BR112018004296B1 - anticorpos anti-cd40 humanizados e usos dos mesmos - Google Patents

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Yu Bo
Reimann Keith
Wang Rijian
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Primatope Therapeutics Inc
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Abstract

a presente descrição refere-se a anticorpos anti-cd40, tais como, anticorpos anti-cd40 humanizados, que podem ser usados em vários métodos terapêuticos, profiláticos e diagnósticos. os anticorpos geralmente bloqueiam a capacidade de cd440 a se ligar a cd154 e sem a ativação da célula que expressa cd440 (por exemplo, célula b). os presentes anticorpos ou fragmentos dos mesmos podem ser usados para reduzir as complicações associadas a transplante de órgão ou tecido.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para:
“ANTICORPOS ANTI-CD40 HUMANIZADOS E USOS DOS MESMOS Referência Cruzada ao Pedido Relacionado [001] Este pedido reivindica prioridade para o Pedido Provisório U.S. n° 62/214.411, depositado em 4 de setembro de 2015, cuja descrição é aqui incorporada por referência em sua totalidade.
Listagem de Sequência [002] Este pedido contém uma Listagem De Sequências que foi depositada eletronicamente no formato ASCII e é incorporada por referência em sua totalidade. A cópia ASCII, criada em 1° de setembro de 2016, é denominada 11212-005211WO0_SL.txt e tem 33.948 bytes de tamanho.
Campo [003] A invenção refere-se a anticorpos anti-CD40 humanizados e usos de tais anticorpos, por exemplo, para reduzir a probabilidade de, ou tratar, a rejeição de transplante, para induzir imunossupressão ou para tratar um distúrbio autoimune.
Fundamentos da Invenção [004] A supressão do sistema imune, particularmente do sistema imune humoral, é benéfica no transplante de órgãos e no tratamento de distúrbios autoimunes. O transplante de órgãos surgiu como um método preferido de tratamento para muitas formas de doenças potencialmente fatais que envolvem
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2/149 danos aos órgãos. Contudo, a rejeição de transplante pode ocorrer quando um organismo que recebe células ou tecido transplantado monta uma resposta imune indesejada a esse tecido. A rejeição de transplante pode ser minimizada pela correspondência do tipo de tecido, mas mesmo o tecido combinado pode ser rejeitado pelo doador. Assim, as terapias imunossupressoras são usadas atualmente para praticamente todos os casos de transplante de tecidos.
[005] Os melhores resultados no transplante clínico foram alcançados principalmente através do desenvolvimento de drogas imunossupressoras não específicas cada vez mais potentes para inibir as respostas de rejeição. Enquanto os resultados de curto prazo melhoraram, os resultados a longo prazo permanecem inadequados. Agentes imunossupressores ao longo da vida podem ser necessários para combater a rejeição crônica do órgão transplantado, e o uso desses agentes aumenta drasticamente os riscos de doenças cardiovasculares, infecções e malignidades.
[006] Um alvo potencial para reduzir a rejeição de transplante é a interação CD40/CD154. O CD40 é expressado principalmente na superfície de linfócitos B e outras células apresentadoras de antígenos (APCs), como células dendríticas e macrófagos. O CD154 é expressado principalmente na superfície de células T. A interação entre estas duas proteínas é associada à ativação de células B, que
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3/149 desencadeia a expressão de citocinas, bem como a expressão de marcadores de superfície celular, incluindo CD23, CD80 e CD86. Kehry M. R., sinalização mediada por CD40 em células B. Equilibrar a sobrevivência, o crescimento e a morte das células. J. Immunol. 1996; 156: 2345-2348. O bloqueio desta interação usando anticorpos anti-CD154 demonstrou reduzir ou eliminar a rejeição de tecidos transplantados em primatas não humanos.
[007] Para qualquer tipo de imunossupressão (por exemplo, em um procedimento de transplante), um equilíbrio entre a eficácia e a toxicidade é um fator chave para sua aceitação clínica. Assim, existe uma necessidade de terapias que alvejem especificamente as vias imunológicas envolvidas, por exemplo, na rejeição de transplantes e distúrbios autoimunes.
Sumário [008] A presente descrição fornece um anticorpo humanizado anti-CD40, ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada, em que a região variável de cadeia pesada compreende três CDR, CDR1, CDR2 e CDR3, tendo sequências de aminoácidos cerca de 80% a cerca de 100% idênticas a sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOs: 13, 14 e 15, respectivamente.
[009] A presente descrição também fornece um anticorpo humanizado anti-CD40, ou uma porção de ligação a
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4/149 antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia leve compreende três CDR, CDR1, CDR2 e CDR3, tendo sequências de aminoácidos cerca de 80% a cerca de 100% idênticas às sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOs: 16, 17 e 18, respectivamente.
[0010] Também englobado pela presente descrição, um anticorpo anti-CD40 humanizado, ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade (CDR), CDR1, CDR2 e CDR3, tendo sequências de aminoácidos de cerca de 80% a cerca de 100% idênticas às sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOs: 13, 14 e 15, respectivamente, e em que a região variável de cadeia leve compreende três CDRs, CDR1 , CDR2 e CDR3, tendo sequências de aminoácidos cerca de 80% a cerca de 100% idênticas às sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOs: 16, 17 e 18, respectivamente.
[0011] A presente descrição fornece um anticorpo humanizado anti-CD40, ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de cerca de 80% a cerca de 100% idêntica a qualquer uma das
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5/149 sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOs: 11, 19, 20, 21, 24, 25 e 26.
[0012] A presente descrição fornece um anticorpo humanizado anti-CD40, ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos de cerca de 80% a cerca de 100% idêntica a qualquer uma das sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOs: 12, 22, 23, 27, 28 e 29.
[0013] A presente descrição fornece um anticorpo humanizado anti-CD40, ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de cerca de 80% a cerca de 100% idêntica a qualquer uma das sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOs: 11, 19, 20, 21, 24, 25 e 26, e em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos de cerca de 80%
a cerca de 100% idêntica a qualquer uma das sequências de
aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOs: 12, 22, 23, 27, 28
e 29.
[0014] A presente descrição fornece um anticorpo
anti-CD40 humanizado, ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada e
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6/149 uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de cerca de 80% a cerca de 100% idêntica a qualquer uma das sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOs: 19, 20 e 21, e em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos com cerca de 80% a cerca de 100% idêntica a qualquer uma das sequências de aminoácidos estabelecido nas SEQ ID NOs: 22 e 23.
[0015] A presente descrição fornece um anticorpo humanizado anti-CD40, ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de cerca de 80% a cerca de 100% idêntica a qualquer uma das sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOs: 24, 25 e 26, e em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos de cerca de 80% a cerca de 100% idêntica a qualquer das sequências de aminoácidos estabelecidas nas SEQ ID NOs: 27, 28 e 29.
[0016] A presente descrição fornece um anticorpo humanizado anti-CD40, ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de cerca de 80% a cerca de 100% idêntica a sequências de
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7/149 aminoácidos apresentadas na SEQ ID NO: 21, e em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos com cerca de 80% a cerca de 100% idêntica a sequências de aminoácidos apresentadas na SEQ ID NO: 23.
[0017] A constante de dissociação (KD) do anticorpo, ou porção de ligação a antígeno do mesmo, pode ser menor que cerca de 1 x 10-9 M ou menor que cerca de 1 x 10-8 M.
[0018] O presente anticorpo ou porção de ligação a antígeno do mesmo pode ser: (a) uma molécula de imunoglobulina completa; (b) um scFv; (c) um fragmento Fab; (d) um F(ab')2; e/ou (e) um Fv ligado por dissulfeto.
[0019] O presente anticorpo ou porção de ligação a antígeno do mesmo pode compreender pelo menos um domínio constante selecionado de: a) um domínio constante de IgG; e (b) um domínio constante de IgA.
[0020] O presente anticorpo ou porção de ligação a antígeno do mesmo pode compreender pelo menos um domínio constante humano.
[0021] O presente anticorpo ou porção de ligação a antígeno do mesmo pode se ligar a domínio extracelular de CD40.
[0022] O CD40 pode ser humano ou rhesus CD40.
[0023] O presente anticorpo ou porção de ligação a antígeno do mesmo pode bloquear a ativação de linfócitos B por células Jurkat que expressam CD154 in vitro.
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8/149 [0024] O presente anticorpo ou porção de ligação a antígeno do mesmo pode inibir a expressão de linfócitos B CD23, CD80 ou CD86.
[0025] Também abrangido pela presente descrição é uma composição compreendendo o presente anticorpo ou porção de ligação a antígeno do mesmo, e pelo menos um carreador farmaceuticamente aceitável.
[0026] A presente descrição fornece um polinucleotídeo que codifica o presente anticorpo ou porção de ligação a antígeno do mesmo. A presente descrição fornece um vetor compreendendo o presente polinucleotídeo e uma célula compreendendo o vetor.
[0027] A presente descrição fornece um polipeptídeo isolado compreendendo o presente anticorpo ou porção de ligação a antígeno do mesmo.
[0028] É também englobado pela presente descrição, um método de produção do presente anticorpo ou da porção de ligação a antígeno do mesmo. O método pode compreender as seguintes etapas: (a) cultivar as presentes células em meio de cultura sob condições, em que o polinucleotíideo que codifica o presente anticorpo ou a porção de ligação a antígeno do mesmo é expressada, produzindo assim pelo menos um polipeptídeo compreendendo o anticorpo ou porção de ligação a antígeno do mesmo; e (b) recuperar o polipeptídeo das células ou do meio de cultura.
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9/149 [0029] A presente descrição também fornece um método de suprimir o sistema imune em um indivíduo, compreendendo a etapa de administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz do presente anticorpo ou da porção de ligação a antígeno do mesmo.
[0030] A presente descrição fornece um método para tratar ou tratar profilaticamente uma rejeição de transplante, ou aumentar a duração do tempo antes da ocorrência da rejeição do transplante, em um indivíduo em necessidade do mesmo, o método compreendendo a etapa de administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz do presente anticorpo ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo.
[0031] A presente descrição fornece um método para tratar ou tratar profilaticamente o enxerto versus hospedeiro em um indivíduo com necessidade do mesmo, o método compreendendo a etapa de administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz do presente anticorpo ou da porção de ligação a antígeno do mesmo.
[0032] A presente descrição fornece um método para tratar ou tratar profilaticamente um distúrbio autoimune em um indivíduo com necessidade do mesmo, o método compreendendo a etapa de administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz do presente anticorpo ou da porção de ligação a antígeno do mesmo.
[0033] O indivíduo pode ter recebido, ou necessita
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10/149 de, um transplante de órgão e/ou um transplante de tecido. O órgão pode ser um coração, rim, pulmão, fígado, pâncreas, intestino e timo, ou uma porção do mesmo. O tecido pode ser osso, tendão, córnea, pele, válvula do coração, veia ou medula óssea.
[0034] O indivíduo pode ser um humano ou um mamífero.
[0035] A administração pode ser iniciada antes do transplante. A administração pode continuar por pelo menos um mês após o transplante. A administração pode continuar por pelo menos seis meses após o transplante do enxerto.
[0036] O distúrbio autoimune pode estar associado ou causado pela presença de um autoanticorpo.
[0037] O distúrbio autoimune pode ser lúpus eritematoso sistêmico (LES), síndrome CREST (calcinose, síndrome de Raynaud, dismotilidade esofágica, esclerodactilia e telangiectasia), opsoclonia, miopatia inflamatória (por exemplo, polimiosite, dermatomiosite e miosite de corpo de inclusão), esclerodermia sistêmica, cirrose biliar primária, doença celíaca (por exemplo, enteropatia sensível a glúten), dermatite herpetiforme, síndrome de Miller-Fisher, neuropatia axonal motora aguda (AMAN), neuropatia motora multifocal com bloqueio de condução, hepatite autoimune, síndrome antifosfolipídica, granulomatose de Wegener, poliangeíte microscópica, Síndrome de Churg-Strauss, artrite reumatóide, hepatite autoimune
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11/149 crônica, escleromiosite, miastenia gravis, síndrome miastênica de Lambert-Eaton, tireoidite de Hashimoto, doença de Graves, degeneração cerebelar paraneoplásica, síndrome da pessoa rígida, encefalite límbica, síndrome de Isaacs, coréia de Sydenham, doença neuropsiquiátrica autoimune pediátrica associado a Streptococcus (PANDAS), encefalite, diabetes mellitus tipo 1 e/ou neuromielite óptica.
[0038] O distúrbio autoimune pode ser anemia perniciosa, doença de Addison, psoríase, doença inflamatória intestinal, artrite psoriásica, síndrome de Sjogren, lúpus eritematoso (por exemplo, lúpus eritematoso discóide, lúpus eritematoso induzido por drogas e lúpus eritematoso neonatal), esclerose múltipla e/ou artrite reativa.
[0039] O distúrbio autoimune pode ser polimiosite, dermatomiosite, falência endócrina múltipla, síndrome de Schmidt, uveíte autoimune, adrenalite, tireoidite, doença tireoidiana autoimune, atrofia gástrica, hepatite lupoide, aterosclerose, demência pré-senil, doenças desmielinizantes, lúpus eritematoso cutâneo subagudo, hipoparatireoidismo, síndrome de Dressler, trombocitopenia autoimune, púrpura trombocitopênica idiopática, anemia hemolítica, pênfigo vulgar, pênfigo, alopecia areata, penfigoide, escleroderma, esclerose sistêmica progressiva, diabetes mellitus de início na idade adulta (por exemplo, diabetes tipo II), infertilidade autoimune masculina e feminina, espondilite
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12/149 anquilosante, colite ulcerativa, doença de Chron, doença mista do tecido conjuntivo, poliarterite nodosa, vasculite necrosante sistêmica, artrite reumatoide de início na fase juvenil, glomerulonefrite, dermatite atópica, rinite atópica, síndrome de Goodpasture, doença de Chagas, sarcoidose, febre reumática, asma, aborto recorrente, Síndrome antifosfolípide, pulmão de fazendeiro, eritema multiforme, síndrome de pós-cardiotomia, síndrome de Cushing, hepatite ativa crônica autoimune, pulmão de caçador, doença alérgica, encefalomielite alérgica, necrólise epidérmica tóxica, alopecia, síndrome de Alport, alveolite, alveolite alérgica, alveolite fibrosante, doença pulmonar intersticial, eritema nodoso, pioderma gangrenoso, reação à transfusão, lepra, malária, leishmaniose, tripanossomíase, artrite de Takayasu, polimialgia reumática, arterite temporal, esquistossomose, arterite de células gigantes, ascaríase, aspergilose, síndrome de Sampter, eczema, granulomatose linfomatoide, doeça de Behcet, síndrome de Caplan, doença de Kawasaki, dengue, endocardite, fibrose endomíniocardial, endoftalmite, eritema elevatum diutinum, eritroblastose fetal, fasciite eosinofílica, síndrome de shulman, síndrome de Felty, filaríase, ciclite, ciclite crônica, ciclite heterocrônica, ciclite de Fuch, neuropatia por IgA, púrpura Henoch-Schonlein, doença de enxerto versus hospedeiro, rejeição de transplante, infecção
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13/149 por vírus da imunodeficiência humana, infecção por ecovírus, cardiomiopatia, doença de Alzheimer, infecção por parvovírus, infecção por vírus da rubéola congênita, linfoma de Hodgking e de não Hodgking, carcinoma de célula renal, mieloma múltiplo, síndrome de Eaton-Lammbert, policondrite recorrente, melanoma maligno, crioglobulinemia, macroglobulinemia de Waldernstrom, infecção por vírus
Epstein-Barr, caxumba, síndrome de Evan, e falha gonodal
autoimune.
[0040] A administração pode ser parentérica,
intravenosa, subcutânea, intramuscular, transdérmica, oral, tópica, intratecal ou local.
[0041] O presente método pode ainda compreender a administração de um imunossupressor dentro de seis meses da administração do presente anticorpo ou porção de ligação a antígeno do mesmo.
[0042] O imunossupressor pode ser um inibidor de
calcineurina, tracolimo, um inibidor mTor, fingolimod,
myriocin, alemtuzumab, rituximab, um anticorpo monoclonal
anti-CD4, um anticorpo monoclonal anti-LFA1, um anticorpo
monoclonal anti-LFA3, um anticorpo anti-CD45, um anticorpo
anti-CD19, monoabatacept, belatacept, indolil-ASC;
azatioprina, imunoglobulina de linfócito e globulina antitimócito [equina], mofetil micofenolato, micofenolato de sódio, daclizumabe, basiliximab, ciclofosfamida, prednisona,
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14/149 prednisolona, leflunomida, FK778, FK779, 15desoxispergualina, LF15-0195, bredinina, brequinar, e muromonab-CD3. O inibidor de calcineurina pode ser ciclosporina A ou ciclosporina G. O inibidor mTor pode ser sirolimus, temsirolimus, zotarolimus ou everolimus. O anticorpo anti-CD45 pode ser um anticorpo anti-CD45RB. Em uma modalidade, o imunossupressor é belatacept.
[0043] O presente anticorpo ou porção de ligação a antígeno do mesmo e o imunossupressor podem ser administrados dentro de um mês, ou dentro de uma semana, um do outro.
Breve Descrição dos Desenhos [0044] A Figura 1 mostra as regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve do anticorpo 2C10. A sequência de nucleotídeos mostrada para a cadeia pesada (SEQ ID NO: 1) inclui um peptídeo de sinal (nucleotídeos 1-57; sublinhado) e a sequência variável de cadeia pesada (nucleotídeos 58396). A sequência de aminoácidos correspondente é mostrada abaixo (SEQ ID NO: 2), em que os aminoácidos 1-19 correspondentes à sequência sinal (sublinhada) e os aminoácidos 20-132 correspondem à região variável de cadeia pesada.
[0045] A sequência de nucleotídeos mostrada para a cadeia leve (SEQ ID NO: 3) inclui um peptídeo de sinal (nucleotídeos 1-66; sublinhado) e a sequência variável de cadeia leve (nucleotídeos 67-384). A sequência de
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15/149 aminoácidos correspondente é mostrada abaixo (SEQ ID NO: 4), em que os aminoácidos 1-22 correspondem ao peptídeo de sinal (sublinhado) e os aminoácidos 23-128 correspondem à região variável de cadeia leve.
[0046] A Figura 2a é um gráfico que mostra dados de citometria de fluxo confirmando a ligação de 2C10 a células B CD20+ humanas e de rhesus.
[0047] A Figura 2b é um gráfico mostrando dados de adsorção de CD40 de ensaios de ELISA com concentrações variáveis de 2C10 para confirmar a ligação de 2C10 a CD40 humano e de rhesus como detectado usando IgG-HRP anticamundongo de cabra.
[0048] A Figura 3 é um gráfico que mostra a inibição dependente da dose da ligação de CD154 a células B humanas por 2C10. As células B foram analisadas quanto a ligação de CD154 através da incubação com CD154 solúvel marcado com
histidina e analisando a expressão de histidina. Os
resultados são representativos de múltiplas repetições do
experimento .
[0049] A Figura 4 é um diagrama esquemático e
gráficos mostrando o princípio do ensaio envolvendo células mononucleares de sangue periférico humano (PBMCs) e células Jurkat.
[0050] A Figura 5 é um conjunto de gráficos que mostram a expressão de CD23 em células CD20+ retiradas de
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16/149 co-culturas de PBMCs de rhesus e células Jurkat na presença de concentrações variáveis de anticorpos 3A8, 5C8 ou 2C10.
[0051] A Figura 6 é um conjunto de gráficos que mostram a expressão de CD86 em células CD20+ tiradas de coculturas de PBMCs humanas e células Jurkat na presença de concentrações variáveis de anticorpos 3A8, 5C8 ou 2C10.
[0052] A Figura 7 é um conjunto de gráficos que mostram células CD20+ de expressão de CD23 de PBMCs humanas ou de rhesus cultivadas sem células Jurkat na presença do anticorpo 3A8 ou 2C10.
[0053] A Figura 8 é um gráfico que mostra a contagem de células B periféricas de macacos rhesus tratados com formas quiméricas camundongo-rhesus de 2C10 manipuladas por engenharia para conter regiões constantes de cadeia pesada de IgG1 (2C10R1) ou IgG4 (2C10R4) de rhesus e formas de IgG1 quiméricas de 3A8 anti-CD40 (3A8R1) ou Chi220 anti-CD40 (Chi220).
[0054] A Figura 9 é um gráfico que mostra as respostas de anticorpos dependentes de células T em macacos macaca, tratados com anticorpo 2C10R1, 2C10R4 ou 3A8R1. Todos os animais foram imunizados com hemocianina de Lapa Californiana conjugada com 4-hidroxi-3-nitrofenilacetila (KLH) após o primeiro tratamento com anticorpo.
[0055] A Figura 10 é um diagrama que mostra que o modelo padrão de macaca de transplante de ilhotas alogênicas
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17/149 foi induzido em macacos macaca usando estreptozotocina. Macacos diabéticos foram transplantados com ilhotas alogênicas e imunossupressão iniciada com basiliximab e sirolumus. Animais experimentais receberam tratamento com 2C10R4 nos dias 0 e 7 pós-transplante.
[0056] A Figura 11a é um gráfico mostrando os níveis de glicose no sangue livre (FBG) em 4 macacas após transplante de ilhotas, imunossupressão de fundo e tratamento com 2C10R4. A linha sólida no gráfico representa o nível de 2C10 no plasma.
[0057] A Figura 11b é um gráfico mostrando FBG em macacas que receberam apenas imunossupressão de fundo.
[0058] A Figura 12 é um gráfico mostrando resultados de um ensaio de bloqueio competitivo usando PBMCs humanas incubadas com concentrações crescentes de anticorpos 2C10, 3A8 ou Chi220 e coradas com um 2C10 conjugado com APC para avaliar a capacidade de cada anticorpo em bloquear cruzadamente 2C10.
[0059] As Figuras 13a e 13b mostram o alinhamento de sequências de regiões variáveis 2C10 humanizadas. Figura 13a: A sequência VH de 2C10 de murino foi alinhada contra a linhagem germinativa humana VH1-3 e três sequências humanizadas 2C10_h1, 2C10_h2 e 2C10_h3. Figura 13b: A sequência VL de 2C10 de murino foi alinhada contra a linhagem germinativa humana VH3-11 e duas sequências humanizadas
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2C10_l1 e 2C10_l2. As CDRs de 2C10 estão em negrito. Os
resíduos de murino em sequências humanizadas estão
sublinhados.
[0060] A Figura 14 mostra as alterações de
aminoácidos na armação 3 entre 2C10HP e 2C10HB1, bem como
construções 2C10HB2.
[0061] A Figura 15 mostra as sequências de regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve para anticorpos 2C10 humanizados. As regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve incluem 2C10HP, 2C10HB1, 2C10HB2, 2C10KP, 2C10KB1 e 2C10KB2.
[0062] A Figura 16 mostra a afinidade de ligação do anticorpo 2C10 humanizado a CD40 de diferentes espécies de primatas. Os anticorpos 2C10 humanizados (h2C10) foram imobilizados na superfície do chip CM5 por acoplamento de amina. Diferentes concentrações de fusões de CD40-MBP de humano, rhesus e babuíno foram analisadas quanto à afinidade em um BIACore 3000. A afinidade de ligação foi calculada com o software BIAevaluation versão 4.1.1.
[0063] A Figura 17 mostra que a indução da resposta de anticorpos anti-KLH (IgM e IgG) foi determinada em macacos imunizados com KLH, 3 horas após receberem solução salina, 10 ou 25 mg/kg de h2C10. Todos os animais de controle exibiram respostas de anticorpos IgG ou IgM ao antígeno de KLH. Macacos individuais tratados com 10 mg/kg, mas nenhum
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19/149 animal tratado com 25 mg/kg de 2C10 desenvolveu respostas de anticorpos IgG ou IgM a KLH.
[0064] Figura 18. O sangue total foi usado para a fenotipagem dos subconjuntos de linfócitos B e T após o tratamento com 25 mg/kg de h2C10 (linha de cima) ou 10 mg/kg de h2C10 (linha do meio) ou animais de controle (linha de baixo). Nenhuma dose de h2C10 teve qualquer efeito aparente nas populações de linfócitos. A ausência de esgotamento apreciável de células B também foi evidente na avaliação precoce de resposta à dose da forma quimérica de primatas que incluiu uma análise detalhada de populações de células B maduras e imaturas.
[0065] Figura 19. Dia 28 sítios de ligação de CD40 totalmente saturados com 2C10 humanizado em células B. O H2C10 administrado in vivo bloqueou completamente a ligação da ligação de 2C10 marcada de modo flurescente às células B. Os dados ilustram os resultados de macacos de controle tratados com 2C10 e humanizados 28 dias após uma dose única de 25 mg/kg (linha de cima), 10 mg/kg (linha do meio) ou 0 mg/kg (controle; linha de baixo). Resultados semelhantes foram obtidos nos dias 3, 7, 14 e 21 após a infusão.
[0066] Figura 20. Média das concentrações séricas de h2C10 por até 28 dias após o tratamento de macacos com 10 ou 25 mg/kg. As concentrações de 2C10 diminuem lentamente ao longo do tempo, e os níveis são detectados ao longo de toda
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20/149 a duração do estudo.
[0067] As Figuras 21a e 21b mostram as sequências de DNA e de aminoácidos do 2C10 humanizado (h2C10) no formato de IgG4 estabilizada. A Figura 21a mostra as sequências de DNA e aminoácidos de cadeia pesada. A Figura 21b mostra as sequências de DNA e aminoácidos de cadeia leve. SEQ ID NO: 32: Sequência de DNA de cadeia pesada; SEQ ID NO: 33: sequência de aminoácidos de cadeia pesada; SEQ ID NO: 34: Sequência de DNA de cadeia leve; SEQ ID NO: 35: sequência de aminoácidos de cadeia leve.
