-Fc同种型变体的优先级，用于以小规模表达上清液表达，用于通过针对FcgR结合的SPR进行筛选。
例如，在1F4抗体中的P238K和N297A单突变提供了有利的弱FcgR结合性质，而保持了超过CT同种型分子的优异的热稳定性和同质性。因此，在dAb-Fc分析中纳入了3h56-269-IgG1a-C220S,P238K和3h56-269-IgG1f-C220S,N297A分子。
此外，与C226S,C229S双重突变相比，C226A,C229A双重突变具有优异的同质性，但相似的热稳定性和FcgR结合性质，增加了将C226A,C229A双重突变与P238S或P238K组合可能具有所需的弱FcgR结合，但是不具有高异质性和O-连接聚糖的可能性，后者是将C226,C229分别突变为Ser的结果。因此，选择了变体(即，3h56-269-IgG1a-C220S,C226A,C229A,P238S和3h56-269-IgG1a-C220S,C226A,C229A,P238K变体)以进行进一步研究。
由于1F4-IgG1分子中的C220残基保留为野生型Cys，以确保与抗体轻链的天然二硫键结合，因而在1F4-IgG分子的情况下未研究在位置220的突变的影响。然而，由于dAb-Fc抗体多肽不具有轻链，因而C220残基将形成游离Cys或与另一游离Cys(如伴侣dAb-Fc链的C220残基)形成潜在的二硫键。因此，在dAb-Fc变体分析中包括一组C220变体，以确定在该位置上的突变对分子FcgR结合性质的影响。
为了进行比较，在IgG1a和IgG1f两者同种异型的背景下产生双L234A,L235A(LALA)突变体。
除了此前描述的方法以外，在本实施例中使用的方法包括下述：
抑制CD40L诱导的人B细胞增殖：人扁桃体B细胞来自儿科患者的常规扁桃体切除术，并且通过切碎和轻轻捣碎组织，将细胞过筛并使用人-H分离培养基(Cedarlane Labs,Burlington,ON)通过密度梯度分离筛选和分离单核细胞分离所述细胞。从界面收集单核细胞，洗涤，并用绵羊红细胞(SRBC,Colorado Serum Company；Denver,CO)在4℃下孵育1小时，然后进行密度梯度分离以除去T细胞。再次洗涤细胞并重悬于含10％FBS的RPMI(完全培养基)中。在完全培养基中制备抗体的滴定物，并加入三次重复的96孔圆底(RB)培养板中。加入1X 105个扁桃体人B细胞，并使用可溶性IZ-hCD40L(2μg/mL)或使用经10,000Rad辐照的使用人CD40 L稳定转染的中国仓鼠卵巢细胞(CHO-hCD40L)进行刺激；然后以2X 103个细胞/孔接种细胞，每孔的终体积为200μL。将板在37℃，5％CO2条件下孵育72小时，最后6小时每孔用0.5μCi 3[H]-胸腺嘧啶标记，收集并通过液闪仪计数。根据胸腺嘧啶的掺入情况对B细胞增殖进行定量。
结果——SPR：如实施例2中所述，将所选定的dAb-Fc变体以小规模上清液的形式表达，捕获在固化的蛋白A BiacoreTM SPR传感器芯片表面上，并且检测其与纯化的FcgR分析物(μM)的结合。数据如表28中所示。
表28：1μM FcgR与蛋白A捕获的dAb-Fc分子结合的％Rmax数据
3h56-269-IgG1a-C220S变体的FcgR结合SPR数据与3h56-269-IgG1a类似，提示C220S突变对FcgR结合具有微乎其微的影响。然而，从dAb-Fc形式可开发性的角度来看，这种突变可能会受到青睐，因为其会除去潜在的反应性巯基，该基团可能会在生产或保质期内造成异质性风险。
其他dAb-Fc分子的FcgR结合SPR数据与1F4-IgG变体的数据非常吻合。例如，与野生型相比，所有含有P238K或N297A的变体显示出与hCD64较弱的结合，并且基本上无法检测到与所有其他FacgR的结合。P238K和N297A变体还显示出比3h56-269-CT更弱的hCD64结合，其类似于在类似的1F4-IgG变体上观察到的结果。也像1F4-IgG变体一样，单个P238S突变或双重C226S/C229S突变降低了FcgR结合，但是不及这三种突变的组合(3h56-269-CT)。而且，具有两个交联Cys突变为Ala的突变体(3h56-269-IgG1a-C220S,C226A,C229A)显示出与双重Cys至Ser铰链突变体(3h56-269-IgG1a-C220S,C226S,C229S)相似的FcgR结合。加入P238S突变还进一步降低了FcgR结合(3h56-269-IgG1a-C220S,C226A,C229A,P238S)，这类似于在1F4-IgG分子中观察到的情况。
特别地，与野生型相比，所检测的LALA变体具有显著降低的FcgR结合，并且证明了其是所检测的任意变体中最弱的hCD64结合。然而，其显示出比3h56-269-CT或者任何P238K或N297A分子更强的hCD16a-V158结合。
根据使用dAb-Fc上清液所获得的SPR数据，选择具有与低亲和性FcgR最弱结合的dAb-Fc变体用于纯化和进一步表征。这些变体包括：
3h56-269-IgG1a-C220S,C226A,C229A,P238S、3h56-269-IgG1a-C220S,C226A,C229A,P238K、3h56-269-IgG1a-C220S,P238K、3h56-269-IgG1f-C220S,N297A。使用SPR，所有4种分子均显示出与CD40靶点以较高亲和性结合。数据如表29中所示。
表29：dAb-Fc分子与人CD40结合的SPR数据
如实施例2中所述，通过SPR评估了与FcgR结合的纯化的dAb-Fc的结合。dAb-FC以及1F4抗体对照的数据如表30中所示。
表30：与抗-His Fab捕获的hFcgR-His蛋白结合的1μM or 10μM dAb-Fc分子或1F4-IgG1f抗体的％Rmax数据
纯化dAb-Fc的SPR数据(使用1F4抗体对照)与dAb-Fc上清液数据一致，显示出CT、N297A和P238K变体与低亲和性FcgR具有最弱的结合。见表30。这种趋势与1F4抗体和dAb-Fc形式一致。事实上，以dAb-Fc形式，在最高检测浓度下，3h56-269-IgG1a-C220S,P238K、3h56-269-IgG1a-C220S,C226A,C229A,P238K和3h56-269-IgG1f-C220S,N297A均显示出甚至比3h56-269-CT更弱的FcgR结合应答。
结果——iDC活化：如实施例1中所述，检测了3h56-269-IgG1a-C220S,P238K和3h56-269-IgG1f-N297A分子单独或与CD32介导的成簇/交联一起激活iDC的能力。数据表明在IgG1 Fc尾中的这些突变能够消除任何iDC活性，从而使抗-CD40 dAb-Fc分子在这些iDC活化测定中呈现出惰性。见图9。对于融合蛋白而言，无论是单独使用还是与CD32介导的成簇一起使用，均未观察到如通过细胞因子产生以及CD86和CD54上调所测量的iDC活化，这突出显示了使用这些突变生产CD40拮抗剂而没有潜在免疫活化作用的可能性。在这些相同的供体中，当仅使用3h-59-269-IgG4.1刺激时，6个样品中有2个，以及当包含CD32介导的成簇/交联时，全部6个供体，在iDC中观察到了至少一个iDC活化指标的适度增加。
结果——抑制CD40L诱导的人B细胞增殖：尽管具有不同Fc尾的融合蛋白具有不同活性，但是这些变化不影响其抑制CD40L介导的免疫细胞(如B细胞)活化的能力。3h-59-269-IgG1a-P238K和3h-59-269-IgG1f-N297A融合蛋白的活性可以证明这一点。由可溶性CD40L三聚体和由表达CD40L的CHO细胞刺激的B细胞增殖被3h-59-269-IgG1-P238K或3h-59-269-IgG1-N297A有效且相似地抑制(表31)。
表31：在Fc尾的变化不影响抗-CD40 dAb抑制CD40L诱导的B细胞增殖的效能
结果-DSC：如实施例3中所述，通过DSC表征了4种纯化的dAb-Fc的热稳定性，这些dAb-Fc均显示出较低的FcgR结合。与此前表征的IgG1-型dAb-Fc分子一样，全部4个新的分子在83℃附近显示出转变，这是人IgG1 Fc结构域的CH3结构域的特征，而较低的温度转变归属为dAb和CH2结构域。这些数据如表32中所示。亦参见图11。
表32：通过DSC确定的dAb-Fc分子的热解链温度(Tm)值
3h56-269-IgG1a-C220S,C226A,C229A,P238S和3h56-269-IgG1a-C220S,C226A,C229A,P238K变体两者较低的温度转变具有在～40℃附近的较低的T起始，并且具有Tm1值为55.7-55.8℃的较宽展开转变，这与此前在3h56-269-CT中观察到的数据类似。3h56-269-IgG1a-C220S,P238K和3h56-269-IgG1f-C220S,N297A的热稳定性要好得多，T起始接近～50℃，并且Tm1值为60.5℃(3h56-269-IgG1f-C220S,N297A)和61.5℃(3h56-269-IgG1a-C220S,P238K)。
结果——加速稳定性研究：在加速稳定性研究条件下研究了dAb-Fc分子的物理稳定性。首先，进行了一项研究，以比较4个新的优化变体(3h56-269-IgG1a-C220S,C226A,C229A,P238S、3h56-269-IgG1a-C220S,C226A,C229A,P238K、3h56-269-IgG1a-C220S,P238K和3h56-269-IgG1f-C220S,N297A)与原始3h56-269-CT分子的物理稳定性。这里，在20mM乙酸盐、250mM蔗糖中，在pH 5.0下制备15mg/ml样品，并且在40℃下孵育4周。在研究开始(零时刻，t0)、1周和4周时，取出等分试样，并对其进行分析性SEC分析(aSEC)。数据如表33中所示。
表33：针对在40℃下孵育4周的dAb-Fc样品通过分析性体积排阻色谱确定的高分子量(HMW)物质的百分比
这些数据表明3h56-269-IgG1a-C220S,C226A,C229A,P238S、3h56-269-IgG1a-C220S,C226A,C229A,P238K和3h56-269-CT的HMW物质增加较多(例如，从0.5％至高于13％)，但3h56-269-IgG1a-C220S,P238K和3h56-269-IgG1f-C220S,N297A仅少量增加(例如，从0％至1.2％)。
为了进一步比较4个优化dAb-Fc蛋白的物理稳定性，在更高浓度下进行了另一项研究。在20mM乙酸盐、250mM蔗糖中，在pH 5.0下，针对3h56-269-IgG1a-C220S,C226A,C229A,P238K、3h56-269-IgG1a-C220S,P238K和3h56-269-IgG1f-C220S,N297A制备70mg/ml样品，以及针对3h56-269-IgG1a-C220S,C226A,C229A,P238S制备70mg/ml样品(由于表达水平较低和纯化后的收率较低，导致材料有限，因而后一种样品的浓度较低)，并且在40℃、25℃或在冷藏温度(4℃)下孵育4至12周，在不同时间点取出等分试样，然后进行分析性SEC分析。数据如表34中所示。
表34：针对在4℃、25℃、32℃或40℃下孵育4周的dAb-Fc样品通过分析性体积排阻色谱确定的高分子量(HMW)物质的百分比
这些数据还表明，与3h56-269-IgG1a-C220S,P238K和3h56-269-IgG1f-C220S,N297A相比，3h56-269-IgG1a-C220S,C226A,C229A,P238S和3h56-269-IgG1a-C220S,C226A,C229A,P238K具有更高或高得多的HMW物质增加。在这三个所检测温度的每一个下，3h56-269-IgG1a-C220S,P238K和3h56-269-IgG1f-C220S,N297A的HMW增加是相似的。
还产生了具有改变和增加的FcgR结合性质的其他对照dAb-Fc分子，包括具有野生型IgG1f Fc结构域(3h56-269-IgG1f)或具有其他点突变以增强与hCD32a-R131和hCD32b的结合(3h56-269-IgG1-S267E)或增强对hCD32b的特异性(3h56-269-IgG1f-G237D,P238D,H268D,P271G,A330R，也称为3h56-269-IgG1-V11)的那些。参见表35中的序列131-133。
表35
使用SPR检测了这些dAb-Fc与人FcgR的结合，并且数据显示了预期的结合特异性。见表36。
表36：与抗-His Fab捕获的hFcgR-His蛋白结合的1μM dAb-Fc的％Rmax数据
在缺乏和存在表达CD32的CHO细胞的条件下，在所有检测浓度下，3h-59-269-IgG1-V11、3h-59-269-S267E的iDC活化数据均显示出了稳健的iDC活化。见图10。3h56-269-IgG1f融合的活性证实了其调节免疫细胞活化的能力，其在缺乏CD32介导的交联的条件下仅显示出适度活化，然后在使用过表达CD32的CHO细胞后增加。见图10。
