JP6976931B2 - ヒト化抗ｃｄ４０抗体及びその使用 - Google Patents

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年９月４日に出願された米国特許仮出願第６２／２１４，４１１号の優先権を主張するものであり、この仮出願の開示内容は引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は配列表を含み、配列表はＡＳＣＩＩ形式で電子形式により提出されており、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。前記のＡＳＣＩＩコピーは、２０１６年９月１日に作成されたものであり、名称は１１２１２−００５２１１−ＷＯ０＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズは３３，９４８バイトである。
本発明は、ヒト化抗ＣＤ４０抗体、及び例えば、移植拒絶反応の尤度を下げるためもしくは、移植拒絶反応を処置するため、免疫抑制を誘導するため、又は自己免疫性障害を処置するためのかかる抗体の使用に関する。
免疫機構、特に体液性免疫機構の抑制は臓器移植及び自己免疫性障害の処置において有益である。臓器移植は、臓器の損傷を伴う生命を脅かす多くの形態の疾患の処置の好ましい方法の１つとして登場した。しかしながら、移植された細胞又は組織を受容した生物体に該組織に対して所望されない免疫応答が生じた場合、移植拒絶反応が起こり得る。移植拒絶反応は、組織型のマッチングによって最小限にされ得るが、マッチした組織であってもドナーが拒絶反応を示す場合があり得る。したがって、現在では事実上すべての組織移植の場合で免疫抑制療法が使用されている。
臨床移植の成績の改善は、主に、拒絶反応応答を抑止するためのだんだん強力になっている非特異的免疫抑制薬の開発によって得られている。短期間での成績は改善されてきたが、長期間の転帰は依然として不充分である。移植された臓器の慢性拒絶反応を根絶するために一生、免疫抑制薬が必要とされる場合もあり得、このような薬剤の使用は、心血管疾患、感染及び悪性腫瘍のリスクを劇的に高める。
移植拒絶反応を低減させるための潜在的標的の１つはＣＤ４０／ＣＤ１５４相互作用である。ＣＤ４０は主に、Ｂリンパ球並びに他の抗原提示細胞（ＡＰＣ）、例えば樹状細胞及びマクロファージの表面上に発現される。ＣＤ１５４は主にＴ細胞の表面上に発現される。この２つのタンパク質間の相互作用は、サイトカインの発現並びに細胞表面マーカー、例えばＣＤ２３、ＣＤ８０及びＣＤ８６の発現を誘発するＢ細胞の活性化と関連している。Ｋｅｈｒｙ Ｍ．Ｒ．，ＣＤ４０−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ Ｂ ｃｅｌｌｓ．Ｂａｌａｎｃｉｎｇ ｃｅｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ，ｇｒｏｗｔｈ，ａｎｄ ｄｅａｔｈ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６；１５６：２３４５−２３４８。抗ＣＤ１５４抗体を用いてこの相互作用をブロックすると、非ヒト霊長類において移植された組織の拒絶反応が低減又は解消されることが示されている。
Ｋｅｈｒｙ Ｍ．Ｒ．，ＣＤ４０−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ Ｂ ｃｅｌｌｓ．Ｂａｌａｎｃｉｎｇ ｃｅｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ，ｇｒｏｗｔｈ，ａｎｄ ｄｅａｔｈ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６；１５６：２３４５−２３４８
任意の型の免疫抑制（例えば、移植処置における）のためには、有効性と毒性との均衡がその臨床的許容のための主要な要素である。したがって、例えば移植拒絶反応及び自己免疫性障害に関与している免疫学的経路を特異的に標的化する治療薬の必要性が存在している。
本開示により、重鎖可変領域を含むヒト化抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合部分であって、該重鎖可変領域が、それぞれ配列番号：１３、１４及び１５に示すアミノ酸配列と約８０％〜約１００％同一のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含むものであるヒト化抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合部分を提供する。
また、本開示により、軽鎖可変領域を含むヒト化抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合部分であって、該軽鎖可変領域が、それぞれ配列番号：１６、１７及び１８に示すアミノ酸配列と約８０％〜約１００％同一のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含むものであるヒト化抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合部分を提供する。
また、本開示には、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含むヒト化抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合部分であって、該重鎖可変領域が、それぞれ配列番号：１３、１４及び１５に示すアミノ酸配列と約８０％〜約１００％同一のアミノ酸配列を有する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含むものであり、該軽鎖可変領域が、それぞれ配列番号：１６、１７及び１８に示すアミノ酸配列と約８０％〜約１００％同一のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含むものであるヒト化抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合部分も包含される。
本開示により、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含むヒト化抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合部分であって、該重鎖可変領域が、配列番号：１１、１９、２０、２１、２４、２５及び２６に示すアミノ酸配列のいずれか１つと約８０％〜約１００％同一のアミノ酸配列を含むものであるヒト化抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合部分を提供する。
本開示により、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含むヒト化抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合部分であって、該軽鎖可変領域が、配列番号：１２、２２、２３、２７、２８及び２９に示すアミノ酸配列のいずれか１つと約８０％〜約１００％同一のアミノ酸配列を含むものであるヒト化抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合部分を提供する。
本開示により、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含むヒト化抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合部分であって、該重鎖可変領域が、配列番号：１１、１９、２０、２１、２４、２５及び２６に示すアミノ酸配列のいずれか１つと約８０％〜約１００％同一のアミノ酸配列を含むものであり、該軽鎖可変領域が、配列番号：１２、２２、２３、２７、２８及び２９に示すアミノ酸配列のいずれか１つと約８０％〜約１００％同一のアミノ酸配列を含むものであるヒト化抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合部分を提供する。
本開示により、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含むヒト化抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合部分であって、該重鎖可変領域が、配列番号：１９，２０及び２１に示すアミノ酸配列のいずれか１つと約８０％〜約１００％同一のアミノ酸配列を含むものであり、該軽鎖可変領域が、配列番号：２２及び２３に示すいずれかのアミノ酸配列と約８０％〜約１００％同一のアミノ酸配列を含むものであるヒト化抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合部分を提供する。
本開示により、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含むヒト化抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合部分であって、該重鎖可変領域が、配列番号：２４、２５及び２６に示すアミノ酸配列のいずれか１つと約８０％〜約１００％同一のアミノ酸配列を含むものであり、該軽鎖可変領域が、配列番号：２７、２８及び２９に示すアミノ酸配列のいずれか１つと約８０％〜約１００％同一のアミノ酸配列を含むものであるヒト化抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合部分を提供する。
本開示により、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含むヒト化抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合部分であって、該重鎖可変領域が、配列番号：２１に示すアミノ酸配列と約８０％〜約１００％同一のアミノ酸配列を含むものであり、該軽鎖可変領域が、配列番号：２３に示すアミノ酸配列と約８０％〜約１００％同一のアミノ酸配列を含むものであるヒト化抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合部分を提供する。
該抗体又はその抗原結合部分の解離定数（ＫＤ）は約１×１０−９Ｍ未満又は約１×１０−８Ｍ未満であり得る。
本発明の抗体又はその抗原結合部分は：（ａ）完全体の免疫グロブリン分子；（ｂ）ｓｃＦｖ；（ｃ）Ｆａｂ断片；（ｄ）Ｆ（ａｂ’）２；及び／又は（ｅ）ジスルフィド結合Ｆｖであり得る。
本発明の抗体又はその抗原結合部分は：ａ）ＩｇＧの定常ドメイン；及び（ｂ）ＩｇＡの定常ドメインから選択される少なくとも１つの定常ドメインを含むものであり得る。
本発明の抗体又はその抗原結合部分は少なくとも１つのヒト定常ドメインを含むものであり得る。
本発明の抗体又はその抗原結合部分はＣＤ４０細胞外ドメインに結合し得るものである。
ＣＤ４０はヒト又はアカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ）のＣＤ４０であり得る。
本発明の抗体又はその抗原結合部分は、ＣＤ１５４発現ジャーカット細胞によるＢリンパ球の活性化をインビトロでブロックし得るものである。
本発明の抗体又はその抗原結合部分は、Ｂリンパ球のＣＤ２３、ＣＤ８０又はＣＤ８６の発現を阻害し得るものである。
また、本発明の抗体又はその抗原結合部分及び少なくとも１種類の薬学的に許容され得る担体を含む組成物も本開示に包含される。
本開示により、本発明の抗体又はその抗原結合部分をコードしているポリヌクレオチドを提供する。本開示により、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、及び該ベクターを含む細胞を提供する。
本開示により、本発明の抗体又はその抗原結合部分を含む単離ポリペプチドを提供する。
また、本発明の抗体又はその抗原結合部分の作製方法も本開示に包含される。該方法は、以下の工程：（ａ）本発明の細胞を培養培地中で、本発明の抗体又はその抗原結合部分をコードしているポリヌクレオチドが発現される条件下で培養し、それにより、該抗体又はその抗原結合部分を含む少なくとも１種類のポリペプチドを産生させる工程；及び（ｂ）該ポリペプチドを該細胞又は培養培地から回収する工程を含むものであり得る。
また、本開示により、被験体に有効量の本発明の抗体又はその抗原結合部分を投与する工程を含む、被験体の免疫機構を抑制する方法を提供する。
本開示により、移植拒絶反応の処置もしくは予防的処置、又は移植拒絶反応が起こるまでの持続時間の長期化を、それを必要とする被験体において行なう方法であって、該被験体に有効量の本発明の抗体又はその抗原結合部分を投与する工程を含む方法を提供する。
本開示により、移植片対宿主病の処置又は予防的処置を、それを必要とする被験体において行なう方法であって、該被験体に有効量の本発明の抗体又はその抗原結合部分を投与する工程を含む方法を提供する。
本開示により、自己免疫性障害の処置又は予防的処置を、それを必要とする被験体において行なう方法であって、該被験体に有効量の本発明の抗体又はその抗原結合部分を投与する工程を含む方法を提供する。
被験体は、臓器移植及び／又は組織移植を受けた被験体であり得るか、或いは臓器移植及び／又は組織移植を必要としている被験体である。臓器は心臓、腎臓、肺、肝臓、膵臓、腸及び胸腺又はその一部分であり得る。組織は骨、腱、角膜、皮膚、心臓の弁、静脈又は骨髄であり得る。
被験体はヒト又は哺乳動物であり得る。
該投与は、移植前に開始してもよい。該投与は、移植後、少なくとも１ヶ月間継続され得る。該投与は、移植片の移植後、少なくとも６ヶ月間継続され得る。
自己免疫性障害は、自己抗体の存在と関連しているものであり得るか、又は自己抗体の存在によって引き起こされるものであり得る。
自己免疫性障害は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ＣＲＥＳＴ症候群（石灰沈着症、レイノー症候群、食道運動障害、強指症（ｓｃｌｅｒｏｄａｃｔｙｌ）及び毛細血管拡張症）、オプソクローヌス、炎症性ミオパチー（例えば、多発性筋炎、皮膚筋炎及び封入体筋炎）、全身性強皮症、原発性胆汁性肝硬変、セリアック病（例えば、グルテン過敏性腸疾患）、疱疹状皮膚炎、ミラー・フィッシャー症候群、急性運動性軸索型ニューロパチー（ＡＭＡＮ）、伝導ブロックを伴う多巣性運動ニューロパチー、自己免疫性肝炎、抗リン脂質抗体症候群、ウェゲナー肉芽腫症、顕微鏡的多発血管炎（ｐｏｌｙａｎｇｉｉｔｉｓ）、チャーグ・ストラウス症候群、関節リウマチ、慢性自己免疫性肝炎、硬化性筋炎（ｓｃｌｅｒｏｍｙｏｓｉｔｉｓ）、重症筋無力症、ランバート・イートン筋無力症候群、橋本甲状腺炎、グレーブス病、傍腫瘍性小脳変性症、スティッフパーソン症候群、辺縁系脳炎、アイザックス症候群、シデナム舞踏病、小児自己免疫性溶連菌関連性精神神経疾患（ＰＡＮＤＡＳ）、脳炎、１型真性糖尿病及び／又は視神経脊髄炎であり得る。
自己免疫性障害は、悪性貧血、アジソン病、乾癬、炎症性腸疾患、乾癬性関節炎、シェーグレン症候群、紅斑性狼瘡（例えば、円板状紅斑性狼瘡、薬物誘発性紅斑性狼瘡及び新生児紅斑性狼瘡）、多発性硬化症、及び／又は反応性関節炎であり得る。
自己免疫性障害は、多発性筋炎、皮膚筋炎、多発性内分泌腺不全、シュミット症候群、自己免疫性ブドウ膜炎、副腎炎、甲状腺炎、自己免疫性甲状腺疾患、胃萎縮、慢性肝炎、ルポイド肝炎、アテローム性動脈硬化症、初老期認知症、脱髄疾患、亜急性皮膚紅斑性狼瘡、副甲状腺機能低下症、ドレスラー症候群、自己免疫性血小板減少症、特発性血小板減少性紫斑病、溶血性貧血、尋常性天疱瘡、天疱瘡、円形（ａｒｃａｔａ）脱毛症、類天疱瘡、強皮症、全身性進行性硬化症、成人発症型真性糖尿病（例えば、ＩＩ型糖尿病）、男性及び女性の自己免疫性不妊症、強直性脊椎関節炎（ｓｐｏｎｄｏｌｙｔｉｓ）、潰瘍性大腸炎、クローン病、混合結合組織病、結節性多発性動脈炎（ｎｅｄｏｓａ）、全身性壊死性血管炎、若年発症型関節リウマチ、糸球体腎炎、アトピー性皮膚炎、アトピー性鼻炎、グッドパスチャー症候群、シャーガス病、サルコイドーシス、リウマチ熱、喘息、反復流産、抗リン脂質抗体症候群、農夫肺、多形性紅斑、開心後症候群、クッシング症候群、自己免疫性慢性活動性肝炎、鳥飼病、アレルギー性疾患、アレルギー性脳脊髄炎、中毒性表皮壊死症、脱毛症、アルポート症候群、肺胞炎、アレルギー性肺胞炎、線維化性肺胞炎、間質性肺疾患、結節性紅斑、壊疽性膿皮症、輸血副作用、ハンセン病、マラリア、リーシュマニア症、トリパノソーマ症、高安動脈炎、リウマチ性多発性筋痛、側頭動脈炎、住血吸虫症、巨細胞性動脈炎、回虫症、アスペルギルス症、サンプター（Ｓａｍｐｔｅｒ’ｓ）症候群、湿疹、リンパ腫様肉芽腫症、ベーチェット病、カプラン症候群、川崎病、デング熱、心内膜炎、心内膜心筋線維症、眼内炎、持久性隆起性紅斑（ｅｒｙｔｈｅｍａ ｅｌｅｖａｔｕｍ ｅｔ ｄｉｕｔｉｎｕｍ）、胎児赤芽球症、好酸球性筋膜炎（ｆａｃｉｉｔｉｓ）、シュルマン症候群、フェルティ症候群、フィラリア症、毛様体炎、慢性毛様体炎、異時性毛様体炎、フックス毛様体炎、ＩｇＡ腎症、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、移植片対宿主病、移植拒絶反応、ヒト免疫不全ウイルス感染、エコーウイルス感染、心筋症、アルツハイマー病、パルボウイルス感染、風疹ウイルス感染、ワクチン接種後症候群、先天性風疹感染、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫、腎細胞癌、多発性骨髄腫、イートン・ランバート症候群、再発性多発性軟骨炎、悪性黒色腫、クリオグロブリン血症、ワルデンストレームマクログロブリン血症、エプスタイン−バーウイルス感染、おたふく風邪、エヴァンズ症候群、及び／又は自己免疫性腺機能不全であり得る。
該投与は非経口、静脈内、皮下、筋肉内、経皮、経口、経表面、髄腔内又は局所であり得る。
本発明の方法はさらに、本発明の抗体又はその抗原結合部分の投与の６ヶ月以内に免疫抑制薬の投与を含むものであってもよい。
免疫抑制薬は、カルシニューリン阻害薬、タクロリムス、ｍＴｏｒ阻害薬、フィンゴリモド、マイリオシン、アレムツズマブ、リツキシマブ、抗ＣＤ４モノクローナル抗体、抗ＬＦＡ１モノクローナル抗体、抗ＬＦＡ３モノクローナル抗体、抗ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ１９抗体、モナバタセプト、ベラタセプト、インドリル−ＡＳＣ；アザチオプリン、リンパ球免疫グロブリン及び抗胸腺細胞グロブリン［ウマ］、ミコフェノール酸モフェチル、ミコフェノール酸ナトリウム、ダクリズマブ、バシリキシマブ、シクロホスファミド、プレドニゾン、プレドニゾロン、レフルノミド、ＦＫ７７８、ＦＫ７７９、１５−デオキシスペルグアリン、ブスルファン、フルダラビン、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、１５−デオキシスペルグアリン、ＬＦ１５−０１９５、ブレディニン、ブレキナール、及び／又はムロモナブ−ＣＤ３であり得る。カルシニューリン阻害薬はシクロスポリンＡ又はシクロスポリンＧであり得る。ｍＴｏｒ阻害薬はシロリムス、テムシロリムス、ゾタロリムス又はエベロリムスであり得る。抗ＣＤ４５抗体は抗ＣＤ４５ＲＢ抗体であり得る。一実施形態では、免疫抑制薬はベラタセプトである。
本発明の抗体又はその抗原結合部分と免疫抑制薬は、互いに１ヶ月以内又は１週間以内に投与され得る。
図１は、２Ｃ１０抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域を示す。重鎖について示したヌクレオチド配列（配列番号：１）はシグナルペプチド（ヌクレオチド１〜５７；下線）及び重鎖可変配列（ヌクレオチド５８〜３９６）を含む。対応するアミノ酸配列を下方に示し（配列番号：２）、ここで、アミノ酸１〜１９はシグナル配列（下線）に対応し、アミノ酸２０〜１３２は重鎖可変領域に対応する。
軽鎖について示したヌクレオチド配列（配列番号：３）はシグナルペプチド（ヌクレオチド１〜６６；下線）及び軽鎖可変配列（ヌクレオチド６７〜３８４）を含む。対応するアミノ酸配列を下方に示し（配列番号：４）、ここで、アミノ酸１〜２２はシグナルペプチド（下線）に対応し、アミノ酸２３〜１２８は軽鎖可変領域に対応する。
図２ａは、ヒト及びアカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ）ＣＤ２０＋ Ｂ細胞に対する２Ｃ１０の結合を確認するフローサイトメトリーデータを示すプロットである。 図２ｂは、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰを用いて検出される、ヒト及びアカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ）ＣＤ４０に対する２Ｃ１０の結合を確認するための、いろいろな濃度の２Ｃ１０を用いたＥＬＩＳＡアッセイによるＣＤ４０吸着データを示すプロットである。 図３は、ヒトＢ細胞に対するＣＤ１５４結合の２Ｃ１０による用量依存性阻害を示すグラフである。Ｂ細胞をＣＤ１５４結合について、ヒスチジンタグ化可溶性ＣＤ１５４とともにインキュベートし、ヒスチジン発現について解析することにより解析した。結果は、複数回の反復実験の代表的なものである。 図４は、アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ）又はヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びジャーカット細胞を伴うアッセイの原理を示す模式図及びグラフである。 図５は、いろいろな濃度の３Ａ８、５Ｃ８又は２Ｃ１０抗体の存在下でのアカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ）ＰＢＭＣ及びジャーカット細胞の共培養物から採取したＣＤ２０＋細胞におけるＣＤ２３の発現を示す一組のグラフである。 図５は、いろいろな濃度の３Ａ８、５Ｃ８又は２Ｃ１０抗体の存在下でのアカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ）ＰＢＭＣ及びジャーカット細胞の共培養物から採取したＣＤ２０＋細胞におけるＣＤ２３の発現を示す一組のグラフである。 図６は、いろいろな濃度の３Ａ８、５Ｃ８又は２Ｃ１０抗体の存在下でのヒトＰＢＭＣ及びジャーカット細胞の共培養物から採取したＣＤ２０＋細胞におけるＣＤ８６の発現を示す一組のグラフである。 図６は、いろいろな濃度の３Ａ８、５Ｃ８又は２Ｃ１０抗体の存在下でのヒトＰＢＭＣ及びジャーカット細胞の共培養物から採取したＣＤ２０＋細胞におけるＣＤ８６の発現を示す一組のグラフである。 図７は、ジャーカット細胞なしで３Ａ８抗体又は２Ｃ１０抗体のいずれかの存在下で培養したヒト又はアカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ）のいずれかのＰＢＭＣのＣＤ２０＋細胞におけるＣＤ２３の発現を示す一組のグラフである。 図７は、ジャーカット細胞なしで３Ａ８抗体又は２Ｃ１０抗体のいずれかの存在下で培養したヒト又はアカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ）のいずれかのＰＢＭＣのＣＤ２０＋細胞におけるＣＤ２３の発現を示す一組のグラフである。 図８は、アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ）ＩｇＧ１（２Ｃ１０Ｒ１）又はＩｇＧ４（２Ｃ１０Ｒ４）のいずれかの重鎖定常領域を含むように改変されたマウス−アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ）キメラ形態の２Ｃ１０及びキメラＩｇＧ１形態の抗ＣＤ４０ ３Ａ８（３Ａ８Ｒ１）又は抗ＣＤ４０ Ｃｈｉ２２０（Ｃｈｉ２２０）で処置したアカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅ）の末梢Ｂ細胞計数を示すグラフである。 図９は、２Ｃ１０Ｒ１、２Ｃ１０Ｒ４又は３Ａ８Ｒ１抗体で処置したアカゲザル（ｍａｃａｑｕｅ ｍｏｎｋｅｙ）におけるＴ細胞依存性抗体応答を示すグラフである。動物はすべて、最初の抗体処置後に４−ヒドロキシ−３−ニトロフェニルアセチルコンジュゲートスカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）で免疫処置した。 図１０は、膵島同種移植の標準的なアカゲザル（ｍａｃａｑｕｅ）モデルを示す図表である。アカゲザル（ｍａｃａｑｕｅ ｍｏｎｋｅｙ）に、ストレプトゾトシンを用いて糖尿病を誘発させた。糖尿病のサルに同種膵島を移植し、バシリキシマブ及びシロリムスを用いて免疫抑制を開始した。実験動物には移植後０日目と７日目に２Ｃ１０Ｒ４処置薬を投与した。 図１１ａは、膵島移植後、バックグラウンド免疫抑制及び２Ｃ１０Ｒ４で処置した４匹のアカゲザル（ｍａｃａｑｕｅ）のフリー（ｆｒｅｅ）血中グルコースレベル（ＦＢＧ）を示すプロットである。プロットの実線は血漿中の２Ｃ１０レベルを表す。 図１１ｂは、バックグラウンド免疫抑制のみを受けたアカゲザル（ｍａｃａｑｕｅ）のＦＢＧを示すプロットである。 図１２は、漸増濃度の２Ｃ１０、３Ａ８又はＣｈｉ２２０抗体とともにインキュベートし、各抗体が２Ｃ１０を交差ブロックする能力を評価するためにＡＰＣコンジュゲート２Ｃ１０で染色したヒトＰＢＭＣを用いた競合的ブロックアッセイの結果を示すグラフである。 図１３ａ及び１３ｂはヒト化２Ｃ１０可変領域の配列アラインメントを示す。図１３ａ：マウス２Ｃ１０ ＶＨ配列をヒト生殖細胞系列ＶＨ１−３並びに３つのヒト化配列２Ｃ１０＿ｈ１、２Ｃ１０＿ｈ２及び２Ｃ１０＿ｈ３に対してアラインメントした。図１３ｂ：マウス２Ｃ１０ ＶＬ配列をヒト生殖細胞系列ＶＨ３−１１並びに２つのヒト化配列２Ｃ１０＿ｌ１及び２Ｃ１０＿ｌ２に対してアラインメントした。２Ｃ１０ ＣＤＲを太字で示す。ヒト化配列内のマウス残基に下線を付している。 図１４は、フレームワーク３における２Ｃ１０ＨＰ及び２Ｃ１０ＨＢ１並びに２Ｃ１０ＨＢ２構築物間のアミノ酸の違いを示す。 図１５は、ヒト化２Ｃ１０抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の配列を示す。この重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は２Ｃ１０ＨＰ、２Ｃ１０ＨＢ１、２Ｃ１０ＨＢ２、２Ｃ１０ＫＰ、２Ｃ１０ＫＢ１及び２Ｃ１０ＫＢ２を含む。 図１６は、異なる霊長類種に由来するＣＤ４０に対するヒト化２Ｃ１０抗体の結合親和性を示す。ヒト化２Ｃ１０抗体（ｈ２Ｃ１０）をＣＭ５チップの表面にアミンカップリングによって固定化した。ヒト、アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ）及びヒヒのいろいろな濃度のＣＤ４０−ＭＢＰ融合体を親和性についてＢＩＡＣｏｒｅ ３０００で解析した。結合親和性を、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン４．１．１．を用いて計算した。 図１７は、抗ＫＬＨ抗体応答（ＩｇＭ及びＩｇＧ）の誘導が、ＫＬＨで免疫処置したサルにおいて、生理食塩水、１０又は２５ｍｇ／ｋｇのｈ２Ｃ１０のいずれかを投与後３時間目に測定されたことを示す。対照動物はすべて、ＫＬＨ抗原に対するＩｇＧ又はＩｇＭ抗体応答を示した。１０ｍｇ／ｋｇで処置した個々のサルではＫＬＨに対してＩｇＧ又はＩｇＭいずれかの抗体応答が生じたが、２５ｍｇ／ｋｇの２Ｃ１０で処置した動物では生じなかった。 ２５ｍｇ／ｋｇ ｈ２Ｃ１０（上列）又は１０ｍｇ／ｋｇ ｈ２Ｃ１０（中列）又は対照動物（下列）での処置後のＢリンパ球サブセット及びＴリンパ球サブセットの表現型分類には全血を使用した。いずれの用量のｈ２Ｃ１０も、リンパ球集団に対してなんら明白な効果を有しなかった。また、認識可能なＢ細胞枯渇がないことも、成熟及び未成熟Ｂ細胞集団の詳細な解析を含む霊長類キメラ形態の初期の用量応答評価において明白であった。 ２５ｍｇ／ｋｇ ｈ２Ｃ１０（上列）又は１０ｍｇ／ｋｇ ｈ２Ｃ１０（中列）又は対照動物（下列）での処置後のＢリンパ球サブセット及びＴリンパ球サブセットの表現型分類には全血を使用した。いずれの用量のｈ２Ｃ１０も、リンパ球集団に対してなんら明白な効果を有しなかった。また、認識可能なＢ細胞枯渇がないことも、成熟及び未成熟Ｂ細胞集団の詳細な解析を含む霊長類キメラ形態の初期の用量応答評価において明白であった。 ２８日目、ヒト化２Ｃ１０はＢ細胞上のＣＤ４０結合部位を完全に飽和させた。インビボで投与されたＨ２Ｃ１０は、Ｂ細胞に結合する蛍光標識２Ｃ１０の結合を完全にブロックした。データは、２５ｍｇ／ｋｇ（上列）、１０ｍｇ／ｋｇ（中列）又は０ｍｇ／ｋｇ（対照；下列）の単回用量後２８日目のヒト化２Ｃ１０処置サル及び対照サルでの結果を示す。同様の結果が輸注後３、７、１４及び２１日目においても得られた。 １０ｍｇ／ｋｇ又は２５ｍｇ／ｋｇいずれかでのサルの処置後２８日目までのｈ２Ｃ１０の平均血清濃度。２Ｃ１０の濃度は経時的にゆっくり低下し、レベルは全試験期間にわたって検出される。 図２１ａ及び２１ｂは、安定化ＩｇＧ４形式のヒト化２Ｃ１０（ｈ２Ｃ１０）のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を示す。図２１ａは重鎖のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を示す。図２１ｂは軽鎖のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を示す。配列番号：３２：重鎖のＤＮＡ配列；配列番号：３３：重鎖のアミノ酸配列；配列番号：３４：軽鎖のＤＮＡ配列；配列番号：３５：軽鎖のアミノ酸配列。 図２１ａ及び２１ｂは、安定化ＩｇＧ４形式のヒト化２Ｃ１０（ｈ２Ｃ１０）のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を示す。図２１ａは重鎖のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を示す。図２１ｂは軽鎖のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を示す。配列番号：３２：重鎖のＤＮＡ配列；配列番号：３３：重鎖のアミノ酸配列；配列番号：３４：軽鎖のＤＮＡ配列；配列番号：３５：軽鎖のアミノ酸配列。 図２１ａ及び２１ｂは、安定化ＩｇＧ４形式のヒト化２Ｃ１０（ｈ２Ｃ１０）のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を示す。図２１ａは重鎖のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を示す。図２１ｂは軽鎖のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を示す。配列番号：３２：重鎖のＤＮＡ配列；配列番号：３３：重鎖のアミノ酸配列；配列番号：３４：軽鎖のＤＮＡ配列；配列番号：３５：軽鎖のアミノ酸配列。