Descrição Detalhada [0068] A presente descrição refere-se a anticorpos anti-CD40 e fragmentos de anticorpo (por exemplo, porções de ligação a antígeno do anticorpo) que podem ser usados em diversos métodos terapêuticos, profiláticos, de diagnóstico e outros métodos. Os anticorpos podem bloquear a capacidade do CD40 para se ligar ao CD154 e fazê-lo sem ativar a célula que expressa CD40 (por exemplo, uma célula B). Os presentes anticorpos ou fragmentos dos mesmos podem ser usados para reduzir as complicações associadas ao transplante de órgãos ou tecidos.
[0069] Os anticorpos ou porções de ligação a antígeno dos mesmos, incluem, mas não estão limitados a anticorpos humanizados, anticorpos humanos, anticorpos monoclonais, anticorpos quiméricos, anticorpos policlonais, anticorpos
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21/149 expressados de forma recombinante, assim como porções de ligação a antígeno do anterior. Uma porção de ligação a antígeno de um anticorpo pode incluir uma porção de um anticorpo que se liga especificamente a CD40.
[0070] A presente descrição também fornece composições e métodos para reduzir a probabilidade de rejeição de transplantes, tratar a rejeição de transplantes, induzir imunossupressão e/ou tratar um distúrbio autoimune. As composições contêm anticorpos ou fragmentos dos mesmos que se ligam especificamente a CD40.
[0071] Em uma modalidade, a presente descrição fornece um método de tratamento ou melhoria da doença de enxerto versus hospedeiro e/ou rejeição de transplante em um indivíduo compreendendo a administração ao mamífero de uma composição compreendendo um anticorpo da invenção (ou o seu fragmento) em uma quantidade suficiente para diminuir um ou mais dos sintomas da doença de enxerto versus hospedeiro e/ou da rejeição do transplante no indivíduo.
[0072] Em outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno é administrado a um indivíduo tendo uma doença inflamatória ou um distúrbio imune, tal como uma doença autoimune. A doença inflamatória ou doença autoimune pode estar associada a células que expressam CD40.
[0073] A invenção apresenta métodos para reduzir a probabilidade de rejeição de transplante, tratar a rejeição
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22/149 de transplantes, induzir imunossupressão e/ou tratar um distúrbio autoimune em um indivíduo, administrando ao indivíduo o presente anticorpo ou porção de ligação a antígeno do mesmo em uma quantidade eficaz.
[0074] É também englobado pela presente descrição um método para bloquear a função de CD40 em um mamífero compreendendo administrar ao mamífero uma composição compreendendo os presentes anticorpos ou porções de ligação a antígeno dos mesmos, em uma quantidade suficiente para bloquear uma resposta imune mediada por CD40 no mamífero.
[0075] Outro método da descrição refere-se inibir o crescimento e/ou a diferenciação de células que expressam CD40, compreendendo a administração do presente anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno a células, em que a ligação do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno a CD40 inibe o crescimento e/ou a diferenciação das células.
[0076] A presente descrição fornece um método para tratar um indivíduo tendo um distúrbio associado a CD40, compreendendo administrar ao indivíduo o presente anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, em que a ligação do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno a CD40 inibe o crescimento e/ou a diferenciação de células do distúrbio associado a CD40. As células podem ser, mas não estão limitadas a, células linfoblastoides B, células pancreáticas, de pulmão, células de mama, células ovarianas,
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23/149 células do cólon, células da próstata, células da pele, células da cabeça e pescoço, células da bexiga, células do osso ou células do rim.
[0077] O presente método pode ser usado para tratar leucemia linfocítica crônica, linfoma de Burkitt, mieloma múltiplo, um linfoma de células T, linfoma não-Hodgkin, doença de Hodgkin, macroglobulinemia de Waldenstrom ou sarcoma de Kaposi.
[0078] Métodos adicionais da presente descrição incluem a inibição da produção de anticorpos por células B em um indivíduo compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-CD40 ou o seu fragmento da presente descrição. Em uma modalidade, o anticorpo é administrado em uma quantidade eficaz para inibir a diferenciação de células B e a comutação do isótipo de anticorpo no indivíduo. Em outra modalidade, o anticorpo é administrado em uma quantidade eficaz para inibir a produção de citocinas e quimiocinas, e/ou inibir a regulação positiva de moléculas de aderência em células T e macrófagos no indivíduo. Em uma terceira modalidade, o anticorpo é administrado em uma quantidade eficaz para inibir a ativação de células dendríticas no indivíduo.
[0079] Além do presente anticorpo ou do seu fragmento, os presentes métodos podem ainda compreender a administração de um segundo agente terapêutico tal como um
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24/149 imunossupressor, um antagonista do fator de necrose tumoral (um antagonista do TNF), um antagonista de CTLA4, um anticorpo receptor anti-IL-6, um anticorpo anti-CD20, ou uma combinação do mesmos.
[0080] Os presentes anticorpos ou porções de ligação a antígeno dos mesmos, podem ligar-se especificamente a CD40 humano e/ou a CD40 de rhesus, incluindo o CD40 humano recombinante e nativo.
[0081] Como aqui usado, uma célula que expressa CD40 é qualquer célula caracterizada pela expressão de superfície de CD40, incluindo, mas não limitada a, células B normais e neoplásicas, células interdigitantes, células epiteliais basais, células de carcinoma, macrófagos, células endoteliais, células dendríticas foliculares, células das amígdalas e células plasmáticas derivadas da medula óssea.
Anticorpos humanizados [0082] O anticorpo humanizado da presente descrição é um anticorpo de uma espécie não humana, onde as sequências de aminoácidos nas regiões de ligação a antígeno (e/ou as regiões de ligação a antígeno) foram alteradas de modo que o anticorpo se assemelhe mais a um anticorpo humano, e ainda mantém sua capacidade de ligação original.
[0083] Uma região variável de cadeia leve ou pesada de anticorpo consiste em três regiões hipervariáveis, referidas como regiões determinantes de complementaridade
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25/149 (CDRs). As CDRs são suportadas dentro das regiões variáveis por regiões de armação (FRs). Em uma modalidade, a região variável de cadeia pesada (ou região variável de cadeia leve) contêm três CDRs e quatro regiões de armação (FRs), arranjadas do terminal amino ao terminal carboxila na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Kabat, E.A., et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, Departamento de Saúde e de serviços Humanos dos EUA, Publicação NIH No. 91-3242, 1991. Chothia, C. et al., J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987.
[0084] Em certas modalidades, os anticorpos humanizados são moléculas de anticorpo de espécies não humanas com uma, duas, três ou todas as CDR da espécie não humana e uma, duas, três, quatro ou todas as regiões de armação de uma molécula de imunoglobulina humana.
[0085] As CDRs dos presentes anticorpos ou porções de ligação a antígeno dos mesmos podem ser de uma fonte não humana ou humana. A armação dos presentes anticorpos ou porções de ligação a antígeno dos mesmos pode ser humana, humanizada, não humana (por exemplo, uma armação de murino modificada para diminuir a antigenicidade em humanos) ou uma armação sintética (por exemplo, uma sequência de consenso). Em uma modalidade, os presentes anticorpos, ou porções de ligação a antígeno dos mesmos, contêm pelo menos uma região variável de cadeia pesada e/ou pelo menos uma região variável
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26/149 de cadeia leve.
[0086] Os anticorpos humanizados da presente descrição podem ser produzidos por métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, um anticorpo humanizado pode ter um ou mais resíduos de aminoácidos introduzidos a partir de uma fonte que não humana. Estes resíduos de aminoácidos não humanos são muitas vezes referidos como resíduos de importação, que são tipicamente retirados de um domínio variável de importação. A humanização pode ser realizada seguindo o método de Winter e colaboradores (Jones et al., Nature 321: 522-5, 1986; Riechmann et al., Nature 332: 3237, 1988; Verhoeyen et al., Science 239: 1534-6, 1988), substituindo sequências da região hipervariável para as sequências correspondentes de um anticorpo humano. Consequentemente, em tais anticorpos humanizados, substancialmente menos do que um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Em certas modalidades, os anticorpos humanizados são anticorpos humanos em que pelo menos alguns resíduos da região hipervariável, bem como outros resíduos da região variável, são substituídos por resíduos de sítios análogos em anticorpos não humanos.
[0087] A escolha de domínios variáveis humanos, leves e pesados, a serem usados na produção de anticorpos humanizados, pode reduzir a antigenicidade. De acordo com o
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27/149 método de melhor ajuste, a sequência do domínio variável de um anticorpo não humano (por exemplo, roedor, tal como camundongo) é triada contra toda a biblioteca de sequências do domínio variável humano conhecidas. A sequência humana que está mais próxima da do não humano é então aceita como armação humana para o anticorpo humanizado. Ver, por exemplo, Sims et al., J. Immunol. 151: 2296-308, 1993; Chothia et al., J. Mol. Biol. 196: 901-17, 1987. Outro método usa uma armação particular derivada da sequência de consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo particular de cadeias leves ou pesadas. A mesma armação pode ser usada para vários anticorpos humanizados diferentes. Ver, por exemplo, Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 89:4285-9, 1992; Presta et al., J. Immunol. 151:2623-32, 1993.
[0088] Os anticorpos humanizados podem ser gerados substituindo sequências da região variável que não estão diretamente envolvidas na ligação a antígeno com sequências equivalentes de regiões variáveis humanas. Esses métodos incluem isolar, manipular e expressar as sequências de ácido nucleico que codificam a totalidade ou parte de regiões variáveis de pelo menos uma cadeia pesada ou leve. As fontes desse ácido nucleico são bem conhecidas dos habilitados na técnica e, por exemplo, podem ser obtidas a partir de um hibridoma que produz um anticorpo contra o CD40. O DNA recombinante que codifica o anticorpo humanizado, ou
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28/149 fragmento do mesmo, pode então ser clonado em um vetor de expressão apropriado.
[0089] Em outro exemplo, uma vez obtidos anticorpos não humanos (por exemplo, de murinos), as regiões variáveis podem ser sequenciadas e a localização das CDRs e dos resíduos da armação determinada. Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, Departamento de Saúde e de serviços Humanos dos EUA,, Publicação NIH No. 91-3242. Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol., 196:901-917. As regiões variáveis de cadeia leve e pesada podem, opcionalmente, ser ligadas a regiões constantes correspondentes. As moléculas de anticorpo enxertadas com CDR podem ser produzidas por enxerto de CDR ou substituição de CDR. Uma, duas, três ou todas as CDRs de uma cadeia de imunoglobulina podem ser substituídas. Por exemplo, todas as CDRs de um anticorpo particular podem ser de pelo menos uma porção de um animal não humano (por exemplo, camundongo, tal como, CDRs mostradas na Tabela 1) ou apenas algumas das CDRs podem ser substituídas. É apenas necessário manter as CDRs requeridas para ligação do anticorpo a um antígeno predeterminado (por exemplo, CD40). Morrison, S. L., 1985, Science, 229: 1202-1207. Oi et al., 1986, BioTechniques, 4: 214. Patentes U.S. Nos 5.585.089; 5.225.539; 5.693.761 e 5.693.762. EP 519596. Jones et al., 1986, Nature, 321: 552-525. Verhoeyan et al., 1988, Science,
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239: 1534. Beidler et al., 1988, J. Immunol., 141: 40534060.
[0090] Pode ser desejável que os anticorpos sejam humanizados com retenção de alta afinidade para o antígeno e outras propriedades biológicas favoráveis. Para atingir este objetivo, de acordo com um método, os anticorpos humanizados são preparados por um processo de análise das sequências precursoras e vários produtos humanizados conceituais usando modelos tridimensionais das sequências precursoras e humanizadas. Os modelos tridimensionais de imunoglobulinas estão vulgarmente disponíveis e são familiares para os habilitados na técnica. Estão disponíveis programas de computador que ilustram e exibem prováveis armações conformacionais tridimensionais de sequências de imunoglobulina candidatas selecionadas. A inspeção destas exibições permite a análise do papel provável dos resíduos no funcionamento da sequência de imunoglobulina candidata, i.e., a análise de resíduos que influencia a capacidade da imunoglobulina candidata se ligar ao seu antígeno. Deste modo, os resíduos de FR podem ser selecionados e combinados a partir das sequências receptoras e de importação, de modo que seja obtida a característica desejada do anticorpo, tal como afinidade aumentada para o(s) antígeno(s) alvo.
[0091] Em algumas modalidades, um anticorpo antiCD40 humanizado também inclui pelo menos uma porção de uma
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30/149 região constante de imunoglobulina, tipicamente a de uma imunoglobulina humana. Em uma modalidade, o anticorpo conterá a cadeia leve, e também pelo menos o domínio variável de uma cadeia pesada. O anticorpo também pode incluir um ou mais do domínio constante CH1, dobradiça, CH2, CH3 e/ou CH4 da cadeia pesada, conforme apropriado.
[0092] Em alguns aspectos da presente descrição, um ou mais domínios dos anticorpos humanizados serão expressados por via recombinante. Tal expressão recombinante pode empregar uma ou mais sequências de controle, isto é, sequências de polinucleotídeos necessárias para a expressão de uma sequência de codificação operativamente ligada em um organismo hospedeiro particular. As sequências de controle adequadas para uso em células procarióticas incluem, por exemplo, sequências de sítios de ligação promotoras, operadoras e de ribossoma. Sequências de controle eucarióticas incluem, mas não estão limitadas a, sinais promotores, de poliadenilação e intensificadores. Estas sequências de controle podem ser utilizadas para expressão e produção de anticorpo anti-CD40 humanizado em células hospedeiras procarióticas e eucarióticas.
[0093] Também são abrangidos pela presente descrição anticorpos ou porções de ligação a antígeno dos mesmos, contendo uma, duas ou todas as CDRs como aqui descritas, com as outras regiões substituídas por sequências de pelo menos
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31/149 uma espécie diferente incluindo, mas não se limitando a, humano, coelhos, ovelhas, cães, gatos, vacas, cavalos, cabras, porcos, macacos, símios, gorilas, chimpanzés, patos, gansos, galinhas, anfíbios, répteis e outros animais.
Anticorpos humanos [0094] Os anticorpos humanos da descrição podem ser construídos combinando sequência(s) do domínio variável do clone Fv selecionadas de bibliotecas de exibição de fagos derivadas de humanos com sequência(s) conhecida(s) do domínio constante humano (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol. 227: 381 -8, 1992, Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-97, 1991). Alternativamente, os anticorpos humanos podem ser preparados pelo método do hibridoma. Linhagens de células de mieloma humano e heteromieloma de camundongo-humano para a produção de anticorpos monoclonais humanos foram descritas, por exemplo, por Kozbor, J. Immunol. 133: 3001-5, 1984; Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, págs. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, 1987); e Boerner et al, J. Immunol. 147:86-95, 1991.
[0095] É possível produzir animais transgênicos (por exemplo, camundongos) que são capazes, após imunização, de produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulina endógena. Por exemplo, foi descrito que a eliminação homozigótica do gene da região de união de cadeia pesada do anticorpo (JH) em
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32/149 camundongos quiméricos e mutantes da linhagem germinativa resulta na inibição completa da produção de anticorpos endógenos. A transferência da matriz de genes de imunoglobulina da linhagem germinativa humana em tais camundongos mutantes da linhagem germinativa resultará na produção de anticorpos humanos após o desafio com o antígeno. Ver, por exemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551-5, 1993; Jakobovits et al., Nature 362:255-8, 1993; Brüggemann et al., Year Immunol. 7:33-40, 1993.
[0096] O embaralhamento de genes pode também ser usado para derivar anticorpos humanos de anticorpos não humanos, por exemplo, de roedores, em que o anticorpo humano tem afinidades e especificidades semelhantes ao anticorpo não humano de partida. De acordo com este método, que também é denominado “imprinting epitópico”, a região variável de cadeia pesada ou leve de um fragmento de anticorpo não humano obtido por técnicas de exibição de fago como aqui descrito é substituída por um repertório de genes do domínio V humano, criando uma população de quimeras de Fab ou scFv de cadeias não humana/cadeia humana. A seleção com antígeno resulta no isolamento de um scFv ou Fab quimérico de cadeia não humana/cadeia humana onde a cadeia humana restaura o sítio de ligação a antígeno destruído na remoção da cadeia não humana correspondente no clone primário de exibição de fagos, isto é, o epítopo governa (imprints) a escolha do parceiro
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33/149 de cadeia humana. Quando o processo é repetido para substituir a cadeia não humana restante, é obtido um anticorpo humano (ver Publicação PCT WO 93/06213). Ao contrário da humanização tradicional de anticorpos não humanos por enxerto de CDR, esta técnica fornece anticorpos completamente humanos, que não têm resíduos de FR ou CDR de origem não humana.
Anticorpos quiméricos [0097] Um anticorpo quimérico é uma molécula na qual diferentes porções são derivadas de diferentes espécies animais. Por exemplo, um anticorpo pode conter uma região variável derivada de um anticorpo de murino e uma região constante de imunoglobulina humana. Anticorpos quiméricos podem ser produzidos por técnicas de DNA recombinante. Morrison et al., Proc Natl Acad Sci, 81:6851-6855 (1984). Por exemplo, um gene que codifica uma molécula de anticorpo monoclonal de murino (ou outra espécie) é digerido com enzimas de restrição para remover a região que codifica o Fc de murinho, e a porção equivalente de um gene que codifica uma região constante de Fc humana é substituída. Anticorpos quiméricos também podem ser criados por técnicas de DNA recombinante em que o DNA que codifica as regiões V de murino pode ser ligado ao DNA que codifica as regiões constantes humanas. Better et al., Science, 1988, 240: 1041-1043. Liu et al. PNAS, 1987 84: 3439-3443. Liu et al., J. Immunol.,
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1987, 139:3521-3526. Sun et al. PNAS, 1987, 84: 214-218. Nishimura et al., Canc. Res., 1987, 47: 999-1005. Wood et al. Nature, 1985, 314: 446-449. Shaw et al., J. Natl. Cancer Inst., 1988, 80: 1553-1559. Publicações de Patente Internacional Nos WO1987002671 e WO 86/01533. Pedido de Patente Europeu Nos 184.187; 171.496; 125.023; e 173.494. Patente U.S. No 4.816.567.
Regiões Variáveis e CDRs [0098] As regiões variáveis de cadeia pesada, regiões variáveis de cadeia leve e CDRs do anticorpo 2C10 de murino e de certos anticorpos anti-CD40 humanizados, são mostradas na Tabela 1.
Tabela 1 SEQ ID NOs: 11 - 31
Nome Cadeia, Região Sequência SEQ ID NO.
2C10 Cadeia QVQLQQSGAELAKPGASVKMSCKASGYTFTNYWMHWVKQRPGQGLE 11
(anticorpo pesada, WIGYINPSNDYTKYNQKFKDKATLTADKSSNTAYMQLGSLTSEDSA
de murino) região variável VYYCARQGFPYWGQGTLVTVSA
2C10 Cadeia leve, região variável QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYHQRSGTSPKRW IYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCHQLSS DPFTFGSGTKLEIK 12
2C10 Cadeia pesada, CDR1 YTFTNYWMH 13
2C10 Cadeia pesada, CDR2 YINPSNDYTKYNQKFKD 14
2C10 Cadeia pesada, CDR3 QGFPY 15
2C10 Cadeia leve, SASSSVSYMH 16
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CDR1
2C10 Cadeia leve, CDR2 DTSKLAS 17
2C10 Cadeia leve, CDR3 HQLSSDPFT 18
2C10_h1 Cadeia pesada, região variável QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMHWVRQAPGQRLE WMGYINPSNDYTKYNQKFKDRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTA VYYCAR QGFPYWGQGTLVTVSS 19
2C10_h2 Cadeia pesada, região variável QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASG YTFTNYWMH WVRQAPGQRLEWMG YINPSNDYTKYNQKFKD RVTITADKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR QGFPY WGQGTLVTVSS 20
2C10_h3 Cadeia pesada, região variável QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASG YTFTNYWMH WVRQAPGQRLEWIG YINPSNDYTKYNQKFKD RATLTADKSANTAYM ELSSLRSEDTAVYYCAR QGFPY WGQGTLVTVSS 21
2C10_l1 Cadeia leve, região variável EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC SASSSVS_______YMH WYQQKPGQAPRLLIY DTSKLAS GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC HQLSSDPFT FGGGTKVEIK 22
2C10_l2 Cadeia leve, região variável EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC SASSSVSYMH WYQQKPGQAPRRWIY DTSKLAS GVPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYC HQLSSDPFT FGGGTKVEIK 23
2C10HP Cadeia pesada, região variável QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMHWVRQAPGQRLE WIGYINPSNDYTKYNQKFKDRATLTADKSANTAYMELSSLRSEDTA VYYCARQGFPYWGQGTLVTVSS 24
2C10HB1 Cadeia pesada, região variável QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMHWVRQAPGQRLE WIGYINPSNDYTKYNQKFKDRATLTADTSTNTAYMELSSLRSEDTA VYYCARQGFPYWGQGTLVTVSS 25
2C10HB2 Cadeia pesada, região variável QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTNYWMHWVRQAPGQGLE WIGYINPSNDYTKYNQKFKDKATITADESTNTAYMELSSLRSEDTA VYYCARQGFPYWGQGTLVTVSS 26
2C10KP Cadeia leve, região variável EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSYMHWYQQKPGQAPRRW IYDTSKLASGVPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCHQLSS DPFTFGGGTKVEIK 27
2C10KB1 Cadeia leve, DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCSASSSVSYMHWYQQKPGKAPKLL 28
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região variável IYDTSKLASGVPARFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCHQLSS DPFTFGQGTKVEVK
2C10KB2 Cadeia leve, região variável EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSYMHWYQQKPGQAPRLL IYDTSKLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCHQLSS DPFTFGQGTKLEIK 29
VH1-3 Cadeia pesada, região variável QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYAMHWVRQAPGQRLE WMGWINAGNGNTKYSQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTA VYYCARWGQGTLVTVSS 30
VK3-11 Cadeia leve, região variável EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRL LIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCFGGG TKVEIK 31
[0099] Em certas modalidades, os anticorpos ou porções de ligação a antígeno incluem uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 99%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99% ou cerca de 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada como estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 11, 19, 20, 21, 24, 25 e 26.
[00100] Em certas modalidades, os anticorpos ou porções de ligação a antígeno incluem uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo
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37/149 menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 99%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85% , cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99% ou cerca de 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve como estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 12, 22, 23, 27, 28 e 29.
[00101] Em certas modalidades, cada um dos anticorpos ou de porções de ligação a antígeno dos mesmos inclui uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 99%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99% ou cerca de 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada como apresentado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 11, 19, 20, 21,
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24, 25 e 26, e uma região variável de cadeia leve incluindo uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 99%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99% ou cerca de 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos de cadeia leve variável como estabelecido nas SEQ ID NOs: 12, 22, 23, 27, 28 e 29.
[00102] Uma região variável de cadeia pesada dos anticorpos ou porções de ligação a antígeno dos mesmos pode compreender uma, duas, três ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDR) que são pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 99%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99% ou cerca de 100% idênticas a CDRs de uma região variável de cadeia pesada do anticorpo
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2C10 (CDR1, CDR2 e CDR3 como apresentado nas SEQ ID NOs: 13, 14, 15, respectivamente).
[00103] Uma região variável de cadeia leve dos anticorpos ou porções de ligação a antígeno dos mesmos pode compreender uma, duas, três ou mais CDRs que sejam pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 99%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99% ou cerca de 100% idênticas a CDRs de uma região variável de cadeia leve do anticorpo 2C10 (CDR1, CDR2 e CDR3 como estabelecido nas SEQ ID NOs: 16, 17, 18, respectivamente).
[00104] Uma região variável de cadeia pesada dos presentes anticorpos, ou porções de ligação a antígeno dos mesmos, pode compreender uma, duas, três ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDR) que são pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 99%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de
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87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99% ou cerca de 100% idênticas às CDRs de uma região variável de cadeia pesada do anticorpo 2C10 (CDR1, CDR2 e CDR3 como estabelecido nas SEQ ID NOs: 13, 14, 15 , respectivamente), e uma região variável de cadeia leve dos anticorpos ou porções de ligação a antígeno dos mesmos podem compreender uma, duas, três ou mais CDRs que são pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo 99%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99% ou cerca de 100% idênticas às CDRs de uma região variável de cadeia leve do anticorpo 2C10 (CDR1, CDR2 e CDR3 como estabelecido nas SEQ ID NOs: 16, 17, 18, respectivamente).
[00105] Uma região variável de cadeia pesada dos anticorpos ou porções de ligação a antígeno dos mesmos pode incluir três CDRs que são pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 99%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de
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80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99% ou cerca de 100% idênticas às CDRs de uma região variável de cadeia pesada do anticorpo 2C10 (CDR1, CDR2 e CDR3 como estabelecido nas SEQ ID NOs: 13, 14, 15, respectivamente).
[00106] Em uma modalidade, uma região variável de cadeia leve dos anticorpos ou porções de ligação a antígeno dos mesmos inclui três CDRs que são pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 99%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99% ou cerca de 100% idênticas às CDRs de uma região variável de cadeia leve do anticorpo 2C10 (CDR1, CDR2 e CDR3 como estabelecido nas SEQ ID NOs: 16, 17, 18, respectivamente).
[00107] Em uma modalidade, uma região variável de cadeia pesada dos anticorpos ou porções de ligação a antígeno dos mesmos inclui três CDRs que são pelo menos cerca de 70%,
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42/149 pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 99%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99% ou cerca de 100% idênticas às CDRs de uma região variável de cadeia pesada do anticorpo 2C10 (CDR1, CDR2 e CDR3 como estabelecido nas SEQ ID NOs: 13, 14, 15, respectivamente), e uma região variável de cadeia leve dos anticorpos ou porções de ligação a antígeno dos mesmos incluem três CDRs que são pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, menos cerca de 99%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99% ou cerca de 100% idênticas às CDRs de uma região variável de cadeia leve do anticorpo 2C10 (CDR1, CDR2 e CDR3 como estabelecido nas SEQ ID NOs: 16, 17, 18, respectivamente).
