JP6838958B2 - (ポリ)ペプチドのアンフォールディングを防止し、および/または(ポリ)ペプチドの(リ)フォールディングを誘導するための方法 - Google Patents
(ポリ)ペプチドのアンフォールディングを防止し、および/または(ポリ)ペプチドの(リ)フォールディングを誘導するための方法 Download PDFInfo
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を含み、水溶液は(a)糖類;ならびに(b-i)タンパク質;および/または(b-ii)変性作用化合物;ならびに(c)シラン類を含まないかまたは実質的に含まない方法に関する
。
割を果たす。自然状態の安定化エネルギーは多くの場合5〜20 kcal/molであり、これは
数個の水素結合のものに等しいので、タンパク質は一般にきわめて安定というわけではない。フォールディングした状態はフォールディングしていない状態よりわずかに安定であるにすぎないので、タンパク質環境のいかなる変化もタンパク質の分解または不活性化を誘発する可能性がある。
る化学的変換には、たとえばアミド分解、酸化、加水分解、異性化、スクシンイミド化、ジスルフィド結合の形成または破断、非ジスルフィド架橋、および脱グリコシルが含まれる。したがって、タンパク質医薬の開発における最も大きな難題のひとつは、物理的および化学的な不安定性に対処すること、ならびに許容できる貯蔵寿命を達成するためにタンパク質を安定化できる配合物を提供することである。
学的利用能、安定性の喪失、およびタンパク質療法薬に対する望ましくない宿主免疫応答の動員が含まれる。特に、療法用タンパク質で治療している間に療法用タンパク質に対する抗体が発現する可能性があり、それはこれらの療法用タンパク質の臨床効果を中和し、または他の形で損ない、また、たとえば自己タンパク質との交差反応性などの重篤な副作用を伴なう可能性もある。したがって、タンパク質医薬中の何らかの凝集物の存在は製品販売について一般に許容できない。タンパク質凝集は多様な物理的要因により誘発される可能性があるが、タンパク質凝集、ならびにタンパク質凝集の速度および機序は、一般にタンパク質依存性である。
セミ化、ならびに二重結合形成など、多くの反応が起きる可能性がある。化学的安定性に対するpHの影響は、賦形剤の存在下ではさらに変化する可能性がある。
うな吸着表面で有意に変化する可能性がある。したがって、表面吸着はタンパク質の損失および/または不安定化をもたらす可能性がある。タンパク質の表面吸着は通常は濃度依存性であり、特定のタンパク質濃度を上回ると-少なくとも特定のタンパク質については-最大に達する可能性がある。たとえばタンパク質の無菌濾過、透析または濃縮のために用いる容器またはメンブレンのタイプ(すなわち材料)が、表面へのタンパク質吸着に著しい影響をもつ。タンパク質の表面吸着は、さらにたとえば凍結乾燥または噴霧乾燥などの乾燥プロセスに際して特に関係がある。
る程度に耐容できる。タンパク質構造の剛性およびタンパク質表面の疎水性残基の数が、そのような剪断耐容性のレベルの相異に関係する。
能性がある。金属イオン、酸素および還元剤は、タンパク質を酸化できる反応性酸素種を生成する可能性がある。
タンパク質-溶媒系の体積はアンフォールディング状態ではより小さいので、高圧はさ
らにタンパク質アンフォールディングを引き起こす可能性がある。言い換えると、アンフォールディングしたタンパク質はフォールディングしたタンパク質より圧縮されやすく、これが凍結乾燥または噴霧凍結乾燥に際して役割をもつ可能性がある。
の化学反応には一定の位置フレキシビリティーが要求され、したがって反応速度は高いフレキシビリティーをもつ変性タンパク質または小型ペプチドの方が天然タンパク質より高い可能性がある。したがって、潜在的な化学分解を防止または阻止するためには、天然タンパク質のコンホメーションを保護する必要がある。
アミノ酸はアスパラギンおよびグルタミンであるが、アスパラギンの方がより不安定なアミノ酸である。水溶液中におけるタンパク質およびペプチド中のアスパラギンのアミド分解は、ペプチド結合の加水分解よりはるかに速い速度で進行する可能性がある。タンパク質におけるアミド分解の速度、機序および位置は、pH依存性である。さらに、タンパク質におけるアスパラギンおよび/またはグルタミンの相対位置がそれらの相対的なアミド分解速度に影響を及ぼし、タンパク質中のアミド分解部位に隣接するアミノ酸も影響を及ぼす。最も不安定な配列はAsn-Glyであると思われ、タンパク質におけるアミド分解速度は
さらにタンパク質の二次構造によって影響を受ける。
は重合を引き起こす可能性がある。タンパク質におけるチオ-ジスルフィド交換は、イオ
ン化したチオール基(チオレートアニオン)とジスルフィド結合の反応である。チオール-ジスルフィド交換の速度は求核性チオールのイオン化度に依存し、したがって一般に求
核性チオール基のpKを超えるまでは反応のpHが上昇するのに伴なって上昇する。タンパク質が遊離システイン残基をもたない場合ですら、なおジスルフィド結合スクランブリングは起きる可能性があり、これがタンパク質凝集を引き起こす。
てアスパラギン酸はスクシンイミド中間体を形成し、これはAsnのアミド分解に際して得
られるスクシンイミド中間体に類似する。さらに、特にアスパラギン酸のC側残基がプロ
リンである場合、環状の無水物中間体が形成される可能性もある。多くの場合、加水分解はアスパラギン残基のアミド分解の後続反応である。
ン酸異性化の速度はタンパク質におけるそれの位置および可動性によって強く影響される。イソアスパラギン酸形成は、無傷タンパク質の比較的構造不定なドメインまたは一過性アンフォールディングを受けやすいドメインで起きる可能性が最も高い。
、不安定残基の隣接基およびタンパク質のコンホメーションによって強く影響される。
たは個別に-起きる可能性がある;たとえば、タンパク質の単離および精製、たとえば凍
結乾燥、噴霧乾燥、噴霧凍結乾燥もしくは発泡乾燥によるタンパク質の乾燥、溶液状または乾燥後のタンパク質の貯蔵、ならびに乾燥後の再構成に際して。
な安定剤が存在しない状態での乾燥に際してタンパク質から水和シェル(hydration shell)が除かれると、タンパク質の構造がさらに不安定になる可能性がある。さらに、圧力、pH値またはイオン濃度の変動、ならびに添加剤の濃度効果、温度変動および剪断力も、乾
燥に際してタンパク質の安定性に影響を及ぼす。酸素の影響、表面作用または加水分解も、タンパク質を不活性化または変性させる可能性がある。乾燥タンパク質の貯蔵に際して、ストレス要因、たとえば残留水分、露光、酸化および貯蔵温度がさらに乾燥タンパク質の変性および不活性化に作用する可能性がある。前記のすべての観点がタンパク質の再構成における問題および活性損失をもたらす可能性がある。
れ異なる安定化効果を発揮することができる。
より多い効果または目的をもつ場合がある。賦形剤の選択に際しては、物理的安定性および化学的安定性を共に最適化しなければならない。賦形剤はしばしば物理的不安定化プロセス(タンパク質凝集)を遅延または防止するために用いられる。溶媒誘発によるタンパク質安定化の特定の機序があり、これは具体的には配合物中の賦形剤に関係する。安定化は、タンパク質安定化力の強化により、変性状態の不安定化により、またはタンパク質への賦形剤の直接結合により達成される。
形剤を一般に添加して、含水率の変化に際してタンパク質の安定性を最適化する。そのような賦形剤の例には、たとえば糖類およびポリオール類が含まれるが、他の賦形剤、たとえば界面活性剤およびアミノ酸も含まれる。凍結乾燥配合物の開発に一般に用いられる賦形剤は、たとえばKofi Bedu-Addo 2004 (Pharmaceutical Technology, Lyophilization; 2004: 10-30)に述べられている。
噴出(すなわち、再構成後の製品の発泡)は阻止しなければならない。この目的で、増量剤、たとえば糖類およびポリオール類が一般に選択される;それらはクリオプロテクタントおよびリオプロテクタントとしても作用できるからである。適切な賦形剤を選択する際には、まず固体状態特性を考慮すべきである。たとえば、マンニトールは通常は結晶化し、したがって良好な構造安定性を備えたケーキを生成するであろう。しかし、マンニトールは異なる安定性をもつ3種類の異なる多型形態(α、β、δ)およびマンニトール半水
和物(それは貯蔵中に結晶水を放出する場合がある)として結晶化する可能性があり、マンニトールの固体状態は適用する凍結乾燥条件および他の賦形剤の存在に依存する。スクロースは通常は凍結乾燥に際して非晶質のままであり、これはタンパク質の安定性にとっては望ましいが、それは初期乾燥後の含水率を高め、最終製品の潮解および崩壊のリスクを高める。
非イオン性界面活性剤の例には、ポロキサマー(Pluronic F-68)およびポリオキシエチ
レングリコールドデシルエーテル(Brij35)、ポリソルベート80、20、ヒト血清アルブミンなどが含まれる。これらの界面活性剤のうちあるもの、特にポリソルベートには、それらの構造に取り込まれたエーテル結合に由来するアルキルペルオキシドが混在する場合があり、それはタンパク質の酸化を促進する可能性があるので不利である。表面吸着を防止するためにポリマーおよびデキストランも使用できるが、大型PEGのみがタンパク質に対
する安定化効果をもつと報告され、一方で小型PEGはアンフォールディングを誘発すると
思われる。選択する界面活性剤濃度は避ける必要がある作用に依存するが、一般にそれは界面活性剤の単層が界面に存在するCMC値のすぐ上である。一般に用いられるイオン性界
面活性剤の例には、セチルトリメチルアンモニウムクロリド(CTAC)およびセチルトリメチルアンモニウムブロミド(CTAB)が含まれる。
で用いた安定化溶液は、代わりに下記のものを含む:(i)好ましくは非イオン性のディ
タージェントである界面活性物質、すなわち界面活性剤、および(ii)少なくとも2種類
のアミノ酸の混合物、その際、これらの少なくとも2種類のアミノ酸はグルタミン酸およ
びグルタミン、またはアスパラギン酸およびアスパラギンである。アミノ酸の安定化効果を彼ら自身が調べた唯一の例(表2)は、界面活性剤ポリソルベート80の不存在下ではタ
ンパク質溶液の安定化はみられないか、あるいは実質的ではない-限られた期間の-安定化がみられるにすぎないことが認められたことを示す。
る。
燥粉末が得られることを保証する;(ii)液状配合物が一定のpH値に留まることを保証する;または(iii)製造により誘発される特定の作用、たとえば吸着に対してタンパク質
を安定化するように選択される。しかし、あるタンパク質に有用と思われるものが他のタンパク質に対しては有害な作用をもつ可能性がある。
したがって、本発明は、(ポリ)ペプチドのアンフォールディングを防止し、および/または(ポリ)ペプチドの(リ)フォールディングを誘導するための方法であって、(ポリ)ペプチドを水溶液に埋め込む段階を含み、その際、水溶液は(i)少なくとも3種類の異なるアミノ酸;または(ii)少なくとも1種類のジペプチドもしくはトリペプチドを含
み、水溶液は(a)糖類;ならびに(b-i)タンパク質;および/または(b-ii)変性作用化合物;ならびに(c)シラン類を含まないかまたは実質的に含まない方法に関する。
を含み、水溶液は(a)糖類;ならびに(b-i)タンパク質;および/または(b-ii)変性
作用化合物;ならびに(c)シラン類を含まないかまたは実質的に含まない方法に関する
。
体、三量体などを形成する(ポリ)ペプチド分子は、同一でも異なってもよい。したがって、対応する高次構造体はホモ-またはヘテロ二量体、ホモ-またはヘテロ三量体などと命名される。ホモ-またはヘテロ二量体なども、用語“(ポリ)ペプチド”の定義に含まれ
る。用語“(ポリ)ペプチド”と“タンパク質”は本明細書中で互換性をもって用いられる。用語“(ポリ)ペプチド”は、自然修飾された(ポリ)ペプチドであってその修飾がたとえば翻訳後修飾、たとえばグリコシル化、アセチル化、リン酸化などにより行なわれるものをも表わす。そのような修飾は当技術分野で周知である。
好ましくは3%未満、たとえば2%未満、または1%未満である。最も好ましくは、液体は0.5%未満、またはそれ以下である。
