CN118139886A - 作为免疫刺激剂的激动性cd40抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用作免疫刺激剂的、与人CD40受体特异性结合并且能够不依赖于Fey介导的CD40受体交联而诱导CD40信号传导的人源化单克隆激动性抗体或其抗原结合片段。

Description

作为免疫刺激剂的激动性CD40抗体
技术领域
本发明涉及用作免疫刺激剂的、与人CD40受体特异性结合并且能够不依赖于Fcγ介导的CD40受体交联而诱导CD40信号传导的人源化单克隆激动性抗体或其抗原结合片段。
背景技术
最近在癌症免疫疗法方面取得的成功恢复了以下假设：免疫系统可以控制许多(即使不是大多数)癌症，在一些情况下以许多小分子药物所不具备的方式产生持久的反应。激动性CD40单克隆抗体(mAb)提供了一种新的治疗选择，它具有通过各种机理产生抗癌免疫力的潜力。
CD40是细胞表面分子，并且是肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族的成员。它在抗原呈递细胞(APC)例如树突细胞、B细胞和单核细胞以及许多非免疫细胞上广泛表达，并且在一系列肿瘤中广泛表达。
CD40的天然配体是CD154，它主要在活化的T淋巴细胞的表面上表达，并且为免疫应答提供T细胞“帮助”的主要组分：通过CD40在APC上的信号传导在很大程度上介导了辅助T细胞授权APC的能力。例如，CD40在DC上的连接诱导共刺激分子和MHC分子的表面表达增加、促炎性细胞因子的产生以及增强的T细胞触发。在静息B细胞上的CD40连接增加了抗原呈递功能和增殖。
CD40信号传导的结果是多方面的，并且取决于表达CD40的细胞类型和提供CD40信号的微环境。像TNF受体家族的一些其它成员一样，CD40信号传导由衔接子分子介导，而不是由CD40胞质尾区的固有信号转导活性介导。受体组装时，下游激酶被激活，多组分信号传导复合体从CD40移位至细胞质溶胶中，并且激活数个特征明确的信号转导途径。
拮抗人CD40抗体是现有技术已知的。尽管数据已表明毒性与FcγR交联之间的相关性，但是大多数临床测试的治疗性抗CD40抗体通过FcγR交联发挥作用。因此，开发了显示减少的Fcγ介导的CD40受体交联的沉默的Fc变体。人IgG1 FC区的各突变记载于例如US2018/0118843中。
在最近设计的免疫调节方法中，靶向CD40的激动剂单克隆抗体(mAb)用于增强免疫系统识别和破坏癌细胞的能力。相应的临床前研究表明，激动性CD40 mAb可以激活APC并促进抗肿瘤T细胞应答，并在缺乏T细胞免疫的情况下培养具有控制癌症的潜力的细胞毒性髓样细胞。因此，激动性CD40mAb根本上不同于通过阻断例如CTLA-4或PD-1等阴性检查点分子来实现免疫激活的mAb。
WO 2019/057792记载了人源化单克隆激动性抗体或其抗原结合片段，其与人CD40受体特异性结合并且能够不依赖于Fcγ介导的CD40受体交联而诱导CD40信号传导。
因此，激动性CD40 mAb代表了用于新型免疫疗法、特别是用于癌症疗法的有前途的策略。然而，关于其潜在的细胞毒性副作用已经引起了关注。激动性单克隆CD40抗体有望触发细胞因子释放综合征、自身免疫反应、血栓栓塞综合征(由于血小板和内皮细胞表达CD40)、过度免疫刺激导致激活诱导的细胞死亡或耐受性、以及肿瘤血管生成。这些作用可以导致不良的毒性或促进肿瘤生长。从机理上讲，在动物研究中，激动性CD40和其它靶向TNF受体家族的抗体与Fcγ受体相互作用的能力已经与毒性的发生有关(Li&Ravetch2012，Xu等人，2003，Byrne等人，2016)。
因此，需要提供具有极小毒副作用或没有毒副作用的有效的免疫疗法。在本申请中，评价了激动性CD40抗体的免疫调节潜力。事实证明，某些抗体具有令人惊讶的大治疗窗，它们在所述治疗窗中引发免疫刺激作用，而不会引起过度的毒性作用。
发明内容
本发明提供用作免疫刺激剂的、与人CD40受体特异性结合并且不依赖于Fcγ介导的CD40受体交联而诱导CD40信号传导的单克隆抗体或其抗原结合片段。根据本发明，提供抗体或抗体片段以约0.1至1mg/kg患者体重的剂量施用于患者。在该范围内，它们能够引发强烈的免疫刺激作用，而毒副作用(如果有的话)可忽略不计。本发明还提供包含所述抗体的药物组合物，其适于用于治疗需要刺激免疫系统的病况或疾病，例如，用于预防或治疗感染性疾病和用于治疗患有癌症的患者。
定义
术语"抗体"涵盖抗体结构的各种形式，包括但不限于整个抗体和抗体片段，只要其显示出根据本发明的特性即可。
"抗体片段"是指除完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的一部分，结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
如本文中所使用的术语"单克隆抗体"或"单克隆抗体组合物"是指单一氨基酸组合物的抗体分子的制剂。
术语"人源化抗体"或"抗体的人源化形式"是指由于抗体工程化而使重链和轻链均被人源化的抗体。人源化链通常是这样的链，其中V区氨基酸序列已改变，以使作为整体分析，其与人种系序列的同源性比与来源物种的种系序列的同源性更近。人源化评估基于所得氨基酸序列，而不是基于方法本身。
如本文中所使用的术语“针对靶标或抗靶标抗体特异性结合”是指通过ELISA测定的、抗体与相应抗原(靶标)或抗原表达细胞的结合，其中所述ELISA优选包括以下：包被相应的抗原至固相支持物，在允许与相应的抗原或蛋白质形成免疫复合体的条件下添加所述抗体，使用与根据本发明的抗体结合的二抗通过测量光密度值(OD)来检测所述免疫复合体，并且使用过氧化物酶介导的显色。
根据本发明的术语“抗原”是指用于免疫的抗原或包含所述抗原作为其蛋白质序列的一部分的蛋白质。例如，对于免疫，可以使用蛋白质的胞外结构域的片段(例如前20个氨基酸)，并且对于检测/测定等，可以使用蛋白质的胞外结构域或全长蛋白质。
本文中的术语“特异性结合”或“特异性识别”意指抗体对抗原表现出明显的亲和力，并且优选地，不表现出显著的交叉反应性。
“不表现出显著的交叉反应性”的抗体是不会明显结合至不希望的其它蛋白质的抗体。可以根据任何本领域公知的用于确定此类结合的手段(例如，通过竞争性结合测定例如ELISA)来确定特异性结合。
作为参考抗体的“与相同表位结合的抗体”是指在竞争测定中将参考抗体与其抗原的结合阻断50％以上的抗体，反过来说，在竞争测定中参考抗体阻断抗体与其抗原的结合达50％以上。
如本文中所使用的"根据本发明的抗体的可变区(或结构域)"(轻链的可变区(VL)、重链的可变区(VH))表示直接参与抗体与抗原结合的该对轻链和重链区中的每一个。可变轻链区和重链区具有相同的一般结构，并且每个区包含四个框架(FR)区，其序列是广泛保守的，通过三个互补决定区(CDR)连接。
当在本文中使用时，术语"抗体的抗原结合部分"是指抗体的负责抗原结合的氨基酸残基。抗体的抗原结合部分优选包含来自"互补决定区"或"CDR"的氨基酸残基。CDR序列根据Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)来定义。使用该编号系统，实际的线性氨基酸序列可以包含较少的或额外的氨基酸，其对应于可变区的FR或CDR的缩短或插入。例如，重链可变区可以包括在H2的残基52之后的单个氨基酸插入(根据Kabat的残基52a)和在重链FR残基82之后的插入的残基(例如根据Kabat的残基82a、82b和82c等)。对于给定抗体，残基的Kabat编号可以通过在抗体序列与“标准”Kabat编号序列的同源区域进行比对来确定。
