CN114206316A - 用于生物治疗剂的赋形剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于稳定活性剂，特别是肽，多肽，核酸，病毒，病毒样颗粒，质子泵抑制剂和抗生素的赋形剂。所述赋形剂减少包含所述活性剂的制剂中的聚集物和/或颗粒形成。所述赋形剂是二羧酸二酰胺，其包含至少一个N‑H酰氨基基团，至少一个未取代或取代的N‑羟基乙基酰氨基基团和/或至少一个未取代或取代的N‑羟基甲基酰氨基基团。特别地，所述赋形剂为N,N,N’,N’‑四‑(2‑羟基乙基)己二酸酰胺。

Description

用于生物治疗剂的赋形剂
说明
本发明涉及用于稳定生物分子的新的赋形剂，所述生物分子特别是肽，多肽，核酸，病毒，病毒样颗粒和其他类型的活性剂，例如抗生素。所述赋形剂减少包含所述生物分子和活性剂的制剂中的聚集物和/或颗粒形成。
导致本申请的项目已获得欧盟Horizon 2020研究和创新计划的资助，该计划由Marie Sklodowska-Curie拨款协议No.675074资助。
背景
肽，多肽，核酸，病毒，病毒样颗粒和其他敏感生物分子通常用作例如药物中的活性剂，用于检测诊断中的生物标志物[1]，或用作多个技术领域中的酶[2]。用于药物中的生物分子的实例包括抗体和抗体衍生物，干扰素，凝固因子例如因子VIII，红细胞生成素，白细胞介素，血管内皮生长因子，腺伴随病毒和溶瘤疱疹病毒。用于诊断中的生物分子的实例包括抗体[3]。用作工业化酶的蛋白质和(多)肽的实例包括脂酶[4]或纤维素酶[5]。
当生物分子经受某些应力条件，如冷冻/融化，摇动，热，剪切力和/或光时，它们趋向于形成颗粒或聚集物[6]。由于不同的原因，不期望出现此类颗粒或聚集物。一方面，聚集通常会使生物分子失活，使其不再满足其预期功能[7]。另一方面，药物中颗粒或聚集物的存在通常与有害免疫反应的发生有关。就药物产品而言，对于每剂量的聚集物数量有严格的监管限制[8]。
因此，期望以在室温下是稳定的方式配制活性剂，例如生物分子。特别地，它们需要抵抗在生产，处理或运输过程中可能发生的摇动应力。
活性剂例如生物分子的稳定性会受到不同参数的影响，例如制剂的pH，缓冲物质和离子强度。此外，能够添加赋形剂，这有助于通过不同的机制稳定活性剂。
原则上，不同类型的赋形剂适合作为生物分子和其他类型活性剂的稳定剂[9]。例如，蛋白质例如人血清白蛋白经常用作稳定剂。然而，由于不同的原因，发现它们是不合需要的，因为它们可能会妨碍对要稳定的生物分子的分析。它们也很昂贵，并且━除非重组生产━必然带来生物风险，因为它们是从血液中产生的。表面活性剂如聚山梨醇酯或泊洛沙姆也经常存在于生物分子制剂中。它们在化学上是异质的，趋向于具有挥发性杂质特征，并且可以使生物分子氧化变性[10,11]。此外，长期研究表明，聚山梨醇酯会分解为游离脂肪酸，其作为颗粒形式沉淀[12]。因此，当需要它们确保稳定性时，表面活性剂经常用作稳定剂，因为找不到足够的替代品，但制剂科学家群体非常强烈期望摆脱聚山梨醇酯和/或用替代稳定剂替代它们。其他常用的赋形剂包括氨基酸，糖和盐。
关于稳定生物分子的广泛的现有技术是可利用的。然而，实际上，仅使用了几种类型的赋形剂。这些赋形剂几乎完全选自氨基酸，糖和糖醇以及表面活性剂。然而，尽管在稳定化方面有数十年的经验和数百篇出版物和专利，但是液体制剂中生物分子的稳定化仍然充满困难。某些生物分子根本不能充分稳定，或者即使在冷冻干燥后它们也仅表现出有限的稳定性，特别是它们在重构后仅在短时间内稳定。许多制剂还表现出特定的杂质，只能通过“床边过滤”去除。其他制剂表现出杂质，例如颗粒，纳米粒和/或聚集物，它们不超过管理部门和药典规定的限制，因此是可以容忍的。鉴于这些杂质的已知免疫原性，它们的质量不是最佳的，且应当改进。
因此，迫切需要额外的新稳定剂，特别是在防止聚集和/或颗粒形成的稳定领域。这主要是因为许多可利用的赋形剂在单独或组合使用时均存在缺点。例如，糖和氨基酸的作用主要与此类赋形剂的高浓度有关。如上所述，最广泛使用的表面活性剂，特别是聚山梨醇酯，由于杂质的存在，表现出自分解和催化活性剂和其他赋形剂的分解。然而，给它们难以定量，因为很难在如透析或过滤这样的操作步骤中耗尽或富集它们。它们会导致溶液起泡并加剧可浸出和可提取成分从表面的溶解。