る溶液に完全に装入することに関する。
本発明によれば、乾燥前および乾燥中にタンパク質を溶液に埋め込み、これにより乾燥段階でのタンパク質のアンフォールディングを防止する。あるいは、またはさらに、乾燥タンパク質の再構成に際してタンパク質を溶液に埋め込んでもよく、これにより再構成タンパク質の適正なフォールディングが保証される。タンパク質を本発明による溶液中で乾燥させた場合に再構成は本発明の方法により定めた溶液とは異なる溶液中で実施でき、あるいはその逆も成り立つことは、当業者に認識されるであろう。好ましくは、タンパク質の乾燥と再構成を両方とも本発明による溶液中で実施し、その際、これらの段階に用いる溶液は同一であってもよく、異なる化合物を含んでもよい。
する。
本発明による用語“アミノ酸”は、カルボン酸基、アミノ基、および異なるアミノ酸間で変動する側鎖をもつ、有機分子に関する。アミノ酸はタンパク質の必須構築ブロックである。本発明によれば、用語“アミノ酸”は、互いに結合してオリゴマーまたはポリマー、たとえばジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチドまたは(ポリ)ペプチドを形成していない、遊離アミノ酸を表わす。
天然アミノ酸は、たとえば20種類のアミノ酸、グリシン、プロリン、アルギニン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、システイン、フェニルアニン、リジン、ロイシン、イソロイシン、ヒスチジン、メチオニン、セリン、バリン、チロシン、トレオニンおよびトリプトファンである。他の天然アミノ酸は、たとえばカルニチン、クレアチン、クレアチニン、グアニジノ酢酸、オルニチン、ヒドロキシプロリン、ホモシステイン、シトルリン、ヒドロキシリジンまたはベータ-アラニンである。
ホスホノトレオニン、ホスホノチロシン、メラニン、アルギニノコハク酸、およびその塩類、ならびにDOPAが含まれる。
本発明によれば、互いに異なる3種類以上のアミノ酸が溶液に含まれる。たとえば、用
語“少なくとも3種類の異なるアミノ酸”は、少なくとも4種類の異なるアミノ酸、たとえば少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10
種類のアミノ酸、またはそれ以上、たとえば少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18種類の異なるアミノ酸にも関する。この用語はさらに、厳密に3、厳密に4、厳密に5、厳密に6、厳密に7、厳密に8、厳密に9、厳密に10、厳密に11、厳密に12、厳密に13、厳密に14、厳密に15、厳密に16、厳密に17、厳密に18種類の異なるアミノ酸を含む。本明細書中でアミノ酸
と言う場合、1分子より多くのそのアミノ酸を意図することは当業者に容易に理解される
であろう。したがって、種々のアミノ酸の記載量は、1タイプのアミノ酸の分子数ではな
く異なるタイプのアミノ酸の量を限定することを意図する。したがって、たとえば用語“3種類の異なるアミノ酸”は3種類の異なるタイプのアミノ酸を表わし、その際、それぞれ個々のアミノ酸の量は具体的に限定されない。好ましくは、異なるアミノ酸の数は18を超えない。
単独と比較して高い水溶性を生じる)およびグリシルグリシンである。
スチジン)、グロリン(glorin)(N-プロピオニル-γ-L-グルタミル-L-オルニチン-δ-la
c エチルエステル)およびバレッチン(barettin)(シクロ-[(6-ブロモ-8-エン-トリプ
トファン)-アルギニン])である。
ニルアラニン 1-メチルエステル)およびプソイドプロリンが含まれる。
代表的なトリペプチドは、グルタチオン(γ-グルタミル-システイニル-グリシン)な
らびにそれのアナログであるオフタルミン酸(L-γ-グルタミル-L-α-アミノブチリル-グリシン)およびノルオフタルミン酸(y-グルタミル-アラニル-グリシン)である。トリペプチドの限定ではないさらに他の例には、イソロイシン-プロリン-プロリン(IPP)、グ
リプロメート(glypromate)(Gly-Pro-Glu)、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン(TRH、チロリベリン(thyroliberin)またはプロチレリン(protirelin))(L-ピログルタミル-L-ヒスチジニル-L-プロリンアミド)、メラノスタチン(melanostatin)(プロリル-ロイシル-グ
リシンアミド)、ロイペプチン(leupeptin)(N-アセチル-L-ロイシル-L-ロイシル-L-アルギニナール)およびエイゼニン(eisenin)(pGlu-Gln-Ala-OH)が含まれる。医薬用途に関して用いる場合、少なくとも1種類のジ-またはトリペプチド、より好ましくは全部のジ-
またはトリペプチドが、何ら薬理学的特性を発揮しないことが好ましい。
シルグリシンおよびグリシルグルタミンからなる群から選択される。
本発明によれば、溶液は1種類以上のジ-またはトリペプチドを含む。たとえば、用語“少なくとも1種類のジペプチドまたはトリペプチド”は、少なくとも2種類のジ-またはト
リペプチド、たとえば少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9種類のジ-またはトリペプチドにも関する。この用語はさらに、厳密に1、厳密に2、厳密に3、厳密に4、厳密に5、厳密に6、厳密に7、厳密に8、厳密に9種類のジ-またはトリペプチドを含む。1種類より多いジ-またはトリペプチドが溶液に含まれる場合、そのジペプチドおよびトリペプチドの混合物は明白に本発明に含まれる。ジ-およびトリペプチドの数は互いに独立して選択でき、たとえば溶液は2種類のジペプチドおよび3種類のトリペプチドを含むことができる。本明細書中で特定数のジ-およびトリペプチドに言及する場合、その数は1タイプのジペプチドまたはトリペプチドの分子数
ではなく異なるタイプのジ-およびトリペプチドの量を限定することを意図するものであ
ることは当業者に容易に理解されるであろう。したがって、たとえば用語“4種類のジペ
プチドまたはトリペプチド”は、4種類の異なるタイプのジペプチドおよび/またはトリ
ペプチドを表わし、その際、それぞれ個々のジ-および/またはトリペプチドの量は具体
的に限定されない。好ましくは、(異なる)ジ-またはトリペプチドの数は9を超えない。
/ml、好ましくは1〜100 mg/ml、より好ましくは10〜50 mg/ml、よりさらに好ましくは20〜35 mg/mlであり、最も好ましくはその量は25 mg/mlである。
タイプの糖類、すなわち単糖、二糖またはオリゴ糖の形態の炭水化物、および糖アルコールを含まないかまたは実質的に含まない溶液を表わす。タンパク質フォールディングの方法に一般に用いられるけれども本発明によれば存在しない糖類の例には、限定ではなくサッカロース、トレハロース、スクロース、グルコース、ラクトース、ソルビトールまたはマンニトールが含まれる。溶液が0.1%(w/v)未満、より好ましくは0.01%(w/v)未
満、よりさらに好ましくは0.001%(w/v)未満、最も好ましくは0.0001%(w/v)未満
の糖類を含有する場合、その溶液は糖類を実質的に含まないとみなされる。
野でしばしば用いられる。さらに、糖類は張度調整剤として、および増量剤として配合物に添加される。
)未満、よりさらに好ましくは0.001%(w/v)未満、最も好ましくは0.0001%(w/v)
未満の、(リ)フォールディングすべき、またはアンフォールディングを防止すべき(ポリ)ペプチド以外のタンパク質を含有する場合、その溶液はタンパク質を実質的に含まないとみなされる。
(w/v)未満、最も好ましくは0.0001%(w/v)未満のシラン類を含有する場合、その溶液はシラン類を実質的に含まないとみなされる。
およびサポニンもしくは脂肪酸またはその誘導体からなるが、さらに他の化合物を含まない。より好ましくは、本発明による溶液は、記載したアミノ酸、またはジ-もしくはトリ
ペプチドのみからなる。
定的には理解されていないこと、および前記に概説したように多数の不活性化機序に起因するが、タンパク質のサイズが大きいこと、フォールディング、コンホメーション安定性およびアンフォールディング/変性など特定の挙動に影響を及ぼすそれらの組成変動性および両親媒性にも起因する。さらに、伝統的に用いられている組合わせの賦形剤の安定化
効果は個々のタンパク質に強く依存し、したがって限定された量でのみタンパク質の安定性を高めることができる。異なるタンパク質間のこれらの構造上の相異のため、普遍的な安定化方策の一般化はこれまで成功していない。
ンパク質構造の剛性およびタンパク質表面の疎水性残基の数は剪断耐容性に影響を及ぼす可能性がある。本明細書中で述べる分解経路の性質の相異にもかかわらず、それらはすべて各タンパク質の三次元構造に依存し、あるいはそれにより影響を受ける。したがって、タンパク質の自然な三次元構造を維持するための本発明方法を提供することにより、これらの多様な影響の大部分により誘導される分解を防止できる。したがって本発明の方法は、タンパク質医薬の開発のためにタンパク質の基本的特性を調べることを要求する先行技術方法に優る著しい利点をもたらす。
とも1種類のジ-もしくはトリペプチドが溶液中に存在すれば、特に乾燥に際して溶液中でのタンパク質のアンフォールディングを防止するのに十分であるとは決して考えられなかった。
スパラギンの組合わせ。
い。
本発明方法のさらに他の好ましい態様において、少なくとも3種類のアミノ酸は下記の
群から選択される:(a)非極性、脂肪族R基をもつアミノ酸;(b)極性、非荷電R基をもつアミノ酸;(c)正に荷電したR基をもつアミノ酸;(d)負に荷電したR基をもつアミノ酸;および(e)芳香族R基をもつアミノ酸。
選択される。言い換えると、この好ましい態様において、3種類のアミノ酸が溶液に含ま
れる場合、その3種類のアミノ酸は少なくとも2つの異なる群から、より好ましくは少なくとも3つの異なる群から、たとえば1つは(a)群から、1つは(b)群から、そして1つは(c)群から選択できる。さらに他の組合わせ、たとえば(b)-(c)-(d)、(c)-(d)-(e)、(e)-(a)-(b)、(b)-(d)-(e)なども本発明において明らかに考慮され
る。4種類のアミノ酸が溶液に含まれる場合にも同じことが適用され、その場合はアミノ
酸は(a)〜(e)から選択される少なくとも2つの異なる群から、より好ましくは少なく
とも3つの異なる群から、最も好ましくは4つの異なる群からのものであるべきである。特に、5種類のアミノ酸が溶液に含まれる場合、アミノ酸は(a)〜(e)から選択される少
なくとも2つの異なる群から、より好ましくは少なくとも3つの異なる群から、より好ましくは少なくとも4つの異なる群から、最も好ましくは5つの異なる群からのものであるべきである。5種類より多いアミノ酸、たとえば6または7種類のアミノ酸が溶液に含まれる場
合にも同じことが適用され、その場合これらのアミノ酸は(a)〜(e)から選択される少なくとも2つの異なる群から、より好ましくは少なくとも3つの異なる群から、より好ましくは少なくとも4つの異なる群から、最も好ましくは5つの異なる群から選択される。
をもつアミノ酸;および(e)芳香族R基をもつアミノ酸。
、いかなる組合わせのアミノ酸も選択できる。
リペプチドとして存在することができる。
本発明方法の他の好ましい態様において、溶液は少なくとも下記のアミノ酸を含む:(a)アラニン、グルタミン酸、リジン、トレオニンおよびトリプトファン;(b)アスパラギン酸、アルギニン、フェニルアラニン、セリンおよびバリン;(c)プロリン、セリン
、アスパラギン、アスパラギン酸、トレオニン、フェニルアラニン;(d)チロシン、イ
ソロイシン、ロイシン、トレオニン、バリン;または(e)アルギニン、グリシン、ヒス
チジン、アラニン、グルタミン酸、リジン、トリプトファン。他の好ましい態様において、溶液は少なくとも下記のアミノ酸を含む:(f)アラニン、アルギニン、グリシン、グ
ルタミン酸、リジン。
アミノ酸が本発明溶液中に含まれてもよいが、少なくとも上記のアミノ酸は存在することが要求される。より好ましくは、溶液は上記のアミノ酸だけを含み、他のアミノ酸を含まない。群(f)のアミノ酸にも、必要な変更を加えて同じことが適用される。