"恒定结构域(恒定部分)"不直接参与抗体与抗原的结合，但是还表现出例如效应子功能。对应于人IgG1的重链恒定区基因片段称为γ1链。对应于人IgG3的重链恒定区基因片段称为γ3链。人恒定的γ重链由Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD.(1991)和由Brueggemann,M.,等人，J.Exp.Med.166(1987)1351-1361；Love,T.W.,等人，Methods Enzymol.178(1989)515-527详细地描述。
本文中的术语"Fc区"用于定义包含至少一部分恒定区的免疫球蛋白重链的C末端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。
除非本文中另有说明，否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号系统(也称为EU索引)进行的，如Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中所述。
"变体Fc区"包含由于如本文中定义的至少一个“氨基酸修饰”而不同于“天然”或“野生型”序列Fc区的氨基酸序列。
如本文中所使用的术语"Fc变体"是指在Fc结构域中包含修饰的多肽。该修饰可以为添加、缺失或取代。取代可以包括天然存在的氨基酸和非天然存在的氨基酸。变体可以包含非天然氨基酸。
术语"含Fc区的多肽"是指包含Fc区的多肽，例如抗体。
术语"Fc受体"或"FcR"用于描述与抗体的Fc区结合的受体。结合IgG抗体的FcR(γ受体)包括FcyRI、FcyRII和FcyRIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和可选择地剪接形式。FcyRII受体包括FcyRIIA("激活受体")和FcyRIIB("抑制受体")，其具有相似的氨基酸序列，其主要区别在于其胞质结构域。激活受体FcyRIIA在其胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcyRIIB在其胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见Daeron,M.,Annu.Rev.Immunol.15(1997)203-234中的综述)。在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol 9(1991)457-492；Capel,等人，Immunomethods4(1994)25-34；和de Haas,等人，J.Lab.Clin.Med.126(1995)330-41中对FcR进行综述。其它FcR(包括将来要鉴定的那些)由本文中的术语"FcR"涵盖。该术语还包括新生儿受体FcRn，其负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer,等人，J.Immunol.117(1976)587和Kim,等人，J.Immunol.24(1994)249)。
如本文中所使用的"IgG Fc配体"意指来自任何生物体的分子，优选多肽，其结合至IgG抗体的Fc区以形成Fc/Fc配体复合体。Fc配体包括但不限于FcyR、FcRn、Clq、C3、甘露聚糖结合凝集素、甘露糖受体、葡萄球菌蛋白A、链球菌蛋白G和病毒FcyR。Fc配体还包括Fc受体同源物(FcRH)，其为与FcyR同源的Fc受体家族(Davis,等人，Immunological Reviews190(2002)123-136，通过引用整体并入)。Fc配体可以包括未发现的结合Fc的分子。特定的IgG Fc配体为FcRn和Fcγ受体。如本文中所使用的"Fc配体"意指来自任何生物体的分子，优选多肽，其结合至抗体的Fc区以形成Fc/Fc配体复合体。
如本文中所使用的"Fcγ受体"、"FcyR"或"FcγR"意指结合IgG抗体Fc区并且由FcyR基因编码的蛋白质家族的任何成员。在人类中，该家族包括但不限于FcyRI(CD64)，包括同工型FcyRIA、FcyRIB和FcyRIC；FcyRII(CD32)，包括同工型FcyRIIA(包括同种异型H131和R131)、FcyRIIB(包括FcyRIIB-l和FcyRIIB-2)、和FcyRIIc；和FcyRIII(CD 16)，包括同工型FcyRIIIA(包括同种异型V158和F158)和FcyRIIIb(包括同种异型FcyRIIB-NAl和FcyRIIB-NA2)(Jefferis,等人，Immunol Lett 82(2002))，以及任何未发现的人FcyR或FcyR同工型或同种异型。FcyR可以来自任何生物体，包括但不限于人类、小鼠、大鼠、兔和猴。小鼠FcyR包括但不限于FcyRI(CD64)、FcyRII(CD32)、FcyRIII(CD 16)和FCYRIII-2(CD16-2)、以及任何未发现的小鼠FcyR或FcyR同工型或同种异型。
如本文中所使用的"FcRn"或"新生儿Fc受体"是指结合IgG抗体Fc区并且至少部分由FcRn基因编码的蛋白质。FcRn可以来自任何生物体，包括但不限于人类、小鼠、大鼠、兔和猴。如本领域已知的，功能性FcRn蛋白包含两个多肽，通常称为重链和轻链。轻链为β-2-微球蛋白，并且重链由FcRn基因编码。除非本文中另有说明，否则FcRn或FcRn蛋白是指FcRn重链与β-2-微球蛋白的复合体。
在比对序列并引入空位后(如有必要)，将相对于肽或多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”定义为候选序列中与特定肽或多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，以实现最大的序列同一性百分比，并且不考虑将任何保守取代作为序列同一性的一部分。为了确定氨基酸序列同一性百分比的目的，比对可以以本领域技术范围内的各种方式，例如，使用公开可用的计算机软件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件来实现。
"抗体依赖性细胞介导的细胞毒性"和"ADCC"是指细胞介导的反应，其中表达FcR的非特异性细胞毒性细胞(例如自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体，随后引起靶细胞的裂解。用于介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcyRIII，而单核细胞表达FcyRI、FcyRII和FcyRIII。造血细胞上的FcR表达总结于Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol9(1991)457-492的第464页的表3中。
术语"抗体依赖性细胞吞噬作用"和"ADCP"是指将抗体包被的细胞通过结合至免疫球蛋白Fc区的吞噬性免疫细胞(例如巨噬细胞、嗜中性粒细胞和树突细胞)进行全部或部分内化的过程。