[00108] Em certas modalidades, uma região variável de
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43/149 cadeia pesada dos anticorpos ou porções de ligação a antígeno dos mesmos inclui três CDRs que são idênticas às CDRs de uma região variável de cadeia pesada do anticorpo 2C10 (CDR1, CDR2 e CDR3 como estabelecido nas SEQ ID NOs: 13, 14, 15, respectivamente), e uma região variável de cadeia leve dos anticorpos ou porções de ligação a antígeno dos mesmos incluem três CDRs que são idênticas às CDRs de uma região variável de cadeia leve do anticorpo 2C10 (CDR1, CDR2 e CDR3 como estabelecido adiante nas SEQ ID NOs: 16, 17, 18, respectivamente).
[00109] São abrangidos pela presente descrição anticorpos com uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve possuindo sequências de aminoácidos pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 99%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou cerca de 100%, idênticas à região variável de cadeia pesada (SEQ ID NO: 11) e região variável de cadeia leve (SEQ ID NO: 12) do anticorpo 2C10, respectivamente.
[00110] Em modalidades relacionadas, os anticorpos
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44/149 anti-CD40 ou porções de ligação a antígeno dos mesmos incluem, por exemplo, as CDRs de regiões variáveis de cadeia pesada e/ou regiões variáveis de cadeia leve de 2C10.
[00111] Em uma modalidade, o anticorpo ou porção de ligação a antígeno do mesmo contém uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve idêntica à região variável de cadeia pesada e à região variável de cadeia leve do anticorpo 2C10 (SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12, respectivamente).
[00112] Em várias modalidades, os anticorpos ou porções de ligação a antígeno dos mesmos se ligam especificamente a um epítopo que se sobrepõe a pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 99%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99% ou cerca de 100%, idêntico a um epítopo ligado a anticorpo 2C10. O epítopo pode estar presente na sequência de SEQ ID NO: 6, ou pode estar presente na sequência dos aminoácidos 8-40 de SEQ ID NO: 6.
[00113] Em certas modalidades, as CDRs
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45/149 correspondentes às CDRs na Tabela 1 têm variações de sequência. Por exemplo, CDRs, em que 1, 2 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 resíduos, ou menos de 20%, menos de 30%, ou menos que cerca de 40%, do total de resíduos na CDR, são substituídos ou eliminados pode estarem presentes em um anticorpo (ou porção de ligação a antígeno ao mesmo) que se liga a CD40.
[00114] Estão também dentro do escopo da descrição, anticorpos ou porções de ligação a antígeno dos mesmos, em que aminoácidos específicos foram substituídos, eliminados ou adicionados. Essas alternações não têm um efeito substancial nas propriedades biológicas do peptídeo, tais como, atividade de ligação. Por exemplo, os anticorpos podem ter substituições de aminoácidos na região de armação, tal como, para melhorar a ligação a antígeno. Em outro exemplo, um número pequeno selecionado de resíduos da armação aceitadores pode ser substituído pelos aminoácidos doadores correspondentes. A armação de doador pode ser uma sequência de armação de anticorpo humano madura ou de linhagem germinativa ou uma sequência de consenso. Orientação sobre como fazer substituições de aminoácidos fenotipicamente silenciosas é fornecida em Bowie et al., Science, 247: 13061310 (1990). Cunningham et al., Science, 244: 1081-1085 (1989). Ausubel (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. (1994). T. Maniatis, E. F. Fritsch e J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory
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Manual, Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989). Pearson, Methods Mol. Biol. 243: 307-31 (1994). Gonnet et al., Science 256: 1443-45 (1992).
[00115] Os presentes peptídeos podem ser o variante funcionalmente ativo de anticorpos de porções de ligação a antígeno aqui descrito, por exemplo, com menos de cerca de 30%, cerca de 25%, cerca de 20%, cerca de 15%, cerca de 10%, cerca de 5% ou cerca de 1% de resíduos de aminoácidos substituídos ou eliminados mas retêm essencialmente às mesmas propriedades imunológicas incluindo, mas não se limitando a, ligação a CD40.
[00116] Os anticorpos ou porções de ligação a antígeno dos mesmos podem também incluir variantes, análogos, ortólogos, homólogos e derivados de peptídeos, que exibem uma atividade biológica, por exemplo, ligação de um antígeno, tal como CD40. Os peptídeos podem conter um ou mais análogos de um aminoácido (incluindo, por exemplo, aminoácidos de ocorrência não natural, aminoácidos apenas de ocorrência natural em um sistema biológico não relacionado, aminoácidos modificados de sistemas de mamíferos, etc.), peptídeos com ligações substituídas, bem como outras modificações conhecidas na técnica.
[00117] O anticorpo, ou a porção de ligação a antígeno do mesmo, pode ser derivado(a) ou ligado(a) a outra molécula funcional. Por exemplo, um anticorpo pode ser funcionalmente
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47/149 ligado (por acoplamento químico, fusão genética, interação não covalente, etc.) a uma ou mais outras entidades moleculares, tais como, outro anticorpo, um agente detectável, um imunossupressor, um agente citotóxico, um agente farmacêutico, uma proteína ou peptídeo que pode mediar a associação com outra molécula (tal como uma região do núcleo de estreptavidina ou uma etiqueta de poli-histidina), ligantes de aminoácidos, sequências de sinal, carreadores imunogênicos ou ligantes úteis na purificação de proteína, tais como, glutationa-S-transferase, etiqueta de histidina e proteína de estafilococos A. Os agentes citotóxicos podem incluir isótopos radioativos, agentes quimioterapêuticos e toxinas, tais como, toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, e fragmentos das mesmas. Tais agentes citotóxicos podem ser acoplados aos anticorpos humanizados da presente descrição usando procedimentos padrão e usados, por exemplo, para tratar um paciente indicado para terapia com o anticorpo.
[00118] Um tipo de proteína derivada é produzido por reticulação de duas ou mais proteínas (do mesmo tipo ou de tipos diferentes). Os agentes de reticulação adequados incluem aqueles que são heterobifuncionais, tendo dois grupos reativos distintos separados por um espaçador apropriado (por exemplo, éster de m-maleimidobenzoil-Nhidroxisuccinimida) ou homobifuncional (por exemplo,
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48/149 suberato de dissuccinimidila). Agentes detectáveis úteis, com os quais uma proteína pode ser derivada (ou marcada), incluem agentes fluorescentes, várias enzimas, grupos prostéticos, materiais luminescentes, materiais bioluminescentes e materiais radioativos. Agentes detectáveis fluorescentes não limitativos e exemplificativos incluem fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina e ficoeritrina. Uma proteína ou anticorpo também pode ser derivada(o) com enzimas detectáveis, tais como, fosfatase alcalina, peroxidase de rábano, betagalactosidase, acetilcolinesterase, glicose oxidase e semelhantes. Uma proteína também pode ser derivada com um grupo prostético (por exemplo, estreptavidina/biotina e avidina/biotina).
[00119] Em outra modalidade, o anticorpo anti-CD40 humanizado ou o fragmento do mesmo é usado não marcado e detectado com um anticorpo marcado que se liga ao anticorpo anti-CD40 humanizado ou ao seu fragmento.
Fragmentos de Anticorpo [00120] Os anticorpos podem ser completos ou podem incluir um fragmento (ou fragmentos) do anticorpo tendo uma porção de ligação a antígeno, incluindo, mas não se limitando a, Fab, F(ab')2, Fab', F(ab)', Fv, Fv de cadeia simples (scFv), scFv bivalente (bi-scFv), scFv trivalente (triscFv), Fd, fragmento dAb (por exemplo, Ward et al., Nature,
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341: 544-546 (1989)), uma CDR isolada, diacorpos, triacorpos, tetracorpos, anticorpos lineares, moléculas de anticorpo de cadeia simples e anticorpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticorpo. Anticorpos de cadeia única produzidos pela junção de fragmentos de anticorpo usando métodos recombinantes, ou um ligante sintético, são também abrangidos pela presente descrição. Bird et al. Science, 1988, 242:423-426. Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 1988, 85: 5879-5883.
[00121] A digestão de anticorpos pela papaína produz dois fragmentos de ligação a antígeno idênticos, chamados fragmentos Fab, cada um com um único sítio de ligação a antígeno, e um fragmento residual Fc, cujo nome reflete sua capacidade de cristalizar prontamente. O tratamento com pepsina origina um fragmento F(ab')2 que possui dois sítios de combinação com antígeno e ainda é capaz de reticular o antígeno.
[00122] Fv é o fragmento de anticorpo mínimo que contém um sítio de ligação a antígeno completo. Em uma modalidade, uma espécie de Fv de duas cadeias consiste em um dímero de um domínio variável de cadeia pesada e um de cadeia leve em associação forte, não covalente. Em uma espécie de Fv de cadeia simples (scFv), um domínio variável de cadeia pesada e um de cadeia leve pode ser covalentemente ligado por um ligante peptídico flexível de modo que as cadeias
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50/149 leve e pesada possam se associar em uma armação dimérica análoga à espécies de Fv de duas cadeias. É nesta configuração que as três CDRs de cada domínio variável interagem para definir um sítio de ligação a antígeno na superfície do dímero VH-VL. Coletivamente, as seis CDRs conferem especificidade de ligação a antígeno ao anticorpo. Contudo, mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv compreendendo apenas três CDRs específicas para um antígeno) tem a capacidade para reconhecer e ligar o antígeno, embora em uma afinidade menor do que o sítio de ligação completo.
[00123] O fragmento Fab contém os domínios variáveis de cadeia pesada e leve e também contém o domínio constante de cadeia leve e o primeiro domínio constante (CH1) de cadeia pesada. Os fragmentos Fab' diferem dos fragmentos Fab pela adição de alguns resíduos no terminal carboxila do domínio CH1 de cadeia pesada, incluindo uma ou mais cisteínas da região de dobradiça do anticorpo. Fab'-SH é a designação para Fab' na qual o(s) resíduo(s) de cisteína dos domínios constantes contêm um grupo tiol livre. Os fragmentos de anticorpo F(ab')2 foram originalmente produzidos como pares de fragmentos Fab' que possuem cisteínas de dobradiça entre dos mesmos. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpos são também conhecidos.
[00124] Os fragmentos de anticorpo Fv ou scFv de cadeia única ou scFv compreendem os domínios de anticorpo VH
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51/149 e VL, em que estes domínios estão presentes em uma única cadeia de polipeptídeos. Geralmente, o polipeptídeo de scFv compreende ainda um ligante de polipeptídeo entre os domínios VH e VL que permite que o scFv forme a armação desejada para ligação a antígeno. Para uma revisão de scFv, ver, por exemplo, Pluckthün, em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, eds. Rosenburg e Moore (SpringerVerlag, Nova Iorque, 1994), págs. 269-315.
[00125] Os diacorpos são fragmentos de anticorpo com dois sítios de ligação a antígeno, cujos fragmentos que compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável de cadeia leve (VL) na mesma cadeia polipeptídica (VH-VL). Utilizando um ligante que é demasiado curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a emparelhar com os domínios complementares de outra cadeia e criar dois sítios de ligação a antígeno. Os diacorpos podem ser bivalentes ou biespecíficos. Os diacorpos são descritos mais completamente em, por exemplo, Patente Europeia N° 404.097; Publicação PCT WO 1993/01161; Hudson e outros, Nat. Med. 9: 129-34, 2003; e Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-8, 1993. Os triacorpos e tetracorpos são também descritos em Hudson et al., Nat. Med. 9: 129-34, 2003.
[00126] Fragmentos de anticorpos podem ser gerados por meios tradicionais, tais como, digestão enzimática, ou
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52/149 por técnicas recombinantes. Em certas circunstâncias, há vantagens de usar fragmentos de anticorpos, em vez de anticorpos inteiros. O tamanho menor dos fragmentos permite uma depuração rápida, e pode levar a um melhor acesso a tumores sólidos. Para uma revisão de certos fragmentos de anticorpos, ver Hudson et al. Nat. Med. 9: 129-134, 2003.
[00127] Várias técnicas foram desenvolvidas para a produção de fragmentos de anticorpos. Tradicionalmente, estes fragmentos foram derivados via digestão proteolítica de anticorpos intactos (ver, por exemplo, Morimoto et al., J. Biochem. Biophys. Methods 24: 107-17, 1992; e Brennan et al., Science 229:81-3, 1985). No entanto, estes fragmentos podem agora ser produzidos diretamente por células hospedeiras recombinantes. Os fragmentos de anticorpo Fab, Fv e ScFv podem todos ser expressados e segregados a partir de E. coli, permitindo assim a produção fácil de grandes quantidades destes fragmentos. Os fragmentos de anticorpos podem ser isolados a partir das bibliotecas de fagos de anticorpos. Alternativamente, os fragmentos Fab'-SH podem ser recuperados diretamente a partir de E. coli e quimicamente acoplados para formar fragmentos F(ab')2 (Carter et al., Bio/Technology 10:163-7, 1992). Em outra abordagem, os fragmentos F(ab')2 são isolados diretamente da cultura de células hospedeiras recombinantes. Os fragmentos Fab e F(ab')2 com semi-vida in vivo aumentada compreendendo
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53/149 resíduos de epítopo de ligação ao receptor de recuperação são descritos na Patente U.S. No. 5.869.046. Outras técnicas para a produção de fragmentos de anticorpos serão evidentes para o habilitado na técnica.
[00128] O presente anticorpo ou porção de ligação a antígeno do mesmo pode compreender pelo menos um domínio constante, tal como, (a) um domínio constante de IgG; (b) um domínio constante IgA, etc.
[00129] Todos os isótipos de anticorpo são abrangidos pela presente descrição, incluindo IgG (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA (IgA1, IgA2), IgD ou IgE. Os anticorpos ou as porções de ligação a antígeno dos mesmos podem ser anticorpos de mamífero (por exemplo, camundongo, humano) ou porções de ligação a antígeno dos mesmos. As cadeias leves do anticorpo podem ser do tipo capa ou lambda. Um anticorpo anti-CD40 humanizado alternativo pode compreender sequências de mais do que uma classe ou isótipo de imunoglobulina, e a seleção de domínios constantes particulares para otimizar as funções efetoras desejadas está dentro do conhecimento normal da técnica.
[00130] Os anticorpos ou porções de ligação a antígeno dos mesmos da presente descrição podem ser monoespecíficos, biespecíficos ou multiespecíficos. Anticorpos multiespecíficos ou biespecíficos ou fragmentos dos mesmos podem ser específicos para diferentes epítopos de um
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54/149 polipeptídeo alvo (por exemplo, CD40) ou podem conter domínios de ligação a antígeno específicos para mais de um polipeptídeo alvo (por exemplo, domínios de ligação a antígeno específicos para CD40 e outro antígeno relacionado à rejeição de transplante ou doença autoimune). Em uma modalidade, um anticorpo multiespecífico ou porção de ligação a antígeno do mesmo compreende pelo menos dois domínios variáveis diferentes, em que cada domínio variável é capaz de se ligar especificamente a um antígeno separado ou a um epítopo diferente no mesmo antígeno. Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147: 60-69. Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22: 238-244. Os presentes anticorpos podem ser ligados ou coexpressados com outra molécula funcional, por exemplo, outro peptídeo ou proteína. Por exemplo, um anticorpo ou fragmento do mesmo pode ser funcionalmente ligado (por exemplo, por acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente ou outra) a uma ou mais outras entidades moleculares, tais como, outro anticorpo ou fragmento de anticorpo para produzir um anticorpo biespecífico ou um multiespecífico com uma segunda especificidade de ligação. Por exemplo, a presente descrição inclui anticorpos biespecíficos em que uma ramificação de uma imunoglobulina específica para CD40, e a outra ramificação da imunoglobulina específica para um segundo alvo terapêutico ou conjugada com uma porção terapêutica,
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55/149 tal como, um imunossupressor.
Produção de Anticorpos [00131] A presente descrição fornece métodos para preparar um anticorpo ou parte de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a CD40.
[00132] Por exemplo, um animal não humano é imunizado com uma composição que inclui CD40, e então um anticorpo específico é isolado do animal. O método pode ainda incluir a avaliação da ligação do anticorpo a CD40.
[00133] Em uma modalidade, a presente descrição fornece um método para produzir um hibridoma que expressa um anticorpo que se liga especificamente a CD40. O método contém as seguintes etapas: imunizar um animal com uma composição que inclui CD40 ou seu fragmento; isolar esplenócitos do animal; gerar hibridomas a partir dos esplenócitos; e selecionar um hibridoma que produz um anticorpo que se liga especificamente a CD40. Kohler e Milstein, Nature, 256: 495, 1975. Harlow, E. and Lane, D. Anticorpos: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1988.
[00134] Em uma modalidade, o CD40 é usado para imunizar camundongos intraperitonealmente ou intravenosamente. Um ou mais reforços podem ou não ser dados. Os títulos dos anticorpos no plasma podem ser monitorados, por exemplo, por ELISA (ensaio imunoabsorvente ligado a
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56/149 enzima) ou citometria de fluxo. Os camundongos com títulos suficientes de anticorpos anti-CD40 são usados para fusões. Os camundongos podem ou não ser reforçados com antígeno 3 dias antes do sacrifício e remoção do baço. Os esplenócitos de camundongo são isolados e fundidos com PEG a uma linhagem celular de mieloma de camundongo. Os hibridomas resultantes são então triados para a produção de anticorpos específicos para o antígeno. As células são plaqueadas, e depois incubadas em meio seletivo. Os sobrenadantes dos cavidades individuais são então triados por ELISA para anticorpos monoclonais anti-CD40 humanos. Os hibridomas que segregam anticorpos são replaqueados, novamente triados, e se ainda forem positivos para anticorpos monoclonais anti-CD40, podem ser subclonados por diluição limitante.
[00135] Os adjuvantes que podem ser usados para aumentar a imunogenicidade do CD40 incluem qualquer agente ou agentes que atuam para aumentar uma resposta imune a peptídeos ou combinação de peptídeos. Exemplos não limitativos de adjuvantes incluem alume, fosfato de alumínio, hidróxido de alumínio, MF59 (esqualeno a 4,3% p/v, polissorbato 80 a 0,5% p/v (Tween 80), trioleato de sorbitano a 0,5% p/v (Span 85)), ácido nucleico contendo CpG, QS21 (adjuvante de saponina), MPL (Monofosforil-Lípido A), 3DMPL (MPL 3-O-desacilado), extratos de Aquilla, ISCOMS (ver, por exemplo, Sjolander et al. (1998) J. Leukocyte Biol. 64:713;
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WO90/03184; WO96/11711; WO 00/48630; WO98/36772; WO
00/41720; WO06/134423 e WO07/026190), mutantes de LT/CT, micropartículas de poli(D,L-lactídeo-co-glicolídeo) (PLG), Quil A, interleucinas, Freund, N-acetil-muramil-L-treonilD-isoglutamina (tre-MDP), N-acetil-nor-muramil-L-alanil-Disoglutamina (CGP 11637, referido como nor-MDP), Nacetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'dip-almitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (CGP) 19835A, referido como MTP-PE), e RIBI, que contém três componentes extraídos de bactérias, monofosforil lipídeo A, dimerolato de trealose e esqueleto de parede celular (MPL + TDM + CWS) em uma emulsão de esqualeno a 2%/Tween 80.
[00136] O animal imunizado pode ser qualquer animal que seja capaz de produzir anticorpos recuperáveis quando administrado um imunogênio, tal como, mas não limitado a, coelhos, camundongos, ratos, hamsters, cabras, cavalos, macacos, babuínos e humanos. Em um aspecto, o hospedeiro é transgênico e produz anticorpos humanos, por exemplo, um camundongo expressando os segmentos do gene da imunoglobulina humana. Patente U.S. N° 8.236.311; 7.625.559 e 5.770.429, a descrição de cada uma das quais é aqui incorporada por referência na sua totalidade. Lonberg et al., Nature 368 (6474): 856-859, 1994. Lonberg, N., Handbook of Experimental Pharmacology 113: 49-101, 1994. Lonberg, N. e Huszar, D., Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, 1995. Harding,
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F. e Lonberg, N., Ann. N.Y. Acad. Sci. 764: 536-546, 1995.
[00137] Os presentes anticorpos ou porções dos mesmos podem ser produzidos por células hospedeiras transformadas com DNA que codifica cadeias leves e pesadas (ou porções das mesmas) de um anticorpo desejado. Os anticorpos (ou porções dos mesmos) podem ser isolados e purificados a partir destes sobrenadantes de cultura e/ou células usando técnicas padrão. Por exemplo, uma célula hospedeira pode ser transformada com DNA que codifica a cadeia leve, a cadeia pesada, ou ambas, de um anticorpo. A tecnologia de DNA recombinante pode também ser usada para remover algum ou todo o DNA que codifica pelo menos uma porção de uma ou ambas das cadeias leve e pesada que não seja necessária para a ligação, por exemplo, a região constante.
[00138] A invenção também engloba um ácido nucleico ou polinucleotídeo que codifica pelo menos um do presentes anticorpo ou parte de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a CD40. O ácido nucleico pode ser expressado em uma célula para produzir o presente anticorpo ou porção de ligação a antígeno do mesmo. O ácido nucleico isolado ou polinucleotídeo da presente descrição compreende pelo menos uma sequência que codifica um peptídeo pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 99%, cerca de 70%,
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59/149 cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99% ou cerca de 100% idêntica a qualquer uma das SEQ ID Nos: 11 - 29.
[00139] A invenção também apresenta vetores de expressão incluindo pelo menos um ácido nucleico ou polinucleotídeo codificando um peptídeo pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 99%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99% ou cerca de 100% idêntico a qualquer das SEQ ID NOs: 11 - 29.
[00140] As moléculas de ácido nucleico que codificam uma variante funcionalmente ativa do presente anticorpo ou da porção de ligação a antígeno do mesmo são também abrangidas pela presente descrição. Estas moléculas de ácido nucleico podem hibridizar com um ácido nucleico que codifica qualquer um dos presentes anticorpos ou porção de ligação a antígeno do mesmo sob condições de média gravidade, alta
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60/149 gravidade ou muito alta gravidade. Orientação para a realização de reações de hibridização pode ser encontrada em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. 6.3.1-6.3.6, 1989, que é aqui incorporado por referência. Condições de hibridização específicas aqui referidas são como a seguir: (1) condições de hibridização de gravidade média: 6XSSC a cerca de 45°C, seguido por uma ou mais lavagens em 0,2XSSC, SDS a 0,1% a 60°C; (2) condições de hibridização de alta gravidade: 6XSSC a cerca de 45°C, seguido por uma ou mais lavagens em 0,2XSSC, 0,1% de SDS a
65°C; e (3) condições de hibridização de gravidade muito alta: fosfato de sódio a 0,5 M, SDS a 7% a 65°C, seguido por uma ou mais lavagens a 0,2XSSC, SDS a 1% a 65°C.
[00141] Um ácido nucleico ou polinucleotídeo que codifica o presente anticorpo ou a porção de ligação a antígeno do mesmo pode ser introduzido em um vetor de expressão que pode ser expressado em um sistema de expressão adequado, seguido de isolamento ou purificação do anticorpo expressado ou porção de ligação a antígeno do mesmo. Opcionalmente, um ácido nucleico que codifica o presente anticorpo ou porção de ligação a antígeno do mesmo pode ser traduzido em um sistema de tradução isento de células.
Patente U.S. N° 4.816.567. Queen et al., Proc Natl Acad Sei
EUA, 86:10029-10033 (1989).
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61/149 [00142] Os presentes ácidos nucleicos podem ser expressados em várias células adequadas, incluindo células procarióticas e eucarióticas, por exemplo, células bacterianas (por exemplo, E. coli), células de levedura, células de planta, células de inseto e células de mamífero. Várias linhagens celulares de mamífero são conhecidas na técnica e incluem linhagens celulares imortalizadas disponíveis na American Type Culture Collection (ATCC). Exemplos não limitativos das células incluem todas as linhagens celulares de origem mamífera ou características do tipo mamífero, incluindo mas não se limitando a, células precursores, derivados e/ou variantes manipuladas por engenharia de células de rim de macaco (COS, por exemplo, COS-1, COS-7), HEK293, rim de hamster bebê (BHK, por exemplo, BHK21), ovário de hamster chinês (CHO), NS0, PerC6, BSC-1, células de carcinoma hepatocelular humano (por exemplo, Hep G2), SP2/0, HeLa, de rim de bovino Madin-Darby (MDBK), mieloma e linfoma. As variantes manipuladas por engenharia incluem, por exemplo, o perfil de glicano modificado e/ou derivados do sítio de integração específico de sítio.
[00143] A presente descrição também fornece células compreendendo os ácidos nucleicos aqui descritos. As células podem ser um hibridoma ou transfectante. O presente anticorpo ou porção de ligação a antígeno do mesmo pode ser expressado em várias células. Os tipos de células são discutidos aqui.
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62/149 [00144] Ao usar técnicas recombinantes para produzir, por exemplo, o anticorpo humanizado ou a porção de ligação a antígeno do mesmo, o anticorpo ou a sua porção pode ser produzido(a) intracelularmente, no espaço periplasmático, ou secretado diretamente no meio. Se o anticorpo for produzido intracelularmente, as células podem ser rompidas para liberar proteína como uma primeira etapa. Os detritos particulados, células hospedeiras ou fragmentos lisados, podem ser removidos, por exemplo, por centrifugação ou ultrafiltração. Carter et al., 1992, Bio/Technology 10: 163167 descrevem um procedimento para isolar anticorpos que são segregados para o espaço periplasmático de E. coli. Resumidamente, a pasta celular é descongelada na presença de acetato de sódio (pH 3,5), EDTA e fenilmetilssulfonilfluoreto (PMSF) por cerca de 30 minutos. Os detritos celulares podem ser removidos por centrifugação. Quando o anticorpo é segregado para o meio, os sobrenadantes de tais sistemas de expressão podem ser primeiramente concentrados usando um filtro de concentração de proteína comercialmente disponível, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração Amicon ou Millipore Pellicon. Uma variedade de métodos pode ser usada para isolar o anticorpo da célula hospedeira.