アミノ酸および合成アミノ酸からなる群から選択される。
本発明による用語“非タンパク源アミノ酸”は、自然界ではポリペプチドおよびタンパク質に取り込まれないアミノ酸に関する。非タンパク源アミノ酸は、タンパク源アミノ酸、すなわちL-α-アミノ酸から、翻訳後修飾により誘導できる。そのような非タンパク源
アミノ酸は、たとえばランチオニン、2-アミノイソ酪酸、デヒドロアラニン、および神経伝達物質ガンマ-アミノ酪酸である。タンパク源L-アミノ酸のD-鏡像異性体も非タンパク
源アミノ酸である。非タンパク源アミノ酸の限定ではないさらに他の例には、カルニチン、クレアチン、クレアチニン、グアニジノ酢酸、オルニチン、ヒドロキシプロリン、ホモシステイン、シトルリン、ヒドロキシリジンまたはベータ-アラニンが含まれる。
。さらに、トランスジェニック動物を用いてヒト化抗体を発現させることができる。最も好ましくは、抗体はモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体の調製には、連続細胞系培養により産生される抗体を供給するいずれかの方法を使用できる。そのような方法の例には、ハイブリドーマ技術(Koehler and Milstein Nature 256 (1975), 495-497)、
トリオーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor, Immunology Today 4 (1983), 72)、およびヒトモノクローナル抗体を調製するためのEBV-ハイブリドーマ技術(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985), 77-96)
が含まれる。抗体はいかなるクラスの抗体であってもよい。抗体がモノクローナル抗体であって、IgG、IgMまたはIgYクラスのものであることが最も好ましい。IgY抗体はニワトリにおけるIgG抗体のアナログである。
汎用性であって多種多様な細胞タイプにおいて細胞分裂を刺激するが、他のものは特定の細胞タイプに特異的である。本発明による好ましい増殖因子には、限定ではなく、エリスロポエチン、インスリン様増殖因子1(IGF-1、元はソマトメジンCと呼ばれた)およびイ
ンスリン様増殖因子2(IGF-2)が含まれる。
マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)および骨形成タンパク質-2(BMP-2)が含ま
れる。
幾つかの段階で、一般に小胞体内においてプロセシングされ(これには、N末端シグナル
配列の除去および時にはグリコシル化が含まれる)、プロホルモンになる。プロホルモンは次いで膜結合した分泌小胞内へパッケージされ、これは特定の刺激、たとえば細胞質のカルシウムおよびcAMPの濃度上昇に応答して、細胞からエキソサイトーシスにより分泌できる。これらのプロホルモンはしばしば余分なアミノ酸残基を含み、それらはホルモン分子がフォールディングしてそれの活性コンフィギュレーションになるのを指令するのに必要であるが、ホルモンがフォールディングすると機能をもたない。細胞内の特異的エンドペプチダーゼは、プロホルモンが血流中へ放出される直前に開裂させて、成熟ホルモン形態の分子を生成する。成熟ペプチドホルモンは次いで血液により身体のすべての細胞に拡散し、そこでペプチドホルモンはそれらの標的細胞の表面にある特異的受容体と相互作用する。あるペプチド/タンパク質ホルモン(アンギオテンシンII、塩基性線維芽細胞増殖因子-2、副甲状腺ホルモン関連タンパク質)も、イントラクライン(intracrine)機序により細胞質または核にある細胞内受容体と相互作用する。幾つかの重要なペプチドホルモンが下垂体から分泌される。前下垂体は、乳腺に作用するプロラクトン、副腎皮質に作用してグルココルチコイドの分泌を調節する副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)、ならびに骨、筋肉および肝臓に作用する成長ホルモンを分泌する。後下垂体は、抗利尿ホルモン(バソプレシンとも呼ばれる)、およびオキシトシンを分泌する。しかし、ペプチドホルモンは多種多様な臓器および組織により産生され、これには心臓(心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)または心房性ナトリウム利尿因子(ANF))および膵臓(インスリンおよびソマトスタチン)、胃腸管(コレシストキニン、ガストリン)、ならびに脂肪組織貯蔵体(レプチン)が含まれる。ある神経伝達物質はペプチドホルモンと同様な様式で分泌および放出され、ある‘神経ペプチド'は、血流中へ放出されるとホルモンとして作用するほかに神
経系において神経伝達物質として使われる場合がある。ペプチドホルモンが細胞表面の受容体に結合すると、第2メッセンジャーが細胞質中に出現し、それが細胞内応答を誘発す
る。ペプチドホルモンには、限定ではなく、インスリン、グルカゴン、ゴナドトロピン、
ヒト甲状腺刺激ホルモン、アンギオテンシンII、塩基性線維芽細胞増殖因子-2、副甲状腺ホルモン関連タンパク質、バソプレシン、オキシトシン、心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)または心房性ナトリウム利尿因子(ANF)、ソマトスタチン、コレシストキニン、ガストリン、ならびに脂肪組織貯蔵体(レプチン)が含まれる。
ク質系ペプチドホルモンを表わし、前下垂体の側翼内の成長ホルモン分泌細胞により貯蔵および分泌される。成長ホルモンが身体組織に及ぼす作用は、全般的に同化作用(構築)であると述べることができる。他の大部分のタンパク質ホルモンと同様に、それは細胞表面の特異的受容体との相互作用により作用する。小児期の身長の伸びは最も良く知られているGHの作用である。身長は少なくとも2つの機序によって刺激されると思われる:1.ポリペプチドホルモンは脂溶性ではないので、それらは筋繊維膜を透過できない。したがって、GHはそれの作用の一部を標的細胞上の受容体に結合することにより発揮し、そこでそれはMAPK/ERK経路を活性化する。この機序により、GHは軟骨の軟骨細胞の分裂および増
殖を直接刺激する。2.GHは、JAK-STAT信号伝達経路により、インスリン様増殖因子1(IGF-1、以前はソマトメジンCとして知られていた)、すなわちプロインスリンのホルモンホモログの産生も刺激する。肝臓はこのプロセスについてGHの主要な標的臓器であり、IGF-1産生の主要部位である。IGF-1は多種多様な組織に対して増殖刺激作用をもつ。追加のIGF-1が標的組織内で産生され、これによりそれはエンドクリンホルモンおよびオートクリ
ン/パラクリンホルモンの両方であるようにみえる。IGF-1は骨芽細胞および軟骨細胞に
対しても刺激作用をもち、骨成長を促進する。小児および青年において身長を伸ばすほかに、成長ホルモンは身体に対して他の多数の作用をもつ:カルシウム固定を増大させる、ならびに骨無機質化を強化および増大させる、筋節肥厚により筋質量を増加させる、脂質溶解を促進する、タンパク質合成を増大させる、脳を除くすべての内臓の増殖を刺激する、ホメオスタシスにおいて役割を果たす、肝臓によるグルコース取込みを低減する、肝臓における糖新生を促進する、膵島の維持および機能に寄与する、免疫系を刺激する。
マトトロピンは組換えDNA技術により製造される成長ホルモンを表わし、ヒトにおいて“HGH”と略記される。それは成長、細胞の増殖および再生を刺激する。
ゼA(ファブリー病)、血栓溶解薬、すなわちスレプトキナーゼ(虚血性発作の処置にお
ける血栓溶解薬)、ウロキナーゼ、(組換え)組織プラスミノーゲンアクチベーター、TNKase;L-アスパラギナーゼ(細胞増殖抑制薬)、尿酸オキシダーゼ、パパインが含まれる。
ス抗原に関する。
に挿入することができる。続いて適切な宿主をこの発現ベクターで形質転換することができる。その後、宿主を培養して目的とする(ポリ)ペプチドを産生させ、それ/それらを単離し、そして場合により本発明に使用する前に精製する。
モーターエレメントを含むクローニングベクター、DNAフラグメントまたはRNA配列を添加すると、組換え(ポリ)ペプチドを発現することができる。
Phase Peptide Synthesis; Freeman Co, San Francisco; Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85 (1963), 2149-2154)。合成によるペプチド合成は、手動法を用いて、または自動化により実施できる。自動合成は、たとえばApplied Biosystems 431A Peptide Synthesizer (Perkin Elmer、カリフォルニア州フォスターシティー)を用いて、製造業者が提供する指示に従って達成できる。種々のフラグメントを個別に化学合成し、化学的方法で結合させて、全長分子を製造することができる。前記のように、化学合成、たとえばHoughton Proc. Natl. Acad. Sci. USA (82) (1985), 5131-5135が記載する固相法を使用できる。さらに、(ポリ)ペプチドは半合成的に、たとえば組換え製造と合成による製造の組合わせにより製造できる。
サポニンは二次代謝産物を形成する一群の化合物であり、それらは天然源中にみられるか、天然源から誘導されるか、あるいは化学合成できる。サポニンは多様な植物種に特に多量にみられる。サポニンは両親媒性グリコシドであり、現象的には水溶液状で振とうした際にそれらが生じるセッケン様の発泡により、また構造的にはそれらの1以上の親水性
グリコシド部分と親油性ステロイド系またはトリテルペノイド系アグリコンとを組み合わせた組成により分類される。それらの構造多様性は、それらの物理化学的および生物学的特性に反映される。サポニンの例は、グリチルリチン酸(glycyrrhicic acid)、グリチル
レチン酸(glycyrrhetinic acid)、グルクロン酸、エスシン(escin)、ヘデラコシド(hederacoside)およびジギトニンである。
ー源である。大部分の天然脂肪酸は4から28までの偶数の炭素原子の鎖をもち、通常はト
リグリセリドまたはリン脂質から誘導される。脂肪酸は種々の長さをもち、これを利用してそれらを短鎖、中鎖または長鎖脂肪酸と分類する。短鎖脂肪酸(SCFA)は炭素原子6個
未満の脂肪族テイルをもつ脂肪酸であり;中鎖脂肪族(MCFA)は炭素原子6〜12個の脂肪
族テイルをもつ脂肪酸であり、それらは中鎖トリグリセリドを形成することができ;長鎖脂肪酸(LCFA)は炭素原子12個より長い脂肪族テイルをもつ脂肪酸であり;極長鎖脂肪酸(VLCFA)は炭素原子22個より長い脂肪族テイルをもつ脂肪酸である。限定ではない脂肪
酸の例には、不飽和脂肪酸、たとえばミリストレイン酸、パルミトレイン酸、サピエン酸(sapienic acid)、オレイン酸、リノール酸、α-リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、エルシン酸(erucic acid)、およびドコサヘキサエン酸、または飽和脂肪酸
、たとえばラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸およびセロチン酸(cerotic acid)が含まれる。
グリチルリチン酸(glycyrrhizic acid)はグリチルリチン酸(glycyrrhicic acid)、グリチルリチン(glycyrrhizin)またはグリチルリチン酸(glycyrrhizinic acid)としても知ら
れ、下記の構造をもつ:
および遊離30-COOH官能基とのコンジュゲート、ならびにグリチルリチン酸分子の炭水化
物部分におけるアミノ酸アルキルエステルの少なくとも1つの残基のコンジュゲートであ
る。具体的な誘導体の例は、たとえばKondratenko et al. (Russian Journal of Bioorganic Chemistry, Vol 30(2), (2004), pp. 148-153)中にある。
短鎖および中鎖脂肪酸は、より長い鎖をもつ脂肪酸と比較したそれらのより良好な水溶性のため、特に好ましい。