尽管已经参考上面的实施例详细描述了本实施方式，但是应当理解，可以在不脱离这些实施方式的主旨的情况下进行各种修改，并且其是本领域技术人员易于知晓的。
序列表
<110> 百时美施贵宝公司
<120> 经修饰的IGG1 FC域与抗-CD40域抗体的融合
<130> 200896-0014-00-WO-577544
<150> 62/511,245
<151> 2017-05-25
<160> 137
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成肽： 3h-56-269的CDR1"
<400> 1
Asp Tyr Glu Met Trp
1 5
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成肽： 3h-56-269的CDR2"
<400> 2
Ala Ile Asn Pro Gln Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成肽： 3h-56-269的CDR3"
<400> 3
Leu Pro Phe Arg Phe Ser Asp
1 5
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成肽： CDR1共有序列"
<220>
<221> 变体
<222> (1)..(1)
<223> /替代="Gly"
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(5)
<223> "序列中给出的变体残基相对于变体位置注释中的那些没有偏好"
<220>
<221> 变体
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<400> 4
Asp Tyr Glu Met Trp
1 5
<210> 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成肽： CDR2共有序列"
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(17)
<223> "序列中给出的变体残基相对于变体位置注释中的那些没有偏好"
<220>
<221> 变体
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<220>
<221> 变体
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<220>
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<220>
<221> 变体
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<400> 5
Ala Ile Asn Pro Gln Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 6
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成肽： CDR3共有序列"
<220>
<221> 变体
<222> (1)..(1)
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> "序列中给出的变体残基相对于变体位置注释中的那些没有偏好"
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"Met"或"Ser"
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<220>
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<222> (6)..(6)
<223> /替代="Gln"或"His"或"Asp"或"Lys"或"Glu"或"Gly"
<220>
<221> 变体
<222> (7)..(7)
<223> /替代="Tyr"或"Glu"或"Ser"
<400> 6
Leu Pro Phe Arg Phe Ser Asp
1 5
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成肽： CDR3-3h-56-1"
<400> 7
Leu Pro Phe Thr Phe Glu Asp
1 5
<210> 8
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成肽： CDR3-3H-56-2"
<400> 8
Leu Pro Phe Thr Phe Asp Asp
1 5
<210> 9
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成肽： CDR3-3h-56-202"
<400> 9
Leu Pro Thr Tyr Phe Ser Asp
1 5
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成肽： CDR3-3h-56-205"
<400> 10
Leu Pro Phe Tyr Phe Ser Glu
1 5
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成肽： CDR3-3h-56-207"
<400> 11
Leu Pro Phe Pro Phe Ser Glu
1 5
<210> 12
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成肽： CDR3-3h-56-7"
<400> 12
Pro Pro Phe Ile Phe Gly Asp
1 5
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成肽： CDR3-3h-56-22"
<400> 13
Leu Pro Phe Ile Phe Glu Tyr
1 5
<210> 14
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成肽： CDR3-3h-56-201"
<400> 14
Leu Pro Phe Tyr Phe Gln Glu
1 5
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成肽： CDR3-3h-56-203"
<400> 15
Leu Pro Phe Phe Phe Glu Glu
1 5
<210> 16
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成肽： CDR3-3h-56-204"
<400> 16
Leu Pro Thr Tyr Phe Lys Asp
1 5
<210> 17
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成肽： CDR3-3h-56-206"
<400> 17
Leu Pro Met Phe Phe Glu Asp
1 5
<210> 18
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成肽： CDR3-3h-56-258"
<400> 18
Leu Pro Phe Tyr Phe His Glu
1 5
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成肽： CDR3-3h-56-261"
<400> 19
Leu Pro Phe Phe Phe Gln Glu
1 5
<210> 20
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成肽： CDR3-3h-56-262"
<400> 20
Leu Pro Gln Leu Phe His Asp
1 5
<210> 21
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成肽： CDR3-3h-56-265"
<400> 21
Leu Pro Gln Leu Phe Gln Asp
1 5
<210> 22
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成肽： CDR3-3h-56-266"
<400> 22
Leu Pro Phe Phe Phe His Glu
1 5
<210> 23
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成肽： CDR3-3h-56-270"
<400> 23
Leu Pro Thr Leu Phe Gln Asp
1 5
<210> 24
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成肽： CDR3-3h-56-9"
<400> 24
Leu Pro Phe Met Phe Asp Asp
1 5
<210> 25
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成肽： CDR3-3h-56-23"
<400> 25
Glu Pro Tyr Ser Phe Asp Ser
1 5
<210> 26
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成肽： CDR3-3h-56-24"
<400> 26
Glu Pro Tyr Ser Tyr Asp Tyr
1 5
<210> 27
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成肽： CDR2-3h-56-16"
<400> 27
Ala Ile Asn Pro Gln Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Met
1 5 10 15
Gly
<210> 28
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成肽： CDR2-3h-56-246"
<400> 28
Ala Ile Asn Pro Trp Gly Thr Leu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 29
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成肽： CDR2-3h-56-215"
<400> 29
Ala Ile Asn Pro His Gly Ser Leu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 30
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成肽： CDR2-3h-56-217"
<400> 30
Ala Ile Asn Pro Trp Gly Ser Leu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 31
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成肽： CDR2-3h-56-220"
<400> 31
Ala Ile Asn Pro Tyr Gly Gly Leu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 32
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成肽： CDR2-3h-56-224"
<400> 32
Ala Ile Asn Pro Trp Gly Gln Leu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 33
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成肽： CDR2-3h-56-232"
<400> 33
Ala Ile Asn Pro Trp Gly Ser His Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 34
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成肽： CDR2-3h-56-239"
