KR101632775B1 - 항-ｃｄ４０ 항체의 침묵 ｆｃ 변이체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항-CD40 항체의 침묵 Fc 변이체, 및 병리학적 장애, 예컨대 자가면역 및 염증성 장애를 치료하고/거나 이식시에 이식편 거부의 위험을 예방하거나 감소시키기 위한 상기 항체의 조성물 및 사용 방법에 관한 것이다.

Description

항-ＣＤ４０ 항체의 침묵 ＦＣ 변이체 {SILENT FC VARIANTS OF ANTI-CD40 ANTIBODIES}
본 발명은 항-CD40 항체의 침묵 불변 단편 (Fc) 변이체, 및 병리학적 장애, 예컨대 자가면역 및 염증성 장애를 치료하고/거나 이식시에 이식편 거부의 위험을 예방하거나 감소시키기 위한 상기 항체의 조성물 및 사용 방법에 관한 것이다.
자가면역 질환에 대한 여러 면역억제 치료가 이용가능함에도 불구하고, 환자 집단 중의 큰 비율에서 보다 효능 있고 보다 안전한 약물에 대한 큰 필요성이 충족되지 않고 있다. 예를 들어, 류마티스성 관절염, 전신 홍반성 루푸스, 쇼그렌 증후군 및 다발 경화증에서 리툭시맙 및 벨리무맙과 같은 B 세포 고갈/억제 치료제의 보고된 효능에도 불구하고, 이들 치료제는 이환된 개체의 일부에서만 효과적이고, 리툭시맙에서는 진행성 다초점성 백질뇌병증의 위험이 수반된다. 또한, 다수의 다른 백혈구 세포 종류, 예컨대 대식세포, 수지상 세포 및 T 세포가 종종 상기 자가면역 질환의 병상에 관련되고, 따라서 추가의 세포 종류 또는 그의 기능을 억제하는 핵심 면역 경로를 표적화하는 치료적 개입은 유익할 수 있다. 이들 세포 종류의 활성화 및 기능에서 CD40-CD154의 다수의 면역학적으로 관련된 역할을 고려할 때, 항-CD40 항체가 상기 개관된 자가면역 질환으로 고통받는 환자에게 현재 사용되는 치료제에 의해 현재 제공되는 것을 넘어서는 치료 이익을 제시할 가능성이 있다. 또한, 장 염증성 장애, 예컨대 크론병 및 궤양성 대장염에서 CD40-CD154 상호작용에 대한 중추적인 역할, 및 보다 희귀한 장애, 예컨대 자가면역 혈관염, 심상성 천포창, 및 ITP의 병상에 대한 CD40 경로의 기계적 연결은 이들 적응증에서 항-CD40 항체의 잠재력을 강조한다.
현재 실질 장기 이식 후에 사용되는 이용가능한 면역억제제는 탁월한 단기 효능을 제공한다. 디 노보 (de novo) 기간 내의 급성 거부는 수여자의 5% - 20%에서 관찰되고 (장기, 환자 집단, 및 요법에 따라), 디 노보 기간 내에 급성 거부로 상실되는 이식편의 비율은 임의의 환경에 대해 5% 미만이다. 현재 충족되지 않은 핵심적인 요건은 환자의 면역억제에 대한 관용성 및 장기간의 이식편 생존이다. 신장 이식 후에, 33%의 환자는 5년 이내에 사망하고/하거나 그의 이식편을 상실하고; 이식 수여자의 평균 사망 연령은 58세이다. 칼시뉴린 억제제 (CNI)는 대다수의 이식 환자에 대한 면역억제 요법의 핵심이 되고 있다. CNI와 연관된 신독성 및 심혈관 이환률은 만성 동종이식편 신장병증 및 기능하는 이식편이 있는 환자 사망의 유발 원인 중의 하나이지만, 대안적인 1차 면역억제가 CNI를 대체할 수 없는 상태이다. 종합하면, 장기적인 이식 면역억제의 개선에 대한 여지가 계속 존재한다. 이식된 신장의 B-세포 매개 면역 손상은 불량한 장기적인 결과의 원인이 될 수 있고, B-세포 거부를 표적화하는 새로운 작용제의 필요성에 대한 인식이 의학계에서 증가하고 있다.
Chir12.12는 CD154 (CD40 리간드로도 알려짐; CD40L)-매개 백혈구 활성화를 차단하고 시험관 내에서 인간 백혈구 및 B 세포 림프종의 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC)을 매개할 수 있는 완전 인간화된 비-효능제 항-CD40 항체 (IgG1, 카파)이다 (WO2006/073443 참조). 또한, WO2005/044306에는 특히 자가면역 및 염증성 장애의 치료에 사용하기 위해 Chir12.12를 포함하는 항-CD40 길항제 항체가 기재되어 있다. 추가로, Chir12.12는 마카카 파시쿨라리스 (Macaca fascicularis) (사이노몰구스 원숭이)에서 단제요법으로서 투여될 때 신장 동종이식편 거부의 지연에 효과적이다 [Li et al. (2008) Transplantation; 86 (1):10-15]. 그러나, Chir12.12는 또한 비-인간 영장류 (NHP)에서 말초 B 세포의 고갈을 매개할 수 있다.
침묵화된 (silenced) ADCC 활성을 갖는 항-CD40 mAb는 모 항-CD40 항체에 비해 개선된 안전성 프로파일을 갖는 것으로 예측되고, 특히 비-종양 적응증, 예컨대 자가면역 질환 및 이식 환경에서의 용도에 보다 적합할 수 있다.
본 발명은 따라서 모 항-CD40 항체 Chir12.12의 비-효능성 CD40L 차단 특성을 보유하는 Fc 침묵 항-CD40 모노클로날 항체를 제공한다.
특히, 본 발명은
a) CD40 폴리펩티드에 10 nM 이하의 KD로 결합하고,
b) 침묵 IgG Fc 영역을 포함하는 것
을 특징으로 하는, 표적 CD40 폴리펩티드 (서열 28)에 대해 작용하는 항체의 항원-결합부를 포함하는 단리된 항체 또는 단백질을 제공한다.
한 실시양태에서, 상기 항체 또는 단백질은 50 ng/ml 이하의 IC50으로 CD40L 유도 신호전달을 억제한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 단리된 항체 또는 단백질은 CD40 신호전달에 관하여 효능제 활성을 갖지 않거나 낮은 효능제 활성을 갖는다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체 또는 단백질은 서열 17, 서열 18 또는 서열 19의 아미노산 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 침묵 IgG Fc 영역을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 단리된 항체 또는 단백질은 각각 Chir12.12의 VH (서열 9) 및 Chir12.12 항체의 VL (서열 10)에 적어도 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL) 가변 영역을 포함한다.
본 발명에 따른 항체의 구체적인 예는
- 서열 11의 중쇄 아미노산 서열 및 서열 12의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 mAb1,
- 서열 13의 중쇄 아미노산 서열 및 서열 14의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 mAb2, 또는,
- 서열 15의 중쇄 아미노산 서열 및 서열 16의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 mAb3이다.
본 발명에 따른 단리된 항체 또는 단백질은 의약으로서 사용될 수 있다. 특히, 이들은 자가면역 장애, 염증성 장애를 치료하고/거나 이식시에 이식편 거부의 위험을 예방하거나 감소시키는 데 사용하기에 적합하다.
본 발명에 따른 단리된 항체 또는 단백질은 특히 다발 경화증, 전신 홍반성 루푸스, 쇼그렌 증후군, 류마티스성 관절염, 이식 거부 및 이식편 대 숙주 질환의 치료에 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 항체 또는 단백질을 적어도 제약상 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체와 조합하여 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다. 상기 제약 조성물은 다른 활성 성분을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 항체 또는 단백질의 동결건조물 또는 액체 제제에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 항체 또는 단백질을 코딩하는 단리된 핵산 및 서열 22 내지 27로 이루어지는 군 중에서 선택되는 적어도 하나의 핵산을 포함하는 대응하는 클로닝 또는 발현 벡터에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 규정된 바와 같은 하나 이상의 클로닝 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명은 상기 규정된 바와 같은 숙주 세포를 배양하고, 본 발명의 항체 또는 단백질을 정제하고 회수하는 것을 포함하는, 상기 항체 또는 단백질의 생산 방법을 추가로 제공한다.
본 발명이 보다 쉽게 이해될 수 있도록 하기 위해, 특정 용어가 먼저 규정된다. 추가의 정의는 상세한 설명 전체에 걸쳐 제시된다.
용어 "면역 반응"은 인체로부터 침습 병원체, 병원체로 감염된 세포 또는 조직, 암성 세포, 또는, 자가면역 또는 병리학적 염증의 경우, 정상 인간 세포 또는 조직의 선택적인 손상, 파괴, 또는 제거를 유도하는, 예를 들어 림프구, 항원 제시 세포, 포식 세포, 과립구, 및 상기 세포 또는 간 (항체, 시토카인, 및 보체 포함)에 의해 생산되는 가용성 거대분자의 작용을 의미한다.
"신호전달 경로" 또는 "신호전달 활성"은 세포의 한 부분으로부터 세포의 또 다른 부분으로의 신호의 전달을 유발하는 단백질-단백질 상호작용, 예컨대 수용체에 대한 성장 인자의 결합에 의해 일반적으로 개시되는 생화학적 인과 관계를 의미한다. 일반적으로, 전달은 신호전달을 야기하는 일련의 반응에서 하나 이상의 단백질 상의 하나 이상의 티로신, 세린, 또는 트레오닌 잔기의 특이적 인산화를 수반한다. 끝에서 두 번째의 과정은 일반적으로 유전자 발현의 변경을 야기하는 핵 사건을 포함한다.
용어 CD40은 달리 설명되지 않으면, 예를 들어 서열 28에 규정된 인간 CD40을 의미한다.
본원에서 언급되는 용어 "항체"는 전체 항체 및 그의 임의의 항원 결합 단편 (즉,"항원-결합부") 또는 단일쇄를 포함한다.
천연 생성 "항체"는 디술피드 결합에 의해 서로 연결된 적어도 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함하는 당단백질이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 VH로서 약칭함) 및 중쇄 불변 영역으로 이루어진다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인 CH1, CH2 및 CH3으로 이루어진다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 VL로 약칭함) 및 경쇄 불변 영역으로 이루어진다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 CL로 이루어진다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)으로 불리는 보다 보존된 영역이 산재하는, 상보성 결정 영역 (CDR)으로 불리는 초가변성 영역으로 추가로 하위분류될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단으로부터 카르복시-말단으로 다음 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 이루어진다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포 (예를 들어, 이펙터 세포) 및 전통적인 보체계의 제1 성분 (Clq)을 비롯한 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 항체의 "항원-결합부" (또는 단순히 "항원부")는 항원 (예를 들어, CD40의 일부)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 전장 또는 하나 이상의 단편을 의미한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있음이 밝혀졌다. 용어 항체의 "항원-결합부"에 포함되는 결합 단편의 예는 VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어지는 일가 단편인 Fab 단편; 힌지 영역에서 디술피드 다리에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab)2 단편; VH 및 CH1 도메인으로 이루어지는 Fd 단편; 항체의 단일 아암 (arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어지는 Fv 단편; VH 도메인으로 이루어지는 dAb 단편 (Ward et al., 1989 Nature 341:544-546); 및 단리된 상보성 결정 영역 (CDR), 또는 상기 항원-결합부를 포함하는 임의의 융합 단백질을 포함한다.
또한, Fv 단편의 2개의 도메인, 즉 VL 및 VH가 별개의 유전자에 의해 코딩되지만, 이들은 재조합 방법을 사용하여, VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 일가 분자를 형성하는 단일쇄 단백질 (단일쇄 Fv (scFv)로 알려짐; 예를 들어, 문헌 [Bird et al., 1988 Science 242:423-426]; 및 [Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883])이 되도록 하는 합성 링커 (linker)에 의해 연결될 수 있다. 상기 단일쇄 항체는 또한 용어 항체의 "항원-결합부" 내에 포함되도록 의도된다. 상기 항체 단편은 당업자에게 공지된 통상적인 기술을 이용하여 얻고, 단편은 무손상 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "IgG Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 비롯하여 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 규정하기 위해 사용된다. 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 일반적으로 IgG 항체의 위치 C226 또는 P230으로부터 카르복실-말단까지의 아미노산 잔기를 포함하는 것으로 규정된다. Fc 영역 내의 잔기의 넘버링은 카바트 (Kabat)의 EU 인덱스 (index)의 넘버링이다. Fc 영역의 C-말단 라이신 (잔기 K447)은 예를 들어 항체의 생산 또는 정제 동안 제거될 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체의 조성물은 모든 K447 잔기가 제거된 항체 집단, 어떠한 K447 잔기도 제거되지 않은 항체 집단, 및 K447 잔기가 존재하거나 존재하지 않는 항체의 혼합물을 갖는 항체 집단을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 의미한다 (예를 들어, CD40에 특이적으로 결합하는 단리된 항체에는 CD40 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없음). 그러나, CD40에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 항원, 예컨대 다른 (비-인간) 종으로부터의 CD40 분자에 대한 교차 반응성을 가질 수 있다. 추가로, 단리된 항체에는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"은 단일 분자 조성의 항체 분자의 제제를 의미한다. 모노클로날 항체 조성물은 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화도를 보인다.
본원에서 사용되는 용어 "인간화 항체"는 비-인간 면역글로불린 서열로부터 유래된 특정 최소 서열을 포함하는 항체를 포함하는 것이 의도된다. 대부분의 경우에, 인간화 항체는 수여자의 초가변 영역 (상보성 결정 영역 또는 CDR로도 알려짐)으로부터의 잔기가 비-인간종 (공여 항체), 예를 들어 목적하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 비-인간 영장류의 초가변 영역으로부터의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린 (수여 항체)이다. 문구 "상보성 결정 영역"은 천연 면역글로불린 결합 부위의 천연 Fv 영역의 결합 친화도 및 특이성을 함께 규정하는 아미노산 서열을 의미한다 (예를 들어, 문헌 [Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917]; [Kabat et al. (1991) US Dept. of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) 참조). 문구 "불변 영역"은 이펙터 기능을 부여하는 항체 분자의 부분을 의미한다. 인간 질환의 치료에 사용하기 위한 비-면역원성 항체의 생산에 관한 이전의 연구에서, 마우스 불변 영역은 인간 불변 영역으로 교체되었다. 해당 인간화 항체의 불변 영역은 인간 면역글로불린으로부터 유래되었다. 인간화는 설치류 및 돌연변이체 설치류 CDR 또는 CDR 서열을 인간 항체의 대응하는 서열로 교체함으로써 윈터 (Winter)와 그의 동료의 방법 ([Jones et al. (1986) Nature 321:522-525]; [Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327]; [Verhoeyen et al. (1988) Science 239: 1534-1536])에 따라 수행할 수 있다. 일부 예에서, 인간 면역글로불린의 하나 이상의 가변 영역의 프레임워크 영역 내의 잔기는 대응하는 비-인간 잔기로 대체된다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762; 및 6,180,370 참조). 또한, 인간화 항체는 수여 항체 또는 공여 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부를 포함할 것이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린의 불변 영역 및 본원의 경우에 침묵 Fc IgG 영역을 포함할 것이다.
본 발명의 항체는 인간 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관 내에서 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이 유발에 의해 또는 생체 내에서 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 특히, 용어 "인간화 항체"는 Fc IgG 영역의 침묵 변이체를 포함하는 항체를 포함한다.
용어 "인간화된 모노클로날 항체"는 가변 영역이 비-인간 서열로부터 인간화된 가변 영역을 갖는 단일 결합 특이성을 보이는 항체를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "재조합 항체"는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 인간 또는 인간화 항체, 예컨대 인간 면역글로불린 유전자에 대한 트랜스제닉 (transgenic) 또는 트랜스크로모조멀 (transchromosomal)인 동물 (예를 들어 마우스), 또는 이로부터 제조된 하이브리도마로부터 단리된 항체, 인간 또는 인간화 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예를 들어 트랜스펙토마 (transfectoma)로부터 단리된 항체, 재조합의 조합형 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 인간 면역글로불린 유전자 서열의 전부 또는 일부를 다른 DNA 서열로 스플라이싱하는 것을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 또는 인간화 항체는 프레임워크 및 CDR 영역이 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래될 수 있는 가변 영역을 갖는다. 그러나, 특정 실시양태에서, 이러한 재조합 인간 또는 인간화 항체를 대상으로 하여 시험관내 돌연변이 유발 (또는, 인간 Ig 서열에 대해 트랜스제닉인 동물을 사용하는 경우에는 생체내 체세포 돌연변이 유발)을 행할 수 있고, 따라서 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 인간 생식계열 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 이와 관련이 있지만 생체 내에서 인간 항체 생식계열 레퍼토리 내에 천연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "이소형"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 제공되는 항체 클래스 (예를 들어, IgM, IgE, IgG, 예컨대 IgG1 또는 IgG4)를 의미한다. 상이한 이소형은 상이한 이펙터 기능을 갖는다. 예를 들어, 야생형 인간 IgG1 및 IgG3 이소형은 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC) 활성을 매개한다.
문구 "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체" 및 "항원에 대해 작용하는 항체"는 본원에서 용어 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"와 교환가능하게 사용된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "CD40 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는" 항체 또는 단백질은 100 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하의 KD로 인간 CD40 폴리펩티드에 결합하는 항체 또는 단백질을 의미하도록 의도된다.
"CD40 이외의 다른 항원과 교차-반응하는" 항체는 1 μM 이하, 100 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하의 KD로 항원에 결합하는 항체를 의미하도록 의도된다. "특정 항원과 교차-반응하지 않는" 항체는 100 nM 이상의 KD로, 또는 1 μM 이상의 KD로, 또는 10 μM 이상의 KD로 항원에 결합하는 항체를 의미하도록 의도된다. 특정 실시양태에서, 항원과 교차-반응하지 않는 상기 항체는 표준 결합 검정에서 상기 단백질에 대한 본질적으로 검출가능하지 않은 결합을 보인다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "K회합" 또는 "Ka"는 특정 항체-항원 상호작용의 회합 속도를 지칭하도록 의도되고, 본원에서 사용된 바와 같이 용어 "K해리" 또는 "Kd"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도를 의미하도록 의도된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "KD"는 해리 상수를 지칭하도록 의도되고, Ka에 대한 Kd의 비율 (즉, Kd/Ka)로부터 구하며, 몰 농도 (M)로 표시된다. 항체에 대한 KD 값은 당업계에 널리 확립된 방법을 이용하여 결정할 수 있다. 항체의 KD를 결정하는 방법은 표면 플라즈몬 공명을 이용하거나 바이오센서 시스템, 예컨대 비아코어(Biacore)® 시스템을 이용하는 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "친화도"는 단일 항원 부위에서 항체와 항원 사이의 상호작용의 강도를 의미한다. 각각의 항원 부위 내에서, 항체 "아암"의 가변 영역은 많은 부위에서 약한 비-공유 힘을 통해 항원과 상호작용하고, 상호작용이 많을수록 친화도가 더 강하다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "결합력"은 항체-항원 복합체의 전체 안정성 또는 강도에 관한 유용한 척도를 의미한다. 이는 항체 에피토프 친화도, 항원과 항체 둘 모두의 결합가, 및 상호작용 부분의 구조적 배열이라는 3가지 주요 인자에 의해 제어된다. 궁극적으로, 이들 인자는 항체의 특이성, 즉, 특정 항체가 정확한 항원 에피토프에 결합할 가능성을 규정한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "CD40 길항제"는 인간 세포 검정, 예컨대 CD40L-매개 PBMC 증식 검정에서 CD40L의 존재 하에 CD40 유도 신호전달 활성을 억제하는 항체 또는 단백질을 의미하도록 의도된다. 상기 검정의 예를 아래 실시예에서 보다 상세히 설명한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 단백질은 CD40L-매개 PBMC 증식 검정에서 측정시에 500 ng/ml 이하의 IC50, 바람직하게는 50 ng/ml 이하의 IC50, 예를 들어 20 ng/ml 이하의 IC50으로 CD40L 유도 신호전달을 억제한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "효능제 활성을 갖지 않는" 항체는 세포-기반 검정, 예컨대 CD40L-매개 PBMC 증식 검정에서 CD40L의 부재 하에 CD40 매개 신호전달 활성을 유의하게 증가시키지 않는 항체를 의미하도록 의도된다. 상기 검정은 아래 실시예에서 보다 상세히 설명된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "ADCC" 또는 "항체-의존성 세포성 세포독성" 활성은 세포 고갈 활성을 의미한다. ADCC 활성은 아래 실시예에서 보다 상세히 설명되는 ADCC 검정에 의해 측정될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "침묵" 항체는 본원의 실시예에서 설명되는 ADCC 검정에 의해 측정시에 ADCC 활성을 보이지 않거나 낮은 ADCC 활성을 보이는 항체를 의미한다.
한 실시양태에서, 용어 "ADCC 활성을 보이지 않거나 낮은 ADCC 활성을 보이는"은 침묵 항체가 실시예에서 설명되는 ADCC 검정에서 측정시에 50% 미만의 특이적 세포 용해, 예를 들어 10% 미만의 특이적 세포 용해인 ADCC 활성을 보임을 의미한다. ADCC 활성을 보이지 않는다는 것은 침묵 항체가 1% 미만의 ADCC 활성 (특이적 세포 용해)을 보인다는 것을 의미한다. 구체적인 실시양태에서, 본 발명에 따른 침묵 항체는 실시예에서 설명되는 ADCC 검정에서 측정시에 임의의 유의한 ADCC 활성을 보이지 않는다.
침묵화된 이펙터 기능은 항체의 Fc 영역의 돌연변이에 의해 얻을 수 있고, 문헌에 기재되어 있다: LALA 및 N297A (Strohl, W., 2009, Curr. Opin. Biotechnol. vol. 20(6):685-691); 및 D265A (Baudino et al., 2008, J. Immunol. 181:6664-69]; [Strohl, W., 상기 문헌]). 침묵 Fc IgG1 항체의 예는 IgG1 Fc 아미노산 서열에 L234A 및 L235A 돌연변이를 포함하는, 소위 LALA 돌연변이체를 포함한다. 침묵 IgG1 항체의 또 다른 예는 D265A 돌연변이를 포함한다. 또 다른 침묵 IgG1 항체는 비글리코실화된/비-글리코실화된 항체를 야기하는 N297A 돌연변이를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 본 발명의 항체 또는 단백질의 "선택성"은 특정 표적 폴리펩티드에 결합하지만 밀접하게 관련된 폴리펩티드에는 결합하지 않는 항체 또는 단백질을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 항체에 대한 "고 친화도"는 표적 항원에 대한 KD가 1 nM 이하인 항체를 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체"는 임의의 인간 또는 비인간 동물을 포함한다.
용어 "비인간 동물"은 모든 척추동물, 예를 들어 포유동물 및 비-포유동물, 예컨대 비-인간 영장류, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어, "최적화된"은, 뉴클레오티드 서열이 생성 세포 또는 유기체, 일반적으로는 진핵 세포, 예를 들어 피치아 (Pichia)의 세포, 트리코더마 (Trichoderma)의 세포, 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO) 또는 인간 세포에 바람직한 코돈을 사용하여 아미노산 서열을 코딩하도록 변경된 것을 의미한다. 최적화된 뉴클레오티드 서열은 "모" 서열이라고도 알려진 출발 뉴클레오티드 서열에 의해 원래 코딩되는 아미노산 서열을 완전히 또는 가능한 많이 보유하도록 조작된다. 본원에서 최적화된 서열은 CHO 포유동물 세포에 바람직한 코돈을 갖도록 조작되었지만, 다른 진핵 세포에서 이들 서열의 최적화된 발현도 본원에서 고려된다. 최적화된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열도 최적화된 것으로 언급된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 2개의 서열들 사이의 동일성 %는 2개 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수 및 각각의 갭의 길이를 고려하여, 서열들에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다 (즉, 동일성 % = (동일한 위치의 수/위치의 총 수) x 100). 2개의 서열 사이의 서열 비교 및 동일성 %의 결정은 아래에서 설명되는 수학적 알고리즘을 이용하여 수행될 수 있다.
2개의 아미노산 서열 사이의 동일성 %는, PAM120 가중 잔기 표, 갭 길이 패널티 12 및 갭 패널티 4를 사용하여 ALIGN 프로그램 (버전 2.0)에 도입된 이. 메이어스 (E. Meyers) 및 더블유. 밀러 (W. Miller)의 알고리즘 (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17, 1988)을 이용하여 결정할 수 있다. 별법으로, 2개의 아미노산 서열 사이의 동일성 %는 GCG 소프트웨어 패키지 (http://www.gcg.com에서 이용가능함) 내의 GAP 프로그램에 도입된 니들만 (Needleman) 및 분쉬 (Wunsch) (J. Mol, Biol. 48:444-453, 1970) 알고리즘을 이용하여, 블로섬 (Blossom) 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 갭 가중치 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4, 및 길이 가중치 1, 2, 3, 4, 5 또는 6을 사용하여 결정할 수 있다.
2개의 뉴클레오티드 아미노산 서열 사이의 동일성 %는 또한 디폴트로서 워드 길이 (W) 11, 기대값 (E) 10, M = 5, N = 4 및 두 가닥의 비교를 사용하는, 핵산 서열에 대해 BLASTN 프로그램과 같은 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다.
재조합 항체
본 발명의 항체는 단리되고 아래 표 1에 기재된 그의 전장 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열에 의해 구조적으로 특성화된 인간화된 재조합 항체 mAb1-mAb3을 포함한다.
Figure 112013042420145-pct00001
본 발명의 상기 단리된 항체 mAb1-mAb3의 대응하는 가변 영역, VH 및 VL 아미노산 서열은 모두 예를 들어 WO2006/073443에 이전에 설명되고 서열 7의 VH 아미노산 서열 및 서열 8의 VL 아미노산 서열로 이루어진 동일한 항체 Chir12.12로부터 유래된다.
본래의 CHIR12.12에 비해 본 발명의 항체의 하나의 중요한 차이는 본 발명의 항체가 침묵 Fc IgG 영역, 예를 들어 침묵 Fc IgG1 영역으로 이루어지는 Fc 영역을 갖는다는 점이다.
특히, 표 2는 본래의 CHIR12.12 항체에 비해, 항체 mAb1-mAb3을 얻기 위해 수행된 Fc IgG1 영역의 변형을 요약한 것이다.
Figure 112013042420145-pct00002
본 발명의 다른 항체는, 아미노산 결실, 삽입 또는 치환에 의해 돌연변이되었지만 CHIR12.12의 VH 및 VL 영역 (각각 서열 7 및 서열 8)과 적어도 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산을 갖고 침묵 IgG Fc 영역, 예를 들어 침묵 IgG1 Fc 영역을 포함하는 항체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 mAb1-mAb3 중의 임의의 하나의 돌연변이체 변이체이고, 여기서 상기 돌연변이체 변이체 항체는, 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 아미노산이 CHIR12.12의 VH 및 VL 영역 (각각 서열 7 및 서열 8)에 비해 VH 및 VL 영역 내의 아미노산 결실, 삽입 또는 치환에 의해 돌연변이되고 mAb1, mAb2 또는 mAb3과 동일한 불변 영역을 보유하는 돌연변이체 아미노산 서열을 포함한다.
mAb1-mAb3의 전장 경쇄 및 중쇄 뉴클레오티드 코딩 서열을 아래 표 3에 제시한다.
Figure 112013042420145-pct00003
본 발명의 항체를 코딩하는 다른 핵산은, 뉴클레오티드 결실, 삽입 또는 치환에 의해 돌연변이되었지만, 예를 들어 각각 서열 20 및 서열 21에 기재된 서열에 제시된 CHIR12.12의 대응하는 VH 및 VL 코딩 영역에 적어도 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%의 동일성을 갖고 침묵 IgG Fc 영역, 예를 들어 침묵 IgG1 Fc 영역의 코딩 서열을 포함하는 핵산을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 핵산은, 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 뉴클레오티드가 예를 들어 각각 서열 20 및 서열 21에 기재된 서열에 제시된 VH 및 VL 코딩 영역에 비해 VH 및 VL 코딩 영역 내의 뉴클레오티드 결실, 삽입 또는 치환에 의해 변경되고 대응하는 mAb1, mAb2 또는 mAb3 코딩 서열과 동일한 불변 영역 코딩 서열을 보유하는 변이체 핵산을 포함한다.
상동성 항체
본 발명의 재조합 항체 mAb1-mAb3 이외에, 본 발명은 또한 mAb1-mAb3 항체의 목적하는 기능적 특성을 보유하는 상동성 항체 또는 단백질을 포함한다.
특히, 본 발명에 따른 상기 상동성 항체 또는 단백질은
a) CD40 폴리펩티드에 10 nM 이하의 KD로 결합하고,
b) 침묵 IgG Fc 영역을 포함하는 것
을 특징으로 하는, 표적 CD40 폴리펩티드 (서열 28)에 대해 작용하는 항체의 항원-결합부를 포함하는 항체 또는 단백질이고, 여기서 상기 상동성 항체 또는 단백질은 본래의 mAb1-mAb3 항체의 목적하는 기능적 특성을 보유한다.