如本文中所使用的术语"一种或多种抗体效应子功能"或"效应子功能"是指由IgG的一个或多个Fc效应子结构域(例如，免疫球蛋白的Fc区)贡献的功能。此类功能可以通过例如将一个或多个Fc效应子结构域与具有吞噬或裂解活性的免疫细胞上的Fc受体结合或通过将一个或多个Fc效应子结构域与补体系统的组分结合来实现。典型的效应子功能为ADCC、ADCP和CDC。
“C1q"为包括免疫球蛋白的Fc区的结合位点的多肽。C1q与两个丝氨酸蛋白酶C1r和C1s一起形成复合体C1，这是补体依赖性细胞毒性(CDC)途径的第一组分。
抗体的"类别"是指其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五种主要类别的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且其中一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
药剂例如药物制剂的"有效量"是指在所需剂量和时间段内有效达到所需治疗或预防结果的量。
如本文中所使用的术语“感染性疾病”是指由感染性生物体引起的任何疾病。感染性生物体可以包括病毒(例如RNA病毒、DNA病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)、甲型、乙型和丙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、巨细胞病毒(CMV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、人乳头瘤病毒(HPV))、寄生虫(例如原生动物和后生动物病原体例如疟原虫属、利什曼原虫属、血吸虫属、锥虫属)、细菌(例如分枝杆菌，特别是结核分枝杆菌、沙门氏菌、链球菌、大肠杆菌、葡萄球菌)、真菌(例如念珠菌属、曲霉属)、卡氏肺孢子菌(Pneumocystis carinii)和朊病毒。
如本文中所使用的术语"癌症"可以为例如肺癌、非小细胞肺(NSCL)癌、细支气管肺泡细胞肺癌、骨癌、胰腺癌、晚期胰腺癌皮肤癌、头部或颈部癌症、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、肠胃癌(stomach cancer)、胃癌(gastric cancer)、结肠癌、乳腺癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、间皮瘤、肝细胞癌、胆管癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、脊髓轴肿瘤、脑干胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、神经鞘瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、脑膜瘤、鳞状细胞癌、垂体腺瘤、淋巴瘤、淋巴细胞白血病(包括以上癌症中任意者的难治性形式(refractory version))、或一种或多种以上癌症的组合。
如本文中所使用的，术语“免疫疗法”是指旨在和/或产生免疫应答(例如，主动或被动免疫应答)的疾病或病症的治疗，例如治疗性或预防性治疗。
术语“免疫治疗剂”是指用于免疫疗法的、包括一种或多种免疫原、免疫球蛋白、抗体、或抗体片段、或其组合或者由其组成的药剂。因此，如本文中所使用的，术语“免疫治疗剂”还包括编码免疫原、免疫球蛋白、抗体或抗体片段的核酸。此类核酸可以为DNA或RNA。编码免疫原的核酸片段通常连接至调节元件，例如允许DNA片段在受试者或患者的目标靶细胞中的表达的启动子和增强子。
“免疫原性剂”或“免疫原”能够在施用于患者(任选地与佐剂结合)时诱导针对其自身的免疫学应答。“免疫原性组合物”为包含免疫原性剂的免疫原性组合物。
术语“佐剂”是指在与免疫原一起施用时增强对免疫原的免疫应答、但是当单独施用时不产生免疫应答的化合物。佐剂可以通过包括淋巴细胞募集、刺激B和/或T细胞和刺激巨噬细胞的数种机理来增强免疫应答。
具体实施方式
本发明满足了医学治疗中提供激动性CD40抗体或其抗原结合片段作为免疫刺激剂的需要。根据本发明，提供抗体或抗体片段以约0.1至1mg/kg患者体重的剂量施用于患者。在该范围内，本文中所述的特异性抗体能够提供所需的信号传导效力和临床有效性，而不引发显著的细胞毒性。
发现WO2019/057792中一般描述的抗体组中的一种激动性CD40抗体具有特别大的治疗窗。其在低至单位患者体重0.1mg的非常小的剂量下已经有效，并且主要毒性作用仅在高超过10倍的剂量下才出现。根据本发明所述的用于用途的抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:3的CDR1H区、SEQ ID NO:4的CDR2H区和SEQ ID NO:5的CDR3H区的VH区、和包含SEQ ID NO:6的CDR1L区、SEQ ID NO:7的CDR2L区和SEQ ID NO:8的CDR3L区的VL区，其中CDR可以包含不减弱其根据本发明的活性的任意一种或多种氨基酸突变。
优选地，CDR与其各自的SEQ ID NO具有至少91％、优选92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
优选地，抗体包括包含SEQ ID NO:3的CDR1H区、SEQ ID NO:4的CDR2H区和SEQ IDNO:5的CDR3H区的VH区、和包含SEQ ID NO:6的CDR1L区、SEQ ID NO:7的CDR2L区和SEQ IDNO:8的CDR3L区的VL区。
在另一实施方案中，根据本发明所述的用于用途的抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变(VH)区。
在某些实施方案中，相对于参考序列具有至少60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的VH序列包含取代(例如，保守取代)、插入或缺失，由此抗体保留与各自的抗原特异性结合的能力。优选地，重链可变区(VH)序列为SEQ ID NO:1。
本发明还涉及包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变(VL)区的抗体。
在某些实施方案中，相对于参考序列具有至少60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列包含取代(例如，保守取代)、插入或缺失，由此抗体保留根据本发明与各自的抗原特异性结合的能力。优选地，轻链可变区(VL)序列为SEQ ID NO:2。
在某些实施方案中，所述VL序列中1至10个氨基酸被取代、插入和/或缺失。在其它实施方案中，所述VH序列中1至10个氨基酸被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，所述VH序列或VL序列的每一者中1至10个氨基酸被取代、插入和/或缺失。所述取代、插入或缺失可以发生在CDR以外的区域(即，在FR中)。
在优选的实施方案中，抗体为人源化IgG1LALA抗体，特别是人源化IgG1型抗体，在人Fc1区的234和235位具有至少两个丙氨酸氨基酸。因此，根据优选的实施方案，IgG1LALA包含人Fc1区的突变L234A和L235A。在另一实施方案中，抗体至少包含在人IgG4 Fc区的S228P和L235E处的氨基酸取代。