<400> 34
Ala Ile Asn Pro Trp Gly Ser Leu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 35
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成肽： CDR2-3h-56-243"
<400> 35
Ala Ile Asn Pro Trp Gly Gly Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 36
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成肽： CDR2-3h-56-244"
<400> 36
Ala Ile Asn Pro Trp Gly Gly Leu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 37
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成肽： CDR2-3h-56-253"
<400> 37
Ala Ile Asn Pro Ala Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 38
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成肽： CDR2-3h-56-248"
<400> 38
Ala Ile Asn Pro Tyr Gly Asn Leu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 39
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成肽： CDR1-3h-56-31"
<400> 39
Gly Tyr Glu Met Trp
1 5
<210> 40
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成肽： CDR1-3h-56-28"
<400> 40
Gly Tyr Glu Leu Trp
1 5
<210> 41
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成多肽：3h-56-269"
<400> 41
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asp Tyr
20 25 30
Glu Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Arg Val
35 40 45
Ser Ala Ile Asn Pro Gln Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Leu Pro Phe Arg Phe Ser Asp Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 42
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成多肽：3h-56-269的FR1 (SEQ ID NO: 41的1-30)"
<400> 42
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg
20 25 30
<210> 43
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成多肽：FR1"
<400> 43
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala
20 25 30
<210> 44
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成肽：3h-56-269的FR2 (SEQ ID NO: 41的36-49)"
<400> 44
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Arg Val Ser
1 5 10
<210> 45
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成肽： FR2"
<400> 45
Trp Val Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Arg Val Ser
1 5 10
<210> 46
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成肽： FR2"
<400> 46
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Arg Val Ser
1 5 10
<210> 47
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成多肽：3h-56-269的FR3 (SEQ ID NO:
41的67-98)"
<400> 47
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys
20 25 30
<210> 48
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成多肽：FR3"
<400> 48
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Met Leu Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys
20 25 30
<210> 49
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成多肽：FR3"
<400> 49
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr His Cys Ala Lys
20 25 30
<210> 50
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成多肽：FR3"
<400> 50
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Lys
20 25 30
<210> 51
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成多肽：FR3"
<400> 51
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Lys
20 25 30
<210> 52
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成多肽：FR3"
<400> 52
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ser Val Tyr His Cys Ala Lys
20 25 30
<210> 53
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成多肽：FR3"
<400> 53
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr His Cys Thr Lys
20 25 30
<210> 54
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成肽： 3h-56-269的FR4 (SEQ ID NO: 41的106-116)"
<400> 54
Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 55
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成肽： FR4"
<400> 55
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 56
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成肽： FR4"
<400> 56
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Asn
1 5 10
<210> 57
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成肽： 接头"
<400> 57
Ala Ser Thr
1
<210> 58
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成肽： 接头"
<400> 58
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 59
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成肽： 接头 (GGGGS)2"
<400> 59
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 60
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成肽： 接头 (GGGGS)3"
<400> 60
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 61
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成肽： 接头 (GGGGS)4"
<400> 61
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 62
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成肽： 接头 (GGGGS)5"
<400> 62
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 63
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成肽： 接头"
<400> 63
Thr Val Ala Ala Pro Ser
1 5
<210> 64
<211> 277
<212> PRT
<213> 智人
<400> 64
Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr
1 5 10 15
Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu
20 25 30
Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val
35 40 45
Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu
50 55 60
Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His
65 70 75 80
Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr
85 90 95
Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr
100 105 110
Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly
115 120 125
Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu
130 135 140
Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys
145 150 155 160
Cys His Pro Trp Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln
165 170 175
Ala Gly Thr Asn Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Leu
180 185 190
Arg Ala Leu Val Val Ile Pro Ile Ile Phe Gly Ile Leu Phe Ala Ile