본래의 mAb1-mAb3 항체의 목적하는 기능적 특성은 하나 이상의 다음 특성으로부터 선택될 수 있다:
(i) CD40에 특이적으로 결합하고, 예를 들어 비아코어 검정에 의해 측정된 KD는 100 nM 이하, 10 nM 이하, 또는 1 nM 이하이다;
(ii) CD40 길항제이고, 예를 들어 CD40L-매개 PBMC 증식 검정에서 측정시에 CD40L 유도 신호전달을 억제한다;
(iii) CD40L-매개 PBMC 증식 검정으로 측정시에 효능제 활성을 보이지 않거나 낮은 효능제 활성을 보인다;
(iv) 사이노몰구스 원숭이 CD40 폴리펩티드와 교차 반응한다;
(v) ADCC 활성을 갖지 않거나 낮은 ADCC 활성을 갖는다;
(vi) 약물 개발을 위한 적합한 특성을 갖는다.
하나의 구체적인 실시양태에서, 본 발명에 따른 상기 상동성 항체 또는 단백질은 침묵 IgG1 Fc 영역, 예를 들어 서열 17, 서열 18 또는 서열 19로 이루어지는 군 중에서 선택되는 침묵 IgG1 Fc 영역을 포함한다.
하나의 구체적인 실시양태에서, 본 발명은 가변 영역 중쇄 및 경쇄 뉴클레오티드 서열, 또는 가변 영역 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열, 또는 상기, 특히 표 1에서 설명한 항체 mAb1-mAb3의 대응하는 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열에 상동성인 6개의 모든 CDR 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 코딩 서열을 갖는 항체 또는 단백질에 관한 것이고, 상기 항체 또는 단백질은 mAb1의 Fc 영역 (서열 17), mAb2의 Fc 영역 (서열 18) 및 mAb3의 Fc 영역 (서열 19)으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 침묵 IgG Fc 영역을 포함하고, 상기 상동성 항체 또는 단백질은 CD40에 특이적으로 결합하고, 항체 또는 단백질은 다음과 같은 기능적 특성을 보인다: CD40 길항제이고, 효능제 활성을 갖지 않거나 낮은 효능제 활성을 갖고, ADCC 활성을 갖지 않거나 낮은 ADCC 활성을 갖는다.
예를 들어, 본 발명은 mAb1의 Fc 영역 (서열 17), mAb2의 Fc 영역 (서열 18) 및 mAb3의 Fc 영역 (서열 19)으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 침묵 IgG Fc 영역을 포함하고 가변 중쇄 (VH) 및 가변 경쇄 (VL) 서열을 포함하는, mAb1-mAb3에 상동성인 항체 또는 단백질에 관한 것이고, 여기서 CDR 서열은 mAb1-mAb3의 대응하는 CDR 서열 (각각 서열 1-6)에 적어도 60, 70, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%의 서열 동일성을 공유하고, 상기 상동성 항체 또는 단백질은 CD40에 특이적으로 결합하고, 상동성 항체 또는 단백질은 다음과 같은 기능적 특성을 보인다: CD40 길항제이고, 효능제 활성을 갖지 않거나 낮은 효능제 활성을 갖고, ADCC 활성을 갖지 않거나 낮은 ADCC 활성을 갖는다.
관련된 구체적인 실시양태에서, 상동성 항체 또는 단백질은
a) 1 nM 이하의 KD로 CD40에 결합하고;
b) 실시예에서 설명되는 CD40L-매개 PBMC 증식 검정에서 측정시에 50 ng/ml 이하의 IC50으로 CD40L 유도 신호전달을 억제하고;
c) 생물학적 검정, 예컨대 본원의 실시예에서 설명되는 CD40L-매개 PBMC 증식 검정에서 측정시에 효능제 활성을 갖지 않거나 낮은 효능제 활성을 갖고;
d) ADCC 활성을 보이지 갖거나 낮은 ADCC 활성을 갖는다.
본 발명은 추가로, mAb1의 Fc 영역 (서열 17), mAb2의 Fc 영역 (서열 18) 및 mAb3의 Fc 영역 (서열 19)으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 침묵 IgG Fc 영역을 포함하고 mAb1-mAb3의 대응하는 (VH) 및 (VL) 서열 (각각 서열 7 및 서열 8)에 적어도 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 서열 동일성을 공유하는 가변 중쇄 (VH) 및 가변 경쇄 (VL) 서열을 포함하는, mAb1-mAb3에 상동성인 항체 또는 단백질에 관한 것이고, 상기 상동성 항체 또는 단백질은 CD40에 특이적으로 결합하고, 항체 또는 단백질은 다음과 같은 기능적 특성을 보인다: CD40 길항제이고, 효능제 활성을 갖지 않거나 낮은 효능제 활성을 갖고, ADCC 활성을 갖지 않거나 낮은 ADCC 활성을 갖는다.
관련된 구체적인 실시양태에서, 상기 상동성 항체 또는 단백질은
a) 1 nM 이하의 KD로 CD40에 결합하고;
b) 실시예에서 설명되는 CD40L-매개 PBMC 증식 검정에서 측정시에 50 ng/ml 이하의 IC50으로 CD40L 유도 신호전달을 억제하고;
c) 생물학적 검정, 예컨대 실시예에서 설명되는 CD40L-매개 PBMC 증식 검정에서 측정시에 효능제 활성을 갖지 않거나 낮은 효능제 활성을 갖고;
d) ADCC 활성을 갖지 않거나 낮은 ADCC 활성을 갖는다.
또 다른 예에서, 본 발명은 mAb1의 Fc 영역 (서열 17), mAb2의 Fc 영역 (서열 18) 및 mAb3의 Fc 영역 (서열 19)으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 침묵 IgG Fc 영역을 포함하는, mAb1-mAb3에 상동성인 항체 또는 단백질에 관한 것이고, 여기서 가변 중쇄 및 경쇄는 mAb1-mAb3의 가변 중쇄 및 경쇄의 상응하는 코딩 뉴클레오티드 서열에 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되고, 상기 상동성 항체 또는 단백질은 CD40에 특이적으로 결합하고, 항체 또는 단백질은 다음과 같은 기능적 특성을 보인다: CD40 길항제이고, 효능제 활성을 갖지 않거나 낮은 효능제 활성을 갖고, ADCC 활성을 갖지 않거나 낮은 ADCC 활성을 갖는다.
관련된 구체적인 실시양태에서, 상기 상동성 항체 또는 단백질은
a) 1 nM 이하의 KD로 CD40에 결합하고;
b) 실시예에서 설명되는 CD40L-매개 PBMC 증식 검정에서 측정시에 50 ng/ml 이하의 IC50으로 CD40L 유도 신호전달을 억제하고;
c) 생물학적 검정, 예컨대 실시예에서 설명되는 CD40L-매개 PBMC 증식 검정에서 측정시에 효능제 활성을 갖지 않거나 낮은 효능제 활성을 갖고;
d) ADCC 활성을 갖지 않거나 낮은 ADCC 활성을 갖는다.
돌연변이체 아미노산 서열을 갖는 항체는 코딩 핵산 분자의 돌연변이 유발 (예를 들어, 부위-지정 또는 PCR-매개 돌연변이 유발), 이어서 하기 실시예에서 설명되는 기능적 검정을 사용한, 코딩되는 변경된 항체의 보유되는 기능 (즉, 상기 제시된 기능)에 대한 시험에 의해 얻을 수 있다.
특정 실시양태에서, 상기 설명한 mAb1-mAb3에 상동성인 항체 또는 단백질은 보존적 서열 변형을 갖는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "보존적 서열 변형"은 아미노산 잔기를 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 치환하는 아미노산 치환을 의미하도록 의도된다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당업계에 규정되어 있다. 상기 패밀리는 염기성 측쇄 (예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄 (예를 들어, 글라이신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비-극성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지형 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다. 따라서, 본 발명의 항체의 CDR 영역 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 패밀리로부터의 다른 아미노산 잔기로 교체될 수 있고, 변경된 항체는 본원에서 설명되는 기능적 검정을 사용하여 보유되는 기능에 대해 시험될 수 있다.
변형은 당업계에 공지된 표준 기술, 예컨대 부위-지정 돌연변이 유발 및 PCR-매개 돌연변이 유발에 의해 본 발명의 항체 내로 도입될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 단백질을 코딩하는 핵산 분자
본 발명의 또 다른 측면은 상기 설명한 본 발명의 항체 또는 단백질을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다.
mAb1 내지 mAb3 중의 임의의 하나의 경쇄 및 중쇄 뉴클레오티드 서열의 예는 표 3 (mAb1 내지 mAb3의 중쇄 및 경쇄의 전체 뉴클레오티드 코딩 서열을 보여줌)으로부터 유도될 수 있다.
본 발명에 따른 경쇄 및 중쇄 뉴클레오티드 서열의 다른 예는 표 1에 기재된 mAb1, mAb2 또는 mAb3의 전장 중쇄 및/또는 경쇄 아미노산 서열을 코딩하는 임의의 서열이다.
본 발명은 또한 포유동물 세포, 예를 들어, CHO 세포주에서의 단백질 발현을 위해 최적화된, 상기 마지막 서열로부터 유래된 핵산 분자에 관한 것이다.
핵산은 전체 세포 또는 세포 용해물에 존재할 수 있거나, 또는 부분적으로 정제된 또는 실질적으로 순수한 형태의 핵산일 수 있다. 핵산은 표준 기술, 예를 들어 알칼리/SDS 처리, CsCl 밴딩 (banding), 컬럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동 및 당업계에 공지된 다른 기술에 의해 다른 세포 성분 또는 다른 오염물질, 예를 들어, 다른 세포 핵산 또는 단백질로부터 정제될 때 "단리된" 또는 "실질적으로 순수하게 된" 것이다 ([F. Ausubel, et al., ed. 1987 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York] 참조). 본 발명의 핵산은 예를 들어 DNA 또는 RNA일 수 있고, 인트론 서열을 함유할 수 있거나 함유하지 않을 수 있다. 한 실시양태에서, 핵산은 cDNA 분자이다. 핵산은 벡터, 예컨대 파지 디스플레이 벡터, 또는 재조합 플라스미드 벡터 내에 존재할 수 있다.
본 발명의 핵산은 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 얻을 수 있다. 예를 들어 VH 및 VL 세그먼트를 코딩하는 DNA 단편을 얻은 후에, 이들 DNA 단편은 예를 들어 가변 영역 유전자를 전장 항체 사슬 유전자로, Fab 단편 유전자로 또는 scFv 유전자로 전환하기 위해 표준 재조합 DNA 기술에 의해 추가로 조작될 수 있다. 상기 조작에서, VL- 또는 VH-코딩 DNA 단편은 또 다른 DNA 분자에, 또는 서열 17-19에 규정된 Fc 영역을 포함하는 mAb1-mAb3의 항체 불변 영역을 코딩하는 단편에 작동가능하게 연결된다.
상기 문맥에서 사용되는 용어 "작동가능하게 연결된"은 예를 들어 2개의 DNA 단편에 의해 코딩되는 아미노산 서열이 인-프레임 (in-frame) 상태로 유지되도록, 또는 단백질이 목적하는 프로모터의 제어 하에 발현되도록, 2개의 DNA 단편이 기능적 방식으로 연결됨을 의미하도록 의도된다.
VH 영역을 코딩하는 단리된 DNA는 VH-코딩 DNA를 중쇄 불변 영역 (CH1, CH2 및 CH3)을 코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결함으로써 전장 중쇄 유전자로 전환될 수 있다. 인간 중쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당업계에 공지되어 있고 (예를 들어, 문헌 [Kabat, E. A., el al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242] 참조), 상기 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 얻을 수 있다. 중쇄 불변 영역은 서열 17-19에 규정된 Fc 영역을 포함하는 IgG1 이소형 중에서 선택될 수 있다.
VL 영역을 코딩하는 단리된 DNA는 VL-코딩 DNA를 경쇄 불변 영역 (CL)을 코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결함으로써 전장 경쇄 유전자 (및 Fab 경쇄 유전자)로 전환될 수 있다. 인간 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당업계에 공지되어 있고 (예를 들어, 문헌 [Kabat, E. A., el al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242] 참조), 상기 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 얻을 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역일 수 있다.
모노클로날 항체를 생산하는 트랜스펙토마의 생성
본 발명의 항체 또는 단백질은 예를 들어 당업계에 공지된 재조합 DNA 기술 및 유전자 형질감염 방법을 조합하여 숙주 세포 트랜스펙토마에서 생산될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Morrison, S. (1985) Science 229:1202] 참조).
예를 들어, 항체를 발현시키기 위해, 부분 또는 전장 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA는 표준 분자 생물학 또는 생화학 기술 (예를 들어, DNA 화학적 합성, PCR 증폭 또는 관심있는 항체를 발현하는 하이브리도마를 사용한 cDNA 클로닝)에 의해 얻을 수 있고, DNA는 유전자가 전사 및 번역 제어 서열에 작동가능하게 연결되도록 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 상기 문맥에서, 용어 "작동가능하게 연결된"은 벡터 내의 전사 및 번역 제어 서열이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 그의 의도된 기능을 수행하도록 항체 유전자가 벡터 내에 라이게이션됨을 의미하도록 의도된다. 발현 벡터 및 발현 제어 서열은 사용되는 발현 숙주 세포에 적합한 것으로 선택된다. 항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자는 별개의 벡터 내에 삽입될 수 있거나, 또는 보다 일반적으로는, 두 유전자는 동일한 발현 벡터 내에 삽입된다.
항체 유전자는 표준 방법 (예를 들어, 항체 유전자 단편 및 벡터 상의 상보성 제한 부위의 라이게이션, 또는 제한 부위가 존재하지 않을 경우 블런트 (blunt) 말단 라이게이션)에 의해 발현 벡터 내로 삽입된다. 본원에서 설명되는 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 VH 세그먼트가 벡터 내의 CH 세그먼트(들)에 작동가능하게 연결되고 VL 세그먼트가 벡터 내의 CL 세그먼트에 작동가능하게 연결되도록, mAb1, mAb2 또는 mAb3의 불변 영역에 대응하는 목적하는 서열의 중쇄 불변 및 경쇄 불변 영역을 이미 코딩하는 발현 벡터 내로 상기 가변 영역을 삽입함으로써 전장 항체 유전자를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 추가로 또는 별법으로, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터 항체 사슬의 분비를 용이하게 하는 신호 펩티드를 코딩할 수 있다. 항체 사슬 유전자는 신호 펩티드가 항체 사슬 유전자의 아미노 말단에 인 프레임으로 연결되도록 벡터 내에 클로닝될 수 있다. 신호 펩티드는 면역글로불린 신호 펩티드 또는 이종성 신호 펩티드 (즉, 비-면역글로불린 단백질로부터의 신호 펩티드)일 수 있다.
항체 사슬 유전자에 추가로, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 항체 사슬 유전자의 발현을 제어하는 조절 서열을 보유한다. 용어 "조절 서열"은 프로모터, 인핸서 및 항체 사슬 유전자의 전사 또는 번역을 제어하는 다른 발현 제어 요소 (예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 포함하도록 의도된다. 상기 조절 서열은 예를 들어 괴델 (Goeddel)에 의해 설명된 바 있다 (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA 1990). 조절 서열의 선택을 비롯하여 발현 벡터의 설계는 형질전환되는 숙주 세포의 선택, 요구되는 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자에 따라 결정될 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다. 포유동물 숙주 세포 발현을 위한 조절 서열은 포유동물 세포에서 높은 수준의 단백질 발현을 유도하는 바이러스 요소, 예컨대 사이토메갈로바이러스 (CMV), 원숭이 바이러스 40 (SV40), 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (AdMLP)), 및 폴리오마로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서를 포함한다. 별법으로, 비바이러스 조절 서열, 예컨대 유비퀴틴 프로모터 또는 P-글로빈 프로모터가 사용될 수 있다. 추가로, 상이한 공급원으로부터의 서열로 이루어진 조절 요소, 예컨대 SV40 조기 프로모터로부터의 서열 및 인간 T 세포 백혈병 바이러스 타입 1의 긴 말단 반복체를 함유하는 SRa 프로모터 시스템이 사용될 수 있다 (Takebe, Y. et al., 1988 Mol. Cell. Biol. 8:466-472).
항체 사슬 유전자 및 조절 서열 이외에, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 추가의 서열, 예컨대 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열 (예를 들어, 복제 기점) 및 선택가능한 마커 유전자를 보유할 수 있다. 선택가능한 마커 유전자는 벡터가 그 내부로 도입된 숙주 세포의 선택을 용이하게 한다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,399,216, 4,634,665 및 5,179,017 (모두 악셀 (Axel) 등) 참조). 예를 들어, 일반적으로 선택가능한 마커 유전자는 벡터가 그 내부로 도입된 숙주 세포에게 약물, 예컨대 G418, 히그로마이신 또는 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여한다. 선택가능한 마커 유전자는 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 유전자 (메토트렉세이트 선택/증폭과 함께 dhfr- 숙주 세포에 사용하기 위한) 및 neo 유전자 (G418 선택을 위한)를 포함한다.
경쇄 및 중쇄의 발현을 위해, 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 발현 벡터(들)은 표준 기술에 의해 숙주 세포 내로 형질감염된다. 용어 "형질감염"의 다양한 형태는 외인성 DNA의 원핵 또는 진핵 숙주 세포 내로의 도입을 위해 통상적으로 사용되는 매우 다양한 기술, 예를 들어, 전기천공, 인산칼슘 침전, DEAE-덱스트란 형질감염 등을 포함하도록 의도된다. 이론적으로 본 발명의 항체를 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 발현하는 것은 가능하다. 진핵 세포, 예를 들어 포유동물 숙주 세포, 효모 또는 사상 진균에서 항체의 발현은, 상기 진핵 세포, 특히 포유동물 세포가 원핵 세포보다 적절하게 폴딩되고 면역 활성을 보이는 항체를 조립하고 분비할 가능성이 더 크기 때문에 논의된다.
하나의 구체적인 실시양태에서, 본 발명에 따른 클로닝 또는 발현 벡터는 적합한 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된 다음 코딩 서열 (a)-(c) 중의 적어도 하나를 포함한다:
(a) mAb1의 전장 중쇄 및 경쇄를 각각 코딩하는 서열 22 및 서열 23;
(b) mAb2의 전장 중쇄 및 경쇄를 각각 코딩하는 서열 24 및 서열 25; 또는
(c) mAb3의 전장 중쇄 및 경쇄를 각각 코딩하는 서열 26 및 서열 27.
본 발명의 재조합 항체를 발현하기 위한 포유동물 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO 세포) (예를 들어, 문헌 [R.J. Kaufman and P.A. Sharp, 1982 Mol. Biol. 159:601-621]에 기재된 바와 같은 DH FR 선택가능한 마커와 함께 사용되는, 문헌 [Urlaub and Chasin, 1980 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220]에 기재된 dhfr- CHO 세포 포함), CHOK1 dhfr+ 세포주, NSO 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포를 포함한다. 특히, NSO 골수종 세포와 함께 사용하기 위한 또 다른 발현 시스템은 PCT 공보 WO 87/04462, WO 89/01036 및 EP 0 338 841에 제시된 GS 유전자 발현 시스템이다.
항체 유전자를 코딩하는 재조합 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포 내로 도입될 때, 항체는 숙주 세포에서 항체의 발현 또는 숙주 세포가 성장하는 배양 배지 내로 항체의 분비를 허용하기에 충분한 시간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 생산된다. 항체는 표준 단백질 정제 방법 (예를 들어, 문헌 [Abhinav et al. 2007, Journal of Chromatography 848: 28-37] 참조)을 사용하여 배양 배지로부터 회수될 수 있다.
하나의 구체적인 실시양태에서, 본 발명의 숙주 세포는 적합한 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된, 각각 mAb1-mAb3의 발현에 적합한 하기 (a)-(c)로 이루어지는 군 중에서 선택되는 코딩 서열을 갖는 발현 벡터로 형질감염된 숙주 세포이다:
(a) 서열 22 및 서열 23;
(b) 서열 24 및 서열 25; 및
(c) 서열 26 및 서열 27.
이어서, 숙주 세포는 각각 mAb1-mAb3으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 본 발명의 항체의 발현 및 생산에 적합한 조건 하에서 추가로 배양될 수 있다.
이중특이적 분자
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항-CD40 항체 또는 단백질을 포함하는 이중특이적 또는 다중특이적 분자를 특징으로 한다. 본 발명의 항체 또는 단백질은 적어도 2개의 상이한 결합 부위 또는 표적 분자에 결합하는 이중특이적 분자를 생성하기 위해서 유도체화되거나 또는 또 다른 기능성 분자, 예를 들어, 또 다른 펩티드 또는 단백질 (예를 들어, 수용체에 대한 또 다른 항체 또는 리간드)에 연결될 수 있다. 본 발명의 항체는 실제로 2개 초과의 상이한 결합 부위 및/또는 표적 분자에 결합하는 다중특이적 분자를 생성하기 위해서 유도체화되거나 또는 하나 초과의 다른 기능성 분자에 연결될 수 있고; 상기 다중특이적 분자는 또한 본원에서 사용되는 용어 "이중특이적 분자"에 포함되는 것으로 의도된다. 본 발명의 이중특이적 분자를 생성하기 위해서, 본 발명의 항체 또는 단백질은 이중특이적 분자가 생성되도록 하나 이상의 다른 결합 분자, 예컨대 또 다른 항체, 항체 단편, 펩티드 또는 결합 모방체 (mimetic)에 기능적으로 연결될 수 있다 (예를 들어, 화학적 결합, 유전자 융합, 비공유 회합 등에 의해).
따라서, 본 발명은 CD40에 대한 적어도 하나의 제1 결합 특이성, 예를 들어, mAb1-mAb3 중의 임의의 하나의 하나의 항원-결합부 및 제2 표적 에피토프에 대한 제2 결합 특이성을 포함하는 이중특이적 분자를 포함한다. 예를 들어, 제2 표적 에피토프는 제1 표적 에피토프와 상이한 CD40의 또 다른 에피토프이다. 또 다른 예는 CD40에 대한 적어도 하나의 제1 결합 특이성, 예를 들어, mAb1-mAb3 중의 임의의 하나의 하나의 항원-결합부 및 CD40 내의 에피토프에 대한 제2 결합 특이성을 포함하는 이중특이적 분자이다.
추가로, 이중특이적 분자가 다중특이적인 본 발명의 경우에, 분자는 제1 및 제2 표적 에피토프 이외에 제3 결합 특이성을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 이중특이적 분자는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 구성성분 결합 특이성을 접합시킴으로써 제조할 수 있다. 예를 들어, 이중특이적 분자의 각각의 결합 특이성은 별개로 생성한 후, 서로 접합될 수 있다. 결합 특이성이 단백질 또는 펩티드일 때, 다양한 결합 또는 가교결합제가 공유 접합을 위해 사용될 수 있다. 가교결합제의 예는 단백질 A, 카르보디이미드, N-숙신이미딜-S-아세틸-티오아세테이트 (SATA), 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산) (DTNB), o-페닐렌디말레이미드 (oPDM), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP) 및 술포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트 (술포-SMCC) (예를 들어, 문헌 [Karpovsky et al., 1984 J. Exp. Med. 160:1686], [Liu, MA et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648] 참조)를 포함한다. 다른 방법은 문헌 [Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132], [Brennan et al., 1985 Science 229:81-83] 및 [Glennie et al., 1987 J. Immunol. 139: 2367-2375]에 기재된 것들을 포함한다. 접합제는 SATA 및 술포-SMCC (둘 다 피어스 케미컬 컴퍼니 (Pierce Chemical Co.) (미국 일리노이주 록포드)로부터 이용가능함)이다.
결합 특이성이 항체인 경우, 이것들은 2개의 중쇄의 C-말단 힌지 영역을 술프히드릴에 결합시킴으로써 접합될 수 있다. 특정 실시양태에서, 힌지 영역은 접합 전에 홀수의 술프히드릴 잔기, 예를 들어 1개의 술프히드릴 잔기를 함유하도록 변형된다.
별법으로, 두 결합 특이성은 동일 벡터 내에서 코딩될 수 있고, 동일 숙주 세포 내에서 발현 및 조립될 수 있다. 이 방법은 이중특이적 분자가 mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 또는 리간드 x Fab 융합 단백질인 경우에 특히 유용하다. 본 발명의 이중특이적 분자는 하나의 단일쇄 항체 및 결합 결정자를 포함하는 단일쇄 분자, 또는 2개의 결합 결정자를 포함하는 단일쇄 이중특이적 분자일 수 있다. 이중특이적 분자는 적어도 2개의 단일쇄 분자를 포함할 수 있다. 이중특이적 분자의 제조 방법은 예를 들어 미국 특허 번호 5,260,203; 미국 특허 번호 5,455,030; 미국 특허 번호 4,881,175; 미국 특허 번호 5,132,405; 미국 특허 번호 5,091,513; 미국 특허 번호 5,476,786; 미국 특허 번호 5,013,653; 미국 특허 번호 5,258,498; 및 미국 특허 번호 5,482,858에 기재되어 있다.
이중특이적 분자의 그의 특이적 표적에 대한 결합은 예를 들어 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA), 방사성 면역검정 (REA), FACS 분석, 생물학적 검정 (예를 들어, 성장 억제) 또는 웨스턴 블롯 검정으로 확인할 수 있다. 이들 검정은 각각 일반적으로 특히 관심이 있는 단백질-항체 복합체에 특이적인 표지된 시약 (예컨대, 항체)을 이용함으로써 상기 복합체의 존재를 검출한다.
다가 항체
또 다른 측면에서, 본 발명은 예를 들어 mAb1-mAb3 중의 임의의 하나의 항원-결합부로부터 선택된, CD40에 결합하는 본 발명의 항체의 적어도 2개의 동일하거나 상이한 항원-결합부를 포함하는 다가 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 다가 항체는 항체의 적어도 2개, 3개 또는 4개의 항원-결합부를 제공한다. 항원-결합부는 단백질 융합 또는 공유 또는 비-공유 연결을 통해 함께 연결될 수 있다. 별법으로, 연결 방법이 이중특이적 분자에 대해 설명되었다. 예를 들어, 본 발명의 항체를 본 발명의 항체의 불변 영역, 예를 들어 Fc 또는 힌지 영역에 결합하는 항체와 가교결합시켜 4가 화합물을 수득할 수 있다.
본 발명의 길항제 항- CD40 항체를 사용한 치료 방법
본 발명의 방법은 자가면역 질환 및/또는 염증성 질환, 또는 자가면역 질환 및/또는 염증성 질환이 발생할 소인이 있는 대상체 (즉, 환자)의 치료를 위한, 본 발명의 항-CD40 항체 또는 단백질의 용도에 관한 것이고, 여기서 질환 및/또는 염증은 CD40 항원을 발현하는 세포에 대한 CD40L-매개 CD40 신호전달에 의해 매개된다.
세포에서 CD40 발현의 검출 방법은 당업계에 공지되어 있고, PCR 기술, 면역조직화학, 유동 세포측정, 웨스턴 블롯, ELISA 등을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 방법은 특히 CD40L-매개 CD40 자극이 관련하는 염증성 및/또는 자가면역 질환의 치료에 유용하다.
염증성 질환은 염증 및 조직 파괴, 또는 이들의 조합을 특징으로 한다. "염증성 질환"은 면역 반응의 개시 사건 또는 표적이 예를 들어 동종항원, 이종항원, 바이러스 항원, 세균 항원, 알려지지 않은 항원, 또는 알레르겐을 포함하는 비-자가 항원(들)을 수반하는 임의의 염증성 면역-매개 과정을 포함한다.
또한, 본 발명의 목적에서, 용어 "염증성 질환(들)"은 "자가면역 질환(들)"을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "자가면역"은 일반적으로 "자가 항원을 수반하는 염증성 면역-매개 과정을 포함하는 것으로 이해된다. 자가면역 질환에서, 자가 항원(들)은 숙주 면역 반응을 촉발한다.
또한, 본 발명은 조직 이식 거부와 관련된 염증의 치료를 포함한다. "이식 거부" 또는 "이식편 거부"는 HLA 항원, 혈액형 항원 등을 포함하고 이로 제한되지 않는 이식편에 대한 임의의 숙주-개시된 면역 반응을 의미한다.
본 발명은 또한 예를 들어 골수 이식과 관련된 것과 같은 이식편 대 숙주 질환의 치료를 위해 사용될 수 있다. 상기 이식편 대 숙주 질환에서, 공여자 골수는 림프구 및 림프구로 성숙되는 세포를 포함한다. 공여자 림프구는 수여자의 항원을 비-자가 항원으로 인식하고 염증성 면역 반응을 개시한다. 따라서, 본원에서 사용되는 "이식편 대 숙주 질환" 또는 "이식편 대 숙주 반응"은 공여자 림프구가 숙주의 항원에 반응하는 임의의 T 세포 매개 면역 반응을 의미한다.