本発明によれば、溶液の賦形剤は非水性の溶液成分であり、それらはフォールディングすべき、またはアンフォールディングから保護すべき(ポリ)ペプチドではない。
である。これらの比の間にあるいかなる数値も明らかに本発明に含まれることは理解されるであろう。さらに、本明細書中で用いる約という用語は、明確に記載した比およびそれから±10%の偏差を含む。
本発明方法のさらに他の好ましい態様において、(ポリ)ペプチドは1以上の分子内ジ
スルフィド結合をもつ。
よって安定化できる。適切なシステイン残基は(ポリ)ペプチド中に自然に存在するか、あるいは適宜なアミノ酸をシステインに変異させることにより(ポリ)ペプチドに導入できる。たとえばWO 2009/007124に、scFvの免疫原ドメイン内へジスルフィド橋を導入すると、それらの特異性に影響を及ぼすことなく、あるいはそれらの親和性および機能性を低減することなく、かつこれらの分子の溶解性を喪失することなく、これらの分子の安定性が大幅に増大すると開示されている。
用語“生物学的に活性”は、(ポリ)ペプチドの自然に存在する活性に関する。生物活性は、個々の(ポリ)ペプチドに依存し、他の分子に対する結合親和性(たとえば、抗体、リガンドまたは転写因子について)、または触媒活性(たとえば、酵素について)を含む。たとえば抗体の生物活性には、それの抗原の特異的結合が要求される。これに関して、用語“生物学的に活性である”は、フォールディングまたはリフォールディングした(ポリ)ペプチド(すなわち、乾燥および再構成の後の)の生物活性であって、その(ポリ)ペプチドの自然に存在する活性の少なくとも50%、より好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも70%、最も好ましくは少なくとも80%であるものを表わす。より
好ましくは、フォールディングまたはリフォールディングした(ポリ)ペプチド(すなわち、乾燥および再構成の後の)の生物活性は、その(ポリ)ペプチドの自然に存在する活性の少なくとも90%、より好ましくは少なくとも100%である。
凍結乾燥(lyophilisation、freeze-dryingとも言う)は当技術分野で周知であり、有機
材料を凍結させ、その後、材料中の凍結水を固相から気相へ直接昇華させるのに十分な熱を加えながら周囲圧力を低下させる工程を含む。好ましくは、水分の再吸収を防止するために凍結乾燥製剤を次いでシールする。
より軽い湿った空気は排気パイプを通して除去される。
噴霧凍結乾燥も当技術分野で周知であり、凍結乾燥と噴霧乾燥に一般的な処理工程を組み合わせた方法である。本発明による溶液に装入した(ポリ)ペプチドを凍結媒体(たとえば、液体窒素)中へ霧化させると、これにより衝撃凍結した液滴の分散物が生成する。この分散物を次いで凍結乾燥装置で乾燥させる。
療法用生体分子、たとえばエリスロポエチン、酵素およびワクチンを安定化するために使用できる。生物医薬の懸濁液または溶液を真空下で、凍結点より高い、ただし100℃より
有意に低い温度で煮沸することにより、泡に変換する。この泡は材料の薄膜からなり、これから水を高温で効果的に除去できる。この方法は、低温での真空蒸発の原理に基づく。
きる。意外にも、本発明溶液の存在下では、(ポリ)ペプチドはそれぞれ活性およびそれらの構造統合性を失うことなくそれらの自然状態にリフォールディングしうることが示された。
すためにタンパク質製剤を殺菌するのを可能にする。その結果、無菌条件下での療法用タンパク質の調製に伴なう時間およびコストが削減される。
埋め込み溶液
種々のアミノ酸L-アラニン、L-アルギニン、L-グルタミン酸、グリシン、L-ヒスチジン、L-リジン1塩酸塩、およびL-トリプトファン-ならびに場合によりグリチルリチン酸-を
原液濃度100 g/Lになるように混和することにより、保護用埋め込み溶液を調製した。タンパク質を特異的に保護するために用いた最終溶液(1〜25 g/L)の重量:重量(w/w)比は>2:1であった。すべての成分が無毒性であった。アミノ酸は静脈内注入用として承認されている(Fong and Grimley)。グリチルリチン酸は慢性肝炎の治療に静脈内適用するために承認されており、それの安全性は幾つかの臨床試験で十分に記載されている。埋め込み溶液中にグリチルリチン酸を1〜10000μg/mLで使用できる。
開放多孔質医療用ポリウレタンフォーム(KCI、米国テキサス州サンアントニオ)を3 cm3の円筒形試料に切断し、4μg/mLの抗Fas IgM(クローンCH11)とのカップリングを1時間行なった。試料をリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)で4回洗浄した後、非特異的反応部位をブロックした。試料をH2Oで洗浄し、25 mg/mLの埋め込み溶液で30分間の埋め込み工程および後続の少なくとも90分間の乾燥を実施した。25 kGyのβ線照射(BGS、ドイツ、ブ
ルーフザル)で殺菌を実施した。
広角X線回折(XRD)を用いて、埋め込み溶液の乾燥層の形態を調べた。銅アノード(40
kV、30 mA、波長0.154 nm)およびシンチレーション計数計を備えたX線回折計XRD 3000 TT(ドイツ、ザイフェルト)を用いた。乾燥膜を試料キャリヤーに装入し、5°から45°
までの2θ角度範囲において0.05°2θのステップおよびステップ当たり2秒で分析した。
分析はCoriolis Pharma Service GmbH(ドイツ、ミューニッヒ)により実施された。
Mettler Toledo 821e(ドイツ、ギーセン)での示差走査熱量測定(DSC)を用いて、最大限に凍結濃縮した液体配合物のガラス転移温度(Tg')を測定した。Tg'試料を約10 K/分の冷却速度で-80℃まで冷却した。ベースラインの吸熱シフトの中間点をTg'として採用した。分析はCoriolis Pharma Service GmbH(ドイツ、ミューニッヒ)により実施された。
膜から光を反射させ、得られる反射スペクトルをある波長範囲にわたって分析すること
により、薄膜の特性を測定した(Filmetrics Inc.、ドイツ、ミューニッヒ)。膜の異な
る界面から反射した光は位相内または位相外の可能性があるので、これらの反射は光の波長ならびに膜の厚さおよび指数に応じて付加または減少する。その結果はその膜に特徴的な反射スペクトルの強度振動である。膜の厚さを測定するために、特定のソフトウェア(Filmetrics Inc.)を用いて、測定スペクトルに可能な限り一致する理論的反射スペクト
ルを計算した。このプロセスは、反射スペクトルがどのようにみえるはずであるかを公称積層膜(nominal film stack)に基づいて初期予測することから開始した。これには、異なる層の、および試料を含む支持体の、厚さおよび屈折率に関する情報が含まれていた。この理論的反射スペクトルを、次いで膜の特性により、測定スペクトルに対する最良適合が見出されるまで調整した。
落球粘度計(モデルAMVn、Anton Paar、ドイツ、オストフィルデルン)を用いて、25℃、角度α=60°で試料の粘度を測定した。AVMnは球が透明液体および不透明液体中を転がる時間を回転球原理に従って測定する。各測定は、10回の試験とそれに続く平均粘度計算からなっていた。この分析はCoriolis Pharma Service GmbH(ドイツ、ミューニッヒ)により実施された。
すべての小角X線散乱(SAXS)実験を、回転アノードジェネレーター(Nanostar,BRUKER AXS)により放射されるCu Ka線で実施した。このシステムはピンホールカメラおよび面検出器(VANTEC 2000)を備えていた。試料をステージホルダーに固定した。SAXS強度パ
ターンを試料-検出器距離109 cmで20分ないし6時間取得した。すべてのデータをバックグラウンド散乱に対して補正し、次いでラジアル平均して関数I(Q)を得た;ここで、Q=
(4π/λ)sinθは散乱ベクトルであり、2θは入射ビームと回折ビームの間の角度であ
り、λ=0.1542 nmはX線の波長である。ヒトIgM(2RCJ)(Perkins et al.)の相同溶液構
造を初期コンフィギュレーションとして選択し、そのSAXSにインハウスフィッティングコードを当てはめおよび適用した。MCアルゴリズムを用いて、それらの位置が相同モデルに関して2 nmのサイズ制限内にあるように制限してランダムに散乱を作製した。この相同モデルはこのようにSAXSデータによってリファインされたが、数値再構築操作の永久補正値(permanent corrective)として各工程後に用いられた。単量体および自己集合体に最終的に当てはめた散乱曲線が得られる。
Beta-Gamma Service(ドイツ、ブルーフザル)により25〜40 kGyのβ線照射を用いて殺菌を行なった。
感染性/不活性化試験のために、アデノウイルス5型、Adenoid 75株(American Type culture collection, ATCC-VR-5)をヒト肺癌細胞系A549(ATTC-CCL-185)で増殖させた。
ウイルスの増殖のために、37℃および5% CO2で、5%ウシ胎仔血清(FCS)を補充した最
小必須培地(MEM)において細胞を増殖させた。終末点滴定(96ウェルのマイクロタイタ
ープレートにおいて希釈液当たり8ウェル)により、ウェル当たり50μLのウイルス希釈液
および50μLのA549細胞(10〜15×103細胞)を用いてウイルス力価を測定した。この実験には、力価1.1×109の組織培養感染用量(tissue culture infectious dose)(TCID50)/mLを用いた。具体的には、体積50μLのウイルス懸濁液を37℃で無菌ポリスチロールチュ
ーブの底において乾燥させた。次いでこの乾燥ウイルスに50μLの埋め込み溶液を乗せ、
再び37℃で乾燥させた。25 kGyまたは40 kGyでのβ線照射の後(対照は照射しなかった)、ウイルス/保護溶液2層を1 mLのMEMに再懸濁した。上記に従ってウイルス力価を再び測定した。培養物を接種の7日後に細胞変性効果(cytopathic effect)(CPE)について観察
した。ウイルス対照を同等に、ただしβ線照射せずに処理した。ウイルス力価を、標準偏差を含むTCID50/mLとして表わす。力価低下をβ線照射後のウイルス力価と対照ウイルス力価の差として表わす。
ELISA:開放多孔質ポリウレタンフォームの表面に固定化したIgMの量を目視定量するために、酵素結合イムノソルベントアッセイ(ELISA)を開発した。検出抗体として西洋わ
さびペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲートしたヤギ-抗マウスIgM抗体を用いた。TMB(3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン;Sigma)を基質反応に用いた。
抗原を用いて実験を行なった。hFas:Fc発現プラスミド(ps299-hFasFc;Pascal Schneiderにより提供、スイス、ローザンヌ)を安定トランスフェクションしたチャイニーズハムスター卵巣細胞から、HiTrap Protein Aカラム1工程精製を用いて標準法に従って組換えhFas:Fcタンパク質を精製した。FasL仲介によるRKO細胞(ヒト大腸癌細胞系)の細胞死の阻害、およびヨウ化プロピジウム染色による低倍数体DNA含有細胞のフローサイトメトリ
ー定量(Nicoletti et al.)により、hFas:Fcの生物活性を調べた。
ペプチド;寄託no.P25445)を、Fmoc化学によって、セルロース膜上の活性PEGスペーサーにおいてMultiPep RS機器(Intavis、ドイツ、ケルン)での自動並行ペプチド合成により、先の記載に従って合成した(Brandt, Dietrich and Koch; Koch and Mahler)。抗体との相互作用試験を公開された方法に従って実施した(Hilpert, Winkler and Hancock; Koch and Mahler)。結合した抗体を化学発光イメージングにより視覚化した。N末端ビオチニル化をもつ選択した可溶性エピトープペプチドをDiana Imhof(Institute of Biochemistry, University of Jena, ドイツ)から得た。