195 200 205
Leu Leu Val Leu Val Phe Ile Lys Lys Val Ala Lys Lys Pro Thr Asn
210 215 220
Lys Ala Pro His Pro Lys Gln Glu Pro Gln Glu Ile Asn Phe Pro Asp
225 230 235 240
Asp Leu Pro Gly Ser Asn Thr Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu His
245 250 255
Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile Ser
260 265 270
Val Gln Glu Arg Gln
275
<210> 65
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成多肽：Fc-共有序列"
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(232)
<223> "序列中给出的变体残基相对于变体位置注释中的那些没有偏好"
<220>
<221> 变体
<222> (23)..(23)
<223> Lys, Ser, Ala, Arg或Trp
<220>
<221> 变体
<222> (141)..(141)
<223> Asp或Glu
<220>
<221> 变体
<222> (143)..(143)
<223> Leu或Met
<220>
<221> 变体
<222> (232)..(232)
<223> Lys或缺乏
<400> 65
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Xaa Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Xaa Glu Xaa Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Xaa
225 230
<210> 66
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成多肽：Fc IgG1a-P238K"
<400> 66
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Lys Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 67
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成多肽：Fc IgG1f-P238K"
<400> 67
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Lys Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 68
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成多肽：Fc IgG1a-P238S"
<400> 68
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 69
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成多肽：Fc IgG1a-P238S"
<400> 69
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 70
<211> 351
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成多肽：3h-56-269-Fc IgG1a-P238K"
<400> 70
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asp Tyr
20 25 30
Glu Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Arg Val
35 40 45
Ser Ala Ile Asn Pro Gln Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Leu Pro Phe Arg Phe Ser Asp Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
115 120 125
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Lys Ser Val
130 135 140
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
145 150 155 160
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
165 170 175
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
180 185 190
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
195 200 205
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
210 215 220
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
225 230 235 240
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
245 250 255
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
260 265 270
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
275 280 285
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
290 295 300
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
305 310 315 320
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
325 330 335
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
340 345 350
<210> 71
<211> 351
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成多肽：3h-56-269-IgG1f-P238K"
<400> 71
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asp Tyr
20 25 30
Glu Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Arg Val
35 40 45
Ser Ala Ile Asn Pro Gln Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Leu Pro Phe Arg Phe Ser Asp Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
115 120 125
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Lys Ser Val
130 135 140
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
145 150 155 160
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
165 170 175
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
180 185 190
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
195 200 205
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
210 215 220
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
225 230 235 240
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
245 250 255
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
260 265 270
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
275 280 285
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
290 295 300
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
305 310 315 320
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
325 330 335
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
340 345 350
<210> 72
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成多核苷酸：3h-56-269的编码序列"
<400> 72
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttcgg gattatgaga tgtggtgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg gtctagagcg ggtctcagct attaatccgc agggtacgcg tacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaacttccg 300
tttaggtttt ccgaccgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348
<210> 73
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成肽： 接头"
<400> 73
Thr Val Ala
1
<210> 74
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成肽： 接头"
<400> 74
Ala Ser Thr Ser Gly Pro Ser
1 5
<210> 75
<211> 348
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成多肽：3h56-269-IgG4.1 (BMS-986090)"
<400> 75
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asp Tyr
20 25 30
Glu Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Arg Val
35 40 45
Ser Ala Ile Asn Pro Gln Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Leu Pro Phe Arg Phe Ser Asp Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
115 120 125
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
130 135 140
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
145 150 155 160
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