본원에서 설명되는 길항제 항-CD40 항체 또는 단백질, 예를 들어 mAb1, mAb2 또는 mAb3은 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 원판성 루푸스, 루푸스 신장염, 유육종증, 염증성 관절염, 예를 들어 연소성 관절염, 류마티스성 관절염, 건선성 관절염, 라이터 증후군, 강직성 척추염, 및 통풍성 관절염, 장기 또는 조직 이식의 거부, 초급성, 급성, 또는 만성 거부 및/또는 이식편 대 숙주 질환, 다발 경화증, 고 IgE 증후군, 결절성 다발성 동맥염, 원발성 담즙성 간경변, 염증성 장 질환, 크론병, 복강 질환 (글루텐-민감 장병증), 원발성 쇼그렌 증후군 (pSS), 자가면역 간염, 악성 빈혈, 자가면역 용혈성 빈혈, 건선, 경피증, 중증 근무력증, 자가면역 혈소판 감소성 자반증, 자가면역 갑상선염, 그레이브 (Grave) 병, 하시모또 (Hasimoto) 갑상선염, 면역 복합체 질환, 만성 피로, 면역 기능이상 증후군 (CFIDS), 다발성 근염 및 피부 근염, 한랭 글로불린혈증, 혈전용해, 심근병증, 심상성 천포창, 간질성 폐 섬유증, I형 및 II형 당뇨병, 1, 2, 3, 및 4형 지연형 과민증, 알러지 또는 알러지성 장애, 치료 단백질에 대한 원치 않은/의도하지 않은 면역 반응 (예를 들어, 미국 특허 출원 번호 US 2002/0119151 및 문헌 [Koren, et al. (2002) Curr. Pharm. Biotechnol. 3: 349-60] 참조), 천식, 척-스트라우스 (Churg-Strauss) 증후군 (알러지성 육아종증), 아토피 피부염, 알러지성 및 자극성 접촉 피부염, 두드러기, IgE-매개 알러지, 죽상경화증, ANCA-연관 혈관염, 혈관염, 특발성 염증성 근병증, 용혈성 질환, 알츠하이머 (Alzheimer) 병, 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증 등을 포함하고, 이로 제한되지 않는 자가면역 및/또는 염증성 장애의 치료를 위해 본 발명의 방법에 따라 사용할 수 있다.
CD40-CD154 경로의 유전자 제거 또는 약리학적 억제는 SLE, pSS, ITP, MS, 크론병, 심상성 천포창, 자가면역 혈관염 및 RA의 임상 또는 전임상 모델 (Law CL, Grewal IS. (2009). Adv. Exp. Med. Biol. 2009;647:8-36)에서 치료 이익을 이미 입증하였고; 그의 의학적 필요성은 아래에서 상세하게 설명된다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD40 항체 또는 단백질은 다음의 치료에 유용하다: (i) 전신 홍반성 루푸스 (루푸스 신장염), 바람직하게는 관해의 유도 및 유지 및 말기 신장 질환의 예방을 위한 효과적인 스테로이드 결핍 치료제의 제공; (ii) 원발성 쇼그렌 증후군, 바람직하게는 타액선 및 누선 파괴의 예방, 및 선외 (extraglandular) 징후의 관해의 유도 및 유지; (iii) 자가면역 혈소판 감소성 자반증, 바람직하게는 치료 표준에 불응성인 환자의 치료; (iv) ANCA-연관 혈관염, 바람직하게는 코르티코스테로이드에 불응성인 환자에서 관해의 유도 및 유지, 및 스테로이드 결핍 치료; (v) 심상성 천포창, 바람직하게는 코르티코스테로이드에 불응성인 환자에서 관해의 유도 및 유지, 및 스테로이드 결핍 치료; (vi) 다발 경화증, 바람직하게는 재발 및 장애 진행의 억제, 및 질환이 없는 상태의 달성을 위한 보다 효과적인 치료제 제공; 및 (vii) 크론병, 바람직하게는 관해의 유지, 및 항-TNF에 불응성인 환자의 치료를 위한 보다 효과적인 치료제의 제공.
몇몇의 다른 실시양태에서, 본 발명의 항-CD40 항체 또는 단백질은 폐 이식편 거부, 천식, 유육종증, 기종, 낭성 섬유증, 특발성 폐 섬유증, 만성 기관지염, 알러지성 비염 및 폐의 알러지성 질환, 예컨대 골수 및/또는 폐 이식 또는 다른 원인에 의한 과민성 폐렴, 호산구성 폐렴, 폐색성 세기관지염, 이식편 죽상경화증/이식편 정맥 경화증, 및 콜라겐, 혈관 및 자가면역 질환, 예컨대 류마티스성 관절염, 경피증 및 홍반성 루푸스에 의한 폐 섬유증을 포함하고 이로 제한되지 않는 폐렴의 치료에 유용하다.
"치료"는 본원에서 대상체에 대한 본 발명에 따른 항-CD40 항체 또는 단백질, 예를 들어, mAb1, mAb2 또는 mAb3 항체의 적용 또는 투여, 또는 자가면역 질환 및/또는 염증성 질환, 자가면역 질환 및/또는 염증성 질환과 연관된 증상, 또는 자가면역 질환 및/또는 염증성 질환이 발생할 소인을 갖는 대상체로부터 단리된 조직 또는 세포주에 대한 본 발명의 상기 항-CD40 항체 또는 단백질을 포함하는 제약 조성물의 적용 또는 투여로서 규정되고, 여기서 그 목적은 자가면역 질환 및/또는 염증성 질환, 자가면역 질환 및/또는 염증성 질환의 임의의 연관된 증상, 또는 자가면역 질환 및/또는 염증성 질환이 발생할 소인을 치유, 치료, 경감, 완화, 변경, 제거, 호전, 개선하거나, 또는 영향을 주는 것이다.
"치료"는 또한 대상체에 대한 본 발명의 항-CD40 항체 또는 단백질, 예를 들어, mAb1, mAb2 또는 mAb3 항체를 포함하는 제약 조성물의 적용 또는 투여, 또는 자가면역 질환 및/또는 염증성 질환, 자가면역 질환 및/또는 염증성 질환과 연관된 증상, 또는 자가면역 질환 및/또는 염증성 질환이 발생할 소인을 갖는 대상체로부터 단리된 조직 또는 세포주에 대한 본 발명의 상기 항-CD40 항체 또는 단백질을 포함하는 제약 조성물의 적용 또는 투여가 의도되고, 여기서 그 목적은 자가면역 질환 및/또는 염증성 질환, 자가면역 질환 및/또는 염증성 질환의 임의의 연관된 증상, 또는 자가면역 질환 및/또는 염증성 질환이 발생할 소인을 치유, 치료, 경감, 완화, 변경, 제거, 호전, 개선하거나, 또는 영향을 주는 것이다.
"항-염증성 활성"은 염증의 감소 또는 억제를 의도한다. 본 발명에 따른 적어도 하나의 항-CD40 항체 또는 단백질을 사용한 요법은 자가면역 질환 및/또는 염증성 질환의 치료에 대해 유익한 생리학적 반응을 유도하고, 여기서 질환은 CD40 항원을 발현하는 세포를 수반한다. 본 발명의 방법이 증식, 활성화 등과 같은 세포의 표현형 변화의 예방에 유용할 수 있음이 인식된다.
본 발명의 방법에 따르면, 상기 본원에서 규정되는 본 발명의 적어도 하나의 항-CD40 항체 또는 단백질은 자가면역 질환 및/또는 염증성 질환의 치료 또는 예방에 대해 긍정적인 치료 반응을 촉진하기 위해 사용된다.
자가면역 질환 및/또는 염증성 질환에 대한 "긍정적인 치료 반응"은 상기 항체 또는 단백질의 항-염증성 활성과 관련한 질환의 개선, 및/또는 질환과 연관된 증상의 개선이 의도된다. 즉, 항-증식 효과, CD40-발현 세포의 추가의 증식의 억제, 염증 반응의 감소, 예컨대 염증성 시토카인, 부착 분자, 프로테아제, 면역글로불린 (CD40 보유 세포가 B 세포인 경우에), 이들의 조합물 등의 분비 감소 (이로 제한되지 않음), 항-염증성 단백질의 생산 증가, 자가반응성 세포의 수 감소, 면역 관용의 증가, 자가반응성 세포 생존의 억제, 및/또는 CD40-발현 세포의 자극에 의해 매개되는 하나 이상의 증상의 감소가 관찰될 수 있다. 상기 긍정적인 치료 반응은 투여 경로로 제한되지 않고, 공여자, 공여자 조직 (예를 들어 장기 관류액), 숙주, 이들의 임의의 조합에 대한 투여 등을 포함할 수 있다.
임상 반응은 스크리닝 기술, 예컨대 자기 공명 영상화 (MRI) 스캔, x-선 영상화, 컴퓨터 단층 (CT) 스캔, 유동 세포측정 또는 형광-활성화 세포 분류기 (FACS) 분석, 조직학, 육안 병리 소견, 및 혈액 화학, 예를 들어 ELISA, RIA, 크로마토그래피 등에 의해 검출가능한 변화 (이로 제한되지 않음)를 사용하여 평가할 수 있다. 상기 긍정적인 치료 반응 이외에, 본 발명의 길항제 항-CD40 항체 또는 단백질을 사용한 요법을 받은 대상체는 질환과 연관된 증상의 개선이라는 유익한 효과를 경험할 수 있다.
"치료 유효 용량 또는 양" 또는 "유효량"은 투여시에 자가면역 질환 및/또는 염증성 질환이 있는 대상체의 치료에 대해 긍정적인 치료 반응을 유발하는 본 발명의 항-CD40 항체 또는 단백질의 양을 의도한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 본 발명의 항-CD40 항체 또는 단백질, 예를 들어, mAb1, mAb2 또는 mAb3의 치료 유효 용량은 0.01 mg/kg 내지 40 mg/kg, 3 mg/kg 내지 20 mg/kg 또는 7 mg/kg 내지 12 mg/kg이다. 치료 방법은 본 발명의 길항제 항-CD40 항체 또는 단백질의 치료 유효 용량의 단일 투여 또는 치료 유효 용량의 다수 투여를 포함할 수 있음이 인식된다.
본 발명의 추가의 실시양태는 예를 들어 제시된 치료 요법의 효능을 결정하기 위한 임상 시험 절차의 일부로서 조직 내의 단백질 수준의 진단 모니터링을 위한, 본 발명의 항-CD40 항체 또는 단백질의 용도이다. 검출은 항체를 검출가능한 물질에 결합함으로써 용이해질 수 있다. 검출가능한 물질의 예는 다양한 효소, 보결 분자단 (prosthetic group), 형광 물질, 발광 물질, 생체발광 물질, 및 방사성 물질을 포함한다. 적합한 효소의 예는 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, P-갈락토시다제, 또는 아세틸콜린에스테라제를 포함하고; 적합한 보결 분자단 복합체의 예는 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴을 포함하고; 적합한 형광 물질의 예는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린을 포함하고; 발광 물질의 예는 루미놀을 포함하고; 생체발광 물질의 예는 루시퍼라제, 루시페린, 및 아에쿠오린을 포함하고; 적합한 방사성 물질의 예는 l25I, l31I, 35S, 또는 3H를 포함한다.
본 발명의 항-CD40 항체 또는 단백질, 예를 들어, mAb1, mAb2 또는 mAb3은 자가면역 및 염증성 질환의 치료에 유용한 것으로 알려져 있거나 또는 사용되었거나 현재 사용 중인 임의의 작용제 또는 작용제의 조합물을 포함하는, 자가면역 및 염증성 질환에 대한 임의의 공지의 요법과 조합되어 사용될 수 있다. 상기 요법 및 치료제는 수술 또는 외과적 절차 (예를 들어 비장절제술, 림프절절제술, 갑상선절제술, 혈장분리 교환술, 백혈구 성분 채집술, 세포, 조직, 또는 장기 이식, 장 처치, 장기 관류 등), 방사선 요법, 스테로이드 요법 및 비-스테로이드 요법, 호르몬 요법, 시토카인 요법, 피부 작용제 (예를 들어, 피부 병태, 예컨대 알러지, 접촉 피부염, 및 건선 치료에 사용되는 국소 작용제)를 사용한 요법, 면역억제 요법, 및 다른 항염증성 모노클로날 항체 요법과 같은 요법 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 상기 방식에서, 본원에서 설명되는 길항제 항-CD40 항체 또는 단백질은 수술, 장기 관류, 방사선 요법, 스테로이드 요법, 비-스테로이드 요법, 항생제 요법, 항진균 요법, 호르몬 요법, 시토카인 요법, 피부 작용제 (예를 들어, 피부 병태, 예컨대 알러지, 접촉 피부염, 및 건선 치료에 사용되는 국소 작용제)를 사용한 요법, 면역억제 요법, 다른 항-염증성 모노클로날 항체 요법, 이들의 조합 등을 포함하고 이로 제한되지 않는 적어도 하나의 다른 요법과 조합되어 투여된다.
따라서, 조합 요법이 본 발명의 항-CD40 항체 또는 단백질, 예컨대 mAb1, mAb2 또는 mAb3 항체를 또 다른 치료제, 일례로서 스테로이드의 투여와 조합하여 투여하는 것을 포함하는 경우에, 본 발명의 방법은 별개의 제제 또는 단일 제약 제제를 사용한 동시 투여, 및 임의의 순서로의 연속적인 투여를 포함한다. 본 발명의 방법이 조합 치료 요법을 포함하는 경우에, 이들 치료제는 동시에 제공될 수 있고, 즉, 본 발명의 항-CD40 항체 또는 단백질은 병용 또는 다른 치료제와 동일한 동일한 기간 내에 투여된다 (즉, 치료제는 병용 투여되지만, 본 발명의 항-CD40 항체 또는 단백질은 다른 치료제와 정확히 동시에 투여되지 않는다). 별법으로, 본 발명의 항-CD40 항체 또는 단백질은 또한 다른 치료제에 선행하여 또는 후속하여 투여할 수 있다. 상이한 치료제의 순차적인 투여는 치료된 대상체가 관해 또는 재발 가능성을 감소시키기 위해 제1 치료 과정에 반응하는지의 여부와 상관없이 수행할 수 있다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 본 발명의 항-CD40 항체 또는 단백질, 예를 들어 mAb1, mAb2 또는 mAb3 항체는 면역억제 약물 또는 항-염증성 약물과 조합 투여되고, 여기서 항체 또는 단백질 및 치료제(들)은 임의의 순서로 순차적으로, 또는 동시에 (즉, 병용 또는 동일한 기간 내에) 투여될 수 있다. 본 발명의 길항성 항-CD40 항체 또는 단백질, 예를 들어 mAb1, mAb2 또는 mAb3 항체와 조합 투여될 수 있는 적합한 면역억제 약물의 예는 메토트렉세이트, 시클로포스파미드, 미조리빈, 클로람부실, 시클로스포린, 예컨대 에어로졸화 시클로스포린 (미국 특허 출원 공보 번호 US 2002/0006901 참조), 타클로리무스 (FK506; 프로그랍™), 미코페놀레이트 모페틸, 및 아자티오프린 (6-머캅토푸린), 시롤리무스 (라파마이신), 데옥시스페르구알린, 레플루노미드 및 그의 말로노니트릴로아미드유사체; 및 면역억제 단백질, 예를 들어, 항-CTLA4 항체 및 Ig 융합체, 항-B 림프구 자극자 항체 (예를 들어, 림포스타트 (LYMPHOSTAT)-BTM) 및 Ig 융합체 (BLyS-Ig), 항-CD80 항체 및 에타너셉트 (엔브렐 (Enbrel) (RTM)), 및 항-T 세포 항체, 예컨대 항-CD3 (OKT3), 항-CD4 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 적합한 항-염증제의 예는 코르티코스테로이드, 예컨대, 예를 들어, 클로베타솔, 할로베타솔, 히드로코티손, 트리암시놀론, 베타메타손, 플루오시놀, 플루오시노니드, 프레드니손, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론; 비-스테로이드성 소염 약물 (NSAID), 예컨대, 술파살라진, 메살라민 (5-ASA 작용제로 알려짐) 함유 약물, 쎄레콕시브, 디클로페낙, 에토돌락, 펜프로펜, 플루르비프로펜, 이부프로펜, 케토프로펜, 메클로파메이트, 멜록시캄, 나부메톤, 나프록센, 옥사프로진, 피록시캄, 로페콕시브, 살리실레이트, 설린닥, 및 톨메틴; 포스포디에스테라제-4 억제제, 항-염증성 항체, 예컨대 아달리무맙 (휴미라(HUMERA) (RTM), TNF-α 길항제) 및 인플릭시맙 (레미케이드(Remicade), TNF-α 길항제) 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 또한, 자가면역 질환의 치료시에 현재 사용되거나 또는 사용 잠재성이 있는 면역 조정제, 예컨대 탈리도마이드 또는 그의 유사체, 예컨대 레날리도마이드가 포함된다.
이식 거부 및 이식편 대 숙주 질환은 초급성 (체액성), 급성 (T 세포 매개된), 또는 만성 (미지의 병인), 또는 이들의 조합일 수 있다. 따라서, 본 발명의 항-CD40 항체 또는 단백질, 예를 들어 mAb1, mAb2 또는 mAb3 항체는 일부 실시양태에서 간, 신장, 췌장, 췌장 섬 세포, 소장, 폐, 심장, 각막, 피부, 혈관, 뼈, 이종성 또는 자가 골수 등을 포함하고 이로 제한되지 않는 임의의 조직의 초급성, 급성, 및/또는 만성 이식 거부 및/또는 거부와 연관된 증상의 억제 및/또는 호전을 위해 사용된다. 이식편 조직은 임의의 공여자로부터 얻고, 임의의 수여자 숙주 내로 이식될 수 있고, 따라서 이식 수술은 동물 조직의 인간에 대한 이식 (예를 들어 이종이식), 인간으로부터의 조직의 또 다른 인간으로의 이식 (예를 들어 동종이식), 및/또는 인체의 한 부분으로부터의 조직의 또 다른 부분으로의 이식 (예를 들어 자가이식)을 포함할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 단백질을 사용한 치료는 또한 이식 후유증, 예컨대 열, 식욕 부진, 혈역학적 이상, 백혈구 감수증, 이식된 장기/조직의 백혈구 침윤, 및 기회 감염을 감소시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항-CD40 항체 또는 단백질, 예를 들어 mAb1, mAb2 또는 mAb3 항체는 이식 거부, 예컨대 초급성, 급성, 및/또는 만성 거부 및/또는 이식편 대 숙주 질환의 치료 및/또는 예방을 위해 단독으로 또는 면역억제 약물과 조합으로 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명의 항-CD40 항체 또는 단백질이 이식편 거부 치료를 위해 사용되는 일부 실시양태에서, 항체, 예를 들어 mAb1, mAb2 또는 mAb3 항체는 메토트렉세이트; 시클로포스파미드; 미조리빈; 클로람부실; 시클로스포린, 예컨대, 예를 들어, 에어로졸화 시클로스포린 (미국 특허 출원 공보 번호 US20020006901 참조), 타클로리무스 (FK506; 프로그랍™), 미코페놀레이트 모페틸, 및 아자티오프린 (6-머캅토푸린), 시롤리무스 (라파마이신), 데옥시스페르구알린, 레플루노미드 및 그의 말로노니트릴로아미드유사체; 면역 조정제, 예를 들어 탈리도마이드 및 그의 유사체; 및 면역억제 단백질, 예를 들어, 항-CTLA 항체 및 Ig 융합체, 항-B 림프구 자극자 항체 (예를 들어, 림포스타트-BTM) 및 Ig 융합체 (BLyS-Ig), 항-CD80 항체 및 에타너셉트 (엔브렐 (RTM)), 및 항-T 세포 항체, 예컨대 항-CD3 (OKT3), 항-CD4 항체 등을 포함하고 이로 제한되지 않는 적합한 면역억제 약물과 조합으로 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명의 조성물 및 방법이 이식 수여자, 예컨대 폐 또는 신장 이식편 수여자에서 증상 및 결과를 추가로 개선하기 위해서 다른 약물과 조합으로 사용됨이 구체적으로 고려된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 항-CD40 항체 또는 단백질, 예를 들어 mAb1, mAb2 또는 mAb3 항체는 단독으로 또는 비경구로 및/또는 비-비경구로 투여되는 시클로스포린, 예를 들어 경구 시클로스포린, 주사가능한 시클로스포린, 에어로졸화 (예를 들어 흡입) 시클로스포린, 및 그의 조합물과 조합되어 이식 거부 (예컨대, 폐 또는 신장 이식 수여자에서 초급성, 급성, 및/또는 만성 거부 또는 이식편 대 숙주 질환)를 치료하기 위해 사용된다. 요법의 적어도 하나의 성분이 에어로졸화 시클로스포린인 일부 실시양태에서, 시클로스포린은 예를 들어 가압 전달 장치 또는 연무기를 사용하여 에어로졸 분무 형태의 시클로스포린의 흡입에 의해 수여자의 폐로 전달된다. 시클로스포린은 건주 분말 또는 습윤 형태로 투여될 수 있다. 시클로스포린은 치료 용량 이하의 용량으로 투여될 수 있다.
몇몇의 다른 실시양태에서, 본 발명의 항-CD40 항체 또는 단백질, 예를 들어 mAb1, mAb2 또는 mAb3 항체는 류마티스성 관절염의 치료 및/또는 예방을 위해 단독으로 또는 면역억제 약물과 조합으로 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 항-CD40 항체 또는 단백질; 예를 들어 mAb1, mAb2 또는 mAb3 항체가 류마티스성 관절염의 치료를 위해 사용되는 일부 실시양태에서, 상기 항체 또는 단백질은 메토트렉세이트, 시클로포스파미드, 미조리빈, 클로람부실, 시클로스포린, 타클로리무스 (FK506; 프로그랍™), 미코페놀레이트 모페틸, 및 아자티오프린 (6-머캅토푸린), 시롤리무스 (라파마이신), 데옥시스페르구알린, 레플루노미드 및 그의 말로노니트릴로아미드유사체; 및 면역억제 단백질, 예를 들어, 항-CTLA 항체 및 Ig 융합체, 항-B 림프구 자극자 항체 (예를 들어, 림포스타트-BTM) 및 Ig 융합체 (BLyS-Ig), 항-CD20 항체 (예를 들어 리툭산(RITUXAN) (g)); 완전 인간 항체 HuMax-CD20, R-1594, IMMU-106, TRU-015, AME-133, 토시투모맙/1-131, 토시투모맙 (벡사 (Bexxar) (D), 이브리투모맙 티툭세탄 (제발린(Zevalin) (RTM)); 항-CD80 항체, 및 에타너셉트 (엔브렐), 및 항-T 세포 항체, 예컨대 항-CD3 (OKT3), 항-CD4 항체 등을 포함하고 이로 제한되지 않는 적합한 면역억제 약물과 조합으로 사용될 수 있다. 상기 논의된 바와 같이, 치료 유효성은 임의의 수단을 이용하여 평가할 수 있고, 미국 류마티스 학회 기준, 유럽 류마티스 학회 기준, 또는 임의의 다른 기준에 의해 규정된 임상 반응에 의해 측정된 유효성을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 예를 들어, [Felson et al. (1995) Arthritis. Rheum. 38: 727-35] 및 [van Gestel et al. (1996) Arthritis Rheum. 39: 34-40] 참조.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항-CD40 항체 또는 단백질, 예를 들어 mAb1, mAb2 또는 mAb3 항체는 다발 경화증의 치료 및/또는 예방을 위해 단독으로 또는 면역억제 약물과 조합으로 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 항-CD40 항체 또는 단백질, 예를 들어 mAb1, mAb2 또는 mAb3 항체가 다발 경화증의 치료를 위해 사용되는 일부 실시양태에서, 항체는 메토트렉세이트, 시클로포스파미드, 미조리빈, 클로람부실, 시클로스포린, 타클로리무스 (FK506; 프로그랍™), 미코페놀레이트 모페틸, 및 아자티오프린 (6-머캅토푸린), 시롤리무스 (라파마이신), 데옥시스페르구알린, 레플루노미드 및 그의 말로노니트릴로아미드유사체; 및 면역억제 단백질, 예를 들어, 항-CTLA 항체 및 Ig 융합체, 항-B 림프구 자극자 항체 (예를 들어, 림포스타트-BTM) 및 Ig 융합체 (BLyS-Ig), 항-CD20 항체 (예를 들어, 리툭산(D); 완전 인간 항체 HuMax-CD20, R-1594, IMMIJ-106, TRU-015, AME-133, 토시투모맙/1-131, 토시투모맙 (벡사 (RTM)), 이브리투모맙 티툭세탄 (제발린 (RTM)); 항-CD80 항체, 및 에타너셉트 (엔브렐), 및 항-T 세포 항체, 예컨대 항-CD3 (OKT3), 항-CD4 항체, S1P 수용체 조정에 관여하는 작용제, 예를 들어 핑골리모드 등을 포함하고 이로 제한되지 않는 적합한 면역억제 약물과 조합으로 사용될 수 있다.
제약 제제 및 투여 방식
본 발명의 항-CD40 항체 또는 단백질은 자가면역 질환 및/또는 염증성 질환의 예방 또는 치료 및/또는 이식에서 이식편 거부와 연관된 위험의 예방 또는 감소에 치료상 효과적인 농도로 투여된다.
상기 목표를 달성하기 위해, 항체는 당업계에 공지된 다양한 허용되는 부형제를 사용하여 제제화될 수 있다. 일반적으로, 항체 또는 단백질은 주사, 예를 들어 정맥내, 복강내, 또는 피하 주사에 의해 투여된다. 상기 투여를 수행하는 방법은 당업자에게 알려져 있다. 또한, 국소 또는 경구 투여될 수 있거나, 점막을 가로질러 전달될 수 있는 조성물을 얻는 것도 가능하다.
정맥내 투여는 투여되는 항-CD40 항체 또는 단백질에 따라 바람직하게는 약 1 내지 약 10시간, 보다 바람직하게는 약 1 내지 약 8시간, 훨씬 더 바람직하게는 약 2 내지 약 7시간, 보다 더 바람직하게는 약 4 내지 약 6시간에 걸친 주입에 의해 수행된다. 제약 조성물을 사용한 초기의 주입은 약 4 내지 약 6시간에 걸쳐 시행될 수 있고, 후속적인 주입은 보다 신속하게 전달된다. 후속적인 주입은 약 1 내지 약 6시간, 예를 들어, 약 1 내지 약 4시간, 약 1 내지 약 3시간, 또는 약 1 내지 약 2시간에 걸쳐 투여될 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 그의 의도된 투여 방식에 적합하게 제제화된다. 가능한 투여 경로의 예는 비경구, (예를 들어, 정맥내 (IV), 근육내 (IM), 피내, 피하 (SC), 또는 주입), 경구 및 폐 (예를 들어, 흡입), 비내, 경피 (국소), 경점막, 및 직장 투여를 포함한다. 비경구, 피내, 또는 피하 적용에 사용되는 용액 또는 현탁액은 다음 성분을 포함할 수 있다: 멸균 희석제, 예컨대 주사용수, 염수 용액, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항균제, 예컨대 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 중아황산나트륨; 킬레이팅제, 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산; 완충제, 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트 및 장성 조정제, 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스. pH는 산 또는 염기, 예컨대 염산 또는 수산화나트륨으로 조정될 수 있다. 비경구 제제는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 앰퓰, 일회용 시린지, 또는 다중 용량 바이알 내에 봉입될 수 있다.
본 발명의 항-CD40 항체 또는 단백질은 일반적으로 표준 기술에 의해 제약상 허용되는 완충제, 예를 들어, 멸균 염수, 멸균 완충된 물, 프로필렌 글리콜, 상기 물질의 조합물 등 내에 제공된다. 비경구로 투여가능한 물질의 제조 방법은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (18th ed.; Mack Publishing Company, Eaton, Pennsylvania, 1990)]에 기재되어 있다. 또한, 예를 들어, 본 발명의 방법에 사용하기 적합한 안정화된 항체 제약 제제를 설명하고 있는 WO 98/56418을 참조한다.
투여되는 본 발명의 적어도 하나의 길항제 항-CD40 항체 또는 단백질의 양은 당업자에 의해 쉽게 결정된다. 투여 방식 및 적어도 하나의 길항제 항-CD40 항체 또는 단백질의 각각의 양에 영향을 주는 인자는 요법이 시행되는 특정 질환, 질환의 중증도, 요법이 시행되는 개체의 병력, 및 연령, 키, 체중, 건강, 및 신체 상태를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 유사하게, 투여되는 길항제 항-CD40 항체 또는 단백질의 양은 투여 방식 및 대상체에게 상기 작용제의 단일 용량 또는 다중 용량이 투여되는지의 여부에 따라 결정될 것이다. 일반적으로, 항-CD40 항체 또는 단백질의 보다 높은 투여량은 요법이 시행되는 환자의 체중 증가시에 바람직하다. 투여되는 항-CD40 항체 또는 단백질의 용량은 약 0.003 mg/kg 내지 약 50 mg/kg, 바람직하게는 0.01 mg/kg 내지 약 40 mg/kg이다.
따라서, 예를 들어, 용량은 0.01 mg/kg, 0.03 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.3 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1 mg/kg, 1.5 mg/kg, 2 mg/kg, 2.5 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 7 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg, 또는 50 mg/kg일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 방법은 길항제 항-CD40 항체 또는 그의 단편의 다중 용량의 투여를 포함한다. 방법은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40회, 또는 그 초과의 길항제 항-CD40 항체 또는 그의 단편을 포함하는 치료 유효 용량의 제약 조성물의 투여를 포함할 수 있다. 항-CD40 항체 또는 단백질을 포함하는 제약 조성물의 다중 용량의 투여 빈도 및 기간은 당업자가 쉽게 결정할 수 있다. 또한, 치료 유효량의 항체 또는 단백질을 사용한 대상체의 치료는 단일 치료를 포함할 수 있거나, 또는 바람직하게는 일련의 치료를 포함할 수 있다. 바람직한 예에서, 대상체는 약 1 내지 10주, 바람직하게는 약 2 내지 8주, 보다 바람직하게는 약 3 내지 7주, 훨씬 더 바람직하게는 약 4, 5, 또는 6주 동안 약 0.1 내지 20 mg/kg 체중의 본 발명의 항-CD40 항체 또는 단백질로 매주 1회 치료된다. 치료는 재발을 방지하거나 또는 재발이 나타난 경우에 매년 시행될 수 있다. 또한, 치료에 사용되는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 효과적인 투여량은 특정 치료 과정에 걸쳐 증가하거나 감소할 수 있음이 이해될 것이다. 투여량의 변화는 본원에서 설명되는 진단 검정의 결과에 의해 유도되고 이 결과로부터 자명해질 수 있다.