本開示は、種々の治療方法、予防方法、診断方法及び他の方法に使用され得る抗ＣＤ４０抗体及び抗体断片（例えば、該抗体の抗原結合部分）に関する。該抗体は、ＣＤ４０がＣＤ１５４に結合する能力をブロックし得るものであり、ＣＤ４０発現細胞（例えば、Ｂ細胞）を活性化させることなくそれを行ない得るものである。本発明の抗体又はその断片は、臓器又は組織の移植に伴う合併症を低減させるために使用され得る。
該抗体又はその抗原結合部分としては、限定されないが、ヒト化抗体、ヒト抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ポリクローナル抗体、組換え発現抗体、並びに前述のものの抗原結合部分が挙げられる。抗体の抗原結合部分としては、ＣＤ４０に特異的に結合する抗体の一部分が挙げられ得る。
また、本開示により、移植拒絶反応の尤度を下げるため、移植拒絶反応を処置するため、免疫抑制を誘導するため、及び／又は自己免疫性障害を処置するための組成物及び方法を提供する。該組成物は、ＣＤ４０に特異的に結合する抗体又はその断片を含有しているものである。
一実施形態では、本開示により、哺乳動物に本発明の抗体（又はその断片）を含む組成物を、被験体の移植片対宿主病及び／又は移植拒絶反応の症状の１つ以上が低減されるのに充分な量で投与することを含む、被験体の移植片対宿主病及び／又は移植拒絶反応を処置又は改善する方法を提供する。
別の実施形態では、該抗体又は抗原結合断片は、炎症性疾患又は免疫障害、例えば自己免疫疾患を有する被験体に投与される。炎症性疾患又は自己免疫疾患はＣＤ４０発現細胞と関連しているものであり得る。
本発明では、被験体に本発明の抗体又はその抗原結合部分を有効量で投与することにより、該被験体の移植拒絶反応の尤度を下げる方法、移植拒絶反応を処置する方法、免疫抑制を誘導する方法及び／又は自己免疫性障害を処置する方法を取り上げて記載する。
また、本開示には、哺乳動物に本発明の抗体又はその抗原結合部分を含む組成物を、該哺乳動物においてＣＤ４０媒介性免疫応答がブロックされるのに充分な量で投与することを含む、哺乳動物におけるＣＤ４０の機能をブロックする方法も包含される。
本開示の別の方法は、ＣＤ４０発現細胞の成長及び／又は分化の阻害に関するものであって、本発明の抗体又は抗原結合断片を該細胞に投与することを含み、該抗体又は抗原結合断片がＣＤ４０に結合すると該細胞の成長及び／又は分化が阻害されるものである。
本開示により、ＣＤ４０関連障害を有する被験体を処置する方法であって、該被験体に本発明の抗体又は抗原結合断片を投与することを含み、該抗体又は抗原結合断片がＣＤ４０に結合するとＣＤ４０関連障害の細胞の成長及び／又は分化が阻害される方法を提供する。該細胞は、限定されないが、Ｂリンパ芽球様細胞、膵臓細胞、肺細胞、乳房細胞、卵巣細胞、結腸細胞、前立腺細胞、皮膚細胞、頭頸部の細胞、膀胱細胞、骨細胞又は腎臓細胞であり得る。
本発明の方法は、慢性リンパ性白血病、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、Ｔ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、ワルデンストレームマクログロブリン血症又はカポジ肉腫を処置するために使用され得る。
本開示のさらなる方法としては、被験体に有効量の本開示の抗ＣＤ４０抗体又はその断片を投与することを含む、被験体のＢ細胞による抗体産生の阻害が挙げられる。一実施形態では、該抗体は、被験体においてＢ細胞の分化及び抗体のアイソタイプスイッチが阻害されるのに有効な量で投与される。別の実施形態では、該抗体は、被験体においてサイトカイン及びケモカインの産生が阻害されるのに有効な量で、及び／又はＴ細胞及びマクロファージにおける接着分子の上方調節が阻害されるのに有効な量で投与される。第３の実施形態では、該抗体は、被験体において樹状細胞の活性化が阻害されるのに有効な量で投与される。
本発明の抗体又はその断片に加えて、本発明の方法はさらに、第２の治療用薬剤、例えば免疫抑制薬、腫瘍壊死因子拮抗薬（ＴＮＦ拮抗薬）、ＣＴＬＡ４拮抗薬、抗ＩＬ−６受容体抗体、抗ＣＤ２０抗体又はその組合せを投与することを含むものであってもよい。
本発明の抗体又はその抗原結合部分は、ヒトＣＤ４０及び／又はアカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ）ＣＤ４０、例えば、組換えヒトＣＤ４０及び天然ヒトＣＤ４０に特異的に結合し得るものである。
本明細書で用いる場合、ＣＤ４０を発現する細胞は、ＣＤ４０の表面発現を特徴とする任意の細胞、例えば限定されないが、正常及び新生物性のＢ細胞、指状嵌入細胞、基底上皮細胞、癌細胞、マクロファージ、内皮細胞、濾胞樹状細胞、扁桃細胞並びに骨髄由来形質細胞である。
ヒト化抗体
本開示のヒト化抗体は、非ヒト種に由来する抗体であって、非抗原結合領域（及び／又は抗原結合領域）内のアミノ酸配列が、該抗体がヒト抗体によりよく似るように改変されているが、依然として元の結合能を保持しているものである。
抗体の軽鎖可変領域又は重鎖可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される３つの超可変領域からなる。ＣＤＲは、フレームワーク領域（ＦＲ）によって可変領域内に支持されている。一実施形態では、重鎖可変領域（又は軽鎖可変領域）には３つのＣＤＲと４つのフレームワーク領域（ＦＲ）が含まれており、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配列されている。Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２，１９９１．Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７，１９８７。
一部の特定の実施形態では、ヒト化抗体は、非ヒト種に由来する抗体分子であって、非ヒト種由来の１つ、２つ、３つ又はすべてのＣＤＲと、ヒト免疫グロブリン分子由来の１つ、２つ、３つ、４つ又はすべてのフレームワーク領域を有するものである。
本発明の抗体又はその抗原結合部分のＣＤＲは、非ヒト供給源に由来するものであってもヒト供給源に由来するものであってもよい。本発明の抗体又はその抗原結合部分のフレームワークは、ヒト、ヒト化、非ヒト（例えば、ヒトにおいて抗原性が低減されるように修飾されたマウスフレームワーク）又は合成のフレームワーク（例えば、コンセンサス配列）であり得る。一実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合部分は少なくとも１つの重鎖可変領域及び／又は少なくとも１つの軽鎖可変領域を含むものである。
本開示のヒト化抗体は、当該技術分野で知られた方法によって作製することができる。例えば、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源由来の１つ以上のアミノ酸残基が導入されたものであり得る。このような非ヒトアミノ酸残基は多くの場合、「インポート」残基と称され、これは典型的には「インポート」可変ドメインから採取される。ヒト化は、Ｗｉｎｔｅｒ及び共同研究者ら（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５，１９８６；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−７，１９８８；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−６，１９８８）の方法に従い、超可変領域の配列をヒト抗体の対応する配列で置き換えることによって行なわれ得る。したがって、かかるヒト化抗体では、インタクトなヒト可変ドメインよりもかなり少ない部分が非ヒト種に由来する対応配列で置換されている。一部の特定の実施形態では、ヒト化抗体は、超可変領域の残基並びに他の可変領域の残基のうちの少なくともいくつかが非ヒト抗体の類似の部位の残基で置換されているヒト抗体である。
ヒト化抗体の作製において使用するヒト可変ドメイン（軽鎖及び重鎖のどちらも）の選択により抗原性が低減され得る。「ベストフィット」法に従い、非ヒト（例えば、マウスなどの齧歯類）抗体の可変ドメインの配列を、既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。次いで、非ヒトのものと最も近いヒト配列をヒト化抗体のヒトフレームワークとして受容させる。例えば、Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６−３０８，１９９３；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−１７，１９８７を参照のこと。別の方法は、特定のサブグループの軽鎖又は重鎖の全ヒト抗体のコンセンサス配列から誘導した特定のフレームワークを使用するものである。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用してもよい。例えば、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４２８５−９，１９９２；Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３−３２，１９９３を参照のこと。
ヒト化抗体は、抗原結合に直接関与していない可変領域の配列をヒト可変領域由来の対応配列で置き換えることにより作製され得る。該方法は、少なくとも１つの重鎖又は軽鎖の可変領域の全部又は一部をコードしている核酸配列を単離し、操作して発現させることを含むものである。かかる核酸の供給源は当業者によく知られており、例えば、ＣＤ４０に対する抗体を産生するハイブリドーマから得られ得る。次いで、該ヒト化抗体又はその断片をコードしている組換えＤＮＡは適切な発現ベクター内にクローニングされ得る。
別の例では、非ヒト（例えば、マウス）抗体が得られたら可変領域がシーケンシングされ得、ＣＤＲ残基及びフレームワーク残基の位置が決定され得る。Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２。Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−９１７。軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を対応する定常領域にライゲーションしてもよい。ＣＤＲグラフティング又はＣＤＲ置換によってＣＤＲグラフト抗体分子を作製してもよい。免疫グロブリン鎖の１つ、２つ、３つ又はすべてのＣＤＲが置き換えられ得る。例えば、特定の抗体のすべてのＣＤＲが非ヒト動物の少なくとも一部分に由来するものであってもよく（例えば、マウスの表１に示すＣＤＲなど）、いくつかのＣＤＲだけが置き換えられていてもよい。必要なのは、該抗体が所定の抗原（例えば、ＣＤ４０）に結合するのに必要とされるＣＤＲが維持されていることだけである。Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：１２０２−１２０７．Ｏｉ ｅｔ ａｌ．，１９８６，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，４：２１４。米国特許第５，５８５，０８９号；同第５，２２５，５３９号；同第５，６９３，７６１号及び同第５，６９３，７６２号。欧州特許第５１９５９６号。Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５５２−５２５。Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４。Ｂｅｉｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４１：４０５３−４０６０。
抗体が、抗原に対する高い親和性及び他の好都合な生物学的特性を保持した状態でヒト化されることが望ましい場合があり得る。この目的を達成するため、一例の方法によれば、親配列及び種々の概念的ヒト化産物を親配列及びヒト化配列の３次元モデルを用いて解析する方法によってヒト化抗体を調製する。３次元の免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者は熟知している。選択した候補免疫グロブリン配列の推定され得る３次元立体構造を図解し、表示するコンピュータプログラムも入手可能である。このような表示された構造を検討することにより、候補免疫グロブリン配列の機能発揮における残基の考えられ得る役割の解析、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響する残基の解析が可能である。このようにして、ＦＲ残基が選択され得、所望の抗体特性（（１又は複数の）標的抗原に対する高い親和性など）が得られるようにレシピエント配列及びインポート配列と結合され得る。
いくつかの実施形態では、ヒト化抗ＣＤ４０抗体はまた、免疫グロブリンの定常領域（典型的にはヒト免疫グロブリンのものである）の少なくとも一部分も含むものである。一実施形態では、該抗体は、軽鎖並びに重鎖の少なくとも可変ドメインの両方を含む。また、該抗体は、適宜、重鎖の定常ドメインＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、及び／又はＣＨ４のうちの１つ以上を含んでいてもよい。
本開示の一部の態様では、ヒト化抗体の１つ以上のドメインが組換え発現される。かかる組換え発現には、１つ以上の制御配列、すなわち、作動可能に連結されたコード配列が特定の宿主生物体において発現されるのに必要なポリヌクレオチド配列が使用され得る。原核生物細胞における使用に適した制御配列としては、例えば、プロモーター、オペレーター及びリボソーム結合部位の配列が挙げられる。真核生物系の制御配列としては、限定されないが、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーが挙げられる。このような制御配列は、原核生物宿主細胞及び真核生物宿主細胞におけるヒト化抗ＣＤ４０抗体の発現及び産生のために使用され得る。
また、本明細書に開示した１つ、２つ又はすべてのＣＤＲを含み、その他の領域が少なくとも１種類の異なる種、例えば限定されないが、ヒト、ウサギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヤギ、ブタ、サル、類人猿、ゴリラ、チンパンジー、アヒル、ガチョウ、ニワトリ、両生類、爬虫類及び他の動物に由来する配列で置き換えられた抗体又はその抗原結合部分も本開示に包含される。
ヒト抗体
本開示のヒト抗体は、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択した（１又は複数の）Ｆｖクローン可変ドメイン配列を既知の（１又は複数の）ヒト定常ドメイン配列と結合することにより構築され得る（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１−８，１９９２；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−９７，１９９１）。あるいはまた、ヒト抗体は、ハイブリドーマ法によって作製され得る。ヒトモノクローナル抗体の作製のためのヒト骨髄腫細胞株及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株は、例えば、Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１−５，１９８４；Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）；及びＢｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：８６−９５，１９９１に報告されている。
免疫処置したら内因性免疫グロブリン産生なしでヒト抗体の全レパートリーを産生し得るトランスジェニック動物（例えば、マウス）を作製することも可能である。例えば、キメラの生殖細胞変異型マウスにおける抗体重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合型欠失により、内因性抗体産生の完全阻害がもたらされることが報告されている。かかる生殖細胞変異型マウスにおけるヒト生殖細胞免疫グロブリン遺伝子アレイの導入により、抗原刺激するとヒト抗体の産生がもたらされる。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２５５１−５，１９９３；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５５−８，１９９３；Ｂｒｕｅｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３−４０，１９９３を参照のこと。
また、非ヒト、例えば齧歯類の抗体からヒト抗体を誘導するために遺伝子シャッフリングを使用することもでき、この場合、ヒト抗体は出発物質の非ヒト抗体と同様の親和性及び特異性を有する。この方法（これは、「エピトープインプリンティング」とも称される）によれば、ファージディスプレイ手法によって得た非ヒト抗体断片の本明細書に記載の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域のいずれかをヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーで置き換え、非ヒト鎖／ヒト鎖ｓｃＦｖ又はＦａｂキメラの集団を作出する。抗原を用いて選択すると非ヒト鎖／ヒト鎖キメラｓｃＦｖ又はＦａｂが単離され、このとき、ヒト鎖には、１次ファージディスプレイクローンの対応する非ヒト鎖を除去した際に破壊された抗原結合部位が復元される、すなわち、エピトープによってヒト鎖パートナーの選択が支配（インプリント）される。残りの非ヒト鎖も置き換えるためにこのプロセスを繰り返すとヒト抗体が得られる（国際公開第９３／０６２１３号参照）。ＣＤＲグラフティングによる非ヒト抗体の従来のヒト化とは異なり、この手法では、非ヒト起源のＦＲ又はＣＤＲ残基を有しない完全ヒト抗体が得られる。
キメラ抗体
キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子である。例えば、抗体は、マウス抗体に由来する可変領域とヒト免疫グロブリンの定常領域を含むものであり得る。キメラ抗体は組換えＤＮＡ手法によって作製され得る。Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，８１：６８５１−６８５５（１９８４）。例えば、マウス（又は他の種）のモノクローナル抗体分子をコードしている遺伝子を制限酵素で消化してマウスＦｃをコードしている領域を除去し、ヒトＦｃ定常領域をコードしている遺伝子の対応部分に置換する。また、キメラ抗体は、マウスＶ領域をコードしているＤＮＡがヒト定常領域をコードしているＤＮＡにライゲートされ得る組換えＤＮＡ手法によっても作出され得る。Ｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８８，２４０：１０４１−１０４３。Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ，１９８７ ８４：３４３９−３４４３。Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９８７，１３９：３５２１−３５２６。Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ，１９８７，８４：２１４−２１８。Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．，１９８７，４７：９９９−１００５。Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，１９８５，３１４：４４６−４４９。Ｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，１９８８，８０：１５５３−１５５９。国際特許出願国際公開第１９８７００２６７１号及び同第８６／０１５３３号。欧州特許出願第１８４，１８７号；同第１７１，４９６号；同第１２５，０２３号；及び同第１７３，４９４号。米国特許第４，８１６，５６７号。
可変領域及びＣＤＲ
マウス２Ｃ１０抗体及び特定のヒト化抗ＣＤ４０抗体の重鎖可変領域、軽鎖可変領域及びＣＤＲを表１に示す。
表１ 配列番号１１〜３１
Figure 0006976931
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一部の特定の実施形態では、該抗体又はその抗原結合部分は、配列番号：１１、１９、２０、２１、２４、２５及び２６のいずれかに示す重鎖可変領域のアミノ酸配列と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、約７０％、約７５％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は約１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含むものである。
一部の特定の実施形態では、該抗体又はその抗原結合部分は、配列番号：１２、２２、２３、２７、２８及び２９のいずれかに示す軽鎖可変領域のアミノ酸配列と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、約７０％、約７５％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は約１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むものである。
一部の特定の実施形態では、該抗体又はその抗原結合部分は各々、配列番号：１１、１９、２０、２１、２４、２５及び２６のいずれかに示す重鎖可変領域のアミノ酸配列と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、約７０％、約７５％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は約１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号：１２、２２、２３、２７、２８及び２９に示す軽鎖可変領域のアミノ酸配列と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、約７０％、約７５％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は約１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域の両方を含むものである。
該抗体又はその抗原結合部分の重鎖可変領域は、２Ｃ１０抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ（それぞれ配列番号：１３、１４、１５に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、約７０％、約７５％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は約１００％同一の１つ、２つ、３つ又はそれ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むものであり得る。
該抗体又はその抗原結合部分の軽鎖可変領域は、２Ｃ１０抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ（それぞれ配列番号：１６、１７、１８に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、約７０％、約７５％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は約１００％同一の１つ、２つ、３つ又はそれ以上のＣＤＲを含むものであり得る。
本発明の抗体又はその抗原結合部分の重鎖可変領域は、２Ｃ１０抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ（それぞれ配列番号：１３、１４、１５に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、約７０％、約７５％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は約１００％同一の１つ、２つ、３つ又はそれ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むものであり得、該抗体又はその抗原結合部分の軽鎖可変領域は、２Ｃ１０抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ（それぞれ配列番号：１６、１７、１８に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、約７０％、約７５％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は約１００％同一の１つ、２つ、３つ又はそれ以上のＣＤＲを含むものであり得る。
該抗体又はその抗原結合部分の重鎖可変領域は、２Ｃ１０抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ（それぞれ配列番号：１３、１４、１５に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、約７０％、約７５％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は約１００％同一の３つのＣＤＲを含むものであり得る。
一実施形態では、該抗体又はその抗原結合部分の軽鎖可変領域は、２Ｃ１０抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ（それぞれ配列番号：１６、１７、１８に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、約７０％、約７５％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は約１００％同一の３つのＣＤＲを含むものである。
一実施形態では、該抗体又はその抗原結合部分の重鎖可変領域は、２Ｃ１０抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ（それぞれ配列番号：１３、１４、１５に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、約７０％、約７５％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は約１００％同一の３つのＣＤＲを含むものであり、該抗体又はその抗原結合部分の軽鎖可変領域は、２Ｃ１０抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ（それぞれ配列番号：１６、１７、１８に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、約７０％、約７５％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は約１００％同一の３つのＣＤＲを含むものである。
一部の特定の実施形態では、該抗体又はその抗原結合部分の重鎖可変領域は、２Ｃ１０抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ（それぞれ配列番号：１３、１４、１５に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）と同一の３つのＣＤＲを含むものであり、該抗体又はその抗原結合部分の軽鎖可変領域は、２Ｃ１０抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ（それぞれ配列番号：１６、１７、１８に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）と同一の３つのＣＤＲを含むものである。
本開示には、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が、それぞれ抗体２Ｃ１０の重鎖可変領域（配列番号：１１）及び軽鎖可変領域（配列番号：１２）と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、約７０％、約７５％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は約１００％同一のアミノ酸配列を有するものである抗体も包含される。