165 170 175
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
180 185 190
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
195 200 205
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
210 215 220
Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
225 230 235 240
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln
245 250 255
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
260 265 270
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
275 280 285
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
290 295 300
Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu
305 310 315 320
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
325 330 335
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
340 345
<210> 76
<211> 351
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成多肽：3h56-269-CT"
<400> 76
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asp Tyr
20 25 30
Glu Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Arg Val
35 40 45
Ser Ala Ile Asn Pro Gln Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Leu Pro Phe Arg Phe Ser Asp Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His
115 120 125
Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val
130 135 140
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
145 150 155 160
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
165 170 175
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
180 185 190
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
195 200 205
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
210 215 220
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
225 230 235 240
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
245 250 255
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
260 265 270
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
275 280 285
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
290 295 300
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
305 310 315 320
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
325 330 335
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
340 345 350
<210> 77
<211> 351
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成多肽：3h56-269-IgG1.1f"
<400> 77
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asp Tyr
20 25 30
Glu Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Arg Val
35 40 45
Ser Ala Ile Asn Pro Gln Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Leu Pro Phe Arg Phe Ser Asp Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
115 120 125
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val
130 135 140
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
145 150 155 160
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
165 170 175
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
180 185 190
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
195 200 205
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
210 215 220
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
225 230 235 240
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
245 250 255
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
260 265 270
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
275 280 285
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
290 295 300
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
305 310 315 320
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
325 330 335
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
340 345 350
<210> 78
<211> 351
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成多肽：3h56-269-IgG1.3f"
<400> 78
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asp Tyr
20 25 30
Glu Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Arg Val
35 40 45
Ser Ala Ile Asn Pro Gln Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Leu Pro Phe Arg Phe Ser Asp Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
115 120 125
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val
130 135 140
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
145 150 155 160
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
165 170 175
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
180 185 190
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
195 200 205
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
210 215 220
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
225 230 235 240
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
245 250 255
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
260 265 270
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
275 280 285
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
290 295 300
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
305 310 315 320
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
325 330 335
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
340 345 350
<210> 79
<211> 351
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成多肽：3h56-269-IgG1-D265A"
<400> 79
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asp Tyr
20 25 30
Glu Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Arg Val
35 40 45
Ser Ala Ile Asn Pro Gln Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Leu Pro Phe Arg Phe Ser Asp Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
115 120 125
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
130 135 140
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
145 150 155 160
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Ala Val Ser His Glu Asp Pro Glu
165 170 175
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
180 185 190
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