따라서, 한 실시양태에서, 투여법은 치료 기간의 제1, 7, 14, 및 21일에 적어도 하나의 본 발명의 항-CD40 항체 또는 단백질의 치료 유효 용량의 제1 투여를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 투여법은 치료 기간 내에 1주의 제1, 2, 3, 4, 5, 6, 및 7일에 적어도 하나의 본 발명의 항-CD40 항체 또는 단백질의 치료 유효 용량의 제1 투여를 포함한다. 추가의 실시양태는 치료 기간 내에 1주의 제1, 3, 5, 및 7일에 적어도 하나의 본 발명의 항-CD40 항체 또는 단백질의 치료 유효 용량의 제1 투여를 포함하고; 투여법은 치료 기간 내에 1주의 제1 및 3일에 적어도 하나의 본 발명의 항-CD40 항체 또는 단백질의 치료 유효 용량의 제1 투여를 포함하고; 바람직한 투여법은 치료 기간 내에 1주의 제1일에 적어도 하나의 본 발명의 항-CD40 항체 또는 단백질의 치료 유효 용량의 제1 투여를 포함한다. 치료 기간은 1주, 2주, 3주, 1개월, 3개월, 6개월, 또는 1년을 포함할 수 있다. 치료 기간은 뒤이어 존재하거나 또는 서로 1일, 1주, 2주, 1개월, 3개월, 6개월, 또는 1년의 시간 간격으로 존재할 수 있다. 용량은 0.003 mg/kg 내지 50 mg/kg, 0.01 mg/kg 내지 40 mg/kg, 0.01 mg/kg 내지 30 mg/kg, 0.1 mg/kg 내지 30 mg/kg, 0.5 mg/kg 내지 30 mg/kg, 1 mg/kg 내지 30 mg/kg, 3 mg/kg 내지 30 mg/kg, 3 mg/kg 내지 25 mg/kg, 3 mg/kg 내지 20 mg/kg, 5 mg/kg 내지 15 mg/kg, 또는 7 mg/kg 내지 12 mg/kg이다. 따라서, 예를 들어, 본 발명의 임의의 하나의 길항제 항-CD40 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 예를 들어 항-CD40 모노클로날 항체 또는 단백질의 용량은 0.003 mg/kg, 0.01 mg/kg, 0.03 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.3 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1 mg/kg, 1.5 mg/kg, 2 mg/kg, 2.5 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 7 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg, 50 mg/kg, 또는 0.003 mg/kg 내지 50 mg/kg의 범위 내에 포함되는 다른 상기 용량일 수 있다. 본 발명의 항-CD40 항체 또는 단백질의 동일한 치료 유효 용량이 각각의 항체 투여 주 (week)에 걸쳐 투여될 수 있다.
별법으로, 상이한 치료 유효 용량의 본 발명의 길항제 항-CD40 항체 또는 단백질이 치료 기간의 과정에 걸쳐 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에서 규정된 길항제 항-CD40 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 초기의 치료 유효 용량은 보다 낮은 용량 범위 (즉, 0.003 mg/kg 내지 20 mg/kg)이고, 후속 용량은 보다 높은 용량 범위 (즉, 20 mg/kg 내지 50 mg/kg)일 수 있다.
다른 실시양태에서, 본원에서 규정되는 길항제 항-CD40 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 초기의 치료 유효 용량은 높은 용량 범위 (즉, 20 mg/kg 내지 50 mg/kg) 내이고, 후속 용량은 낮은 용량 범위 (즉, 0.003 mg/kg 내지 20 mg/kg) 내일 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 길항제 항-CD40 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 초기의 치료 유효 용량은 20 mg/kg 내지 35 mg/kg, 예를 들어 약 20 mg/kg, 약 25 mg/kg, 약 30 mg/kg, 및 약 35 mg/kg이고, 본 발명의 길항제 항-CD40 항체 또는 단백질의 후속 치료 유효 용량은 약 5 mg/kg 내지 약 15 mg/kg, 예를 들어 약 5 mg/kg, 8 mg/kg, 10 mg/kg, 12 mg/kg, 및 약 15 mg/kg이다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 항-CD40 요법은 항-CD40 요법을 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 항체 또는 단백질의 "로딩 (loading) 용량"을 투여함으로써 개시된다. "로딩 용량"은 대상체에게 투여되는 본 발명의 항-CD40 항체 또는 단백질의 초기 용량을 의도하고, 여기서 투여되는 본 발명의 항체 또는 단백질의 용량은 높은 용량 범위 (즉, 약 20 mg/kg 내지 약 50 mg/kg)에 해당한다. "로딩 용량"은 단일 투여, 예를 들어 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 IV 투여되는 단일 주입으로서, 또는 완전한 "로딩 용량"이 약 24시간 내에 투여되는 한, 다수 투여, 예를 들어 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 IV로 투여되는 다중 주입으로서 투여될 수 있다. "로딩 용량"의 투여 후에, 대상체에게 본 발명의 항-CD40 항체 또는 단백질의 하나 이상의 추가의 치료 유효 용량이 투여된다. 후속 치료 유효 용량은 예를 들어 매주 투여 계획에 따라, 또는 2주마다 1회, 3주마다 1회, 또는 4주마다 1회 투여될 수 있다. 상기 실시양태에서, 후속 치료 유효 용량은 일반적으로 낮은 용량 범위 (즉, 0.003 mg/kg 내지 20 mg/kg) 내에 해당한다.
별법으로, 일부 실시양태에서, "로딩 용량" 후에, 본 발명의 항-CD40 항체 또는 단백질의 후속적인 치료 유효 용량이 "유지 계획"에 따라 투여되고, 여기서 본 발명의 항체 또는 단백질의 치료 유효 용량은 매월 1회, 6주마다 1회, 2개월마다 1회, 10주마다 1회, 3개월마다 1회, 14주마다 1회, 4개월마다 1회, 18주마다 1회, 5개월마다 1회, 22주마다 1회, 6개월마다 1회, 7개월마다 1회, 8개월마다 1회, 9개월마다 1회, 10개월마다 1회, 11개월마다 1회, 또는 12개월마다 1회 투여된다. 상기 실시양태에서, 본 발명의 항-CD40 항체 또는 단백질의 치료 유효 용량은 특히 후속 용량이 보다 빈번한 간격으로, 예를 들어, 2주마다 1회 내지 매월 1회 투여될 때 낮은 용량 범위 (즉, 0.003 mg/kg 내지 약 20 mg/kg) 내에, 또는 특히 후속 용량이 보다 덜 빈번한 간격으로 투여될 때, 예를 들어, 후속 용량이 1개월 내지 12개월 간격으로 투여될 때 높은 용량 범위 (즉, 20 mg/kg 내지 50 mg/kg) 내에 해당한다.
치료 활성 성분으로서 본원에서 설명되는 목적하는 기능적 특성을 갖는 본 발명의 항-CD40 항체 또는 단백질을 포함하는 임의의 제약 조성물이 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 따라서, 하나 이상의 본 발명의 항-CD40 항체 또는 단백질, 예를 들어, mAb1, mAb2 또는 mAb3 항체를 포함하는 액체, 동결건조된, 또는 분무-건조된 조성물은 본 발명의 방법에 따라 대상체에게 후속 투여하기 위한 수성 또는 비-수성 용액 또는 현탁액으로서 제조될 수 있다.
각각의 상기 조성물은 적어도 하나의 본 발명의 항-CD40 항체 또는 단백질을 치료 또는 예방 활성 성분으로서 포함할 것이다.
"치료 또는 예방 활성 성분"은 제약 조성물이 대상체에게 투여될 때 대상체의 질환 또는 병태의 치료, 예방, 또는 진단에 대한 요구되는 치료 또는 예방 반응을 유도하기 위해 본 발명의 항-CD40 항체 또는 단백질이 조성물 내에 구체적으로 포함됨을 의도한다. 바람직하게는, 제약 조성물은 제조 및 저장 동안 단백질 안정성 및 생물학적 활성의 상실과 연관된 문제를 최소화하기 위해 적절한 안정화제, 증량제, 또는 둘 모두를 포함한다.
제제 첨가제 (formulant)가 본 발명의 항-CD40 항체 또는 단백질을 포함하는 제약 조성물에 첨가될 수 있다. 상기 제제 첨가제는 오일, 중합체, 비타민, 탄수화물, 아민산, 염, 완충제, 알부민, 계면활성제, 또는 증량제 (이로 제한되지 않음)를 포함할 수 있다. 바람직하게는 탄수화물은 당 또는 당 알콜, 예컨대 단당류, 이당류, 또는 다당류, 또는 수용성 글루칸을 포함한다. 당류 또는 글루칸은 프럭토스, 글루코스, 만노스, 소르보스, 자일로스, 말토스, 수크로스, 덱스트란, 풀룰란, 덱스트린, α 및 β 시클로덱스트린, 가용성 전분, 히드록시에틸 전분, 및 카르복시메틸셀룰로스, 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다.
"당 알콜"은 히드록실기를 갖는 C4 내지 C8 탄화수소로서 규정되고, 갈락티톨, 이노시톨, 만니톨, 자일리톨, 소르비톨, 글리세롤, 및 아라비톨을 포함한다. 이들 당 또는 당 알콜은 개별적으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 당 또는 당 알콜 농도는 1.0% 내지 7% w/v, 보다 바람직하게는 2.0% 내지 6.0% w/v일 수 있다. 예를 들어, 아미노산은 좌선성 (L) 형태의 카르니틴, 아르기닌, 및 베타인을 포함하지만; 다른 아미노산이 첨가될 수 있다. 바람직한 중합체는 평균 분자량이 2,000 내지 3,000인 폴리비닐피롤리돈 (PVP), 또는 평균 분자량이 3,000 내지 5,000인 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다. 제제에 첨가될 수 있는 계면활성제는 EP 270,799 및 268,110에 제시되어 있다.
추가로, 항체는 예를 들어 그의 순환 반감기를 증가시키기 위해 중합체에 대한 공유 접합에 의해 화학적으로 변형될 수 있다. 바람직한 중합체, 및 이를 펩티드에 부착시키는 방법은 미국 특허 번호 4,766,106; 4,179,337; 4,495,285; 및 4,609,546에 제시되어 있다. 바람직한 중합체는 폴리옥시에틸화 폴리올 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이다. PEG는 실온에서 수용성이고, 화학식 R (O-CH2-CH2)nO-R (R은 수소, 또는 보호기, 예컨대 알킬 또는 알칸올기일 수 있다)로 표시된다. 바람직하게는, 보호기는 1 내지 8개의 탄소를 갖고, 보다 바람직하게는 메틸이다. 기호 n은 양의 정수, 바람직하게는 1 내지 1,000, 보다 바람직하게는 2 내지 500이다. PEG의 바람직한 평균 분자량은 1,000 내지 40,000, 보다 바람직하게는 2,000 내지 20,000, 가장 바람직하게는 3,000 내지 12,000이다. 바람직하게는, PEG는 적어도 하나의 히드록시기, 보다 바람직하게는 말단 히드록시기를 갖는다. 바람직하게는 억제제 상의 유리 아미노기와 반응하도록 활성화되는 것은 바로 상기 히드록시기이다. 그러나, 반응성 기의 종류 및 양은 본 발명의 공유 접합된 PEG/항체를 얻기 위해 변경될 수 있음이 이해될 것이다.
수용성 폴리옥시에틸화된 폴리올도 본 발명에 유용하다.
이것은 폴리옥시에틸화된 소르비톨, 폴리옥시에틸화된 글루코스, 폴리옥시에틸화된 글리세롤 (POG) 등을 포함한다. POG가 바람직하다. 한가지 이유는 폴리옥시에틸화된 글리세롤의 글리세롤 백본이 예를 들어 동물 및 인간에서 모노-, 디-, 트리-글리세라이드의 천연 생성되는 것과 동일한 백본이기 때문이다. 따라서, 상기 분지형이 신체의 외래 물질로서 반드시 관찰되지는 않는다. POG의 바람직한 분자량은 PEG와 동일한 범위 내의 분자량이다. POG의 구조는 문헌 [Knauf et al. (1988, J. Bio. Chem. 263: 15064-15070)]에 제시되어 있고, POG/IL-2 접합체에 대한 논의는 미국 특허 번호 4,766,106에서 볼 수 있다.
순환 반감기를 증가시키기 위한 또 다른 약물 전달 시스템은 리포좀이다.
리포좀 전달 시스템의 제조 방법은 문헌 [Gabizon et al. (1982) Cancer Research 42: 4734]; [Cafiso (1981) Biochem Biophys Acta 649: 129]; 및 [Szoka (1980) Ann. Rev. Bioplays. Eng. 9: 467]에 논의되어 있다. 다른 약물 전달 시스템은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Poznansky et al. (1980) Drug Delivery Systems (R. L. Juliano, ed., Oxford, N.Y.) pp. 253-315]; [Poznansky (1984) Pharm Revs 36: 277]에 기재되어 있다.
제약 조성물 내에 혼입되는 제제 첨가제는 본 발명의 길항제 항-CD40 항체 또는 단백질의 안정성을 위해 제공되어야 한다. 즉, 본 발명의 항-CD40 항체 또는 단백질은 그의 물리적 및/또는 화학적 안정성을 보유하고, 목적하는 기능적 특성, 즉, 상기 규정된 하나 이상의 목적하는 기능적 특성을 가져야 한다.
단백질 안정성을 모니터링하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Jones (1993) Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90]; [Lee, ed. (1991) Peptide and Protein Drug Delivery (Marcel Dekker, Inc., New York, New York)]; 및 아래에서 개시되는 안정성 검정을 참조한다. 일반적으로, 단백질 안정성은 특정 기간 동안 선택된 온도에서 측정된다. 바람직한 실시양태에서, 안정한 항체 제약 제제는 실온에서 (약 25℃)에서 적어도 1개월, 적어도 3개월, 또는 적어도 6개월 동안 저장할 때 본 발명의 길항제 항-CD40 항체 또는 단백질의 안정성을 제공하고/하거나 적어도 6개월, 적어도 9개월, 적어도 12개월, 적어도 18개월, 적어도 24개월 동안 약 2-8℃에서 안정하다.
제약 조성물 내에서 제제화될 때 단백질, 예컨대 항체는 제약 조성물에서 시각적 징후 (즉, 변색 또는 투명도의 상실) 또는 침전, 응집, 및/또는 변성의 측정가능한 징후 (예를 들어, 크기-배제 크로마토그래피 (SEC) 또는 UV 광 산란 사용)를 보이지 않으면 제시된 시점에서 그의 물리적 안정성을 보유하는 것으로 간주된다. 화학적 안정성에 대해, 제약 조성물 내에서 제제화될 때 단백질, 예컨대 항체는 제약 조성물에서 화학적 안정성 측정치가 단백질 (즉, 항체)이 관심있는 생물학적 활성을 보유함을 나타내면 제시된 시점에서 그의 화학적 안정성을 보유하는 것으로 간주된다. 화학적 안정성의 변화를 모니터링하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예컨대 SDS-PAGE, SEC, 및/또는 매트릭스-보조 레이저 탈착 이온화/비행시간형 (time of flight) 질량 분석법을 사용한, 클리핑 (clipping)에 의한 화학적으로 변경된 형태의 단백질의 검출 방법; 및 예를 들어 이온-교환 크로마토그래피를 사용한 분자 전하의 변화와 연관된 분해 (예를 들어, 탈아미드화와 연관된)를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 예를 들어, 아래에 개시되는 방법을 참조한다.
제약 조성물 내에서 제제화될 때 본 발명의 항-CD40 항체 또는 단백질은 목적하는 생물학적 활성에 적합한 검정으로 결정될 때 제시된 시점에서 목적하는 생물학적 활성이, 제약 조성물이 제조시에 보이는 목적하는 생물학적 활성의 약 30% 내, 바람직하게는 약 20% 내이면, 제시된 시점에서 요구되는 생물학적 안정성을 보유하는 것으로 간주된다. 본원에 개시된 길항제 항-CD40 항체 또는 단백질의 목적하는 생물학적 활성을 측정하는 검정은 본원의 실시예에서 설명되는 바와 같이 수행할 수 있다. 또한, 문헌 [Schutze et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8200-8204]; [Denton et al. (1998) Pediatr Transplant. 2: 6-15]; [Evans et al. (2000) J: Immunol. 164: 688-697]; [Noelle (1998) Agents Actions Suppl. 49: 17-22]; [Lederman et al. (1996) Curr Opin. Hematol. 3: 77-86]; [Coligan et al. (1991) Current Protocols in Immunology 13: 12]; [Kwekkeboom et al. (1993) Immunology 79: 439-444]; 및 미국 특허 번호 5,674, 492 및 5,847,082에 기재된 검정을 참조한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 예를 들어 mAb1-mAb3 재조합 항체 중에서 선택된 항-CD40 항체는 액체 제약 제제에서 제제화된다. 본 발명의 항-CD40 항체 또는 단백질은 상기 본원에서 개시된 방법을 포함하는, 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 한 실시양태에서, 예를 들어 mAb1-mAb3 항체 중에서 선택된 항-CD40 항체는 CHO 세포주에서 재조합 방식으로 생산된다.
그의 제조 및 정제 후에, 항-CD40 항체는 본원에서 제시된 방식으로 액체 제약 제제로서 제제화될 수 있다. 길항제 항-CD40 항체가 그의 제제화 전에 보관되는 경우에, 항체는 예를 들어 -20℃에서 동결된 후, 추가의 제제화를 위해 실온에서 해동될 수 있다.
액체 제약 제제는 치료 유효량의 본 발명의 항-CD40 항체 또는 단백질, 예를 들어, mAb1, mAb2 또는 mAb3 항체를 포함한다. 제제에 존재하는 항체의 양은 투여 경로 및 요구되는 용량 부피를 고려한다.
상기 방식에서, 액체 제약 조성물은 항-CD40 항체, 예를 들어, mAb1, mAb2 또는 mAb3 항체를 0.1 mg/ml 내지 300.0 mg/ml, 1.0 mg/ml 내지 200 mg/ml, 5.0 mg/ml 내지 100.0 mg/ml, 7.5 mg/ml 내지 50 mg/ml, 또는 15.0 mg/ml 내지 25.0 mg/ml의 농도로 포함한다.
액체 제약 조성물은 항-CD40 항체, 예를 들어, mAb1, mAb2 또는 mAb3 항체 및 제제의 pH를 5.0 내지 7.0으로 유지하는 완충제를 포함한다.
항체의 물리화학적 안정성 및 요구되는 생물학적 활성이 상기한 바와 같이 보유된다면, 액체 항-CD40 항체 제제의 pH를 약 pH 5.0 내지 약 pH 7.0으로 유지하는 임의의 적합한 완충제가 제제에 사용될 수 있다. 적합한 완충제는 통상적인 산 및 그의 염 (여기서, 반대 이온은 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 또는 마그네슘일 수 있음)을 포함한다. 제약 액체 제제를 완충하기 위해 사용될 수 있는 통상적인 산 및 그의 염의 예는 숙신산 또는 숙시네이트, 히스티딘 또는 히스티딘 염산염, 시트르산 또는 시트레이트, 아세트산 또는 아세테이트, 타르타르산 또는 타르타레이트, 인산 또는 포스페이트, 글루콘산 또는 글루코네이트, 글루탐산 또는 글루타메이트, 아스파르트산 또는 아스파르테이트, 말레산 또는 말리에이트, 밀 말산 또는 말레이트 완충제를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 제제 내의 완충제 농도는 1 mM 내지 50 mM, 예를 들어 약 1 mM, 2 mM, 5 mM, 8 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, 또는 1 mM 내지 50 mM 범위 내의 다른 값일 수 있다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 액체 제약 제제는 치료 유효량의 항-CD40 항체, 예를 들어, mAb1, mAb2 또는 mAb3 항체, 및 제제 내의 pH를 약 pH 5.0 내지 pH 7.0으로 유지하는 농도의 숙시네이트 완충제 또는 시트레이트 완충제 또는 히스티딘 완충제 또는 히스티딘 염산염 완충제를 포함한다. "숙시네이트 완충제" 또는 "시트레이트 완충제"는 각각 숙신산의 염 또는 시트르산의 염을 포함하는 완충제를 의도한다. "히스티딘 완충제"는 아미노산 히스티딘의 염을 포함하는 완충제를 의도한다.
바람직한 실시양태에서, 완충제는 히스티딘 완충제, 예를 들어, 히스티딘 염산염이다. 상기에서 알 수 있는 바와 같이, 제제 내의 히스티딘 완충제 농도는 1 mM 내지 50 mM, 예를 들어 약 1 mM, 2 mM, 5 mM, 8 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, 또는 1 mM 내지 50 mM 범위 내의 다른 값일 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 숙시네이트 또는 시트레이트 반대 이온은 나트륨 양이온이고, 따라서 완충제는 각각 숙신산나트륨 또는 시트르산나트륨이다. 그러나, 임의의 양이온이 효과적일 것으로 예상된다. 다른 가능한 숙시네이트 또는 시트레이트 양이온은 칼륨, 암모늄, 칼슘, 및 마그네슘을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 상기에서 알 수 있는 바와 같이, 제제 내의 숙시네이트 또는 시트레이트 완충제 농도는 1 mM 내지 50 mM, 예를 들어 약 1 mM, 2 mM, 5 mM, 8 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, 또는 1 mM 내지 50 mM 범위 내의 다른 값일 수 있다.
다른 실시양태에서, 액체 제약 제제는 0.1 mg/ml 내지 300.0 mg/ml, 또는 1.0 mg/ml 내지 200 mg/ml, 5.0 mg/ml 내지 100.0 mg/ml, 7.5 mg/ml 내지 50 mg/ml, 또는 15.0 mg/ml 내지 25.0 mg/ml의 농도의 길항제 항-CD40 항체, 예를 들어, mAb1, mAb2 또는 mAb3 항체, 및 1 mM 내지 50 mM, 5 mM 내지 40 mM, 10 mM 내지 35 mM, 바람직하게는 약 30 mM의 농도의 히스티딘 또는 숙시네이트 또는 시트레이트 완충제, 예를 들어, 숙신산나트륨 또는 시트르산나트륨 완충제 또는 히스티딘 염산염을 포함한다.
액체 제약 제제가 등장성에 가까운 것이 바람직한 경우에, 치료 유효량의 본 발명의 항-CD40 항체 또는 단백질, 예를 들어, mAb1, mAb2 또는 mAb3 항체, 및 제제의 pH를 약 5.0 내지 약 7.0으로 유지하기 위한 완충제를 포함하는 액체 제약 제제는 제제를 등장성에 가깝게 만들기 위해 충분한 양의 등장화제를 추가로 포함할 수 있다. "등장성에 가까운"은 수성 제제의 오스몰 농도가 240 mmol/kg 내지 800 mmol/kg, 바람직하게는 약 240 내지 약 600 mmol/kg, 보다 바람직하게는 약 240 내지 약 440 mmol/kg, 보다 바람직하게는 약 250 내지 약 330 mmol/kg, 훨씬 더 바람직하게는 약 260 내지 약 320 mmol/kg, 보다 더 바람직하게는 약 270 내지 약 310 mmol/kg임을 의도한다.
용액의 등장성을 결정하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Setnikar et al. (1959) J. Am. Pharm. Assoc. 48:628]을 참조한다. 당업자는 제약 조성물에 등장성을 제공할 때 유용한 제약상 허용되는 다양한 용질을 잘 알고 있다. 등장화제는 본 발명의 액체 제약 제제의 삼투압을 신체 유체와 거의 동일한 값으로 조정할 수 있는 임의의 시약일 수 있다. 생리학상 허용되는 등장화제를 사용하는 것이 바람직하다.
따라서, 치료 유효량의 길항제 항-CD40 항체, 예를 들어, mAb1, mAb2 또는 mAb3 항체 및 제제의 pH를 약 5.0 내지 약 7.0으로 유지하기 위한 완충제를 포함하는 액체 제약 제제는 등장성을 제공하기 위해 사용될 수 있는 성분, 예를 들어, 염화나트륨; 아미노산, 예컨대 알라닌, 발린, 및 글라이신; 당 및 당 알콜 (폴리올), 비제한적인 예를 들어 글루코스, 덱스트로스, 프럭토스, 수크로스, 말토스, 만니톨, 트레할로스, 글리세롤, 소르비톨, 및 자일리톨; 아세트산, 다른 유기 산 또는 그들의 염, 및 비교적 소량의 시트레이트 또는 포스페이트를 추가로 포함할 수 있다. 당업자는 액체 제제의 최적 장성을 제공하기에 적합한 추가의 작용제를 알 것이다.
몇몇의 바람직한 실시양태에서, 치료 유효량의 항-CD40 항체, 예를 들어, mAb1, mAb2 또는 mAb3 항체, 및 제제의 pH를 약 5.0 내지 약 7.0으로 유지하기 위한 완충제를 포함하는 액체 제약 제제는 염화나트륨을 등장화제로서 추가로 포함한다.
제제 내의 염화나트륨의 농도는 장성에 대한 다른 성분의 기여도에 따라 결정될 것이다. 일부 실시양태에서, 염화나트륨의 농도는 50 mM 내지 300 mM이다. 하나의 상기 실시양태에서, 염화나트륨의 농도는 약 150 mM이다. 다른 상기 실시양태에서, 염화나트륨의 농도는 약 150 mM이고, 완충제는 5 mM 내지 15 mM 농도의 숙신산나트륨 또는 시트르산나트륨 완충제이고, 액체 제약 제제는 치료 유효량의 본 발명의 항-CD40 항체 또는 단백질, 예를 들어, mAb1, mAb2 또는 mAb3 항체를 포함하고, 제제의 pH는 5.0 내지 pH 7.0이다.
다른 실시양태에서, 액체 제약 제제는 0.1 mg/ml 내지 50.0 mg/ml 또는 5.0 mg/ml 내지 25.0 mg/ml의 농도의 본 발명의 항-CD40 항체 또는 단백질, 예를 들어, mAb1, mAb2 또는 mAb3 항체, 약 150 mM 염화나트륨, 및 약 10 mM, 20 mM 30 mM, 40 mM 또는 50 mM 숙신산나트륨 또는 시트르산나트륨을 약 5.5의 pH에서 포함한다.
본 발명의 액체 제약 제제의 처리 동안 동결 해동 또는 기계적 전단에 의한 단백질 분해는 용액-공기 계면에서 표면 장력을 저하시키기 위해 제제 내로 계면활성제를 혼입함으로써 억제될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 액체 제약 제제는 치료 유효량의 본 발명의 항-CD40 항체 또는 단백질, 예를 들어, mAb1, mAb2 또는 mAb3 항체, 제제의 pH를 약 5.0 내지 약 7.0으로 유지하기 위한 완충제를 포함하고, 계면활성제를 추가로 포함한다. 다른 실시양태에서, 액체 제약 제제는 치료 유효량의 본 발명의 항-CD40 항체 또는 단백질, 예를 들어, mAb1, mAb2 또는 mAb3 항체, 제제의 pH를 약 5.0 내지 약 7.0으로 유지하기 위한 완충제, 50 mM 내지 약 300 mM의 농도의 등장화제, 예컨대 염화나트륨을 포함하고, 계면활성제를 추가로 포함한다.
사용되는 일반적인 계면활성제는 비이온성 계면활성제, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르, 예컨대 폴리소르베이트 80 (트윈 (Tween) 80) 및 폴리소르베이트 20 (트윈 20); 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 에스테르, 예컨대 플루로닉 (Pluronic) F68; 폴리옥시에틸렌 알콜, 예컨대 Brij 35; 시메티콘; 폴리에틸렌 글리콜, 예컨대 PEG400; 리소포스파티딜콜린; 및 폴리옥시에틸렌-p-t-옥틸페놀, 예컨대 트리톤 (Triton) X-100이다.
계면활성제 또는 유화제에 의한 제약물질의 전통적인 안정화는 예를 들어 본원에 참고로 포함된 문헌 [Levine et al. (1991) J. Parenteral Sci. Technol. 45 (3): 160-165]에 기재되어 있다. 본 발명의 실행시에 사용되는 바람직한 계면활성제는 폴리소르베이트 80이다. 계면활성제가 포함되는 경우에, 이것은 일반적으로 0.001% 내지 1.0% (w/v)의 양으로 첨가된다.