すべての実験を少なくとも5回行なった。関連がある場合、データを平均±SEMとして提示する。統計分析をスチューデントのt検定により実施した(GraphPad Prism Program,version 5,GraphPad Software,カリフォルニア州サンディエゴ)。0.05未満のp値を統計的に有意とみなした。
糖類はそれらの溶解性および水素結合を形成するOH基のため一般に用いられるリオプロテクタントであるが、高濃度におけるそれらの急速な結晶化は明らかな欠点である(Y. Ha
n et al.)。初期モル比500:1(糖:タンパク質)であれば、この比は乾燥プロセスでさ
らに増大する。したがって、結晶化が起き、これにより糖分子の利用能が低下し、結果的にそれらが水素結合を提供する能力は低下する。本発明者らは、あるグリコシド系の植物代謝産物、たとえばグリチルリチン酸(図1)が適切なリオプロテクタントとして作用す
ることを見出した;これはおそらくグリコシドOH基の存在によるものであろう。
態)を形成し(Fuchs et al.)、これによりタンパク質が完全に乾燥するまでOH基を水素結合の形成のために提供する。選択したアミノ酸と組み合わせたグリチルリチン酸を含むガラス質状態の本発明溶液が凍結および乾燥に際して望ましくない微結晶形成の防止を補助するかどうかを調べるために、幾つかの実験法に従った(後記を参照)。
よるこの材料のコーティングは同じXRDパターンを生じ、これは追加の結晶化ピークをも
たない非晶質構造を示唆する(図2B)。本発明による溶液にグリチルリチン酸を補充すると、より顕著な非晶質性になり、コートされたキャリヤーの回折信号との干渉を生じた(図2C)。さらに、本発明による溶液の存在下で凍結乾燥した抗体固体は、非結晶質固体に一般的なハロー粉末XRDパターンを示した(図2D)。ピークが存在しないのは、分析した
試料が非晶質状態で存在していたことを示す。
非氷相の2つの熱転移が明らかになった(Tg':最大限に凍結濃縮された相のガラス転移):アミノ酸に典型的な-60℃におけるTg1'および-49℃におけるTg2'。凍結した本発明溶液のサーモグラムには特徴的な結晶化事象はみられなかった(図3A)。さらに、本発明による溶液の存在下で凍結乾燥した抗体固体のDSCサーモグラムは、何ら結晶化の証拠がない
非晶質固体と一致した(図3B)。
、スペクトル反射率分析を実施した(図4)。スペクトル反射率はマンニトール-アルブミン混合物中でのマンニトールの結晶化を示し(図4A)、これに対し本発明による溶液の存在下では均一な膜が形成された(図4B)。対応する振動曲線により、それぞれ結晶質および非晶質の層特性が確認された(データを示していない)。本発明による溶液の膜は1.15
mPa*(水:0.89 mPa*)の粘度、および観察された特徴的な“レインボー”効果(図4C)によれば低ナノメートル範囲の厚さを示した。
験した。
安定化
本発明による溶液に埋め込む目的は、たとえば貯蔵または殺菌操作に際してタンパク質の構造および機能統合性を保存することである。本発明溶液が乾燥後(図5A)、β線照射後および再水和後(図5BおよびC)のポリウレタン(PU)-IgMFasの三次元構造の統合性に及ぼす保護効果をSAXSにより分析した(Horejs, Gollner, et al.; Horejs, Pum, et al.)。
は、逆格子空間(reciprocal space)Q[nm-1]にIgMの特徴的な空間配列を描いた(図5A〜C,上パネル,大きな赤色オープンサークル)。これらの曲線から固定化IgM構造体を再構築するために、IgMパラメーターを数学的に自己相似性でありしたがってフラクタルであ
るとみなした(Horejs, Gollner, et al.; Horejs, Pum, et al.)。種々の長さ尺度でのIgM分子の自己相似性は、特徴的なY字様構造に基づく(図5,Y字モデル)。
固定化IgM分子と比較して調べた。処理していない固定化PU-IgMFasの信号は、PU単独のバックグラウンド信号と比較した場合、解像下限にあった。したがって本発明者らは、乾燥PU-IgMFasの形態係数の相対変化△P(Q)を計算した(図5A,上パネル,赤色、灰色およ
び黒色の小さいオープンサークル)。相対散乱コントラストはマイナスである。最大差は非処理PU-IgMFas試料をPU-IgMFas-NCと比較した際にみられた(図5A,上パネル,大きな
赤色オープンサークル)。埋め込みにより散乱コントラストはζ=3とζ=15 nmの間の特徴的な距離で低下した。これらの距離はIgM分子の平均エクステンションに対応し、IgM分子が完全に埋め込まれたことの証拠を提供する。
and Scarfi; Kapoor and Priyadarsini; Stadtman and Levine; Zbikowska, Nowak and Wachowicz)、あるいはタンパク質内の結合の破断をもたらし、したがって電子コントラストが低下するという事実を反映している可能性がある。PU-IgMFasを*PU-IgMFas-NCと比
較すると、散乱コントラストの相対差はPU-IgMFasと*PU-IgMFas試料の間にみられた差と比較して低かった(図5A,上パネル,小さい黒色オープンサークル)。
、初期コンフィギュレーションとしてのIgGユニットセルの既知の三次元構造(Protein Data Bank:2RCJ)(Perkins et al.)に基づいて、図5Aの灰色ビーズモデルにより表わされる乾燥した固定化IgM分子のIgGサブユニットを再構築することができた。さらにコンピューター操作により、五量体IgM分子内のIgGサブユニットの空間配列、特に2つの反対側IgGアームを繋ぐ環の寸法κp、続いてそれらの開口角θを決定した。フラクタル寸法Dは、5
つのIgGアームを含む特定の開口角θ(図5)に関係する。乾燥したすべての系が共通のフラクタル寸法D=3をもつ。本発明者らは、乾燥したすべての試料がIgGアームについてθ
≒0.51°またはθ≒29.22°の共通のIgM超構造をもつと予測した。乾燥試料*PU-IgMFas
、PU-IgMFas-NC、および*PU-IgMFas-NCの予測IgM構造モデルを図5Aに緑色ビーズモデル
により示す。
これらを図5Aの下部に示す(連結した小さいオープンサークル)。平均力の起伏が高いことは、安定化してはいるが圧壊したタンパク質構造の指標となる。本発明者らはこの高い起伏をすべての乾燥試料における水和シェルの欠如と関係づけた。
より破壊されたこと、およびPU-IgMFasの再水和の結果として水和シェルの再付加により
起きた角度θの増大を含む部分的に開放されたIgM超構造が生じたことの指標となる。対
応する平均力の起伏は低下し(図5Bの下部)、これはIgGアーム相互牽引がより少ないこ
とを示唆し、これはIgM超構造の部分的開放コンフィギュレーションと一致する。
た場合はよりいっそう良好であった。IgGアームの構造モデルを計算した(図5Cの灰色ビ
ーズモデル)。フラクタル寸法がD=1.5に低下するのに伴なって角度θは増大すると予想できる。本発明者らは埋め込みはタンパク質の再水和に好都合であると予測した。構造モデルと開放角θを組み合わせると、IgM分子についてかなり開放した構造モデルを再構築
できる。これを緑色ビーズモデルにより図5Cに示す。この場合も平均力を計算し、図5(
下部)に示した他の例より起伏が低いことを見出した。
次に、本発明溶液中への埋め込みによりIgMFasの機能性を保存できるかどうかを調べた。そのために、IgMFasをELISAプレートに固定化し、本発明溶液への埋め込みおよび/ま
たはβ線照射を伴なう状態と伴わない状態で、高特異性組換えヒトFas抗原フラグメント
(hFas::Fc)の結合を証明した(Schneider et al.)。
ない状態では、>25 kGyのβ線照射は抗原結合能の完全喪失によって立証されるようにIgMFasの機能損傷をもたらした。これと対照的に、本発明溶液中への埋め込みはIgMFasの抗原結合性に影響を及ぼさず、IgMFasを広範な濃度にわたって照射仲介損傷から保護した。IgMFasパラトープの機能統合性を分子レベルで調べるために、ペプチドアレイスクリーニングにより同定されたN末端ビオチニル化エピトープペプチド(ビオチン-RCKPNFFCNSTVCEHCDP-NH2)を用いた。IgMFasをELISAプレートに固定化し(β線照射および/または埋め込
みを伴なう状態と伴わない状態)、漸増量のエピトープペプチドを用い、続いてこれをストレプトアビジンHRPコンジュゲートアッセイにより検出して証明した(図6C)。参考の
ために、埋め込みおよびβ線照射を伴なわないエピトープペプチドに対するIgMFasのKDは160±13 nMと測定された(データを示していない)。図6Cに示すように、β線照射はエピトープペプチドに対するIgMFasの親和性を劇的に低下させ(KD=855±129 nM)、これは
著しい照射誘発損傷を立証する。これと対照的に、β線照射の前に埋め込みを行なうと抗体パラトープの統合性は完全に維持され、これはエピトープペプチドに対するIgMFasのKDが保存されたことにより立証される(188±25 nM)。
生物活性の維持をさらに調べるために、PU-IgMFas-NCがアポトーシスを誘導する能力(Logters et al.; Paunel-Gorgulu, Logters, et al.; Paunel-Gorgulu, Zornig, et al.; Scholz et al.)、およびFas感受性細胞を不活性化する能力(Zamzami and Kroemer)をインビトロで試験した。PU-IgMFas-NCによるアポトーシス誘導が受容体特異的であることを証明するために、Fas陽性およびFas陰性ジャーカットT細胞を標的として用いた。図7Cに示
すように、アポトーシス誘導はPU-IgMFas-NCと共にインキュベートした後のFas陽性細胞
においてのみ起きた。さらに、臨床関連設定でのPU-IgMFas-NCの潜在的な療法有効性を確認するために、重篤な障害をもつ外傷患者から得た高度に活性化したFas発現好中球(Paunel-Gorgulu, Zornig, et al.)(傷害重症度スコア>16)を用いて、患者の好中球におけるPU-IgMFas-NC仲介アポトーシスを確認した。具体的には、核染色(図7D)およびフローサイトメトリー(図7E)により立証されるように、これらの好中球をエクスビボにおいてPU-IgMFas-NCで4時間攻撃した後、好中球核のアポトーシス関連凝集(Zamzami and Kroemer)がPU-IgMFas-NC処理細胞にみられたが、非処理細胞にはみられなかった。
本発明溶液中へのポリペプチド埋め込みが、ポリペプチド製剤を汚染している可能性のある細菌またはウイルスを殺菌プロセスで不都合に保護する可能性があるかどうかを調べるために、機能化した埋め込みポリウレタンフォームの生物汚染度を測定した。PU-IgMFas-NCを収容した6つの異なるロットのそれぞれ>70のプラスチックハウジングを、体外免
疫調節に使用する予定で製造した。各ロットからの10の非殺菌PU-IgMFas-NC試料を基準として測定した。平均した生物汚染度は、モジュール当たり151±18個の細菌/真菌であっ
た。≧25 kGyのβ線照射により殺菌を実施し、殺菌性の評価をISO 11137 VDmax(Paunel-Gorgulu, Logters, et al.)法に従って実施した。基準線量(8.5±0.8 kGy)で照射した60すべてのPU-IgMFas-NCモジュールが無菌であることが認められ、これによりNCを伴なう殺菌の有効性が確認された。
チューブの底で乾燥させた。次いでこの乾燥ウイルスに50μLの本発明溶液を乗せ、再び37℃で乾燥させた。25 kGyまたは40 kGyでβ線照射した後(対照は照射しなかった)、ウ
イルス/保護溶液の2層を1 mLのMEMに再懸濁し、終末点滴定法により感染性ウイルスの力価を測定した(図8A/B)。並行して、IgMについて同じ実験設定を用いた(LO-MM-3;図8C/D)。
理論により拘束されたくはないが、本発明の発明者らは、図9に示すように、小分子間