195 200 205
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
210 215 220
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
225 230 235 240
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
245 250 255
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
260 265 270
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
275 280 285
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
290 295 300
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
305 310 315 320
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
325 330 335
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
340 345 350
<210> 80
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成多肽：1F4重链可变和CH1"
<400> 80
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ile Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Asp Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Phe Ala Asp Ser Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Ser
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Asp Tyr Ser Asn Tyr Leu Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val
210 215
<210> 81
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成多肽：1F4轻链可变和CL"
<400> 81
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
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Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
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210 215
<210> 82
<211> 450
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<213> 人工序列
<220>
<223> "合成多肽：1F4-IgG1f重链"
<400> 82
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1 5 10 15
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20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Asp Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Phe Ala Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
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195 200 205
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450
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<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成多肽：1F4-IgG4.1轻链"
<400> 83
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1 5 10 15
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115 120 125
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Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
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325 330 335
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<213> 人工序列
<220>
<223> "合成多肽：1F4-IgG1.1f重链"
<400> 84
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ile Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Asp Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Phe Ala Asp Ser Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Ser
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Asp Tyr Ser Asn Tyr Leu Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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Gly
<210> 85
<211> 449
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<213> 人工序列
<220>
<223> "合成多肽：1F4-IgG1.3f重链"
<400> 85
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275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
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340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
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Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
<210> 86
<211> 448
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<220>
<223> "合成多肽：1F4-D265A重链"
<400> 86
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
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435 440 445
<210> 87
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成多肽：1F4-CT重链"
<400> 87
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
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385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
Gly Lys
450
<210> 88
<211> 351
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成多肽：3h56-269-CTf"
<400> 88
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1 5 10 15
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100 105 110
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225 230 235 240
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245 250 255
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
260 265 270
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
275 280 285
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
290 295 300
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
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325 330 335
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
340 345 350
<210> 89
<211> 351
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成多肽：3h56-269-IgG1a"
<400> 89
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
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Glu Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Arg Val
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145 150 155 160
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195 200 205
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
210 215 220
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
225 230 235 240
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
245 250 255
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
260 265 270
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
275 280 285
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
290 295 300
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305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
<210> 90
<211> 351
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成多肽：3h56-269-IgG1a-C220S"