[00145] O anticorpo ou a sua porção preparada a partir das células pode ser purificado(a) usando, por exemplo,
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63/149 cromatografia em hidroxilapatita, eletroforese em gel, diálise e cromatografia por afinidade, com a cromatografia por afinidade sendo uma técnica de purificação típica. A adequabilidade da proteína A como um ligante de afinidade depende da espécie e do isótipo de qualquer domínio Fc de imunoglobulina que esteja presente no anticorpo. A proteína A pode ser usada para purificar anticorpos que se baseiam em cadeias pesadas humanas gama1, gama2 ou gama4 (ver, por exemplo, Lindmark et al., 1983 J. Immunol. Meth. 62: 1-13). A proteína G é recomendada para todos os isótipos de camundongo e para gama3 humana (ver, por exemplo, Guss et al., 1986 EMBO J. 5: 1567-1575). Uma matriz à qual um ligante de afinidade está afixado é mais frequentemente agarose, mas outras matrizes estão disponíveis. Matrizes mecanicamente estáveis, como vidro de poros controlados ou poli(estirenodivinil)benzeno, permitem vazões mais rápidas e tempos de processamento mais curtos do que os que podem ser obtidos com agarose. Quando o anticorpo compreende um domínio C.sub.H3, a resina Bakerbond ABX.TM. (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.) é útil para purificação. Outras técnicas para purificação de proteínas, tais como, fracionamento em uma coluna de troca iônica, precipitação com etanol, HPLC de fase reversa, cromatografia em sílica, cromatografia em heparina SEPHAROSE.TM. cromatografia sobre uma resina de troca aniônica ou catiônica (tal como uma coluna de ácido
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64/149 poliaspártico), precipitação com cromatografia, SDS-PAGE e precipitação com sulfato de amônio também estão disponíveis dependendo do anticorpo a ser recuperado.
[00146] Após qualquer etapa(s) de purificação preliminar(es), a mistura compreendendo o anticorpo de interesse e contaminantes pode ser submetida à cromatografia de interação hidrofóbica de pH baixo usando um tampão de eluição a um pH entre cerca de 2,5-4,5, tipicamente realizado em baixas concentrações de sal (por exemplo, cerca de 00.25M de sal).
[00147] Os hibridomas ou outras células que produzem anticorpos que se ligam, de preferência com alta afinidade, CD40 pode então ser subclonado e posteriormente caracterizado. Um clone de cada hibridoma ou célula, que retém a reatividade das células precursoras (por ELISA), pode então ser escolhido para preparar um banco de células, e para purificação de anticorpos.
[00148] Alternativamente, o presente anticorpo ou porção de ligação a antígeno do mesmo pode ser sintetizado por processos em fase sólida bem conhecidos na técnica. Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach by E. Atherton and R. C. Sheppard, published by IRL at Oxford University Press (1989). Methods in Molecular Biology, Vol. 35: Peptide Synthesis Protocols (ed. M. W.Pennington e B. M. Dunn), capítulo 7. Solid Phase Peptide Synthesis, 2a Ed., Pierce
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Chemical Co., Rockford, IL (1984). G. Barany and R. B. Merrifield, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, editors E. Gross and J. Meienhofer, Vol. 1 e Vol. 2, Academic Press, Nova Iorque, (1980), págs. 3-254. M. Bodansky, Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Berlim (1984).
[00149] Anticorpos adicionais (por exemplo, anticorpos monoclonais, policlonais, poliespecíficos ou monoespecíficos) contra o epítopo de CD40 reconhecido por 2C10 podem ser preparados, por exemplo, usando um modo adequado para preparar anticorpos. Em um exemplo, uma sequência de codificação para um epítopo reconhecido pelo anticorpo 2C10 é expressada como uma fusão C-terminal com glutationa S-transferase (GST) (Smith et al., Gene 67: 3140, 1988). A proteína de fusão é purificada em grânulos de glutationa-Sepharose, eluída com glutationa, clivada com trombina (em um sítio de clivagem manipulado por engenharia) e purificada para imunização de coelhos. As imunizações primárias são realizadas com adjuvante completo de Freund e subsequentes imunizações com adjuvante incompleto de Freund. Os títulos de anticorpos são monitorados por análises Western blot e imunoprecipitação usando o fragmento de proteína clivado com trombina da proteína de fusão GST. Os soros imunes são purificados por afinidade usando proteína acoplada a Sepharose CNBr. A especificidade do antissoro
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66/149 pode ser determinada usando um painel de proteínas GST não relacionadas.
[00150] Como imunogênio alternativo ou adjunto a proteínas de fusão de GST, os peptídeos correspondentes a regiões imunogênicas relativamente exclusivas de um polipeptídeo da invenção podem ser gerados e acoplados a hemocianina de lapa californiana (KLH) através de uma lisina C terminal introduzida. O antissoro de cada um destes peptídeos é purificado por afinidade de modo semelhante em peptídeos conjugados com BSA, e a especificidade é testada por ELISA ou análise de Western blotting utilizando conjugados de peptídeos ou por Western blot ou imunoprecipitação usando o polipeptídeo expressado como uma proteína de fusão GST.
[00151] Alternativamente, os anticorpos monoclonais que se ligam especificamente a epítopo de CD40 reconhecido pelo anticorpo 2C10 podem ser preparados usando tecnologia de hibridoma convencional (ver, por exemplo, Kohler et al., Nature 256:495-7, 1975; Kohler et al., Eur. J. Immunol 6:5119, 1976, Kohler et ai, Eur. J. Immunol 6: 292-5, 1976, Hammerling et al., Monoclonal Antibodies e T Cell Hybridomas, Elsevier, NY, 1981). Uma vez produzidos, os anticorpos monoclonais também podem ser testados para reconhecimento específico por Western blot ou análise de imunoprecipitação. Alternativamente, os anticorpos monoclonais podem ser
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67/149 preparados usando o polipeptídeo da invenção descrito acima e uma biblioteca de apresentação em fagos (Vaughan et al., Nat. Biotechnol. 14:309-14, 1996).
[00152] Os fragmentos epitópicos podem ser gerados por técnicas padrão, por exemplo, usando PCR e clonagem do fragmento em um vetor de expressão pGEX. As proteínas de fusão são expressadas em E. coli e purificadas usando uma matriz de afinidade de agarose de glutationa. Para minimizar os problemas potenciais de baixa afinidade ou especificidade de antissoros, duas ou três dessas fusões são geradas para cada proteína, e cada fusão é injetada em pelo menos dois coelhos. Os antissoros são criados por injeções em uma série e podem incluir, por exemplo, pelo menos três injeções de reforço.
[00153] A fim de gerar anticorpos policlonais em larga escala e a baixo custo, uma espécie animal apropriada pode ser escolhida. Os anticorpos policlonais podem ser isolados de leite ou colostro de, por exemplo, vacas imunizadas. O colostro bovino contém 28 g de IgG por litro, enquanto o leite bovino contém 1,5 g de IgG por litro (Ontsouka et al., J. Dairy Sci. 86: 2005-11, 2003). Anticorpos policlonais podem também ser isolados a partir da gema de ovos de galinhas imunizadas (Sarker et al., J. Pedíatr. Gastroenterol. Nutr. 32: 19-25, 2001).
Ensaios
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68/149 [00154] Vários métodos podem ser usados para ensaiar os anticorpos ou porções de ligação a antígeno dos mesmos, para confirmar a sua especificidade para o antígeno de interesse e/ou para estudar as suas propriedades. Um método de conduzir tais ensaios é um ensaio de triagem de soros, como descrito na Publicação de Patente U.S. N° 2004/0126829. Os anticorpos anti-CD40 podem ser caracterizados quanto à ligação a CD40 por uma variedade de técnicas conhecidas. Por exemplo, em um ELISA, placas de microtitulação são revestidas com CD40 ou um fragmento de CD40 em PBS e depois bloqueadas com proteínas irrelevantes, tais como, albumina de soro bovino (BSA) diluídas em PBS. Diluições de plasma de camundongos imunizados com CD40 (ou soluções contendo anticorpos anti-CD40) são adicionadas a cada cavidade e incubadas. As placas são lavadas e depois incubadas com um anticorpo secundário conjugado com uma enzima (por exemplo, fosfatase alcalina). Após a lavagem, as placas são desenvolvidas com o substrato da enzima (por exemplo, ABTS) e analisadas em um OD específico. Em outras modalidades, para determinar se os anticorpos monoclonais selecionados se ligam a epítopos únicos, o anticorpo pode ser biotinilado, que pode então ser detectado com uma sonda marcada com estreptavidina. Anticorpos anti-CD40 podem ser testados quanto à reatividade com CD40 por Western blotting.
[00155] Anticorpos, ou fragmentos de ligação a
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69/149 antígeno, variantes ou derivados dos mesmos da presente descrição podem também ser descritos ou especificados em termos da sua afinidade de ligação a um antígeno. A afinidade de um anticorpo para um antígeno pode ser determinada experimentalmente usando qualquer modo adequado (ver, por exemplo, Berzofsky et al., “Antibody-Antigen Interactions”, em Fundamental Immunology, Paul, WE, ed, Raven Press: Nova Iorque, NY (1984), Kuby, Janis Immunology, WH Freeman and Company: Nova Iorque, NY (1992) e métodos aqui descritos). A afinidade medida de uma interação anticorpo-antígeno particular pode variar se medida em condições diferentes (por exemplo, concentração de sal, pH). Assim, medidas de afinidade e outros parâmetros de ligação a antígeno (por exemplo, KD, Ka, Kd) são preferivelmente feitos com soluções padronizadas de anticorpo e antígeno, e um tampão padronizado.
[00156] Os presentes anticorpos ou porções de ligação a antígeno dos mesmos ligam-se especificamente a CD40 com uma constante de dissociação (KD) menor que cerca de 10-7 M, menor que cerca de 10-8 M, menor que cerca de 10-9 M, menor que cerca de 10-8 M, menor que cerca de 10-10 M, menor que cerca de 10-11 M, menor que cerca de 10-12 M, de cerca de 107 M a cerca de 10-12 M, de cerca de 10-8 M a cerca de 10-11 M, a cerca de 10-9 M a cerca de 10-10 M, ou de cerca de 10-8 M a cerca de 10-12 M.
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70/149 [00157] Os ensaios também podem ser usados para testar a capacidade de um anticorpo (ou o seu fragmento) para bloquear a ligação de CD40 a CD154, ou inibir ou diminuir as respostas mediadas por CD40.
[00158] Como aqui usado, os termos “inibe a ligação” e “bloqueia a ligação” (por exemplo, inibição/bloqueio da ligação de CD154 a CD40) são usados indistintamente e abrangem a inibição/bloqueio parcial e total. A inibição e o bloqueio destinam-se também a incluir qualquer diminuição mensurável na ligação de CD154 a CD40 quando em contato com um anticorpo anti-CD40 ou porções do mesmo, como aqui descrito, em comparação com ligante não em contato com um anticorpo anti-CD40, por exemplo, bloqueio de CD154 a CD40 em pelo menos cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%,
98%, 99% ou 100%.
[00159] Em uma modalidade, a ativação de células B, ou inibição das mesmas, pode ser determinada medindo a expressão de um ou mais marcadores selecionados de CD23, CD80, CD86 e qualquer marcador adequado adicional em células CD20+.
[00160] Os presentes anticorpos ou fragmentos dos mesmos podem ser caracterizados pelos seus efeitos nas respostas de anticorpos mediadas por células T. Por exemplo, os anticorpos ou fragmentos dos mesmos podem inibir a
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71/149 produção de IgM e/ou IgG em um mamífero, quando o anticorpo, ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo, é administrado ao mamífero em uma dosagem variando de cerca de 1 mg/kg de peso corporal a cerca de 50 mg/kg de peso corporal, de cerca de 2 mg/kg de peso corporal a cerca de 40 mg/kg de peso corporal, de cerca de 3 mg/kg de peso corporal a cerca de 30 mg/kg de peso corporal, de cerca de 5 mg/kg de peso corporal a cerca de 20 mg/kg de peso corporal, de cerca de 8 mg/kg de peso corporal a cerca de 13 mg/kg de peso corporal, cerca de 1 mg/kg de peso corporal, cerca de 2 mg/kg de peso corporal, cerca de 5 mg/kg de peso corporal, cerca de 10 mg/kg de peso corporal, cerca de 15 mg/kg de peso corporal, cerca de 20 mg/kg de peso corporal, cerca de 25 mg/kg de peso corporal, cerca de 30 mg/kg de peso corporal, cerca de 35 mg/kg de peso corporal, cerca de 40 mg/kg de peso corporal, cerca de 50 mg/kg de peso corporal, cerca de 60 mg/kg de peso corporal, cerca de 70 mg/kg de peso corporal, ou cerca de 80 mg/kg de peso corporal.
[00161] Os presentes anticorpos ou fragmentos dos mesmos podem ser caracterizados pelos seus efeitos no prolongamento da sobrevivência do enxerto após o transplante. Os presentes anticorpos ou fragmentos dos mesmos, isolados ou em combinação com um ou mais outros imunossupressores, podem prolongar a sobrevivência do enxerto em cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca
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de 60%, cerca de 70% , cerca de 80%, cerca de 90 % , cerca de
2 vezes , cerca de 5 vezes, cerca de 10 vezes, cerca de 15
vezes, cerca de 20 vezes, cerca de 25 vezes, cerca de 30
vezes, cerca de 35 vezes, cerca de 40 vezes, cerca de 45
vezes, cerca de 50 vezes, cerca de 55 vezes, maior que cerca de 40%, maior que cerca de 50%, maior que cerca de 60%, maior que cerca de 70%, maior que cerca de 80%, ou maior que cerca de 90%, maior que cerca de 2 vezes, maior que cerca de 5 vezes, maior que cerca de 10 vezes, maior que cerca de 20 vezes, maior que cerca de 30 vezes ou maior que cerca de 40 vezes. Por exemplo, os presentes anticorpos ou fragmentos dos mesmos podem prolongar a sobrevivência dos aloenxertos das ilhotas.
[00162] Em certas modalidades, o presente anticorpo, ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo: a) pode bloquear a ligação de CD40 a CD154; c) pode bloquear a ativação de células apresentadoras de antígeno (por exemplo, células B, células dendríticas, macrófagos, etc.); d) pode ou não induzir o esgotamento de células B; e) pode ou não inibir ou diminuir a liberação de citocinas a partir de células apresentadoras de antígeno; f) pode ou não induzir apoptose de células tumorais; g) pode ou não inibir a proliferação de células tumorais; h) pode ou não matar células tumorais; i) pode ou não estimular respostas de células T antitumor; e/ou j) pode ou não reduzir os tumores estabelecidos. Os
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73/149 anticorpos aqui descritos podem ter ou induzir uma combinação de qualquer um ou mais destes atributos ou destas atividades. Tai, et al., Cancer Res. 2005, 1; 65 (13): 5898-906; Luqman et al., Blood 112: 711-720, 2008. Os anticorpos ou porções dos mesmos aqui descritos também podem ser testados quanto aos efeitos na internalização de CD40, eficiência in vitro e in vivo, etc. Tais ensaios podem ser realizados usando protocolos bem estabelecidos conhecidos pela pessoa habilitada (ver, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publ. Assoc. Inc. & John Wiley & Sons, Inc., NY, NY); Current Protocols in Immunology (Editado por: John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober 2001 John Wiley & Sons, NY, NY) ou kits comercialmente disponíveis.
Condições a serem tratadas [00163] Os presentes anticorpos ou porções de ligação a antígeno dos mesmos têm utilidades terapêuticas, profiláticas e/ou terapêuticas in vitro e in vivo. Por exemplo, as células podem ser cultivadas in vitro em meio de cultura e contatadas pelo anticorpo anti-CD40 ou fragmento das mesmas. Os anticorpos ou porções de ligação a antígeno dos mesmos podem ser administrados em um indivíduo, como parte de um protocolo in vivo (por exemplo, terapêutico ou profilático). Para modalidades in vivo, a etapa de contato é efetuada em um indivíduo e inclui a administração de um
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74/149 anticorpo anti-CD40 ou porção do mesmo ao indivíduo sob condições eficazes para permitir a ligação do anticorpo, ou porção do mesmo, a CD40 no indivíduo. Os anticorpos ou porções de ligação a antígeno dos mesmos podem ser administrados para reduzir a probabilidade de, ou aumentar a duração antes da rejeição do transplante, induzir imunossupressão ou tratar um distúrbio autoimune.
[00164] Os anticorpos ou fragmentos de anticorpo aqui descritos podem ser usados em qualquer situação em que a imunossupressão é desejada (por exemplo, rejeição de transplantes ou distúrbios autoimunes). Estes anticorpos são particularmente úteis para o tratamento da rejeição de transplantes, por exemplo, reduzindo a probabilidade de um transplante particular ser rejeitado pelo hospedeiro ou aumentando o tempo antes de ocorrer a rejeição. Os anticorpos ou fragmentos de anticorpo aqui descritos podem ser usados em conjunto com o transplante de qualquer órgão ou qualquer tecido que seja adequado para transplante. Órgãos exemplificativos não limitativos incluem coração, rim, pulmão, fígado, pâncreas, intestino e timo; tecidos exemplificativos não limitativos incluem osso, tendão, córnea, pele, válvula do coração, veia e medula óssea. Os anticorpos e fragmentos de anticorpos também podem ser usados para tratar distúrbios autoimunes. Em uma modalidade, o distúrbio autoimune pode estar associado ou causado pela
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75/149 presença de um autoanticorpo. As doenças autoimunes que podem ser tratadas com os presentes anticorpos ou fragmentos dos mesmos incluem, mas não se limitam a, lúpus eritematoso sistêmico (SLE), síndroma CREST (calcinose, síndroma de Raynaud, dismotilidade esofágica, esclerodactilia e telangiectasia), opsoclonia, miopatia inflamatória (por exemplo, polimiosite, dermatomiosite e miosite de corpos de inclusão), esclerodermia sistêmica, cirrose biliar primária, doença celíaca (por exemplo, enteropatia sensível ao glúten), dermatite herpetiforme, síndrome de Miller-Fisher, neuropatia axonal motora aguda (AMAN), neuropatia motora multifocal com bloqueio de condução, hepatite autoimune, síndrome antifosfolipídica, granulomatose de Wegener, poliangiite microscópica, síndrome de Churg-Strauss, artrite reumatoide, hepatite autoimune crônica, escleromiosite, miastenia grave, síndrome miastênica de Lambert-Eaton, Tireoide de Hashimoto, doença de Grave, degeneração cerebelar paraneoplástica, síndrome da pessoa rígida, encefalite límbica, síndrome de Isaacs, coreia de Sydenham, doença neuropsiquiátrica autoimune pediátrica associada a Streptococcus (PANDAS), encefalite, diabete mellittus tipo 1, e neuromielite óptica. Outros distúrbios autoimunes incluem anemia perniciosa, doença de Addison, psoríase, doença inflamatória intestinal, artrite psoriática, síndrome de Sjogren, lúpus eritematoso (por exemplo, lúpus
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76/149 eritematoso discóide, lúpus eritematoso induzido por drogas e lúpus eritematoso neonatal), esclerose múltipla e artrite reativa.
[00165] Distúrbios adicionais que podem ser tratados usando os métodos da presente descrição incluem, por exemplo, polimiosite, dermatomiosite, múltiplas lesões endócrinas, síndrome de Schmidt, uveíte autoimune, adrenalite, tiroidite, doença da tireoide autoimune, atrofia gástrica, hepatite crônica, hepatite lupoide, aterosclerose, demência pré-senil, doenças desmielinizantes, lúpus eritematoso cutâneo subagudo, hipoparatireoidismo, síndrome de Dressler, trombocitopenia autoimune, púrpura trombocitopênica idiopática, anemia hemolítica, pênfigo vulgar, pênfigo, alopecia areata, penfigoide, escleroderma, esclerose sistêmica progressiva, diabetes mellitus de início na idade adulta (por exemplo, diabetes tipo II), infertilidade autoimune masculina e feminina, espondilite anquilosante, colite ulcerativa, doença de Chron, doença mista do tecido conjuntivo, poliarterite nodosa, vasculite necrosante sistêmica, artrite reumatoide de início na fase juvenil, glomerulonefrite, dermatite atópica, rinite atópica, síndrome de Goodpasture, doença de Chagas, sarcoidose, febre reumática, asma, aborto recorrente, Síndrome antifosfolípide, pulmão de fazendeiro, eritema multiforme, síndrome de pós-cardiotomia, síndrome de Cushing, hepatite
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77/149 ativa crônica autoimune, pulmão de caçador, doença alérgica, encefalomielite alérgica, necrólise epidérmica tóxica, alopecia, síndrome de Alport, alveolite, alveolite alérgica, alveolite fibrosante, doença pulmonar intersticial, eritema nodoso, pioderma gangrenoso, reação à transfusão, lepra, malária, leishmaniose, tripanossomíase, artrite de Takayasu, polimialgia reumática, arterite temporal, esquistossomose, arterite de células gigantes, ascaríase, aspergilose, síndrome de Sampter, eczema, granulomatose linfomatoide, doeça de Behcet, síndrome de Caplan, doença de Kawasaki, dengue, endocardite, fibrose endomiocardial, endoftalmite, eritema elevatum diutinum, eritroblastose fetal, fasciite eosinofílica, síndrome de shulman, síndrome de Felty, filaríase, ciclite, ciclite crônica, ciclite heterocrônica, ciclite de Fuch, neuropatia por IgA, púrpura HenochSchonlein, doença de enxerto versus hospedeiro, rejeição de transplante, infecção por vírus da imunodeficiência humana, infecção por ecovírus, cardiomiopatia, doença de Alzheimer, infecção por parvovírus, infecção por vírus da rubéola congênita, linfoma de Hodgking e de não Hodgking, carcinoma de célula renal, mieloma múltiplo, síndrome de EatonLammbert, policondrite recorrente, melanoma maligno, crioglobulinemia, macroglobulinemia de Waldernstrom, infecção por vírus Epstein-Barr, caxumba, síndrome de Evan, e falha gonodal autoimune.
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78/149 [00166] Em outra modalidade, o presente anticorpo ou o seu fragmento pode ser usado no tratamento de vários distúrbios associados à expressão de CD40.
[00167] Um distúrbio pode ser qualquer condição que se beneficiaria do tratamento com o presente anticorpo ou seu fragmento. Isso inclui distúrbios ou doenças crônicas e agudas, incluindo as condições patológicas que predispõem o mamífero ao transtorno em questão. Exemplos não limitativos de distúrbios a serem tratados no presente documento incluem doenças autoimunes, distúrbios imunológicos, distúrbios inflamatórios, câncer, malignidades hematológicas, tumores benignos e malignos, leucemias, malignidades linfoides e distúrbios angiogênicos.
[00168] Como aqui usado, o termo “distúrbio associado a CD40” ou “doença associada a CD40” refere-se a uma condição na qual a modificação ou eliminação de células que expressam CD40 está indicada. Estes incluem células que expressam CD40 demonstrando proliferação anormal ou células que expressam CD40 que estão associadas a crescimento canceroso ou maligno. Os distúrbios associados a CD40 incluem, mas não estão limitados a doenças e distúrbios do sistema imune, tais como, distúrbios autoimunes e distúrbios inflamatórios. Tais condições incluem, mas não estão limitadas a, artrite reumatoide (AR), lúpus eritematoso sistêmico (LES), escleroderma, síndrome de Sjogren, esclerose múltipla,
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79/149 psoríase, doença inflamatória intestinal (por exemplo, colite ulcerativa e doença de Crohn), inflamação pulmonar, asma, e púrpura trombocitopênica imunológica (ITP). Exemplos mais particulares de cânceres que demonstram expressão anormal do antígeno CD40 incluem células linfoblastóides B, linfoma de Burkitt, mieloma múltiplo, linfomas de células T, sarcoma de Kaposi, osteossarcoma, tumores epidérmicos e endoteliais, cânceres pancreático, de pulmão, de mama, de ovário, de cólon, de próstata, de cabeça e pescoço, de pele (melanoma), da bexiga e dos rins. Tais distúrbios também incluem, mas não estão limitados a, leucemias, linfomas, incluindo linfoma de células B e linfoma não-Hodgkin, mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenstrom; tumores sólidos, incluindo sarcomas, tais como osteossarcoma, sarcoma de Ewing, melanoma maligno, adenocarcinoma, incluindo adenocarcinoma de ovário, sarcoma de Kaposi/tumor de Kaposi e carcinoma de células escamosas. Patente U.S. N° 9.090.696.
[00169] Os cânceres que expressam CD40 que podem ser tratados ou prevenidos pelos presentes anticorpos ou fragmentos dos mesmos também incluem, por exemplo, leucemia, tal como leucemia aguda, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda (por exemplo, mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica ou eritroleucemia), leucemia crônica, leucemia mielocítica crônica (granulocítica) ou leucemia linfocítica crônica;
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Policitemia vera; Linfoma (por exemplo, doença de Hodgkin ou doença de não-Hodgkin); mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenstrom; doença de cadeia pesada; tumores sólidos, tais como, sarcomas e carcinomas (por exemplo, fibrossarcoma, mixossarcoma, lipossarcoma, condrossarcoma, sarcoma osteogênico, osteossarcoma, cordoma, angiossarcoma, endoteliolosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliossarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiossarcoma, rabdomiossarcoma, carcinoma do cólon, carcinoma colorretal, câncer pancreático, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, carcinoma de células escamosas, carcinoma basocelular, adenocarcinoma, carcinoma de glândula sudorípara, carcinoma de glândula sebácea, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogênico, carcinoma de células renais, hepatoma, carcinoma de duto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionário, tumor de Wilms, câncer do colo do útero, câncer uterino, tumor testicular, carcinoma pulmonar, carcinoma de pulmão de células pequenas, carcinoma de pulmão de células não pequenas, carcinoma de bexiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma, carcinoma nasofaríngeo ou
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81/149 carcinoma esofágico).
[00170] Também estão englobados métodos para tratar distúrbios de linfócitos B (por exemplo, lúpus eritematoso sistêmico, síndrome de Goodpasture, artrite reumatóide e diabetes tipo I), de linfócitos Th1 (por exemplo, artrite reumatoide, esclerose múltipla, psoríase, síndrome de Sjorgren, tireoidite de Hashimoto, Doença de Grave, cirrose biliar primária, granulomatose de Wegener, tuberculose ou doença de enxerto versus hospedeiro) ou de linfócitos Th2 (por exemplo, dermatite atópica, lúpus eritematoso sistêmico, asma atópica, rinoconjuntivite, rinite alérgica, síndrome de Omenn, esclerose sistêmica ou doença de enxerto versus hospedeiro crônica).