发明概述
本发明人已经发现，来自二羧酸二酰胺类的化合物能够稳定液体制剂中的生物分子例如抗体或干扰素。特别地，表明当经受例如冷冻/融化应力，摇动应力或搅拌应力时，与不含赋形剂的制剂或含有相同浓度的已知赋形剂L-精氨酸或D(+)-海藻糖的制剂相比，生物分子制剂中这些物质的存在导致颗粒数量减少。在不含表面活性剂例如聚山梨醇酯的制剂中也观察到了稳定作用。
本发明的第一方面为二羧酸二酰胺(以下为“二酰胺”)在液体或干燥制剂中作为活性剂，特别是生物分子的稳定剂以减少聚集物和/或颗粒的形成的用途，其中所述二酰胺包含至少一个N-H酰胺基基团，即C(＝O)-N-H基团，至少一个未取代或取代的N-羟基乙基酰胺基基团和/或至少一个未取代或取代的N-羟基甲基酰氨基基团。
本发明的另外的方面为一种制剂，特别是含水液体制剂，其包含活性剂，特别是生物分子，和二羧酸二酰胺，其中所述二酰胺包含至少一个N-H酰胺基基团，即C(＝O)-N-H基团，至少一个未取代或取代的N-羟基乙基酰氨基基团和/或至少一个未取代或取代的N-羟基甲基酰氨基基团。
在某些实施方案中，二酰胺是羟基烷基二酰胺，即包含至少一个未取代或取代的N-羟基乙基酰氨基基团和/或至少一个未取代或取代的N-羟基甲基酰氨基基团的二酰胺。
在某些实施方案中，二酰胺具有式(I)的结构：
Figure BDA0003463794110000031
其中每个R1独立地选自H和C1-C10烃残基，所述烃残基任选地包含至少一个杂原子，
并且其中两个R1可以一起形成环，
条件是至少一个R1为H，式(II)的基团或式(III)的基团：
Figure BDA0003463794110000041
其中每个R2独立地选自H和C1-8烃残基，所述烃残基任选地包含至少一个杂原子，
且
其中A选自直链，支链或环状C1-C24烃残基，所述烃残基任选地包含至少一个杂原子。
发明详述
本发明能够通过添加如上所述的二酰胺以液体或干燥形式生产活性剂，特别是生物分子的稳定制剂。该制剂可用于例如工业酶催化，诊断，化妆品，分析或医药，包括人类医药和兽药。还存在更多可能的应用。
术语“稳定的”和“稳定化的”是指包含如上所述的二酰胺的制剂在经受应力时比不含赋形剂的制剂更不可能形成聚集物和/或颗粒。本发明在冷冻/融化应力，摇动应力和/或搅拌应力的情况下特别稳定。必须提到的是，这种定义明确但以某种方式的人工应力代表了—作为替代物—生物分子在制造过程，定期储存时间和处理过程组成部分中遇到的情况，且由此与此类生物分子和包含此类生物分子的产品的质量和稳定性高度相关。
本发明中涉及的“聚集物和颗粒”典型地在约1nm至约1mm的尺寸范围，如通过尺寸排阻色谱法(SEC)和FlowCam图像所确定的。
如本文所用，术语“活性剂”特别地是指生物分子，例如肽，包括修饰或环状肽，多肽，包括未糖基化和糖基化的，单体或多聚化多肽，核酸，包括寡核苷酸，DNA，RNA和核酸类似物，病毒，病毒样颗粒，和其他类型的活性剂，如，例如质子泵抑制剂和抗生素。
术语“肽”是指包含至少一个通过肽键连接的至多50个天然或非天然氨基酸的链的化合物。术语“多肽”是指包含至少一个通过肽键连接的51或以上个天然或非天然氨基酸的链的化合物。肽或多肽链可以通过共价键和/或非共价相互作用彼此结合或连接。
例如，本文所述的生物分子可以为治疗或酶促活性物质或病毒载体。生物分子的非限制性实例包括抗体和抗体衍生物，干扰素例如干扰素-α，干扰素-β和干扰素-γ，血液凝固因子例如因子VIII，红细胞生成素，细胞因子例如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，肿瘤坏死因子(TNF)例如TNF-α，白细胞介素例如白细胞介素2，白细胞介素和白细胞介素受体的激动剂和拮抗剂例如阿那白滞素，TNF家族和TNF家族受体成员的激动剂和拮抗剂，生长因子例如血管内皮细胞生长因子，胰岛素样生长因子，转化生长因子(TGF)，或骨形态生成蛋白，以及重组融合蛋白例如免疫球蛋白融合蛋白，酶例如脂酶，纤维素酶，腺伴随病毒或溶瘤疱疹病毒，任意种类的病毒样颗粒。生物分子还可以被聚乙二醇化或糖基化，与另一种活性剂缀合或可以以不同方式修饰它们。