<400> 90
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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<220>
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<400> 121
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<400> 128
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Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ile Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Asp Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Phe Ala Asp Ser Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Ser
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Asp Tyr Ser Asn Tyr Leu Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 130
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成多肽：1F4-N297A重链"
<400> 130
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ile Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Asp Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Phe Ala Asp Ser Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Ser
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Asp Tyr Ser Asn Tyr Leu Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
<210> 131
<211> 351
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成多肽：3h56-269-IgG1f"
<400> 131
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asp Tyr
20 25 30
Glu Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Arg Val
35 40 45
Ser Ala Ile Asn Pro Gln Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Leu Pro Phe Arg Phe Ser Asp Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
115 120 125
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
130 135 140
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
145 150 155 160
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
165 170 175
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
180 185 190
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
195 200 205
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
210 215 220
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
225 230 235 240
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
245 250 255
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
260 265 270
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
275 280 285
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
290 295 300
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
305 310 315 320
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
325 330 335
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
340 345 350
<210> 132
<211> 351
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成多肽：3h56-269-IgG1-S267E"
<400> 132
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asp Tyr
20 25 30
Glu Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Arg Val
35 40 45
Ser Ala Ile Asn Pro Gln Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Leu Pro Phe Arg Phe Ser Asp Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
115 120 125
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
130 135 140
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
145 150 155 160
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Glu His Glu Asp Pro Glu
165 170 175
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
180 185 190
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
195 200 205
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
210 215 220
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
225 230 235 240
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
245 250 255
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
260 265 270
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
275 280 285
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
290 295 300
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
305 310 315 320
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
325 330 335
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
340 345 350
<210> 133
<211> 351
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成多肽：3h56-269-IgG1f-G237D, P238D, H268D,
P271G, A330R"
<400> 133
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asp Tyr
20 25 30
Glu Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Arg Val
35 40 45
Ser Ala Ile Asn Pro Gln Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Leu Pro Phe Arg Phe Ser Asp Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
115 120 125
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Asp Asp Ser Val
130 135 140
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
145 150 155 160
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Asp Glu Asp Gly Glu
165 170 175
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
180 185 190
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
195 200 205
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
210 215 220
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Arg Pro Ile Glu Lys Thr Ile
225 230 235 240
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
245 250 255
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
260 265 270
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
275 280 285
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
290 295 300
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
305 310 315 320
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
325 330 335
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
340 345 350
<210> 134
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "合成肽： IgG1a-P238K (-C-末端Lys)
<400> 134
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Lys Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
225 230
<210> 135