関連する実施形態では、抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合部分は、例えば、２Ｃ１０の重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域のＣＤＲを含むものである。
一実施形態では、該抗体又はその抗原結合部分は、２Ｃ１０抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域（それぞれ配列番号：１１と配列番号：１２）と同一の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含むものである。
種々の実施形態において、該抗体又はその抗原結合部分は、２Ｃ１０抗体が結合するエピトープと重複するエピトープに特異的に結合するもの、又は２Ｃ１０抗体が結合するエピトープと少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、約７０％、約７５％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％もしくは約１００％同一のエピトープに特異的に結合するものである。該エピトープは配列番号：６の配列内に存在しているものであり得るか、又は配列番号：６のアミノ酸８〜４０の配列内に存在しているものであり得る
一部の特定の実施形態では、表１のＣＤＲに相当するＣＤＲは配列バリエーションを有するものである。例えば、ＣＤＲの１、２ ３、４、５、６、７もしくは８個の残基又は全残基の２０％未満、３０％未満もしくは約４０％未満が置換されているか、又は欠失しているＣＤＲが、ＣＤ４０に結合する抗体（又はその抗原結合部分）内に存在し得る。
また、特定のアミノ酸が置換、欠失又は付加されている抗体又はその抗原結合部分も本開示の範囲に含まれる。このような改変は、結合活性などのペプチドの生物学的特性に対して実質的な効果を有しないものである。例えば、抗体は、例えば抗原に対する結合を改善するためにフレームワーク領域内にアミノ酸置換を有するものであり得る。別の例では、選択された少数のアクセプターフレームワーク残基が対応するドナーアミノ酸で置き換えられ得る。ドナーフレームワークは、成熟又は生殖細胞系列のヒト抗体フレームワーク配列又はコンセンサス配列であり得る。表現型においてサイレントなアミノ酸置換をどのようにして行なうかに関する手引きは、Ｂｏｗｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７：１３０６−１３１０（１９９０）．Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５（１９８９）．Ａｕｓｕｂｅｌ（ｅｄ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）．Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）．Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４３：３０７−３１（１９９４）．Ｇｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３−４５（１９９２）に示されている。
本発明のペプチドは、例えば、約３０％未満、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、約５％又は約１％のアミノ酸残基が置換されているか又は欠失しているが本質的に同じ免疫学的特性、例えば限定されないがＣＤ４０に対する結合を保持している本明細書に開示した抗体又はその抗原結合部分の機能的に活性なバリアントであってもよい。
該抗体又はその抗原結合部分には、生物学的活性、例えば、ＣＤ４０などの抗原の結合を示すペプチドバリアント、ペプチドアナログ、ペプチドオルソログ、ペプチドホモログ及びペプチド誘導体もまた包含され得る。該ペプチドは、１個以上のアミノ酸アナログ（例えば、天然に存在しないアミノ酸、無関連の生物学的系にのみ天然に存在するアミノ酸、哺乳動物の系に由来する修飾アミノ酸など）を含有しているもの、置換型結合を有するペプチド並びに当該技術分野で知られた他の修飾型であり得る。
該抗体又はその抗原結合部分を誘導体化してもよく、別の機能性分子に連結させてもよい。例えば、抗体は、１種類以上の他の分子実体、例えば、別の抗体、検出可能な薬剤、免疫抑制薬、細胞毒性剤、医薬用薬剤、別の分子との会合を媒介し得るタンパク質もしくはペプチド（例えば、ストレプトアビジンコア領域もしくはポリヒスチジンタグ）、アミノ酸リンカー、シグナル配列、免疫原性担体、又はタンパク質の精製に有用なリガンド、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ヒスチジンタグ、及びブドウ球菌のプロテインＡに機能的に連結され得る（化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合性相互作用などによって）。細胞毒性剤としては、放射性同位体、化学療法剤、及び毒素、例えば細菌、真菌、植物又は動物起源の酵素活性毒素、並びにその断片が挙げられ得る。かかる細胞毒性剤は、本開示のヒト化抗体に標準的な手順を用いてカップリングされ、例えば、該抗体での治療が指示された患者を処置するために使用され得る。
一例の型の誘導体化タンパク質は、（同じ型又は異なる型の）２種類以上のタンパク質を架橋させることにより作製されるものである。好適な橋かけ剤としては、ヘテロ二官能性であり、適切なスペーサーによって隔離された２つの相違する反応性基を有するもの（例えば、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）又はホモ二官能性を有するもの（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）が挙げられる。タンパク質を誘導体化させ（又は標識し）得る有用な検出可能な薬剤としては、蛍光性薬剤、種々の酵素、補欠分子族、発光性物質、生物発光性物質、及び放射性物質が挙げられる。非限定的で例示的な蛍光性の検出可能な薬剤としては、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、及びフィコエリトリンが挙げられる。また、タンパク質又は抗体を、検出可能な酵素、例えば、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコースオキシダーゼなどを用いて誘導体化してもよい。また、タンパク質を、補欠分子族（例えば、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチン）を用いて誘導体化してもよい。
別の実施形態では、ヒト化抗ＣＤ４０抗体又はその断片を標識なしで使用し、ヒト化抗ＣＤ４０抗体又はその断片に結合する標識抗体を用いて検出する。
抗体断片
該抗体は完全長であってもよく、抗原結合部分を有する該抗体の断片（１つ又は複数）を含むもの、例えば限定されないが、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、二価ｓｃＦｖ（ｂｉ−ｓｃＦｖ）、三価ｓｃＦｖ（ｔｒｉ−ｓｃＦｖ）、Ｆｄ、ｄＡｂ断片（例えば、Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４１：５４４−５４６（１９８９））、単離ＣＤＲ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、線状抗体、一本鎖抗体分子、及び抗体断片から形成された多重特異性抗体であってもよい。また、組換え方法又は合成リンカーを用いて抗体断片を連接することにより作製される一本鎖抗体も本開示に包含される。Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８８，２４２：４２３−４２６。Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８８，８５：５８７９−５８８３。
抗体のパパイン消化により「Ｆａｂ」断片と称される２つの同一の抗原結合断片が生じ、各々は１つの抗原結合部位を有し、残部は「Ｆｃ」断片であり、その名称は容易に結晶化する能力を反映している。ペプシン処理によりＦ（ａｂ’）２断片が生じ、これは、２つの抗原結合部位を有し、依然として抗原を架橋させる能力を有する。
Ｆｖは、完全な抗原結合部位を含有している最小限の抗体断片である。一実施形態では、２つの鎖のＦｖ種は、堅固な非共有結合状態の１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなるものである。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）種では、１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインが柔軟性のペプチドリンカーにより、軽鎖と重鎖が２つの鎖のＦｖ種のものと同様の「二量体」構造の状態に会合し得るように共有結合され得る。各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用してＶＨ−ＶＬ二量体の表面上に抗原結合部位を画定するのはこの構成においてである。合わせて６つのＣＤＲが該抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（すなわち抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含む片方のＦｖ）であっても抗原を認識して結合する能力を有するが、完全な結合部位より親和性は低い。
Ｆａｂ断片は、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインを含んでおり、また、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）も含んでいるものである。Ｆａｂ’断片は、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に数個の残基が付加されており、抗体のヒンジ領域の１つ以上のシステインを含むことによってＦａｂ断片と異なっている。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインの（１又は複数の）システイン残基が遊離チオール基を有しているＦａｂ’の表示である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元々は、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片ペアとして作製されたものである。また、抗体断片の他の化学カップリングも知られている。
単鎖Ｆｖ又はｓｃＦｖ抗体断片は抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、ここで、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。一般的に、ｓｃＦｖポリペプチドはさらに、ＶＨドメインとＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを含んでおり、これによりｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することが可能である。ｓｃＦｖの概説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｅｎ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９４），ｐｐ．２６９−３１５を参照のこと。
ダイアボディは２つの抗原結合部位を有する抗体断片であり、該断片は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に同じポリペプチド鎖内で連結されたもの（ＶＨ−ＶＬ）を含むものである。同じ鎖上のこの２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用することにより、該ドメインは別の鎖の相補的ドメインと対合せざるを得ず、２つの抗原結合部位が作出される。ダイアボディは二価又は二重特異性であり得る。ダイアボディは、例えば、欧州特許第４０４，０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−３４，２００３；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−８，１９９３．にさらに充分に記載されている。また、トリアボディ及びテトラボディもＨｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−３４，２００３に記載されている。
抗体断片は、従来の手段、例えば酵素での消化によって、又は組換え手法によって作製され得る。一部の特定の状況では、完全体の抗体ではなく抗体断片を使用する利点がある。小サイズの断片の方が迅速な排出か可能であり、充実性腫瘍への到達の改善がもたらされる場合があり得る。一部の特定の抗体断片の概説については、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４，２００３を参照されたい。
抗体断片の作製のための種々の手法が開発されている。従来では、このような断片は、インタクトな抗体のタンパク質分解性消化によって誘導されていた（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：１０７−１７，１９９２；及びＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１−３，１９８５参照）。しかしながら、現在では、このような断片は組換え宿主細胞によって直接生成させることができる。Ｆａｂ、Ｆｖ及びＳｃＦｖ抗体断片はすべて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現させて分泌させることができ、したがって、大量のこのような断片を容易に作製することが可能である。抗体断片は、抗体ファージライブラリーから単離されるものであってもよい。あるいはまた、Ｆａｂ’−ＳＨ断片を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から直接回収し、化学カップリングさせてＦ（ａｂ’）２断片を形成してもよい（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３−７，１９９２）。別のアプローチでは、Ｆ（ａｂ’）２断片を組換え宿主細胞培養物から直接単離する。長いインビボ半減期を有し、サルベージ受容体結合性エピトープ残基を含むＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片が米国特許第５，８６９，０４６号に記載されている。抗体断片の作製のための他の手法は当業者に自明であろう。
本発明の抗体又はその抗原結合部分は少なくとも１つの定常ドメイン、例えば（ａ）ＩｇＧの定常ドメイン；（ｂ）ＩｇＡの定常ドメインなどを含むものであり得る。
あらゆる抗体のアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ（ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）、ＩｇＤ又はＩｇＥが本開示に包含される。該抗体又はその抗原結合部分は哺乳動物（例えば、マウス、ヒト）の抗体又はその抗原結合部分であり得る。該抗体の軽鎖はκ又はλ型のものであり得る。代替的なヒト化抗ＣＤ４０抗体は、１種類より多くの免疫グロブリンクラス又はアイソタイプに由来する配列を含むものであり得、所望のエフェクター機能を最適化するための特定の定常ドメインの選択は当該技術分野の通常の技能の範囲内である。
本開示の抗体又はその抗原結合部分は単一特異性であっても二重特異性であっても多重特異性であってもよい。多重特異性もしくは二重特異性抗体又はその断片は、１種類の標的ポリペプチド（例えば、ＣＤ４０）の異なるエピトープに特異的なものであってもよく、１種類より多くの標的ポリペプチドに特異的な抗原結合ドメイン（例えば、ＣＤ４０及び移植拒絶反応又は自己免疫疾患に関連する他の抗原に特異的な抗原結合ドメイン）を含むものであってもよい。一実施形態では、多重特異性抗体又はその抗原結合部分は少なくとも２つの異なる可変ドメインを含むものであって、該可変ドメインの各々が別々の抗原又は同じ抗原上の異なるエピトープに特異的に結合し得るものである。Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９．Ｋｕｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：２３８−２４４。本発明の抗体を別の機能性分子、例えば別のペプチド又はタンパク質に連結させてもよく、又はこれらと共発現させてもよい。例えば、該抗体又はその断片を１種類以上の他の分子実体、例えば別の抗体又は抗体断片に機能的に連結させ（例えば、化学カップリング、遺伝子融合、非共有結合性会合又はその他の手段によって）、第２の結合特異性を有する二重特異性抗体又は多重特異性抗体を作製してもよい。例えば、本開示には、免疫グロブリンの一方のアームがＣＤ４０に特異的であり、該免疫グロブリンの他方のアームが第２の治療標的に特異的であるか、又は治療性部分、例えば免疫抑制薬にコンジュゲートされている二重特異性抗体が包含される。
抗体の作製
本開示により、ＣＤ４０に特異的に結合する抗体又はその抗原結合部分を作製するための方法を提供する。
例えば、非ヒト動物を、ＣＤ４０を含む組成物で免疫処置し、次いで特異的抗体を該動物から単離する。該方法にさらに、ＣＤ４０に対する該抗体の結合を評価することを含めてもよい。
一実施形態では、本開示により、ＣＤ４０に特異的に結合する抗体を発現するハイブリドーマを作製するための方法を提供する。該方法は、以下の工程：動物を、ＣＤ４０又はその断片を含む組成物で免疫処置すること；脾細胞を該動物から単離すること；該脾細胞からハイブリドーマを作製すること；及びＣＤ４０に特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択することを含むものである。Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５，１９７５。Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｄ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８。
一実施形態では、ＣＤ４０を、マウスを腹腔内又は静脈内にて免疫処置するために使用する。１回以上の追加免疫を行なってよく、行なわなくてもよい。血漿中の抗体の力価が、例えば、ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベントアッセイ）又はフローサイトメトリーによってモニタリングされ得る。充分な抗ＣＤ４０抗体力価を有するマウスが融合に使用される。マウスに、致死させ脾臓を取り出す３日前に抗原で追加免疫してもよく、しなくてもよい。マウスの脾細胞を単離し、ＰＥＧを用いてマウス骨髄腫細胞株と融合させる。次いで、得られたハイブリドーマを抗原特異的抗体の産生についてスクリーニングする。細胞をプレーティングし、次いで選択培地中でインキュベートする。次いで、個々のウェルからの上清みをＥＬＩＳＡにより、ヒト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体についてスクリーニングする。抗体分泌ハイブリドーマを再度プレーティングし、再度スクリーニングし、依然として抗ＣＤ４０モノクローナル抗体について陽性である場合、限界希釈によってサブクローニングされ得る。
ＣＤ４０の免疫原性を高めるために使用され得るアジュバントとしては、ペプチド又はペプチドの組合せに対する免疫応答を高める作用をする任意の薬剤（１種類又は複数種）が挙げられる。アジュバントの非限定的な例としては、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ＭＦ５９（４．３％ｗ／ｖのスクアレン，０．５％ｗ／ｖのポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ ８０），０．５％ｗ／ｖのソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ ８５））、ＣｐＧ含有核酸、ＱＳ２１（サポニンアジュバント）、ＭＰＬ（モノホスホリルリピドＡ）、３ＤＭＰＬ（３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ）、Ａｑｕｉｌｌａエキス、ＩＳＣＯＭＳ（例えば、Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌ．６４：７１３；国際公開第９０／０３１８４号；国際公開第９６／１１７１１号；国際公開第００／４８６３０号；国際公開第９８／３６７７２号；国際公開第００／４１７２０号；国際公開第０６／１３４４２３号及び国際公開第０７／０２６１９０号参照）、ＬＴ／ＣＴ変異型、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）マイクロ粒子、Ｑｕｉｌ Ａ、インターロイキン、フロイント、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ １１６３７，ノル−ＭＤＰと称される）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ｄｉｐ−アルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ １９８３５Ａ， ＭＴＰ−ＰＥと称される）、並びにＲＩＢＩ（これは、細菌から抽出された３種類の成分、モノホスホリルリピドＡ、トレハロースジミコール酸及び細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）が２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ ８０乳剤中に含有されたものである）が挙げられる。
免疫処置される動物は、免疫原を投与すると回収可能な抗体が生成し得る任意の動物、限定されないが、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、ヤギ、ウマ、サル、ヒヒ及びヒトなどであり得る。一態様では、宿主はトランスジェニックであってヒト抗体を生成するもの、例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子のセグメントを発現するマウスである。米国特許第８，２３６，３１１号；同第７，６２５，５５９号及び同第５，７７０，４２９号（これらの各々の開示内容は引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）。Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６８（６４７４）：８５６−８５９，１９９４。Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １１３：４９−１０１，１９９４。Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ，Ｄ．，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３：６５−９３，１９９５。Ｈａｒｄｉｎｇ，Ｆ．ａｎｄ Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７６４：５３６−５４６，１９９５。
本発明の抗体又はその一部分は、所望の抗体の軽鎖及び重鎖（又はその一部分）をコードしているＤＮＡで形質転換した宿主細胞によって作製することができる。該抗体（又はその一部分）は、このような培養上清み及び／又は細胞から標準的な手法を用いて単離及び精製することができる。例えば、宿主細胞は、抗体の軽鎖、重鎖又は両方をコードしているＤＮＡで形質転換され得る。また、組換えＤＮＡ技術を使用し、軽鎖及び重鎖のいずれか又は両方の少なくとも一部分をコードしているＤＮＡの結合に必要でない一部分又は全部、例えば定常領域を除去してもよい。
また、本発明は、ＣＤ４０に特異的に結合する少なくとも１種類の本発明の抗体又はその抗原結合部分をコードしている核酸又はポリヌクレオチドも包含している。該核酸を細胞内で発現させ、本発明の抗体又はその抗原結合部分を産生させてもよい。本開示の単離された核酸又はポリヌクレオチドは、配列番号：１１〜２９のいずれかと少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、約７０％、約７５％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は約１００％同一のペプチドをコードしている少なくとも１つの配列を含むものである。
本発明ではまた、配列番号：１１〜２９のいずれかと少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、約７０％、約７５％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は約１００％同一のペプチドをコードしている少なくとも１種類の核酸又はポリヌクレオチドを含む発現ベクターを取り上げて記載する。
また、本発明の抗体又はその抗原結合部分の機能的に活性なバリアントをコードしている核酸分子も本開示に包含される。このような核酸分子は、本発明の任意の抗体又はその抗原結合部分をコードしている核酸と、中ストリンジェンシー、高ストリンジェンシー又は超高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし得る。ハイブリダイゼーション反応を行なうための手引きは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．６．３．１−６．３．６，１９８９（これは引用により本明細書に組み込まれる）を見るとよい。本明細書でいう特異的ハイブリダイゼーション条件は以下のとおり：（１）中ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件：約４５℃で６×ＳＳＣの後、０．２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ中で６０℃にて１回以上の洗浄；（２）高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件：約４５℃で６×ＳＳＣの後、０．２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ中で６５℃にて１回以上の洗浄；及び（３）超高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件：６５℃で０．５Ｍリン酸ナトリウム，７％ＳＤＳの後、０．２×ＳＳＣ，１％ＳＤＳで６５℃にて１回以上の洗浄である。
本発明の抗体又はその抗原結合部分をコードしている核酸又はポリヌクレオチドは、適切な発現系内で発現され得る発現ベクター内に導入され、その後、発現された抗体又はその抗原結合部分の単離又は精製が行なわれ得る。本発明の抗体又はその抗原結合部分をコードしている核酸を無細胞翻訳系内で翻訳させてもよい。米国特許第４，８１６，５６７号。Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、８６：１００２９−１００３３（１９８９）。
本発明の核酸は種々の適切な細胞内で、例えば、原核生物細胞及び真核生物細胞、例えば、細菌細胞，（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞及び哺乳動物細胞内で発現させることができる。いくつかの哺乳動物細胞株が当該技術分野で知られており、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な不死化細胞株が挙げられる。該細胞の非限定的な例としては、哺乳動物起源又は哺乳動物様の特徴のあらゆる細胞株、例えば限定されないが、サル腎臓細胞（ＣＯＳ、例えば、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７）、ＨＥＫ２９３、乳児ハムスター腎臓（ＢＨＫ、例えば、ＢＨＫ２１）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＮＳ０、ＰｅｒＣ６、ＢＳＣ−１、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、ＳＰ２／０、ＨｅＬａ、マディン・ダービーウシ腎臓（ＭＤＢＫ）、骨髄腫及びリンパ腫細胞の親細胞、誘導体及び／又は改変バリアントが挙げられる。改変バリアントとしては、例えば、グリカンプロフィール修飾型及び／又は部位特異的組込み部位誘導体が挙げられる。
また、本開示により、本明細書に記載の核酸を含む細胞を提供する。該細胞はハイブリドーマであってもトランスフェクタントであってもよい。本発明の抗体又はその抗原結合部分は種々の細胞内で発現させることができる。該細胞の型は本明細書において論考している。