[00171] Em algumas modalidades, o distúrbio imunológico é um distúrbio imunológico mediado por células T, tal como um distúrbio de células T, no qual células T ativadas associadas ao distúrbio expressam CD40. Os anticorpos ou agentes anti-CD40 podem ser administrados para esgotar essas células T ativadas que expressam CD40. Em uma modalidade específica, a administração de anticorpos ou agentes anti-CD40 pode esgotar as células T ativadas que expressam CD40, enquanto que as células T em repouso não estão substancialmente esgotadas pelo agente ou anti-CD40. Neste contexto, “não substancialmente esgotados” significa que menos de cerca de 60%, ou menos de cerca de 70% ou menos
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82/149 de cerca de 80% das células T em repouso não são esgotados.
Terapia combinada [00172] O presente anticorpo ou porção de ligação a antígeno do mesmo pode ser administrado isoladamente ou em combinação com um ou mais outros agentes terapêuticos (por exemplo, um segundo agente terapêutico). Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas compreendendo o anticorpo anti-CD40 ou o seu fragmento podem ainda compreender um segundo agente terapêutico, conjugado ou não conjugado com o anticorpo ou o seu fragmento. Em uma modalidade, o segundo agente é outro anticorpo monoclonal ou policlonal ou porção de ligação a antígeno do mesmo. Em outra modalidade, o segundo agente é um imunossupressor. Em uma terceira modalidade, o segundo agente é um agente citotóxico ou citostático. Em uma quarta modalidade, o segundo agente pode ter como alvo um receptor ou complexo receptor diferente de CD40 na superfície de linfócitos ativados, células dendríticas ou células cancerosas que expressam CD40.
[00173] Tal terapia de combinação pode ter um efeito aditivo ou sinergístico nos parâmetros de condição (por exemplo, gravidade de um sintoma, o número de sintomas ou frequência de recaída).
[00174] O presente anticorpo anti-CD40 ou o seu fragmento pode ser administrado concorrentemente com o segundo agente terapêutico. Em outra modalidade específica,
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83/149 o segundo agente terapêutico é administrado antes ou após a administração do anticorpo anti-CD40 ou do seu fragmento.
[00175] Os anticorpos e fragmentos de anticorpo aqui descritos podem ser formulados ou administrados em combinação com um imunossupressor. Exemplos de imunossupressores incluem, mas não estão limitados a, inibidores da calcineurina (por exemplo, ciclosporina A (Sandimmune®), ciclosporina G e tacrolimus (Prograf®, Protopic®)), inibidores mTor (por exemplo, sirolimus (Rapamune®, Neoral®), temsirolimus (Torisel®), zotarolimus e everolimus (Certican®)), fingolimod (Gilenya ™), miriocina, alemtuzumab (Campath®, MabCampath®, Campath-1H®), rituximabe (Rituxan®, MabThera®), um anticorpo monoclonal anti-CD4 (por exemplo, HuMax-CD4), um anticorpo monoclonal anti-LFA1 (por exemplo, CD11a), um anticorpo monoclonal anti-LFA3, um anticorpo anti-CD45 (por exemplo, um anticorpo anti-CD45RB), um anticorpo anti-CD19 (ver, por exemplo, Publicação de Patente US 2006/0280738), monabatacept (Orencia®), belatacept, indolil-ASC (derivados do éter 32indol de tacrolimus e ascomicina), azatioprina (Azasan®, Imuran®), imunoglobulina de linfócitos e globulina antitimócitos [equina] (Atgam®), mofetil micofenolato (Cellcept®), micofenolato de sódio (myfortic®), daclizumab (Zenapax®), basiliximab (Simulect®), ciclofosfamida (Endoxan®, Cytoxan®, Neosar™, Procytox™, Revimmune™),
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84/149 prednisona, prednisolona, leflunomida (Arava®), FK778, FK779, 15-desoxiespergualina (DSG), bussulfano (Myleran®, Busulfex®), fludarabina (Fludara®), metotrexato (Rheumatrex®, Trexall®), etanercepte (Enbrel®), adalimumabe (Humira®), 6-mercaptopurina (Purinethol®), 15desoxiespergualina (Gusperimus), LF15-0195, bredinina, brequinar e muromonab CD3 (Orthoclone®).
[00176] Métodos para avaliar a atividade imunossupressora de um agente são conhecidos na técnica. Por exemplo, a duração do tempo de sobrevivência do órgão transplantado in vivo com e sem intervenção farmacológica serve como uma medida quantitativa para a supressão da resposta imune. Podem também ser usados ensaios in vitro, por exemplo, um ensaio de reação mista de linfócitos (MLR) (ver, por exemplo, Fathman et al., J. Immunol. 118: 1232-8, 1977); um ensaio de CD3 (ativação específica de células imunes via um anticorpo anti-CD3 (por exemplo, OKT3)) (ver, por exemplo, Khanna et al., Transplantation 67:882-9, 1999; Khanna et al. (1999) Transplantation 67:S58); e um ensaio de IL-2R (ativação específica de células imunes com a citocina IL-2 exogenamente adicionada) (ver, por exemplo, Farrar et al., J. Immunol. 126: 1120-5, 1981).
[00177] A ciclosporina A (CsA; CAS N° 59865-13-3; Patente U.S. N° 3.737.433) e os seus análogos podem ser usados como um imunossupressor. Um número de outras
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85/149 ciclosporinas e seus derivados e análogos que exibem atividade imunossupressora são conhecidos. As ciclosporinas e as suas formulações são descritas, por exemplo, em 2004 Physicians Desk Reference® (2003) Thomson Healthcare, 58a ed., e patentes U.S. N° 5.766.629; 5.827.822; 4.220.641; 4.639.434; 4.289.851; 4.384.996; 5.047.396; 4.388.307; 4.970.076; 4.990.337; 4.822.618; 4.576.284; 5.120.710; e 4.894.235.
[00178] O tacrolimus (FK506) é um macrolídeo que exerce efeitos largamente semelhantes aos da CsA, tanto no que diz respeito ao seu método molecular de ação como à sua eficácia clínica (Liu, Immunol. Today 14: 290-5, 1993; Schreiber et al., Immunol. Today 13: 136-42, 1992); no entanto, estes efeitos são apresentados em doses 20 a 100 vezes menores que as da CsA (Peters et al., Drugs 46: 74694, 1993). O tacrolimus e as suas formulações são descritas, por exemplo, em 2004, Physicians Desk Refernce® (2003) Thomson Healthcare, 58a ed., e Patentes US N° 4.894.366; 4.929.611; e 5.164.495.
[00179] O sirolimus (rapamicina) é um macrolídeo de lactama imunossupressor que pode ser produzido, por exemplo, por Streptomyces hygroscopicus. Numerosos derivados do sirolimus e seus análogos e suas formulações são conhecidos e descritos, por exemplo, em 2004 Physicians Desk Reference® (2003) Thomson Healthcare, 58a ed., Patente Europeia EP
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0467606; Publicações PCT Nos WO 94/02136, WO 94/09010, WO 92/05179, WO 93/11130, WO 94/02385, WO 95/14023 e WO 94/02136 e Patentes U.S. Nos 5.023.262; 5.120.725; 5.120.727; 5.177.203; 5.258.389; 5.118.677; 5.118.678; 5.100.883; 5.151.413; 5.120.842; e 5.256.790.
[00180] Em algumas modalidades, o segundo agente é um agente citotóxico que pode ser um quimioterápico convencional, tal como, por exemplo, doxorrubicina, paclitaxel, melfalano, alcalóides da vinca, metotrexato, mitomicina C ou etoposida. Adicionalmente, agentes potentes, tais como, análogos de CC-1065, caliqueamicina, maitansina, análogos de dolastatina 10, rizoxina e palitoxina podem ser ligados a anticorpos anti-CD40 ou agentes dos mesmos.
[00181] Em modalidades adicionais, o segundo agente é um anticorpo monoclonal anti-HER2 humanizado; RITUXAN (rituximab; Genentech, Inc., São Francisco do Sul, Calif.); um anticorpo monoclonal anti-CD20 quimérico); OVAREX (AltaRex Corporation, MA); PANOREX (Glaxo Wellcome, NC; um anticorpo IgG2a de murino); ERBITUX (cetuximab) (Imclone Systems Inc., NY; um anticorpo quimérico de IgG anti-EGFR); VITAXIN (Medlmmune, Inc., MD); CAMPATH I/H (Leukosite, MA; um anticorpo IgG1 humanizado); Smart MI95 (Protein Design Labs, Inc., CA; um anticorpo IgG anti-CD33 humanizado); LymphoCide (Immunomedics, Inc., NJ; um anticorpo IgG antiCD22 humanizado); Smart ID10 (Protein Design Labs, Inc., CA;
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87/149 um anticorpo anti-HLA-DR humanizado); Oncolym (Techniclone, Inc., CA; um anticorpo anti-HLA-Dr10 de murino radiomarcado); ALLOMUNE (BioTransplant, CA; um mAb anti-CD2 humanizado); AVASTIN (Genentech, Inc., CA; um anticorpo humanizado anti-VEGF); Epratuzamab (Immunomedics, Inc., NJ e Amgen, CA; um anticorpo anti-CD22); e CEAcide (Immunomedics, NJ; um anticorpo anti-CEA humanizado).
[00182] Outros anticorpos adequados que podem ser usados como segundo agente incluem, mas não estão limitados a, anticorpos contra os seguintes antígenos: CA125, CA15-3, CA19-9, L6, LewisY, LewisX, alfa-fetoproteína, CA 242, fosfatase alcalina placentária, antígeno específico da próstata, fosfatase ácida prostática, fator de crescimento epidérmico, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, receptor antitransferrina, p97, MUC1-KLH, CEA, gp100, MART1, antígeno específico da próstata, receptor de IL-2, CD20, CD52, CD33, CD22, gonadotrofina coriônica humana, CD38, mucina, P21, MPG e produto de oncogene Neu.
Usos Não Terapêuticos [00183] Os anticorpos aqui descritos são úteis como agentes de purificação por afinidade. Neste processo, os anticorpos ou fragmentos dos mesmos são imobilizados em uma fase sólida, tal como uma resina de Proteína A, usando métodos bem conhecidos na técnica. O anticorpo imobilizado ou o seu fragmento é contatado com uma amostra contendo a
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88/149 proteína CD40 (ou fragmento da mesma) a ser purificado, e depois o suporte é lavado com um solvente adequado que irá remover substancialmente todo o material na amostra exceto a proteína CD40, que é ligada ao anticorpo imobilizado. Finalmente, o suporte é lavado com outro solvente adequado que irá liberar a proteína CD40 do anticorpo.
[00184] Os presentes anticorpos anti-CD40 são também úteis em ensaios de diagnóstico para detectar e/ou quantificar a proteína CD40, por exemplo, detectando a expressão de CD40 em células, tecidos ou soro específicos.
[00185] Os anticorpos aqui descritos podem ser empregados em qualquer método de ensaio conhecido, tais como, ensaios de ligação competitiva, ensaios em sanduiche diretos e indiretos e ensaios de imunoprecipitação. Ver, por exemplo, Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, págs. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987).
Composições Farmacêuticas [00186] A presente descrição fornece uma composição, por exemplo, uma composição farmacêutica, contendo um anticorpo, ou porção(ões) de ligação a antígeno do mesmo, da presente descrição, formulada em conjunto com um carreador farmaceuticamente aceitável. Em outra modalidade, a composição pode conter um ácido nucleico isolado que codifica o presente anticorpo ou porção de ligação a antígeno do mesmo e um carreador farmaceuticamente aceitável. A composição
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89/149 pode ser eficaz para reduzir a probabilidade de, ou aumentar a duração antes da rejeição do transplante, para induzir imunossupressão, ou para tratar um distúrbio autoimune em um indivíduo. A presente composição pode ser eficaz em qualquer dos métodos aqui descritos.
[00187] Carreadores farmaceuticamente aceitáveis incluem qualquer e todos os solventes adequados, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardamento da absorção, e semelhantes que sejam fisiologicamente compatíveis. Dependendo da via de administração, os presentes anticorpos (ou porção(ões) de ligação a antígeno) pode(m) ser revestido(s) em um material para proteger os anticorpos (ou porção(ões) de ligação a antígeno dos mesmos) da ação de ácidos e outras condições naturais que podem inativar os anticorpos (ou porção(ões) de ligação a antígeno dos mesmos). O carreador pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol e polietileno glicol líquido e semelhantes) e misturas dos mesmos adequadas. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento, tal como, lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos. Em certas modalidades, a presente composição pode incluir agentes isotônicos, por exemplo,
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90/149 açúcares, poliálcoois, tais como, manitol, sorbitol ou cloreto de sódio na composição. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser conseguida incluindo na composição, um agente que retarda a absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina.
[00188] As composições farmacêuticas da invenção podem conter o presente anticorpo ou o seu fragmento, e o segundo agente terapêutico como aqui descrito (por exemplo, um ou mais imunossupressores).
[00189] A composição pode estar na forma de uma solução, uma suspensão, uma emulsão, um dispositivo de infusão ou um dispositivo de dispensação para implantação, ou pode ser apresentada como uma forma sólida (por exemplo, um pó seco) para ser reconstituída com água ou outro veículo adequado antes de usar. As composições podem estar na forma de uma emulsão de óleo, emulsão de água em óleo, emulsão de água em óleo em água, emulsão específica de sítio, emulsão de longa residência, emulsão pegajosa, microemulsão, nanoemulsão, lipossoma, micropartículas, microsferas, nanoesferas, nanopartículas e vários polímeros naturais ou sintéticos, tais como, polímeros impermeáveis não ressorvíveis, tais como, copolímeros de acetato de etilenoacetato de vinila e copolímeros Hytrel®, polímeros dilatáveis, tais como hidrogéis, ou polímeros ressorvíveis, tais como, colágeno e certos poliácidos ou poliésteres, tais
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91/149 como os usados para fazer suturas ressorvíveis, que permitem a liberação prolongada da vacina.
[00190] A composição pode estar na forma de uma pílula, comprimido, cápsula, líquido ou comprimido de liberação prolongada para administração oral; ou um líquido para administração intravenosa, intratecal, subcutânea ou parentérica; ou um polímero ou outro veículo de liberação prolongada para administração local.
[00191] Em um aspecto, uma solução da composição é dissolvida em um carreador farmaceuticamente aceitável, por exemplo, um carreador aquoso se a composição for solúvel em água. Exemplos de soluções aquosas incluem, por exemplo, água, solução salina, solução salina tamponada com fosfato, solução de Hank, solução de Ringer, dextrose/solução salina, soluções de glicose e semelhantes. As formulações podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis como requerido para aproximar condições fisiológicas, tais como agentes tamponantes, agentes de ajuste de tonicidade, agentes umectantes, detergentes e semelhantes. Os aditivos também podem incluir ingredientes ativos adicionais, tais como, agentes bactericidas ou estabilizadores. Por exemplo, a solução pode conter acetato de sódio, lactato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, monolaurato de sorbitano ou oleato de trietanolamina. As formulações sólidas podem ser usadas na presente descrição.
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Eles podem ser formulados como, por exemplo, pílulas, comprimidos, pós ou cápsulas. Para composições sólidas, carreadores sólidos convencionais podem ser usados que incluem, por exemplo, manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina de sódio, talco, celulose, glicose, sacarose, carbonato de magnésio e semelhantes. Excipientes farmacêuticos adequados incluem, por exemplo, amido, celulose, talco, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, sílica gel, estearato de magnésio, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, cloreto de sódio, leite desnatado seco, glicerol, propileno glicol, água, etanol.
[00192] Os métodos bem conhecidos na técnica para fazer formulações encontram-se, por exemplo, em “Remington: The Science and Pratice of Pharmacy” (20a ed., Ed. A.R. Gennaro AR., 2000, Lippincott Williams & Wilkins, Filadélfia, PA).
[00193] Em um aspecto, as formulações farmacêuticas compreendendo composições ou ácidos nucleicos, polipeptídeos ou anticorpos da invenção são incorporadas em monocamadas ou bicamadas lipídicas, por exemplo, lipossomas. Patentes U.S. Nos 6.110.490; 6.096.716; 5.283.185 e 5.279.833. Aspectos da invenção também fornecem formulações nas quais ácidos nucleicos solúveis em água, peptídeos ou polipeptídeos da invenção foram afixados à superfície da monocamada ou
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93/149 bicamada. Por exemplo, os peptídeos podem ser afixados a lipossomas contendo hidrazida-PEG-(diestearoilfosfatidil) etanolamina (ver, por exemplo, Zalipsky, Bioconjug. Chem. 6: 705-708, 1995). Podem ser usados lipossomas ou qualquer forma de membrana lipídica, tais como, membranas lipídicas planares ou a membrana celular de uma célula intacta, por exemplo, um glóbulo vermelho. As formulações lipossômicas podem ser por qualquer meio, incluindo administração intravenosa, transdermicamente (ver, por exemplo, Vutla, J. Pharm. Sei. 85: 5-8, 1996), transmucosalmente ou oralmente. A invenção também fornece preparações farmacêuticas nas quais o ácido nucleico, peptídeos e/ou polipeptídeos da invenção são incorporados em micelas e/ou lipossomas (ver, por exemplo, Suntres, J. Pharm. Pharmacol. 46: 23-28, 1994; Woodle, Pharm Res. 9: 260-265, 1992). Os lipossomas e as formulações lipossômicas podem ser preparados de acordo com métodos padrão e são também bem conhecidos na técnica. Akimaru, Cytokines Mol. Ther. 1: 197-210, 1995. Alving, Immunol. Rev. 145: 5-31, 1995. Szoka, Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9: 467, 1980. Patente U.S. Nos 4.235.871; 4.501.728 e 4.837.028.
[00194] Em um aspecto, as composições são preparadas com carreadores que protegerão o peptídeo contra a rápida eliminação do corpo, tal como, uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes e sistemas de distribuição
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94/149 microencapsulados. Polímeros biocompatíveis e biodegradáveis podem ser usados, tais como, acetato de vinil e etileno, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácido poliláctico. Os métodos para a preparação de tais formulações serão evidentes para os habilitados na técnica. As suspensões lipossômicas podem também ser usadas como carreadores farmaceuticamente aceitáveis. Patente U.S. N° 4.522.811.
[00195] Uma composição da presente descrição pode ser administrada por uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Como será apreciado pelo habilitado, a via e/ou o modo de administração variará dependendo dos resultados desejados. A administração pode ser parentérica, intravenosa, intratecal, subcutânea, oral, tópica, local, intramuscular, intradérmica, transdérmica, subdérmica, retal, espinhal ou epidérmica. A administração intravenosa por infusão contínua é um método exemplificativo para administrar os presentes anticorpos.
[00196] Para administrar o agente presente por certas vias de administração, pode ser necessário revestir o agente com, ou coadministrar o agente com um material para prevenir a sua inativação. Por exemplo, o agente pode ser administrado a um indivíduo em um carreador apropriado, por exemplo, lipossomas ou um diluente. Os diluentes farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções salinas e soluções tampão
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95/149 aquosas. Os lipossomas incluem emulsões CGF de água em óleo em água bem como lipossomas convencionais (Strejan et al., J. Neuroimmunol. 7: 27-41, 1984).
[00197] A administração parentérica pode incluir métodos de administração diferentes da administração entérica e tópica, usualmente por injeção, e incluem, sem limitação, injeção e infusão intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnóidea, intraespinal, epidural e intraesternal. Exemplos de carreadores aquosos e não aquosos adequados que podem ser empregados nas composições farmacêuticas da invenção incluem água, etanol, polióis (tais como glicerol, propileno glicol, polietileno glicol, e semelhantes), e misturas adequadas dos mesmos, óleos vegetais, tais como, azeite e ésteres orgânicos injetáveis, tais como, oleato de etila. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de materiais de revestimento, tais como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersões e pelo uso de tensoativos.
[00198] Os métodos para preparar composições administráveis parentericamente serão conhecidos ou evidentes para os habilitados na técnica e são descritos em detalhe. Bai, J. Neuroimmunol. 80: 65-75, 1997. Warren, J.
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Neurol. Sci. 152: 31-38, 1997. Tonegawa, J. Exp. Med. 186: 507-515, 1997. As formulações para administração parentérica podem, por exemplo, conter excipientes, água estéril, solução salina, polialquileno glicóis, tais como, polietileno glicol, óleos de origem vegetal ou naftalenos hidrogenados. Polímeros de lactídeo biodegradáveis, copolímeros de lactídeo/glicolídeo ou copolímeros de polioxietileno-polioxipropileno podem ser usados para controlar a liberação do presente agente. As formulações nanoparticuladas (por exemplo, nanopartículas biodegradáveis, nanopartículas lipídicas sólidas,
lipossomas) podem ser usadas para controlar a
biodistribuição do agente presente. Outros sistemas de
distribuição potencialmente úteis incluem partículas de
copolímero de etileno-acetato de vinila, bombas osmóticas, bombas intratecais, sistemas de infusão implantáveis e lipossomas. A concentração do agente na formulação varia dependendo de vários fatores, incluindo a dosagem do fármaco a ser administrado, e a via de administração.
[00199] As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas incorporando o agente presente na quantidade requerida em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, como necessário, seguido de microfiltração por esterilização. Geralmente, as dispersões são preparadas incorporando o presente agente em
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97/149 um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes requeridos dos enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos de preparação incluem secagem sob vácuo e liofilização (liofilização) que produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir de uma solução previamente filtrada estéril. Os regimes de dosagem são ajustados para fornecer a resposta ótima desejada (por exemplo, uma resposta terapêutica). Por exemplo, um único bolus pode ser administrado, várias doses divididas podem ser administradas ao longo do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada como indicado pelas exigências da situação terapêutica. Por exemplo, os anticorpos da invenção podem ser administrados uma ou duas vezes por semana por injeção subcutânea ou uma ou duas vezes por mês por injeção subcutânea. As composições parenterais podem ser formuladas na forma de dosagem unitária para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. A forma de dosagem unitária, como aqui usada, refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para os indivíduos a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade predeterminada de agente ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o carreador farmacêutico requerido. A especificação para as formas unitárias de
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98/149 dosagem da invenção são ditadas por e diretamente dependentes (a) das características do agente ativo e do efeito terapêutico particular a ser alcançado, e (b) das limitações inerentes na técnica de se agenciar tal agente ativo para o tratamento da sensibilidade em indivíduos.
[00200] Quando administradas oralmente, as presentes composições podem ser protegidas da digestão. Isto pode ser conseguido por complexação do anticorpo ou porção de ligação a antígeno do mesmo com uma composição para o tornar resistente a hidrólise ácida e enzimática ou por acondicionamento do anticorpo ou da porção de ligação a antígeno do mesmo em um carreador apropriadamente resistente tal como um lipossoma. Meios de proteger agentes da digestão são bem conhecidos na técnica. Fix, Pharm Res. 13: 17601764, 1996. Samanen, J. Pharm. Pharmacol. 48: 119-135, 1996. Patente U.S. No 5.391.377.
[00201] Para administração transmucosa ou transdérmica, podem ser utilizados penetrantes apropriados à barreira a ser permeada na formulação. Tais penetrantes são geralmente conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, para administração transmucosal, sais biliares e derivados de ácido fusídico. Além disso, detergentes podem ser usados para facilitar a permeação. A administração transmucosal pode ser através de sprays nasais ou usando supositórios. Sayani, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 13: 85-184, 1996.
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Para administração tópica, transdérmica, os agentes são formulados em unguentos, cremes, pomadas, pós e géis. Os sistemas de dispensação transdérmica também podem incluir, por exemplo, emplastros.
[00202] As presentes composições podem também ser administradas em mecanismos de liberação prolongada ou dispensação prolongada. Por exemplo, microesferas ou cápsulas biodegradáveis ou outras configurações de polímero biodegradáveis capazes de dispensação prolongada de um peptídeo podem ser incluídas nas formulações da invenção (ver, por exemplo, Putney, Nat. Biotechnol. 16: 153-157, 1998).
[00203] Para inalação, as presentes composições podem ser dispensadas usando qualquer sistema conhecido na técnica, incluindo aerossóis de pó seco, sistemas de dispensação de líquidos, nebulizadores de jato de ar, sistemas propelentes e semelhantes. Patton, Biotechniques 16: 141-143, 1998. Também podem ser usados na presente descrição sistemas de dispensação de produto e inalação para macromoléculas polipeptídicas por, por exemplo, Dura Pharmaceuticals (San Diego, Calif.), Aradigrn (Hayward, Calif.), Aerogen (Santa Clara, Calif.), Inhale Therapeutic Systems (San Carlos, Calif.) e semelhantes. Por exemplo, a formulação farmacêutica pode ser administrada na forma de um aerossol ou névoa. Para administração por aerossol, a
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100/149 formulação pode ser fornecida em forma finamente dividida juntamente com um tensoativo e um propelente. Em outro aspecto, o dispositivo para dispensar a formulação ao tecido respiratório é um inalador no qual a formulação se vaporiza. Outros sistemas de dispensação de líquidos incluem, por exemplo, nebulizadores de jato de ar.
[00204] As composições podem ser administradas em um tratamento em dose única e tratamento em múltiplas doses em uma programação e ao longo de um período apropriado à idade, peso e condição do indivíduo, a composição particular usada e a via de administração. A frequência de administração pode variar dependendo de qualquer um de uma variedade de fatores, por exemplo, gravidade dos sintomas, grau de imunoprotecção desejada, se a composição é usada para fins profiláticos ou curativos, etc. Por exemplo, em uma modalidade, a composição de acordo com a invenção é administrada uma vez por mês, duas vezes por mês, três vezes por mês, quinzenalmente, uma vez por semana (qw), duas vezes por semana (biw), três vezes por semana (tiw), quatro vezes por semana, cinco vezes por semana, seis vezes por semana, em dias alternados (qod), diariamente (qd), duas vezes por dia (qid) ou três vezes ao dia (tid).