따라서, 일부 실시양태에서, 액체 제약 제제는 치료 유효량의 본 발명의 항-CD40 항체 또는 단백질, 예를 들어, mAb1, mAb2 또는 mAb3 항체를 포함하고, 완충제는 1 mM 내지 50 mM, 3 mM 내지 40 mM, 또는 5 mM 내지 35 mM; 또는 7.5 mM 내지 30 mM의 농도의 숙신산나트륨 또는 시트르산나트륨 또는 히스티딘 완충제 또는 히스티딘 염산염 완충제이고; 제제의 pH는 5.0 내지 7.0이고; 제제는 계면활성제, 예를 들어, 폴리소르베이트 80을 0.001% 내지 1.0% 또는 0.001% 내지 0.5%의 양으로 포함한다. 상기 제제는 임의로 등장화제, 예컨대 염화나트륨을 50 mM 내지 300 mM, 50 mM 내지 200 mM, 또는 50 mM 내지 150 mM의 농도로 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 액체 제약 제제는 0.1 mg/ml 내지 200.0 mg/ml 또는 1 mg/ml 내지 100.0 mg/ml 또는 2 mg/ml 내지 50.0 mg/ml 또는 5.0 mg/ml 내지 25.0 mg/ml, 예를 들어 약 20.0 mg/ml의 농도의 본 발명의 항-CD40 항체 또는 단백질, 예를 들어, mAb1, mAb2 또는 mAb3 항체; 50 mM 내지 200 mM 염화나트륨, 예를 들어 약 150 mM 염화나트륨; 5 mM 내지 20 mM의 숙신산나트륨 또는 시트르산나트륨, 예를 들어 약 10 mM 숙신산나트륨 또는 시트르산나트륨; 50 mM 내지 200 mM, 예를 들어 약 150 mM의 염화나트륨; 5 mM 내지 50 mM의 히스티딘 또는 히스티딘 클로라이드, 예를 들어 약 30 mM 히스티딘 또는 히스티딘 클로라이드; 및 임의로 0.001% 내지 1.0%, 예를 들어 0.001% 내지 0.5%의 양의 계면활성제, 예를 들어, 폴리소르베이트 80을 포함하고; 여기서 액체 제약 제제의 pH는 약 5.0 내지 약 7.0이다.
액체 제약 제제에는 본질적으로 상기한 임의의 보존제 및 다른 담체, 부형제, 또는 안정화제가 존재하지 않을 수 있다. 별법으로, 제제는 길항제 항-CD40 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 물리화학적 안정성에 유해한 영향을 주지 않으면 상기 본원에서 설명되는 하나 이상의 보존제, 예를 들어, 항균제, 제약상 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제를 포함할 수 있다. 허용되는 담체, 부형제, 및 안정화제의 예는 추가의 완충제, 공용매, 계면활성제, 항산화제, 아스코르브산 및 메티오닌, 킬레이팅제, 예컨대 EDTA, 금속 복합체 (예를 들어, Zn-단백질 복합체), 및 생분해성 중합체, 예컨대 폴리에스테르를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 제약상 허용되는 담체, 안정화제, 및 이소몰라이트 (isomolyte)의 제제화 및 선택에 대한 자세한 논의는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (18th ed.; Mack Publishing Company, Eaton, Pennsylvania, 1990)]에서 볼 수 있다.
본원에서 설명되는 액체 제약 제제 또는 다른 제약 조성물의 제조 후에, 분해를 억제하기 위해 동결건조될 수 있다. 액체 조성물의 동결건조 방법은 당업자에게 알려져 있다. 사용 직전에, 조성물은 추가의 성분을 포함할 수 있는 멸균 희석제 (예를 들어, 링거액, 증류수, 또는 멸균 염수)로 재구성될 수 있다.
재구성시에, 조성물은 바람직하게는 당업자에게 알려진 방법을 사용하여 대상체에게 투여된다.
의약의 제조에 있어서 길항제 항- CD40 항체의 용도
본 발명은 또한 대상체에서 자가면역 질환 및/또는 염증성 질환의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 길항제 항-CD40 항체 또는 단백질을 제공하고, 여기서 의약은 적어도 하나의 다른 요법을 사용한 치료와 공동작용한다.
"공동작용한"은 의약이 적어도 하나의 다른 요법을 사용한 대상체의 치료 전, 동안 후에 사용됨을 의도한다. 다른 요법의 예는 상기 본원에서 설명된 것, 즉, 수술 또는 외과적 절차 (예를 들어 비장절제술, 림프절절제술, 갑상선절제술, 혈장분리 교환술, 백혈구 성분 채집술, 세포, 조직, 또는 장기 이식, 장기 관류, 장 처치 등), 방사선 요법, 요법, 예컨대 스테로이드 요법 및 비-스테로이드 요법, 호르몬 요법, 시토카인 요법, 피부 작용제 (예를 들어, 피부 병태, 예컨대 알러지, 접촉 피부염, 및 건선 치료에 사용되는 국소 작용제)를 사용한 요법, 면역억제 요법, 및 다른 항염증성 모노클로날 항체 요법과 같은 요법 등을 포함하고 이로 제한되지 않고, 여기서 추가의 요법, 또는 추가의 치료제를 사용한 치료는 본원에서 상기한 본 발명의 길항제 항-CD40 항체 또는 단백질을 포함하는 의약을 사용한 대상체의 치료 전, 동안 또는 후에 시행된다.
하나의 상기 실시양태에서, 본 발명은 대상체에서 자가면역 질환 및/또는 염증성 질환의 치료에 사용하기 위한 mAb1, mAb2 또는 mAb3 항체를 제공하고, 여기서 의약은 본원에서 상기한 적어도 하나의 다른 요법을 사용한 치료와 공동작용한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 길항제 항-CD40 항체, 예를 들어, 모노클로날 항체 mAb1, mAb2 또는 mAb3, 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 의약은 2개의 다른 치료제를 사용한 치료와 공동작용한다.
길항제 항-CD40 항체를 포함하는 의약이 2개의 다른 치료제와 공동작용할 경우, 의약은 다른 치료제 중의 어느 하나 또는 둘 모두를 사용한 대상체의 치료 전, 동안 또는 후에 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 대상체에서 자가면역 질환 및/또는 염증성 질환의 치료에 사용하기 위한 본원에 개시된 길항제 항-CD40 항체, 예를 들어, 항체 mAb1, mAb2 또는 mAb3을 제공하고, 여기서 의약은 적어도 하나의 다른 요법으로 사전치료된 대상체에서 사용된다.
"사전치료된" 또는 "사전치료"는 대상체가 본 발명의 길항제 항-CD40 항체 또는 단백질을 포함하는 의약의 투여 전에 하나 이상의 다른 치료제로 치료됨을 의도한다.
다음 예는 예시로서 제공되고 본 발명을 제한하지는 않는다.
도면 범례
도 1은 Chir12.12 (빈 원), mAb1 (채워진 원), mAb2 (채워진 사각형), mAb3 (채워진 삼각형) 또는 인간 CD40L (빈 사각형)의 투여 반응으로 자극된 인간 PBMC 배양 72시간 후에 3H-티미딘의 혼입을 보여준다.
도 2는 5 ㎍/ml 항-IgM F(ab')2 또는 1 μM CpG2006의 존재 하에 동시-자극된 Chir12.12 (빈 원), mAb1 (채워진 원), mAb2 (채워진 사각형), mAb3 (채워진 삼각형), 인간 CD40L (빈 사각형), 이소형 대조군 (채워진 다이아몬드)의 투여 반응으로 자극된 인간 PBMC 배양 72시간 후에 3H-티미딘의 혼입을 보여준다.
도 3은 75 ng/ml IL-4의 존재 하에 동시-자극된 Chir12.12 (빈 원), mAb1 (채워진 원), mAb2 (채워진 사각형), mAb3 (흑색 삼각형), 인간 CD40L (빈 사각형), 이소형 대조군 (채워진 다이아몬드)의 투여 반응으로 자극된 인간 PBMC 배양 72시간 후에 3H-티미딘의 혼입을 보여준다.
도 4는 Chir12.12 (빈 원), mAb1 (채워진 원), mAb2 (채워진 사각형), mAb3 (흑색 삼각형) 또는 인간 CD40L (빈 사각형)의 투여 반응과 함께 20 ㎍/ml CD40L로 자극된 인간 PBMC 배양 72시간 후에 3H-티미딘의 혼입을 보여준다.
도 5는 BJAB 세포주에 대한 항-인간 CD40 항체, 각각 Chir12.12 (채워진 원), mAb1 (빈 사각형), mAb2 (빈 삼각형), mAb3 (채워진 삼각형)의 용량-의존성 결합을 각각 보여준다.
실시예
재료
1. 모노클로날 항체
Chir12.12 (1.9 mg/ml), mAb1 (0.88 mg/ml), mAb2 (1.9 mg/ml), 및 mAb3 (1.9 mg/ml)을 50 mM 시트레이트 pH 7.0, 140 mM NaCl 내에 제공하였다. 선택 실험을 위해 IgG 이소형 대조군을 또한 사용하였다 (시그마 (Sigma; 미국 세인트루이스)).
2. B 세포 활성화 자극
AfiniPure F(ab')2 단편 토끼 항-인간 IgM은 잭슨 이뮤노 리서치 (Jackson Immuno Research, 영국 서폴크)로부터 입수하고, CpG2006은 마이크로신쓰 (Microsynth, 스위스 발가)로부터 입수하였다. 재조합 인간 CD40L은 당업자에게 공지된 표준 절차를 이용하여 생성하였다. 인간 IL-4를 함유하는 상청액을 당업자에게 공지된 표준 절차를 이용하여 생성하였다.
3. 시험관내 조직 배양 시약
PBMC 배양 배지: RPMI-1640, 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 1% 비필수 아미노산, 1% 피루브산나트륨, 5 mM β-머캅토에탄올 (모두 인비트로겐 (Invitrogen, 미국 샌디에고) 제품).
방법
1. CD40L -매개 PBMC 증식 검정
1.1 인간 말초 혈액 단핵 세포 ( PBMC )의 정제
1차 PBMC를 건강한 지원자로부터 얻어진 전혈 버피 코트 (buffy coat)로부터 정제하였다 (블루츠펜데젠트룸 (Blutspendezentrum, 스위스 바젤)). 버피 코트를 5 mM EDTA를 함유하는 Ca2+ 및 Mg2+ 비함유 PBS로 1:4 희석하고, 25 ml을 50 ml 팔콘 (Falcon) 튜브 내로 분취하였다. 희석시킨 버피 코트에 팔콘 튜브당 14 ml의 피콜-플라크 플러스 (Ficoll-Plaque Plus: 지이 헬쓰케어 (GE Healthcare))를 밑에 넣고, 실온에서 20 min 동안 2250 rpm에서 (휴식 없이) 원심분리하였다. 원심분리 후에, 경계층을 단일 50 ml 팔콘 튜브에 옮겼다. 다수 튜브로부터의 경계층 (단일 공여자로부터)을 30 ml의 부피까지 합하였다. 5 mM EDTA를 보충한 PBS를 첨가하고, 세포를 실온에서 5 min 동안 2250 rpm에서 원심분리하였다. 상청액을 폐기한 후, 15 ml 적혈구 (RBC) 용해 완충제를 첨가하고, 실온에서 5 min 동안 인큐베이팅하였다. 후속적으로, 20 ml의 PBS/5 mM EDTA를 첨가하고, 세포를 다시 원심분리하였다 (RT/2250 rpm에서 5 min). 세포를 PBS/5 mM EDTA 내에 2회 세척하고 (원심분리 단계가 개재함) 및 35 ml PBMC 배지 내에 재현탁한 후, 트립판 블루 염색 배제를 이용하여 생존 세포 수를 결정하였다. 시험관내 자극을 위해 즉시 사용하지 않는 세포는 냉동보존하였다.
1.2 시험관내 PBMC 자극 검정
각각의 항-CD40 또는 이소형 대조군 mAb의 7 지점 2배 연속 희석액을 코스타 (Costar) 96 웰 플레이트 내에서 불변 용량의 5 ㎍/ml 항-IgM F(ab')2, 1 μM CpG2006, 인간 IL-4을 함유하는 상청액 (75 ng/ml), 또는 40 ㎍/ml 재조합 huCD40L (지시된 최종 농도)의 존재 또는 부재 하에 삼중으로 제조하였다. 각각의 항-CD40 mAb의 출발 농도는 실험에 따라 20 ㎍/ml 내지 100 ㎍/ml 범위였다. CD40L을 모든 실험에 대한 양성 대조군으로서 투여 반응에서 사용하였다. 항-IgM, CpG2006, IL-4 및 CD40L의 용량을 PBMC 또는 B 세포 증식을 유도하는 이들 시약 (단독 또는 조합으로)의 능력을 투여 반응에서 평가한 (데이타를 제시하지 않음) 선행 실험을 기초로 하여 선택하였다. 후속적으로, PBMC (웰 당 8x104의 최종 밀도)를 각각의 웰에 첨가한 후, 3일 동안 37℃/5% CO2에서 인큐베이팅하였다. 3H-티미딘 (1 μCi/50 ㎕/웰)을 배양의 마지막 6시간 동안 각각의 웰에 첨가한 후, 수거하고 MicroBetaTrilux 섬광 계수기를 사용하여 티미딘 혼입을 결정하였다. 세포 + 배지 및 세포 + 배지 + 항-IgM, IL-4, CpG2006 또는 CD40L 대조 배양액 (항-CD40 mAb의 부재 하에)을 각각의 실험에 포함시켰음에 주목한다.
섬광 데이타는 엑셀 (Excel) 및 그래프패드 프리즘 (GraphPad Prism) 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 결과를 평균 분당 계수 (cpm) (+/- 평균의 표준 오차) 대 항-CD40 mAb 농도의 로그 (log) 변환으로서 제시한다. 양성 대조군 및 세포 + 배지 배경 수준을 각각의 그래프 상에 지시한다. IC50 또는 EC50 값은 프리즘에 의한 데이타의 성공적인 곡선-피팅 (fitting)을 위해 계산하였다.
PBMC를 3일 동안 시험 항-CD40 mAb의 투여 반응의 존재 또는 부재 하에 20 ㎍/ml CD40L로 상기 지시된 바와 같이 자극하였다. 증식을 72시간의 배양 후에 3H-티미딘 혼입에 의해 평가하였다. 결과를 삼중 배양의 평균 + SEM으로서 제시하고, 4명의 공여자를 대표한다 (독립적인 실험). 항-CD40 mAb 매개된 억제에 대한 IC50 값을 ㎍/ml 단위로 표로 작성하였다.
2. 시험관내 PBMC 효능제 검정
인간 PBMC를 동시-자극의 부재 하에 또는 5 ㎍/ml 항-IgM F(ab')2 또는 1 μM CpG2006의 존재 하에 3일 동안 Chir12.12, mAb1, mAb2 또는 mAb3의 투여 반응으로 상기 단락 1.2에 지시된 바와 같이 자극하였다. 증식을 72시간의 배양 후에 3H-티미딘 혼입에 의해 평가하였다. 결과를 삼중 배양의 평균 + SEM으로서 제시하고, 4명의 공여자를 대표한다 (독립적인 실험).
3. ADCC 검정
50 ㎕의 PBMC 현탁액 (10x106 세포/mL)을 환저 웰 (코닝 인코포레이티드 (Corning Incorporated) - 코스타 #3790)에 첨가하고, 50 ㎕ 칼세인-염색된 Raji 세포 (2x105 세포/mL) 및 100 ㎕의 항체 희석액 또는 대조군을 첨가하였다. 최대 용해는 2% 트리톤 100 내에서 결정하였다.
세포를 플레이트의 저변에 수집하고 (250 g에서 3분), 37℃에서 가습 CO2 분위기 (5%) 내에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 세포를 원심분리 (750 g에서 3분)에 의해 배지로부터 분리하고, 100 ㎕의 상청액을 측정을 위해 투명 바닥 흑색 플레이트 (코닝 인코포레이티드 - 코스타 #3904) 내로 옮겼다.
형광은 스펙트라맥스 제미니 (SpectraMax Gemini) 분광계 (몰레큘라 디바이시즈 (Molecular Devices))를 사용하여 485 nm에서 여기 후에 535 nm에서 결정하였다. 특이적 용해는 다음 식을 이용하여 계산하였다:
(실험적 방출 - 자발적 방출)/(최대 방출 - 자발적 방출) x 100.
4. 인간 BJAB 세포주에 대한 항-인간 CD40 항체 변이체의 결합
인간 BJAB 세포에 대한 그들의 결합에서 상이한 항-CD40 항체 Fc 변이체의 결합을 비교하기 위해 유동 세포측정을 이용하였다. 따라서, 2 x 105개의 세포를 96-웰 V자형 플레이트의 웰마다 접종하였다. 플레이트를 200 ㎕의 FACS 완충제 (PBS, 5% FCS, 2 mM EDTA)로 2 min 동안 4℃에서 1350 x g에서 2회 세척하였다. 상청액을 폐기하고, 세포를 8% 인간 혈청을 함유하는 100 mL FACS 완충제 내에 재현탁하고 (인비트로멕스 (InVitromex), Cat. No. S4190), 10 min 동안 인큐베이팅하였다. 2회 세척 후에, 항-인간 CD40 Fc 변이체를 1:2 희석비로 10 ㎍/mL의 농도에서 출발하여 1% 인간 혈청을 함유하는 50 ㎕ FACS 완충제 내에 첨가하였다. 세포를 30 min 동안 얼음 상에서 인큐베이팅한 후 2회 세척하였다. 50 ㎕의 폴리클로날 토끼 항-인간 IgG FITC, F(ab')2 (다코 (DAKO), Cat. No. F 0315)를 각각의 웰에 첨가하고, 30 min 동안 얼음 상에서 인큐베이팅하였다. 인큐베이션의 끝에, 세포를 2회 세척하고, 100 ㎕ FACS 완충제 내에 재현탁하고, FACS CantoII 상에서 획득하였다.
획득 후에, FITC 채널의 평균 형광 강도를 FloJo.Graphing에서 획득하고, 그래프패드 프리즘 5.0을 사용하여 곡선 피팅을 수행하였다. 개별 실험 사이의 변화하는 강도 때문에, 값들을 표준화하였다. 따라서, 일련의 각각의 항체 시험의 최고값은 100%와 동일하였다. 비-선형 곡선 피팅은 % 값을 이용하여 수행하였다.
5. 단핵구-유래 수지상 세포 ( MoDC )에서 CD40L - 매개된 시토카인 생산 검정
5.1 인간 단핵구-유래 수지상 세포의 제조
인간 PBMC를 스위스 적십자 (Swiss Red Cross)에서 제공된 인간 버피 코트로부터 제조하였다. 버피 코트를 PBS (인비트로겐, Cat. No. 20012019) 내에 1:5 희석하고, 35 mL 분취액으로 50 mL 팔콘 튜브에 분포하였다. 후속적으로, 13 mL의 피콜 (지이 헬쓰케어, Cat. No. 17 1440-02)을 각각의 튜브 내에서 밑에 넣었다. 세포를 1680 x g에서 RT에서 20 min 동안 휴식 없이 원심분리하였다. PBMC 함유 층을 수집하고, 다량의 부피의 PBS 내에서 5 min 동안 1000 x g에서 2회 세척하였다. 마지막으로, 세포를 10 mL PBS 내에 재현탁하고 계수하였다.
인간 단핵구는 제조자의 지시에 따라 AutoMACS 기기 상에서 밀테니이 (Miltenyi)의 인간 단핵구 단리 키트 II (밀테니이 (Miltenyi, 독일), Cat. No. 130-091-153)를 사용하여 100 x 107개의 PBMC로부터 음성 선택으로 단리하였다. 단리 후에, 세포를 5 min 동안 1000 x g에서 4℃에서 배양 배지 (RPMI1640 (인비트로겐, Cat. No. 61870010), 10% FCS (인비트로겐, Cat. No. 16000044, US origin), 1 mM 피루브산나트륨 (인비트로겐, Cat. No. 11360039), 1 x NEAA (인비트로겐, Cat. No. 11140035), 1x 페니실린/스트렙토마이신 (인비트로겐, Cat. No. 15140122)) 내에서 2회 세척하였다. 단리된 단핵구를 계수하고, 6 웰 플레이트 내에 0.4 x 106/mL의 밀도로 플레이팅하고, 7일 동안 37℃ 및 5% CO2에서 배양하였다. 단핵구를 수지상 세포로 분화시키기 위해, 재조합 인간 IL-4 [80 ng/mL] 및 인간 GM-CSF [100 ng/mL] (둘 모두 사내 제조됨)를 배양의 시작시에 배양 배지에 첨가하였다.
5.2 시토카인 방출을 위한 수지상 세포 ( DC )의 자극
6 웰 플레이트를 세정하고, 세포를 모으고, 5 min 동안 1400 x g에서 배양 배지 내에서 2회 세척함으로써 7일의 배양 후에 미성숙 DC를 수거하였다. 후속적으로, 2 x 105 iDC를 96-웰 평저 플레이트 (벡톤 디킨슨 (Becton Dickinson), Cat. No. 353072) 내에 100 ㎕로 접종하였다. 양성 대조군에 대해 세포를 MegaCD40L (알렉시스 (Alexis), Cat. No. ALX-522-110-C010)로 1 ㎍/mL의 농도로 자극하였고, 음성 대조군은 배지 내의 iDC만으로 이루어졌다. 길항 작용 검정에서, 항-인간 CD40 항체 Fc 변이체를 용량-반응을 위해 1 ㎍/mL MegaCD40L과 함께 1:2 희석비로 10 ㎍/mL로 첨가하였다. TNFα의 측정을 위해 자극한 세포의 상청액을 24 h 후에 수집하였다. 효능 작용 검정에서, 항-인간 CD40 항체 Fc 변이체를 1:2 희석비로만 10 ㎍/mL로 첨가하였고, TNFα의 측정을 위해 상청액을 48 h 후에 수집하였다. 세포를 접종하고, 모든 검정에 대해 삼중으로 자극하였다.
5.3 ELISA 에 의한 TNF 알파의 측정
상청액 내의 TNFα의 양을 측정하기 위해, ELISA를 다음과 같이 수행하였다. 항-TNFα 포획 항체 (비디 파밍엔 (BD Pharmingen), Cat. No. 551220)을 ELISA 플레이트 (그라이너 (Greiner), 넝크 (Nunc) F96 Maxisorp, Cat. No. 442404) 상에 5 ㎍/mL로 웰 당 50 ㎕로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 모든 세척 단계에 대해, 플레이트를 BioTek ELx 405 플레이트 세척기 내에서 250 ㎕로 3회 세척하였다. 제1 세척 후에, 200 ㎕의 Superblock TBS (써모 사이언티픽 (Thermo Scientific), 피어스, Cat. No. 37535)를 1 h 동안 37℃에서 인큐베이팅하였다. 이어서, TNFα 표준물 (재조합 인간 TNFα, 알앤디 시스템즈 (R&D Systems), Cat. No. 210-TA) 또는 샘플을 25 ㎕로 첨가하였다. 표준물은 1:2 연속 희석액으로 20 ng/mL의 최종 농도에서 출발하였다. 추가로 25 ㎕의 검출 항체 (항-인간 TNFα 비오틴, 비디 파밍엔, Cat. No. 554511)를 1:500 희석비로 첨가하였다. 플레이트를 4℃에서 밤새 인큐베이팅하였다. 세척한 후에, 아비딘-POD 접합체 (ExtrAV 알칼리성 포스파타제, 시그마, Cat. No. E-2636)를 Superblock TBS 내에 1:5000 희석하고, 50 ㎕로 첨가하고, 1 h 동안 RT에서 인큐베이팅하였다. 플레이트를 세척하고, 50 ㎕의 기질 p-니트로페닐포스페이트 (시그마, Cat. No. C-3041)를 첨가하여 15 min 동안 발색시켰다. ELISA 플레이트를 SpectraMax M5 (몰레큘라 디바이시즈) 상에서 소프트웨어 SoftMax Pro를 사용하여 450 nm에서 판독하였다.
6. 독성학 연구
독성학 연구의 1차 초기 목적은 Chir12.12에 비해 고용량 (100 mg/kg) mAb1의 잠재적인 독성을 조사하기 위한 것이었다.
30마리의 마우리티안 (Mauritian) 기원의 사이노몰구스 원숭이를 본 연구를 위해 이용하였다. 투여의 개시시에, 동물은 약 4 내지 5살이고, 체중은 수컷에 대해 4.5 내지 6.6 kg, 암컷에 대해 3.1 내지 4.3 kg이었다.
mAb1 (50 mg/mL)을 하나의 군의 사이노몰구스 원숭이 (5마리 수컷/5마리 암컷; 제2군)에게 100 mg/kg의 용량 수준 및 2 mL/kg의 용량 부피에서 5주 동안 매주 1회 정맥내 투여하였다 (제1, 8, 15, 22, 29, 및 36일에 시험 항목 적용). 추가의 군의 사이노몰구스 원숭이 (5마리 수컷/5마리 암컷; 제3군)에게 모 항체 Chir12.12를 100 mg/kg의 용량 수준 및 5 mL/kg의 용량 부피로 저속 볼러스 (bolus) 주입에 의해 정맥내 투여하였다. 2 mL/kg의 용량 부피에서 mAb1 위약을 대조군으로서 역할을 하는 또 다른 군의 사이노몰구스 원숭이에 제공하였다 (5마리 수컷/5마리 암컷; 제1군). 모든 동물을 마지막 투여의 1 또는 2일 후에 부검하였다.
두 항-CD40 Ab의 효능을 평가하기 위해 키홀 림펫 헤모시아닌 (Keyhole Limpet Hemocyanin; KLH)-면역화를 포함하도록 결정하였다. 제2일에, 동물을 명반 내의 1 mg KLH로 면역화시킨 후, 제23일에 명반 내의 0.5 mg KLH의 추가접종 (booster) 주사를 수행하였다. 혈청을 면역화/추가접종 전에 및 면역화 및 추가접종의 제7 및 14일 후에 샘플링하였다. KLH 특이적 IgM/IgG 역가를 표준물로서 사이노몰구스 원숭이 항 KLH IgM/IgG 참조 혈청을 사용하는 ELISA를 이용하여 결정하였다. 나이브 (naive) B 세포 (CD20+CD21+CD27-)의 면역표현형 결정을 위해 투여 전 3회 및 제15, 29일 및 부검시에 (제37/38일) 혈액을 샘플링하였다. 절대적인 나이브 CD20 B 세포 계수는 혈액 샘플당 총 림프구 계수로부터 계산하고, 상대적인 나이브 CD20 B 세포 계수는 유동 세포측정에 의해 계산하였다.
Figure 112013042420145-pct00004
독성의 평가는 사망률, 임상 관찰 (임상 징후, 예컨대 투여 후 관찰, 대변 평가, 털 검사, 및 음식 소비), 체중, 안과 검사, 심혈관 조사, 임상 병리학 (응고, 외부 혈소판 활성화 검사, 혈액학, 임상 화학 및 뇨 분석 포함), 장기 중량, 및 육안 및 현미경 부검 결과를 기초로 하였다. 혈액 면역표현형 결정을 투여전 3회, 투여기의 제15 및 29일에 및 부검일에 수행하였다. 또한, 비장 조직 및 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH) 주사 부위의 배수 (draining) 림프절의 면역표현형 결정을 부검시에 수행하였다. 추가로, 완전한 ADCC 가능 Chir12.12의 영향을 mAb1과 직접 비교하기 위해 KLH에 대한 T-세포 의존 항체 반응 (TDAR)을 조사하였다. 혈액을 독성역학적 평가 및 가능한 항-약물-항체 (ADA) 평가를 위해 모든 동물로부터 수집하였다.
7. mAb1 의 추가의 시험관내 프로파일링 ( profiling )
7.1 PBMC 정제
인간 말초 혈액 단핵 세포는 앞서 섹션 1.1에서 설명한 바와 같이 제조하였다.
7.2 인간 편도선 B 세포 정제
편도선 피막 및 결합 조직을 제거하고, 편도선을 ~ 5 mm 큰 조각으로 절단한 후, B 세포 배지로 규칙적으로 세척하면서 금속 세포 여과기를 통해 으깨었다. 이어서, 편도선 세포를 70 μM 세포 여과기를 통해 2회 여과하여 세포 파쇄물을 제거하였다. 이지셉 (EasySep) 음성 선택 인간 B 세포 농축 키트 (스템셀 테크놀로지스 (Stemcell Technologies, 캐나다 BC 밴쿠버))를 사용하여 B 세포를 신선한 PBMC로부터 단리하였다. B 세포를 제조자의 지시에 따라 (스템셀 테크놀로지스, 캐나다 BC 밴쿠버) 이지셉 음성 선택 인간 B 세포 농축 키트를 사용하여 정제하였다.
7.3 인간 및 비-인간 영장류 PBMC 또는 B 세포를 사용한 CD40 결합 EC50 값의 평가
PBMC (붉은털 원숭이 (Rhesus), 사이노몰구스 또는 인간) 또는 편도선 B 세포 (인간 단독)를 투여 반응 (최종 농도 범위 2.5 ㎍/ml - 0.00125 ㎍/ml)에서 정제된 표지된 mAb1 또는 이소형 대조군 항체와 함께 4℃에서 30 min 동안 인큐베이팅하였다. 세포를 후속적으로 세척한 후, 항-인간 (비-인간 영장류 교차-반응성) 및 NHP에 대한 최소 교차-반응성을 갖는 비오티닐화 항-인간 IgG 항체와 함께 인큐베이팅하였다 (R10; 항-IgM 염색을 포함시키거나 또는 FACS 염색의 차별적인 강도를 통해 막 IgG 발현 인간 B 세포를 구분하는 것이 가능함을 유의한다). 세포를 4℃에서 30 min 동안 다시 인큐베이팅한 후 세척하고, 스트렙타비딘-FITC로 20 min 동안 4℃에서 최종 염색하였다. 세포를 후속적으로 세척하고, CD20+ 세포 상의 CD40 발현의 평가의 평가는 유동 세포측정에 의해 수행하였다.