例えばヒト化抗体又はその抗原結合部分を作製するために組換え手法を使用する場合、該抗体又はその一部分は、細胞内で、細胞周辺腔内で、又は培地中に直接分泌させて生成させ得る。抗体を細胞内で産生させる場合、第１工程として、細胞が、タンパク質を放出させるために破壊され得る。宿主細胞又は溶解断片のいずれかである粒状残屑は、例えば遠心分離又は限外濾過によって除去され得る。Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３−１６７には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の細胞周辺腔に分泌された抗体を単離するための手順が記載されている。簡単には、細胞ペーストを酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ及びフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分間にわたって解凍する。細胞残屑は遠心分離によって除去され得る。抗体を培地中に分泌させる場合では、かかる発現系の上清みがまず、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、Ａｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを用いて濃縮され得る。宿主細胞から抗体を単離するためには、さまざまな方法が使用され得る。
細胞で調製された抗体又はその一部分は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製され得、アフィニティークロマトグラフィーは典型的な精製手法である。親和性リガンドとしてのプロテインＡの好適性は、抗体に存在させる免疫グロブリンＦｃドメイン（あれば）の種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２又はγ４重鎖がベースの抗体を精製するために使用され得る（例えば、Ｌｉｎｄｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．，１９８３ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３参照）。プロテインＧは、すべてのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨される（例えば、Ｇｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６ ＥＭＢＯ Ｊ．５：１５６７−１５７５参照）。親和性リガンドを結合させるマトリックスは、たいていはアガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。機械的に安定なマトリックス、例えば細孔制御ガラス又はポリ（スチレンジビニル）ベンゼンでは、アガロースで得られ得るものより速い流速及び短い加工処理時間が可能である。抗体がＣＨ３ドメインを含むものである場合は、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ．ＴＭ．樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）が精製に有用である。また、回収対象の抗体に応じて、タンパク質精製のための他の手法、例えば、イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンセファロース．ＴＭ．でのクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂（例えば、ポリアスパラギン酸カラム）でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫酸アルミニウム沈殿も利用可能である。
（１回又は複数の）予備精製工程（あれば）後、目的の抗体及び夾雑物を含む混合物は、約２．５〜４．５のｐＨの溶出バッファーが使用され、典型的には低塩濃度（例えば、約０〜０．２５Ｍの塩）で行なわれる低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーに供され得る。
ハイブリドーマ又は好ましくは高い親和性でＣＤ４０に結合する抗体を産生する他の細胞は次いでサブクローニングされ、さらに特性評価され得る。各ハイブリドーマ又は細胞からの、親細胞の反応性を保持している（ＥＬＩＳＡにより）１つのクローンが次いで、細胞バンクの作製のため、及び抗体精製のために選択され得る。
あるいはまた、本発明の抗体又はその抗原結合部分は、当該技術分野でよく知られた固相手順によって合成され得る。Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｂｙ Ｅ．Ａｔｈｅｒｔｏｎ ａｎｄ Ｒ．Ｃ．Ｓｈｅｐｐａｒｄ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ＩＲＬ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）。Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３５：Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（ｅｄ．Ｍ．Ｗ．Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｂ．Ｍ．Ｄｕｎｎ），ｃｈａｐｔｅｒ ７．Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ（１９８４）。Ｇ．Ｂａｒａｎｙ ａｎｄ Ｒ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｉｔｏｒｓ Ｅ．Ｇｒｏｓｓ ａｎｄ Ｊ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｖｏｌ．１ ａｎｄ Ｖｏｌ．２，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８０），ｐｐ．３−２５４。Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｋｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ（１９８４）。
２Ｃ１０によって認識されるＣＤ４０エピトープに対するさらなる抗体（例えば、モノクローナル、ポリクローナル、多重特異性又は単一特異性抗体）は、例えば、抗体作製のための適切な方法を用いて作製することができる。一例では、２Ｃ１０抗体によって認識されるエピトープのコード配列を、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）とのＣ末端融合体として発現させる（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０，１９８８）。この融合タンパク質は、グルタチオン−セファロースビーズで精製され、グルタチオンを用いて溶出され、トロンビンを用いて（改変切断部位で）切断され、ウサギの免疫処置のために精製される。一次免疫処置は完全フロイントアジュバントを用いて、その後の免疫処置は不完全フロイントアジュバントを用いて行なわれる。抗体力価は、ウエスタンブロット及び免疫沈降解析（ＧＳＴ融合タンパク質のトロンビン切断タンパク質断片を使用）によってモニタリングされる。免疫血清は、ＣＮＢｒ−セファロース結合タンパク質を用いてアフィニティー精製される。抗血清の特異性は、一群の無関連ＧＳＴタンパク質を用いて測定され得る。
ＧＳＴ融合タンパク質の代替又は補助免疫原として、本発明のポリペプチドの比較的固有の免疫原性領域に相当するペプチドを作製し、スカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）に、導入したＣ末端リシンを介してカップリングさせてもよい。このようなペプチドの各々に対する抗血清は、ＢＳＡにコンジュゲートさせたペプチドで同様にアフィニティー精製され、特異性が、ＥＬＩＳＡもしくはウエスタンブロット解析（ペプチドコンジュゲートを使用）又はウエスタンブロットもしくは免疫沈降（ＧＳＴ融合タンパク質として発現させたポリペプチドを使用）によって試験される。
あるいはまた、２Ｃ１０抗体によって認識されるＣＤ４０エピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体を、標準的なハイブリドーマ技術を用いて調製してもよい（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−７，１９７５；Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−９，１９７６；Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２９２−５，１９７６；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ＮＹ，１９８１参照）。作製されたら、モノクローナル抗体も同様に、特異的認識についてウエスタンブロット又は免疫沈降解析によって試験され得る。あるいはまた、モノクローナル抗体は、上記の本発明のポリペプチド及びファージディスプレイライブラリーを用いて調製され得る（Ｖａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：３０９−１４，１９９６）。
エピトープ断片を標準的な手法により、例えば、ＰＣＲ及びｐＧＥＸ発現ベクター内への断片のクローニングを用いて作製してもよい。融合タンパク質を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で発現させ、グルタチオンアガロースアフィニティーマトリックスを用いて精製する。抗血清の低い親和性又は特異性が問題となる可能性を最小限にするため、各タンパク質について２種類又は３種類のかかる融合体を作製し、各融合体を少なくとも２匹のウサギに注射する。一連の注射によって抗血清が生じ、例えば、少なくとも３回の追加免疫注射が含められ得る。
ポリクローナル抗体を大規模に低コストで作製するためには、適切な動物種が選択され得る。ポリクローナル抗体は、例えば、免疫処置したウシの乳汁又は初乳から単離され得る。ウシの初乳には１リットルあたり２８ｇのＩｇＧが含有されており、一方、ウシの乳汁には１リットルあたり１．５ｇのＩｇＧが含有されている（Ｏｎｔｓｏｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．８６：２００５−１１，２００３）。また、ポリクローナル抗体は、免疫処置したニワトリの卵の卵黄からから単離することもできる（Ｓａｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｎｕｔｒ．３２：１９−２５，２００１）。
アッセイ
目的の抗原に対する特異性を確認するため、及び／又は特性を試験するために該抗体又はその抗原結合部分をアッセイするのに、種々の方法が使用され得る。かかるアッセイの実施方法の一例は、米国特許出願公開第２００４／０１２６８２９号に記載の血清スクリーニングアッセイである。抗ＣＤ４０抗体は、ＣＤ４０に対する結合について既知のさまざまな手法によって特性評価され得る。例えば、ＥＬＩＳＡでは、マイクロタイタープレートをＣＤ４０又はＣＤ４０断片（ＰＢＳ中）でコーティングし、次いで、無関連タンパク質、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ＰＢＳで希釈）を用いてブロックする。ＣＤ４０で免疫処置したマウス由来の血漿の希釈液（又は抗ＣＤ４０抗体を含有する溶液）を各ウェルに添加し、インキュベートする。プレートを洗浄し、次いで、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ）にコンジュゲートさせた二次抗体とともにインキュベートする。洗浄後、プレートで該酵素の基質（例えば、ＡＢＴＳ）を用いて発色させ、特定のＯＤで解析する。他の実施形態では、選択されたモノクローナル抗体が独自のエピトープに結合するかどうかを調べるため、該抗体がビオチン化され得、次いで、これが、ストレプトアビジン標識プローブを用いて検出され得る。抗ＣＤ４０抗体を、ＣＤ４０との反応性についてウエスタンブロッティングによって試験してもよい。
また、本開示の抗体又はその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体は、抗原に対する結合親和性に関して説明又は明記され得る。抗原に対する抗体の親和性は、任意の適切な方法を用いて実験により測定され得る（例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｎｔｉｇｅｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，”Ｉｎ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９８４）；Ｋｕｂｙ，Ｊａｎｉｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９２）；及び本明細書に記載の方法参照）。特定の抗体−抗原相互作用の親和性の測定値は、異なる条件（例えば、塩濃度、ｐＨ）下で測定した場合、異なる場合があり得る。したがって、親和性及び他の抗原結合パラメータ（例えば、ＫＤ、Ｋａ、Ｋｄ）の測定は好ましくは、抗体及び抗原の標準化溶液並びに標準化バッファーを用いて行なわれる。
本発明の抗体又はその抗原結合部分はＣＤ４０に、約１０−７Ｍ未満、約１０−８Ｍ未満、約１０−９Ｍ未満、約１０−１０Ｍ未満、約１０−１１Ｍ未満、約１０−１２Ｍ未満、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−８Ｍ〜約１０−１１Ｍ、約１０−９Ｍ〜約１０−１０Ｍ又は約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍの解離定数（ＫＤ）で特異的に結合するものである。
また、抗体（又はその断片）がＣＤ１５４に対するＣＤ４０の結合をブロックする能力、又はＣＤ４０媒介性応答を阻害もしくは低減させる能力を試験するためのアッセイを使用してもよい。
本明細書で用いる場合、用語「結合を阻害する」及び「結合をブロックする」（例えば、ＣＤ４０に対するＣＤ１５４の結合の阻害／ブロック）は互換的に用いており、一部阻害／ブロックと完全な阻害／ブロックの両方を包含している。また、阻害及びブロックは、本明細書に開示の抗ＣＤ４０抗体又はその一部分と接触している場合の、抗ＣＤ４０抗体と接触していないリガンドと比べたときの、ＣＤ４０に対するＣＤ１５４の結合の任意の測定可能な低減、例えば、ＣＤ４０に対するＣＤ１５４の少なくとも約１０％，２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％のブロックを包含していることも意図する。
一実施形態では、Ｂ細胞の活性化又はその阻害は、ＣＤ２３、ＣＤ８０、ＣＤ８６及びＣＤ２０＋細胞上の任意のさらなる適切なマーカーから選択される１種類以上のマーカーの発現を測定することにより測定され得る。
本発明の抗体又はその断片は、Ｔ細胞媒介性抗体応答に対する効果を特徴とするものであり得る。例えば、該抗体又はその断片は、該抗体又はその抗原結合部分を哺乳動物に約１ｍｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約２ｍｇ／ｋｇ体重〜約４０ｍｇ／ｋｇ体重、約３ｍｇ／ｋｇ体重〜約３０ｍｇ／ｋｇ体重、約５ｍｇ／ｋｇ体重〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重、約８ｍｇ／ｋｇ体重〜約１３ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の投薬量、約１ｍｇ／ｋｇ体重、約２ｍｇ／ｋｇ体重、約５ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１５ｍｇ／ｋｇ体重、約２０ｍｇ／ｋｇ体重、約２５ｍｇ／ｋｇ体重、約３０ｍｇ／ｋｇ体重、約３５ｍｇ／ｋｇ体重、約４０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約６０ｍｇ／ｋｇ体重、約７０ｍｇ／ｋｇ体重又は約８０ｍｇ／ｋｇ体重で投与した場合、該哺乳動物におけるＩｇＭ及び／又はＩｇＧの産生を阻害し得るものである。
本発明の抗体又はその断片は、移植後の移植片の生着の長期化に対する効果を特徴とするものであり得る。本発明の抗体又はその断片は、単独又は１種類以上の他の免疫抑制薬との組合せで、移植片の生着を約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約２倍、約５倍、約１０倍、約１５倍、約２０倍、約２５倍、約３０倍、約３５倍、約４０倍、約４５倍、約５０倍、約５５倍、約４０％超、約５０％超、約６０％超、約７０％超、約８０％超又は約９０％超、約２倍超、約５倍超、約１０倍超、約２０倍超、約３０倍超又は約４０倍超、長期化させ得るものである。例えば、本発明の抗体又はその断片は膵島同種移植片の生着を長期化させ得るものである。
一部の特定の実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合断片は：ａ）ＣＤ１５４に対するＣＤ４０の結合をブロックし得るものである；ｃ）抗原提示細胞（例えば、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージなど）の活性化をブロックし得るものである；ｄ）Ｂ細胞の枯渇を誘導するものであってもそうでなくてもよい；ｅ）抗原提示細胞からのサイトカイン放出を阻害もしくは低減するものであってもそうでなくてもよい；ｆ）腫瘍細胞のアポトーシスを誘導するものであってもそうでなくてもよい；ｇ）腫瘍細胞の増殖を阻害するものであってもそうでなくてもよい；ｈ）腫瘍細胞を死滅させるものであってもそうでなくてもよい；ｉ）抗腫瘍Ｔ細胞応答を刺激するものであってもそうでなくてもよい；及び／又はｊ）確立された腫瘍を縮小させるものであってもそうでなくてもよい。本明細書に記載の抗体は、これらの属性又は活性の任意の１つ以上の組合せを有するもの、又は誘導するものであり得る。Ｔａｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００５，１；６５（１３）：５８９８−９０６；Ｌｕｑｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １１２：７１１−７２０，２００８。また、本明細書に記載の抗体又はその一部分は、ＣＤ４０インターナリゼーション、インビトロ及びインビボでの有効性などに対する効果について試験され得る。かかるアッセイは、当業者に知られた充分に確立されたプロトコル（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．Ｉｎｃ．＆ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ：Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａｄａ Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄａｖｉｄ Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅｔｈａｎ Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗａｒｒｅｎ Ｓｔｒｏｂｅｒ ２００１ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．）参照；又は市販のキットを用いて行なわれ得る。
処置対象の病状
本発明の抗体又はその抗原結合部分は、インビトロ及びインビボで治療的、予防的及び／又は診断的な有用性を有する。例えば、細胞を培養培地中でインビトロで培養し、抗ＣＤ４０抗体又はその断片と接触させることができる。該抗体又はその抗原結合部分は被験体において、インビボ（例えば、治療的又は予防的な）プロトコルの一部として投与され得る。インビボでの実施形態では、接触工程は被験体内で行なわれ、抗ＣＤ４０抗体又はその一部分を被験体に、該被験体において該抗体又はその一部分がＣＤ４０に結合することを可能にするのに有効な条件下で投与することを含む。該抗体又はその抗原結合部分は、移植拒絶反応の尤度を下げるか、又は移植拒絶反応までの持続時間を長くし、免疫抑制を誘導するため、又は自己免疫性障害を処置するために投与され得る。
本明細書に記載の抗体又は抗体断片は、免疫抑制が所望される任意の状況（例えば、移植拒絶反応又は自己免疫性障害）において使用され得る。このような抗体は、移植拒絶反応の処置、例えば、宿主が特定の移植に拒絶反応を示す尤度の低下又は拒絶反応が起こるまでの時間の長期化に特に有用である。本明細書に記載の抗体又は抗体断片は、移植に適した任意の臓器又は任意の組織の移植とともに使用され得る。非限定的で例示的な臓器としては心臓、腎臓、肺、肝臓、膵臓、腸及び胸腺が挙げられ；非限定的で例示的な組織としては骨、腱、角膜、皮膚、心臓の弁、静脈及び骨髄が挙げられる。また、該抗体及び抗体断片は自己免疫性障害を処置するためにも使用され得る。一実施形態では、自己免疫性障害は、自己抗体の存在と関連しているもの、自己抗体の存在によって引き起こされるものであり得る。本発明の抗体又はその断片で処置され得る自己免疫疾患としては、限定されないが、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ＣＲＥＳＴ症候群（石灰沈着症、レイノー症候群、食道運動障害、強指症及び毛細血管拡張症）、オプソクローヌス、炎症性ミオパチー（例えば、多発性筋炎、皮膚筋炎及び封入体筋炎）、全身性強皮症、原発性胆汁性肝硬変、セリアック病（例えば、グルテン過敏性腸疾患）、疱疹状皮膚炎、ミラー・フィッシャー症候群、急性運動性軸索型ニューロパチー（ＡＭＡＮ）、伝導ブロックを伴う多巣性運動ニューロパチー、自己免疫性肝炎、抗リン脂質抗体症候群、ウェゲナー肉芽腫症、顕微鏡的多発血管炎、チャーグ・ストラウス症候群、関節リウマチ、慢性自己免疫性肝炎、硬化性筋炎、重症筋無力症、ランバート・イートン筋無力症候群、橋本甲状腺炎、グレーブス病、傍腫瘍性小脳変性症、スティッフパーソン症候群、辺縁系脳炎、アイザックス症候群、シデナム舞踏病、小児自己免疫性溶連菌関連性精神神経疾患（ＰＡＮＤＡＳ）、脳炎、１型真性糖尿病並びに視神経脊髄炎が挙げられる。他の自己免疫性障害としては、悪性貧血、アジソン病、乾癬、炎症性腸疾患、乾癬性関節炎、シェーグレン症候群、紅斑性狼瘡（例えば、円板状紅斑性狼瘡、薬物誘発性紅斑性狼瘡及び新生児紅斑性狼瘡）、多発性硬化症並びに反応性関節炎が挙げられる。
本開示の方法を用いて処置され得るさらなる障害としては、例えば、多発性筋炎、皮膚筋炎、多発性内分泌腺不全、シュミット症候群、自己免疫性ブドウ膜炎、副腎炎、甲状腺炎、自己免疫性甲状腺疾患、胃萎縮、慢性肝炎、ルポイド肝炎、アテローム性動脈硬化症、初老期認知症、脱髄疾患、亜急性皮膚紅斑性狼瘡、副甲状腺機能低下症、ドレスラー症候群、自己免疫性血小板減少症、特発性血小板減少性紫斑病、溶血性貧血、尋常性天疱瘡、天疱瘡、円形脱毛症、類天疱瘡、強皮症、全身性進行性硬化症、成人発症型真性糖尿病（例えば、ＩＩ型糖尿病）、男性及び女性の自己免疫性不妊症、強直性脊椎関節炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、混合結合組織病、結節性多発性動脈炎、全身性壊死性血管炎、若年発症型関節リウマチ、糸球体腎炎、アトピー性皮膚炎、アトピー性鼻炎、グッドパスチャー症候群、シャーガス病、サルコイドーシス、リウマチ熱、喘息、反復流産、抗リン脂質抗体症候群、農夫肺、多形性紅斑、開心後症候群、クッシング症候群、自己免疫性慢性活動性肝炎、鳥飼病、アレルギー性疾患、アレルギー性脳脊髄炎、中毒性表皮壊死症、脱毛症、アルポート症候群、肺胞炎、アレルギー性肺胞炎、線維化性肺胞炎、間質性肺疾患、結節性紅斑、壊疽性膿皮症、輸血副作用、ハンセン病、マラリア、リーシュマニア症、トリパノソーマ症、高安動脈炎、リウマチ性多発性筋痛、側頭動脈炎、住血吸虫症、巨細胞性動脈炎、回虫症、アスペルギルス症、サンプター症候群、湿疹、リンパ腫様肉芽腫症、ベーチェット病、カプラン症候群、川崎病、デング熱、心内膜炎、心内膜心筋線維症、眼内炎、持久性隆起性紅斑、胎児赤芽球症、好酸球性筋膜炎、シュルマン症候群、フェルティ症候群、フィラリア症、毛様体炎、慢性毛様体炎、異時性毛様体炎、フックス毛様体炎、ＩｇＡ腎症、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、移植片対宿主病、移植拒絶反応、ヒト免疫不全ウイルス感染、エコーウイルス感染、心筋症、アルツハイマー病、パルボウイルス感染、風疹ウイルス感染、ワクチン接種後症候群、先天性風疹感染、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫、腎細胞癌、多発性骨髄腫、イートン・ランバート症候群、再発性多発性軟骨炎、悪性黒色腫、クリオグロブリン血症、ワルデンストレームマクログロブリン血症、エプスタイン−バーウイルス感染、おたふく風邪、エヴァンズ症候群、並びに自己免疫性腺機能不全が挙げられる。
別の実施形態では、本発明の抗体又はその断片は、ＣＤ４０の発現と関連している種々の障害の処置において使用され得る。
障害は、本発明の抗体又はその断片での処置の恩恵を被り得る任意の病状であり得る。これには慢性及び急性の障害又は疾患が包含され、哺乳動物の対象障害の素因をもたらす病理学的状態も包含される。本明細書における処置対象の障害の非限定的な例としては、自己免疫疾患、免疫学的障害、炎症性障害、癌、血液悪性腫瘍、良性及び悪性の腫瘍、白血病、リンパ系の悪性腫瘍、並びに血管系の障害が挙げられる。
本明細書で用いる場合、用語「ＣＤ４０関連障害」又は「ＣＤ４０関連疾患」は、ＣＤ４０発現細胞の修飾又は消失が示される病状をいう。このようなものは、異常な増殖を示すＣＤ４０発現細胞又は癌性もしくは悪性の増殖と関連しているＣＤ４０発現細胞を含むものである。ＣＤ４０関連障害としては、限定されないが、免疫機構の疾患及び障害、例えば、自己免疫性障害及び炎症性障害が挙げられる。かかる病状としては、限定されないが、関節リウマチ（ＲＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、強皮症、シェーグレン症候群、多発性硬化症、乾癬、炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎及びクローン病）、肺の炎症、喘息、及び特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）が挙げられる。ＣＤ４０抗原の異常な発現を示す癌のより具体的な例としては、Ｂリンパ芽球様細胞、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、Ｔ細胞リンパ腫、カポジ肉腫、骨肉腫、上皮及び内皮の腫瘍、膵臓、肺、乳房、卵巣、結腸、前立腺、頭頸部、皮膚（黒色腫）、膀胱及び腎臓の癌が挙げられる。また、かかる障害としては、限定されないが、白血病、リンパ腫、例えばＢ細胞リンパ腫及び非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症；充実性腫瘍、例えば肉腫、例えば、骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性黒色腫、腺癌、例えば、卵巣腺癌、カポジ肉腫／カポジ腫瘍及び扁平上皮癌も挙げられる。米国特許第９，０９０，６９６号。
また、本発明の抗体又はその断片によって処置又は予防され得るＣＤ４０発現癌としては、例えば、白血病、例えば、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病（例えば、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性もしくは赤白血病）、慢性白血病、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病もしくは慢性リンパ性白血病；真性赤血球増加症；リンパ腫（例えば、ホジキン疾患もしくは非ホジキン疾患）；多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症；重鎖病；充実性腫瘍、肉腫及び癌など（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫（ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、結腸直腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝臓癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、子宮癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、鼻咽腔癌又は食道癌）も挙げられる。
また、Ｂリンパ球（例えば、全身性エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、関節リウマチ及びＩ型糖尿病）、Ｔｈ１−リンパ球（例えば、関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、グレーブス病、原発性胆汁性肝硬変、ウェゲナー肉芽腫症、結核もしくは移植片対宿主病）、又はＴｈ２−リンパ球（例えば、アトピー性皮膚炎、全身性エリテマトーデス、アトピー性喘息、鼻炎結膜炎、アレルギー性鼻炎、オーメン症候群、全身性硬化症もしくは慢性移植片対宿主病）の障害を処置する方法も包含される。