进一步优选的是，抗体为重组分子。
根据本发明所述的用于用途的激动性单克隆抗体或其抗原结合片段能够与人CD40受体结合并且不依赖于Fcγ介导的CD40受体交联而诱导CD40信号传导。此外，当与野生型IgG Fcγ受体信号传导或与现有技术的抗体的Fcγ信号传导进行比较时，其可以通过人Fcγ受体表现出降低的或耗尽的信号传导能力。
在某些实施方案中，与野生型IgG Fcγ相比，根据本发明所述的用于用途的激动性单克隆CD40抗体或其抗原结合片段表现出对人Fcγ受体的减少或耗尽的亲和力。根据优选实施方案，抗体不与Fcγ受体结合-相应地，抗体不触发Fcγ介导的CD40受体交联。
根据本发明所述的用于用途的抗体在施用后显示与表达恒河猴CD40的免疫细胞的快速结合以及共刺激和归巢标志物(例如CD80、CCR7)的上调。药代动力学分析显示本发明的抗体或抗体片段在循环中持续约一周。全身性细胞因子分泌(例如TNF、IL-12)低。仅在施用较高剂量时，观察到IFNγ和IL-6的短暂增加。抗体在外周诱导血小板和淋巴细胞的短暂下降和粒细胞的增加，这表明免疫激活。此外，观察到增强抗原特异性免疫的佐剂作用。在上述0.1至1mg/kg的范围内给药(静脉内施用或皮下施用)诱导可比较且长期强烈的细胞和细胞因子全身性免疫应答。这表明抗体的典型信号传导诱导高度强效的CD40激活。
总之，用上述定义的抗体或其片段对CD40的典型激活在NHP中诱导相关的全身性免疫应答而没有毒性作用。本发明的激动性抗CD40抗体(MAB273)显示抗原呈递细胞的强激活特性和抗原特异性T细胞应答的增强，并且因此可以代表用于诱导细胞毒性T细胞免疫的独特的佐剂候选物。
根据本发明所述的用于用途的抗体的其它特征记载于WO2019/057792，其公开内容通过引用并入本文。
根据本发明，提供抗体或其片段以约0.1至1mg/kg患者体重的剂量施用于患者。优选地，剂量小于1mg，例如小于0.9mg/kg，或小于0.8mg/kg。在优选的实施方案中，剂量在约0.2至0.7mg/kg、0.3至0.6mg/kg或0.4至0.5mg/kg的范围内。
由于上述抗体的有利特性，它们能够用作免疫调节剂，特别是在感染性疾病和/或癌症的治疗或预防中。
在一个方面，抗体或其片段用于预防或治疗感染性疾病。感染性疾病包括病毒感染(例如RNA病毒、DNA病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)、甲型、乙型和丙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、巨细胞病毒(CMV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、人乳头瘤病毒(HPV))、寄生虫感染(例如原生动物和后生动物病原体例如疟原虫属、利什曼原虫属、血吸虫属、锥虫属)、细菌感染(例如分枝杆菌特别是结核分枝杆菌、沙门氏菌、链球菌、大肠杆菌、葡萄球菌),真菌感染(例如念珠菌属、曲霉属、卡氏肺孢子)和朊病毒。
上述定义的抗体或其片段能够支持受到感染性疾病影响的患者的免疫应答。此外，抗体或其片段能够增强对施用于患者的免疫原的免疫学应答。例如，抗体或其片段因此可以在包含旨在患者中引发免疫应答的免疫原的疫苗中施用或者除所述疫苗以外还施用所述抗体或其片段，以防御感染性疾病。任选地，出于该目的，抗体或其片段可以与其它佐剂和赋形剂组合。
将进一步理解，患者还可以接受一种或多种其它治疗，例如，药剂例如免疫治疗剂。免疫疗法可以包括例如免疫检查点抑制，并且可以使用一种或多种免疫检查点抑制剂例如抗TIGIT、抗PD-L1、抗PD-1、抗CTLA-4、抗CD137、抗LAG-3、抗TIM-3、抗OX40和/或抗GITR。
在另一方面，抗体或其片段用于治疗患有癌症的患者。
所述癌症可以为选自包括以下的组中的一种或多种类型的癌症：胰脏癌(pancreas cancer)、晚期胰腺癌肺癌、非小细胞肺(NSCL)癌、细支气管肺泡细胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头部或颈部癌症、皮肤或眼内黑素瘤、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、肠胃癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、肾癌、霍奇金淋巴瘤、肝癌、胆囊癌、膀胱癌、前列腺癌、甲状腺癌、唾液腺癌或子宫癌。
在某些实施方案中，癌症为实体瘤。
在一些实施方案中癌症为表达CD40的癌症也是可能的。然而，这对于抗体有效起作用不是必需的。
将进一步理解，抗体可以用作患者中唯一的治疗或作为联合治疗的一部分(其它治疗可以为药物细胞毒性剂或细胞生长抑制剂、放射疗法、靶向疗法和/或手术)。
因此，患者还可以接受一种或多种其它治疗(特别是针对感染性疾病或癌症)，例如药剂(例如细胞毒性剂或细胞生长抑制剂、靶向疗法)、放射疗法和/或手术。
因此，在一些实施方案中，根据本发明的抗体与细胞毒性剂或细胞生长抑制剂、放射疗法、靶向疗法和/或免疫疗法组合用于治疗癌症。
本发明的抗体也可以用于治疗对细胞毒性剂或细胞生长抑制剂、放射疗法、靶向疗法和/或免疫疗法应答不足和/或耐受的患者。
所述放射疗法可以选自包括以下的组：外部束放射疗法、接触X射线近距离放射疗法、近距离放射疗法、全身放射性同位素疗法或术中放射疗法。
根据本发明的细胞毒性或细胞生长抑制性抗癌剂可以来自包括以下的组：紫杉烷类、蒽环类、烷化剂、组蛋白脱乙酰酶抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、激酶抑制剂、核苷酸类似物、肽抗生素和铂系药剂。
优选地，靶向抗癌剂用于靶向疗法并且选自以下之一或其组合：抗EGFR化合物例如西妥昔单抗(cetuximab)、吉非替尼(gefitinib)、埃罗替尼(erlotinib)、拉帕替尼(lapatinib)、帕尼单抗(panitumumab)，抗HER2化合物例如曲妥珠单抗(trastuzumab)、曲妥珠单抗-美坦新偶联物(ado-trastuzumab emtansine)、帕妥珠单抗(pertuzumab)，靶向VEGF的化合物例如贝伐单抗(bevacizumab)、阿柏西普(Aflibercept)和哌加他尼(Pegaptanib)和酪氨酸激酶抑制剂例如舒尼替尼(Sunitinib)、帕唑帕尼(Pazopanib)、阿昔替尼(Axitinib)、凡德他尼(Vandetatanib)、卡博替尼(cabozantinib)和瑞戈非尼(Regorafinib)。
如果患者正在接受免疫疗法，则这可以为免疫检查点抑制并且可以使用一种或多种免疫检查点抑制剂。一种或多种免疫检查点抑制剂可以选自包括抗TIGIT、抗PD-L1、抗PD-1、抗CTLA-4、抗CD137、抗LAG-3、抗TIM-3、抗OX40和/或抗GITR的组。
抗体也可以与特异性结合人PD-L1、TIGIT、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、CD137、OX40、GITR的抗体组合使用和/或与药物纳武单抗(Nivolumab)、派姆单抗(Pembrolizumab)、乌瑞芦单抗(Urelumab)、乌托鲁单抗(Utomilumab)、阿特朱单抗(Atezolizumab)、阿维鲁单抗(Avelumab)、杜鲁伐单抗(Durvalumab)、曲美单抗(Tremelimumab)、伊匹单抗(Ipilimumab)组合使用。