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽： IgG1f-P238K (-C-末端Lys)
<400> 135
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Lys Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
225 230
<210> 136
<211> 350
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 136
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asp Tyr
20 25 30
Glu Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Arg Val
35 40 45
Ser Ala Ile Asn Pro Gln Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Leu Pro Phe Arg Phe Ser Asp Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
115 120 125
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Lys Ser Val
130 135 140
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
145 150 155 160
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
165 170 175
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
180 185 190
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
195 200 205
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
210 215 220
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
225 230 235 240
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
245 250 255
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
260 265 270
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
275 280 285
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
290 295 300
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
305 310 315 320
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
325 330 335
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
340 345 350
<210> 137
<211> 350
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 137
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asp Tyr
20 25 30
Glu Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Arg Val
35 40 45
Ser Ala Ile Asn Pro Gln Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Leu Pro Phe Arg Phe Ser Asp Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
115 120 125
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Lys Ser Val
130 135 140
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
145 150 155 160
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
165 170 175
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
180 185 190
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
195 200 205
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
210 215 220
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
225 230 235 240
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
245 250 255
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
260 265 270
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
275 280 285
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
290 295 300
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
305 310 315 320
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
325 330 335
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
340 345 350

Claims (22)

1.一种人IgG1 Fc结构域多肽，其包含在Kabat位置238的突变，所述突变减少与FCγ受体的结合，其中脯氨酸238(P238)突变为选自下述的残基之一：赖氨酸、丝氨酸、丙氨酸、精氨酸和色氨酸。
2.根据权利要求1所述的人IgG1 Fc结构域多肽，其中P238突变为赖氨酸。
3.根据权利要求2所述的人IgG1 Fc结构域多肽，包含选自下述的氨基酸序列：SEQ IDNO:134(IgG1a-P238K(-C-末端Lys))、SEQ ID NO:66(IgG1a-P238K)、SEQ ID NO:135(IgG1f-P238K(-C-末端Lys))或SEQ ID NO:67(IgG1f-P238K)。
4.一种融合多肽，所述多肽包含：(A)异源多肽；和(B)根据权利要求1-3中任一项所述的人IgG1Fc结构域。
5.一种抗体多肽，所述抗体多肽包含：
(1)单可变结构域，所述单可变结构域包含：
(a)CDR1区，其包含：SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1所示的CDR1区最多相差2个氨基酸的氨基酸序列，
(b)CDR2区，其包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2所示的CDR2区最多相差3个氨基酸的氨基酸序列，和
(c)CDR3区，其包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3所示的CDR1区最多相差6个氨基酸的氨基酸序列，和
其中所述单可变结构域结合CD40；和
(2)根据权利要求1-3中任一项所述的人IgG1 Fc结构域。
6.根据权利要求5所述的抗体多肽，其中所述单可变结构域拮抗CD40的活性。
7.根据权利要求5所述的抗体多肽，其中所述抗体多肽的稳定性增加。
8.根据权利要求5所述的抗体多肽，其中
(a)所述CDR1区由X1-Tyr-Glu-Y1-Trp所示的序列(SEQ ID NO:4)组成，其中X1是Asp或Gly，或Y1是Met或Leu；
(b)所述CDR2区由
Ala-Ile-Asn-Pro-X2-Gly-Y2-Z2-Thr-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-A2-Gly所示的序列(SEQ ID NO:5)，其中X2是Gln、Tyr、His、Trp或Ala，Y2是Thr、Asn、Gly、Ser或Gln，Z2是Arg、Leu、Tyr、His或Phe，和A2是Lys或Met；和
(c)所述CDR3区由X3-Pro-Y3-Z3-A3-B3-C3所示的序列(SEQ ID NO:6)组成，其中X3是Leu、Pro或Glu，Y3是Phe、Gln、Thr、Met或Tyr，Z3是Arg、Tyr、Pro、Leu、Thr、Ile、Phe、Met或Ser，A3是Phe或Tyr，B3是Ser、Gln、His、Asp、Lys、Glu或Gly，和C3是Asp、Tyr、Glu或Ser。
9.根据权利要求5所述的抗体多肽，其中：
(a)所述CDR1区由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成(3h-56-269的CDR1)，
(b)所述CDR2区由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成(3h-56-269的CDR2)，和
(c)所述CDR3区由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列组成(3h-56-269的CDR3)。
10.根据权利要求5所述的抗体多肽，其中所述单可变结构域的氨基酸序列如SEQ IDNO:41所示(3h-56-269序列)。
11.一种抗体多肽，所述抗体多肽包含SEQ ID NO:136或SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列。
12.一种抗体多肽，所述抗体多肽由SEQ ID NO:136或SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列组成。
13.一种抗体多肽，所述抗体多肽包含SEQ ID NO:137或SEQ ID NO:71所示的氨基酸序列。
14.一种抗体多肽，所述抗体多肽由SEQ ID NO:137或SEQ ID NO:71所示的氨基酸序列组成。
15.一种编码权利要求1-4中任一项所述的多肽的核酸。
16.一种表达载体，所述表达载体包含权利要求15所述的核酸分子。
17.一种使用权利要求16所述的表达载体转化的细胞。
18.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求5-14中任一项所述的抗体多肽和药学上可接受的运载体。
19.一种在对象中治疗或预防免疫疾病的方法，所述方法包括向对象施用权利要求5-14中任一项所述的抗体多肽。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述免疫疾病选自下组：艾迪生氏病、变态反应、过敏反应、强制性脊柱炎、哮喘、动脉粥样硬化、特应性变态反应、耳部自身免疫性疾病、眼部自身免疫性疾病、自身免疫性肝炎、自身免疫性腮腺炎、支气管哮喘、冠心病、克罗恩病、糖尿病、附睾炎、肾小球肾炎、格雷夫斯病、格林-巴利综合征、桥本氏病、溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜、炎性肠病、对重组药品(例如，血友病中的因子VII)的免疫应答、系统性红斑狼疮、多发性硬化、重症肌无力、天疱疮、银屑病、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、干燥综合征，脊柱关节炎、甲状腺炎、移植排斥、血管炎和溃疡性结肠炎。
21.权利要求5-14中任一项所述的抗体多肽在制备用于治疗或预防在有需要的对象中的免疫应答的药物中的用途。
22.包含权利要求5-14中任一项所述的抗体多肽的药物用于治疗在有需要的对象中的免疫疾病的用途。
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