いくつかの実施形態では、免疫学的障害はＴ細胞媒介性免疫学的障害、例えば、障害と関連している活性化Ｔ細胞がＣＤ４０を発現しているＴ細胞障害である。抗ＣＤ４０抗体又は薬剤は、かかるＣＤ４０発現活性化Ｔ細胞を枯渇させるために投与され得る。特定の一実施形態では、抗ＣＤ４０抗体又は薬剤の投与によりＣＤ４０発現活性化Ｔ細胞は枯渇され得るが、休止Ｔ細胞は抗ＣＤ４０又は薬剤によって実質的に枯渇されない。この状況において、「実質的に枯渇されない」とは、休止Ｔ細胞の約６０％未満、又は約７０％未満又は約８０％未満が枯渇されないことを意味する。
併用療法
本発明の抗体又はその抗原結合部分は単独で、又は１種類以上の他の治療用薬剤（例えば、第２の治療用薬剤）と併用して投与され得る。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ４０抗体又はその断片を含む医薬組成物はさらに、該抗体又はその断片とコンジュゲートされた状態又はコンジュゲートされていない状態のいずれかである第２の治療用薬剤を含むものであり得る。一実施形態では、該第２の薬剤は別のモノクローナルもしくはポリクローナル抗体又はその抗原結合部分である。別の実施形態では、該第２の薬剤は免疫抑制薬である。第３の実施形態では、該第２の薬剤は細胞毒性剤又は細胞増殖抑制性剤である。第４の実施形態では、該第２の薬剤は、活性化リンパ球、樹状細胞又はＣＤ４０発現癌細胞の表面上のＣＤ４０以外の受容体又は受容体複合体を標的化し得るものであり得る。
かかる併用療法は、病状パラメータ（例えば、症状の重症度、症状の数又は再発頻度）に対して相加効果又は相乗効果を有し得る。
本発明の抗ＣＤ４０抗体又はその断片は第２の治療用薬剤と並行して投与され得る。別の特定の実施形態では、第２の治療用薬剤は、抗ＣＤ４０抗体又はその断片の投与の前又は後に投与される。
本明細書に記載の抗体及び抗体断片を免疫抑制薬との組合せで製剤化又は投与してもよい。免疫抑制薬の例としては、限定されないが、カルシニューリン阻害薬（例えば、シクロスポリンＡ（Ｓａｎｄｉｍｍｕｎｅ（登録商標））、シクロスポリンＧ タクロリムス（Ｐｒｏｇｒａｆ（登録商標）、Ｐｒｏｔｏｐｉｃ（登録商標）））、ｍＴｏｒ阻害薬（例えば、シロリムス（Ｒａｐａｍｕｎｅ（登録商標）、Ｎｅｏｒａｌ（登録商標））、テムシロリムス（Ｔｏｒｉｓｅｌ（登録商標））、ゾタロリムス及びエベロリムス（Ｃｅｒｔｉｃａｎ（登録商標）））、フィンゴリモド（Ｇｉｌｅｎｙａ（商標））、マイリオシン、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標）、ＭａｂＣａｍｐａｔｈ（登録商標）、Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ（登録商標））、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）、ＭａｂＴｈｅｒａ（登録商標））、抗ＣＤ４モノクローナル抗体（例えば、ＨｕＭａｘ−ＣＤ４）、抗ＬＦＡ１モノクローナル抗体（例えば、ＣＤ１１ａ）、抗ＬＦＡ３モノクローナル抗体、抗ＣＤ４５抗体（例えば、抗ＣＤ４５ＲＢ抗体）、抗ＣＤ１９抗体（例えば、米国特許公開公報第２００６／０２８０７３８号参照）、モナバタセプト（Ｏｒｅｎｃｉａ（登録商標））、ベラタセプト、インドリル−ＡＳＣ（タクロリムス及びアスコマイシンの３２−インドールエーテル誘導体）、アザチオプリン（Ａｚａｓａｎ（登録商標）、Ｉｍｕｒａｎ（登録商標））、リンパ球免疫グロブリン及び抗胸腺細胞グロブリン［ウマ］（Ａｔｇａｍ（登録商標））、ミコフェノール酸モフェチル（Ｃｅｌｌｃｅｐｔ（登録商標））、ミコフェノール酸ナトリウム（ｍｙｆｏｒｔｉｃ（登録商標））、ダクリズマブ（Ｚｅｎａｐａｘ（登録商標））、バシリキシマブ（Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（登録商標））、シクロホスファミド（Ｅｎｄｏｘａｎ（登録商標）、Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）、Ｎｅｏｓａｒ（商標）、Ｐｒｏｃｙｔｏｘ（商標）、Ｒｅｖｉｍｍｕｎｅ（商標））、プレドニゾン、プレドニゾロン、レフルノミド（Ａｒａｖａ（登録商標））、ＦＫ７７８、ＦＫ７７９、１５−デオキシスペルグアリン（ＤＳＧ）、ブスルファン（Ｍｙｌｅｒａｎ（登録商標）、Ｂｕｓｕｌｆｅｘ（登録商標））、フルダラビン（Ｆｌｕｄａｒａ（登録商標））、メトトレキサート（Ｒｈｅｕｍａｔｒｅｘ（登録商標）、Ｔｒｅｘａｌｌ（登録商標））、エタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））、アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（登録商標））、６−メルカプトプリン（Ｐｕｒｉｎｅｔｈｏｌ（登録商標））、１５−デオキシスペルグアリン（Ｇｕｓｐｅｒｉｍｕｓ）、ＬＦ１５−０１９５、ブレディニン、ブレキナール、並びにムロモナブ−ＣＤ３（Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ（登録商標））が挙げられる。
薬剤の免疫抑制活性を評価するための方法は当該技術分野で知られている。例えば、薬理学的介入あり及びなしでの移植臓器のインビボでの生存期間の長さが、免疫応答の抑制の定量的尺度として使用される。また、インビトロアッセイ、例えば、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイ（例えば、Ｆａｔｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１８：１２３２−８，１９７７参照）；ＣＤ３アッセイ（抗ＣＤ３抗体（例えば、ＯＫＴ３）による免疫細胞の特異的活性化）（例えば、Ｋｈａｎｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６７：８８２−９，１９９９；Ｋｈａｎｎａ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６７：Ｓ５８参照）；及びＩＬ−２Ｒアッセイ（外来的に添加されたサイトカインＩＬ−２による免疫細胞の特異的活性化）（例えば、Ｆａｒｒａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２６：１１２０−５，１９８１参照）も使用され得る。
シクロスポリンＡ（ＣｓＡ；ＣＡＳ番号５９８６５−１３−３；米国特許第３，７３７，４３３号）及びそのアナログは免疫抑制薬として使用され得る。免疫抑制活性を示すいくつかの他のシクロスポリン並びにその誘導体及びアナログも知られている。シクロスポリン及びその製剤は、例えば、２００４ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（登録商標）（２００３）Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，５８ｔｈ ｅｄ．並びに米国特許第５，７６６，６２９号；同第５，８２７，８２２号；同第４，２２０，６４１号；同第４，６３９，４３４号；同第４，２８９，８５１号；同第４，３８４，９９６号；同第５，０４７，３９６号；同第４，３８８，３０７号；同第４，９７０，０７６号；同第４，９９０，３３７号；同第４，８２２，６１８号；同第４，５７６，２８４号；同第５，１２０，７１０号；及び同第４，８９４，２３５号に記載されている。
タクロリムス（ＦＫ５０６）は、分子レベルでの作用様式及びその臨床有効性の両方に関しておおむねＣｓＡと同様の効果を奏するマクロライドである（Ｌｉｕ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １４：２９０−５，１９９３；Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，１３：１３６−４２，１９９２）；しかしながら、このような効果は、ＣｓＡより２０〜１００倍少ない用量で示される（Ｐｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇｓ ４６：７４６−９４，１９９３）。タクロリムス及びその製剤は、例えば、２００４ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（登録商標）（２００３）Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，５８ｔｈ ｅｄ．並びに米国特許第４，８９４，３６６号；同第４，９２９，６１１号；及び同第５，１６４，４９５号に記載されている。
シロリムス（ラパマイシン）は、例えばストレプトマイセス・ハイグロスコピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）によって産生され得る免疫抑制性のラクタムマクロライドである。シロリムス及びそのアナログの数多くの誘導体並びにその製剤が知られており、例えば、２００４ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（登録商標）（２００３）Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，５８ｔｈ ｅｄ．、欧州特許第０４６７６０６号；国際公開第９４／０２１３６号、同第９４／０９０１０号、同第９２／０５１７９号、同第９３／１１１３０号、同第９４／０２３８５号、同第９５／１４０２３号及び同第９４／０２１３６号並びに米国特許第５，０２３，２６２号；同第５，１２０，７２５号；同第５，１２０，７２７号；同第５，１７７，２０３号；同第５，２５８，３８９号；同第５，１１８，６７７号；同第５，１１８，６７８号；同第５，１００，８８３号；同第５，１５１，４１３号；同第５，１２０，８４２号；及び同第５，２５６，７９０号に記載されている。
いくつかの実施形態では、該第２の薬剤が、慣用的な化学療法薬であり得る細胞毒性剤、例えば、ドキソルビシン、パクリタキセル、メルファラン、ビンカアルカロイド、メトトレキサート、マイトマイシンＣ又はエトポシドなどである。また、強力な薬剤、例えば、ＣＣ−１０６５アナログ、カリケアミシン、マイタンシン、ドラスタチン１０のアナログ、リゾキシン、及びパリトキシンを抗ＣＤ４０抗体又はその薬剤に連結させてもよい。
さらなる実施形態では、該第２の薬剤がヒト化抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体；ＲＩＴＵＸＡＮ（リツキシマブ；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ．）；キメラ抗ＣＤ２０モノクローナル抗体）；ＯＶＡＲＥＸ（ＡｌｔａＲｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＭＡ）；ＰＡＮＯＲＥＸ（Ｇｌａｘｏ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ，ＮＣ；マウスＩｇＧ２ａ抗体）；ＥＲＢＩＴＵＸ（セツキシマブ）（Ｉｍｃｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，ＮＹ；抗ＥＧＦＲ ＩｇＧキメラ抗体）；ＶＩＴＡＸＩＮ（Ｍｅｄｌｍｍｕｎｅ，Ｉｎｃ．，ＭＤ）；ＣＡＭＰＡＴＨ Ｉ／Ｈ（Ｌｅｕｋｏｓｉｔｅ，ＭＡ；ヒト化ＩｇＧ１抗体）；Ｓｍａｒｔ ＭＩ９５（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，ＣＡ；ヒト化抗ＣＤ３３ ＩｇＧ抗体）；ＬｙｍｐｈｏＣｉｄｅ（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ，Ｉｎｃ．，ＮＪ；ヒト化抗ＣＤ２２ ＩｇＧ抗体）；Ｓｍａｒｔ ＩＤ１０（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，ＣＡ；ヒト化抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体）；Ｏｎｃｏｌｙｍ（Ｔｅｃｈｎｉｃｌｏｎｅ，Ｉｎｃ．，ＣＡ；放射性標識マウス抗ＨＬＡ−Ｄｒ１０抗体）；ＡＬＬＯＭＵＮＥ（ＢｉｏＴｒａｎｓｐｌａｎｔ，ＣＡ；ヒト化抗ＣＤ２ ｍＡｂ）；ＡＶＡＳＴＩＮ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，ＣＡ；抗ＶＥＧＦヒト化抗体）；Ｅｐｒａｔｕｚａｍａｂ（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ，Ｉｎｃ．，ＮＪ及びＡｍｇｅｎ，ＣＡ；抗ＣＤ２２抗体）；並びにＣＥＡｃｉｄｅ（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ，ＮＪ；ヒト化抗ＣＥＡ抗体）である。
該第２の薬剤として使用され得る他の好適な抗体としては、限定されないが、以下の抗原：ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、Ｌ６、ルイスＹ、ルイスＸ、αフェトプロテイン、ＣＡ ２４２、胎盤アルカリホスファターゼ、前立腺特異抗原、前立腺酸性ホスファターゼ、上皮成長因子、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、抗トランスフェリン受容体、ｐ９７、ＭＵＣ１−ＫＬＨ、ＣＥＡ、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ１、前立腺特異抗原、ＩＬ−２受容体、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＣＤ３３、ＣＤ２２、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ＣＤ３８、ムチン、Ｐ２１、ＭＰＧ、及びＮｅｕ癌遺伝子産物に対する抗体が挙げられる。
非治療的使用
本明細書に記載の抗体は親和性精製用薬剤として有用である。この方法では、該抗体又はその断片をプロテインＡ樹脂などの固相上に、当該技術分野でよく知られた方法を用いて固定化する。固定化した該抗体又はその断片を、精製対象のＣＤ４０タンパク質（又はその断片）含有試料と接触させ、その後、支持体を、ＣＤ４０タンパク質（これは固定化した抗体に結合されている）以外の試料中の実質的にすべての物質を除去する適切な溶媒で洗浄する。最後に、支持体を、該抗体からＣＤ４０タンパク質を放出させる別の適切な溶媒で洗浄する。
また、本発明の抗ＣＤ４０抗体は、ＣＤ４０タンパク質を検出及び／又は定量するための、例えば、特定の細胞、組織又は血清中におけるＣＤ４０発現を検出するための診断アッセイにも有用である。
本明細書に記載の抗体は、任意の既知のアッセイ法、例えば、競合的結合アッセイ、直接及び間接サンドイッチアッセイ、並びに免疫沈降アッセイにおいて使用され得る。例えば、Ｚｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１４７−１５８（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９８７）を参照のこと。
医薬組成物
本開示により、薬学的に許容され得る担体と一緒に製剤化された本開示の抗体又はその（１種類又は複数種の）抗原結合部分を含む組成物、例えば医薬組成物を提供する。別の実施形態では、該組成物は、本発明の抗体又はその抗原結合部分をコードしている単離核酸及び薬学的に許容され得る担体を含むものであり得る。該組成物は、移植拒絶反応の尤度を下げるため、もしくは移植拒絶反応までの持続時間を長くするため、免疫抑制を誘導するため、又は被験体の自己免疫性障害を処置するために有効であり得る。本発明の組成物は、本明細書に記載の任意の方法において有効であり得る。
薬学的に許容され得る担体としては、生理学的に適合性のある任意のあらゆる適切な溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤並びに吸収遅延剤などが挙げられる。投与経路に応じて、本発明の抗体（又はその（１又は複数の）抗原結合部分）を、該抗体（又はその（１又は複数の）抗原結合部分）を酸及び該抗体（又はその（１又は複数の）抗原結合部分）を不活化させ得る他の天然条件の作用から保護するための物質でコーティングしてもよい。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液状ポリエチレングリコールなど）、並びに適切なその混合物を含有している溶媒又は分散媒であり得る。適正な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散体の場合では必要とされる粒径の維持及び界面活性剤の使用によって維持され得る。一部の特定の実施形態では、本発明の組成物は、等張剤、例えば糖類、多価アルコール（マンニトール、ソルビトールなど）又は塩化ナトリウムを該組成物中に含むものであり得る。注射用組成物の持効性吸収は、該組成物中に吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩及びゼラチンを含めることによってもたらされ得る。
本発明の医薬組成物は本発明の抗体又はその断片及び本明細書に記載の第２の治療用薬剤（例えば、１種類以上の免疫抑制薬）を含むものであり得る。
該組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、輸注デバイスもしくは埋込み用送達デバイスの形態であり得るか、又は使用直前に水もしくは別の適切なビヒクルで再構成される固形形態（例えば、乾燥粉末）として提示され得る。該組成物は、油性乳剤、油中水型乳剤、水中油中水型乳剤、部位特異的乳剤、長時間滞留型乳剤、粘性乳剤、マイクロエマルジョン、ナノエマルジョン、リポソーム、マイクロ粒子、マイクロスフェア、ナノスフェア、ナノ粒子並びに種々の天然又は合成のポリマー、例えば非吸収性不透過性ポリマー、例えばエチレン酢酸ビニルコポリマー及びＨｙｔｒｅｌ（登録商標）コポリマー、膨潤性ポリマー、例えばヒドロゲル、又は吸収性ポリマー、例えばコラーゲン及び特定のポリ酸又はポリエステル（吸収性縫合糸を作製するために使用されるものなど）の形態であって、ワクチンの持続放出が可能な形態であり得る。
該組成物は、経口投与のためには丸剤、錠剤、カプセル剤、液状剤もしくは持続放出性錠；又は静脈内、髄腔内、皮下もしくは非経口投与のためには液状剤；又は局所投与のためにはポリマーもしくは他の持続放出性ビヒクルの形態であり得る。
一態様では、該組成物が水溶性である場合、該組成物の溶液を薬学的に許容され得る担体、例えば水性担体に溶解させる。水性液の例としては、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ハンクス液、リンゲル液、デキストロース／生理食塩水、グルコース液などが挙げられる。製剤に必要に応じて、生理学的条件に近づけるための薬学的に許容され得る補助物質、例えば、緩衝剤、張度調整剤、湿潤剤、デタージェントなどを含有させてもよい。また、添加剤としては、さらなる活性成分、例えば殺菌剤又は安定剤も挙げられ得る。例えば、該溶液は、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート又はトリエタノールアミンオレエートを含有しているものであり得る。本開示においては固形製剤も使用され得る。該製剤は、例えば、丸剤、錠剤、散剤又はカプセル剤として製剤化され得る。固形組成物には慣用的な固形担体が使用され得、該担体としては、例えば、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどが挙げられる。好適な医薬用賦形剤としては、例えば、デンプン、セルロース、タルク、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールが挙げられる。
製剤を作製するための当該技術分野でよく知られた方法は、例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ”（２０ｔｈ ｅｄ．，ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ ＡＲ．，２０００，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）を見るとよい。
一態様では、本発明の組成物又は核酸、ポリペプチドもしくは抗体を含む医薬用製剤は脂質の単層又は二重層、例えばリポソーム内に組み込まれる。米国特許第６，１１０，４９０号；同第６，０９６，７１６号；同第５，２８３，１８５号及び同第５，２７９，８３３号。また、本発明の諸態様により、本発明の水溶性の核酸、ペプチド又はポリペプチドが該単層又は二重層の表面に結合されている製剤を提供する。例えば、ペプチドはヒドラジド−ＰＥＧ−（ジステアロイルホスファチジル）エタノールアミン含有リポソーム（例えば、Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．６：７０５−７０８，１９９５参照）に結合され得る。リポソーム又は任意の形態の脂質膜、例えば、平面脂質膜又はインタクトな細胞、例えば赤血球の細胞膜が使用され得る。リポソーム製剤は、任意の手段、例えば静脈内投与、経皮投与（例えば、Ｖｕｔｌａ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８５：５−８，１９９６参照）、経粘膜投与又は経口投与によるものであり得る。また、本発明により、本発明の核酸、ペプチド及び／又はポリペプチドがミセル及び／又はリポソーム内に組み込まれた医薬調製物を提供する（例えば、Ｓｕｎｔｒｅｓ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４６：２３−２８，１９９４；Ｗｏｏｄｌｅ，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．９：２６０−２６５，１９９２参照）。リポソーム及びリポソーム製剤は標準的な方法に従って調製され得、また、当該技術分野でよく知られている。Ａｋｉｍａｒｕ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１：１９７−２１０，１９９５。Ａｌｖｉｎｇ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１４５：５−３１，１９９５。Ｓｚｏｋａ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７，１９８０。米国特許第４，２３５，８７１号；同第４，５０１，７２８号及び同第４，８３７，０２８号。
一態様では、該組成物は、該ペプチドを体内からの急速な消失から保護する担体、例えば、制御放出製剤、例えば、埋入物及びマイクロカプセル封入送達系を用いて調製される。生分解性で生体適合性のポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸使用することもできる。かかる製剤の調製方法は当業者に自明であろう。また、リポソーム懸濁剤を薬学的に許容され得る担体として使用してもよい。米国特許第４，５２２，８１１号。
本開示の組成物は、当該技術分野で知られたさまざまな方法によって投与され得る。当業者には認識されるように、投与の経路及び／又は様式は所望される結果に応じて異なる。投与は非経口、静脈内、髄腔内、皮下、経口、経表面、局所、筋肉内、皮内、経皮、皮下、経直腸、経脊髄又は経上皮であり得る。連続輸注による静脈内送達は本発明の抗体を投与するための例示的な方法の一例である。
本発明の薬剤を特定の投与経路によって投与するためには、該薬剤をその不活化を抑制する物質でコーティングするか、又は該薬剤を該物質と共投与することが必要な場合があり得る。例えば、該薬剤は被験体に、適切な担体内、例えばリポソーム内又は希釈剤中にて投与され得る。薬学的に許容され得る希釈剤としては生理食塩水及び水性バッファー溶液が挙げられる。リポソームとしては水中油中水型ＣＧＦエマルジョン並びに慣用的なリポソームが挙げられる（Ｓｔｒｅｊａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．７：２７−４１，１９８４）。
非経口投与には経腸投与及び経表面投与以外の、通常、注射による投与様式が包含され得、限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、包内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、気管経由、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、髄腔内、硬膜外及び胸骨内注射及び輸注が挙げられ得る。本発明の医薬組成物において使用され得る好適な水性担体及び非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）及び適切なその混合物、植物油、例えばオリーブ油、並びに注射用有機エステル、例えばオレイン酸エチルが挙げられる。適正な流動性は、例えば、コーティング物質、例えばレシチンの使用、分散体の場合では必要とされる粒径の維持、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。
非経口投与可能な組成物を調製するための方法は知られているか、又は当業者に自明であり、詳細の報告されている。Ｂａｉ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．８０：６５−７５，１９９７。Ｗａｒｒｅｎ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．１５２：３１−３８，１９９７。Ｔｏｎｅｇａｗａ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：５０７−５１５，１９９７。非経口投与のための製剤には、例えば、賦形剤、滅菌水、生理食塩水、ポリアルキレングリコール、例えばポリエチレングリコール、植物起源の油、又は水素化ナフタレンが含有され得る。生体適合性で生分解性のラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマー、又はポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーは本発明の薬剤の放出を制御するために使用され得る。ナノ粒子状製剤（例えば、生分解性ナノ粒子、固形脂質ナノ粒子、リポソーム）は、本発明の薬剤の体内分布を制御するために使用され得る。他の潜在的に有用な送達系としては、エチレン−酢酸ビニルコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、髄腔内ポンプ、埋込み可能な輸注システム及びリポソームが挙げられる。製剤中の該薬剤の濃度は、いくつかの要素、例えば、投与される薬物の投薬量及び投与経路に応じて異なる。
滅菌注射用液剤は、必要とされる量の本発明の薬剤を適切な溶媒中に、必要に応じて、上記に列挙した成分のうちの１種類又はその組合せとともに組み込んだ後、滅菌精密濾過することにより調製され得る。一般的に、分散剤は、本発明の薬剤を、ベースとなる分散媒及び上記に列挙したもののうちの必要とされる他の成分を含有している滅菌ビヒクル中に組み込むことにより調製される。滅菌注射用液剤の調製用の滅菌粉末の場合、その調製方法は、活性成分＋任意のさらなる所望の成分の粉末が先のこれらの滅菌濾過溶液から得られる真空乾燥及びフリーズドライ（凍結乾燥）を含むものである。投薬量レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療応答）がもたらされるように調整される。例えば、単回ボーラスを投与してもよく、数回の分割用量を経時的に投与してもよく、治療状況の要件に示されるとおりに用量を比例的に減少又は増加してもよい。例えば、本発明の抗体は、週に１回又は２回、皮下注射によって投与してもよく、月に１回又は２回、皮下注射によって投与してもよい。非経口用組成物は、容易な投与及び均等な投薬量のために単位投薬形態に製剤化され得る。単位投薬形態は、本明細書で用いる場合、処置対象の被験体に対する投薬ユニットとして適した物理的に独立した単位をいい；各単位は、所望の治療効果がもたらされるように計算された所定の量の活性薬剤を、必要とされる医薬用担体との会合状態で含有している。本発明の単位投薬形態の仕様は、（ａ）活性薬剤の特有の特徴及び得ようとする具体的な治療効果、並びに（ｂ）個体の過敏性の処置のためのかる活性薬剤の薬剤化の技術分野に固有の制限によって決定され、これらに直接依存する。
経口投与される場合、本発明の組成物を消化から保護してもよい。これは、該抗体又はその抗原結合部分を酸による加水分解及び酵素による加水分解に対して抵抗性にするための組成物と複合体化すること、又は該抗体又はその抗原結合部分を適切に抵抗性の担体、例えばリポソーム内に封入することのいずれかによって行なわれ得る。薬剤を消化から保護する手段は当該技術分野でよく知られている。Ｆｉｘ，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．１３：１７６０−１７６４，１９９６。Ｓａｍａｎｅｎ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４８：１１９−１３５，１９９６。米国特許第５，３９１，３７７号。
経粘膜投与又は経皮投与のためには、バリアを透過するのに適切な浸透剤が製剤中に使用され得る。かかる浸透剤は一般的に当該技術分野で知られており、例えば、経粘膜投与では、胆汁酸塩及びフシジン酸誘導体が挙げられる。また、デタージェントが、透過を助長するために使用され得る。経粘膜投与は経鼻スプレー剤又は坐剤の使用によるものであり得る。Ｓａｙａｎｉ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．１３：８５−１８４，１９９６。経表面投与、経皮投与のためには、該薬剤は軟膏、クリーム剤、膏薬、粉末剤及びゲル剤に製剤化される。また、経皮送達系としては、例えば貼付剤も挙げられ得る。