在根据本发明的一些实施方案中，抗体或其片段以每周一次至每月一次的给药方案使用。剂量应当使得患者体内的剂量在任何时间均不超过1mg/kg体重。优选地，患者体内的剂量总是小于1mg/kg体重，例如小于0.9mg/kg。为了获得显著的效果，剂量可以在较长的时间内保持高于0.1mg/kg患者体重。
在另一方面，本发明涉及包含药学上可接受的载体和治疗有效量的抗体或抗体片段的药物组合物，其中药物组合物适于以0.1至1mg/kg体重的剂量施用抗体或片段。
根据本发明的药物组合物可以适于在较长的时间内控制释放抗体或片段，优选用于持续释放抗体或片段的储库型制剂(depot formulation)。
在一个具体方面，药物组合物为包含与免疫原组合的上述抗体或其片段的疫苗。此类疫苗特别可以用于预防感染性疾病。在该情况下，免疫原为能够诱导免疫学应答的疾病相关抗原。
在另一方面，药物组合物用于治疗患有癌症的患者。此类癌症可以为实体瘤。癌症还可以选自包括以下的组：胰脏癌、晚期胰腺癌肺癌、非小细胞肺(NSCL)癌、细支气管肺泡细胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头部或颈部癌症、皮肤或眼内黑素瘤、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、肠胃癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、肾癌、霍奇金淋巴瘤、肝癌、胆囊癌、膀胱癌、前列腺癌、甲状腺癌、唾液腺癌或子宫癌。
组合物还可以与化学疗法、放射疗法、靶向疗法和/或免疫疗法组合用于治疗癌症。所述免疫疗法可以为免疫检查点抑制。
用所述组合物治疗的患者可能会对化学疗法、放射疗法、靶向疗法和/或免疫疗法应答不足和/或耐受。
根据本发明的药物组合物还可以与一种或多种细胞毒性抗癌化合物、细胞生长抑制性抗癌化合物或靶向抗癌化合物组合用于治疗癌症。
它可以与一种或多种免疫检查点抑制剂组合使用，其中所述免疫检查点抑制剂可以选自包括抗TIGIT、抗PD-L1、抗PD-1、抗CTLA-4、抗CD137、抗LAG-3、抗TIM-3、抗OX40和/或抗GITR的组。
组合物还可以与特异性结合人PD-L1、TIGIT、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、CD137、OX40、GITR的抗体组合使用和/或与药物纳武单抗、派姆单抗、乌瑞芦单抗、乌托鲁单抗、阿特朱单抗、阿维鲁单抗、杜鲁伐单抗、曲美单抗、伊匹单抗组合使用。
它还可以以每周一次至每月一次的给药方案使用。
在另一方面，本发明还涉及治疗方法，其包括将有效量的抗体施用于有需要的个体，其中剂量在0.1至1mg/kg体重的范围内。此类个体可以为患有感染性疾病和/或癌症的患者。因此，本发明还涉及治疗感染性疾病和癌症(例如实体瘤)的方法。
施用于有需要的个体的步骤可以包括局部施用，例如对患者中的肿瘤局部施用(例如，肿瘤内或肿瘤周围)。优选地，施用为皮下施用或静脉内施用。
例如，癌症可以选自由以下组成的组：前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、肺癌、宫颈癌、横纹肌肉瘤、成神经细胞瘤、多发性骨髓瘤、白血病、急性淋巴细胞白血病、黑素瘤、膀胱癌和胶质母细胞瘤。
将进一步理解，根据本发明的治疗方法可以包括向患者单独施用本发明的基于抗体的药剂或作为组合治疗的一部分(其它治疗可以为免疫治疗剂、药物细胞毒性剂或细胞生长抑制剂、放射疗法、靶向疗法和/或手术。
事实上，如上详述的本发明的抗体的所有特征和有利的特性也反映并包含在根据本发明的抗体的治疗方法和用途中。
实施例
将以下实施例与附图和表格结合用于说明本发明。
材料和方法
动物
该研究由当地动物实验伦理委员会批准。在Astrid Fagraeus实验室(卡罗林斯卡医学院)饲养六只雄性(毒性研究)/三只雄性和三只雌性(免疫原性/生物分布研究)印度原产恒河猴。所有过程均根据实验动物护理评估和认证协会的指南进行。
免疫接种和样品采集[1-4]
毒性研究交叉进行，将动物分为三组。前两只动物接受静脉内(i.v.)施用1mg/kg抗CD40 mAb(MAB273，Icano MAB GmbH)，随后两只动物接受静脉内施用0.1mg/kg MAB273，并且最后两只动物接受皮下(s.c.)施用0.1mg/kg MAB273。对于静脉内施用，在隐静脉中进行静脉内输注抗体，总体积为25ml并且逐步分配，每5分钟给予约4ml，持续1分钟，直至在30分钟内给予25ml。对于皮下施用，在左股四头肌上方的皮肤中进行单次0.5ml皮下注射抗体。在给药前、MAB273给药后30min、4小时、24小时、48小时、72小时、1周、2周、3周和4周，在4mL肝素管中进行抽血。对于免疫原性研究，在第0天进行初次免疫接种。将六只恒河猴分为两组(n＝3)。第一组接受皮下施用单独的0.1mg/kg HIV包膜肽(GenScript，肽合成服务)，第二组接受皮下施用0.1mg/kg HIV包膜肽与皮下施用0.1mg/kg MAB273的组合。以与各组初免(prime)相同的剂量和给药在第7周进行加强免疫接种；在第11周进行第二次加强免疫接种，所有六只恒河猴均接受皮下施用1mg/kg HIV包膜肽与皮下施用0.1mg/kg MAB273的组合。在第0天、初免后48小时、第1周、第2周、第3周、第7周、第8周、第9周、第11周、加强后48小时、第12周和第13周进行抽血；在第9周和第13周进行支气管肺泡灌洗(BAL)。对于生物分布研究，通过皮下施用注射0.1mg/kg缀合有Alexa Fluor 680的MAB273，将动物在24小时或48小时之后处死，然后进行尸检，随后收集组织并且进行分析。
安全临床化学和血液学测试[5，6]
在使用Boule Vet Con对照血液进行QC之后，肝素化血液的血液学分析在采集后8h内在Exigo Vet仪器(型号H400，Boule Diagnostics AB，Sweden)上进行。所分析的参数为RBC、HCT、MCV、RDW％、RDWa、HGB、MCH、MCHC、PLT、MPV、WBC、LYM、GRAN和MONO。
肝素化血浆样品使用ABAXIS Vetscan VS2 3.1.35化学分析仪(Triolab、Solna、Sweden)来分析。所分析的参数为具有单独的QC对照的哺乳动物肝脏分析转子(MammalianLiver Profile rotors(Triolab))上的TBIL、BUN、BA、ALP、ALB、ALT、CHOL和GGT。
血液样品处理[2-4，7]
通过以2200rpm进行血液样品的Ficoll-Paque(GE Healthcare，Fairfield，CT)密度梯度离心25分钟而不进行制动或加速来分离外周血单核细胞(PBMC)。洗涤PBMC并且将其保存在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。将样品立即染色或使用90％热灭活的胎牛血清(FBS)和10％ DMSO(Sigma-Aldrich)冷冻并且在-170℃下储存。
针对固有细胞特征的流式细胞分析[2、3、7、8]