[00205] A duração da administração de um polipeptídeo de acordo com a invenção, por exemplo, o período de tempo durante o qual a composição é administrada, pode variar,
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101/149 dependendo de qualquer um de uma variedade de fatores, por exemplo, resposta do indivíduo, etc. Por exemplo, a composição pode ser administrada ao longo de um período de tempo de cerca de um dia a cerca de uma semana, de cerca de duas semanas a cerca de quatro semanas, de cerca de um mês
a cerca de dois meses, de cerca de dois meses a cerca de
quatro meses seis meses, de cerca de seis meses a cerca de
oito meses, de cerca de oito meses a cerca de um ano, de
cerca de um ano a cerca de dois anos, ou de cerca de dois anos a cerca de quatro anos, ou mais.
[00206] É vantajoso formular composições orais ou parentéricas na forma de dosagem unitária para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. A forma de dosagem unitária tal como aqui usada refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para o indivíduo a ser tratado; cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de agente ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o carreador farmacêutico requerido.
[00207] Níveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas da presente descrição podem ser variados de modo a obter uma quantidade do ingrediente ativo que seja eficaz para alcançar a resposta terapêutica desejada para um paciente particular, composição e modo de administração, sem ser tóxico para o paciente. O
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102/149 nível de dosagem selecionado dependerá de uma variedade de fatores farmacocinéticos, incluindo a atividade das composições particulares da presente descrição empregada, ou o éster, sal ou amida das mesmas, a via de administração, o tempo de administração, a taxa de excreção da agente particular sendo empregado, a duração do tratamento, outros fármacos, agentes e/ou materiais usados em combinação com as composições particulares empregadas, a idade, o sexo, o peso, a condição, a saúde geral e o histórico médico anterior do paciente a ser tratado; como fatores bem conhecidos nas artes médicas. Um médico ou veterinário tendo habilidade comum na técnica pode determinar e prescrever prontamente a quantidade eficaz da composição farmacêutica requerida. Por exemplo, o médico ou veterinário pode iniciar doses dos agentes da invenção empregados na composição farmacêutica a níveis menores que os requeridos para se conseguir o efeito terapêutico desejado e aumentar gradualmente a dosagem até ser atingido o efeito desejado. Em geral, uma dose diária adequada de uma composição da invenção será aquela quantidade do agente que é a dose mais baixa eficaz para produzir um efeito terapêutico. Uma tal dose eficaz dependerá geralmente dos fatores descritos acima. Se desejado, a dose diária eficaz de uma composição terapêutica pode ser administrada como duas, três, quatro, cinco, seis ou mais subdoses administradas separadamente em intervalos apropriados ao
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103/149 longo do dia, opcionalmente, em formas de dosagem unitárias.
[00208] Os dados obtidos a partir dos ensaios de cultura de células e estudos em animais podem ser usados na formulação de uma faixa de dosagem para uso em humanos. Em uma modalidade, a dosagem de tais agentes situa-se dentro de uma faixa de concentrações circulantes que incluem o ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro desta faixa dependendo da forma de dosagem empregada e da via de administração utilizada. Em outra modalidade, a dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente a partir de ensaios de cultura de células. Uma dose pode ser formulada em modelos animais para atingir um faixa de concentração no plasma circulante que inclui o IC50 (i.e., a concentração do agente de teste que consegue uma inibição semimáxima dos sintomas) como determinado em cultura de células. Sonderstrup, Springer, Sem. Imunopatol 25:35-45, 2003. Nikula et al., Inhal. Toxicol 4 (12): 123-53, 2000.
[00209] Uma faixa não limitativa exemplificativa para uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz de um anticorpo ou porção de ligação a antígeno da invenção é de cerca de 0,001 a cerca de 100 mg/kg de peso corporal ou mais, cerca de 0,1 a cerca de 100 mg/kg de peso corporal, cerca de 0,01 a cerca de 80 mg/kg de peso corporal, cerca de 0,001 a cerca de 60 mg/kg de peso corporal, cerca de 0,01 a cerca de 30 mg/kg de peso corporal, cerca de 0,01 a cerca de
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104/149 mg/kg de peso corporal, cerca de 0,5 a cerca de 25 mg/kg de peso corporal, cerca de 0,1 a cerca de 15 mg/kg de peso corporal, cerca de 0,1 a cerca de 20 mg/kg de peso corporal, cerca de 10 a cerca de 20 mg/kg de peso corporal, cerca de 0,75 a cerca de 10 mg/kg de peso corporal, cerca de 1 a cerca de 10 mg/kg de peso corporal, cerca de 2 a cerca de 9 mg/kg de peso corporal, cerca de 1 a cerca de 2 mg/kg de peso corporal, cerca de 3 a cerca de 8 mg/kg de peso corporal, cerca de 4 a cerca de 7 mg/kg de peso corporal, cerca de 5 a cerca de 6 mg/kg de peso corporal, cerca de 8 a cerca de 13 mg/kg de peso corporal, cerca de 8,3 a cerca de 12,5 mg/kg de peso corporal, cerca de 4 a cerca de 6 mg/kg de peso corporal, 4,2 a cerca de 6,3 mg/kg de peso corporal, cerca de 1,6 a cerca de 2,5 mg/kg de peso corporal, cerca de 2 a cerca de 3 mg/kg de peso corporal, ou cerca de 10 mg/kg de peso corporal. A dosagem administrada a um indivíduo pode também ser de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 50 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a cerca de 30 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a cerca de 20 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a cerca de 15 mg/kg, ou cerca de 1 mg/kg a cerca de 10 mg/kg do peso corporal do indivíduo. Doses exemplificativas incluem, mas não estão limitadas a, de 1 ng/kg a 100 mg/kg. Em algumas modalidades, uma dose de cerca de 0,5 mg/kg, cerca de 1 mg/kg, cerca de 2 mg/kg, cerca de 3 mg/kg, cerca de 4 mg/kg, cerca de 5 mg/kg, cerca de 6 mg/kg, cerca de 7 mg/kg, cerca de 8 mg/kg, cerca de 9 mg/kg,
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105/149 cerca de 10 mg/kg, cerca de 11 mg/kg, cerca de 12 mg/kg, cerca de 13 mg/kg, cerca de 14 mg/kg, cerca de 15 mg/kg ou cerca de 16 mg/kg do peso corporal do indivíduo. WO 94/04188.
[00210] A composição é formulada para conter uma quantidade eficaz do presente anticorpo ou porção de ligação a antígeno do mesmo, em que a quantidade depende do animal a ser tratado e da condição a ser tratada. Em uma modalidade, o presente anticorpo ou porção de ligação a antígeno do mesmo é administrado em uma dose variando de cerca de 0,01 mg a cerca de 10 g, de cerca de 0,1 mg a cerca de 9 g, de cerca de 1 mg a cerca de 8 g, de cerca de 1 mg a cerca de 7 g, de cerca de 5 mg a cerca de 6 g, de cerca de 10 mg a cerca de 5 g, de cerca de 20 mg a cerca de 1 g, de cerca de 50 mg a cerca de 800 mg, de cerca de 100 mg a cerca de 500 mg, de cerca de 0,01 mg a cerca de 10 g, de cerca de 0,05 μg a cerca de 1,5 mg, de cerca de 10 μg a cerca de 1 mg de proteína, de cerca de 30 μg a cerca de 500 μg, de cerca de 40 pg a cerca de 300 pg, de cerca de 0,1 μg a cerca de 200 mg, de cerca de
0,1 μg a cerca de 5 μg, de cerca de 5 μg a cerca de 10 μg, de cerca de 10 μg a cerca de 25 μg, de cerca de 25 μg a cerca de 50 μg, de cerca de 50 μg a cerca de 100 μg, de cerca de 100 μg a cerca de 500 μg, de cerca de 500 μg a cerca de 1 mg, de cerca de 1 mg a cerca de 2 mg. O nível de dose específica para qualquer indivíduo particular depende de uma
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106/149 variedade de fatores, incluindo a atividade do peptídeo específico, a idade, o peso corporal, a saúde geral, sexo, dieta, tempo de administração, via de administração e taxa de excreção, a combinação de fármacos e a severidade da doença particular em terapia.
Artigos de Fabricação [00211] Em outro aspecto, um artigo de fabricação contendo materiais úteis para o tratamento das condições ou distúrbios aqui descritos. O artigo de fabricação compreende um recipiente e um rótulo. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas e tubos de ensaio. Os recipientes podem ser formados a partir de uma variedade de materiais, como vidro ou plástico. O recipiente contém uma composição que é eficaz para tratar a condição e pode ter uma porta de acesso estéril. Por exemplo, o recipiente pode ser um saco de solução intravenosa ou um frasco tendo um tamponamento perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica. O agente ativo na composição pode ser o anticorpo anti-CD40 humanizado ou o seu fragmento, ou qualquer outro anticorpo ou o seu fragmento como aqui descrito. O rótulo ou associado ao recipiente indica que a composição é usada para tratar a condição de escolha. O artigo de fabricação pode ainda compreender um segundo recipiente compreendendo um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como solução salina tamponada com fosfato,
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107/149 solução de Ringer e solução de dextrose. Pode ainda incluir outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas e folhetos informativos com instruções de uso.
[00212] Em uma modalidade, a invenção fornece um kit contendo um anticorpo anti-CD40 ou sua porção de ligação a antígeno. Componentes adicionais dos kits podem incluir um ou mais dos seguintes: instruções de uso; outros reagentes, um agente terapêutico ou um agente útil para acoplamento de um anticorpo a uma marcação ou agente terapêutico, ou outros materiais para preparar o anticorpo para administração; carreadores farmaceuticamente aceitáveis; e dispositivos ou outros materiais para administração a um indivíduo.
[00213] O kit pode ou não conter o segundo agente terapêutico como descrito aqui. Os agentes podem ser misturados ou acondicionados separadamente no kit.
[00214] O kit pode ou não conter, pelo menos, um ácido nucleico que codifica anticorpos anti-CD40 ou um fragmento dos mesmos e instruções para a expressão dos ácidos nucleicos. Outros componentes possíveis do kit incluem vetores de expressão e células.
[00215] O presente anticorpo ou o seu fragmento pode ser usado em um kit de diagnóstico, isto é, uma combinação de reagentes acondicionados em quantidades predeterminadas
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108/149 com instruções para realizar o ensaio de diagnóstico. Quando o anticorpo é marcado com uma enzima, o kit pode incluir substratos e cofatores requeridos pela enzima, tal como um precursor de substrato que fornece o cromóforo ou fluoróforo detectável. Além disso, outros aditivos podem ser incluídos, tais como estabilizadores, tampões (por exemplo, um tampão de bloqueio ou tampão de lise) e semelhantes. As quantidades relativas dos vários reagentes podem variar amplamente para fornecer concentrações na solução dos reagentes que otimizem substancialmente a sensibilidade do ensaio. Os reagentes podem ser fornecidos como pós secos, normalmente liofilizados, incluindo excipientes que, na dissolução, fornecerão uma solução reagente com a concentração apropriada.
Mapeamento de Epítopo [00216] Os métodos para identificar o epítopo particular ao qual um anticorpo se liga são conhecidos dos habilitados na técnica. As técnicas padrão incluem triagem de peptídeos, em que peptídeos curtos sobrepostos (por exemplo, 10-30 aminoácidos, por exemplo, 20, de comprimento) derivados da proteína completa a que o anticorpo se liga são testados individualmente quanto sua capacidade de se ligar ao anticorpo. A partir de tais experimentos, a região da proteína à qual o anticorpo se liga pode então ser determinada
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109/149 [00217] A mutagênese direcionada pode também ser usada para identificar a(s) região(ões) antigênica(s) de uma proteína particular. Nesta abordagem, mutações pontuais são sistematicamente introduzidas no polipeptídeo alvo e a capacidade do anticorpo para se ligar ao peptídeo com mutações em várias posições é usada para determinar se uma região particular dessa proteína contém o epítopo ao qual o anticorpo se liga.
[00218] Os epítopos de anticorpos podem também ser identificados usando técnicas de mutagênese de alto rendimento, tais como, Mutagênese Shotgun (Integral Molecular, Inc., Filadélfia, Pa.), que podem ser usados para gerar um grande número de mutações dentro da proteína alvo. Tais metodologias permitem a identificação eficiente de epítopos dentro da proteína.
[00219] Para determinar se vários anticorpos para o CD40 se ligam a epítopos semelhantes, pode ser realizado um ensaio de bloqueio competitivo in vitro. Em uma modalidade, os anticorpos 2C10, 3A8 e Chi220, um anticorpo específico de CD40 de IgG1 quimérico, foram utilizados no ensaio. O 2C10 foi conjugado a aloficocianina (APC) usando o kit de marcação de anticorpos de Ligação de Iluminação (Novus Biologics, Littleton, CO). As PBMCs humanas foram incubadas com concentrações crescentes de 2C10, 3A8 ou Chi220 e depois coradas com o 2C10 conjugado com APT para avaliar a
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110/149 capacidade de cada anticorpo em bloquear cruzadamente 2C10. A ligação de 2C10 conjugada com APC diminuiu com concentrações crescentes de 2C10 mas não Chi220 ou 3A8 como mostrado na Figura 12. O resultado indica que 2C10 se liga a um epítopo único distinto de Chi220 ou 3A8.
Fragmentos de CD40 [00220] A invenção também apresenta fragmentos de CD40 que incluem o epítopo que é especificamente ligado pelo anticorpo 2C10. O anticorpo 2C10 foi criado contra a porção extracelular do polipeptídeo CD40. O anticorpo 2C10 reage com uma porção desta sequência (SEQ ID NOs: 5 e 6).
[00221] A descrição, portanto, apresenta fragmentos de CD40 (por exemplo, menos de 150, 120, 100, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 18, 15, 12, 11, 10, 9, 8 ou 7) aminoácidos no comprimento que são especificamente ligados pelo anticorpo 2C10. Em certas modalidades, o fragmento é 8-10, 8-12, 8-15, 8-20, 8-30, 8-40, 8-50, 8-60, 8-70, 8-80 ou 8100 aminoácidos de comprimento. Em outras modalidades, o fragmento é 7-10, 7-12, 7-15, 7-20, 7-30, 7-40, 7-50, 7-60, 7-70, 7-80 ou 7-100 de comprimento. O anticorpo 2C10 se liga a um epítopo presente na sequência dos aminoácidos 8-10, 812, 8-15, 8-20, 8-30, 8-40, 8-50, 8-60, 8-70, 8-80, 8-100, 7-10, 7-12, 7-15, 7-20, 7-30, 7-40, 7-50, 7-60, 7-70, 7-80 ou 7-100, da SEQ ID NO: 6.
[00222] A invenção também apresenta proteína de fusão
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111/149 que inclui um fragmento aqui descrito e uma sequência heteróloga. Em certas modalidades, um dos parceiros de fusão é a proteína Fc (por exemplo, Fc de camundongo ou Fc humano). A fusão também pode ser uma sequência útil para a produção de anticorpos, por exemplo, uma proteína de ligação a maltose ou GST. Em outras modalidades, a proteína de fusão é uma etiqueta de purificação ou detecção, por exemplo, proteínas que podem ser detectadas direta ou indiretamente, tais como, proteína fluorescente verde, hemaglutinina ou fosfatase alcalina), domínios de ligação a DNA (por exemplo, GAL4 ou LexA), domínios de ativação de genes (por exemplo, GAL4 ou VP16), etiquetas de purificação ou peptídeos de sinal de secreção (por exemplo, sequência de sinal de preprotripsina). Em outras modalidades, o parceiro de fusão pode ser uma etiqueta, tal como c-myc, poli histidina ou FLAG. Cada parceiro de fusão pode conter um ou mais domínios, por exemplo, uma sequência de sinal de pré-protripsina e etiqueta FLAG.
[00223] Os fragmentos de CD40 e proteínas de fusão aqui descritas podem ser produzidos por transformação de uma célula hospedeira adequada com uma molécula polinucleotídica que codifica o fragmento polipeptídico ou proteína de fusão em um veículo de expressão adequado.
[00224] Qualquer um de uma ampla variedade de sistemas de expressão pode ser usado. Os sistemas de expressão
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112/149 exemplares incluem hospedeiros procarióticos (por exemplo, E. coli) e hospedeiros eucarióticos (por exemplo, S. cerevisiae, células de inseto, por exemplo, células Sf21 ou células de mamífero, por exemplo, células 3T3 NIH, HeLa ou preferivelmente COS). Tais células estão disponíveis a partir de uma vasta faixa de fontes (por exemplo, American Type Culture Collection, Manassas, VA). O método de transformação ou transfecção e a escolha do veículo de expressão dependerão do sistema hospedeiro selecionado. Os métodos de transformação e transfecção estão descritos, por exemplo, em Kucherlapati et al. (CRC Crit. Rev. Biochem. 16: 349-379, 1982) e em DNA Transfer to Cultured Cells (eds., Ravid e Freshney, Wiley-Liss, 1998); e os veículos de expressão podem ser escolhidos entre os fornecidos, por exemplo, em Vectors: Expression Systems: Essential Techniques (ed., Jones, Wiley & Sons Ltd., 1998).
[00225] Uma vez expressado o fragmento de polipeptídeo CD40 recombinante ou a proteína de fusão, este pode ser isolado, por exemplo, usando cromatografia por afinidade. Em um exemplo, um anticorpo específico para CD40 (por exemplo, um anticorpo ou seu fragmento como descrito aqui) pode ser afixado a uma coluna e usado para isolar o fragmento polipeptídico ou proteína de fusão. A lise e o fracionamento de células que abrigam ou fragmentos ou proteína de fusão antes da cromatografia por afinidade podem
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113/149 ser realizados por métodos padrão (ver, por exemplo, Methods in Enzymology, volume 182, eds., Abelson, Simon e Deutscher, Elsevier, 1990). Uma vez isolado, o fragmento de polipeptídeo CD40 ou proteína de fusão pode, se desejado, ser ainda purificado, por exemplo, por cromatografia líquida de alta eficiência (ver, por exemplo, Fisher, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, eds., Work and Burdon, Elsevier, 1980 e Scopes, Protein Purification: Principies and Practice, Terceira Edição, ed., Cantor, Springer, 1994).
[00226] Os fragmentos de polipeptídeo CD40 ou proteínas de fusão podem também ser produzidos por síntese química (por exemplo, pelos métodos descritos em Solid Phase Peptide Synthesis, 2a ed., 1984, The Pierce Chemical Co., Rockford, IL; e Solid-Phase Synthesis: A Practical Guide, ed., Kates e Albericio, Marcel Dekker Inc., 2000).
[00227] Os presentes anticorpos, porções de ligação a antígeno dos mesmos, composições e métodos podem ser usados em todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos e não mamíferos, incluindo humanos, camundongos, ratos, porquinhos da índia, hamsters, cães, gatos, vacas, cavalos, cabras, ovelhas, porcos, macacos, símios, gorilas, chimpanzés, coelhos, patos, gansos, galinhas, anfíbios, répteis e outros animais.
[00228] Os seguintes exemplos de aspectos específicos para realizar a presente descrição são oferecidos apenas
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114/149 para fins ilustrativos e não pretendem limitar de qualquer forma o escopo da presente descrição.
Exemplo 1 Produção e Identificação de Anticorpos de Murino Anti-CD40 [00229] Os camundongos (cepa AJ) foram imunizados com uma proteína de fusão consistindo no domínio extracelular de macaco Rhesus (M. mulatta) CD40 (sequência de aminoácidos: EPPTACREKQYLINSQCCSLCQPGQKLVSDCTEFTETECLPCSESEFLDTWNRETRCHQ HKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTICTCEEGLHCMSESCESCV; SEQ ID NO:5) fundida com proteína de ligação a maltose (CD40-MBP). A sequência de aminoácidos nesta região da proteína CD40 de macaco Rhesus difere da proteína CD40 humana em cinco posições de aminoácidos (sequência de aminoácidos humana: EPPTACREKQYLINSQCCSLCQPGQKLVSDCTEFTETECLPCGESEFLDTWNRETHCHQ HKYCDPNLGLRVQQKGTSETD TICTCEEGWHCTSEACESCV; SEQ ID NO:6). O CD40-MBP foi administrado a camundongos múltiplas vezes com adjuvante completo de Freund e adjuvante incompleto de Freund. Esplenócitos de camundongos imunizados foram fundidos com a linhagem celular de mieloma de camundongo SP2/0 e os híbridos selecionados usando tecnologia padrão de hibridoma.
[00230] Os anticorpos foram selecionados para reatividade a uma segunda proteína de fusão consistindo no mesmo domínio CD40 rhesus fundido com glutamina sintetase (CD40-GST). Anticorpos reativos a CD40-GST por ELISA foram
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115/149 ainda testados para reatividade a CD40 nativo expressado em células B de sangue de macaco Rhesus, células B de sangue humano e linhagens celulares linfoblastoides B de macaco Rhesus por citometria de fluxo. Como um nível final de seleção, os anticorpos foram testados em um ensaio in vitro quanto sua capacidade para inibir a ativação de células B humanas ou de macaco Rhesus após a co-cultura de células Jurkat D1.1 que expressam CD154. Um subclone estável do anticorpo anti-CD40 2C10 foi obtido por diluição limitante. O anticorpo é um camundongo IgG1-caps.
[00231] Lowe et al., A novel monoclonal antibody to CD40 prolongs islet allograft survival, Am. J. Transplant (2012) 12(8):2079-87.
Clonagem de anticorpo [00232] Regiões variáveis de anticorpos monoclonais podem ser clonadas usando qualquer método conhecido na técnica. Métodos baseados em PCR para obter sequências de região variável de anticorpo para células de hibridoma são descritos, por exemplo, em Larrick et al., Nat. Biotechnol. 7: 934-8, 1989 e em Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 86: 3833-7, 1989. Usando estas técnicas ou técnicas semelhantes, as regiões variáveis de anticorpos monoclonais podem ser clonadas e submetidas à manipulação adicional. No presente caso, as sequências variáveis das cadeias pesada e leve do anticorpo 2C10 foram clonadas e foram sequenciadas.
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O DNA que representa as regiões variáveis de cadeia pesada e leve de imunoglobulina do hibridoma 2C10 foi clonado usando
PCR RACE 5' empregando os seguintes iniciadores de DNA:
Capa de camundongo Reverso : 5' -CTA ACT CTC ATT CCT GTT GAA
GCT CTTGAC (SEQ ID NO: 7);
Capa de camundongo Direto: 5' -GCT GAT GCT GCA CCA ACT GTA
TCC -3' (SEQ ID NO: 8)
IgG1 de camundongo reverso : 5' - GGC AAC GTT GCA GGT CTC GC
- 3' (SEQ ID NO: 9)
IgG1 de rato direto: 5'- CTG GAT CTG CCC AAA ATO CCA CC - 3' (SEQ ID NO: 10) [00233] Os produtos de PCR foram clonados em um vetor de clonagem comercial e foram sequenciados usando técnicas de sequenciação padrão. As sequências resultantes são fornecidas na Figura 1.
[00234] Os genes da região variável de imunoglobulina foram clonados a partir dos hibridomas que segregam o clone 2C10 do anticorpo anti-CD40 e do clone 3A8 anti-CD40 humano (Kwekkeboom et al., Immunology 79: 439-44, 1993) (obtido da American Type Culture Collection, ATCC, Viena, VA) usando amplificação rápida 5' de reação em cadeia da polimerase de extremidades de cDNA. As regiões variáveis de cadeia pesada e leve de imunoglobulina foram subclonadas em vetores de expressão contendo sequências de região constante de cadeia leve capa de rhesus e cadeia pesada de IgG4 de Rhesus e de
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IgG1 de Rhesus.
[00235] As cadeias pesadas e leves recombinantes foram subclonadas em vetores de expressão e acondicionadas em vetores retrovirais usados para transduzir células de ovário de hamster chinês usando a tecnologia de expressão GPEx™ (Catalent Pharma Solutions, Middleton, WI). Desenvolveu-se um agrupamento de células transduzidas em meio isento de soro e o anticorpo secretado foi purificado por cromatografia por afinidade com proteína A. Os anticorpos IgG1 quiméricos purificados (2C10R1, 3A8R1) e IgG4 (2C10R4) foram diafiltrados em tampão fosfato; os níveis de endotoxina foram confirmados para serem menores que 1 unidade de endotoxina/mg.
Caracterização de anticorpo
2C10 liga-se a CD40 e impede a ligação do CD154 [00236] Para avaliar a capacidade de 2C10 se ligar CD40 de rhesus e de humano, CD40 humano ou de rhesus expressados por recombinação foram adsorvidos em placas de ELISA e reagiram com concentrações variáveis de 2C10. A ligação de 2C10 a CD40 foi detectada usando HRP de IgG de cabra anti-camundongo em um ELISA. Os resultados na Figura 2B mostram que 2C10 tem afinidades de ligação semelhantes a CD40 de rhesus e humano, o que é importante para tradução clínica de 2C10. Para confirmar a capacidade de 2C10 bloquear a ligação do seu ligante cognato, CD154, células B de rhesus
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118/149 e humano foram incubadas com concentrações crescentes de 2C10 ou um isótipo controle e depois incubadas com CD154 solúvel marcado com histidina (R & D Systems, Minneapolis, MN) e analisados para a expressão de histidina. 2C10 bloqueou a ligação de CD154 de uma maneira dependente da dose (Figura 3), indicando que 2C10 pode bloquear eficazmente a interação de CD154 ligado a células T com CD40 em células B e células apresentadoras de antígeno.