また、本発明の組成物を持続送達又は徐放機構で投与してもよい。例えば、生分解性のマイクロスフェアもしくはカプセル又はペプチドの持続送達が可能な他の生分解性のポリマー構成が本発明の製剤に包含され得る（例えば、Ｐｕｔｎｅｙ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：１５３−１５７，１９９８参照）。
吸入のためには、本発明の組成物は、当該技術分野で知られた任意のシステム、例えば、乾燥粉末エーロゾル、液体送達系、エアジェット式ネブライザ、噴射剤系などを用いて送達され得る。Ｐａｔｔｏｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １６：１４１−１４３，１９９８。同様に本開示において使用され得るのは、例えば、Ｄｕｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、Ａｒａｄｉｇｒｎ（Ｈａｙｗａｒｄ，Ｃａｌｉｆ．）、Ａｅｒｏｇｅｎ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆ．）、Ｉｎｈａｌｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ，Ｃａｌｉｆ．）などによるポリペプチド巨大分子用の製品及び吸入送達系である。例えば、医薬用製剤はエーロゾル又はミストの形態で投与され得る。エーロゾル投与のためには、製剤は、微粉化された形態で界面活性剤及び噴射剤とともに供給され得る。別の態様では、製剤を呼吸器組織に送達するためのデバイスは、製剤を気化させる吸入器である。他の液状物送達系としては、例えば、エアジェット式ネブライザが挙げられる。
該組成物は、単回用量処置で投与してもよく、反復用量処置で、被験体の年齢、体重及び体調、使用される具体的な組成物並びに投与経路に適切なスケジュール及び期間で投与してもよい。投与頻度は、任意のさまざまな要素、例えば、症状の重症度、所望される免疫防御の度合、該組成物が予防目的で使用されるのか治癒目的で使用されるのかなどに応じて異なり得る。例えば、一実施形態では、本発明による組成物は月１回、月２回、月３回、隔週（ｑｏｗ）、週１回（ｑｗ）、週２回（ｂｉｗ）、週３回（ｔｉｗ）、週４回、週５回、週６回、１日おき（ｑｏｄ）、毎日（ｑｄ）、１日２回（ｑｉｄ）又は１日３回（ｔｉｄ）で投与される。
本発明によるポリペプチドの投与の持続期間、例えば、該組成物を投与する期間は、任意のさまざまな要素、例えば被験体の応答などに応じて異なり得る。例えば、該組成物は約１日〜約１週間、約２週間〜約４週間、約１ヶ月間〜約２ヶ月間、約２ヶ月間〜約４ヶ月間、約４ヶ月間〜約６ヶ月間、約６ヶ月間〜約８ヶ月間、約８ヶ月間〜約１年間、約１年間〜約２年間、もしくは約２年間〜約４年間の範囲又はそれ以上の期間にわたって投与され得る。
経口用又は非経口用の組成物を、容易な投与及び均等な投薬量のために単位投薬形態に製剤化することが好都合である。単位投薬形態は、本明細書で用いる場合、処置対象の被験体に対する投薬ユニットとして適した物理的に独立した単位をいい；各単位は、所望の治療効果がもたらされるように計算された所定の量の活性薬剤を、必要とされる医薬用担体との会合状態で含有している。
本開示の医薬組成物中の活性成分の実際の投薬量レベルは、具体的な患者、組成物及び投与様式で該患者に対して毒性になることなく所望の治療応答が得られるのに有効な活性成分量が得られるように変更され得る。選択される投薬量レベルは、さまざまな薬物動態学的要素、例えば、使用される本開示の具体的な組成物又はそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与期間、使用される具体的な薬剤の排出速度、処置の持続期間、使用される具体的な組成物と併用して使用される他の薬物、薬剤及び／又は物質、処置対象の患者の年齢、性別、体重、体調、一般健康状態及び既往歴などの医学分野でよく知られた要素に依存する。当該技術分野の通常の技能を有する医師又は獣医は、必要とされる医薬組成物の有効量を容易に決定し、処方することができよう。例えば、医師又は獣医により、医薬組成物に使用する本発明の薬剤の用量は所望の治療効果を得るために必要とされるものより低いレベルから開始され、所望の効果が得られるまで投薬量が徐々に増やされ得る。一般に、本発明の組成物の好適な日用量は、治療効果がもたらされるのに有効な最小用量である薬剤量である。かかる有効用量は、一般的には上記の要素に依存する。所望される場合は、治療用組成物の有効日用量を、その日中に適切な間隔で別々（単位投薬形態でもよい）に投与される２、３、４、５、６回又はそれ以上の分割用量として投与してもよい。
細胞培養アッセイ及び動物試験から得られたデータは、ヒトにおける使用のための投薬量範囲の設定において使用され得る。一実施形態では、かかる薬剤の投薬量は、毒性をほとんど又はまったく伴わないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内である。投薬量は、この範囲内で、使用される投薬形態及び使用される投与経路に応じて変更され得る。別の実施形態では、まず細胞培養アッセイから治療有効用量が推定され得る。細胞培養で測定されたＩＣ５０（すなわち、症状の最大阻害の半分がもたらされる試験薬剤濃度）を含む循環血漿濃度範囲が得られる用量が動物モデルにおいて設定され得る。Ｓｏｎｄｅｒｓｔｒｕｐ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｓｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．２５：３５−４５，２００３。Ｎｉｋｕｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｈａｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．４（１２）：１２３−５３，２０００。
本発明の抗体又は抗原結合部分の治療有効量又は予防有効量の例示的で非限定的な範囲は約０．００１〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重もしくはそれ以上、約０．１〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１〜約８０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１〜約６０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１〜約３０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１〜約２５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．５〜約２５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１〜約１５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重、約１０〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．７５〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約２〜約９ｍｇ／ｋｇ体重、約１〜約２ｍｇ／ｋｇ体重，約３〜約８ｍｇ／ｋｇ体重、約４〜約７ｍｇ／ｋｇ体重、約５〜約６ｍｇ／ｋｇ体重、約８〜約１３ｍｇ／ｋｇ体重、約８．３〜約１２．５ｍｇ／ｋｇ体重、約４〜約６ｍｇ／ｋｇ体重、約４．２〜約６．３ｍｇ／ｋｇ体重、約１．６〜約２．５ｍｇ／ｋｇ体重、約２〜約３ｍｇ／ｋｇ体重、又は約１０ｍｇ／ｋｇ体重である。また、被験体に投与される投薬量は約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇ、又は約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ被験体体重であり得る。例示的な用量としては、限定されないが１ｎｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇが挙げられる。いくつかの実施形態では、用量は約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１１ｍｇ／ｋｇ、約１２ｍｇ／ｋｇ、約１３ｍｇ／ｋｇ、約１４ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ又は約１６ｍｇ／ｋｇ被験体体重である。国際公開第９４／０４１８８号。
該組成物は、有効量の本発明の抗体又はその抗原結合部分を含有するように製剤化され、ここで、該量は、処置対象の動物及び処置対象の病状に依存する。一実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合部分は、約０．０１ｍｇ〜約１０ｇ、約０．１ｍｇ〜約９ｇ、約１ｍｇ〜約８ｇ、約１ｍｇ〜約７ｇ、約５ｍｇ〜約６ｇ、約１０ｍｇ〜約５ｇ、約２０ｍｇ〜約１ｇ、約５０ｍｇ〜約８００ｍｇ、約１００ｍｇ〜約５００ｍｇ、約０．０１ｍｇ〜約１０ｇ、約０．０５μｇ〜約１．５ｍｇ、約１０μｇ〜約１ｍｇのタンパク質、約３０μｇ〜約５００μｇ、約４０ｐｇ〜約３００ｐｇ、約０．１μｇ〜約２００ｍｇ、約０．１μｇ〜約５μｇ、約５μｇ〜約１０μｇ、約１０μｇ〜約２５μｇ、約２５μｇ〜約５０μｇ、約５０μｇ〜約１００μｇ、約１００μｇ〜約５００μｇ、約５００μｇ〜約１ｍｇ、約１ｍｇ〜約２ｍｇの範囲の用量で投与される。任意の具体的な被験体に対する具体的な用量レベルは、さまざまな要素、例えば、具体的なペプチドの活性、年齢、体重、一般健康状態、性別、食生活、投与期間、投与経路及び排出速度、薬物併用並びに治療が施されている具体的な疾患の重症度に依存する。
製造物品
別の態様では、本明細書に記載の病状又は障害の処置に有用な物質を含むものである製造物品が包含される。製造物品は容器とラベルを含むものである。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ及び試験管が挙げられる。容器は、さまざまな材質、例えばガラス又はプラスチックで形成されたものであり得る。容器は、該病状の処置に有効な組成物を保持し、滅菌されたアクセスポートを有していてもよい。例えば、容器は静脈内用液剤バッグ又はストッパーを有し、皮下注射針が貫通可能なバイアルであり得る。組成物中の活性薬剤はヒト化抗ＣＤ４０抗体もしくはその断片、又は本明細書に記載の任意の他の抗体もしくはその断片であり得る。容器上又は容器に付随させたラベルには、該組成物が選択肢の病状を処置するために使用されるものであることが表示されている。製造物品はさらに、薬学的に許容され得るバッファー、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液及びデキストロース液が入った第２の容器を含むものであってもよい。これは、さらに、市販品としてユーザーの観点から望ましい他の物質、例えば、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ及び使用のための使用説明を有する添付文書を含むものであってもよい。
一実施形態では、本発明により、抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合部分を含むものであるキットを提供する。キットのさらなる成分としては、以下：使用説明書；他の試薬、治療用薬剤、又は抗体を標識もしくは治療用薬剤にカップリングさせるのに有用な薬剤又は投与用の抗体を調製するための他の物質；薬学的に許容され得る担体；及び被験体への投与のためのデバイス又は他の物質のうちの１種類以上が挙げられ得る。
キットに本明細書に記載の第２の治療用薬剤を含めてもよく、含めなくてもよい。諸薬剤はキット内において一緒に混合されていてもよく、個々にパッケージングされていてもよい。
キットは、抗ＣＤ４０抗体又はその断片をコードしている少なくとも１種類の核酸及び該核酸の発現のための使用説明書を含むものであってもよく、そうでなくてもよい。キットの他の考えられ得る成分としては発現ベクター及び細胞が挙げられる。
本発明の抗体又はその断片を診断キット、すなわち、診断アッセイを行なうための使用説明書とともにパッケージ化された所定の量の試薬の組合せにおいて使用してもよい。該抗体が酵素で標識されている場合、キットには、該酵素に必要とされる基質及び補因子、例えば検出可能な発色団又はフルオロフォアをもたらす基質前駆物質が含められ得る。また、他の添加剤、例えば安定剤、バッファー（例えば、ブロックバッファー又は溶解バッファー）などを含めてもよい。アッセイの感度が実質的に最適化される試薬溶液中の濃度をもたらすための種々の試薬の相対量は広く異なり得る。試薬は、溶解させると適切な濃度を有する試薬溶液をもたらす賦形剤を含む乾燥粉末（通常、凍結乾燥状態）として提供され得る。
エピトープマッピング
抗体が結合する対象の具体的なエピトープを同定するための方法は当業者に知られている。標準的な手法としてはペプチドスキャニングが挙げられ、これは、抗体が結合する対象の完全長タンパク質に由来する重複している短鎖ペプチド（例えば１０〜３０個、例えば２０個のアミノ酸長）を個々に、該抗体に対する結合能について試験するというものである。かかる実験により、次いで、抗体が結合する対象のタンパク質領域が決定され得る。
また、部位特異的変異誘発も、特定のタンパク質の（１又は複数の）抗原性領域を同定するために使用され得る。このアプローチでは、点変異を標的ポリペプチド内に体系的に導入し、種々の位置に変異を有するペプチドに抗体が結合する能力を用いて、該タンパク質の特定の領域に該抗体が結合する対象のエピトープが含まれているかどうかを調べる。
また、抗体エピトープは、ハイスループット変異誘発手法、例えば、ショットガン変異誘発（Ｓｈｏｔｇｕｎ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｉｎｔｅｇｒａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．）（これは、標的タンパク質内に大量数の変異を生じさせるために使用され得る）を用いて同定することもできる。かかる方法論では、タンパク質内における効率的なエピトープ同定が可能である。
ＣＤ４０に対する種々の抗体が同様のエピトープに結合するかどうかを調べるため、インビトロ競合的ブロックアッセイが行なわれ得る。一実施形態において、キメラＩｇＧ１ ＣＤ４０特異的抗体である抗体２Ｃ１０、３Ａ８及びＣｈｉ２２０をこのアッセイに使用した。２Ｃ１０をアロフィコシアニン（ＡＰＣ）に、Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｌｉｎｋ抗体標識キット（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ，ＣＯ）を用いてコンジュゲートさせた。ヒトＰＢＭＣを漸増濃度の２Ｃ１０、３Ａ８又はＣｈｉ２２０とともにインキュベートし、次いでＡＰＴコンジュゲート２Ｃ１０で染色し、各抗体が２Ｃ１０を交差ブロックする能力を評価した。ＡＰＣコンジュゲート２Ｃ１０の結合は、図１２に示されるように、２Ｃ１０では濃度の増大に伴って低減されたがＣｈｉ２２０又は３Ａ８ではそうではなかった。この結果は、２Ｃ１０が、Ｃｈｉ２２０又は３Ａ８のいずれとも相違する独自のエピトープに結合することを示す。
ＣＤ４０断片
本発明ではまた、２Ｃ１０抗体によって特異的に結合されるエピトープを含むＣＤ４０の断片を取り上げて記載する。２Ｃ１０抗体を、ＣＤ４０ポリペプチドの細胞外部分に対して生じさせた。２Ｃ１０抗体は、この配列（配列番号：５及び６）の一部分と反応する。
したがって、本開示では、２Ｃ１０抗体によって特異的に結合されるＣＤ４０断片（例えば、１５０個より少ない、１２０、１００、８０、７０、６０、５０、４０、３０，２０、１８、１５、１２、１１、１０、９、８又は７個の）アミノ酸長を取り上げて記載する。一部の特定の実施形態では、該断片は８〜１０、８〜１２、８〜１５、８〜２０、８〜３０、８〜４０、８〜５０、８〜６０、８〜７０、８〜８０又は８〜１００個のアミノ酸長である。他の実施形態では、該断片は７〜１０、７〜１２、７〜１５、７〜２０、７〜３０、７〜４０、７〜５０、７〜６０、７〜７０、７〜８０又は７〜１００個の長さである。
２Ｃ１０抗体は、配列番号：６のアミノ酸８〜１０、８〜１２、８〜１５、８〜２０、８〜３０、８〜４０、８〜５０、８〜６０、８〜７０、８〜８０、８〜１００、７〜１０、７〜１２、７〜１５、７〜２０、７〜３０、７〜４０、７〜５０、７〜６０、７〜７０、７〜８０又は７〜１００個の配列内に存在するエピトープに結合する。
本発明ではまた、本明細書に記載の断片と非相同配列を含む融合タンパク質を取り上げて記載する。一部の特定の実施形態では、融合パートナーの一方はＦｃタンパク質（例えば、マウスＦｃ又はヒトＦｃ）である。また、融合パートナーの一方は、抗体産生に有用な配列、例えば、マルトース結合タンパク質又はＧＳＴであってもよい。他の実施形態では、融合タンパク質は、精製又は検出用タグ、例えば、直接又は間接的に検出され得るタンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質、血球凝集素もしくはアルカリホスファターゼ）、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＧＡＬ４もしくはＬｅｘＡ）、遺伝子活性化ドメイン（例えば、ＧＡＬ４もしくはＶＰ１６）、精製タグ、又は分泌シグナルペプチド（例えば、プレプロチリプシン（ｐｒｅｐｒｏｔｙｒｙｐｓｉｎ）シグナル配列）である。他の実施形態では、融合パートナーは、タグ、例えば、ｃ−ｍｙｃ、ポリヒスチジン又はＦＬＡＧであり得る。各融合パートナーは、１つ以上のドメイン、例えば、プレプロトリプシンシグナル配列及びＦＬＡＧタグを含むものであり得る。
本明細書に記載のＣＤ４０断片及び融合タンパク質は、適切な宿主細胞を、該ポリペプチド断片又は融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチド分子で適切な発現媒体にて形質転換することによって作製され得る。
多種多様な任意の発現系が使用され得る。例示的な発現系としては、原核生物宿主（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））及び真核生物宿主（例えば、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、昆虫細胞、例えばＳｆ２１細胞、又は哺乳動物細胞、例えばＮＩＨ ３Ｔ３、ＨｅＬａ、もしくは好ましくはＣＯＳ細胞）が挙げられる。かかる細胞は広範な供給元（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手可能である。形質転換又はトランスフェクションの方法及び発現媒体の選択は、選択される宿主系に依存する。形質転換及びトランスフェクションの方法は、例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ ｅｔ ａｌ．（ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６：３４９−３７９，１９８２）及びＤＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ Ｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｃｅｌｌｓ（ｅｄｓ．，Ｒａｖｉｄ ａｎｄ Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，１９９８）に記載されており；発現媒体は、例えば、Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（ｅｄ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｌｔｄ．，１９９８）に示されているものから選択され得る。
組換えＣＤ４０ポリペプチド断片又は融合タンパク質が発現されたら、これは、例えばアフィニティークロマトグラフィーを用いて単離され得る。一例では、ＣＤ４０に特異的な抗体（例えば、本明細書に記載の抗体又はその断片）をカラムに結合させ、該ポリペプチド断片又は融合タンパク質を単離するために使用され得る。アフィニティークロマトグラフィーの前に、断片又は融合タンパク質を有する細胞の溶解及び分画が標準的な方法によって行なわれ得る（例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌｕｍｅ １８２，ｅｄｓ．，Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｓｉｍｏｎ，ａｎｄ Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９９０参照）。単離されたら、ＣＤ４０ポリペプチド断片又は融合タンパク質は、所望により、例えば高速液体クロマトグラフィーによってさらに精製され得る（例えば、Ｆｉｓｈｅｒ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．，Ｗｏｒｋ ａｎｄ Ｂｕｒｄｏｎ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８０；及びＳｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄ．，Ｃａｎｔｏｒ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，１９９４参照）。
また、ＣＤ４０ポリペプチド断片又は融合タンパク質は化学合成によっても作製することができる（例えば、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ ｅｄ．，１９８４，Ｔｈｅ Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ；及びＳｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ，ｅｄ．，Ｋａｔｅｓ ａｎｄ Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ．，２０００に記載の方法によって）。
本発明の抗体、その抗原結合部分、組成物及び方法は、あらゆる脊椎動物、例えば、哺乳動物及び非哺乳動物、例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、サル、類人猿、ゴリラ、チンパンジー、ウサギ、アヒル、ガチョウ、ニワトリ、両生類、爬虫類及び他の動物において使用され得る。
本開示を実施するための具体的な態様の以下の実施例は、実例を示す目的のために示したものにすぎず、なんら本開示の範囲を限定することを意図するものではない。
［実施例１］
抗ＣＤ４０マウス抗体の作製及び同定
マウス（系統ＡＪ）を、マルトース結合タンパク質と融合させたアカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅ）（Ｍ．ｍｕｌａｔｔａ）ＣＤ４０（アミノ酸配列：ＥＰＰＴＡＣＲＥＫＱＹＬＩＮＳＱＣＣＳＬＣＱＰＧＱＫＬＶＳＤＣＴＥＦＴＥＴＥＣＬＰＣＳＥＳＥＦＬＤＴＷＮＲＥＴＲＣＨＱＨＫＹＣＤＰＮＬＧＬＲＶＱＱＫＧＴＳＥＴＤＴＩＣＴＣＥＥＧＬＨＣＭＳＥＳＣＥＳＣＶ；配列番号：５）の細胞外ドメインからなる融合タンパク質（ＣＤ４０−ＭＢＰ）で免疫処置した。アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅ）ＣＤ４０タンパク質のこの領域のアミノ酸配列は、ヒトＣＤ４０タンパク質と５つのアミノ酸位置において異なる（ヒトアミノ酸配列：ＥＰＰＴＡＣＲＥＫＱＹＬＩＮＳＱＣＣＳＬＣＱＰＧＱＫＬＶＳＤＣＴＥＦＴＥＴＥＣＬＰＣＧＥＳＥＦＬＤＴＷＮＲＥＴＨＣＨＱＨＫＹＣＤＰＮＬＧＬＲＶＱＱＫＧＴＳＥＴＤ ＴＩＣＴＣＥＥＧＷＨＣＴＳＥＡＣＥＳＣＶ；配列番号：６）。ＣＤ４０−ＭＢＰをマウスに複数回、完全フロイントアジュバント及び不完全フロイントアジュバントとともに投与した。免疫処置したマウスの脾細胞をマウス骨髄腫細胞株ＳＰ２／０と融合させ、ハイブリッド細胞を標準的なハイブリドーマ技術を用いて選択した。
抗体を、グルタミン合成酵素と融合させた同じアカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ）ＣＤ４０ドメインからなる第２の融合タンパク質（ＣＤ４０−ＧＳＴ）に対する反応性で選択した。ＣＤ４０−ＧＳＴに反応性である（ＥＬＩＳＡによる）抗体を、アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅ）血中Ｂ細胞、ヒト血中Ｂ細胞及びアカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅ）Ｂリンパ芽球様細胞株上に発現される天然ＣＤ４０に対する反応性について、フローサイトメトリーによってさらに試験した。最終選択レベルとして、抗体をインビトロアッセイにおいて、ＣＤ１５４発現Ｊｕｒｋａｔ Ｄ１．１細胞との共培養後のヒト又はアカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅ）のＢ細胞活性化を阻害する能力について試験した。抗ＣＤ４０抗体２Ｃ１０の安定なサブクローンを限界希釈によって得た。抗体はマウスＩｇＧ１−κである。
Ｌｏｗｅ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｎｏｖｅｌ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ＣＤ４０ ｐｒｏｌｏｎｇｓ ｉｓｌｅｔ ａｌｌｏｇｒａｆｔ ｓｕｒｖｉｖａｌ，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ（２０１２）１２（８）：２０７９−８７．
抗体のクローニング
モノクローナル抗体の可変領域は、当該技術分野で知られた任意の方法を用いてクローニングすることができる。ハイブリドーマ細胞のための抗体可変領域の配列を得るためのＰＣＲベースの方法は、例えば、Ｌａｒｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７：９３４−８，１９８９及びＯｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：３８３３−７，１９８９に記載されている。このような手法又は同様の手法を使用し、モノクローナル抗体の可変領域はクローニングし、さらなる操作に供され得る。本発明の場合では、２Ｃ１０抗体の重鎖及び軽鎖の可変配列をクローニングし、配列決定した。２Ｃ１０ハイブリドーマ由来の免疫グロブリンの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域であるＤＮＡを、５’ＲＡＣＥ ＰＣＲを使用し、以下のＤＮＡプライマー：
マウスκリバース：５’−ＣＴＡ ＡＣＡ ＣＴＣ ＡＴＴ ＣＣＴ ＧＴＴ ＧＡＡ ＧＣＴ ＣＴＴＧＡＣ（配列番号：７）；
マウスκフォワード：５’−ＧＣＴ ＧＡＴ ＧＣＴ ＧＣＡ ＣＣＡ ＡＣＴ ＧＴＡ ＴＣＣ−３’（配列番号：８）
マウスＩｇＧ１リバース：５’−ＧＧＣ ＡＡＣ ＧＴＴ ＧＣＡ ＧＧＴ ＣＴＣ ＧＣ−３’（配列番号：９）
マウスＩｇＧ１フォワード：５’−ＣＴＧ ＧＡＴ ＣＴＧ ＣＴＧ ＣＣＣ ＡＡＡ ＣＴＡ ＡＣＴ ＣＣ−３’（配列番号：１０）
を用いてクローニングした。
ＰＣＲ産物を市販のクローニングベクター内にクローニングし、標準的なシーケンシング手法を用いて配列決定した。得られた配列を図１に示す。
免疫グロブリン可変領域の遺伝子を、抗ＣＤ４０抗体クローン２Ｃ１０分泌ハイブリドーマ及び抗ヒトＣＤ４０クローン３Ａ８（Ｋｗｅｋｋｅｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ７９：４３９−４４，１９９３）（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣ，Ｖｉｅｎｎａ，ＶＡから入手）から、ｃＤＮＡの５’末端の迅速増幅（５’ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ）−ポリメラーゼ連鎖反応を用いてクローニングした。免疫グロブリンの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を、アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ）ＩｇＧ１又はアカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ）ＩｇＧ４重鎖とアカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ）κ軽鎖定常領域の配列を含む発現ベクター内にサブクローニングした。
組換え重鎖及び軽鎖を発現ベクター内にサブクローニングし、チャイニーズハムスター卵巣細胞を形質導入するために使用されるレトロウイルスベクター内に、ＧＰＥｘ（商標）発現技術（Ｃａｔａｌｅｎｔ Ｐｈａｒｍａ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ，ＷＩ）を用いてパッケージングした。形質導入細胞プールを無血清培地中で培養し、分泌された抗体をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。精製されたキメラアカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ）ＩｇＧ１（２Ｃ１０Ｒ１，３Ａ８Ｒ１）及びＩｇＧ４（２Ｃ１０Ｒ４）抗体をリン酸バッファー中でダイアフィルトレーションした；内毒素レベルは１内毒素単位／ｍｇ未満であることが確認された。