将新鲜的PBMC用LIVE/DEADTM可固定蓝色死细胞染色试剂盒(Invitrogen，L23105)染色，然后根据制造商的方案用FcR封闭试剂(Miltenyi Biotec，130-059-901)封闭。接下来是如下的表面染色面板(surface staining panel)：
染色和洗涤后，将PBMC重悬于1％多聚甲醛(PFA)中并且在LSRFortessa流式细胞仪(BD)上捕集。使用FlowJo v10进行数据分析。
B细胞增殖测定[2、4]
将人PBMC以100万个/ml的细胞浓度用0.25μM CellTrace Violet(Invitrogen)在37℃下标记20min。用1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml或0.001μg/ml MAB273或抗CD40 Ab(clone 5C3，BioLegend，334306)刺激经标记的人PBMC。作为对照，将细胞在完全培养基(RPMI1640，10％FBS，1％L-谷氨酰胺，1％青霉素/链霉素)中用1μg/ml CpG B(Invivogen)、0.2μg/ml SEB(Sigma)刺激或者不进行刺激，并且培养6天。培养后，将细胞用PBS洗涤并且用LIVE/DEADTM可固定蓝色死细胞染色试剂盒(Invitrogen，L23105)染色，然后根据制造商的方案用FcR封闭试剂(Miltenyi Biotec，130-059-901)封闭。接下来是如下的表面染色面板：
标志物 颜色 克隆 供应商 目录编号 ul/测试
CD19 ECD J3-119 Beckman A07770 4
CD3 APC-Cy7 SP34-2 BD 557757 1，25
CD20 BV605 2H7 Biolegend 302334 0，625
染色和洗涤后，将PBMC重悬于1％多聚甲醛(PFA)中并且在LSRFortessa流式细胞仪(BD)上捕集。使用FlowJo v10进行数据分析。
T细胞刺激[2-4，7]
将新鲜的PBMC或来自BAL样品的细胞以100万个细胞/mL在0.2％DMSO+CD107a染色抗体+R10(unstim)、2μg/mL HIV包膜肽+CD107a染色抗体+R10或1μg/mL SEB+CD107a染色抗体+R10中在37℃下培养过夜。染色前6小时，将10μg/ml布雷非德菌素A(BFA；Invitrogen)和10μg/ml莫能菌素(Invitrogen)添加至培养物中。培养后，将细胞用PBS洗涤并且用LIVE/DEADTM可固定蓝色死细胞染色试剂盒(Invitrogen，L23105)染色。接下来是如下的表面染色面板：
标志物 颜色 克隆 供应商 目录编号 ul/测试
OX40 BV510 L106 BD 745040 2，5
CCR7 BV786 G043H7 Biolegend 353230 2
CD103 FITC 2G5 Beckman B49222 2
CD8a BV711 RPA-T8 Biolegend 301044 1，25
CD4 PE-Cy55 S3.5 Invitrogen MHCD0418 1，25
CD45RA BV650 5H9 BD 740608 0，20
染色和洗涤后，将细胞使用Cytofix/Cytoperm试剂盒(BD Biosciences)进行透化并且进行细胞内染色，如下面板中所示：
标志物 颜色 克隆 供应商 目录编号 ul/测试
4-1BB APC 484-1 BD 550890 5
IL-2 PE MQ1-17H12 BD 559334 2
CD69 ECD TP1.55.3 Beckman 6607110 1，5
CD3 APC-Cy7 SP34.2 BD 557757 0，5
IFNg AF700 B27 Biolegend 506516 0，5
将细胞在染色后进行洗涤，然后重悬于1％多聚甲醛(PFA)中并且在LSRFortessa流式细胞仪(BD)上捕集。使用FlowJo v10进行数据分析。
追踪实验的流式细胞分析[2，4]
将来自不同所采集组织的新鲜细胞用LIVE/DEADTM可固定蓝色死细胞染色试剂盒(Invitrogen，L23105)染色，然后根据制造商的方案用FcR封闭试剂(Miltenyi Biotec，130-059-901)封闭。接下来是如下的表面染色面板：
标志物 颜色 克隆 供应商 目录编号 ul/测试
CDla PE SK9 BD 333167 5
CD209 PerCP-Cy55 DCN46 BD 558263 5
CD40 FITC 5C3 BioLegend 334306 5
CD11c PE-Cy7 3.9 Biolegend 301608 3
CD14 BV711 M5E2 Biolegend 301838 2，5
CD66abce APC TET2 Miltenyi 130-118-539 2
CD45 BV605 D058-1283 BD 564098 2
CCR7 PE-Dazzle 594 G043H7 Biolegend 353236 2
CD3 APC-Cy7 SP34-2 BD 557757 2
CD8 APC-Cy7 RPA-T8 BD 557760 2
CD20 APC-Cy7 L27 BD 335829 2
HLA-DR PE-Cy55 Tu36 Life Tech MHLDR18 1
CD123 BV510 6H6 Biolegend 306022 1
CD80 BV650 L307.4 BD 564158 0，5
CD16 BV421 3G8 Biolegend 302038 0，5
染色和洗涤后，将细胞重悬于1％多聚甲醛(PFA)中并且在LSRFortessa流式细胞仪(BD)上捕集。使用FlowJo v10进行数据分析。
用于MAB273药代动力学分析的ELISA测定[5，9]
血浆中MAB273的浓度通过定制的内部ELISA测定来测量。将Greiner-Bio One 96孔半区ELISA板(VWR，738-0032)用在新鲜PBS中的CD40蛋白(ThermoFisher，A42565)在4℃下包被过夜。将板用含有5％牛奶的PBS在室温(RT)下封闭1小时。将稀释的血浆添加至板中并且在室温下温育2小时。通过添加猴交叉吸附多克隆山羊抗人IgG HRP抗体(SouthemBiotech，2049-05)的1∶5,000稀释物并且通过添加TMB底物(BioLegend)使信号显色来检测MAB273。添加等体积的1M H2SO4终止反应，并且在450nm处读取光密度(OD)并在550nm处读取背景。在各温育步骤之间使用补充有0.05％吐温20的PBS将板洗涤3次。
用于检测血浆细胞因子的ELISA测定[2，3，7]
通过ELISA试剂盒(来自ThermoFisher的EP8RB、BMS223HS、BMS654和BMS646以及来自Mabtech的3460-1H-6和3512M-1H-6)来评价来自恒河猴的血浆样品的IFN-γ、IL-6、TNF和IL-12p70水平。根据制造商的方案进行测定。
图例
图1：(A)根据指定的门控策略，通过流式细胞术对恒河猴PBMC中的CD20+B细胞、CD14+经典单核细胞(CM)、CD11c+髓样树突细胞(MDC)和CD123+浆细胞样树突细胞(PDC)进行表型鉴定。示出一只代表性动物。(B)不同恒河猴免疫细胞上CD40的基线表达。示出CD40的平均荧光强度(MFI)。n＝4只动物。