7.4 인간 및 비-인간 영장류 PBMC 또는 B 세포의 CD154 -유도된 증식의 억제 평가
각각의 항-CD40 또는 이소형 대조군 mAb의 7 지점 2배 연속 희석액을 인간 재조합 CD154 및 IL-4의 EC80 농도의 존재 하에 96 웰 플레이트에 삼중으로 제조하였다. 각각의 항-CD40 mAb의 출발 농도는 실험에 따라 20 ㎍/ml 내지 100 ㎍/ml이었다. 세포 및 배지 대조군을 모든 실험에 대해 음성 대조군으로 사용하였다. 후속적으로, PBMC (붉은털 원숭이, 사이노몰구스 또는 인간) 또는 편도선 B 세포 (인간 단독)를 각각의 웰에 첨가한 후, 3일 동안 37℃/5% CO2에서 인큐베이팅하였다. 3H-티미딘 (1 μCi/50 ㎕/웰)을 배양의 마지막 6시간 동안 각각의 웰에 첨가한 후 수거하고, 섬광 계수기를 사용하여 티미딘 혼입을 결정하였다.
8. 사이노몰구스 원숭이의 신장 동종이식 모델에서 시클로스포린 A와 조합된 mAb1의 효능
8.1 동물
사용된 모든 사이노몰구스 원숭이 (마카카 파시쿨라리스)는 7.7±0.9 kg의 필리핀산 (필리핀 마카티 시티 시콘브렉)의 포획 사육된 7.5-9세 수컷 (#5529/#5533, #5523/#5524 및 #5536/#5538)이었다. 이식시에, 동물은 정상 혈액학, 혈청/뇨 화학을 보였고, 결핵, 살모넬라/시겔라에 대해, 바이러스 물질 (헤르페스 B, 원숭이 T-세포 백혈병 바이러스, 원숭이 면역결핍 바이러스, 원숭이 타입 D 레트로바이러스, B형 간염 바이러스)에 대한 항체에 대해 및 관련 외부/내부 기생충에 대해 음성이었다. 그러나, 모든 동물은 사이토메갈로바이러스 및 A형 간염 바이러스 (HAV)에 대한 항체를 제시하였다 (2010년도에 시험됨; 동물 #5536은 HAV에 대해 음성이었다). 동물 #5523의 분변 검사는 2010년 12월에 발란티듐 콜라이 (Balantidium coli)에 대해 양성으로 시험되었다.
수술 후 제1주 동안, 동물을 단일 원격측정 우리에 수용하고, 서로 볼 수 있도록 하였다. 나머지 기간에, 동물 #5536/#5538을 함께 수용하고, 나머지 4마리의 동물은 전체 실험 동안 격리하였다 (공존할 수 없는 동물). 모든 동물을 유지된 온도 (20-24℃), 적어도 40%의 습도 및 천연 광주기 하에 수용하였다. 모든 동물에게 과일과 채소의 혼합물을 매일 적어도 2회 공급하였다. 물 및 클리바 나파그 (Kliba Nafag) 3446 펠렛 (카이저라욱스트 (Kaiseraugst, 독일))은 무제한 제공하였다.
모든 실험은 스위스 동물 복지 규정 (Swiss Animal Welfare Regulations)에 따라 라이센스 BS1555 하에 수행하였다.
Figure 112013042420145-pct00005
8.2 실험 조건
8.2.1 신장 이식 및 수술 후 모니터링
공여자/수여자 쌍은 ABO 일치, DRB exon2 불일치 (Blancher A, Tisseyre P, Dutaur M, et al. (2006) Immunogenetics; 58(4):269-82) 및 MLR-자극 지수 (MLR-SI)가 >7 및 <47인 단방향 (one-way) 혼합 림프구 반응 (MLR)에서의 반응 (Bigaud M, Maurer C, Vedrine, et al. (2004) J. Pharmacol. Toxicol. Methods; 50(2):153-9)에 따라 선택하였다. 상기 선택의 결과는 표 6에 제시되고, 이중-이식 (2 공여자 사이의 교환 이식)에 있다. 동맥 혈압, 심박수 및 운동 활성의 모니터링을 위해 각각의 수여자에게 원격계측 프로브 (데이타 사이언시스 인크. (Data Sciences Inc, USA))를 이식하였다.
수술을 위해, 아트로핀 (0.05 mg/kg i.m.)과 함께 10 mg/kg, 근육내 (i.m.) 케타민에 의해 전신 마취를 유도하고, N2O/O2 (50:50) 환기 및 정맥내 프로포폴 (i.v.) (4-10 mg/kg/h; 필요할 때마다 5-10 mg 볼러스에 의해 보충)에 의해 유지하였다. 공여자 신장을 수거하고, 차가운 (4℃) 위스콘신 대학교 (University of Wisconsin) 용액 (차가운 보존 시간 ≤ 4시간)으로 씻어내고, 이식편 신장 정맥과 수여자 대정맥 사이 및 이식편 신장 동맥과 수여자 원위 대동맥 사이의 말단 대 측면 문합 (문합 시간 ≤ 40분)을 생성하기 위해 표준 미세혈관 기술을 사용하여 이소 이식하였다. 요관-방광신구형성술 (uretero-cystoneostomy)를 이식편으로부터 뇨가 보일 때 수행하였다. 천연 신장을 제거하였다. 수술후 무통증을 부프레노르핀 (0.01-0.02 mg/kg, i.m., 1일 3회); 항생제 (세포탁심, 25 mg/kg, i.m., 1일 2회 또는 1% 리도카인 내의 세프트리악손, 50 mg/kg, i.m., 1일 4회)에 의해 제공하였다. 무통증 및 항생제를 5일 동안 제공하였다. 혈소판 계수가 뚜렷한 증가 또는 감소를 경험할 때마다, 아스피린을 매일 5 mg/kg i.m.으로 투여하였다 (아스페직 (Aspegic), 사포니-아벤티스 (Sanofi-Aventis, 스위스 메랑)).
수여자를 임상 및 심혈관 상태의 변화, 체중, 음식 및 물 섭취 (최대 100-150 ml/kg/일로 보충함), 소변량, 혈액학 (베크만 코울터 (Beckmann Coulter) ACT5Diff를 사용함), 혈청 및 뇨 화학 (SCrea/SUrea/SAmylase 결정을 위해 베트스캔 (Vetscan) 분석기를 사용하고 혈청 및 뇨 샘플의 최종 확인을 위해 베크만 신크론 (Beckmann Synchron) CX5 분석기를 사용함)에 대해 모니터링하였다. 혈청 크레아티닌 (SCrea) 및 요소 (SUrea) 수준을 이식편 기능의 마커로서 사용하였다. 경피 초음파-유도 생검을 제30일 (동물 #5529 및 #5533만)에 전신 마취 하에 이전에 설명된 바와 같이 (Gaschen L, Kunkler A, Menninger K, et al. (2001) Vet. Radiol. Ultrasound; 42(3):259-64) 16G 바늘로 수행하였다. 추가로, 혈액 응고성 및 혈소판 응집에 대한 특수 모니터링을 또한 동물 #5529/#5533 및 #5523/#5524에서 이식 전 및 후에 수행하였다.
수여자를 (i) 심각한 이식편 기능부전 (예를 들어, 증가된 초음파 스코어와 연관되거나 연관되지 않은 Screa >500 μmol/l 또는 Surea >20 mmol/l); 또는 (ii) 전반적인 건강 문제 및/또는 명백한 고통의 임상 징후의 경우에 최종적으로 안락사시켰다. 부검시에, 신장 동종이식편을 모든 다른 주요 장기와 함께 수거하고 (요관 및 문합 포함), 후속적인 조직학적 분석을 위해 처리하였다.
Figure 112013042420145-pct00006
8.2.2 mAb1 및 시클로스포린 A ( CsA ) 치료
mAb1을 -80℃로부터 주입일에 새로 해동한 액체 형태로 제공하였다. 제-1, 0 및 1일 (이식 전 및 이식 후)의 처음 3회 용량을 제외하고 30 mg/kg/i.v.의 적용을 매주 1회 시행하였다. 경구 투여 (p.o.)를 위한 CsA는 미세에멀젼 전구농축물 (산디문 네오랄 (Sandimmun Neoral) (RTM) 음용액, 100 mg/ml, 노바티스 파르마 아게 (Novartis Pharma AG))이었다. CsA는 mAb1과 조합으로 20 mg/kg/p.o.의 1일 용량 (제 -1일에 시작함)으로 적용하였다 (표 6 참조).
8.2.3 mAb1 약동학 ( PK ), 면역원성 (영장류 항-인간 항체) 및 약역학 ( PD )의 모니터링
혈액 샘플 (500 ㎕ 혈청)을 제-1, 3, 7 (기준선 및 15 min), 14, 28, 42, 56, 70, 84 및 100일에 mAb1 노출의 결정을 위해 (i.v. 투여 전에) 수거하였다. CsA 결정을 위해, 혈액 샘플을 CsA의 경구 투여 전 (C0/C24) 및 적용 2시간 후에 (C2) 수거하였다. C2는 CsA 흡수의 피크 수준에 대응한다. 모든 물질을 추가 처리시까지 -80℃에서 보관하였다 (CsA 검출 키트, 핫 스타 태그 매스터 믹스 (Hot Star Taq Master Mix), 퀴아겐 (Qiagen 미국 미네소타주)). mAb1-면역원성에 대한 샘플을 제-1, 7, 14, 28, 42, 56, 70, 84 및 100일에 수거하고 (50 ㎕ 혈청), -80℃에서 냉동하였다. 간단히 설명하면, 96 웰 미량역가 플레이트를 재조합 인간 CD40으로 코팅하였다. 이들은 4℃에서 명목상 밤새 보관하였다. 차단 후에, 보정 표준물질 (Cs), 품질 대조군 (QC) 샘플 및 mAb1 함유 샘플 시료를 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 교반하면서 +25℃에서 명목상 120분 동안 인큐베이팅하였다. 플레이트의 세척 후에, 마우스 항 인간 카파 경쇄 항체, 이어서 HRP 염소 항 마우스 (H+L) 접합체를, 재조합 CD40에 결합된 임의의 mAb1을 검출하기 위해서 플레이트에 첨가하였다. 이것은 발색 기질 (TMB)의 첨가에 의해 가시화되고, 생성된 색상의 강도 (흡광도)는 존재하는 mAb1의 농도에 정비례하였다. 샘플 내의 mAb1의 농도는 교정 곡선으로부터 역산하였다. PD 샘플을 기준선으로서 이식 2-3일 전에 얻었다 (헤파린 내의 0.5 ml). 이어서, 수거액은 PK 샘플과 동일한 계획에 따라 처리하였다. CD20+ 및 CD3+ 세포를 항-인간 CD40-APC mAb (클론 5C3, 벡톤 디킨슨, cat# 555591), 항-인간 CD3-PerCP (클론 SP34-2, 벡톤 디킨슨, cat# 552851) 및 항-인간 CD20-FITC mAb (클론 LT20, 이뮤노툴즈 (Immunotools), cat# 21279203X2)과 함께 제조자의 지시에 따라 사용된 TruCount 튜브 (벡톤 디킨슨, cat# 340334)로 계수하였다. 데이타를 DIVA (버전 6.1.1) 소프트웨어를 사용하여 LSRII 유동 세포측정계 (벡톤 디킨슨 바이오사이언시스 (Becton Dickinson Biosciences))로 얻었다. 림프구 및 비드를 크기 및 입도에 따라 FSC/SSC 도트 블롯 (dot blot)에서 게이팅하고, CD20 및 CD3의 발현에 대해 추가로 분석하였다.
8.2.4 조직학
수집한 모든 조직 (이식편 생검 또는 부검시에)을 육안으로 검사하고, 4% 완충 포르말린 내에 고정시켰다. 탈수 후에, 파라핀 왁스에 포매하였다. 3 ㎛ 두께의 절편을 파라핀 블록으로부터 절단하고, 헤마톡실린 및 에오신 (HE)으로 염색하였다. 3회의 추가의 염색 (과요오드산 쉬프, 트리크롬, 및 베르회프 (Verhoeff))을 신장 절편에 대해 수행하였다. 생검 및 부검 샘플을 숙련된 병리학자가 조사하고 신장 동종이식편 병리학의 반프 (Banff) 07 분류에 따라 점수를 매겼다 (Solez K, Colvin RB, Racusen LC, et al (2008) Am. J. Transplant; 8(4):753-60). 또한, 제3자 검토를 외부 전문가에 의해 수행하였다.
추가로, 보체 단백질 C4d에 대한 면역조직화학을 파라핀 절편의 염색에 적합한 다가 항-C4d 항체를 사용하여 수행하였다 (Regele H, Exner M, Watschinger B, et al. 2001, Nephrol. Dial. Transplant; 16: 2058-2066). C4b는 급성 체액성 거부 (AHR)의 안정하고 신뢰할 수 있는 마커로 간주된다. 고정 및 파라핀 왁스 포매 후에, 3 ㎛ 두께의 절편이 있는 유리 슬라이드 (수퍼프로스트플러스 (SuperFrostPlus), RTM, 멘젤-글레저 (Menzel-Glaeser, 독일))를 제조하고, 슬라이드에 대한 최적 부착을 위해 37℃에서 오븐에서 밤새 건조하였다. 인간 거부된 신장 절편을 양성 대조군으로서 첨가하였다. 사용 전에, 슬라이드를 자일렌 (10 min) 내에서 탈파라핀화하고, 등급별 (graded) 에탄올을 통해 재수화하고, 증류수에 넣었다. 항원 복구를 이전에 설명된 바와 같이 (Segerer S, Mack M, Regele H, Kerjaschki D, Schloendorff D. Kidney Int. 1999; 56: 52-64) 시트레이트-완충제 (pH 6.0) 내에 10 min 동안 1 bar에서 가압조리 (pressure-cooking)에 의해 수행하였다. 면역염색을 위해, 다음 절차를 이용하였다: (i) 내인성 퍼옥시다제를 무수 메탄올 내의 0.5% H2O2로 20 min 동안 실온에서 불활성화시키고; (ii) 슬라이드를 0.01 M PBS, pH 7.4 (시그마-알드리치 케미 게엠베하 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, 독일)) 내에서 세척하고; (iii) 슬라이드를 60 min 동안 실온에서 PBS 중의 4% 무지방 분유 "라필레이트 (Rapilait)"와 함께 인큐베이팅하고 (미그로스 게노센샤프츠분트 (Migros Genossenschaftsbund, 스위스)); 꺼내고, 세척하지 않고; (iv) 하나의 슬라이드를 1% NGtS를 함유하는 PBS 내에서 pAb 토끼 항-인간 C4d (바이오메디카 메디진프로둑테 (Biomedica Medizinprodukte, 오스트리아 비엔나) 1:40과 함께 밤새 +4℃에서 인큐베이팅한다. 제2 슬라이드는 1차 항체 대신에 토끼 이소형 대조군 (자이메드 래보러토리즈 인크 (Zymed Laboratories Inc, 미국))을 인가함으로써 음성 대조군으로서 기능한다; (v) 슬라이드를 0.01 M PBS, pH 7.4 내에서 세척하고; (vi) 모든 슬라이드를 1% NGtS를 함유하는 PBS 내에서 비오티닐화 염소 항-토끼 IgG (벡터 래보러토리즈, 인크. (Vector Laboratories, Inc. 미국)) 1:200과 함께 실온에서 30 min 동안 인큐베이팅한다; (vii) 슬라이드를 0.01 M PBS, pH 7.4로 세척하고; (viii) PBS 내의 스트렙타비딘/HRP (벡터 래보러토리즈, 인크. 미국)과 함께 30 min 동안 실온에서 인큐베이팅하고, (ix) AEC+ (다코사이토메이션 코프. (DakoCytomation Corp., 미국 카펜테리아))로 8-10 min 동안 HRP 활성을 발생시키고, 염색 강도를 현미경에 의해 제어하고, 증류수 내에 세척하고, (x) Dako (RTM) 자동화 헤마톡실린 (다코사이토메이션 코프., 미국 카펜테리아)으로 2 min 동안 역염색하고 흐르는 수돗물에서 5 min 동안 세척하고; (xi) 수성 봉입제 (mounting medium) (메디테 메디진테크닉 아게 (Medite Medizintechnik AG, 스위스))로 봉입한다.
실시예 1: mAb1 , mAb2 및 mAb3 의 효능제 활성의 평가
실험 데이타는 단리된, 비분획화된 1차 인간 PBMC의 사용을 기초로 한다. 전체 PBMC 제제 (단리된 B 세포 또는 단핵구 대신에)는 생체 내에서 항-CD40 mAb가 상이한 백혈구 세포 종류에 대한 다수의 직접 및 간접적 효과를 가질 수 있는 상황을 보다 가깝게 모방한다. 상기 PBMC 증식 검정을 사용하여, 모 Chir12.12 항체로부터 변하지 않은 항원 결합부의 아미노산 서열을 보유한 비글리코실화된 항-CD40 mAb mAb1 (N297A) 및 mAb2 (D265A)가 모 Chir12.12 mAb의 비효능성의 CD40L 차단 특성을 보유함을 결정하였다. 항체 mAb3 (LALA 돌연변이체)는 IL-4의 존재 하에 약하게 효능성이었다.
특히, 실험 결과는 어느 Fc 침묵 항-CD40 mAb도 인간 PBMC (n = 4 공여자)에 의한 세포 분열을 자극할 수 없었고, 이것은 모 Chir12.12 mAb에서 관찰된 것과 유사함을 보여준다 (도 1 참조). PBMC는 CD40L에 반응하여 증식하였다. mAb1 및 mAb2는 PBMC의 CpG2006 또는 항-IgM F(ab')2 유도 증식을 향상시킬 수 없었다 (도 2). 추가로, Chir12.12는 PBMC의 항-IgM F(ab')2 유도 증식을 향상시키지 못하였지만, mAb1 및 mAb2와 달리, CpG 유도된 PBMC 증식을 완전히 억제하였다.
IL-4의 존재 하에, mAb3 (LALA 돌연변이)은 IL-4 단독에 의해 유도되는 수준을 초과하는 낮지만 재현가능한 (n = 4 공여자) 수준의 티미딘 혼입을 유도하는 것으로 관찰된 반면, mAb1, mAb2 및 Chir12.12는 그렇지 않았다 (도 3). 종합적으로, 이들 결과는 mAb3 (IL-4의 존재 하에)을 제외하고, 어떠한 항-CD40 mAb도 효능제 활성을 갖지 않음을 보여주었다.
상기 결과는 또한 mAb1 및 mAb2가 동시-자극 신호의 존재 하에 효능제 활성을 갖지 않음을 분명하게 입증하였다. 이것은 만성 자가면역 질환의 환자에서 백혈구가 활성화된 또는 부분적으로 활성화된 표현형을 갖고 따라서 CD40 또는 다른 자극원을 통한 신호전달에 감수성일 수 있기 때문에 중요한 발견이다. Chir12.12은 CpG2006 유도 PBMC 증식을 완전히 억제하였음이 밝혀졌다 (그러나, Fc 침묵 mAb 또는 CD40L은 그렇지 않았다). CpG2006은 Toll-유사 수용체 9 (TLR9: 병원체 및 숙주 유래 ssDNA에 결합하는 것으로 입증된 수용체)에 대한 합성 리간드이다. 인간에서, TLR9는 말초 혈액 내에서 B 세포 및 (보다 적은 정도로) 단핵구에 의해 발현된다. CpG 함유 ODN은 ADCC를 향상시키는 것으로 이전에 밝혀졌기 때문에 (Moga, et al. 2008), CpG2006이 모 Chir12.12 mAb의 생식계열 IgG1 Fc 부분에 의해 매개된 ADCC를 향상시킬 수 있다고 추정할 수 있다.
실시예 2: CD40L -매개 PBMC 증식을 차단하는 Fc 침묵 항- CD40 mAb 의 능력의 평가
이전의 데이타는 Chir12.12가 1차 인간 B 세포 및 인간 B 세포 림프종 세포주의 CD40L-매개 증식을 차단할 수 있음을 나타냈다. 본 발명자들은 Chir12.12 및 본 발명에 따른 3가지 항체, 즉 mAb1, mAb2, mAb3에 의한 CD40L-매개 PBMC 증식의 억제를 측정하였다. 아래 표 7은 mg/ml 단위로 표로 작성한 상기 억제에 대한 IC50 값을 제시한다 (결과를 삼중 배양의 평균 + SEM으로서 제시하고, 4명의 공여자를 대표한다 (독립적인 실험)). 결과는 Chir12.12가 CD40L-매개 PBMC 증식을 또한 억제할 수 있음을 입증한다. 추가로, mAb1, mAb2 및 mAb3은 또한 CD40L-매개 PBMC 분열을 Chir12.12와 유사한 효력으로 완전히 차단하였다. 항-CD40 mAb는 그 어느 것도 항-IgM + IL-2 유도된 PBMC 증식을 차단하지 않았고 (데이타를 제시하지 않음), 이것은 항-CD40 mAb의 차단 활성이 표적 의존적임 (그리고 Fc 기능에 관련되지 않음)을 제안한다.
Figure 112013042420145-pct00007
실시예 3: 인간 BJAB 세포주에 대한 항-인간 CD40 항체 변이체의 결합
CD40에 대한 특이적 결합의 변화 가능성을 배제하기 위해, 3가지 변이체 mAb1, mAb2 및 mAb3의 결합을 모 Chir12.12에 비해 B 세포주, 즉 CD40을 구성적으로 발현하는 BJAB에서 시험하였다. 결합을 1:2 희석비로 10 ㎍/mL에서 시작하는 용량-적정으로 시험하였다.
상이한 실험의 곡선을 비교하기 위해, 각각의 개별 용량-적정의 최고 중간 형광 강도를 100% 결합으로 설정하고, 비-선형 곡선 피팅을 적용하였다. 2회의 별개의 실험에서, 4가지의 모든 항체 변이체 Chir12.12, mAb1, mAb2 및 mAb3은 BJAB 세포에 대한 동등한 결합 곡선을 보여주었다 (도 5). 변이체의 결합 능력의 변화는 Chir12.12의 Fc 결합 영역의 상이한 돌연변이에서는 관찰될 수 없었다.
따라서, 상기 결과는 Fc 결합 부위의 돌연변이가 모 Chir12.12의 가변 영역의 CD40 결합 부위에 영향을 미치지 않았음을 입증한다. mAb1, mAb2 및 mAb3은 BJAB 세포 상에서 CD40의 동등한 결합을 보유하였다.
실시예 4: 항- CD40 Fc 변이체에 의한 인간 단핵구 유래 수지상 세포로부터 TNF 알파 방출의 자극/억제
항- CD40 Fc 변이체에 의한 인간 MoDC 로부터 TNF 알파 방출의 자극
일부 항-인간 CD40 항체는 상이한 세포 집단에 대해 효능성 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다 (Gruber 1989). Fc 변이체 mAb1, mAb2, mAb3 및 Chir12.12가 MoDC의 활성화를 일으키는 것을 배제하기 위해, 본 발명자들은 48 h 동안 세포와 함께 인큐베이팅할 때 항체가 단독으로 TNFα 방출을 유도하는지 여부를 조사하였다. 길항성 검정과는 반대로, 7일령 인간 MoDC를 10 ㎍/mL에서 시작하는 용량-반응 곡선에서 4가지의 모든 항-CD40 변이체의 존재 하에서만 48 h 동안 배양하였다. 후속적으로, 상청액을 ELISA에 의해 TNFα의 양에 대해 시험하였다. 모든 항-CD40 변이체 mAb1, mAb2, mAb3 및 Chir12.12는 양성 대조군으로서 CD40L-자극에 비해 MoDC로부터 TNFα의 방출을 유도하지 않았다 (데이타를 제시하지 않음). 용량 의존성이 4가지의 모든 항체 변이체에 의해 관찰될 수 없었다. TNFα의 양은 자극되지 않은 MoDC의 수준을 초과하여 유의하게 상승하지 않았다 (데이타를 제시하지 않음). 따라서, 이들 4가지 항체의 효능제 활성은 배제될 수 있었다.
항- CD40 Fc 변이체에 의한 인간 MoDC 로부터 TNF 알파 방출의 억제
모 Chir12.12 항체는 CD40-CD40L의 상호작용을 차단하고, 따라서 세포 활성화를 또한 차단할 것이다. CD40L 삼량체를 사용한 인간 단핵구-유래 수지상 세포 상의 CD40의 자극은 예를 들어 TNFα와 같은 전-염증성 시토카인의 방출을 일으킨다 (Ma 2009). 다시, Fc 영역 내의 변화는 Chir12.12에 비해 변이체의 차단 기능에 영향을 미치지 않을 것이다. 4가지 모든 항체는 동등한 IC50으로 인간 MoDC로부터 CD40L-매개된 TNFα 방출을 억제할 것이다.
따라서, 7일령 인간 MoDC를 4가지 모든 차단 항-CD40 변이체의 존재 하에 MegaCD40L (이중 삼량체성 재조합 구축물)로 24 h 동안 자극하였다. 후속적으로, 상청액을 ELISA에 의해 TNFα의 양에 대해 시험하였다. 모든 Fc-돌연변이된 변이체 mAb1, mAb2 및 mAb3은 3회의 별개의 실험에서 Chir12.12와 같이 동일한 용량-반응 억제를 보여주었다 (데이타를 제시하지 않음). 예비 결과는 또한 인간 MoDC로부터 IL-23 방출의 유사한 억제를 보여준다 (데이타를 제시하지 않음).
4가지 모든 항체의 IC50을 추정하기 위해 비-선형 곡선 피팅을 적용하였고, 실험으로부터 평균 IC50을 계산하였다. 인간 MoDC로부터 TNFα 방출에 대한 4가지 변이체의 평균 IC50은 32 ng/mL 내지 40 ng/mL이었다 (표 8). 요약하면, Fc 영역 내의 돌연변이는 항체 변이체의 길항성 효과에 영향을 미치지 않았다.
Figure 112013042420145-pct00008
3회의 독립적인 실험으로부터의 상이한 항-인간 CD40 Fc 변이체에 대한 IC50 (ng/mL). Chir12.12에 대한 #1에서 비-곡선 곡선 피팅은 IC50의 유효한 추정치를 허용하지 않았다 (n.c. = 계산되지 않음).
따라서, 상기 결과에 의해 4가지 모든 변이체가 MoDC로부터 TNFα 방출을 유도하는데 비활성이었음이 보여진다. 보다 중요하게, 모든 변이체 mAb1, mAb2 및 mAb3은 Chir12.12에 비해 인간 MoDC에 의한 CD40L-매개 시토카인 생산을 시험관 내에서 유사한 효능으로 억제하였다.
실시예 5: 데이타 요약
다음 표 9는 모 Chir12.12 항체에 비해 본 발명의 항체 mAb1, mAb2 및 mAb3의 중요한 특성의 일부를 요약한다.
Figure 112013042420145-pct00009
실시예 6: 본 발명을 실시하기 위해 유용한 아미노산 및 뉴클레오티드 서열의 간단한 설명
Figure 112013042420145-pct00010
실시예 7: 본 발명을 실시하기 위해 유용한 아미노산 및 뉴클레오티드 서열
Figure 112013042420145-pct00011
Figure 112013042420145-pct00012
Figure 112013042420145-pct00013
Figure 112013042420145-pct00014
Figure 112013042420145-pct00015
Figure 112013042420145-pct00016
실시예 8: 독성학 결과
독성학 연구의 1차 목적은 5주 동안 사이노몰구스 원숭이에 매주 1회 정맥내 투여한 후 mAb1의 독성을 결정하기 위한 것이었다 (6개의 시험 항목 적용). ADCC-활성 항체의 효과를 ADCC-침묵 버전 (mAb1)과 비교하기 위해 상기 항체 (Chir12.12)의 비-침묵 (ADCC) 버전을 또한 사용하였다.
추가로, 두 항-CD40 Ab의 효능을 평가하기 위해 동물을 KLH로 면역화시켰다.
mAb1 또는 Chir12.12를 사용한 치료에 기인한 사망률 또는 체중, 임상 징후 및 추정된 음식 소비의 변화는 없었다. KLH 주사 부위에서 국소 반응은 모든 군에서 대등하였다.
또한, 안과 및 심혈관 조사에서 시험 항목-관련 발견은 없었다.
혈액학에서, 호염기구의 백분율 및 절대 수의 근소하지만 통계상 유의한 감소가 mAb1- 및 Chir12.12-치료 동물에서 관찰되었고: 시험 항목-치료에 대한 관련은 배제될 수 없었다. 뇨 분석으로 1/5 mAb1-치료 암컷 및 2/5 Chir12.12-치료 암컷의 뇨 내의 케톤을 밝혔고, 여기서 투여에 대한 관련성은 불명료하였다. 임상 화학에서, Chir12.12-치료 수컷 및 Chir12.12로 치료한 1마리의 암컷에 대해 상승한 리파제 농도에 대한 약간의 경향이 관찰되었지만, 이것은 제한된 독성학적 관련성인 것으로 간주되었다.
혈액 응고는 프로트롬빈 시간, 활성화된 부분 프로트롬빈 시간, 및 피브리노겐에 의해 평가할 때 mAb1 또는 Chir12.12를 사용한 치료에 의해 영향을 받지 않았다. 혈소판 계수는 정상 범위 내에 나타났다. 혈장 내의 P-셀렉틴 또는 sCD40L 농도는 혈소판 활성화를 나타내지 않았다.