、たとえばアミノ酸間(図9A)、アミノ酸とグリチルリチン酸の間(図9B)、およびアミノ酸/グリチルリチン酸とタンパク質構造体の間(図9C)の相互作用が本発明溶液の活性を仲介するという仮説を立てた。このモデルにおいて、グリチルリチン酸はタンパク質(イオン性相互作用および水素結合により)および小分子(たとえばアミノ酸と、グリコシド部分の3つのカルボキシル基およびアグリコンにより)の両方と相互作用する。優先排
除の概念によれば、グリチルリチン酸は非荷電分子と一緒に、水の存在下で水溶液の表面張力を高めることにより、タンパク質の周囲の水和シェルの浸透溶解(osmolytic)安定化
を支持することができる。この例では、種々のアミノ酸の間、およびアミノ酸とグリチルリチン酸の間の相互作用が、本発明溶液の強い非晶質性をもたらす。さらに、乾燥に際し
て、タンパク質はグリチルリチン酸および荷電アミノ酸と相互結合し、それが水分子を置換し、一方で優先結合の概念に従って水素結合によりタンパク質と相互作用する(図9C)。非晶質性は、特定の成分の抗酸化、ラジカル捕捉、および金属キレート化の特性との組合わせで、タンパク質の周囲のシェルの保護効果を支持することができる。
噴霧乾燥に際してタンパク質を安定化するための本発明溶液の有用性を確認するために、オボアルブミン(OVA)をモデルタンパク質として用い、本発明溶液と共に噴霧乾燥し
た。乾燥粉末を、次いで円偏光二色性(CD)、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)および蛍光分光分析により、統合性について特性分析した。
オボアルブミンはSigma(米国ミズーリ州セントルイス)から購入された。本発明溶液
は前記のものであった(埋め込み溶液を参照)。1-アニリノ-8-ナフタレンスルホネート
(ANS)もSigma(米国ミズーリ州セントルイス)から購入された。他のすべての試薬は分析グレードのものであった。
3%(w/v)のオボアルブミンを6%(w/v)の本発明溶液と共にBuechi B-290実験室用噴霧乾燥機(Buechi,スイス、フラヴィル)により噴霧乾燥した。入口空気温度を120℃に設定し、空気流は470 L/時であり、ポンプ速度は7.5 ml/分であり、出口空気温度は50
〜55℃であった。
SDS-PAGEをBio-Red Mini-Protean 3ゲル電気泳動システム(Bio-Red Laboratories,米国ハーキュレス)により実施した。10μlのタンパク質試料(0.5 mg/ml)を10μlの試料緩衝液と共にインキュベート(95℃,5分)した後に各ウェルに装入し、200 Vの電圧で約55分間の電気泳動を行なった。タンパク質をクーマシーブルー染色により視覚化した。
Jasco J-715分光偏光計(ジャスコインタナショナル株式会社,日本、日立市)を用い
て、噴霧乾燥の前と後のタンパク質の二次構造を評価した。CDスペクトルを、遠UV範囲(200〜250 nm)領域においてサンプリング間隔1.0 nmで0.05 cmの路程のキュベット内で記録した。本発明溶液はCDにおいて若干の信号をもつので、それを限外濾過装置(Vivaspin
6,Sartorius Stedim biotechから,ドイツ、ゲッチンゲン)によりタンパク質から分離した。すべてのスペクトルは2つのスキャンの平均であり、バックグラウンド補正および
正規化された。スペクトルを次いで純粋な/非処理タンパク質のものと比較した。
蛍光分光計(LS55,PerkinElmerから,米国ウォルサム)で1 cmの路程のキュベットを
用いて蛍光スペクトルを記録した。ANSを360 nmで励起することによりその固有蛍光を測
定し、390〜550 nmの範囲で発光スペクトルを記録した。蛍光スペクトルを溶媒のバック
グラウンドスペクトルに対して補正した。
OVA対照、および本発明溶液と共に噴霧乾燥したOVAの、SDS-PAGE分析を図10(A)に示
す。両試料に同じゲルパターンがみられ、低分子量バンドはみられなかった;これは、噴霧乾燥に際してOVA分子の分解が起きなかったことを示す。
OVA対照に類似し、これは再分散後に二次構造の変化がみられなかったことの指標となる
。
事象が起きなかったことの指標となる。
実施例9:凍結乾燥および40℃で6週間の貯蔵後のタンパク質の安定化
本発明の安定化および保護用の溶液(Stabilizing and Protecting Solution)(SPS)が療法用抗TNF-α抗体に及ぼす影響を判定するために、タンパク質マイクロアレイを簡便かつ迅速なツールとして採用した。UNIchip(登録商標)高密度タンパク質マイクロアレイ
は、抗体結合プロフィールの定量分析および特性分析のために設計されている(Feyen et al. 2008; Lueking et al. 2008; Lueking et al. 2005)。UNIchip(登録商標)マイクロアレイは384の前決定およびHisタグ精製した組換えヒトタンパク質をニトロセルロースコートしたスライドガラス上に含む。膜タンパク質、細胞内および細胞外タンパク質のセットを入手できる。抗体結合プロフィールのスクリーニングは、たとえば療法用抗体の特異性を解明するために、抗体の交差反応性による副作用を避けるために、または患者の血中の自己免疫抗体を検出するために、重要なツールである。
UNIchip(登録商標)タンパク質マイクロアレイ
タンパク質マイクロアレイはProtagenにより、ニトロセルロースコートしたスライド上に作製された(UNIchip(登録商標)AV-400 Premium,ロット0421104;Protagen,ドイツ、ドルトムント)。各マイクロアレイには、種々の遺伝子オントロジークラスのものである384の異なる組換えヒトタンパク質がプリントされていた。さらに、19のヒト血清タン
パク質および10の対照タンパク質がUNIchip(登録商標)AV-400マイクロアレイの内容に
含まれる。これらのタンパク質は大腸菌タンパク質発現ライブラリーに由来し、先に公表されたようにHisタグを用いて精製された(Feyen et al. 2008)。それぞれの組換えヒトタンパク質はバイオチップ上に平均量20 fmol/スポットで四重にプリントされていた。さ
らに、抗体産生のための宿主として一般に用いられる種々の種に由来するIgGが、二次抗
体による免疫検出のためのプロセス対照として種々の濃度でプリントされていた。このタンパク質バイオチップには、天然TNF-α(Sigma,ミズーリ州セントルイス)系列希釈液
も下記の濃度でプリントされていた:10、8、6、4、2、1、0.5、0.2、0.1、0.05、0.025
、0.01、0.001、0.0005、0.0001 pmol/μl。これは、それぞれスポット当たり20、16、12、8、4、2、1、0.4、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01、0.002 fmolのTNF-αに相当する。
別途指示しない限り、療法用抗TNF-α抗体を各実験につき2つのタンパク質バイオチッ
プ上でインキュベートした。先に決定された最適作業濃度2.5 mg/mlを用いた(Feyen et al. 2008)。
A/TBST中におけるインキュベーションの後、タンパク質マイクロアレイをTBST中で3回洗浄した。すべての抗体インキュベーション段階を200μlの体積で自動ハイブリダイゼーションステーション(Tecan HS 4800 Pro;Tecan,ドイツ、クライルスハイム)において実施した。結果の読出しを共焦点マイクロアレイリーダー(ScanArray 4000,Perkin Elmer
Life Science;カリフォルニア州サンノゼ)により、すべてのタンパク質マイクロアレ
イにつき同一設定を用いて実施した。
下記の試料を調製した:
a) 5 mgの療法用抗TNF-α抗体を本発明のSPS溶液(7種類のアミノ酸の混合物;Arg,Ala,Gly,Lys,Glu,His,Trp,pH5.2〜7.5)で再緩衝化したもの;
b) 5 mgの療法用抗TNF-α抗体をSPS無しで再緩衝化したもの;
各調製物をバイアルに1.25 mgで小分けし、凍結乾燥した。試料に高温および時間のス
トレスを付与した。再構成した後、試料をUNIchip(登録商標)AV-400により分析した。
対照として、療法用抗TNF-α抗体を製造業者の指示に従って再構成し、溶解状態で高温(40℃)および時間(6週間;t6)のストレスを付与した。
緩衝液を標準プロトコルに従って調製した。TBS緩衝液:10 mM Tris-HCl,pH7.5(Merck,ドイツ、ダルムシュタット),150 mM NaCl(Diagonal,ドイツ、ミュンスター)。ブロッキング緩衝液:10 mM Tris-HCl,pH7.5(Merck),150 mM NaCl(Diagonal),2% BSA(Sigma)。TBS-T緩衝液:20 mM Tris-HCl,pH7.5(Merck),0.5 M NaCl(Diagonal),0.1%(v/v)Tween 20(Sigma)。
イメージ解析をGenePix Pro 6.0(Molecular Devices,ドイツ、イスマニング)により実施した。
オフターゲット活性(OTA)を報告するために、各タンパク質の4つのタンパク質スポットの中央強度を決定した(四重試験)。
度の中央強度の平均を、対応するIgGプロセス対照(たとえば、宿主IgGタンパク質のスポットへの二次抗体の結合から得られる蛍光強度)を用いて正規化した。下記の計算を正規化に用いた:抗原の信号/IgGプロセス対照の平均信号×100=X単位。
ンパク質スポットの平均±SDを用いた(四重試験)。データグループ間の統計的有意性を判定するために、スチューデントのt検定を用いた。pが<0.05である場合にデータグループ間の差を統計的に有意とみなした。
マイクロチップ上にスポットすべき最適な抗原(TNF-α)濃度を決定するために、種々の量の標的抗原(範囲,0〜20 fmol/スポット)をプリントした。結合試験のために、療法用抗TNF-α抗体をマイクロチップに2.5 mg/mlの濃度で、再構築したばかり(t0)または6週間貯蔵後(t6)のいずれかの状態で添加した。蛍光信号強度により示される結合親
和性を経時的に測定した(図13)。図13Aに示すように、40℃で6週間貯蔵した後の抗TNF-α抗体の機能損失が濃度12、16および20 fmol/スポットでみられた(p<0.05)が、0〜8
fmol/スポットの範囲の抗体濃度ではみられなかった。たとえば、20 fmol/スポットを用いた場合、時点t0での正規化した信号強度単位は700〜800の範囲であり、これに対し6
週間後には信号強度の低下(450単位)がみられた。経時的な蛍光強度損失を定性的に図13Bに示す。
体機能の損失をモニターできる信号強度の範囲は安定化用配合物を試験するのに十分であることを示す。したがって、以下の実験においては抗原濃度20 fmol/スポットおよび2.5
mg/mlの療法用抗TNF-α抗体を標準として用いた。
抗体の安定化における本発明溶液(SPS)の有効性を評価するために、療法用抗TNF-α
抗体をSPS中または製造業者が推奨する緩衝液中に再緩衝化し、凍結乾燥した。凍結乾燥
した後、試料を高温で貯蔵し、0日目(t0)および40℃で6週間貯蔵後(t6)の指示した時点で水中に再構築し、マイクロアレイ試験に用いた。両配合物の機能活性を、t0において製造業者の元の緩衝液中に新たに再構成して流体配合物として貯蔵した抗体(対照)と比較した。t0およびt6で再構成した直後、SPSを用いずに凍結乾燥した調製物は最大779/889(正規化した信号強度;対照の108/123%)のより高い信号強度で反応した。再構成し
た抗体のt6調製物(凍結乾燥していないもの)は、低下した信号強度を示した(456単位
;63%)。これと対照的に、図14に示すように、SPSを含む配合物は時点t6でさらに増大
した信号強度(138%)を示した。
確認される。
9.4 結合特異性-オフターゲット活性(OTA)の数
SPS配合した療法用抗TNF-α抗体が非特異的的結合プロフィールを示すかどうかを調べ
るために、無関係なタンパク質に対する親和性をOTA数の計数により定量した。
結乾燥した試料の比較により、凍結乾燥段階で有意数の高いOTAが生じたことが示される
(表1)。しかし、SPS配合した試料のOTA数は、製造業者の推奨に従った配合物(t0で212のOTA;t6で286のOTA)と比較して、両方の時点t0およびt6で低下した(それぞれ36およ