首先，将MAB273在体外在恒河猴PBMC上进行测试以观察抗体是否具有交叉反应性以及恒河猴模型是否可以用于在体内研究该抗体。流式细胞术门控策略如(图1A)所示。
发现B细胞具有最高的CD40基线表达，其次是浆细胞样树突细胞(PDC)和髓样树突细胞(MDC)，而经典单核细胞(CM)具有相对低的CD40基线(图1B)。
图2：将恒河猴PBMC用MAB273(1、10、20μg/ml)、同种型对照Ab(1、10、20μg/ml)或TLR7/8L(5μg/ml)刺激24小时。MDC和B细胞上细胞激活标志物(CD86、CD70)、淋巴结归巢标志物(CCR7)和CD40的表面表达水平通过流式细胞术来评价。汇编数据来自四个独立实验。示出MFI值，n＝4只动物。双尾配对t检验用于统计学分析。
然后，在体外分析用MAB273刺激24小时后细胞的表型分化。本发明人对不同的细胞亚群进行门控，并且尤其关注表达CD40的细胞(图1)。这表明：
·MAB273激活MDC和B细胞以上调CD86、CD70和CCR7的表达(图2A)。同种型对照抗体未发现上调。
·在CD40染色方面，数据表明CD40染色抗体被MAB273结合阻断，因此，在将细胞用MAB273培养之后，本发明人无法检测到CD40表达。
·未发现PDC和CM的激活或发现PDC和CM的有限激活(图2B)。
图3：将恒河猴PBMC用抗CD40 Ab(1、10、20μg/ml)、同种型对照Ab(1、10、20μg/ml)或TLR7/8L(5μg/ml)刺激24小时。测量从细胞培养物收集的上清液中TNF和IL-12p70的水平。汇编数据来自四个独立实验。n＝4只动物。
这表明：
·MAB273在1μg/ml和10μg/ml下均刺激低水平的TNF分泌，但是在20μg/ml下甚至更低，这很可能是由于毒性。TLR7/8配体用作阳性对照。相比之下，同种型对照抗体不诱导TNF。
·本发明人在培养物中未检测到IL-12p70。可能其以低于ELISA试剂盒的检测水平产生。
·无论如何，本发明人可以得出结论：通过用MAB273体外刺激恒河猴PBMC不会诱导大量IL-12p70的分泌。
图4：(A)门控策略。(B)将人PBMC用0.25μM CellTrace Violet在37℃下标记20min，然后用MAB273(1、0.1、0.01、0.001μg/ml)、抗CD40 Ab(1、0.1、0.01、0.001μg/ml)、CpG B(1μg/ml)或SEB(0.2μg/ml)刺激6天。B细胞增殖的状态通过流式细胞术来评价。
用MAB273培养6天之后，还进行B细胞增殖测定。
这表明：
·在用不同浓度的MAB273处理的PBMC中、尤其是在0.1μg/ml组中可以观察到可检测到的B细胞增殖(图4)。然而，在抗CD40 Ab组中未观察到增殖。作为阳性对照的CpG组显示出如所预期的强烈增殖。
图5：将新鲜血液样品(350μl)送往Adlego Biomedical AB(位于KarolinskaInstitutet Science Park)进行临床化学测试。每组n＝2只动物。
体外测试后，本发明人通过将六只恒河猴分为三组在体内测试了三种不同条件的MAB273。本发明人交叉地进行研究，从静脉内施用1mg/kg开始，对第二组施用低10倍的剂量，并且对第三组也施用低10倍的剂量但是皮下施用。给药后频繁地进行抽血并且对动物随访4周。本发明人进行了临床化学测试，其为一系列肝肾功能的测试。
这表明：
·对于1mg/kg i.v.组，数个参数被评价为高于健康参考范围。该组还表现出在食欲不振、呕吐和行为改变方面的一些副作用。
·0.1mg/kg i.v.的降低的剂量未引起明显的副作用。
·以0.1mg/kg的剂量皮下(s.c.)施用未引起明显的副作用。
·对于0.1mg/kg组(i.v.和s.c.二者)，几乎所有参数均处于正常范围内(图5)。
图6：将新鲜血液样品s(350μl)送往Adlego Biomedical AB(位于KarolinskaInstitutet Science Park)进行全血细胞计数(CBC)。每组n＝2只动物。
通过全血细胞计数，施用MAB273后存在细胞数量的明显波动。
这表明：
·在所有组中，在给药后半小时至四小时已经观察到血小板的快速下降和粒细胞的快速增加(图6)。
·细胞数量波动是剂量依赖性的，在1mg/kg i.v.组中具有明显延长的作用。
图7：给药后血浆中MAB273的浓度通过定制的内部ELISA测定来测量。ULOD＝检测上限(67967.1ng/mL)，LLOD＝检测下限(0.047ng/mL)，LLOQ＝定量下限(0.261ng/mL)。每组n＝2只动物。
使用ELISA测定来测量给药后血浆中MAB273的浓度。
这表明：
·在给药后30min之后已经顺利地检测到MAB273，尤其是在i.v.组中(图7)。
·对于高剂量组，MAB273浓度的峰值出现在30分钟至4小时左右，然后开始逐渐下降，直至在第14天检测不到。
·对于低剂量i.v.组，在30分钟检测到最高浓度，并且持续下降，直至在第7天检测不到。
·对于低剂量s.c.组，MAB273浓度的峰值出现较晚(第3天左右)并且保持在该水平更长时间，直至在第7-14天检测不到。与其它两组相比，最高浓度相对较低。
图8：(A)门控策略。(B)恒河猴PBMC的细胞频率通过流式细胞术来评价。每组n＝2只动物。
为了进一步在子集水平上分解免疫细胞数量的波动并且分析它们的激活状态，使用14参数流式细胞术面板来纵向跟踪PBMC样品(图8A)。将所分析的细胞子集频率归一化为全血细胞计数(CBC)数据(图6)。
这表明：
·细胞波动遵循与CBC数据类似的趋势，其中嗜中性粒细胞快速增加并且B细胞和MDC二者均短暂下降(图8B)。
·观察到的动力学可以解释为免疫细胞从循环向组织的再分布、然后是来自骨髓的新的免疫细胞的再增殖。
图9：恒河猴PBMC上CD40的细胞表面表达通过流式细胞术来评价。示出CD40的平均荧光强度(MFI)。每组n＝2只动物。
MAB273对细胞表面CD40的靶向通过借助流式细胞术对竞争性荧光抗体的结合的减少进行定量来评价(如图2中所述)。
这表明
·MAB273快速且有效地隔离B细胞和MDC上的CD40(图9)。
·CD40检测的动力学遵循血浆中MAB273的药代动力学(图7)。
·可检测到的CD40表达的恢复可能是由于从骨髓中出现新细胞以及抗体在体内的半衰期所导致的。
图10：恒河猴PBMC上CD80(一种共刺激标志物)的细胞表面表达通过流式细胞术来评价。示出CD80的平均荧光强度(MFI)。每组n＝2只动物。
还通过流式细胞术分析了表型激活。
这表明：
·在MAB273给药后，立即出现CD80(一种共刺激标志物)表达的增加，随后是B细胞的减少，尤其是在静脉内给药组中(图10)。
·APC的快速表型成熟之后可能会是细胞离开循环并且新的未成熟APC的再增殖发生。
图11：恒河猴PBMC上的CCR7(一种淋巴结归巢标志物)通过流式细胞术来评价。示出CCR7的平均荧光强度(MFI)。每组n＝2只动物。
与CD80表达类似，本发明人发现
·CCR7(一种淋巴结归巢标志物)的表达在B细胞上也快速增加并且随后减少，尤其是在静脉内给药组中(图11)。
·原因很可能与CD80相同。
图12：血浆细胞因子(IFN-γ和IL-6)的水平使用ELISA试剂盒根据制造商的方案来测量。每组n＝2只动物。
血浆中促炎性细胞因子的全身水平通过ELISA来评估。本发明人检测到：