抗体の特性評価
２Ｃ１０はＣＤ４０に結合してＣＤ１５４の結合を妨げる
２Ｃ１０がアカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ）及びヒトの両方のＣＤ４０に結合する能力を評価するため、組換え発現させたヒト又はアカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ）のＣＤ４０をＥＬＩＳＡプレートに吸着させ、いろいろな濃度の２Ｃ１０と反応させた。ＣＤ４０に対する２Ｃ１０の結合を、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰを用いてＥＬＩＳＡで検出した。図２Ｂの結果は、２Ｃ１０がアカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ）及びヒトのＣＤ４０に対して同様の結合親和性を有することを示し、これは、２Ｃ１０の臨床的翻訳のためには重要なことである。２Ｃ１０がそのコグネイトリガンドであるＣＤ１５４の結合をブロックする能力を確認するため、アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ）及びヒトのＢ細胞を漸増濃度の２Ｃ１０又はアイソタイプ対照とともにインキュベートし、次いでヒスチジンタグ化可溶性ＣＤ１５４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）とともにインキュベートし、ヒスチジン発現について解析した。２Ｃ１０はＣＤ１５４の結合を用量依存的様式でブロックし（図３）、２Ｃ１０はＴ細胞結合ＣＤ１５４とＢ細胞及び抗原提示細胞上のＣＤ４０との相互作用を有効にブロックし得ることが示された。
表２ ２Ｃ１０のＣＤ４０受容体結合速度論
Figure 0006976931
２Ｃ１０はアカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）及びヒトの末梢血単核細胞においてＢ細胞の活性化をブロックする
抗ＣＤ４０抗体２Ｃ１０を、Ｂ細胞の活性化に影響を及ぼす能力に関してアカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）及びヒトの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の両方を用いて特性評価した。ＣＤ２０発現を選択したのは、これがＢ細胞のインジケータであり、ＣＤ２３、ＣＤ８０及びＣＤ８６の発現はＢ細胞の活性化と関連しているためである。２Ｃ１０をまず、ＣＤ２０に結合する能力について評価した。アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ）又はヒトのＰＢＭＣを、蛍光色素コンジュゲート２Ｃ１０及び抗ＣＤ２０抗体とともにインキュベートした。フローサイトメトリー解析を使用し、ヒト及びアカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ）のＣＤ２０＋ Ｂ細胞に対する２Ｃ１０の結合を確認した（図２Ａ）。別の一組の実験において、アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）又はヒトのいずれかに由来するＰＢＭＣを、不死化Ｔリンパ球（ｌｙｍｏｐｈｏｃｙｔｅ）細胞株であるＣＤ１５４＋ Ｊｕｒｋａｔ Ｄ１．１細胞の存在下又は非存在下のいずれかで培養した。Ｂ細胞の活性化を、ＰＢＭＣに存在しているＣＤ２０＋細胞における３種類のマーカー（ＣＤ２３、ＣＤ８０及びＣＤ８６）の発現を測定することにより調べた。このアッセイの一般的なスキームを図４に示す。図４に示すように、ジャーカット細胞の存在下でのＰＢＭＣの培養により３種類すべてのマーカー発現の増大がもたらされ、Ｂ細胞がＣＤ１５４＋ジャーカット細胞によって活性化されることが示された。
抗体がＢ細胞の活性化をブロックする能力を試験するため、ＰＢＭＣとジャーカット細胞を３種類の抗体：３Ａ８、５Ｃ８及び２Ｃ１０のうちの１種類の存在下及び非存在下で共培養した。３Ａ８抗体はマウス抗ヒトＣＤ４０抗体（ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ−１２０２４）であり、５Ｃ８は抗ＣＤ１５４抗体（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ−１０９１５）である。各々を陽性対照として使用した。共培養は、５桁の抗体濃度範囲（０．００１μｇ〜１０μｇ）において実施した。図５に示されるように、３Ａ８は、アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ）ＰＢＭＣにおいてＣＤ２３発現によって測定されるように、Ｂ細胞の活性化をブロックしなかったが、２Ｃ１０と５Ｃ８はどちらも、同様の効率で活性化をブロックすることができた。また、対応する変化もＣＤ８０及びＣＤ８６の発現で観察された。このような結果は、２Ｃ１０が３Ａ８とは異なるＣＤ４０上のエピトープに結合することを示す。また、このような結果は、２Ｃ１０が、弱い刺激性潜在能を有する部分作動薬として作用することが以前に示されていた３Ａ８とは対照的に（Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７４：５４２−５０，２００５，Ｂａｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．ａｃｃｅｐｔｅｄ ｆｏｒ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，２０１１）、主にＣＤ４０拮抗薬として作用することも示す。アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ）ではなくヒトのＰＢＭＣを用いて同様の実験を行なった場合、この場合でも２Ｃ１０と５Ｃ８はどちらも、ＣＤ８６の発現によって測定されるように、同様の効率でＢ細胞の活性化をブロックすることが観察された。この場合、３Ａ８抗体は、アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ）ＰＢＭＣの場合とは異なり、Ｂ細胞の活性化をブロックした（図６）。
また、２Ｃ１０抗体及び３Ａ８抗体を、Ｂ細胞を活性化させる能力について、ジャーカット細胞の非存在下でアカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）又はヒトＰＢＭＣのいずれかを用いて試験した。この場合、ＰＢＭＣを、２Ｃ１０又は３Ａ８のいずれかの存在下又は非存在下のいずれかで培養した。次いで、ＣＤ２３、ＣＤ８０及びＣＤ８６の発現をＣＤ２０＋細胞において測定した。図７に示されるように、アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ）細胞におけるＣＤ２３発現は３Ａ８抗体の存在下で増大したが、２Ｃ１０抗体の存在下では増大しなかった。対照的に、３Ａ８も２Ｃ１０もヒトＢ細胞を活性化させなかった。３Ａ８抗体と２Ｃ１０抗体間で観察された活性の違いは、２Ｃ１０抗体が３Ａ８抗体のものとは異なるエピトープに結合することを示す。
２Ｃ１０はＴ細胞依存性抗体応答を妨げる
２Ｃ１０がＣＤ４０上の独自のエピトープに結合し、Ｂ細胞の活性化を抗ＣＤ１５４抗体と同様に阻害し、アゴニスト特性がないことが確立されたため、本発明者らは、次いで、インビボでの２Ｃ１０の効果を特性評価した。２Ｃ１０の組換えマウス−アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ）キメラ形態を、アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ）のＩｇＧ１（２Ｃ１０Ｒ１）又はＩｇＧ４（２Ｃ１０Ｒ４）のいずれかの重鎖とアカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ）κ軽鎖定常領域の配列を用いて作製した。また、３Ａ８のキメラアカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ）ＩｇＧ１形態（３Ａ８Ｒ１）を対照としての使用のために作製した。
アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅ）をゼロ日目に、４−ヒドロキシ−３−ニトロフェニルアセチルコンジュゲートスカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ，１０ｍｇ ＩＭ）抗原（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）で１回免疫処置した。免疫処置の前及び１週間目に、３匹の動物のコホートに静脈内用量（５０ｍｇ／ｋｇ）の２Ｃ１０Ｒ１、２Ｃ１０Ｒ４、３Ａ８Ｒ１又は生理食塩水を投与した。すべての動物を７０日間観察し、フローサイトメトリーを毎週実施した。いずれかの組換え２Ｃ１０アイソタイプでの処置により、３Ａ８Ｒ１（Ｂａｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１０：２１４，２０１０）又はＣｈｉ２２０（Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７４：５４２−５０，２００５）のいずれかを投与された動物で生じた以前に報告された有意な長期間の末梢Ｂ細胞枯渇と比べて末梢Ｂ細胞計数において穏やかな変化がもたらされた（図８）。
ＫＬＨ−ＮＰに対するＴ細胞依存性抗体応答をＥＬＩＳＡによって試験した。プレートをＫＬＨ（０．０１ｍｇ／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）でコーティングし、Ｓｕｐｅｒ Ｂｌｏｃｋ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗｏｏｄｓｔｏｃｋ，ＧＡ）を用いてブロックした。処置前及び処置後の血漿試料を段階希釈し、１時間プレーティングし、リン酸緩衝生理食塩水／０．０５％Ｔｗｅｅｎで洗浄した。抗ＫＬＨ抗体を、モノクローナル抗アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ）ＩｇＧ−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（クローン１Ｂ３，ＮＨＰ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）とともに１時間インキュベートすることにより検出した。次いでプレートをペルオキシダーゼ基質溶液（ＫＰＬ）とともにインキュベートした。次いで停止液（ＫＰＬ）を添加し、光学密度を、ＥＬＩＳＡプレートリーダーで４５０ｎｍにおいて読み取った。試料は、同じ２倍希釈において処置後の血漿の光学密度の読み値が処置前の血漿の光学密度を超えた場合、所与の希釈度において陽性とみなした。ＫＬＨでの免疫処置後、対照動物では高力価のＫＬＨ特異的ＩｇＧが発生した（図９）。また、３Ａ８Ｒ１を投与された動物でも抗ＫＬＨ応答が生じたが、力価は、Ｂ細胞の有意な枯渇にもかかわらず、対照よりもおよそ１０倍低かった。対照的に、ＩｇＧ抗ＫＬＨ抗体の生成は、２Ｃ１０Ｒ１又は２Ｃ１０Ｒ４のいずれかを投与されたすべての動物で、５６日目までほぼ完全にブロックされた。
２Ｃ１０は、膵島同種移植のアカゲザル（ｍａｃａｑｕｅ）モデルにおいて膵島同種移植片の生着を有意に長期化させる
本発明者らはさらに、ＣＤ４精製キメラリーシス（ｒｈｅｓｉｓ）ＩｇＧ４抗体である２Ｃ１０Ｒ４を、非ヒト霊長類膵島同種移植モデルにおいて試験した（図１０）。体重が１０〜２０ｋｇのアカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅ）に、移植の１日前に正中開腹によってドナー膵切除を実施した。動物を致死的に放血させた後、膵臓を単離し、氷上に置いた。膵島の単離は、コラゲナーゼ／中性プロテアーゼ（それぞれ、９５０Ｗｕｎｓｃｈ単位及び６３単位；Ｓｅｒｖａ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて行なった。消化された膵臓を、４層の不連続Ｅｕｒｏｆｉｃｏｌｌ勾配（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）及びＣｏｂｅ ２９９１血球プロセッサ（ＣａｒｉｄｉａｎＢＣＴ，Ｌａｋｅｗｏｏｄ，ＣＯ）で精製した。最終の膵島調製物試料を計数し、膵島当量（ＩＥＱ）として表示した。単離した膵島を一晩培養し、計数し、移植用培地（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）中に懸濁させた。
体重が３〜５ｋｇのアカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅ）を、移植の４週間前に、ストレプトゾトシン（１２５０ｍｇ／ｍ２ ＩＶ；Ｚａｎｏｓａｒ，Ｔｅｖａ Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を用いて糖尿病にした。糖尿病は、経静脈ブドウ糖負荷試験（ＩＶＧＴＴ）によりボーラスでの５００ｍｇ／ｋｇのデキストロース及び霊長類Ｃ−ペプチドの測定を用いて確認した。グルコースレベルをモニタリングし、Ｃ−ペプチドをベースライン時並びにデキストロースの注射後１０、３０、６０及び９０に測定した。糖尿病は、検出可能な血清Ｃ−ペプチドがない高値の血中グルコースレベルの測定によって確認した。糖尿病のレシピエントに対してＭＨＣミスマッチ膵島の同種移植を実施した。平均１５，７４５（±４，０６３）のＩＥＱを正中小開腹及び腸間膜静脈のカニューレ挿入によって注入した。
血中グルコースレベルを１日２回、耳穿刺；ＮＰＨ（Ｎｏｖｏｌｉｎ；Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）によって測定し、グラルギン（Ｌａｎｔｕｓ；Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ，Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＮＪ）インスリンを投与し、移植前及び移植片拒絶反応後の空腹時血中グルコース（ＦＢＧ）を３００ｍｇ／ｄＬ未満に維持した。移植後、ＩＶＧＴＴを定期的に実施し、移植片の機能をモニタリングした。移植レシピエントに対してフローサイトメトリー解析を毎週実施し、Ｔ細胞（ＣＤ３ Ｖ４５０，ＣＤ４ ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５，ＣＤ８ ＰｅｒＣｐ；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）集団及びＢ細胞（ＣＤ２０ ＰＥ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）集団をモニタリングした。膵島生着後、拒絶反応を、２日間連続で１３０ｍｇ／ｄＬより高いＦＢＧと定義した。一次エンドポイントは拒絶反応のない膵島移植片の生着であった。
移植レシピエントに２Ｃ１０Ｒ４、バシリキシマブ（Ｓｉｍｕｌｅｃｔ，Ｎｏｖａｒｔｉｓ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）とシロリムス又はバシリキシマブ及びシロリムス単独のいずれかを投与した。２Ｃ１０Ｒ４（５０ｍｇ／ｋｇ）は術後（ＰＯＤ）０日目と７日目に静脈内投与した。バシリキシマブ（０．３ｍｇ／ｋｇ）はＰＯＤ ０及び３に静脈内投与した。シロリムスは、５〜１５ｎｇ／ｍｌの谷レベルが得られるようにＰＯＤ １２０まで毎日筋肉内投与した。バシリキシマブ及びシロリムス単独を投与された３匹の動物はすべて、歴史的対照である（Ｂａｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２０：４５２０−３１２，２０１０）。これらの歴史的対照のうちの２匹（ＲＱｚ６とＲＩｂ７）に対し、膵切除によって糖尿病誘発を実施し、経口シロリムスを投与した。
上記のレジメンでの処置により、バシリキシマブ単独導入療法とシロリムス維持療法を受けた対照（図１１Ｂ）と比べて膵島移植片の生着の有意な長期化（図１１Ａ）がもたらされた。２Ｃ１０Ｒ４を投与された動物の拒絶反応のない移植片の生着期間の中央値は２８０日間であるのに対して対照動物では８日間である（ｐ＝０．０１０，表３）。薬物動態データにより、血漿２Ｃ１０Ｒ４レベルはＰＯＤ １００までに１μｇ／ｍｌ未満になるであろうことが予測される。シロリムスをＰＯＤ１２０に中止したため、最も長く（３０４日間）生存したレシピエントには、拒絶反応が起こるまでのおよそ２４週間、免疫抑制を行なわなかった。２Ｃ１０Ｒ４で処置した動物では、臨床的に重要な感染性の合併症又は体重減少は発生しなかった。この結果は、２Ｃ１０のＩｇＧ４アイソタイプを投与した動物を反映している。２Ｃ１０のＩｇＧ１アイソタイプ（２Ｃ１０Ｒ１）をバシリキシマブ及びシロリムスと併用して投与したさらに２匹の動物では、２２０日間及び１６２日間の同様の長期化した移植片の生着がもたらされた。導入療法薬として使用した２Ｃ１０でのプラスの結果を考慮すると、次の工程は、維持療法薬として２Ｃ１０を投与することによる移植片の生着に対する効果を評価することである。
表３
Figure 0006976931
ＣＤ２８／Ｂ７経路と併せてのＣＤ４０／ＣＤ１５４経路のブロック
ＣＤ４０／ＣＤ１５４経路のブロックは、他の共刺激ブロック剤と併せると有用であることが証明され得る。ＣＤ２８／Ｂ７共刺激経路をブロックするために設計された高親和性型のＣＴＬＡ４−Ｉｇであるベラタセプトは、腎移植及び膵島移植の非ヒト霊長類モデルにおいて、並びに腎移植のフェーズＩＩ及びＩＩＩ臨床試験において有効性が示されている（Ｌａｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ９０：１５２８−３５，２０１０、Ｖｉｎｃｅｎｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１０：５３５−４６，２０１０、Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７４：５４２−５０，２００５、Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５１：２６５−７０，２００２、Ｌａｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．５：４４３−５３，２００５、Ｖｉｎｃｅｎｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５８：７７０−８１，２００５）。ＢＥＮＥＦＩＴ治験では、ベラタセプトで処置した患者において優れた腎機能が示された；しかしながら、このような患者は、発生率がより高く、等級がより重度の、生検により確定診断された急性拒絶反応を有した（Ｌａｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ９０：１５２８−３５，２０１０、Ｖｉｎｃｅｎｔｉ ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１０：５３５−４６，２０１０）。この高率の急性拒絶反応及びＣＤ４０とＢ７のブロック間の相乗効果（Ｌａｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３８１：４３４−８，１９９６）に鑑みて、本発明者らは、次に、非ヒト霊長類の腎臓移植における２Ｃ１０とベラタセプトの併用療法の有効性を試験する。
［実施例２］
ヒト化抗ＣＤ４０抗体
本発明者らは、ｈ２Ｃ１０と称するＣＤ４０に対する新規なヒト化Ａｂ（ヒト化２Ｃ１０抗体）を開発して特性評価し、これをＣＤ４０の機能性完全拮抗薬として選択した。結合性エピトープを、Ｂ細胞を活性化もしくは枯渇させるか、又は部分作動薬としての機能を果たすかいずれかである競合体分子とは識別される独自の結合特性が付与されるように注意深く設計した。該抗体の初期のマウス霊長類キメラ型は、関連するインビトロ及びインビボ前臨床試験、例えば、非ヒト霊長類での複数の試験（これにより、移植拒絶反応の抑制に対して有望な有効性並びに同種移植片及び異種移植片の両方での生着の長期化、並びに非臨床試験での好都合な安全性プロフィールが実証されている）において調べられている。また、本発明者らは、優れた特徴を示す２Ｃ１０のヒト化（ｈ２Ｃ１０）も完成させた。
ヒト化抗ＣＤ４０抗体を作製するため、マウス抗体２Ｃ１０の可変領域の配列を用いてヒト抗体のデータベースを検索した。ＶＨは、ほとんどが生殖細胞系列由来抗体の配列ＶＨ１−４６、ＶＨ１−６９及びＶＨ１−３（配列番号：３０）と関連しており、一方、ＶＬは、ほとんどが生殖細胞系列由来抗体の配列ＶＫ３−１１（配列番号：３１）、ＶＫ１−３９及びＶＫ６−２１と関連していることがわかった。ヒトＶＨ１−３とＶＫ３−１１を、ヒトレパートリーにおける比較的高い出現頻度及び極めて重要なフレームワーク位置における良好な保存のため、ＣＤＲグラフティングのためのアクセプターフレームワークとなるように選択した。両方の可変領域を使用し、マウス２Ｃ１０抗体由来のＣＤＲをヒトアクセプターフレームワーク内にグラフティングすると３Ｄモデルが構築された。ヒト対応物と異なる６個のマウスＶＨフレームワーク残基は、おそらく該ＣＤＲと接触しており：Ｍ４８、Ａ６７、Ｌ６９、Ａ７１、Ｋ７３及びＮ７６であると同定された。モデル設計後、それぞれ０、２及び６個のマウスフレームワーク残基を含む３種類のヒト化ＶＨ配列２Ｃ１０＿ｈ１、２Ｃ１０＿ｈ２及び２Ｃ１０＿ｈ３を設計した（図１３ａ）。同様に、５個のマウスＶＫフレームワーク残基が、おそらく該ＣＤＲと接触しており：Ｑ１、Ｒ４６、Ｗ４７、Ｖ５８及びＹ７１であると同定された。モデル設計後、それぞれ０及び４個のマウスフレームワーク残基を含む２種類のヒト化ＶＬ配列２Ｃ１０＿ｌ１及び２Ｃ１０＿ｌ２を設計した（図１３ｂ）。
親マウス２Ｃ１０抗体をＣＤＲグラフティングによってヒト化した。ヒト抗体ＶＨ１−３及びＶＫ３−１１の生殖細胞系列フレームワークをアクセプターとなるように選択した。３種類のＶＨ配列及び２種類のＶＬ配列を設計し、全部で６種類のヒト化抗体を作製し、ヒトＣＤ４０結合について試験した。
２Ｃ１０−重鎖−３（２Ｃ１０＿ｈ３）と２Ｃ１０−軽鎖−２（２Ｃ１０＿ｌ２）の構築物は、マウス２Ｃ１０のもの（０．２２ｎＭ）の２倍以内の０．３９ｎＭのＣＤ４０結合親和性を有する最良の抗体をもたらすことがわかった（表２）。ヒト化可変領域を使用し、ＩｇＧ４又は安定化ＩｇＧ４としての臨床候補ヒト化抗体を構築し、これをＳｗｉＭＲ発現系内にクローニングした。
高産生性の安定なＣＨＯ細胞株をＦＡＣＳによって単離し、３回のＥＬＩＳＡ及び１回のフェッドバッチ培養によってスクリーニングした。フェッドバッチ培養において０．８ｇ／Ｌより多くのヒト化２Ｃ１０を産生する７個のクローンを単離した。最良のクローン３Ｃ９−Ｉ６は、非最適化条件下で約１．２ｇ／Ｌを産生した。
抗体発現ベクターの構築
ヒト化ＶＨ配列を遺伝子合成し、ヒトＩｇＧ２重鎖の定常領域を含むベクターｐＦＵＳＥ−ＣＨＩｇ−ｈＧ２ａ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）内にクローニングし、発現ベクターＬＢ３００−３０２を作製した。ヒト化ＶＫ配列を遺伝子合成し、ヒトκ軽鎖の定常領域を含む発現ベクター内にクローニングし、発現ベクターＬＢ３０３−３０４を作製した。該重鎖及び軽鎖は、哺乳動物細胞での強力で構成的な発現のためのヒトＥＦ１αプロモーターの下流に存在させた。また、キメラ２Ｃ１０抗体をマウスのＶＨとＶＬを使用することによって同様にして構築し、それぞれ、発現ベクターＬＢ３０５及びＬＢ３０６を作製した。抗体発現ベクターを表４にまとめた。
表４ 抗体発現ベクター
Figure 0006976931
表４の各ベクターは、ヒトＥＦ１ａプロモーターの制御下の重鎖又は軽鎖発現カセットを含有している。ベクターＬＢ３００〜３０２、ＬＢ３０５はヒトＩｇＧ２重鎖の定常領域を含有しているものである。ベクターＬＢ３０８〜３０９はヒトＩｇＧ４重鎖の定常領域を含有しているものである。ベクターＬＢ３０３〜３０４、ＬＢ３０６はヒトκ軽鎖の定常領域を含有しているものである。
ヒト化ＩｇＧ４抗体の作製
潜在的エフェクター機能をさらに最小限に抑えるため、最良の結合活性を有するヒト化抗体（２Ｃ１０＿ｈ３と２Ｃ１０＿ｌ２）をヒトＩｇＧ４又は安定化ヒトＩｇＧ４（Ｓ２４１Ｐ）に変換させた。重鎖可変領域２Ｃ１０＿ｈ３をまず、安定化変異Ｓ２４１Ｐを導入する前に、ヒトＩｇＧ４重鎖の定常領域を含むベクターｐＦＵＳＥ−ＣＨＩｇ−ｈＧ４（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）内にクローニングした（表４）。ヒト化ＩｇＧ４及びＩｇＧ４（Ｓ２４１Ｐ）を、一過性トランスフェクション後に２９３Ｆ細胞から精製した。産生収量は、ＩｇＧ２抗体のものより２倍多い２５〜３５ｍｇ／Ｌであった。ＩｇＧ４抗体は少量の半分子を有するようであり、これは安定化ＩｇＧ４抗体では有意に少なかった。安定化ＩｇＧ４抗体のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を図２１に示す。
ＳｗｉＭＲ発現ベクターでのヒト化ＩｇＧ４（Ｓ２４１Ｐ）抗体のクローニング
ＳｗｉＭＲ発現は、抗体産生細胞株の容易な開発のために開発され、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）による高産生性細胞の単離を容易にするための切替可能な膜レポーターが使用された。膜アンカー型ＧＦＰのＩＲＥＳ媒介性バイシストロニック発現カセットを目的遺伝子（ＧＯＩ）の下流に配置した。ＩＲＥＳ−ＧＦＰカセットには、後で染色体から除去するためのＬｏｘＰ部位をフランキングさせた。ＧＦＰ発現レベルをＧＯＩの発現レベルの表示に使用した。高産生性細胞をＦＡＣＳによって単離し、次いでＣｒｅリコンビナーゼで処理し、ＧＦＰカセットを除去した。安定化ＩｇＧ４形式のヒト化２Ｃ１０をＳｗｉＭＲ発現系でクローニングし、ベクターＬＢ３１２を作製した。重鎖と軽鎖は、ヒトＥＦ１α プロモーターの制御下の２種類の別々の発現カセットでクローニングした。ＩＲＥＳ−ＧＦＰカセットを重鎖配列の下流に配置し、２つのＬｏｘＰ部位をフランキングさせた。このプラスミドには、哺乳動物細胞での選択のためのピューロマイシン耐性遺伝子と細菌増殖のためのβ−ラクタマーゼ遺伝子を担持させる。
ＣＨＯ細胞の安定な選択及び高産生性細胞の単離
１００ｍｌのＣＨＯＳ細胞（１×１０６細胞／ｍｌ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、１２０ｕｇのＬＢ３１２（Ａｓｃ Ｉの制限消化によって線状化）及び１２０ｕｌのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ Ｍａｘリージェント（ｒｅｇｅｎｔ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でトランスフェクトした。細胞を、１０〜２０ｕｇ／ｍｌのピューロマイシンにより２週間選択した。安定なプールのＧＦＰ発現プロフィールをフローサイトメトリーによって特性評価した。最高ＧＦＰシグナルを有する上位１％の細胞を、１００，０００個の細胞を含むプール番号１として選別した。２週間培養した後、プール番号１をＧＦＰ発現についてフローサイトメトリーによって再度解析した。再度、最高ＧＦＰシグナルを有する上位１％の細胞を、１００，０００個の細胞を含むプール番号２として選別した。２日間培養した後、プール番号２を２ｕＭの組換え膜透過性ＤＮＡリコンビナーゼＣｒｅ（ＴＡＴ−ＮＬＳ−Ｃｒｅ，Ｅｘｃｅｌｌｇｅｎ）で処理した。ＧＦＰ発現プロフィールを、１週間の培養後に解析した。約１０％の細胞において、染色体からのＧＦＰ発現カセットの成功裡の除去を示すＧＦＰ発現の完全な喪失が見られた。ＧＦＰ陰性細胞を、３８４ウェルプレート内に単独細胞として選別した。２週間後、１０×３８４ウェルプレートから約８００個のコロニーが成長した。
さらなるヒト化抗体
また、ＶＨ１−６９及びＶＬ１−３９ヒト生殖細胞系列フレームワーク内にクローニングした２種類のＣＤＲグラフト化ＶＨ配列と２種類のＣＤＲグラフト化ＶＬ配列を用いてヒト化抗体も作製した。本発明者らは、このさらなる実験において、２種類の重鎖（ＨＢ１とＨＢ２）及び２種類の軽鎖（ＫＢ１とＫＢ２）を作製した。この重鎖配列と軽鎖配列ＨＰ＋ＫＰを陽性対照として使用する。このような構築物の組合せをＨＥＫ２９３細胞において一過性発現させ、抗体をプロテインＡクロマトグラフィーによって精製し、ｈＣＤ４０結合について試験した。
図１４は、フレームワーク３における２Ｃ１０ＨＰ及び２Ｃ１０ＨＢ１並びに２Ｃ１０ＨＢ２構築物間のアミノ酸の違いを示す。図１５は、ヒト化２Ｃ１０抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の配列を示す。この重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は２Ｃ１０ＨＰ、２Ｃ１０ＨＢ１、２Ｃ１０ＨＢ２、２Ｃ１０ＫＰ、２Ｃ１０ＫＢ１及び２Ｃ１０ＫＢ２を含む。したがって、一部の特定の実施形態では、抗ＣＤ４０抗体は、以下のいずれかの２Ｃ１０Ｈ−Ｋの組合せ：
１．２Ｃ１０ＨＰ＋２Ｃ１０ＫＰ
２．２Ｃ１０ＨＢ１＋２Ｃ１０ＫＢ１
３．２Ｃ１０ＨＢ１＋２Ｃ１０ＫＢ２
４．２Ｃ１０ＨＢ１＋２Ｃ１０ＫＰ
５．２Ｃ１０ＨＢ２＋２Ｃ１０ＫＢ２
６．２Ｃ１０ＨＢ２＋２Ｃ１０ＫＢ１
７．２Ｃ１０ＨＢ２＋２Ｃ１０ＫＰ
８．２Ｃ１０ＨＰ＋２Ｃ１０ＫＢ１
９．２Ｃ１０ＨＰ＋２Ｃ１０ＫＢ２
を含むものであり得る。
精製抗体によるＣＤ４０のインビトロ結合
ヒト化抗体及びキメラ抗体を、１００又は２００ｍｌの２９３Ｆ細胞の一過性トランスフェクション後に精製した。抗体は、プロテインＡカラムを用いて、トランスフェクションの４日後に回収した条件培地から精製した。