び150のOTA)。
、OTAにより表わされる非特異的的結合の結果ではない。
OTA数の評価のほかに、抗体結合プロフィールを解明する際の重要な観点としての非特
異的的結合強度を定量した(概要については図15を参照)。
い平均OTA信号強度値をもつ212に及ぶOTAを示した(表1)。対照の平均OTA値プラスこの
平均の標準偏差の2倍を採用することにより、20%の有意性閾値を任意に決定した。詳細
には、わずか14のOTAが有意性閾値より高く、これは大部分のOTAが有意ではないとみなされたことを示す。T6の時点で、OTA数は10%の平均OTA値へのわずかな増大を伴なって286
にまで増加した。SPS配合した抗体はt0でわずか36のOTAを示した。しかし、平均信号強度は23%であり、したがって対照により得られたものよりわずかに高かった。さらに、15のOTAが信号強度値20%より高く、これには約50%の範囲のより高い値をもつOTAが含まれていた。ストレス条件下で、OTA数は150 OTAに増加し、これには20%より高い信号強度値を伴なう76のOTAが含まれていた(示していない)。全体として、これは平均信号強度値45
%となった(表1)。
た。ストレス条件下で、OTA数は135 OTAにまで増加し、平均信号強度83%を伴なっていた。
したがって、この例はSPS法による保護下でそれぞれのコグネイト抗原TNF-αの抗体認
識が改善されたことを示す。一方で凍結乾燥は特異的抗原への結合活性を改善し、他方で凍結乾燥後のOTAは有意に増加した;これに対し、SPSを配合した抗体は製造業者の推奨に従って配合した抗体と比較してより低いOTAを生じた。これらの結果は、SPS配合して凍結乾燥した療法用抗TNF-α抗体を再構成したものが、元の配合物を用いて同じ処理を行なった療法用抗TNF-α抗体と比較して、再構成後に有意に低いオフターゲット活性(OTA)を
誘発し、40℃で6週間の貯蔵後ですら結合強度を保存していることを示す。結論として、
保存された抗体機能性により示されるように、SPSのタンパク質安定化効果を確認できた
。
療法用抗ErbB2ヒト化IgG1抗体をモデル抗体として用いて、照射仲介によるタンパク質
損傷を防止するための本発明の安定化および保護用の溶液(SPS)の有効性を調べた。
ELISA
固定化した組換えErbB2抗原(Sino Biological Inc.,中国、北京)を用いたELISAアッセイを確立し、可溶性抗ErbB2抗体抗体(Roche Pharma AG,ドイツ、グレンザッハ-ワイ
レン)の抗原特異的結合を定量評価した。ErbB2抗原をマイクロタイタープレートにカッ
プリングさせた後、FCSおよびTween 20(Sigma-Aldrich,ドイツ、ミューニッヒ)を含有するブロッキング緩衝液を用いて遊離のタンパク質結合部位をブロックした。抗ErbB2抗
体を添加した後、プレートを洗浄し、アルカリホスファターゼコンジュゲートした二次抗体(Dianova,ドイツ、ハンブルク)を添加した。ErbB2への抗ErbB2抗体の特異的結合を
、測光法でアルカリホスファターゼ基質p-ニトロフェニルホスフェートの酵素変換により405 nmで検出した。時間および濃度に依存する発色反応により、機能性抗ErbB2抗体を定
量できる。
配合物を照射実験に際して陽性対照として用いた。
構成したハーセプチン(Herceptin)(20 ng/mL)について実施した。
フーリエ変換赤外分光分析FT-IR
抗ErbB2抗体の二次構造を、水銀-カドミウム-テルル化物(mercury-cadmium-telluride)(MCT)検出器、ダイヤモンド-ATR-ユニットDuraSampI/RII(商標)(SensIR)およびOPUS 65ソフトウェア(Bruker Optics)を備えた、FT-IR分光計Equinox 55(Bruker Optics
GmbH,ドイツ、エットリンゲン)により分析した。各スペクトルについて、240スキャンの蓄積を4 cm-1の解像度で4000から400 cm-1まで収集した。各実験の前に、対応する緩衝液および賦形剤溶液について基準スペクトルを記録して、バックグラウンド効果に対して補正した。二次派生スペクトルをOPUS-65ソフトウェアで計算し、最終タンパク質スペク
トルを13点関数で調整した(smoothed)。
非還元SDS-PAGEを用いて抗体配合物の凝集および断片化をモニターした。Novex XCell II Mini細胞系およびNovex NuPAGEビスTrisゲル(4〜12%)を用い;10ウェル、厚さ1 mm(Invitrogen,ドイツ、ダルムシュタット)、NuPAGE MOPS泳動緩衝液で分析を実施した
。再構成した凍結乾燥物を最終濃度0.4 mg/mLになるようにLDS試料緩衝液(Invitrogen
)中に希釈した。試料を95℃で10分間変性させ、次いで10μLの試料をゲルのウェルに装
填した。タンパク質の適用量は4μg/ウェルであった。一定の電圧200 Vで分離を行ない
、泳動時間は約90分間であった。
マイクロプレート凝集アッセイ(ProteoStat(登録商標);Enzo Life Sciences,米国
ニューヨーク州ファーミンデール)を製造業者の推奨に従って実施した。簡単に述べると、試料を凝集アッセイ用に周囲温度でアッセイ緩衝液中に調製した。タンパク質凝集のモニタリングおよび検出のためのProteoStat(登録商標)陽性対照(凝集したリゾチーム)および陰性対照(天然リゾチーム)を凍結乾燥粉末(それぞれ300μg)として供給し、500μlの脱イオン水中に再構成して、40μMの原液を調製した;これは4℃で数週間貯蔵できる。これらの溶液をアッセイ緩衝液中に1:2希釈(20μM)した後に適用した。再構成し
た抗ErbB2抗体試料(20 mg/mL)をアッセイ緩衝液中に希釈して4.5 mg/mLの濃度にした。対照として、再構成したばかりの抗ErbB2抗体(20 mg/mL)を4.5 mg/mLに希釈した。透明底96ウェルマイクロプレート(μClear black;Greiner,ドイツ、フリッケンハウゼン)に、これらのタンパク質溶液98μLを供給した。2μLの調製したばかりのProteoStat
(登録商標)検出試薬装填溶液を各ウェルに分配した。被験試料を入れたマイクロプレートを暗所で15分間、室温でインキュベートした。蛍光を融合蛍光マイクロプレートリーダーにより定量した(励起:550 nm;発光:603 nm;PerkinElmer,米国マサチュセッツ州
)。
タンパク質の凝集および分解をSE-HPLCにより定量した。分析は、UV-280 nm検出器(Malvern Instruments,英国ウースターシャー州)およびTSKゲルG3000SWXL 7.8×300 nmカ
ラム(トーソー・バイオサイエンス,日本、東京)を備えたHPLCシステムにより、30℃および流速0.5 mL/分で実施された。注入体積は50〜100μLであった。SE-HPLCの流動緩衝
液はダルベッコ(Dulbecco)のPBS pH7.1(PAA Laboratories,オーストリア、パシング
)であった。分子量標準品(BSA,Thermo Scientific;米国マサチュセッツ州ウォルサム)および偽緩衝液を各シーケンスに流した。凝集および断片化の量を、単量体ピークの曲線下面積、高分子量種の和および低分子量種の和との比較により%で決定した。
殺菌はSterigenics(Leuven,ベルギー)により25または40 kGyのβ線または線照射を
用いて実施された。標準照射プロトコルに対する改変として、試料の一部を-80℃で照射
した。
抗ErbB2抗体(20 mg/mL)を、SPS(40 mg/mL)pH6、元の配合物、およびpH6に調整したダルベッコのPBSに対して、Thermo Scientificから購入したSlide-A-Lyzer(登録商標
)透析カセット(カットオフ3.5 kDa;体積3〜12 mL)を用いて一夜透析した。透析は最
適安定性を確保するために凍結乾燥の直前に実施された。抗体試料の一部をSPSまたはPBS中での再緩衝化のために透析した。
凍結乾燥をEPSILON 2-6D(Martin Christ;ドイツ、オステローデ・アム・ハルツ)で
、下記の表2に示すプロトコルに従って行なった:
すべての実験を少なくとも三重に行ない、データを平均±SDとして表わす。SigmaStat 3.0を用いて、マン-ホイットニーの順位和検定を用いる非パラメーター解析を実施した。p<0.01で差を有意とみなした。
照射が機能性抗原結合に及ぼす影響を調べるために、抗ErbB2 ELISAを確立した。図17
は、固定化した組換えErbB2および再構成したばかりの抗ErbB2抗体を用いて確立した標準曲線を表わす。この標準曲線により、抗ErbB2抗体20 ng/mLを以下の実験のための標準濃度として選択した。
衝化し、凍結乾燥し、そしてELISAで試験した場合、抗体結合は115±13.7%であり、これに対し元の緩衝液中に再緩衝化した試料の抗原結合は95±5.2%であった(図2)。25 kGyでβ線およびγ線照射した後、SPS配合試料においてほぼ100%、元の緩衝液について83.2±6.4%〜87.4±1.9%の結合活性がみられた。試料を40 kGyで処理した場合、活性はSPS
配合試料において93.0±2.1%〜102.6±5.1%の範囲にあり、これに対し元の緩衝液につ
いては結合活性は63.19±2.1%〜71.8±4.5%の範囲にあった(図16)。
照射後の療法用抗ErbB2 IgG1抗体の分子構造の統合性を分析するために、照射した試料の凝集状態を対照と比較した。療法に適用する生物製剤の凝集物含量は可能な限り低くなければならず(たとえば2%未満)、規定遵守に必須のパラメーターである。半定量非還
元SDS-PAGE(図18)および蛍光に基づくマイクロプレートアッセイ(図19)により、抗ErbB2抗体の実質的な凝集物および分解生成物の形成を、25および40 kGyのβ線およびγ線
の両方の照射後に観察した。試料をSPS中で凍結乾燥および照射した場合、照射仲介によ
る凝集物および分解生成物は顕著に減少することが認められた。この半定量所見をサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)分析(図20)により確認した。SPS配合物と共に照射した試料について得られた選択したクロマトグラムを元の配合物およびPBS(陰性対照)と比
較したものを、図20Aおよび20B(拡大)に示す。約160 kDaの分子量をもつ無傷IgG1単量
体(M)に対応する主ピークは、保持体積8.5 mLで溶出する。二量体、三量体、四量体か
らなる高分子量凝集物(high molecular weight aggregat)(HMW)およびおそらくIgG単
量体のより高い分子量の凝集物の溶出範囲は、5.5〜8 mLにある。保持体積10〜11 mLでは、低分子量種(low molecular weight species)(LMW)の形のわずかな断片化の傾向がみ
られたにすぎない。HMW、LMWおよび単量体(M)のパーセント値を表3に挙げる。すべての実験において、SPS配合物は最大で20倍の凝集物および分解生成物の減少を生じた(p<0.05)。
凍結乾燥分子の二次構造を調べるために、FT-IR分析を実施した(図21)。すべてのス
ペクトルに1638 cm-1におけるアミド-I吸収バンドの変化はみられなかった。しかし、元
の配合物中および陰性対照PBS中に配合した乾燥抗体のスペクトルは、1547 cm-1におけるアミド-II吸収バンドのピーク位置および形状の両方においてかなりの変化を示し、これ
は凍結乾燥後にα-ヘリックス二次構造含量の実質的損失があるが、βシート含量には損
失がないことを示唆する。乾燥したSPS配合抗体については、二次構造の変化は検出され
なかった(図21および表4)。
おいて照射試料をSDS-PAGEおよび蛍光凝集アッセイにより分析した際に、有意の凝集が明らかになった。凝集物形成は副作用および認識されない免疫応答を誘発する可能性があるので、患者に対する重大なリスクである。したがって、療法用タンパク質の製造および貯蔵に際して、高いパーセントの単量体を保持することが必須である。抗ErbB2 IgG1抗体をSPS中に再配合するとこの重要な目標を達成できることが示された。