·IFN-γ和IL-6二者仅在高剂量给药的第一天或第二天内显著地增加(图12)。
·即使当本发明人运行另外的高灵敏度ELISA试剂盒(TNF ELISA试剂盒：BMS223HS、BMS654、3512M-1H-6。IL-12 p70 ELISA试剂盒：BMS646)时，TNF-α和IL-12 p70也超出可检测范围。
这表明：
·较低剂量的组缺乏全身性细胞因子释放与所观察到的更好的安全特性相符。
图13：随时间推移，PBMC(A)和BAL(B)中的Ag特异性T细胞。汇编数据已扣除背景。初次免疫接种和加强免疫接种分别在第0周和第7周进行(在初免和加强时，3只动物接受单独的皮下施用0.1mg/kg HIV包膜肽，而另外3只动物接受皮下施用0.1mg/kg HIV包膜肽与皮下施用0.1mg/kg MAB273的组合)。
还进行第二次加强免疫接种。这次所有6只动物均在第11周接受皮下施用1mg/kgHIV包膜肽与皮下施用0.1mg/kg MAB273的组合。个体数据以圆点示出。每组n＝3只动物。
这表明：
·在两组中均诱导了包膜特异性CD4和CD8 T细胞应答，但是水平较低。可以使用HIV 1-包膜肽的次优剂量0.1mg/kg。
·尽管如此，与仅接受肽的组相比，在MAB273组中发现包膜特异性CD4和CD8 T细胞的总体更高的频率。
·对所有动物进行的包括MAB273加更高剂量的肽的第二次加强在两个组中均显示动物体内T细胞应答的加强作用。
·除了PBMC中的应答以外，在BAL中也可检测到T细胞应答。
图14：来自不同组织中不同细胞群的Alexa Fluor 680信号的直方图。对照＝来自同一动物但是在追踪免疫接种之前即刻的外周血B细胞。示出一只代表性动物。n＝3只动物。
最后，为了评估给药后MAB273的生物分布，三只动物通过皮下施用接受0.1mg/kg缀合有Alexa Fluor 680的MAB273。将动物在24小时或48小时之后处死，并且进行尸检以评估组织中MAB273的存在。
这表明
·Alexa Fluor 680信号仅在注射部位(左侧皮肤)和引流注射部位的特定的淋巴结(LN)(左侧腹股沟淋巴结、左侧髂总动脉淋巴结和主动脉旁淋巴结(L.Inguinal,L.Com.Iliac and Paraaortic LN))被检测到。
·淋巴结距离注射部位越远，Alexa Fluor 680信号逐渐降低。
·与24小时相比，更多的MAB273在48小时到达更远的淋巴结。
·MAB273在体内靶向的主要细胞群为单核细胞、MDC、嗜中性粒细胞，而T细胞显示如所预期的低靶向性。
·发现在PBMC上未检测到MAB273，这可能是由于抗MAB273 IgG妨碍在这些非初始动物(non-animal)中的全身性播散。
图15：序列(以一个字母编码的氨基酸)
可变区(VR)的完整序列：
重链：VH完整：SEQ ID NO:1
轻链：VL完整：SEQ ID NO:2
互补决定区(CDR)：
重链：CDR-H1：SEQ ID NO:3
CDR-H2：SEQ ID NO:4
CDR-H3：SEQ ID NO:5
轻链：CDR-L1：SEQ ID NO:6
CDR-L2：SEQ ID NO:7
CDR-L3：SEQ ID NO:8
参考文献
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Claims (15)

1.一种激动性单克隆抗体或其抗原结合片段，其与人CD40受体特异性结合并且能够不依赖于Fcγ介导的CD40受体交联而诱导CD40信号传导，其中所述抗体包含
a)包含SEQ ID NO:3的CDR1H区、SEQ ID NO:4的CDR2H区和SEQ ID NO:5的CDR3H区的VH区，和
b)包含SEQ ID NO:6的CDR1L区、SEQ ID NO:7的CDR2L区和SEQ ID NO:8的CDR3L区的VL区，
其中所述CDR可以包含不减弱其根据本发明的活性的任意一种或多种氨基酸突变，
用于医疗用途，特别是作为免疫刺激剂，其中所述抗体或其片段以0.1至1mg/kg体重的剂量施用。
2.根据权利要求1所述的用于用途的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段以0.2至0.9mg/kg体重、优选0.3至0.7mg/kg、或0.4至0.5mg/kg的剂量施用。
3.根据权利要求1或2所述的用于用途的抗体或其片段，其中所述抗体为人源化IgG1LALA抗体。
4.根据权利要求3所述的用于用途的抗体或其片段，其中所述抗体至少包含在人IgG1Fc区的L234A和L235A或人IgG4 Fc区的S228P和L235E处的氨基酸取代。
5.根据前述权利要求中任一项所述的用于用途的抗体或其片段，其中所述抗体包含与SEQ ID NO:1的VH区具有至少85％同一性的重链可变(VH)区。
6.根据前述权利要求中任一项所述的用于用途的抗体或其片段，其中所述抗体包含与SEQ ID NO:2的VL区具有至少85％同一性的轻链可变(VL)区。
7.根据前述权利要求中任一项所述的用于用途的抗体或其片段，其用于预防或治疗感染性疾病和/或癌症。
8.根据权利要求7所述的用于用途的抗体或其片段，其中所述癌症为实体瘤。
9.根据权利要求7或8所述的用于用途的抗体或其片段，其中所述癌症选自包括以下的组：胰脏癌、晚期胰腺癌肺癌、非小细胞肺(NSCL)癌、细支气管肺泡细胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头部或颈部癌症、皮肤或眼内黑素瘤、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、肠胃癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、肾癌、霍奇金淋巴瘤、肝癌、胆囊癌、膀胱癌、前列腺癌、甲状腺癌、唾液腺癌或子宫癌。
10.根据前述权利要求中任一项所述的用于用途的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段与细胞毒性剂或细胞生长抑制剂、放射疗法、靶向疗法、免疫疗法或手术组合使用。
11.根据前述权利要求中任一项所述的用于用途的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段与至少一种免疫检查点抑制剂、优选选自由抗TIGIT、抗PD-L1、抗PD-1、抗CTLA-4、抗CD137、抗LAG-3、抗TIM-3、抗OX40和/或抗GITR组成的组中的至少一种免疫检查点抑制剂组合使用。
12.根据前述权利要求中任一项所述的用于用途的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段作为单剂量或作为多剂量施用。
13.一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体和治疗有效量的如前述权利要求中任一项所限定的抗体或片段，其中所述药物组合物适于以0.1至1mg/kg体重的剂量施用所述抗体或片段。
14.根据权利要求13所述的药物组合物，其适于在较长的时间内控制释放所述抗体或片段，优选用于持续释放所述抗体或片段的储库型制剂。
15.根据权利要求13或14所述的药物组合物，其适于静脉内施用或皮下施用。
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