Chir12.12-치료 동물에서, 혈액 면역표현형 결정은 CD20+ B-세포의 현저한 감소를 보여주었고, 이것은 상기 항체의 예상된 약리학적 작용이었다. 특히, CD20lowCD21+ B-세포 (CD40high인 것으로 간주됨)는 Chir12.12에 의해 고갈되었다. 그러나, 또한 CD20highCD21- B-세포는 특히 연구의 끝을 향하여 실질적으로 감소되었다. 우선적으로, CD20+CD21+CD27- 나이브 B-세포는 ADCC-활성 항체 Chir12.12에 의해 고갈된 반면, CD20+CD21+CD27+ 기억 B-세포는 거의 영향을 받지 않았다. 또한 Chir12.12-치료 동물에서 CD16+ NK-세포의 절대 수의 50%의 근사치 감소가 있었다. 예상되는 바와 같이, mAb1 (ADCC-침묵)로 치료한 후에, CD20+ B-세포의 현저한 감소는 관찰되지 않았고, CD16+ NK-세포의 절대 수의 임의의 감소도 없었다. 투여 동안 중등도 감소를 보여주는 유일한 B-세포는 CD20high CD21- B-세포였다. 이들 세포는 마카크 원숭이 (macaque) 특이적이고 배 중심 (germinal center) 기원인 것으로 알려져 있고, 따라서 상기 발견은 인간에의 전이에 관련된 것으로 간주되지 않는다.
부검시에 비장 및 KLH 배수 림프절의 면역표현형 결정은 유사한 상황을 밝혔다. Chir12.12-치료 동물에서 CD20+ B-세포의 상대 수가 감소하였지만, CD20+ B-세포의 관련 감소는 mAb1-치료 동물에 대해 관찰되지 않았고, 여기서 CD21- B-세포의 약간 내지 중등도 감소가 있었다 (림프절은 두 성별 모두에서, 비장은 수컷에서만). KLH 주사 부위에 배수하는 우측 및 좌측 림프절에 대한 면역표현형 결정의 결과는 차이가 없었다.
T-세포 의존 항체 반응 (TDAR)은 대조군에 비해, KLH에 대한 IgG 및 IgM 반응이 mAb1- 또는 Chir12.12-치료 동물에서 관찰되지 않았음을 보여주었다. CD40-CD40 리간드 상호작용을 차단함으로써 B-세포 활성화를 차단하는 것은 mAb1의 의도된 약리학적 작용이므로 및 Chir12.12는 B-세포를 고갈시키는 것으로 의도되므로, 상기 발견은 독성학적 관련성인 것으로 간주되지 않는다.
독성역학적 평가는 최저 농도가 연구의 과정 동안 증가하였음을 밝혔고, 이것은 mAb1 및 Chir12.12의 축적을 나타낸다. 제4 및 제5 용량 후에 평균 최저 농도는 유사하였고, 이것은 mAb1 및 Chir12.12에 대한 제5 용량 후에 항정 상태에 근접한 상태를 나타낸다. 제4 및 제5 용량 후에 투여 간격에 걸쳐 평균 노출 (두 성별 모두) (AUCτ)은 mAb1에 대해 각각 906 및 990 h.mg/mL, 및 Chir12.12에 대해 각각 757 및 751 h.mg/mL이었다. AUCτ 값은 또한 제5 용량 후에 항정 상태에 근접한 상태를 표시하였다.
육안 검사는 표적 장기 독성의 임의의 증거를 보여주지 않았고, 장기 중량또 또한 상기 종에 대한 정상 범위 내에 있었다.
현미경에 의해, 두 항체의 시험 항목-관련 발견이 모든 림프계 장기 (비장 및 림프절 (장간막, 하악, 액와, 및 서혜부))에서 보였고, 여기서 mAb1 및 Chir12.12는 피질 B-세포 영역에서 배 중심 발달의 완전 억제를 일으켰다. 비장 및 KLH 배수 및 반대쪽 림프절 조직의 CD20 면역염색은 비장 내의 림프 여포의 감소된 크기, 및 비장 및 림프절에서 B-세포 고갈을 보여주었고, 이 효과는 mAb1을 사용한 치료에 비해 Chir12.12-치료 동물에서 훨씬 더 확연하였다. mAb1-치료 동물에서 배 중심 발견은 면역표현형 결정에서 보이는 CD21- B-세포의 감소에 상응한다. CD40 면역염색은 mAb1 또는 Chir12.12를 사용한 치료 후에 림프절 및 비장에서 CD40의 염색의 유의한 감소를 보여주었다.
결론적으로, 본 연구의 결과에 기초하여, 수컷 및 암컷 사이노몰구스 원숭이에 대한 100 mg/kg의 농도로 5주 동안 mAb1 또는 Chir12.12의 매주 1회 정맥내 투여 (6회 투여)는 잘 견뎌졌다. 면역표현형 결정은 Chir12.12-처리 동물에서 B-세포의 고갈을 보여주지만 CD21- B-세포를 제외하고는 mAb1-치료 동물에서는 그렇지 않았지만, TDAR은 mAb1- 및 Chir12.12-치료 동물 모두에서 KLH 면역화 후에 IgG 및 IgM 반응의 부재를 보여주었다. 조직병리학은 mAb1- 및 Chir12.12-치료 동물로부터의 비장 및 림프절에서 배 중심의 결여를 밝혔다. B-세포에 대한 효과는 목적하는 약물학적 작용이고, 따라서 유해한 것으로 간주되지 않는다. 관찰가능한-유해-효과가 없는 수준 (NOAEL)은 본 연구의 조건 하에 mAb1 및 Chir12.12 둘 모두에 대해 100 mg/kg의 용량인 것으로 여겨졌다.
실시예 9: mAb1 의 추가의 시험관내 프로파일링
인간, 붉은털 원숭이 및 사이노몰구스 백혈구 사이에서 mAb1의 결합 및 기능적 교차-반응성을 결정하였다. 표 10은 3가지 모든 종에서 mAb1에 대한 결합 EC50의 직접적인 비교를 보여준다.
Figure 112013042420145-pct00017
mAb1은 3가지 모든 종의 CD20+ 세포 (B 세포)에 대등한 EC50으로 결합한다. 추가로, mAb1은 인간 편도선 B 세포, 및 사이노몰구스 및 붉은털 원숭이로부터의 PBMC의 CD154+IL-4 유도된 증식을 억제할 수 있었다. 종합적으로, 이들 결과는 CD40에 결합하고 인간 B 세포 또는 비-인간 영장류 PBMC의 CD154-유도된 증식을 억제하는 mAb1의 능력이 매우 유사함을 나타냈다. 시험관내 수용체 점유 (RO) 데이타 및 기능적 억제의 이용가능성은 이들 2가지 변수 사이의 관계가 각각의 종에 대해 결정될 수 있게 하였다 (표 11).
Figure 112013042420145-pct00018
결과는 인간 B 세포에 비해 PBMC 증식을 50% 억제하기 위해 mAb1 붉은털 원숭이 PBMC에 의해 대략 2배 더 적은 RO가 요구됨을 나타낸다. 인간에서, 완전 억제는 약 75% (생체내 예측된) RO에서 얻을 수 있었다.
실시예 10: 이식 연구
이식편 생존
동종이식편 신장 이식 동안 mAb1 (30 mg/kg i.v.) 및 시클로스포린 A (20 mg/kg 경구)를 사용한 조합 치료는 연구에 참여한 6마리 동물의 생존을 유의하게 연장시켰다. 이식은 동물 #5529, #5533, #5523, #5524, #5536 및 #5538에서 각각 >91*, 31, >92*, >92*, >98* 및 >98*일 (평균: >83.6일) 동안 기능적이었다 (* 프로토콜의 끝). 비치료 동물 (또는 치료 용량 미만의 용량으로 치료한 동물)의 생존은 7-10일이었다 (기왕 데이타).
동물 #5533은 급성 신부전증 및 무뇨증 때문에 이식 31일 후에 안락사시켰다. 상기 병리학은 지속 고혈압 기간 후에 나타났고, 생검 수집을 위해 마취하였다.
이식 후 모니터링
(a) 크레아티닌 ( SCrea ) 및 요소 ( SUrea ) 혈청 농도
SCrea는 신장 기능의 평가를 위해 사용되는 주요 파라미터이다. 6마리의 모든 동물에서, SCrea 수준은 이식 1일 후에 기준선 수준을 초과하여 증가하였다 (81.8±14.6에서 221.5±37.1 μmol/l로). 상기 SCrea의 증가는 이식 후 제1주 동안 공통적인 특징이다 (표 12).
Figure 112013042420145-pct00019
제1주 동안, SUrea 농도는 제0일에 측정한 기준선 (4.5±1.3 mmol/l)을 초과하여 급속한 증가를 경험하였다 (표 13). 동물 #5529/#5533 및 #5536/#5538에서 SUrea 수준은 16-20 mmol/l (제3-5일)인 한편, 동물 #5523 및 #5524에서 각각 9 또는 8 mmol/l (제7일)이었다.
Figure 112013042420145-pct00020
이식 1주 후에, 신장 기능은 표준화하는 경향이 있고, SCrea/Surea는 기준선 수준에 보다 가까워졌다. 그러나, 동물 #5533, #5523 및 #5524는 이식후 제7일 내지 제19-25일에 SCrea/SUrea의 추가의 증가를 나타냈고 (그러나, 동물 #5529, #5536 및 #5538은 그렇지 않았다), 이것은 신장 기능부전을 나타낸다. 상기 기간 동안, 다음다갈증/다뇨증 (#5523 및 #5524), 높은 지속 혈청 칼슘 (SCa) (#5533) 또는 이식편 부피의 증가 (#5523 및 #5524)와 같은 징후가 관찰될 수 있었다.
제20-25일 후에, 동물 #5529, #5523, #5524, #5536 및 #5538은 개선되었고, 연구의 끝까지 뛰어난 신장 기능을 보였다. 그러나, 제31일에, 동물 #5533은 SCrea/SUrea 수준의 확연한 증가를 보였고, 이것은 급성 신부전증 (SCrea; 629 μmol/l 및 SUrea; 18 mmol/l)을 확인한다. 상기 병리학은 지속 고혈압 기간 후에 일어났고, 안락사 1일 전에 생검 절차를 수행하였다. 상기 기간 동안, 고혈압 피크 (~170 mmgHg 수축기) 및 저혈압 에피소드 (~40 mmgHg 수축기)가 기록되었다.
(b) 혈청 아밀라제, 리파제 농도, 체중 및 혈소판 계수
혈청 아밀라제 농도는 이식 후 제1-7일에 약 1.3배로 모든 동물에서 약간 증가하였다 (제0일에 311±53 U/L 및 이식 후 제7일에 418±66.8 U/L) (표 14). 동물 #5533은 이식 후 제1일에 연구에서 관찰된 최고 아밀라제 농도를 나타냈다 (1050 U/L). 이식 전에, 제1 mAb1 용량 전 및 24시간 후의 아밀라제 수준 사이에 차이가 없었다 (제 -1일 및 제0일).
Figure 112013042420145-pct00021
리파제 혈청 농도는 평균으로 이식 전 및 이식 후에 적은 변화를 경험하였다 (표 15). 실험 프로토콜의 끝에서만, 적은 증가를 볼 수 있다 (제84일; 2.18배). 동물 #5533은 제1일에 측정한 최고 리파제 농도를 보였다 (284.4 U/L). 동물 #5536 및 #5538로부터 리파제 데이타는 이용가능하지 않았다. 아밀라제 및 리파제 농도의 변화는 상이한 항체 또는 저분자량 화합물을 사용하는 다른 이식-실험에서 발견된 수준과 유사하였다 (데이타를 제시하지 않음).
Figure 112013042420145-pct00022
급속하고 뚜렷한 체중 감소가 동물 #5529, #5533 및 #5536에서 주로 관찰될 수 있었다. 6마리의 모든 이식한 동물에서, 이식 후 처음 21일 동안 -4 내지 -18%이었다. 그러나, 체중 감소는 그 시점 후에 및 연구의 끝을 향하여 회복하는 경향이 있었다.
혈소판 계수는 이식후 기간 동안 정상 (300-400 세포 x 103/㎕)이거나 증가하였다 (600-800 세포 x 103/㎕). 동물 #5529는 혈소판 계수의 급속한 증가 때문에 3일 (제7-9일) 동안 아스피린 치료를 받았다. 동물 #5533은 장기간 혈소판증가증 (>1000 세포 x 103/㎕)을 나타냈고, 제7-26일에 아스피린 치료를 받았다.
(c) mAb1 혈액 수준 및 B-세포 계수
참조 PK/PD 연구 및 분석은 이전에 수행되었고, 여기서 사이노몰구스 원숭이에게 10 mg/kg에서 단일 정맥내 용량의 항체를 제공하였다 (데이타를 제시하지 않음). 본 연구에서, 농도 대 시간 프로파일은 명백한 표적 매개된 소인 (TMD)을 보여주었고, 여기서 1마리의 동물은 아마도 보다 높은 표적 발현 수준의 결과로서 또 다른 동물에 비해 보다 신속한 청소율을 보이고, 이것은 PK를 지배하는데 있어서 표적 발현 수준의 역할을 강조한다. 상기 연구로부터, mAb1 혈청 농도가 약 5 ㎍/mL를 초과할 때, 이것은 거의 100% CD40 수용체 점유로 번역되는 것으로 또한 확립되었다.
이식 연구의 설계 (매주 및 높은 mAb1 용량 수준 - 30 mg/kg, 및 회복/휴약기 없음)는 이전에 수행된 PK/PD 연구와 동일한 수준의 분석 및 모델링을 허용하지 않았다. 그럼에도 불구하고, 다음 관찰이 이루어졌다 (표 16에 요약함); i) mAb1은 제1 용량 전에 수집된 샘플 내에서 관찰되지 않았음, ii) mAb1은 모든 용량 투여기에 걸쳐 검출되었음, iii) 수집한 모든 샘플 및 개체간 최저 농도는 가변적이었음 (사이노몰구스 5524에 대해 1200 - 2500 ㎍/mL, 사이노몰구스 5523에 대해 1000 - 2000 ㎍/mL, 사이노몰구스 5529에 대해 850 - 2400 ㎍/mL). 모든 노출 값은 사이노몰구스 원숭이에서 완전 수용체 점유를 얻기 위해 필요한 농도를 훨씬 초과하였다 (170 내지 500배).
Figure 112013042420145-pct00023
면역원성 시험 (원숭이 항-mAb1 항체)을 본 연구에서 또한 평가하였다. 모든 샘플은 음성이었지만, 상기 샘플에서 높은 mAb1 수준은 약물 간섭 때문에 그들의 검출을 잠재적으로 방해할 수 있다.
CD20+ 세포의 부분적 고갈이 모든 처리 동물에서 시간이 지남에 따라 관찰될 수 있었다. 유사한 관찰이 이전에 수행된 PK/PD 연구에서 보였다 (데이타를 제시하지 않음).
조직학 결과
신장 동종이식편의 조직병리학적 평가는 이식편 #5523, #5524, #5529 및 #5538에서 급성 및 만성 거부가 없음과 실험의 끝에 도달한 이식편 #5536에서 경계선 변화를 밝혀주었다 (결과를 표 17에 요약한다). 동물 #5523, #5524 및 #5538에서 최소 혈관주위 또는 간질성 침윤, 및 동물 #5529에서 최소 사구체 세포과다가 관찰되었다.
Figure 112013042420145-pct00024
이식 후 제31일에 안락사시킨 동물 #5533은 요세관 확장, 간질성 침윤 및 섬유증을 보였지만, 단지 최소 요세관염을 보였다. 추가로, 요관 부근에 주요 호산구 침윤 및 문합 다음의 농양이 발견되었다. 이들 모든 발견은 다년간의 불량한 신장 기능이 확인될 수 있지만 거부는 확인될 수 없음을 나타냈다.
C4d 면역염색은 모든 경우에 음성이었다.
여포 위축이 있는 또는 없는 배 중심 발달의 결여가 모든 동물에서 림프 기관 내에서 관찰되었다. 발란티듐 콜라이 감염에 의해 유발된 맹장결장염이 동물 #5529 및 #5533에서 진단되었다.
다른 치료 관련 변화는 접해지지 않았다.
이식 연구 - 논의
이식 연구의 목적은 신장 동종이식편 거부의 비-인간 영장류 모델에서 치료 용량 미만의 용량의 시클로스포린 A와 조합 요법으로서 제공될 때 mAb1의 유익한 효과를 평가하기 위한 것이었다. 추가로, 전신 염증이 유도되는 모델에서 부작용의 부재를 평가하는 것에 관련되었다.
치료 용량 미만 용량의 CsA (20 mg/kg p.o.)와 조합 요법으로서 적용될 때, mAb1는 NHP에서 신장 동종이식편의 생존을 증가시키는데 효능을 나타냈다. 평균 이식편 생존은 >83.6일이고, 6마리 동물 중 5마리가 실험 프로토콜의 끝에 도달하였다 (91-98일에 확립됨).
비-효능제 차단 항-CD40 항체 (mAb1)를 사용하여 CD40을 표적화하면 신장 또는 섬 이식된 NHP에서 이식편 생존을 연장시킨다. 추가로, 본 발명자들은 이전에 보고된 Chir12.12 (B 세포 고갈 및 동시-자극 차단 특성을 갖는 IgG1/카파 이소형의 완전 인간 모노클로날 항-CD40 항체)에 비해 mAb1 (Fc-침묵)을 사용함으로써 보다 우수한 효능 및 안전성을 평가할 수 있었다.
전체 이식 후 기간 동안, 임의의 관련 임상 병리학 사건이 부재하였다 (예를 들어, 이식 후에 전형적인 손상된 신장 기능에 기인하는 아밀라제/리파제 수준에서 적은 증가). 그러나, 동물 #5333, #5523 및 #5524는 제7-19일에 감소한 신장 기능을 나타냈다. 상기 시간 기간은 일반적으로 이식 후 동물에서 SCrea/Surea 수준, 혈압 및 이식편 부피의 회복을 특징으로 한다. 이들 동물에서, 손상된 신장 기능의 징후, 예컨대 증가한 SCrea/SUrea (3마리의 모든 동물), 이식편 부피의 일시적 증가 (#5523, #5524) 또는 다음다갈증/다뇨증 (#5523, #5524)이 보였다. 하나의 가설은 이들 동물이 조기 거부 과정을 발현하였고, 이것은 mAb1 치료의 3주 후에 제어되었다는 것일 수 있다. 조기 이식 후기에 상기 이상은 CD40 경로를 표적으로 하는 분자 (Fc-침묵)의 면역학적 작용 방식에 의해 유도된 차이 때문일 수 있다.
1마리의 동물 (#5533)을 급성 신부전증 때문에 제31일에 안락사시켰다 (거부가 아님). 상기 결과는 이식 수술 후에 신장 기능의 불완전한 회복에 의해 유발되었다. 불량한 신장 기능을 나타내는 징후는 높은 SUrea 수준 (11-19 mmol/l) 또는 지속 높은 SCa 농도 (>2.8 mmol/l)이었다. 말기 이식편 손실은 생검 수집 절차 동안 적용된 마취 동안 관찰된 저혈압과 조합된 지속 고혈압 (>140 mmHg 수축기) 및 안락사 전날 밤에 나타난 높은 고혈압 피크 (~170 mmHg 수축기)에 의해 가속화되었다 (Palmer BF (2002) N. Engl. J. Med; 347(16): 1256-1261). 이들 모든 사건은 mAb1 치료에 기인하지 않을 수 있고, 단지 이식 후기에 개별 차이에 기인할 수 있다.
조합 요법의 높은 효능은 또한 조직학적으로 입증될 수 있다. 6개의 이식편 중 5개가 실험의 끝에 뛰어난 이식편 품질을 보였다. Chir12.12를 사용하는 이식 실험에서 배 중심 발달의 결여가 또한 관찰되었다. 다른 치료 관련 조직 변화는 관찰되지 않았다.
장기간 생존자 중 1마리 (#5529)는 발란티듐 콜라이에 의해 유발된 맹장결장염을 발병하였다. 감염은 마카크 원숭이에서 흔하고 종종 무증상이지만, 면역억제는 급성 질환의 발병을 일으킬 수 있다 (Schuster FL, Ramirez-Avila L, (2008) Clin. Microbiol. Rev; 21(4): 626-38). 상기 동물에서, 임상 징후, 예컨대 설사 또는 체중 감소는 관찰되지 않았다.
B-세포 계수 모니터링에 관하여, 모든 처리 동물에서 시간이 지남에 따라 부분적 고갈이 관찰될 수 있었다. 상기 부분적 고갈은 아마도 활성 Fc-수용체 매개된 고갈 때문이 아니고, 이것은 mAb1이 FcR에 결합하지 않고 시험관내 ADCC를 매개하지 않는 침묵화된 항체이기 때문이다. 부분적 고갈은 실험의 끝에서 조직학에서 관찰되는, 배 중심의 결여의 거울일 수 있다. 상기 부분적 고갈은 생존 신호의 결여로 인한 것일 수 있다.
결론적으로, 이식 연구의 결과는 뛰어난 안전성 프로파일을 갖는, 조합 요법으로 신장 거부의 치료를 위한 유효한 표적으로서 mAb1 (및 더 나아가, 본 발명의 다른 항체 및 단백질)의 용도를 제안한다. 뛰어난 안전성 프로파일 및 효능은 자가면역 장애 및/또는 염증성 장애의 치료, 및 CD40 항원을 발현하는 세포에 대한 CD40L-매개 CD40 신호전달에 의해 매개된 이식 거부의 예방에서 본 발명의 항체의 용도를 추가로 지지한다.
개요
항-CD40 항체가 환자에서 울혈 사건을 유도하는 것으로 보고되지 않았지만, 항-CD40 Ab Chir12.12를 투여받는 B 세포 림프종 환자에서 췌장 효소의 상승 및 췌장염의 가능한 위험은 안전성 이유로 인해 만성 자가면역 질환 및 이식에서 상기 Fc-적격 (competent) 항-CD40 항체의 사용을 불가능하게 한다. 따라서, 본 발명자들은 시험관 내에서 및 생체 내에서 모두 항체-의존 세포성 세포독성 (ADCC) 또는 보체-의존 세포독성 (CDC)을 매개할 수 없는 Fc-침묵 IgG1 항-CD40 항체 (mAb1, mAb2, 및 mAb3)을 생성하였다. mAb1은 치료 용량 미만 용량의 시클로스포린과 조합으로 비-인간 영장류 신장 동종이식편 생존을 연장할 수 있었다. 추가로, mAb1은 T 세포-의존성 항원을 사용한 면역화에 대한 1차 및 2차 항체 반응을 완전히 억제할 수 있었다. 결정적으로, 이식 또는 면역화 연구에서 울혈 사건 또는 비정상적인 췌장 조직학의 증거는 없었다. 종합적으로, 이들 결과는 mAb1이 안전하고 효능있는 치료제일 것이고, B 림프구 및 항원 제시 세포 주도된 자가면역 질환에 걸리거나 또는 CD40-CD154 상호작용이 병리학에 기여하는 것에 관여되는 동종이식편 이식을 받은 환자를 치료하기 위해 사용될 수 있음을 제안한다.
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ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca 1380 agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg 1440 tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc 1500 tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg tgggacccgt ggggtgcgag 1560 ggccacatgg acagaggccg gctcggccca ccctctgccc tgagagtgac cgctgtacca 1620 acctctgtcc ctacagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1680 gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1740 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1800 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctatagca agctcaccgt ggacaagagc 1860 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1920 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaa 1956 <210> 21 <211> 657 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 gatattgtga tgactcagtc tccactctcc ctgaccgtca cccctggaga gccggcctcc 60 atctcctgca ggtccagtca gagcctcctg tatagtaatg gatacaacta tttggattgg 120 tacctgcaga agccagggca gtctccacag gtcctgatct ctttgggttc taatcgggcc 180 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accaagagct tcaacagggg cgagtgc 657 <210> 24 <211> 1350 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 24 caggtgcagc tggtggaatc tggcggcgga gtggtgcagc ctggccggtc cctgagactg 60 tcttgcgccg cctccggctt caccttctcc agctacggca tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggcaagg gactggaatg ggtggccgtg atctcctacg aggaatccaa cagataccac 180 gctgactccg tgaagggccg gttcacaatc tcccgggaca actccaagat caccctgtac 240 ctgcagatga actccctgcg gaccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagggacgga 300 ggaatcgccg ctcctggacc tgattattgg ggccagggca ccctggtgac agtgtcctcc 360 gctagcacca agggcccctc cgtgttccct ctggccccct ccagcaagtc cacctctggc 420 ggcaccgccg ctctgggctg cctggtgaaa gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc 480 tggaactctg gcgccctgac ctccggcgtg cacacctttc cagccgtgct gcagtcctcc 540 ggcctgtact ccctgtcctc cgtggtgacc gtgccctcta gctctctggg cacccagacc 600 tacatctgca acgtgaacca caagccctcc aacaccaagg tggacaagcg ggtggaaccc 660 aagtcctgcg acaagaccca cacctgtccc ccctgccctg cccctgaact gctgggcgga 720 ccttccgtgt tcctgttccc cccaaagccc aaggacaccc tgatgatctc ccggaccccc 780 gaagtgacct gcgtggtggt ggccgtgtcc cacgaggacc ctgaagtgaa gttcaattgg 840 tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc aagaccaagc ccagagagga acagtacaac 900 tccacctacc gggtggtgtc tgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa 960 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaggcc ctgcctgccc ccatcgaaaa gaccatctcc 1020 aaggccaagg gccagccccg cgagccacag gtgtacacac tgccccccag ccgggaagag 1080 atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgt ctggtcaaag gcttctaccc ctccgatatc 1140 gccgtggagt gggagtccaa cggacagccc gagaacaact acaagaccac cccccctgtg 1200 ctggactccg acggctcatt cttcctgtac tccaagctga ccgtggacaa gtcccggtgg 1260 cagcagggca acgtgttctc ctgctccgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 1320 cagaagtccc tgtccctgag ccccggcaag 1350 <210> 25 <211> 657 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 gacatcgtga tgacccagtc ccccctgtcc ctgaccgtga cacctggcga gcctgcctct 60 atctcctgca gatcctccca gtccctgctg tactccaacg gctacaacta cctggactgg 120 tatctgcaga agcccggcca gtccccacag gtgctgatct ccctgggctc caacagagcc 180 tctggcgtgc ccgaccggtt ctccggctct ggctctggca ccgacttcac actgaagatc 240 tcacgggtgg aagccgagga cgtgggcgtg tactactgca tgcaggcccg gcagaccccc 300 ttcaccttcg gccctggcac caaggtggac atccggcgta cggtggccgc tcccagcgtg 360 ttcatcttcc cccccagcga cgagcagctg aagagcggca ccgccagcgt ggtgtgcctg 420 ctgaacaact tctacccccg ggaggccaag gtgcagtgga aggtggacaa cgccctgcag 480 agcggcaaca gccaggagag cgtcaccgag caggacagca aggactccac ctacagcctg 540 agcagcaccc tgaccctgag caaggccgac tacgagaagc ataaggtgta cgcctgcgag 600 gtgacccacc agggcctgtc cagccccgtg accaagagct tcaacagggg cgagtgc 657 <210> 26 <211> 1350 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 26 caggtgcagc tggtggaatc tggcggcgga gtggtgcagc ctggccggtc cctgagactg 60 tcttgcgccg cctccggctt caccttctcc agctacggca tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggcaagg gactggaatg ggtggccgtg atctcctacg aggaatccaa cagataccac 180 gctgactccg tgaagggccg gttcacaatc tcccgggaca actccaagat caccctgtac 240 ctgcagatga actccctgcg gaccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagggacgga 300 ggaatcgccg ctcctggacc tgattattgg ggccagggca ccctggtgac agtgtcctcc 360 gctagcacca agggcccctc cgtgttccct ctggcccctt ccagcaagtc tacctccggc 420 ggcacagctg ctctgggctg cctggtcaag gactacttcc ctgagcctgt gacagtgtcc 480 tggaactctg gcgccctgac ctctggcgtg cacaccttcc ctgccgtgct gcagtcctcc 540 ggcctgtact ccctgtcctc cgtggtcaca gtgccttcaa gcagcctggg cacccagacc 600 tatatctgca acgtgaacca caagccttcc aacaccaagg tggacaagcg ggtggagcct 660 aagtcctgcg acaagaccca cacctgtcct ccctgccctg ctcctgaagc tgctggcggc 720 ccttctgtgt tcctgttccc tccaaagccc aaggacaccc tgatgatctc ccggacccct 780 gaagtgacct gcgtggtggt ggacgtgtcc cacgaggatc ctgaagtgaa gttcaattgg 840 tacgtggacg gcgtggaggt gcacaacgcc aagaccaagc ctcgggagga acagtacaac 900 tccacctacc gggtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa 960 gagtacaagt gcaaagtctc caacaaggcc ctgcctgccc ctatcgaaaa gacaatctcc 1020 aaggccaagg gccagcctag ggaaccccag gtgtacaccc tgccacccag ccgggaggaa 1080 atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgt ctggtcaagg gcttctaccc ttccgatatc 1140 gccgtggagt gggagtctaa cggccagcct gagaacaact acaagaccac ccctcctgtg 1200 ctggactccg acggctcctt cttcctgtac tccaaactga ccgtggacaa gtcccggtgg 1260 cagcagggca acgtgttctc ctgctccgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 1320 cagaagtccc tgtccctgtc tcccggcaag 1350 <210> 27 <211> 657 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 gacatcgtga tgacccagtc ccccctgtcc ctgaccgtga cacctggcga gcctgcctct 60 atctcctgca gatcctccca gtccctgctg tactccaacg gctacaacta cctggactgg 120 tatctgcaga agcccggcca gtccccacag gtgctgatct ccctgggctc caacagagcc 180 tctggcgtgc ccgaccggtt ctccggctct ggctctggca ccgacttcac actgaagatc 240 tcacgggtgg aagccgagga cgtgggcgtg tactactgca tgcaggcccg gcagaccccc 300 ttcaccttcg gccctggcac caaggtggac atccggcgta cggtggccgc tcccagcgtg 360 ttcatcttcc cccccagcga cgagcagctg aagagcggca ccgccagcgt ggtgtgcctg 420 ctgaacaact tctacccccg ggaggccaag gtgcagtgga aggtggacaa cgccctgcag 480 agcggcaaca gccaggagag cgtcaccgag caggacagca aggactccac ctacagcctg 540 agcagcaccc tgaccctgag caaggccgac tacgagaagc ataaggtgta cgcctgcgag 600 gtgacccacc agggcctgtc cagccccgtg accaagagct tcaacagggg cgagtgc 657 <210> 28 <211> 277 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr 1 5 10 15 Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu 20 25 30 Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val 35 40 45 Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu 50 55 60 Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His 65 70 75 80 Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr 85 90 95 Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr 100 105 110 Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly 115 120 125 Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu 130 135 140 Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys 145 150 155 160 Cys His Pro Trp Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln 165 170 175 Ala Gly Thr Asn Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Leu 180 185 190 Arg Ala Leu Val Val Ile Pro Ile Ile Phe Gly Ile Leu Phe Ala Ile 195 200 205 Leu Leu Val Leu Val Phe Ile Lys Lys Val Ala Lys Lys Pro Thr Asn 210 215 220 Lys Ala Pro His Pro Lys Gln Glu Pro Gln Glu Ile Asn Phe Pro Asp 225 230 235 240 Asp Leu Pro Gly Ser Asn Thr Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu His 245 250 255 Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile Ser 260 265 270 Val Gln Glu Arg Gln 275

Claims (19)

  1. a) CD40 폴리펩티드에 10 nM 이하의 KD로 결합하고,
    b) 서열 17 또는 서열 18에 따른 침묵 IgG1 Fc 영역을 포함하는 것
    을 특징으로 하며, 서열 4의 L-CDR1, 서열 5의 L-CDR2 및 서열 6의 L-CDR3를 포함하는 경쇄 가변 영역과 서열 1의 H-CDR1, 서열 2의 H-CDR2 및 서열 3의 H-CDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 표적 CD40 폴리펩티드 (서열 28)에 대해 작용하는 항체의 항원-결합부를 포함하는 단리된 항체 또는 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 단백질이 50 ng/ml 이하의 IC50으로 CD40L 유도 신호전달을 억제하는 것인 단리된 항체 또는 단백질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체 또는 단백질이 CD40 신호전달에 관하여 효능제 활성을 갖지 않는 것인 단리된 항체 또는 단백질.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열 7의 중쇄 가변 영역 (VH) 및 서열 8의 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 단리된 항체 또는 단백질.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    a. 서열 11의 중쇄 아미노산 서열 및 서열 12의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 mAb1 항체, 및
    b. 서열 13의 중쇄 아미노산 서열 및 서열 14의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 mAb2 항체
    로 이루어지는 군 중에서 선택되는 단리된 항체 또는 단백질.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 의약으로서 사용하기 위한 단리된 항체 또는 단백질.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 자가면역 장애 및/또는 염증성 장애의 치료에 사용하기 위한 단리된 항체 또는 단백질.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 이식시에 이식편 거부의 위험을 예방하거나 감소시키는 데 사용하기 위한 단리된 항체 또는 단백질.