著しい凝集および分解を誘導するが、SPS配合した試料においては誘導しないことを示し
、したがってSDS-PAGEおよび蛍光凝集試験による所見が確認された。興味深いことに、40
kGyで照射した後ですらSPS配合した生体分子はこの目標に達し、高分子量凝集物の含量
は約2%以下であった。
込み
40 kGyのβ線照射に対する、多種多様な組成の本発明の保護溶液による、ヒト抗IL6-IgG抗体の保護を分析した。
検出した。図22に、抗原結合活性を非処理対照に対するパーセントで示す。7種類のアミ
ノ酸(アミノ酸混合物1:Ala,Arg,Gly,Glu,Lys,His,Trp)または5種類のアミノ酸
(それぞれ、アミノ酸混合物2:Ala,Arg,Gly,Glu,Lys、およびアミノ酸混合物3:Ala,Gly,Glu,His,Trp)を含む組成物を用いた。これらの実験により、長期貯蔵に対する認識されていない副作用(酸化感受性;吸湿性)をもつ可能性があるアミノ酸の除外は保護効果を低下させることが明らかになった。GAおよび/またはカルノシン、および/またはジペプチド(Gly-Tyr,Gly-GLy,Gly-Gln)をこれらの組成物に補充すると、組成物の
保護効果を高めることができた。
凍結乾燥した組換え乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)を、多種多様な組成の本発明による
保護溶液に、約1:2,5の酵素/賦形剤比で溶解し、続いて凍結乾燥した。凍結乾燥を100μlの体積で行ない、乾燥試料を40 kGyでβ線照射した。試料を再構成した後、酵素の還
元型補因子NADHがNADH+に酸化され、同時に基質ピルビン酸が乳酸に還元される際の吸収低下を340 nmでモニターすることにより、酵素LDH活性を測光法で測定した。酵素活性を
非処理対照に対するパーセントで表わす。7種類のアミノ酸(アミノ酸混合物1:Ala,Arg,Gly,Glu,Lys,His,Trp)または5種類のアミノ酸(アミノ酸混合物2:Ala,Arg,Gly,Glu,Lys)を含む組成物を用いた。グリチルリチン酸を、特にジペプチドであるカルノシンおよび他のジペプチドと組み合わせてこれらのアミノ酸混合物に補充すると、照射仲介による機能損失が種々の程度に救済された(表6)。
不活化インフルエンザA H1N1スプリットワクチンの供給業者の元の配合物を、2〜8℃で本発明による種々の組成の保護溶液と交換した。w/w(ワクチン/保護溶液の賦形剤)比は約1:50〜1:12.5であった。凍結乾燥を100μlの体積で行ない、凍結乾燥物を40 kGyのβ線照射で照射した。
(凍結乾燥後に既に完全な血球凝集活性喪失を示した)と対照的に、種々の組成の本発明溶液中で凍結乾燥したインフルエンザAスプリットワクチンの再構成後には血球凝集活性
がほぼ完全に保持されていた。
えた後、組成物のモル浸透圧濃度はより低く、したがって療法の目的に有益となる可能性がある。
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以下に、出願時の特許請求の範囲の記載を示す。
[請求項1]
乾燥中の(ポリ)ペプチドのアンフォールディングを防止し、および/または乾燥後の(ポリ)ペプチドの(リ)フォールディングを誘導するための方法であって、(ポリ)ペプチドを水溶液に埋め込む段階を含み、その際、水溶液は
(i)少なくとも3種類の異なるアミノ酸;または
(ii)少なくとも1種類のジペプチドもしくはトリペプチド
を含み、水溶液は
(a)糖類;ならびに
(b−i)タンパク質;および/または
(b―ii)変性作用化合物;ならびに
(c)シラン類
を含まないかまたは実質的に含まない方法。
[請求項2]
少なくとも3種類のアミノ酸が、
(i−a)グルタミン酸とグルタミンの組合わせ、および/または
(i−b)アスパラギン酸とアスパラギンの組合わせ
を含まない、請求項1に記載の方法。
[請求項3]
少なくとも3種類のアミノ酸が、下記の群:
(a)非極性、脂肪族R基をもつアミノ酸;
(b)極性、非荷電R基をもつアミノ酸;
(c)正に荷電したR基をもつアミノ酸;
(d)負に荷電したR基をもつアミノ酸;および
(e)芳香族R基をもつアミノ酸
から選択される、請求項1または2に記載の方法。
[請求項4]
水溶液が、下記の各群から選択される少なくとも1種類のアミノ酸:
(a)非極性、脂肪族R基をもつアミノ酸;
(b)極性、非荷電R基をもつアミノ酸;
(c)正に荷電したR基をもつアミノ酸;
(d)負に荷電したR基をもつアミノ酸;および
(e)芳香族R基をもつアミノ酸
を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
[請求項5]
水溶液が、少なくとも下記のアミノ酸:
(a)アラニン、グルタミン酸、リジン、トレオニンおよびトリプトファン;
(b)アスパラギン酸、アルギニン、フェニルアラニン、セリンおよびバリン;
(c)プロリン、セリン、アスパラギンおよび/またはアスパラギン酸、トレオニンおよびフェニルアラニン;
(d)チロシン、イソロイシン、ロイシン、トレオニンおよびバリン;あるいは
(e)アルギニン、グリシン、ヒスチジン、アラニン、グルタミン酸、リジンおよびトリプトファン;あるいは
(F)アラニン、アルギニン、グリシン、グルタミン酸、リジン
を含む、請求項1、3または4のいずれか1項に記載の方法。
[請求項6]
少なくとも1種類のアミノ酸が、天然の非タンパク源アミノ酸および合成アミノ酸からなる群から選択される、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
[請求項7]
水溶液がさらに、サポニンもしくは脂肪酸またはその誘導体を含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
[請求項8]
サポニンがグリチルリチン酸またはその誘導体である、請求項7に記載の方法。
[請求項9]
脂肪酸が短鎖および中鎖脂肪酸からなる群から選択される、請求項7に記載の方法。
[請求項10]
水溶液の賦形剤と(ポリ)ペプチドのw/w比が1:1〜500:1である、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
[請求項11]
(ポリ)ペプチドが組換え(ポリ)ペプチドである、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
[請求項12]
(ポリ)ペプチドが1以上の分子内ジスルフィド結合を有する、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
[請求項13]
(リ)フォールディングした(ポリ)ペプチドが生物学的に活性である、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
[請求項14]
乾燥が凍結乾燥、風乾、噴霧乾燥、噴霧凍結乾燥または発泡乾燥である、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
[請求項15]
請求項1(ii)に記載の少なくとも1種類のジペプチドが、カルノシン、グリシルトリロシン、グリシルグリシンおよびグリシルグルタミンからなる群から選択される、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
Claims (16)
- 水溶液中の(ポリ)ペプチドを乾燥させる際に、乾燥中の(ポリ)ペプチドのアンフォールディングを防止し、および、当該乾燥後の(ポリ)ペプチドを再構成する際に、(ポリ)ペプチドのリフォールディングを誘導するための方法であって、
(ポリ)ペプチドを水溶液に溶解する段階を含み、その際、水溶液は下記(a)群または(b)群の少なくとも一群のアミノ酸:
(a)アラニン、アルギニン、グリシン、グルタミン酸およびリジン;または、
(b)アラニン、グリシン、グルタミン酸、ヒスチジンおよびトリプトファン;
を含み、
前記水溶液が、
(A)0.1%(w/v)未満の糖類;および/または、
(B)0.1%(w/v)未満のタンパク質;および/または、
(C)0.01%(w/v)未満の変性作用化合物、ここで前記変性作用化合物は尿素、塩化グアニジニウム、およびドデシル硫酸ナトリウム(SDS)からなる群から選択されるものである;および/または、
(D)0.01%(w/v)未満のシラン類;
を含み、
前記乾燥が、凍結乾燥または噴霧凍結乾燥である、前記方法。 - 前記乾燥後の(ポリ)ペプチドの再構成が、請求項1に記載の水溶液とは異なる溶液中で行われる、請求項1に記載の方法。
- さらに、水溶液が少なくとも1種類のジペプチドまたはトリペプチドを含む、請求項1または2に記載の方法。
- アミノ酸が、
(i−a)グルタミン酸とグルタミンの組み合わせ、および/または、
(i−b)アスパラギン酸とアスパラギンの組み合わせ、
を含まない、請求項1に記載の方法。 - 少なくとも1種類のアミノ酸が、天然の非タンパク源アミノ酸および合成アミノ酸からなる群から選択される、請求項1または2に記載の方法。
- 水溶液がさらに、サポニンもしくは脂肪酸またはその誘導体を含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- サポニンがグリチルリチン酸またはその誘導体である、請求項6に記載の方法。
- 脂肪酸が短鎖および中鎖脂肪酸からなる群から選択される、請求項6に記載の方法。
- 水溶液に含まれる賦形剤と(ポリ)ペプチドのw/w比が1:1〜500:1であり、ここで、前記水溶液に含まれる賦形剤はアンフォールディングから保護すべき(ポリ)ペプチド以外の水溶液中に存在する成分である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- (ポリ)ペプチドが組換え(ポリ)ペプチドである、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- (ポリ)ペプチドが1以上の分子内ジスルフィド結合を有する、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- フォールディングおよび/またはリフォールディングした(ポリ)ペプチドが生物学的に活性である、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1(ii)に記載の少なくとも1種類のジペプチドが、カルノシン、グリシルトリロシン、グリシルグリシンおよびグリシルグルタミンからなる群から選択される、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- さらに、水溶液がβ−アラニン、および/またはN−アセチル−ヒスチジンを含む、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- (ポリ)ペプチドの三次元構造が、変性から維持または保護されるように、乾燥中の(ポリ)ペプチドを安定化する方法であって、
(ポリ)ペプチドを、有効量の少なくとも5種類の異なるアミノ酸を含む水溶液に溶解することを含み、ここで前記少なくとも5種類の異なるアミノ酸は少なくとも以下のアミノ酸:アラニン、アルギニン、グリシン、グルタミン酸およびリジン;または以下のアミノ酸:アラニン、グリシン、グルタミン酸、ヒスチジンおよびトリプトファン;を含み、
前記水溶液が、
(A)0.1%(w/v)未満の糖類;および/または、
(B)0.1%(w/v)未満のタンパク質;および/または、
(C)0.01%(w/v)未満の変性作用化合物、ここで前記変性作用化合物は尿素、塩化グアニジニウム、およびドデシル硫酸ナトリウム(SDS)からなる群から選択されるものである;および/または、
(D)0.01%(w/v)未満のシラン類;
を含み、
前記乾燥が、凍結乾燥または噴霧凍結乾燥である、前記方法。 - さらに、水溶液がβ−アラニン、および/またはN−アセチル−ヒスチジンを含む、請求項15に記載の方法。
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