Tabela 2 Cinética de Ligação do Receptor CD40 de 2C10
Anticorpos anti-CD40 2C10 3A8 5D12 4D11 Chi220
Kativado (M-1 s-1) 2,73 x 103 0,223 x 103 1,51 x 103 1,25 x 103 0,413 x 103
Kdesativado (s ) 1,86 x 10-6 4,15 x 10-6 1,54 x 10-5 1,58 x 10-6 2,5 x 10-5
KD (M) 2,73 x 10-10 1,86 x 10-8 1,02 x 10-8 2,28 x 10-9 6,07 x 10-8
2C10 bloqueia a ativação de células B em macacos rhesus e células mononucleares de sangue periférico humano [00237] O anticorpo anti-CD40 2C10 foi caracterizado em relação à sua capacidade de afetar a ativação de células B usando células mononucleares de macaco rhesus e de sangue periférico humano (PBMCs). A expressão de CD20 foi escolhida como sendo um indicador de células B, e a expressão de CD23, CD80 e CD86 está associada à ativação de células B. O 2C10 foi primeiramente avaliado pela sua capacidade de se ligar ao CD20. PBMCs humanas ou de rhesus foram incubadas com 2C10 conjugado com fluorocromo e um anticorpo anti-CD20. A análise
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119/149 por citometria de fluxo para confirmar a ligação de 2C10 a células B CD20+ humanas e DE rhesus (Figura 2A). Em outro conjunto de experimentos, PBMCs de macaco rhesus ou humanas foram cultivadas na presença ou ausência de células Jurkat D1.1 CD154+, uma linhagem celular imortalizada de linfócitos T. A ativação de células B foi determinada medindo a expressão de três marcadores (CD23, CD80 e CD86) em células CD20+ presentes nas PBMCs. O esquema geral deste ensaio é mostrado na Figura 4. Como mostrado na Figura 4, a cultura de PBMCs na presença de células Jurkat resultou em expressão aumentada de todos os três marcadores, indicando que as células B são ativadas pelas células Jurkat CD154+.
[00238] Para testar a capacidade de anticorpos para bloquear a ativação de células B, as PBMCs e as células Jurkat foram co-cultivadas na presença ou ausência de um de três anticorpos: 3A8, 5C8 e 2C10. O anticorpo 3A8 é um anticorpo anti-CD40 de camundongo humano (Depósito ATCC N° HB-12024), e 5C8 é um anticorpo anti-CD154 (Depósito ATCC N° CRL-10915). Cada um foi usado como um controle positivo. As co-culturas foram conduzidas em uma faixa de cinco ordens de grandeza de concentração de anticorpo (0,001 pg a 10 pg). Como mostrado na Figura 5, 3A8 não bloqueou a ativação de células B em PBMCs de Rhesus, como medido pela expressão de CD23, enquanto ambos os 2C10 e 5C8 foram capazes de bloquear a ativação com eficiência semelhante. Alterações
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120/149 correspondentes também foram observadas com a expressão de CD80 e CD86. Estes resultados indicam que o 2C10 se liga a um epítopo diferente no CD40 do que no 3A8. Estes resultados também indicam que o 2C10 atua principalmente como um antagonista de CD40 em contraste com o 3A8 que anteriormente demonstrou atuar como agonistas parciais com potencial estimulador fraco (Adams et al., J. Immunol. 174: 542-50, 2005, Badell et al. al., Am. J. Transplant, aceito para publicação, 2011). Quando uma experiência semelhante foi realizada usando PBMCs humanas, em vez de rhesus, o 2C10 e o 5C8 foram novamente observados para bloquear a ativação das células B, medida pela expressão de CD86, com eficiência semelhante. Aqui, o anticorpo 3A8, ao contrário das PBMCs do tipo rhesus, bloqueou a ativação das células B (Figura 6).
[00239] Os anticorpos 2C10 e 3A8 foram também testados quanto à sua capacidade de ativar células B na ausência de células Jurkat usando macaco rhesus ou PBMCs humanas. Aqui, as PBMCs foram cultivadas na presença ou ausência de 2C10 ou 3A8. A expressão de CD23, CD80 e CD86 foi então medida em células CD20+. Como mostrado na Figura 7, a expressão de CD23 em células rhesus foi aumentada na presença do anticorpo 3A8, mas não do 2C10. Em contraste, nem 3A8 nem 2C10 ativaram células B humanas. As diferenças na atividade observada entre os anticorpos 3A8 e 2C10 indicam que o anticorpo 2C10 se liga a um epítopo diferente do anticorpo 3A8.
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2C10 impede uma resposta de anticorpos dependente de células [00240] Tendo estabelecido que 2C10 se liga a um epítopo único em CD40, inibe a ativação de células B de forma semelhante a um anticorpo anti-CD154 e não tem propriedades agonistas, então caracterizados os efeitos de 2C10 in vivo. Formas quiméricas recombinantes de camundongo-Rhesus de 2C10 foram geradas usando sequências de regiões constantes de cadeia leve capa e de rhesus e de cadeia pesada de IgG1 (2C10R1) ou IgG4 (2C10R4). Uma forma de IgG1 quimérica rhesus de 3A8 (3A8R1) também foi gerada para uso como um controle.
[00241] Os macacos rhesus foram imunizados uma vez no dia zero com o antígeno de hemocianina de lapa californiana (KLH, 10 mg a 1M) conjugado com 4-hidroxi-3nitrofenilacetila (Biosearch Technologies, Novato, CA). Antes da imunização e em uma semana, coortes de três animais receberam uma dose intravenosa (50 mg/kg) de 2C10R1, 2C10R4, 3A8R1 ou solução salina. Todos os animais foram observados por 70 dias, e a citometria de fluxo foi realizada semanalmente. O tratamento com ambos os isótipos 2C10 recombinantes resultou em uma modesta alteração nas contagens de células B periféricas (Figura 8) comparativamente com o esgotamento significativo e prolongado anteriormente relatado de células B periféricas que ocorrem em animais que receberam 3A8R1 (Badell et al.,
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Am. J. Transplant. 10: 214, 2010) ou Chi220 (Adams et al., J. Immunol. 174: 542-50, 2005).
[00242] As respostas de anticorpos dependentes de células T a KLH-NP foram testadas por ELISA. As placas foram revestidas com KLH (0,01 mg/ml, Sigma, St. Louis, MO) e bloqueadas com Super Block (Thermo Scientific, Woodstock, GA). Amostras de plasma pré e pós-tratamento foram diluídas em série, plaqueadas por 1 h, e lavadas com solução salina tamponada com fosfato/Tween a 0,05%. Os anticorpos anti-KLH foram detectados por incubação durante 1 h com peroxidase de rábano de IgG anti-rhesus monoclonal (clone 1B3, Recurso de Reagente NHP, Boston, MA). As placas foram então incubadas com solução de substrato de peroxidase (KPL). A solução de paragem (KPL) foi então adicionada, e a densidade óptica foi lida em um leitor de placas ELISA a 450 nm. Uma amostra foi considerada positiva para uma determinada diluição se a leitura da densidade óptica do plasma pós-tratamento excedesse em 2 vezes a densidade óptica do plasma de prétratamento com a mesma diluição. Após a imunização com KLH, os animais de controle desenvolveram IgG específica para KLH de título alto (Figura 9). Os animais que receberam 3A8R1 também desenvolveram respostas anti-KLH, mas os títulos foram aproximadamente 10 vezes menores que os controles, apesar da significativa esgotamento de células B. Em contraste, a geração de anticorpos IgG anti-KLH foi quase
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123/149 completamente bloqueada até ao dia 56 em todos os animais que receberam 2C10R1 ou 2C10R4.
2C10 prolonga significativamente a sobrevivência de aloenxerto de ilhotas em um modelo de macaco de transplante de ilhotas alogênicas [00243] Foram testados ainda 2C10R4, o anticorpo IgG4 de rhesus quimérico purificado por CD4, em um modelo de transplante de ilhotas alogênicas de primatas não humanos (Figura 10). Macacos rhesus com peso de 10-20 kg foram submetidos a pancreatectomia doadora um dia antes do transplante através de laparotomia mediana. O pâncreas foi isolado e colocado em gelo após os animais terem sido exsanguinados terminalmente. O isolamento das ilhotas foi realizado usando Colagenase/protease neutro (950 unidades Wunsch e 63 unidades, respectivamente; Serva, Heidelberg, Alemanha). O pâncreas digerido foi purificado em um gradiente Euroficoll descontínuo de quatro camadas (Mediatech, Manassas, VA) e processador de células sanguíneas Cobe 2991 (CaridianBCT, Lakewood, CO). As amostras da preparação final das ilhotas foram contadas e expressadas como equivalentes de ilhotas (IEQ). As ilhotas isoladas foram cultivadas durante a noite, contadas e suspensas em Meios de Transplante (Mediatech).
[00244] Macacos rhesus pesando 3-5 kg foram tornados diabéticos usando estreptozotocina (1250 mg/m2 IV; Zanosar,
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Teva Parenteral Medicines, Irvine, CA) quatro semanas antes do transplante. A diabetes foi confirmada pelo teste de tolerância de glicose intravenosa (IVGTT) com um bolo de 500 mg/kg de dextrose e medição do peptídeo C de primata. Os níveis de glicose foram monitorados e o peptídeo C foi medido na linha de base e 10, 30, 60 e 90 após a injeção de dextrose. O diabetes foi confirmado pela medição de elevados níveis de glicose no sangue na ausência de peptídeo C no soro detectável. Receptores diabéticos foram submetidos a alotransplante de ilhotas incompatíveis com MHC. Uma média de 15,745 (± 4,063) IEQ foi infundida através de uma pequena laparotomia mediana e canulação de uma veia mesentérica.
[00245] Os níveis de glicose no sangue foram medidos duas vezes ao dia por furos na orelha; as insulinas NPH (Novolin; Novo Nordisk, Princeton, NJ) e glargina (Lantus; Sanofi-Aventis, Bridgewater, NJ) foram administradas para manter a glicose no sangue em jejum (FBG) menor que 300 mg/dL pré-transplante e após a rejeição do enxerto. O IVGTT foi realizado periodicamente após o transplante para monitorar a função do enxerto. Os receptores de transplante foram submetidos à análise citométrica de fluxo semanal para monitorar as populações de células T (CD3 V450, CD4 PerCPCy5.5, CD8 PerCp; BD Bioscience) e células B (CD20 PE, BD Bioscience). Após rejeição de enxerto de ilhotas foi definida como FBG maior que 130 mg/dL em dois dias consecutivos. O
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125/149 parâmetro final primário foi a sobrevida do enxerto de ilhotas livre de rejeição.
[00246] Os receptores de transplantes receberam 2C10R4, basiliximab (Simulect, Novartis, Basiléia, Suíça) e sirolimus, ou basiliximab e sirolimus isoladamente. 2C10R4 (50 mg/kg) foi administrado intravenosamente no dia pósoperatório (POD) 0 e 7. O basiliximab (0,3 mg/kg) foi administrado intravenosamente no POD 0 e 3. O sirolimus foi administrado por via intramuscular diariamente para atingir níveis de 5- 15 ng/ml através de POD 120. Todos os três animais que recebem basiliximab e sirolimus isolados são controles históricos (Badell et al., J. Clin. Invest. 120: 4520-312, 2010). Dois desses controles históricos (RQz6 e RIb7) foram submetidos à indução do diabetes por pancreatectomia e receberam sirolimus por via oral.
[00247] O tratamento com os regimes descritos acima resultou em uma sobrevivência de enxerto de ilhotas significativamente prolongada (Figura 11A) em comparação com os controles que receberam apenas indução com basiliximab e terapia de manutenção com sirolimus (Figura 11B). O tempo mediano de sobrevivência do enxerto livre de rejeição para animais que recebem 2C10R4 é de 280 dias em comparação com 8 dias para animais de controle (p = 0,010, Tabela 3). Os dados farmacocinéticos predizem que os níveis plasmáticos de 2C10R4 seriam menores que 1 pg/ml em POD 100. Como o
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126/149 sirolimus foi descontinuado em POD120, o receptor com a maior sobrevivência (304 dias) não recebeu imunossupressão por aproximadamente 24 semanas antes da rejeição. Nenhum animal tratado com 2C10R4 desenvolveu complicações infecciosas clinicamente relevantes ou perda de peso. Esses resultados refletem animais que receberam o isótipo IgG4 de 2C10. Dois animais adicionais que receberam o isótipo IgG1 de 2C10 (2C10R1) em combinação com basiliximab e sirolimus alcançaram uma sobrevivência de enxerto prolongada semelhante de 220 e 162 dias. Dados os resultados positivos com o uso de 2C10 como terapia de indução, a próxima etapa é avaliar os efeitos sobre a sobrevida do enxerto pela administração de 2C10 como terapia de manutenção.
Tabela 3
Receptor Terapia 1EQ/kg Sobrevivência de enxerto (dias) Comentário
DPA4 2C10R4/Basiliximab/Sirolimus 21,973 296 Rejeição
RAo13 2C10R4/Basiliximab/Sirolimus 14,388 304 Rejeição
RZq13 2C10R4/Basiliximab/Sirolimus 15,881 265 Rejeição
RRq13 2C10R4/Basiliximab/Sirolimus 20,596 163 Rejeição
RQz6 Basiliximab/Sirolimus 12,980 8 Rejeição
R1b7 Basiliximab/Sirolimus 10,903 8 Rejeição
RMc11 Basiliximab/Sirolimus 13,796 10 Rejeição
Bloqueio da via CD40/CD154 em conjunto com a via CD28/B7 [00248] O bloqueio da via CD40/CD154 pode ser útil em conjunto com outros agentes de bloqueio de coestimulação.
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Belatacept, uma versão de alta afinidade de CTLA4-Ig projetado para bloquear as vias costimuladoras CD28/B7, demonstrou eficácia em modelos de primatas não humanos de transplante de rim e ilhotas e em ensaios clínicos de fase II e III em transplante renal (Larsen et al., Transplantation 90:1528-35, 2010, Vincenti et al., Am. J. Transplant, 10:53546, 2010, Adams et al., J. Immunol. 174:542-50, 2005, Adams et al., Diabetes 51:265-70, 2002, Larsen et al., Am. J. Transplant, 5:443-53, 2005, Vincenti et al., N. Engl. J. Med. 358:770-81, 2005). O ensaio BENEFIT revelou uma função renal superior em pacientes tratados com belatacept; no entanto, esses pacientes tiveram uma maior incidência e grau mais grave de rejeição aguda comprovada por biópsia (Larsen et al., Transplantation 90: 1528-35, 2010; Vincenti et al., Am. J. Transplant. 10: 535-46, 2010). À luz desta taxa aumentada de rejeição aguda e da sinergia entre o bloqueio de CD40 e B7 (Larsen et al., Nature 381: 434-8, 1996), testaremos em seguida a eficácia da terapia combinada de 2C10 e belatacept no transplante renal de primata não humano.
Exemplo 2 Anticorpos Anti-CD40 Humanizados [00249] Um novo Ab humanizado desenvolvido e caracterizado para CD40 chamado h2C10 (anticorpo 2C10 humanizado) que foi selecionado como um antagonista funcional completo de CD40. Os epítopos de ligação foram cuidadosamente projetados para conferir propriedades de
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128/149 ligação únicas que o distinguem de moléculas competidoras que ativam ou esgotam as células B ou atuam como agonistas parciais. A versão quimérica de primata de camundongo precoce do anticorpo primata foi investigada em estudos pré-clínicos relevantes in vitro e in vivo, incluindo múltiplos estudos em primatas não humanos que demonstram eficácia promissora contra a rejeição de transplante e prolongamento da sobrevida de aloenxerto e xenoenxerto, e um perfil de segurança não clínica favorável. Completamos também a humanização do 2C10 (h2C10), que exibe excelentes características.
[00250] Para produzir os anticorpos anti-CD40 humanizados, as sequências da região variável do anticorpo de murino 2C10 foram utilizadas para pesquisar a base de dados de anticorpos humanos. Verificou-se que a VH estava principalmente relacionada com as sequências de anticorpos da linhagen germinal VH1-46, VH1-69 e VH1-3 (SEQ ID NO: 30), enquanto que o VL estava principalmente relacionado com as sequências de anticorpos da linhagen germinal VK3-11 (SEQ ID NO: 31), VK1-39 e VK6-21. As VH1-3 e VK3-11 humanas foram escolhidas para serem a armação do aceitador para enxerto de CDR devido ao alto uso relativo no repertório humano e boa conservação nas posições críticas da armação. Modelos 3D foram construídos com ambas as regiões variáveis após enxertar as CDRs do anticorpo 2C10 de murino nas armações do aceitador humanas. Verificou-se que seis resíduos da armação
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129/149 de VH de murídeo que são diferentes das contrapartes de humanos estão potencialmente em contato com as CDRs: M48, A67, L69, A71, K73 e N76. Após a modelagem, três sequencias de VH humanizadas 2C10_h1, 2C10_h2 e 2C10_h3 foram projetadas para conter 0, 2 e 6 resíduos da armação de murino, respectivamente (Figura 13a). Similarmente, cinco resíduos de armação de VK de murino foram identificados como potencialmente em contato com as CDRs: Q1, R46, W47, V58 e Y71. Após a modelagem, duas sequências VL humanizadas 2C10_l1 e 2C10_l2 foram projetadas para conter 0 e 4 resíduos de armação de murino, respectivamente (Figura 13b).
[00251] O anticorpo 2C10 de murino precursor foi humanizado por enxerto de CDR. As armações da linhagem germinativa VH1-3 e VK3-11 de anticorpo humano foram escolhidas para serem o aceitador. Foram projetadas três sequências VH e duas VL e todos os 6 anticorpos humanizados foram produzidos e testados quanto à ligação de CD40 humano.
[00252] Verificou-se que as construções 2C10-pesada3 (2C10_h3) e 2C10-leve-2 (2C10_2) produzem o melhor anticorpo com afinidade de ligação a CD40 de 0,39 nM, dentro de 2 vezes o do 2C10 de murino (0,22 nM) (Tabela 2). As regiões variáveis humanizadas foram utilizadas para construir o anticorpo humanizado candidato clínico como uma IgG4 ou uma IgG4 estabilizada, que foi clonada no sistema de expressão SwiMR.
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130/149 [00253] Linhagens de células de CHO estáveis de alta produção foram isoladas por FACS e triadas por três ciclos de ELISA e uma rodada de cultura alimentada em batelada. Sete clones foram isolados que produziram mais de 0,8 g/L de 2C10 humanizado em uma cultura alimentada em batelada. O melhor clone 3C9-I6 produziu ~ 1,2 g/L sob condições não otimizadas.
Construção de vetores de expressão de anticorpos [00254] As sequências de VH humanizadas foram sintetizadas por genes e clonadas no vetor pFUSE-CHIg-hG2a (Invivogen) contendo a região constante de cadeia pesada de IgG2 humana para produzir o vetor de expressão LB300-302. As sequências de VK humanizadas foram sintetizadas por genes e clonadas em um vetor de expressão contendo a região constante de cadeia leve capa humana para preparar o vetor de expressão LB303-304. As cadeias pesada e leve estavam a jusante do promotor de EF1a humano para expressão de células de mamífero fortes e constitutivas. O anticorpo 2C10 quimérico foi também construído de modo semelhante utilizando VH e VL de murinos para preparar o vetor de expressão LB305 e LB306, respectivamente. Os vetores de expressão de anticorpos foram resumidos na Tabela 4.
Tabela 4 Vetores de Expressão de Anticorpo
Plasmídeo VH/VK CH/CK Promotor Seleção
LB300 2C10 h1 hIgG2 CH hEF1a Zeocina
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LB301 2C10 h2 hIgG2 CH hEF1a Zeocina
LB302 2C10 h3 hIgG2 CH hEF1a Zeocina
LB303 2C10 l1 hCK hEF1a Neomicina
LB304 2C10 l2 hCK hEF1a Neomicina
LB305 2C10 VH hIgG2 CH hEF1a Zeocina
LB306 2C10 VK hCK hEF1a Neomicina
LB308 2C10 h3 hIgG4 CH hEF1a Zeocina
LB309 2C10_h3 hIgG4 CH (S241P) hEF1a Zeocina
[00255] Cada vetor da Tabela 4 contém um cassete de expressão de cadeia pesada ou cadeia leve sob o controle do promotor EF1a humano. Os vetores LB300-302, LB305 contêm a região constante de cadeia pesada de IgG2 humana. Os vetores LB308-309 contêm a região constante de cadeia pesada de IgG4 humana. Os vetores LB303-304, LB306 contêm a região constante de cadeia leve capa humana.
Produção do anticorpo IgG4 humanizada [00256] De modo a minimizar ainda mais a função efetora potencial, o anticorpo humanizado com a melhor atividade de ligação (2C10_h3 e 2C10_2) foi convertido em IgG4 humana ou IgG4 humana estabilizada (S241P). A região variável de cadeia pesada 2C10_h3 foi primeiro clonada no vetor pFUSE-CHIg-hG4 (Invivogen) contendo a região constante de cadeia pesada de IgG4 humana, antes da introdução da mutação estabilizadora S241P (Tabela 4). As IgG4 e IgG4 humanizadas (S241P) foram purificadas a partir de células 293F após transfecção transiente. O rendimento de produção foi de 25-35 mg/l, duas vezes superior ao dos anticorpos
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IgG2. O anticorpo IgG4 pareceu ter uma pequena quantidade de meia molécula, que foi significativamente reduzida no anticorpo IgG4 estabilizado. A sequência de DNA e aminoácidos do anticorpo IgG4 estabilizado é mostrada na Figura 21. Clonagem do anticorpo IgG4 (S241P) humanizado no vetor de expressão de SwiMR [00257] A expressão de SwiMR foi desenvolvida para o desenvolvimento fácil de linhagens celulares de produção de anticorpos, utilizando um repórter de membrana comutável para facilitar o isolamento de células altamente produtivas através de triagem de células ativadas por fluorescência (FACS). Um cassete de expressão bicistrônico mediado por IRES de GFP ancorada na membrana foi colocada a jusante do gene de interesse (GOI). O cassete de IRES-GFP foi flanqueado por sítios LoxP para posterior remoção do cromossoma. O nível de expressão de GFP foi usado para marcar o nível de expressão do GOI. Células altamente produtivas foram isoladas por FACS e depois tratadas com Cre recombinase para remover o cassete de GFP. O 2C10 humanizado no formato de IgG4 estabilizado foi clonado no sistema de expressão SwiMR para preparar o vetor LB312. As cadeias pesada e leve foram clonadas em dois cassetes de expressão separados sob o controle dos promotores EF1a Humanos. O cassete de IRES-GFP foi colocado a jusante da sequência de cadeia pesada e foi flanqueado por dois sítios LoxP. O plasmídeo transporta um
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133/149 gene de resistência a puromicina para seleção de células de mamífero e um gene de β-lactamase para propagação bacteriana. Seleção estável das células de CHO e isolamento das células de alta produção [00258] 100 ml de células de CHOS (1 x 106 células/ml, Invitrogen) foram transfectadas com 120 ug de LB312 linearizado por digestão com restrição de Asc I e 120 ul de regente Freestyle Max (Invitrogen). As células foram selecionadas com 10 - 20 ug/mL de puromicina por 2 semanas. O perfil de expressão GFP do grupamento estável foi caracterizado por citometria de fluxo. O 1% superior das células com o sinal de GFP mais alto foi classificado como Grupamento # 1 contendo 100.000 células. Após cultura por 2 semanas, o Grupamento # 1 foi analisado novamente quanto à expressão de GFP por citometria de fluxo. O 1% superior das células com o sinal de GFP mais alto foi classificado novamente como Grupamento # 2 contendo 100.000 células. Após a cultura por 2 dias, o Grupamento # 2 foi tratado com 2 uM de recombinante de DNA recombinante permeável a membrana recombinante (TAT-NLS-Cre, Excellgen). O perfil de expressão GFP foi analisado após 1 semana de cultura. ~ 10% das células perderam completamente a expressão de GFP indicando remoção bem-sucedida do cassete de expressão de GFP do cromossomo. As células negativas de GFP foram classificadas como células únicas em placas de 384 cavidades. Após 2 semanas, ~ 800
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134/149 colônias cresceram a partir de 10 x em placas 384 cavidades. Anticorpos humanizados adicionais [00259] Os anticorpos humanizados foram também gerados utilizando duas sequências VH enxertadas com CDR e VL enxertadas com CDR clonadas em uma armação de linhagem germinativa humana VH1-69 e VL1-39. Foram feitas duas cadeias pesadas (HB1 e HB2) e duas leves (KB1 e KB2) nestes experimentos adicionais. As sequências das cadeias pesada e leve HP + KP servem como controle positivo. A combinação destas construções foi transitoriamente expressada em células HEK293, o anticorpo foi purificado por cromatografia em proteína A e testado quanto à ligação a hCD40.
[00260] A Figura 14 mostra as alterações de aminoácidos na armação 3 entre 2C10HP e 2C10HB1, bem como construções 2C10HB2. A Figura 15 mostra as sequências das regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve para anticorpos 2C10 humanizados. As regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve incluem 2C10HP, 2C10HB1, 2C10HB2, 2C10KP, 2C10KB1 e 2C10KB2. Portanto, em certas modalidades, um anticorpo anti-CD40 pode incluir qualquer uma das seguintes combinações 2C10H-K:
1. 2C10HP + 2C10KP
2. 2C10HB1 + 2C10KB1
3. 2C10HB1 + 2C10KB2
4. 2C10HB1 + 2C10KP
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5. 2C10HB2 + 2C10KB2
6. 2C10HB2 + 2C10KB1
7. 2C10HB2 + 2C10KP
8. 2C10HP + 2C10KB1
9. 2C10HP + 2C10KB2
Ligação in vitro de CD40 com anticorpos purificados [00261] Os anticorpos humanizados e o anticorpo quimérico foram purificados após transfecção transiente de 100 ou 200 ml de células 293F. Os anticorpos foram purificados com uma coluna de Proteína A do meio condicionado colhido 4 dias após a transfecção.
Determinação da cinética de ligação de CD40 [00262] A cinética de ligação do CD40 foi determinada no Forte Bio (contratado para a Aragen Bioscience). O CD40 purificado foi biotinilado e imobilizado em biossensores de estreptavidina.