  9. 제6항에 있어서, 다발 경화증, 전신 홍반성 루푸스, 쇼그렌 증후군, 류마티스성 관절염, 이식 거부 및 이식편 대 숙주 질환의 치료에 사용하기 위한 단리된 항체 또는 단백질.
  10. 제1항 또는 제2항에 따른 항체 또는 단백질을 적어도 제약상 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체와 조합하여 포함하는, 자가면역 장애 및/또는 염증성 장애의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물.
  11. 제1항 또는 제2항에 따른 항체 또는 단백질을 적어도 완충제와 함께 포함하는, 자가면역 장애 및/또는 염증성 장애의 치료에 사용하기 위한 액체 제약 제제.
  12. 제1항 또는 제2항에 따른 항체 또는 단백질을 코딩하는 단리된 핵산.
  13. 제12항에 따른 하나 이상의 핵산을 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터.
  14. 제13항에 있어서, 적합한 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된 다음 코딩 서열 (a)-(b) 중의 적어도 하나를 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터:
    (a) 서열 22 및 서열 23; 또는
    (b) 서열 24 및 서열 25.
  15. 제13항에 따른 하나 이상의 클로닝 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  16. 제14항에 따른 하나 이상의 클로닝 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  17. 제1항 또는 제2항에 따른 항체 또는 단백질을 코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 하나 이상의 클로닝 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하고, 상기 항체 또는 단백질을 정제하고 회수하는 것을 포함하는, 상기 항체 또는 단백질의 생산 방법.
  18. 삭제
  19. 삭제
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Families Citing this family (84)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2618292T3 (es) 2008-01-31 2017-06-21 Inserm - Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale Anticuerpos contra CD39 humano y uso de los mismos para inhibir la actividad de las células T reguladoras
AR083847A1 (es) 2010-11-15 2013-03-27 Novartis Ag Variantes de fc (fragmento constante) silenciosas de los anticuerpos anti-cd40
EP2676677B1 (en) * 2011-02-17 2019-05-22 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Highly concentrated anti-cd40 antibody pharmaceutical preparation
CA3122934A1 (en) 2011-03-11 2012-09-20 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Fusion protein comprising a fragment of cd40 and method of producing same
CN106977604A (zh) 2011-04-21 2017-07-25 百时美施贵宝公司 拮抗cd40之抗体多肽
MX339239B (es) 2011-04-29 2016-05-18 Apexigen Inc Anticuerpos anti-cd40 y metodos de uso.
JP6163158B2 (ja) 2011-10-13 2017-07-12 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｃｄ４０ｌに拮抗する抗体ポリペプチド
US20140004131A1 (en) * 2012-05-04 2014-01-02 Novartis Ag Antibody formulation
CN104918957B (zh) 2012-10-30 2018-11-16 埃派斯进有限公司 抗-cd40抗体及其使用方法
MA38396B1 (fr) 2013-03-15 2019-05-31 Novartis Ag Anticorps medicamenteux conjugues et leurs compositions pharmaceutiques pour traiter un cancer positif a ckit
WO2015134988A1 (en) 2014-03-07 2015-09-11 Bristol-Myers Squibb Company Method of using antibody polypeptides that antagonize cd40 to treat ibd
WO2016020791A1 (en) 2014-08-05 2016-02-11 Novartis Ag Ckit antibody drug conjugates
WO2016024195A1 (en) 2014-08-12 2016-02-18 Novartis Ag Anti-cdh6 antibody drug conjugates
EP3736294A3 (en) 2014-10-10 2021-02-17 Innate Pharma Cd73 blockade
KR102656470B1 (ko) 2014-12-10 2024-04-09 리전츠 오브 더 유니버스티 오브 미네소타 질환을 치료하기 위한 유전적으로 변형된 세포, 조직 및 장기
GB201501613D0 (en) * 2015-01-30 2015-03-18 Ucb Biopharma Sprl Treatment of autoimmune disorders with CD154 antibodies
EP3081942A1 (en) * 2015-04-17 2016-10-19 Roche Diagniostics GmbH Pressure transmission liquid for cellular analyzer, cellular analyzer and method for analyzing a liquid cellular sample
CA2987051A1 (en) 2015-05-29 2016-12-08 Abbvie Inc. Anti-cd40 antibodies and uses thereof
SI3307322T1 (sl) 2015-09-04 2021-08-31 Primatope Therapeutics Inc. Humanizirana protitelesa proti CD40 in njihove uporabe
AU2016321146C1 (en) * 2015-09-08 2021-10-28 Theripion, Inc. ApoA-1 fusion polypeptides and related compositions and methods
US9862760B2 (en) 2015-09-16 2018-01-09 Novartis Ag Polyomavirus neutralizing antibodies
EP3355921A4 (en) 2015-09-30 2019-05-22 Janssen Biotech, Inc. ANTAGONIST ANTIBODIES SPECIFICALLY BINDING TO HUMAN CD40 AND METHODS OF USE
EP3362475B1 (en) 2015-10-12 2023-08-30 Innate Pharma Cd73 blocking agents
RS60477B1 (sr) 2016-02-10 2020-08-31 Novartis Ag Upotreba inhibitora aktivnosti ili funkcije pi3k za lečenje primarnog sjögren-ovog sindroma
CN108699158B (zh) 2016-03-08 2022-06-03 依奈特制药公司 Siglec中和抗体
EP3912681A1 (en) 2016-03-14 2021-11-24 Orega Biotech Anti-cd39 antibodies
JP7461741B2 (ja) 2016-06-20 2024-04-04 カイマブ・リミテッド 抗ｐｄ－ｌ１およびｉｌ－２サイトカイン
WO2018065552A1 (en) 2016-10-06 2018-04-12 Innate Pharma Anti-cd39 antibodies
WO2018083080A2 (en) 2016-11-04 2018-05-11 Innate Pharma Nkp46 ligand
WO2018106959A1 (en) 2016-12-07 2018-06-14 Progenity Inc. Gastrointestinal tract detection methods, devices and systems
CA3046548A1 (en) 2017-01-24 2018-08-02 Innate Pharma Nkp46 binding agents
EP3577138A1 (en) 2017-02-06 2019-12-11 Innate Pharma Immunomodulatory antibody drug conjugates binding to a human mica polypeptide
CA3051640A1 (en) 2017-03-16 2018-09-20 Innate Pharma Compositions and methods for treating cancer
WO2018182562A1 (en) * 2017-03-26 2018-10-04 Stafford Vivi Robyn Method of treatment of skin conditions of eye lids
EP4108183A1 (en) 2017-03-30 2022-12-28 Biora Therapeutics, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immune modulatory agent released using an ingestible device
WO2018185618A1 (en) 2017-04-03 2018-10-11 Novartis Ag Anti-cdh6 antibody drug conjugates and anti-gitr antibody combinations and methods of treatment
WO2018217976A1 (en) 2017-05-25 2018-11-29 Bristol-Myers Squibb Company Antagonistic cd40 monoclonal antibodies and uses thereof
EP3630832A1 (en) * 2017-05-25 2020-04-08 Bristol-Myers Squibb Company MODIFIED IgG1 Fc DOMAINS AND ANTI-CD40 DOMAIN ANTIBODY FUSIONS THEREWITH
TW201902462A (zh) * 2017-06-02 2019-01-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 用於免疫促效劑之新穎投與途徑
US11447545B2 (en) 2017-07-10 2022-09-20 Innate Pharma Combination therapy using antibody to human Siglec-9 and antibody to human NKG2A for treating cancer
CN111263769B (zh) 2017-07-10 2024-01-02 先天制药公司 Siglec-9中和性抗体
EP3684813A1 (en) * 2017-09-19 2020-07-29 MAB Discovery GmbH Agonistic cd40 antibodies
CA3076872A1 (en) * 2017-11-03 2019-05-09 Novartis Ag Anti-cd40 antibodies for use in treatment of sjogren's syndrome
CA3083363A1 (en) 2017-12-01 2019-06-06 Novartis Ag Polyomavirus neutralizing antibodies
TW201943731A (zh) 2018-04-13 2019-11-16 瑞士商諾華公司 用於預防移植物排斥之抗cd40抗體
IT201800004853A1 (it) 2018-04-24 2019-10-24 Metodi per trattare il cancro
WO2019229699A1 (en) 2018-05-31 2019-12-05 Novartis Ag Hepatitis b antibodies
CA3103629A1 (en) 2018-06-15 2019-12-19 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Increasing immune activity through modulation of postcellular signaling factors
WO2019243252A1 (en) 2018-06-18 2019-12-26 Innate Pharma Compositions and methods for treating cancer
WO2019246312A1 (en) 2018-06-20 2019-12-26 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immunomodulator
WO2019246317A1 (en) 2018-06-20 2019-12-26 Progenity, Inc. Treatment of a disease or condition in a tissue originating from the endoderm
WO2020053742A2 (en) 2018-09-10 2020-03-19 Novartis Ag Anti-hla-hbv peptide antibodies
AR117091A1 (es) 2018-11-19 2021-07-07 Bristol Myers Squibb Co Anticuerpos monoclonales antagonistas contra cd40 y sus usos
WO2020106757A1 (en) 2018-11-19 2020-05-28 Progenity, Inc. Ingestible device for delivery of therapeutic agent to the gastrointestinal tract
TW202039554A (zh) 2018-12-19 2020-11-01 瑞士商諾華公司 抗ＴＮＦ－α抗體
AU2019414793A1 (en) 2018-12-26 2021-06-24 Innate Pharma Compounds and methods for treatment of head and neck cancer
BR112021013174A2 (pt) * 2019-01-11 2021-11-03 Novartis Ag Anticorpos anti-cd40 para uso no tratamento da hidradenite supurativa
JP2022530404A (ja) 2019-04-23 2022-06-29 イナート・ファルマ・ソシエテ・アノニム Ｃｄ７３遮断抗体
EP3962493A2 (en) 2019-05-03 2022-03-09 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Methods of modulating immune activity/level of irf or sting or of treating cancer, comprising the administration of a sting modulator and/or purinergic receptor modulator or postcellular signaling factor
US20220195061A1 (en) 2019-05-08 2022-06-23 Novartis Ag Anti-cd40 antibodies for use in treatment of tidm and insulitis
JP7137696B2 (ja) 2019-05-14 2022-09-14 プロヴェンション・バイオ・インコーポレイテッド １型糖尿病を予防するための方法および組成物
EA202193345A1 (ru) 2019-06-12 2022-03-16 Новартис Аг Антитела к рецептору-1 натрийуретического пептида и способы их применения
US20220332836A1 (en) * 2019-09-11 2022-10-20 Novartis Ag A method for preventing human virus associated disorders in patients
AU2020347945A1 (en) 2019-09-18 2022-03-31 Novartis Ag NKG2D fusion proteins and uses thereof
US11707610B2 (en) 2019-12-13 2023-07-25 Biora Therapeutics, Inc. Ingestible device for delivery of therapeutic agent to the gastrointestinal tract
JP2023509359A (ja) 2019-12-17 2023-03-08 フラグシップ パイオニアリング イノベーションズ ブイ，インコーポレーテッド 鉄依存性細胞分解の誘導物質との併用抗癌療法
CA3173394A1 (en) 2020-02-27 2021-09-02 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
CN116096906A (zh) 2020-06-29 2023-05-09 旗舰创业创新五公司 工程化以促进萨诺传递的病毒及其在治疗癌症中的用途
WO2022033978A2 (en) 2020-08-13 2022-02-17 Innate Pharma Cancer treatment methods using anti-cd73 antibodies
US20230348609A1 (en) * 2020-08-21 2023-11-02 Wuxi Biologics (Shanghai) Co. Ltd. Cd40 agonistic antibody and method of use
EP4199960A2 (en) 2020-08-21 2023-06-28 Novartis AG Compositions and methods for in vivo generation of car expressing cells
WO2022097065A2 (en) 2020-11-06 2022-05-12 Novartis Ag ANTIBODY Fc VARIANTS
WO2022130182A1 (en) 2020-12-14 2022-06-23 Novartis Ag Reversal binding agents for anti-natriuretic peptide receptor 1 (npr1) antibodies and uses thereof
CA3214085A1 (en) 2021-03-31 2022-10-06 Darby Rye Schmidt Thanotransmission polypeptides and their use in treating cancer
KR20240026185A (ko) * 2021-06-28 2024-02-27 지앙수 헨그루이 파마슈티컬스 컴퍼니 리미티드 항-cd40 항체, 항원 결합 단편 및 이의 의학적 용도
KR20240026507A (ko) 2021-06-29 2024-02-28 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 브이, 인크. 타노트랜스미션을 촉진시키도록 엔지니어링된 면역 세포 및 이의 용도
TW202323521A (zh) 2021-08-20 2023-06-16 瑞士商諾華公司 製備表現嵌合抗原受體的細胞之方法
WO2023025248A1 (zh) 2021-08-26 2023-03-02 映恩生物制药（苏州）有限公司 一种甾体化合物及其缀合物
WO2023044048A1 (en) 2021-09-17 2023-03-23 Novartis Ag Methods for prevention of graft rejection in xenotransplantation
CA3232171A1 (en) 2021-09-24 2023-03-30 Zhenzhen Lu Anti-cd40 antibody and use thereof
WO2023052581A1 (en) 2021-10-01 2023-04-06 Mab Discovery Gmbh Agonistic cd40 antibodies as immune stimulatory agents
TW202405009A (zh) 2022-03-30 2024-02-01 瑞士商諾華公司 使用抗利尿鈉肽受體１（ｎｐｒ１）抗體治療障礙之方法
WO2024056809A1 (en) 2022-09-15 2024-03-21 Novartis Ag Treatment of autoimmune disorders using chimeric antigen receptor therapy
WO2024077191A1 (en) 2022-10-05 2024-04-11 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Nucleic acid molecules encoding trif and additionalpolypeptides and their use in treating cancer

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010123012A1 (ja) * 2009-04-20 2010-10-28 協和発酵キリン株式会社 アミノ酸変異が導入されたIgG2を有する抗体

Family Cites Families (72)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4766A (en) 1846-09-19 Stbaw-cutter
US106A (en) 1915-08-24 Specipication
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
JPS5896026A (ja) 1981-10-30 1983-06-07 Nippon Chemiphar Co Ltd 新規ウロキナ−ゼ誘導体およびその製造法ならびにそれを含有する血栓溶解剤
US4609546A (en) 1982-06-24 1986-09-02 Japan Chemical Research Co., Ltd. Long-acting composition
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US4881175A (en) 1986-09-02 1989-11-14 Genex Corporation Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
CA1292686C (en) 1986-10-27 1991-12-03 Ze'ev Shaked Pharmaceutical compositions of recombinant interleukin-2 and formulation process
CA1294215C (en) 1986-10-27 1992-01-14 Ze'ev Shaked Pharmaceutical compositions of recombinant beta-interferon and formulation processes
US5013653A (en) 1987-03-20 1991-05-07 Creative Biomolecules, Inc. Product and process for introduction of a hinge region into a fusion protein to facilitate cleavage
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
JPH02500329A (ja) 1987-05-21 1990-02-08 クリエイテイブ・バイオマリキユールズ・インコーポレーテツド ターゲット化多機能蛋白質
US5132405A (en) 1987-05-21 1992-07-21 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5397703A (en) 1992-07-09 1995-03-14 Cetus Oncology Corporation Method for generation of antibodies to cell surface molecules
US5874082A (en) 1992-07-09 1999-02-23 Chiron Corporation Humanized anti-CD40 monoclonal antibodies and fragments capable of blocking B cell proliferation
ES2211884T3 (es) 1993-10-01 2004-07-16 Immunex Corporation Anticuerpos contra el cd40.
ATE267607T1 (de) 1993-12-23 2004-06-15 Immunex Corp Verwendung von löslichen oligomerischen cd40 liganden oder monoklonalen antikörpern zur herstellung eines arzneimitells zur vorbeugung oder behandlung von neoplastischen krankheiten
ES2204944T3 (es) 1994-03-03 2004-05-01 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Genes y proteinas de fusion inhibidores del complemento terminal.
GB9425060D0 (en) 1994-12-13 1995-02-08 Univ Birmingham Carcinoma treatment
CA2226575C (en) 1995-07-27 2011-10-18 Genentech, Inc. Stabile isotonic lyophilized protein formulation
DE69810481T2 (de) 1997-06-13 2003-09-25 Genentech Inc Stabilisierte antikörperformulierung
TR199903141T2 (xx) 1997-06-20 2000-09-21 Biogen, Inc. Terap�tik protein engelleyici sendrom i�in CD154 blokaj tedavisi.
PT1224940E (pt) 1997-09-23 2005-01-31 Rentschler Biotech Gmbh Formulacoes liquidas de intrferao beta
US6051228A (en) 1998-02-19 2000-04-18 Bristol-Myers Squibb Co. Antibodies against human CD40
US20020006901A1 (en) 1999-02-05 2002-01-17 Aldo T. Iacono Use of aerosolized cyclosporine for prevention and treatment of pulmonary disease
WO2001034649A2 (en) 1999-11-09 2001-05-17 Chiron Corporation Compositions and methods for treating autoimmune diseases and transplant rejections
US7063845B2 (en) 2000-04-28 2006-06-20 Gemini Science, Inc. Human anti-CD40 antibodies
US20030059427A1 (en) 2000-04-28 2003-03-27 Force Walker R. Isolation and characterization of highly active anti-CD40 antibody
WO2001083755A2 (en) 2000-04-28 2001-11-08 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Human anti-cd40 antibodies and methods of making and using same
KR20030031957A (ko) 2000-07-12 2003-04-23 아이덱 파마슈티칼즈 코포레이션 Ｂ 세포 고갈 항체 및 면역 조절 항체 관련 적용의 조합을이용한 ｂ 세포 악성종양의 치료
KR20040023565A (ko) 2000-09-18 2004-03-18 아이덱 파마슈티칼즈 코포레이션 Ｂ 세포 고갈/면역조절 항체 조합을 이용한 자가면역질환의 치료를 위한 조합 요법
DE60143535D1 (de) 2000-10-02 2011-01-05 Novartis Vaccines & Diagnostic Humane antikörper gegen cd40
AU2002243718B2 (en) 2001-01-31 2007-12-06 Biogen Idec Inc. Use of immunoregulatory antibodies in the treatment of neoplastic disorders
ATE507839T1 (de) 2001-04-02 2011-05-15 Genentech Inc Kombinationstherapie
CA2658221C (en) 2001-04-27 2012-11-27 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Anti-cd40 monoclonal antibody
WO2003029296A1 (en) 2001-10-02 2003-04-10 Chiron Corporation Human anti-cd40 antibodies
AR039067A1 (es) * 2001-11-09 2005-02-09 Pfizer Prod Inc Anticuerpos para cd40
WO2003045978A2 (en) 2001-11-26 2003-06-05 Chiron Corporation Antagonist anti-cd40 monoclonal antibody therapy for multiple sclerosis treatment
US20080199471A1 (en) * 2002-03-01 2008-08-21 Bernett Matthew J Optimized cd40 antibodies and methods of using the same
WO2003074679A2 (en) * 2002-03-01 2003-09-12 Xencor Antibody optimization
WO2004071439A2 (en) 2003-02-10 2004-08-26 Elan Pharmaceuticals, Inc. Immunoglobulin formulation and method of preparation thereof
EP2236172A1 (en) 2003-11-04 2010-10-06 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Combination therapy comprising anti-CD20 and anti-CD40 antibodies for the treatment of B cell-related cancers
US8277810B2 (en) 2003-11-04 2012-10-02 Novartis Vaccines & Diagnostics, Inc. Antagonist anti-CD40 antibodies
EP1694360B1 (en) 2003-11-04 2010-08-04 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Use of antagonist anti-cd40 antibodies for treatment of autoimmune and inflammatory diseases and organ transplant rejection
WO2005044304A2 (en) 2003-11-04 2005-05-19 Chiron Corporation Use of antagonist anti-cd40 antibodies for treatment of chronic lymphocytic leukemia
EP2301575A1 (en) 2003-11-04 2011-03-30 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Methods of therapy for solid tumors expressing the CD40 cell-surface antigen
ES2346978T3 (es) 2003-11-04 2010-10-22 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Uso de anticuerpos monoclonantes anti-cd40 antagonistas para el tratamiento del mieloma multiple.
AU2004309275B2 (en) * 2003-12-25 2010-12-23 Kyowa Kirin Co., Ltd. Mutants of anti-CD40 antibody
WO2006073443A2 (en) 2004-04-27 2006-07-13 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Antagonist anti-cd40 monoclonal antibodies and methods for their use
US20080057070A1 (en) * 2004-11-04 2008-03-06 Chiron Corporation Antagonist Anti-Cd40 Monoclonal Antibodies and Methods for Their Use
JP5421590B2 (ja) 2005-05-18 2014-02-19 ノバルティス アーゲー 自己免疫および／または炎症性成分を有する疾患の診断および治療のための方法
CN101351478A (zh) 2005-11-01 2009-01-21 诺华有限公司 抗cd40抗体的应用
BRPI0621065A2 (pt) * 2005-12-16 2011-11-29 Genentech Inc anticorpo anti-ox40l, anticorpos isolados, polinucleotìdeo, vetor, célula hospedeira, método para fabricar um anticorpo anti-ox40l, método para tratar ou previnir uma disfunção imune, composição e uso de um anticorpo anti-ox40l
EA018301B1 (ru) 2006-04-21 2013-07-30 Новартис Аг Фармацевтические композиции, содержащие антагонистическое моноклональное антитело к cd40, и их применение
EP1854810A1 (en) 2006-05-09 2007-11-14 PanGenetics B.V. Deimmunized antagonistic anti-human CD40 monoclonal antibody from the ch5D12 antibody
NZ572177A (en) * 2006-06-06 2012-02-24 Genentech Inc Anti-dll4 antibodies and methods using same
WO2008122007A1 (en) * 2007-04-02 2008-10-09 Genentech, Inc. Biological markers predictive of rheumatoid arthritis response to b-cell antagonists
AU2008275559B2 (en) * 2007-04-02 2014-04-10 Genentech, Inc. Klotho-beta for use in treating cancer, liver disorders, gallstones, wasting syndrome and obesity-related diseases
AU2008260498B2 (en) * 2007-05-30 2012-11-29 Xencor, Inc. Methods and compositions for inhibiting CD32b expressing cells
PE20120341A1 (es) * 2008-12-09 2012-04-24 Genentech Inc Anticuerpos anti-pd-l1 y su uso para mejorar la funcion de celulas t
AR083847A1 (es) 2010-11-15 2013-03-27 Novartis Ag Variantes de fc (fragmento constante) silenciosas de los anticuerpos anti-cd40
US20140004131A1 (en) 2012-05-04 2014-01-02 Novartis Ag Antibody formulation
EP2967348B1 (en) 2013-03-15 2022-03-23 Synaptive Medical Inc. Intelligent positioning system

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010123012A1 (ja) * 2009-04-20 2010-10-28 協和発酵キリン株式会社 アミノ酸変異が導入されたIgG2を有する抗体

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Blood, Vol. 116, No. 16, pp. 3004-3012 (2010.07.08.)*

Also Published As

Publication number Publication date
BR112013011644B1 (pt) 2022-02-22
HRP20171084T1 (hr) 2017-10-06
EP3502138A1 (en) 2019-06-26
HUE034203T2 (en) 2018-01-29
EP3222636A1 (en) 2017-09-27
ES2911460T3 (es) 2022-05-19
US20140341898A1 (en) 2014-11-20
US9828433B2 (en) 2017-11-28
US11124578B2 (en) 2021-09-21
CU24057B1 (es) 2014-12-26
TW201305208A (zh) 2013-02-01
HRP20220413T1 (hr) 2022-05-27
AR122999A2 (es) 2022-10-19
CA2815921A1 (en) 2012-05-24
US20160152721A1 (en) 2016-06-02
IL225719A0 (en) 2013-06-27
US20170267772A1 (en) 2017-09-21
SG189928A1 (en) 2013-06-28
EA201390725A1 (ru) 2013-09-30
US8828396B2 (en) 2014-09-09
AR083847A1 (es) 2013-03-27
PT3502138T (pt) 2022-04-06
AU2011331288A1 (en) 2013-05-02
CN105949314A (zh) 2016-09-21
US20180118843A1 (en) 2018-05-03
UA112417C2 (uk) 2016-09-12
EP2640749B1 (en) 2017-04-19
BR112013011644A2 (pt) 2016-08-02
US9221913B2 (en) 2015-12-29
MA34654B1 (fr) 2013-11-02
HUE058015T2 (hu) 2022-06-28
CN105949314B (zh) 2021-04-09
EP3502138B1 (en) 2022-01-19
PE20140979A1 (es) 2014-08-09
EP3502138B9 (en) 2022-03-09
US20120121585A1 (en) 2012-05-17
TW201623335A (zh) 2016-07-01
CN103209996A (zh) 2013-07-17
TWI531581B (zh) 2016-05-01
CN103209996B (zh) 2016-07-20
RS56153B1 (sr) 2017-11-30
PT2640749T (pt) 2017-07-25
AU2011331288B2 (en) 2014-09-11
UY39292A (es) 2021-07-30
NZ609549A (en) 2015-05-29
JO3266B1 (ar) 2018-09-16
LT2640749T (lt) 2017-07-10
US20200087409A1 (en) 2020-03-19
DK3502138T3 (da) 2022-04-19
JP5782132B2 (ja) 2015-09-24
RS63094B1 (sr) 2022-04-29
EP2640749A1 (en) 2013-09-25
EP4023676A1 (en) 2022-07-06
CU20130071A7 (es) 2013-09-27
GT201300128A (es) 2015-06-02
TWI608016B (zh) 2017-12-11
US20220204635A1 (en) 2022-06-30
CA2815921C (en) 2021-07-06
SI3502138T1 (sl) 2022-05-31
ZA201302532B (en) 2014-09-25
UY33728A (es) 2012-06-29
WO2012065950A1 (en) 2012-05-24
DK2640749T3 (en) 2017-07-31
PL3502138T3 (pl) 2022-05-02
EA026133B1 (ru) 2017-03-31
IL225719A (en) 2017-09-28
CY1119097T1 (el) 2018-01-10
US9688768B2 (en) 2017-06-27
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