ＣＤ４０結合速度論の測定
ＣＤ４０結合速度論を、Ｆｏｒｔｅ Ｂｉｏ（ｃｏｎｔｒａｃｔｅｄ ｔｏ Ａｒａｇｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で測定した。精製ＣＤ４０をビオチン化し、ストレプトアビジンバイオセンサー上に固定化した。
インビボ試験のためのバイオプロダクション
ＣＨＯ細胞のトランスフェクション及び安定的にトランスフェクトされた細胞の選択後、抗体をプロテインＡカラムによって精製した後、バッファー交換し（２０ｍＭクエン酸ナトリウム，５０ｍＭ ＮａＣｌ，５％マルトース，ｐＨ６．０）、０．２μｍで濾過した。プール番号１を、ＣＤ ＦｏｒｔｉＣＨＯ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中での２５Ｌ容ウェーブ式バッグ内培養（ｗａｖｅ ｂａｇ ｃｕｌｔｕｒｅ）のセットアップのために使用した。培養液は、３、５及び７日目に３回、１０％ＣＤ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｆｅｅｄ Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに供給した。精製抗体の最終収量は合計１．６ｇであった。抗体をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＳＥＣ−ＨＰＬＣ解析によって特性評価し、単量体抗体として９９．４％純粋であった。
細胞株の開発
単独細胞のコロニーを、３回のＥＬＩＳＡ及び１回のフェッドバッチ産生によってスクリーニングした。スクリーニングプロセス全体を通して、細胞をＣＤ ＦｏｒｔｉＣＨＯ培地中に維持した。３８４ウェルプレートのすべてのコロニーを９６ウェルプレート内に取り出した。各ウェルからの１．２μｌの培養培地を使用し、抗ヒトＦｃ抗体でコーティングしたＥＬＩＳＡプレート内で抗体をスクリーニングした。上位２４０個のクローンを１０個の２４ウェルプレート内で拡大培養した。５日間培養した後、１．２μｌの培養培地を再度、抗体レベルについてスクリーニングし、上位６０個のクローンを１０×６ウェルプレート内で拡大培養し、振盪インキュベータ内で培養した。５日間培養した後、６ウェルプレートを、細胞を１：１０で新たな一組に６ウェルプレート内に継代することにより二連にした。元の一組の６ウェルプレートの培養物を消衰まで増殖させた後、抗体レベルをＥＬＩＳＡによって測定した。二連の組の６ウェルプレートの上位２４個のクローンを３０ｍｌの培養液中で１２５ｍｌ容振盪フラスコ内で拡大培養した。クローンを３０ｍｌ容フェッドバッチ産生に供した。供給ストラテジーは、３、５、７、９及び１１日目に７．５％のＥｘ−Ｃｅｌｌ Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣＨＯ Ｆｅｅｄ １（Ｓｉｇｍａ）であった。上位のクローン３Ｃ９−Ｉ６は約１．２ｇ／Ｌの産生力価を示すものであった。
霊長類キメラ２Ｃ１０及びヒト化２Ｃ１０のインビトロ薬理学
本発明者らは、本発明者らのリード候補の以下の重要なインビトロ薬理学的属性：
・ＣＤ１５４−ＣＤ４０結合によって誘導されるＢ細胞活性化の抑制
・Ｂ細胞の直接活性化なし
・ＣＤ４０の高親和性拮抗薬（例えば、Ｋｄは約１０−１０Ｍ以下、約１０−１０Ｍ〜約１０−９Ｍ、又は本明細書に記載のとおりである）
を特定した。
新規な免疫処置アプローチ及び広範なインビトロスクリーニングアプローチにより、本発明者らは、このような基準を満たし、ヒトＣＤ４０に対する非枯渇性／非活性化性アンタゴニスト抗体である抗ＣＤ４０抗体を同定した。
インビトロ試験及びインビボ試験により、ヒト化形態は優れた特性を保持していることが確認された。
先のセクションに記載のように、２Ｃ１０ ｍＡｂは、ヒト重鎖及び軽鎖のフレームワーク内へのＣＤＲグラフティングによってヒト化した。元の２Ｃ１０ ｍＡｂの特性を維持するため、ヒト化２Ｃ１０構築物をＢｉａｃｏｒｅにより、ヒトＣＤ４０に対する親和性でスクリーニングした。上位３種類のヒト化２Ｃ１０抗体はすべて、親２Ｃ１０ ｍＡｂと比べておよそ２倍の親和性のわずかな低下を示した（表５）。最も重要なことには、これらはすべて、親２Ｃ１０ ｍＡｂの並外れて遅い解離速度を維持していた。これらの抗体の中でも、３９０ｐＭで最も高い親和性を示したクローン２．１８９．２をリードヒト化ｍＡｂ（ｈ２Ｃ１０）として選択した。
表５：ヒト化型の２Ｃ１０のＣＤ４０受容体結合速度論
Figure 0006976931
ヒト化２Ｃ１０の結合速度論を競合体と比較すると、ｈ２Ｃ１０の全体的な親和性は依然として、ナノモル範囲の親和性を有する競合体よりもかなり良好である。本発明者らはまた、ｈ２Ｃ１０の結合親和性を、ヒトＣＤ４０と前臨床評価で使用した非ヒト霊長類種のものに由来するＣＤ４０間でも比較した。図１６に示されるように、ｈ２Ｃ１０は、これらの霊長類種のＣＤ４０に対して同等の親和性を有する。
霊長類キメラ２Ｃ１０及びヒト化２Ｃ１０のインビボ特性評価
２Ｃ１０のインビボ薬力学、薬物動態及び診査的安全性評価をアカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）において、２Ｃ１０の霊長類キメラ構築物及び臨床候補ヒト化ｈ２Ｃ１０抗体を用いて実施した。インビトロ結合速度論に基づいたヒト化型リード２Ｃ１０（ｍＡｂ ２．１８９．２；ｈ２Ｃ１０）の選択後、本発明者らは、ｈ２Ｃ１０をアカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）でのＰＫ／ＰＤ試験に進め、そのさらなる特性を特性評価した。これらの試験（これは、極めて重要な広範な実験エンドポイントがカバーされている）で得られたデータによりｈ２Ｃ１０の優れた特性が明白に確立される。
ＰＤ、ＰＫ及び安全性エンドポイントを調べるアカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）での試験を終了した。主要なエンドポイント及び目的を含む試験計画の重要要素を表６（アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）での２Ｃ１０の薬力学（ＰＤ）、薬物動態学的（ＰＫ）及び安全性試験）にまとめる。主要転帰及び主要実験エンドポイントに関する関連する比較評価には：
・血中のＢリンパ球数及びＴリンパ球数に対する効果
・Ｔ細胞依存性抗原スカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）に対する体液性免疫応答に対する効果
・血中Ｂ細胞上のＣＤ４０受容体占有率（ＰＤ）
・薬物動力学（ＰＫ）
・抗薬物抗体（ＡＤＡ）の形成によって評価される免疫原性
・ＣＢＣ、血清化学検査及び完全検死を含む診査的毒物学的検査
を含めた。
表６．アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）での２Ｃ１０のＰＤ、ＰＫ及び安全性試験
Figure 0006976931
試験結果を以下のセクションにまとめる。ｈ２Ｃ１０は、Ｂ細胞枯渇なしでのＣＤ４０受容体活性化の選択的ブロックが治療的有益性をもたらすことが期待される病状の処置のために使用され得る。
Ｔ細胞媒介性免役に対する効果
ｈ２Ｃ１０がインビボでＴ細胞依存性抗体応答（ＴＤＡＲ）をブロックすることをインビボで証明するため、サルを、ｈ２Ｃ１０の投与後６時間目にＫＬＨで免疫処置した。その後、ＫＬＨに対する抗体力価を毎週測定した。
１０及び２５ｍｇ／ｋｇ用量のｈ２Ｃ１０をサルに投与した後、ＫＬＨ抗原刺激を行なった。ＩｇＧ及びＩｇＭの両方の抗ＫＬＨ力価を、処置後２８日目まで毎週測定した。図１７は、ヒト化型の２Ｃ１０で最大試験用量において、ほとんどの場合、１０ｍｇ／ｋｇ用量レベルでＫＬＨ抗体応答の完全阻害が得られたことを示す。ＩｇＭ応答及びＩｇＧ応答はどちらも抑制された。
Ｂ細胞に対する非枯渇性効果
アンタゴニストＣＤ４０抗体の開発における目標には標的のＣＤ４０＋細胞の枯渇を最小限にすることが含まれていたため、本発明者らは、リンパ球亜集団に対する効果、特にＢ細胞に対する効果を解析した。
また、１０又は２５ｍｇ／ｋｇのヒト化形態の２Ｃ１０（ｈ２Ｃ１０）でのサルの処置は、ＣＤ４０標的は、これらの濃度の抗体によって完全に飽和される（以下の受容体占有率のセクション参照）にもかかわらず、Ｂ細胞に対して認識可能な枯渇性効果を有しなかった。
Ｂ細胞上の２Ｃ１０結合部位の飽和が最終測定日（２８日目）まで持続したにもかかわらず、いずれかの用量のｈ２Ｃ１０を投与されたすべてのサルで、正常なＢリンパ球サブセット及びＴリンパ球サブセットが維持された（図１８）。このような結果は、サルにおいて、１０ｍｇ／ｋｇという低い用量の注射で２Ｃ１０が、そのＢ細胞（並びにおそらく単球及び他の抗原提示細胞）上の治療標的であるＣＤ４０に、望ましくないＢ細胞の枯渇を引き起こすことなく持続的に結合し得ることを示す。
２Ｃ１０がＢ細胞を枯渇させないことが示されたことは、３Ａ８及びＣｈｉ２２０のみならず競合体と比べたときの明白な利点を示唆する。
薬力学
ＣＤ４０受容体占有率
霊長類キメラ及びヒト化型の２Ｃ１０によるＣＤ４０標的の結合及び占有率を、ＣＤ２０＋ Ｂ細胞上のＣＤ４０に対して２Ｃ１０が利用可能な結合部位をフローサイトメトリーにより、蛍光標識した２Ｃ１０及び標識した非競合性抗ＣＤ４０抗体を用いて測定することにより調べた。血液試料を複数の日に、対照サル及び霊長類キメラＩｇＧ４又はヒト化２Ｃ１０のいずれかで処置したサルから採取し、ＦＡＣＳによって解析した。標的結合の度合（受容体占有率％）を直接、平均蛍光強度の記録値から計算した。
ヒト化２Ｃ１０抗体は、１０及び２５ｍｇ／ｋｇの単回用量で静脈内投与した。Ｂ細胞上の表面ＣＤ４０は３日目までに完全に飽和し、いずれかの用量のｈ２Ｃ１０が投与されたすべてのサルで、その効果が最終測定日（２８日目）まで持続した。ヒト化２Ｃ１０での処置後２８日目にサルから採取した血液のフローサイトメトリー解析の代表的なデータを図１９に示す。
このような結果は、１０ｍｇ／ｋｇという低い用量のｈ２Ｃ１０の単回注射で、Ｂ細胞上のＣＤ４０受容体が少なくとも２８日間、完全に飽和し得ることを示す。
薬物動力学及び抗薬物抗体応答
ＣＤ４０受容体占有率に基づいた２Ｃ１０の薬力学的効果と２Ｃ１０の薬物動態間の明白な関連性を確立するため、２Ｃ１０の血漿濃度を、受容体占有率を測定したものと同じ血液試料の血漿において測定した。また、血漿濃度の解析により、２Ｃ１０の薬物動態プロフィール、最も重要なことには、その血漿中での持続性（半減期によって測定）の特性評価が可能であった。この測定により、有効治療濃度を維持するために必要とされる投薬頻度の手引きがもたらされる。
１０ｍｇ／ｋｇ又は２５ｍｇ／ｋｇのいずれかのヒト化２Ｃ１０で処置したサルで測定された平均血清濃度を図２０にプロットしている。このデータは、動物が全試験期間、２Ｃ１０に曝露されたこと、及びヒト化２Ｃ１０がサルではおよそ１５日間（９〜２０日間の範囲）の半減期を有することを示す。この半減期は、霊長類における治療用抗体で予測されるものの範囲内であり、臨床試験において比較的低頻度の投薬スケジュール（例えば、２週間に１回以下）にする裏付けとなるはずである。完全なデータセットのさらなるモデル設計により、有効な抗体濃度を持続させるために必要とされる用量及び頻度のロバストな推定が、ｈ２Ｃ１０の初期の臨床試験において可能になる。
ヒト化２Ｃ１０の別の評価は、ｈ２Ｃ１０に対する抗体（ＡＤＡ）の生成の可能性であった。これは、ある種に由来するエピトープの生物製剤を異なる種（例えば、ヒト化ｍＡｂを霊長類に）投与し、該薬物の血漿からの急速な排出がもたらされた場合に起こり得る。この試験では、タイムコースプロフィールにおいて、試験中、測定可能な抗２Ｃ１０力価を示す動物はいなかったため、ｈ２Ｃ１０に対する抗体が生成される形跡はみられなかった。
予備安全性評価
このセクションに記載した実験は、免疫機構及びオフターゲット効果に対するｈ２Ｃ１０の有害な帰結の可能性を調べるために実施した。生物学的療法では、このような評価は、ヒトを薬物に曝露する前の安全性を評価するため、及び臨床試験のためのリスク軽減計画を作成するためにとりわけ最も重要である。サルの免疫機能又は病態において予期しない転帰又は望ましくない転帰がなんら存在しないことは、ｈ２Ｃ１０の全体的安全性評価が良好であると考えられる。また、２Ｃ１０で処置したサルにおいて、血液検査パラメータ、例えば血小板計数及び血清化学検査パラメータの変化についての常套的な試験を投与後、何日か実施し、キメラ２Ｃ１０及びヒト化２Ｃ１０での処置による影響はなかった。２５ｍｇ／ｋｇの霊長類キメラ２Ｃ１０で２回処置した２匹の動物を、処置に関連する病態の肉眼的及び鏡検的形跡について評価した；処置に関連する病理学的変化は観察されなかった。また、血栓塞栓性（ｔｈｒｏｍｏｂｏｅｍｏｌｉｃ）合併症を除外するため、すべての組織を、繊維素沈着について特殊な染色によって検査した。無症候性凝固異常の形跡は検出されなかった。重要なことには、ＣＤ４０受容体を完全に占有するために必要とされる用量を明らかに超えており、したがって、ＩＮＤ承認（−ｅｎａｂｌｉｎｇ）フェーズにおいて実施される重要な毒物学試験で試験される用量レベルに近い比較高い用量が本試験において試験された。この予備安全性評価はｈ２Ｃ１０の安全性になんら問題がないことを示す。
これらの統合的データは、関連する霊長類モデルにおいて、ｈ２Ｃ１０が、ＣＤ４０＋標的細胞の不要な活性化又は枯渇を引き起こすことなく、及びオフターゲット毒性の形跡なくＣＤ４０活性化の特異的阻害が所望される患者の処置が意図されたモノクローナル抗体のための望ましい薬力学的、薬物動態学的及び安全性の属性を有することを示す。
本発明の特定の態様を説明し、図示したが、かかる態様は、本発明の実例にすぎず、添付の特許請求の範囲に従って解釈される本発明を限定するものでないとみなされたい。本明細書に挙げた刊行物及び特許出願はすべて、引用によりその全体があらゆる目的のために、あたかも個々の各刊行物又は特許出願が具体的に個々に示されて引用によりあらゆる目的のために組み込まれているかのごとく本明細書に組み込まれる。前述の本発明を、明瞭な理解を目的とした例示及び実施例によってある程度詳細に説明したが、当業者には、本発明の教示に鑑みると、添付の特許請求の範囲の趣旨及び範囲から逸脱することなく一定の変更及び修正がなされ得ることが容易に自明であろう。

Claims (57)

  1. 配列番号：２１に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号：２３に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ヒト化抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片。
  2. 前記抗体又はその抗原結合断片の解離定数（ＫＤ）が約１×１０−９Ｍ未満である、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  3. 前記抗体又はその抗原結合断片が：（ａ）完全体の免疫グロブリン分子；（ｂ）ｓｃＦｖ；（ｃ）Ｆａｂ断片；（ｄ）Ｆ（ａｂ’）２；及び（ｅ）ジスルフィド結合Ｆｖからなる群より選択される、請求項1又は２に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  4. 前記抗体又はその抗原結合断片が：ａ）ＩｇＧの定常ドメイン；及び（ｂ）ＩｇＡの定常ドメインからなる群より選択される少なくとも１つの定常ドメインを含むものである、請求項１〜３のいずれか１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  5. 前記抗体又はその抗原結合断片が少なくとも１つのヒト定常ドメインを含むものである、請求項１〜４のいずれか１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  6. 前記抗体又はその抗原結合断片がＣＤ４０細胞外ドメインに結合するものである、請求項１〜５のいずれか１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  7. 前記ＣＤ４０がヒト又はアカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ）のＣＤ４０である、請求項１〜６のいずれか１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  8. ＣＤ１５４発現ジャーカット細胞によるＢリンパ球の活性化をインビトロでブロックするものである、請求項１〜７のいずれか１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  9. Ｂリンパ球のＣＤ２３、ＣＤ８０又はＣＤ８６の発現を阻害するものである、請求項１〜８のいずれか１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  10. 請求項１〜９のいずれか１に記載の抗体又はその抗原結合断片をコードしているポリヌクレオチド。
  11. 請求項１０に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  12. 請求項１１に記載のベクターを含む細胞。
  13. 請求項１〜９のいずれか１に記載の抗体又はその抗原結合断片、請求項１０に記載のポリヌクレオチド、請求項１１に記載のベクター、又は請求項１２に記載の細胞；及び、薬学的に許容され得る担体を含む組成物。
  14. 免疫機構の抑制、移植拒絶反応の処置もしくは予防的処置、又は移植拒絶反応が起こるまでの持続時間の長期化を、それを必要とする被験体において行なう用途に用いるための、請求項１３に記載の組成物。
  15. 前記被験体が臓器移植を受けた被験体であるか、又は臓器移植を必要としている被験体である、請求項１４に記載の組成物。
  16. 前記臓器が、心臓、腎臓、肺、肝臓、膵臓、腸及び胸腺又はその一部分からなる群より選択される、請求項１５に記載の組成物。
  17. 前記被験体が組織移植を受けた被験体であるか、又は組織移植を必要としている被験体である、請求項１４に記載の組成物。
  18. 前記組織が骨、腱、角膜、皮膚、心臓の弁、静脈又は骨髄である、請求項１７に記載の組成物。
  19. 移植の前の投与のために製剤化されている、請求項１４に記載の組成物。
  20. 移植後、少なくとも１ヶ月間継続する投与のために製剤化されている、請求項１４に記載の組成物。
  21. 移植後、少なくとも６ヶ月間継続する投与のために製剤化されている、請求項２０に記載の組成物。
  22. 移植片対宿主病の処置又は予防的処置を、それを必要とする被験体において行なう用途に用いるための、請求項１３に記載の組成物。
  23. 自己免疫性障害の処置又は予防的処置を、それを必要とする被験体において行なう用途に用いるための、請求項１３に記載の組成物。
  24. 前記自己免疫性障害が自己抗体の存在と関連しているもの、又は自己抗体の存在によって引き起こされるものである、請求項２３に記載の組成物。
  25. 前記自己免疫性障害が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ＣＲＥＳＴ症候群（石灰沈着症、レイノー症候群、食道運動障害、強指症及び毛細血管拡張症）、オプソクローヌス、炎症性ミオパチー（例えば、多発性筋炎、皮膚筋炎及び封入体筋炎）、全身性強皮症、原発性胆汁性肝硬変、セリアック病（例えば、グルテン過敏性腸疾患）、疱疹状皮膚炎、ミラー・フィッシャー症候群、急性運動性軸索型ニューロパチー（ＡＭＡＮ）、伝導ブロックを伴う多巣性運動ニューロパチー、自己免疫性肝炎、抗リン脂質抗体症候群、ウェゲナー肉芽腫症、顕微鏡的多発血管炎、チャーグ・ストラウス症候群、関節リウマチ、慢性自己免疫性肝炎、硬化性筋炎、重症筋無力症、ランバート・イートン筋無力症候群、橋本甲状腺炎、グレーブス病、傍腫瘍性小脳変性症、スティッフパーソン症候群、辺縁系脳炎、アイザックス症候群、シデナム舞踏病、小児自己免疫性溶連菌関連性精神神経疾患（ＰＡＮＤＡＳ）、脳炎、１型真性糖尿病、視神経脊髄炎、悪性貧血、アジソン病、乾癬、炎症性腸疾患、乾癬性関節炎、シェーグレン症候群、紅斑性狼瘡（例えば、円板状紅斑性狼瘡、薬物誘発性紅斑性狼瘡及び新生児紅斑性狼瘡）、多発性硬化症、反応性関節炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、多発性内分泌腺不全、シュミット症候群、自己免疫性ブドウ膜炎、副腎炎、甲状腺炎、自己免疫性甲状腺疾患、胃萎縮、慢性肝炎、ルポイド肝炎、アテローム性動脈硬化症、初老期認知症、脱髄疾患、亜急性皮膚紅斑性狼瘡、副甲状腺機能低下症、ドレスラー症候群、自己免疫性血小板減少症、特発性血小板減少性紫斑病、溶血性貧血、尋常性天疱瘡、天疱瘡、円形脱毛症、類天疱瘡、強皮症、全身性進行性硬化症、成人発症型真性糖尿病（例えば、ＩＩ型糖尿病）、男性及び女性の自己免疫性不妊症、強直性脊椎関節炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、混合結合組織病、結節性多発性動脈炎、全身性壊死性血管炎、若年発症型関節リウマチ、糸球体腎炎、アトピー性皮膚炎、アトピー性鼻炎、グッドパスチャー症候群、シャーガス病、サルコイドーシス、リウマチ熱、喘息、反復流産、抗リン脂質抗体症候群、農夫肺、多形性紅斑、開心後症候群、クッシング症候群、自己免疫性慢性活動性肝炎、鳥飼病、アレルギー性疾患、アレルギー性脳脊髄炎、中毒性表皮壊死症、脱毛症、アルポート症候群、肺胞炎、アレルギー性肺胞炎、線維化性肺胞炎、間質性肺疾患、結節性紅斑、壊疽性膿皮症、輸血副作用、ハンセン病、マラリア、リーシュマニア症、トリパノソーマ症、高安動脈炎、リウマチ性多発性筋痛、側頭動脈炎、住血吸虫症、巨細胞性動脈炎、回虫症、アスペルギルス症、サンプター症候群、湿疹、リンパ腫様肉芽腫症、ベーチェット病、カプラン症候群、川崎病、デング熱、心内膜炎、心内膜心筋線維症、眼内炎、持久性隆起性紅斑、胎児赤芽球症、好酸球性筋膜炎、シュルマン症候群、フェルティ症候群、フィラリア症、毛様体炎、慢性毛様体炎、異時性毛様体炎、フックス毛様体炎、ＩｇＡ腎症、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、移植片対宿主病、移植拒絶反応、ヒト免疫不全ウイルス感染、エコーウイルス感染、心筋症、アルツハイマー病、パルボウイルス感染、風疹ウイルス感染、ワクチン接種後症候群、先天性風疹感染、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫、腎細胞癌、多発性骨髄腫、イートン・ランバート症候群、再発性多発性軟骨炎、悪性黒色腫、クリオグロブリン血症、ワルデンストレームマクログロブリン血症、エプスタイン−バーウイルス感染、おたふく風邪、エヴァンズ症候群、並びに自己免疫性腺機能不全からなる群より選択される、請求項２３に記載の組成物。
  26. 前記被験体がヒトである、請求項１４に記載の組成物。
  27. 非経口、静脈内、皮下、筋肉内、経皮、経口、経表面、髄腔内又は局所投与のために製剤化されている、請求項１４に記載の組成物。
  28. 前記用途が、さらに、前記抗体又はその抗原結合断片の投与の６ヶ月以内における免疫抑制薬の投与を含む、請求項１４に記載の組成物。
  29. 前記免疫抑制薬が、カルシニューリン阻害薬、タクロリムス、ｍＴｏｒ阻害薬、フィンゴリモド、マイリオシン、アレムツズマブ、リツキシマブ、抗ＣＤ４モノクローナル抗体、抗ＬＦＡ１モノクローナル抗体、抗ＬＦＡ３モノクローナル抗体、抗ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ１９抗体、モナバタセプト、ベラタセプト、インドリル−ＡＳＣ；アザチオプリン、リンパ球免疫グロブリン及び抗胸腺細胞グロブリン［ウマ］、ミコフェノール酸モフェチル、ミコフェノール酸ナトリウム、ダクリズマブ、バシリキシマブ、シクロホスファミド、プレドニゾン、プレドニゾロン、レフルノミド、ＦＫ７７８、ＦＫ７７９、１５−デオキシスペルグアリン、ブスルファン、フルダラビン、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、１５−デオキシスペルグアリン、ＬＦ１５−０１９５、ブレディニン、ブレキナール、並びにムロモナブ−ＣＤ３からなる群より選択される、請求項２８に記載の組成物。
  30. 前記カルシニューリン阻害薬がシクロスポリンＡ又はシクロスポリンＧである、請求項２９に記載の組成物。
  31. 前記ｍＴｏｒ阻害薬がシロリムス、テムシロリムス、ゾタロリムス又はエベロリムスである、請求項２９に記載の組成物。
  32. 前記抗ＣＤ４５抗体が抗ＣＤ４５ＲＢ抗体である、請求項２９に記載の組成物。
  33. 前記免疫抑制薬がベラタセプトである、請求項２９に記載の組成物。
  34. 前記組成物と前記免疫抑制薬が互いに１ヶ月以内に投与されるためのものである、請求項２９に記載の組成物。
  35. 前記組成物と前記免疫抑制薬が互いに１週間以内に投与されるためのものである、請求項３４に記載の組成物。
  36. 前記被験体がヒトである、請求項２２に記載の組成物。
  37. 非経口、静脈内、皮下、筋肉内、経皮、経口、経表面、髄腔内又は局所投与のために製剤化されている、請求項２２に記載の組成物。
  38. 前記用途が、さらに、前記組成物の投与の６ヶ月以内における免疫抑制薬の投与を含む、請求項２２に記載の組成物。
  39. 前記免疫抑制薬が、カルシニューリン阻害薬、タクロリムス、ｍＴｏｒ阻害薬、フィンゴリモド、マイリオシン、アレムツズマブ、リツキシマブ、抗ＣＤ４モノクローナル抗体、抗ＬＦＡ１モノクローナル抗体、抗ＬＦＡ３モノクローナル抗体、抗ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ１９抗体、モナバタセプト、ベラタセプト、インドリル−ＡＳＣ；アザチオプリン、リンパ球免疫グロブリン及び抗胸腺細胞グロブリン［ウマ］、ミコフェノール酸モフェチル、ミコフェノール酸ナトリウム、ダクリズマブ、バシリキシマブ、シクロホスファミド、プレドニゾン、プレドニゾロン、レフルノミド、ＦＫ７７８、ＦＫ７７９、１５−デオキシスペルグアリン、ブスルファン、フルダラビン、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、１５−デオキシスペルグアリン、ＬＦ１５−０１９５、ブレディニン、ブレキナール、並びにムロモナブ−ＣＤ３からなる群より選択される、請求項３８に記載の組成物。
  40. 前記カルシニューリン阻害薬がシクロスポリンＡ又はシクロスポリンＧである、請求項３９に記載の組成物。
  41. 前記ｍＴｏｒ阻害薬がシロリムス、テムシロリムス、ゾタロリムス又はエベロリムスである、請求項３９に記載の組成物。
  42. 前記抗ＣＤ４５抗体が抗ＣＤ４５ＲＢ抗体である、請求項３９に記載の組成物。
  43. 前記免疫抑制薬がベラタセプトである、請求項３９に記載の組成物。
  44. 前記組成物と前記免疫抑制薬が互いに１ヶ月以内に投与されるためのものである、請求項３９に記載の組成物。
  45. 前記組成物と前記免疫抑制薬が互いに１週間以内に投与されるためのものである、請求項４４に記載の組成物。
  46. 前記被験体がヒトである、請求項２３に記載の組成物。
  47. 非経口、静脈内、皮下、筋肉内、経皮、経口、経表面、髄腔内又は局所投与のために製剤化されている、請求項２３に記載の組成物。
  48. 前記用途が、さらに、前記組成物の投与の６ヶ月以内における免疫抑制薬の投与を含む、請求項２３に記載の組成物。
  49. 前記免疫抑制薬が、カルシニューリン阻害薬、タクロリムス、ｍＴｏｒ阻害薬、フィンゴリモド、マイリオシン、アレムツズマブ、リツキシマブ、抗ＣＤ４モノクローナル抗体、抗ＬＦＡ１モノクローナル抗体、抗ＬＦＡ３モノクローナル抗体、抗ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ１９抗体、モナバタセプト、ベラタセプト、インドリル−ＡＳＣ；アザチオプリン、リンパ球免疫グロブリン及び抗胸腺細胞グロブリン［ウマ］、ミコフェノール酸モフェチル、ミコフェノール酸ナトリウム、ダクリズマブ、バシリキシマブ、シクロホスファミド、プレドニゾン、プレドニゾロン、レフルノミド、ＦＫ７７８、ＦＫ７７９、１５−デオキシスペルグアリン、ブスルファン、フルダラビン、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、１５−デオキシスペルグアリン、ＬＦ１５−０１９５、ブレディニン、ブレキナール、並びにムロモナブ−ＣＤ３からなる群より選択される、請求項４８に記載の組成物。
  50. 前記カルシニューリン阻害薬がシクロスポリンＡ又はシクロスポリンＧである、請求項４９に記載の組成物。
  51. 前記ｍＴｏｒ阻害薬がシロリムス、テムシロリムス、ゾタロリムス又はエベロリムスである、請求項４９に記載の組成物。
  52. 前記抗ＣＤ４５抗体が抗ＣＤ４５ＲＢ抗体である、請求項４９に記載の組成物。
  53. 前記免疫抑制薬がベラタセプトである、請求項４９に記載の組成物。
  54. 前記組成物と前記免疫抑制薬が互いに１ヶ月以内に投与されるためのものである、請求項４９に記載の組成物。
  55. 前記組成物と前記免疫抑制薬が互いに１週間以内に投与されるためのものである、請求項５４に記載の組成物。
  56. 請求項１〜９のいずれか１に記載の抗体又はその抗原結合断片を含む単離ポリペプチド。
  57. 請求項１〜９のいずれか１に記載の抗体又はその抗原結合断片の作製方法であって：
    （ａ）請求項１〜９のいずれか１に記載の抗体又はその抗原結合断片をコードしているポリヌクレオチドで形質転換した細胞を、培養培地中で、前記ポリヌクレオチドが発現される条件下で培養する工程；及び
    （ｂ）ポリペプチドを前記細胞又は培養培地から回収する工程
    を含む方法。
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