Bioprodução para estudo in vivo [00263] Após transfecção de células de CHO e seleção de células estavelmente transfectadas, o anticorpo foi purificado por coluna de proteína A e seguido por troca de tampão (citrato de sódio a 20 mM, NaCl a 50 mM, maltose a 5%, pH 6,0) e filtração a 0,2 μη. O Grupamento # 1 foi usado para configurar a cultura em wave bag de 25L em meio CD FortiCHO (Invitrogen). A cultura foi alimentada três vezes no dia 3, 5 e 7 com 10% de Alimentação C Eficiente CD
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136/149 (Invitrogen). O rendimento final do anticorpo purificado foi de 1,6 g no total. O anticorpo foi caracterizado por análise por SDS-PAGE e SEC-HPLC e foi 99,4% puro como anticorpo monomérico.
Desenvolvimento de linhagem celular [00264] As colônias de células individuais foram triadas por 3 rodadas de ELISA e 1 rodada de produção alimentadas em batelada. As células foram mantidas em meio CD FortiCHO durante todo o processo de triagem. Todas as colônias de placas de 384 cavidades foram coletadas em placas de 96 cavidades. Foram utilizados 1,2 pl de meio de cultura de cada cavidade para triar anticorpos em placas de ELISA revestidas com anticorpo Fc anti-humano. Os 240 clones superiores foram expandidos em 10 x em placas de 24 cavidades. Após a cultura por 5 dias, 1,2 mL de meio de cultura foram novamente triados para o nível de anticorpos, os 60 clones superiores foram expandidos em 10 x em placas de 6 cavidades e cultivados em incubadora com agitação. Após cultura por 5 dias, as placas de 6 cavidades foram duplicadas por passagem das células 1:10 para um novo conjunto de placas de 6 cavidades. As culturas no conjunto original das placas de 6 cavidades foram deixadas crescer até à extinção, seguindo-se a determinação do nível de anticorpos por ELISA. Os 24 clones superiores no conjunto duplicado de placas de 6 cavidades foram expandidos em 30 ml de cultura em frascos
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137/149 de agitação de 125 ml. Os clones foram submetidos a uma produção de 30 ml alimentados em batelada. A estratégia de alimentação foi de 7,5% de Alimentação de CHO Ex-Cell Advanced (Sigma) nos dias 3, 5, 7, 9 e 11. O clone superior 3C9-I6 exibiu título de produção de ~ 1,2 g/L.
Farmacologia In Vitro de 2C10 Quimérico de Primata e 2C10 Humanizado [00265] Foram identificamos os seguintes importantes
atributos farmacológicos in vitro para nosso principal
candidato:
• Supressão da ativação de células B induzida pela
associação CD154-CD40
• Nenhuma ativação direta de células B
• Antagonista de alta afinidade de CD40 (por exemplo, Kd é cerca de 10-10M ou inferior, cerca de 10-10M a cerca de 10-9M, ou conforme aqui descrito).
[00266] Através de uma nova abordagem de imunização e uma extensa abordagem de triagem in vitro, foi identificado um anticorpo anti-CD40 que satisfaz estes critérios e representa um anticorpo antagonista de não esgotamento/não ativação do CD40 humano.
[00267] Estudos in vitro e in vivo confirmaram que a forma humanizada mantém excelentes propriedades.
[00268] Como descrito na seção anterior, o mAb 2C10 foi humanizado por enxerto de CDR em armações de cadeias
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138/149 pesadas e leves humanas. Para manter as propriedades do mAc 2C10 original, as construções 2C10 humanizadas foram triadas por Biacore para afinidade para o CD40 humano. Todos os três anticorpos de 2C10 humanizados de topo exibiram apenas ligeira redução na afinidade em aproximadamente duas vezes, em relação ao mAc parente de 2C10 (Tabela 5). Mais importante ainda, todos eles mantiveram a excepcional taxa de desaceleração do mAb 2C10 precursor. Entre estes anticorpos, o clone 2.189.2 que exibiu a maior afinidade a 390 pM foi selecionado como o mAb humanizado de chumbo (h2C10).
Tabela 5: Cinética de Ligação do Receptor CD40 de Versões Humanizadas de 2C10
mAb Kd (M) Kativado (1/Ms) Kdesativado (1/s) Rmax Total ΧΛ2 Total RΛ2
2C10 2,22E-10 1,48E+05 6,01E-05 0,3124 0,284838 0,993451
2.189.1 5,11E-10 1,98E+05 1,85E-04 0,3917 0,490659 0,991111
2.189.2 3,90E-10 1,79E+05 1,28E-04 0,3946 0,401784 0,991697
2.191.1 5,61E-10 1,84E+05 1,88E-04 0,3924 0,402934 0,992955
[00269] Comparando a cinética de ligação de 2C10 humanizado a concorrentes, a afinidade global de h2C10 permanece substancialmente melhor do que os concorrentes que possuem afinidades na faixa nanomolar. Também comparamos a afinidade de ligação de h2C10 entre CD40 e CD40 humanos daqueles de espécies de primatas não humanos usados em avaliações pré-clínicas. Como mostrado na Figura 16, h2C10 tem afinidade comparável para o CD40 através destas espécies
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139/149 de primatas.
Caracterização in vivo de 2C10 de primatas quiméricos e humanizados [00270] As avaliações farmacodinâmicas, farmacocinéticas e avaliações de segurança exploratória in vivo de 2C10 foram conduzidas em macacos rhesus usando a construção quimérica de primatas de 2C10 e o anticorpo h2C10 humanizado candidato clínico. Após seleção da versão humanizada de condução de 2C10 (mAb 2.189.2; h2C10) com base na cinética de ligação in vitro, h2C10 foi avançado em um estudo de PK/PD em macacos rhesus para caracterizar as suas propriedades adicionais. Os dados gerados nestes estudos, que abrangem uma ampla faixa de parâmetros finais experimentais críticos, estabelecem claramente as excelentes propriedades de h2C10.
[00271] Estudos foram concluídos em macacos rhesus examinando PD, PK e parâmetros finais de segurança. Os elementos críticos dos desenhos do estudo, incluindo os principais parâmetros e objetivos, estão resumidos na Tabela 6 (Estudos Farmacodinâmicos (PD), Farmacocinéticos (PK) e de Estudos de Segurança do 2C10 em Macacos Rhesus). Os principais resultados e avaliações comparativas relevantes sobre os principais parâmetros experimentais incluíram:
• Efeito no número de linfócitos B e T no sangue • Efeito na resposta imune humoral ao antígeno
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140/149 dependente de células T de Hemocianina de Lapa Californiana (KLH) • Ocupação dos receptores CD40 nas células B sanguíneas (PD) • Farmacocinética (PK) • Imunogeneicidade avaliada pela formação de anticorpos antifármaco (ADA) • A toxicologia exploratória inclui CBC, química sérica e necropsia completa
Figure BR112018004296B1_D0001
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Tabela 6. Estudos de PD, PK e de Segurança de 2C10 em Macacos Rhesus
Exceto # Objetivo Chave (s) Versões teste Tamanho do Grupo Doses de Teste/ Regime Período de Acompanhamento Parâmetros chave
1 Comparar 2C10 de 3 Duas Doses; 56 Dias CBC
formas IgG1 Primata 50 mk/kg, IV Subconjuntos de
e IgG4 e quimérico em Dias 0 e Linfócitos
Competidor 7; Controle Primários de TDAR
3A8 de solução (anti-KLH)
salina
2 Avaliação 2C10 IgG4 3 Uma Dose; 56 Dias CBC
de Resposta de Primata 5, 10, 25, Subconjuntos de
à Dose quimérico 50 mg/kg, Linfócitos
IV; Controle Subconjuntos de
de IgG Células B
irrelevante Detalhadas
TDAR (resposta
primária e de
rechamada a KLH)
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3 Avaliação 2C10 IgG4 2 Duas Doses; 14 Dias após CBC
de de Primata 25 mg/kg, IV segunda dose (28 Química sérica
Segurança/ quimérico no Dia 0 e Dias no Total) Necrópsia de
Toxicologia 14; Controle Subconjuntos de
Exploratóri Histórico Linfócitos
a Patologia Bruta &
Microscópica
4 PK, PD, 2C10 IgG4 3 Uma Dose; 28 Dias Ocupação do
Segurança Humanizado 10, 25 receptor CBC
mg/kg, IV; Química sérica
Controle de Subconjuntos de
Solução Linfócitos
salina TDAR Primário
(anti-KLH)PK
ADA
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143/149 [00272] Os resultados do estudo estão resumidos na seção seguinte. O h2C10 pode ser utilizado para o tratamento de condições em que se espera que o bloqueio seletivo da ativação do receptor de CD40 na ausência de esgotamento de células B proporcione benefícios terapêuticos.
Efeitos sobre a imunidade mediada por células T [00273] Para provar in vivo que o h2C10 bloqueia respostas de anticorpos dependentes de células T (TDAR) in vivo, os macacos foram imunizados com KLH 6 horas após a administração de h2C10. Os títulos de anticorpos contra KLH foram medidos semanalmente depois disso.
[00274] Doses de 10 e 25 mg/kg de h2C10 foram administradas a macacos, seguidas de um desafio com KLH. Os títulos de IgG e IgM anti-KLH foram determinados semanalmente até ao dia 28 após o tratamento. A Figura 17 mostra que a versão humanizada de 2C10 atingiu a inibição completa da resposta do anticorpo KLH à dose mais alta e, na maior parte dos casos, ao nível da dose de 10 mg/kg. Ambas as respostas IgM e IgG foram prevenidas.
Efeitos não esgotáveis nas células B [00275] Como objetivos no desenvolvimento de um anticorpo CD40 antagonista incluiu a minimização da esgotamento de células CD40+ alvo, os efeitos nas subpopulações de linfócitos foram analisados, especialmente
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144/149 o efeito nas células B.
[00276] O tratamento de macacos com 10 ou 25 mg/kg da forma humanizada de 2C10 (h2C10) também não teve efeito de esgotamento apreciável nas células B, embora o alvo CD40 esteja totalmente saturado pelo anticorpo a estas concentrações (ver Seção seguinte Ocupação do Receptor).
[00277] Apesar da saturação dos sítios de ligação 2C10 em células B que duraram até o último dia medido (Dia 28), todos os macacos que receberam uma dose de h2C10 mantiveram subconjuntos de linfócitos B e T normais (Figura 18). Estes resultados demonstram que a injeção com uma dose tão baixa como 10 mg/kg de 2C10 pode persistentemente ligar o CD40, o seu alvo terapêutico em células B (e presumivelmente monócitos e outras células apresentadoras de antígeno) sem causar esgotamento indesejada de células B em macacos.
[00278] A demonstração de que 2C10 não empobrece as células B sugere uma clara vantagem sobre os concorrentes, além de 3A8 e Chi220.
Farmacodinâmica
Ocupação do Receptor CD40 [00279] A associação e a ocupação alvo de CD40 pelas versões quimérica e humanizada de primatas de 2C10 foram determinadas medindo os sítios de ligação disponíveis para 2C10 a CD40 em células B CD20+ por citometria de fluxo utilizando 2C10 marcado fluorescentemente e um anticorpo
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145/149 anti-CD40 marcado, não competidor. Amostras de sangue foram coletadas em vários dias a partir de macacos de controle e macacos tratados com IgG4 quimérica de primata ou 2C10 humanizado e analisadas por FACS. O grau de associação alvo (% de ocupação dos receptores) foi calculado diretamente a partir dos registros de intensidade de fluorescência média.
[00280] Os anticorpos 2C10 humanizados foram administrados intravenosamente em doses únicas de 10 e 25 mg/kg. A superfície CD40 nas células B estava completamente saturada no Dia 3, e o efeito persistiu até ao último dia medido (Dia 28) em todos os macacos que receberam qualquer das doses de h2C10. Dados representativos da análise de citometria de fluxo de sangue coletado de macacos 28 dias após o tratamento com 2C10 humanizado é mostrado na Figura 19.
[00281] Estes resultados demonstram que uma única injeção de h2C10 em uma dose tão baixa quanto 10 mg/kg pode saturar completamente os receptores CD40 nas células B por pelo menos 28 dias.
Farmacocinética e Resposta a Anticorpo Antifármaco [00282] Para estabelecer uma ligação clara entre os efeitos farmacodinâmicos de 2C10 com base na ocupação dos receptores CD40 e a farmacocinética de 2C10, as concentrações plasmáticas de 2C10 foram medidas no plasma a partir das mesmas amostras de sangue nas quais a ocupação dos receptores
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146/149 foi determinada. A análise da concentração plasmática também possibilitou a caracterização do perfil farmacocinético de 2C10, principalmente sua persistência no plasma, determinada pela sua meia-vida. Esta determinação fornece orientação para a frequência de dosagem que será necessária para manter concentrações terapêuticas eficazes.
[00283] As concentrações séricas médias determinadas em macacos tratados com 10 ou 25 mg/kg de 2C10 humanizado são mostradas na Figura 20. Esses dados demonstram que os animais foram expostos a 2C10 por toda a duração do estudo, e que o 2C10 humanizado tem meia-vida em macacos de aproximadamente 15 dias (variando de 9 a 20 dias). Esta meiavida está na faixa do esperado para um anticorpo terapêutico em primatas, e deve suportar um cronograma de dosagem relativamente infrequente em investigações clínicas (por exemplo, não mais do que uma vez a cada duas semanas). A modelagem adicional do conjunto de dados completo permitirá uma estimativa robusta da dose e da frequência necessárias para manter concentrações efetivas de anticorpos em estudos clínicos iniciais de h2C10.
[00284] Outra avaliação do 2C10 humanizado foi o potencial desenvolvimento de anticorpos contra h2C10 (ADA). Isto pode ocorrer quando os agentes biológicos de epítopos de uma espécie são administrados a uma espécie diferente (por exemplo, mAb humanizado a primatas) resultando na
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147/149 depuração rápida do fármaco a partir do plasma. Neste estudo não houve evidência, a partir do perfil do curso do tempo, que os anticorpos contra h2C10 foram gerados, uma vez que nenhum animal exibiu títulos anti-2C10 mensuráveis durante o estudo.
Avaliação Preliminar de Segurança [00285] Os experimentos descritos nesta seção foram conduzidos para determinar potenciais consequências adversas do h2C10 no sistema imune e para efeitos fora do alvo. Para terapias biológicas, essas avaliações estão entre as mais críticas para avaliar a segurança antes da exposição humana ao medicamento e desenvolver planos de mitigação de risco para testes clínicos. A ausência de quaisquer resultados inesperados ou indesejados na função imune ou patologia em macacos é vista favoravelmente para a avaliação de segurança global do h2C10. Além disso, testes de rotina para alterações em parâmetros hematológicos, incluindo contagem de plaquetas e parâmetros de química sérica em macacos tratados com 2C10 foram conduzidos em vários dias após a administração, e não foram afetados pelo tratamento com 2C10 quimérico e humanizado. Dois animais que foram tratados duas vezes com 25 mg/kg de 2C10 quimérico de primata foram avaliados quanto a evidência macroscópica e microscópica de patologia relacionada com o tratamento; nenhuma alteração patológica relacionada ao tratamento foi observada. Além disso, para
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148/149 descartar complicações tromoboemolíticas, todos os tecidos foram examinados por colorações especiais para deposição de fibrina. Nenhuma evidência de anormalidades de coagulação subclínica foi detectada. É importante ressaltar que doses relativamente altas foram testadas nos estudos que excederam sensivelmente as doses necessárias para ocupar completamente os receptores CD40 e, portanto, se aproximarem dos níveis de dose que serão testados nos principais estudos de toxicologia conduzidos durante a fase de capacitação do IND. Estas avaliações preliminares de segurança mostram ausência de qualquer preocupação de segurança para o h2C10.
[00286] Estes dados combinados demonstram em um modelo de primata relevante que h2C10 tem os atributos farmacodinâmicos, farmacocinéticos e de segurança desejáveis para um anticorpo monoclonal destinado a tratar doentes, em que é desejada inibição específica de ativação de CD40 sem causar ativação ou esgotamento indesejáveis de células alvo CD40+ e sem evidência de toxicidade fora do alvo.
[00287] Embora aspectos específicos da invenção tenham sido descritos e ilustrados, tais aspectos devem ser considerados apenas como ilustrativos da invenção e não como limitativos da invenção, conforme interpretados de acordo com as reivindicações anexas. Todas as publicações e pedidos de patentes citados nesta descrição são aqui incorporados por referência na sua totalidade para todos os fins como se
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149/149 cada publicação ou pedido de patente individual fosse especificamente e individualmente indicada(o) para ser incorporada(o) por referência para todos as finalidades. Embora a invenção anterior tenha sido descrita com alguns detalhes por meio de ilustração e exemplo para fins de clareza de compreensão, será prontamente evidente para um habilitado na técnica à luz dos ensinamentos desta invenção que certas alterações e modificações podem ser feitas sem sair do espírito ou escopo das reivindicações anexas.

Claims (8)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Anticorpo anti-CD40 humanizado, ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de compreender uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos como estabelecida na SEQ ID NO: 21, e em que a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos como estabelecida nas SEQ ID NO: 23.
  2. 2. Anticorpo ou porção de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a constante de dissociação (KD) do anticorpo, ou porção de ligação a antígeno do mesmo, é menor que cerca de 1 x 109 M.
  3. 3. Anticorpo ou porção de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou a porção de ligação a antígeno do mesmo é selecionado do grupo consistindo em: (a) uma molécula de imunoglobulina inteira;
    (b) um scFV; (c) um fragmento Fab; (d) um F(ab')2; e (e) um Fv ligado por dissulfeto. 4. Anticorpo ou porção de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3,
    caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou a porção de ligação a antígeno do mesmo compreende pelo menos um domínio
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    2/8 constante selecionado do grupo consistindo em: a) um domínio constante de IgG; e (b) um domínio constante de IgA.
    5. Anticorpo ou porção de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou a porção de ligação a antígeno do mesmo compreende pelo menos um domínio constante humano.
    6. Anticorpo ou porção de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou a porção de ligação a antígeno do mesmo se liga ao domínio extracelular CD40.
    7. Anticorpo ou porção de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o CD4 0 é CD4 0 humano ou de rhesus.
    8. Anticorpo ou porção de ligação a antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou a porção de ligação a antígeno do mesmo bloqueia a ativação de linfócitos B por células Jurkat que expressam CD-154 in vitro.
    9. Anticorpo ou porção de ligação a antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou a porção de ligação a antígeno do mesmo inibe a expressão CD23, CD80 ou CD86 de linfócitos B.
    Petição 870180065314, de 27/07/2018, pág. 9/15
    3/8
    10. Anticorpo ou porção de ligação a antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 1 a 9, caracterizado pelo fato de que é para uso em uma composição para supressão do sistema imune em um indivíduo; para tratar ou tratar profilaticamente a rejeição de transplante, ou aumentar a duração de tempo antes de a rejeição de transplante ocorrer, em um indivíduo em necessidade do mesmo; para tratar ou tratar profilaticamente uma doença de enxerto-versus-hospedeiro em um indivíduo em necessidade do mesmo; ou para bloquear a interação do CD40 com CD154 em um indivíduo; ou para inibir ou reduzir o crescimento e/ou diferenciação de células que expressam CD40 em um indivíduo.
    11. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo ou a porção de ligação a antígeno do mesmo como definido(a) em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, e pelo menos um carreador farmaceuticamente aceitável.
    12. Polipeptídio isolado, caracterizado pelo fato de que compreende o anticorpo ou a porção de ligação a antígeno do mesmo como definido(a) em qualquer uma das reivindicações 1 a 9.
    13. Uso de anticorpo ou a porção de ligação a antígeno do mesmo como definido(a) em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição farmacêutica para suprimir o sistema imune em um indivíduo.
    Petição 870180065314, de 27/07/2018, pág. 10/15
  4. 4/8
    14. Uso de anticorpo ou a porção de ligação a antígeno do mesmo como definido(a) em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição farmacêutica para tratar ou tratar profilaticamente a rejeição de transplante, ou aumentar a duração de tempo antes de a rejeição de transplante ocorrer, em um indivíduo em necessidade do mesmo.
    15. Uso de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o indivíduo recebeu, ou está em necessidade de, um transplante de órgão ou um transplante de tecido.
    16. Uso de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o órgão é selecionado do grupo que consiste em: coração, rim, pulmão, fígado, pâncreas, intestino e timo, ou uma porção do mesmo; e que o tecido é selecionado do grupo que consiste em: osso, tendão, córnea, pele, válvula cardíaca, veia, ou medula óssea.
    17. Uso de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a administração é parenteral, intravenosa, subcutânea, intramuscular, transdérmica, oral, tópica, intratecal ou local.
    18. Uso de anticorpo ou a porção de ligação a antígeno do mesmo como definido(a) em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição farmacêutica para tratar ou tratar
    Petição 870180065314, de 27/07/2018, pág. 11/15
  5. 5/8 profilaticamente uma doença de enxerto-versus-hospedeiro em um indivíduo em necessidade do mesmo.
    19. Uso de anticorpo ou a porção de ligação a antígeno do mesmo como definido(a) em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição farmacêutica para bloquear a interação do CD40 com CD154 em um indivíduo.
    20. Uso de anticorpo ou a porção de ligação a antígeno do mesmo como definido(a) em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição farmacêutica para inibir ou reduzir o crescimento e/ou diferenciação de células que expressam CD40 em um indivíduo.
    21. Uso de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem uma desordem associada a CD40.
    22. Uso de acordo com a reivindicação 19 ou 21, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem uma desordem autoimune ou inflamatória.
    23. Uso de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a desordem autoimune ou inflamatória é selecionada a partir do grupo consistindo em: lúpus eritematoso sistêmico (SLE), síndrome de CREST (calcinose, síndrome de Raynaud, dismotilidade esofágica, escleodactilia e telangiectasia), opsoclonia, miopatia inflamatória (por
    Petição 870180065314, de 27/07/2018, pág. 12/15
  6. 6/8 exemplo, poliomiosite, dermatomiosite, e miosite com corpos de inclusão), escleroderma sistêmico, cirrose biliar primária, doença celíaca, (por exemplo, enteropatia sensível a glúten), dermatite herpetiforme, síndrome de MillerFisher, neuropatia axonal motora aguda (AMAN), neuropatia motora multifocal com bloqueio de condução, hepatite autoimune, síndrome antifosfolipídica, granulomatose de Wegener, poliangiite microscópica, síndrome de ChurgStrauss, artrite reumatoide, hepatite autoimune crônica, escleromiosite, miastenia grave, síndrome miastênica de Lambert-Eaton, Tireoide de Hashimoto, doença de Grave, degeneração cerebelar paraneoplástica, síndrome da pessoa rígida, encefalite límbica, síndrome de Isaacs, coreia de Sydenham, doença neuropsiquiátrica autoimune pediátrica associada a Streptococcus (PANDAS), encefalite, diabete mellittus tipo 1, e neuromielite óptica; ou é selecionada a partir do grupo consistindo em: anemia perniciosa, doença de Addison, psoríase, doença inflamatória intestinal, artrite psoriática, síndrome de Sjogren, lúpus eritematoso (por exemplo, lúpus eritematoso discoide, lúpus eritematoso induzido por droga, e lúpus eritematoso neonatal), esclerose múltipla e artrite reativa; ou é selecionada a partir do grupo consistindo em: polimiosite, dermatomiosite, múltiplas lesões endócrinas, síndrome de Schmidt, uveíte autoimune, adrenalite, tiroidite, doença da tireoide autoimune, atrofia
    Petição 870180065314, de 27/07/2018, pág. 13/15
  7. 7/8 gástrica, hepatite crônica, hepatite lupoide, aterosclerose, demência pré-senil, doenças desmielinizantes, lúpus eritematoso cutâneo subagudo, hipoparatireoidismo, síndrome de Dressler, trombocitopenia autoimune, púrpura trombocitopênica idiopática, anemia hemolítica, pênfigo vulgar, pênfigo, alopecia areata, penfigoide, escleroderma, esclerose sistêmica progressiva, diabetes mellitus de início na idade adulta (por exemplo, diabetes tipo II), infertilidade autoimune masculina e feminina, espondilite anquilosante, colite ulcerativa, doença de Chron, doença mista do tecido conjuntivo, poliarterite nodosa, vasculite necrosante sistêmica, artrite reumatoide de início na fase juvenil, glomerulonefrite, dermatite atópica, rinite atópica, síndrome de Goodpasture, doença de Chagas, sarcoidose, febre reumática, asma, aborto recorrente, Síndrome antifosfolípide, pulmão de fazendeiro, eritema multiforme, síndrome de pós-cardiotomia, síndrome de Cushing, hepatite ativa crônica autoimune, pulmão de caçador, doença alérgica, encefalomielite alérgica, necrólise epidérmica tóxica, alopecia, síndrome de Alport, alveolite, alveolite alérgica, alveolite fibrosante, doença pulmonar intersticial, eritema nodoso, pioderma gangrenoso, reação à transfusão, lepra, malária, leishmaniose, tripanossomíase, artrite de Takayasu, polimialgia reumática, arterite temporal, esquistossomose, arterite de células
    Petição 870180065314, de 27/07/2018, pág. 14/15
  8. 8/8 gigantes, ascaríase, aspergilose, síndrome de Sampter, eczema, granulomatose linfomatoide, doeça de Behcet, síndrome de Caplan, doença de Kawasaki, dengue, endocardite, fibrose endomiocardial, endoftalmite, eritema elevatum et diutinum, eritroblastose fetal, fasciite eosinofílica, síndrome de Shulman, síndrome de Felty, filaríase, ciclite, ciclite crônica, ciclite heterocrônica, ciclite de Fuch, neuropatia por IgA, púrpura Henoch-Schonlein, doença de enxerto versus hospedeiro, rejeição de transplante, infecção por vírus da imunodeficiência humana, infecção por ecovírus, cardiomiopatia, doença de Alzheimer, infecção por parvovírus, infecção por vírus rubéola, síndromes pós vacinação, infecção por vírus da rubéola congênita, linfoma de Hodgking e de não Hodgking, carcinoma de célula renal, mieloma múltiplo, síndrome de Eaton-Lammbert, policondrite recorrente, melanoma maligno, crioglobulinemia, macroglobulinemia de Waldernstrom, infecção por vírus Epstein-Barr, caxumba, síndrome de Evan, e falha gonodal autoimune.
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