如上所述的所有生物分子均为众所周知的，并且可以通过标准方法生产，例如通过化学合成或在生物系统中，例如细胞系统，例如大肠杆菌(E.coli)，酵母，哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢细胞或幼仓鼠肾细胞，随后进行纯化。
在本发明的一个优选实施方案中，生物分子选自抗体，包括不同类别的完整抗体例如IgG，IgM，IgA，IgD和IgE，修饰的抗体例如单链抗体，抗体片段和此类抗体的缀合物，例如与报道基团，药物活性基团例如细胞毒素或放射性基团的缀合物。例如，抗体为IgG抗体，例如曲妥珠单抗，利妥昔单抗或奥马珠单抗。
在本发明的另一个优选的实施方案中，生物分子选自免疫球蛋白融合蛋白，例如具有恒定免疫球蛋白结构域的细胞因子或生长因子的融合蛋白以及此类免疫球蛋白融合蛋白的缀合物，例如与报道基团，药物活性基团例如细胞毒素或放射性基团的缀合物。
在本发明的另一个优选的实施方案中，生物分子选自细胞因子，白细胞介素和干扰素，包括干扰素-α，干扰素-β和干扰素-γ及其缀合物。例如，细胞因子为G-CSF，且干扰素为干扰素-α。
在本发明的另一个优选的实施方案中，生物分子选自白细胞介素和白细胞介素受体的激动剂和拮抗剂，TNF家族和TNF家族受体成员的激动剂和拮抗剂及其缀合物。例如，生物分子为白细胞介素受体拮抗剂，例如阿那白滞素。
如本文所用，术语“活性剂”包括如上所述的生物分子和其他类型的药物活性剂例如质子泵抑制剂，例如奥美拉唑或泮托拉唑，或抗生素例如β-内酰胺类，大环内酯类，氨基糖苷类，喹诺酮类/氟喹诺酮类，糖肽类(万古霉素)，四环素类。
与已知的赋形剂相比，来自所述二酰胺类的本发明赋形剂是有利的。例如，它们在相对低的浓度下是有效的。它们是化学上明确定义的物质。它们在不同形式的应力后减少生物分子和其他类型活性剂的聚集。特别优选在机械应力例如摇动应力，搅拌应力，泵送应力，雾化应力，喷雾应力，滴落应力(dripping stress)或可能导致空穴化的溶液的跌落应力(dropping stress)的情况下使用赋形剂。
如本文所用，术语“二酰胺”是指二羧酸二酰胺，其中两个羧基作为羧酰胺(carboxamide)基团存在，且其中所述二酰胺包含至少一个N-H酰氨基基团，即C(＝O)-N-H基图，至少一个未取代或取代的N-羟基乙基酰氨基基团和/或至少一个未取代或取代的N-羟基甲基酰氨基基团。
N-羟基乙基酰氨基基团，N-羟基甲基酰氨基基团的取代基包括C1-C10烃残基，特别是C1-C6烃残基，且更特别地是C1-C2烃残基，其任选地包含至少一个杂原子，所述杂原子例如选自卤素即F，Cl，Br或I；N，O，S和/或P，特别地选自O。烃残基可以选自取代或未取代的烷基残基，其中术语“烷基”特别地包括甲基，乙基，异丙基，正丙基，叔丁基，异丁基或正丁基。烃，例如烷基残基可以未被取代或被卤素例如F，OH，OCH3和/或＝O取代。
在某些实施方案中，二酰胺在20℃在水中具有至少约0.02％(w/v)，至少约0.05％(w/v)，至少约0.1％(w/v)，至少约0.5％(w/v)或至少约1％(w/v)的溶解度，如根据OECD指南测试编号105通过柱洗脱方法测定的。优选地，根据欧洲药典的分类，二酰胺被认为是可溶的，充分可溶的或易溶的，该药典通过引用并入本文。
在某些实施方案中，二酰胺具有在约120Da至约600Da，例如约150Da至约350Da范围内的分子量。
在某些实施方案中，二酰胺在水中具有溶解性并且具有如上所述范围的分子量。
在某些实施方案中，二酰胺为如上所述的式(I)的化合物。
在式(I)中，R1选自H和C1-C10烃残基，特别是C1-C6烃残基，且更特别地是C1-C2烃残基，其任选地包含至少一个杂原子，所述杂原子例如选自卤素即F，Cl，Br或I；N，O，S和/或P，特别地选自O。烃残基可以选自取代或未取代的烷基残基，其中术语“烷基”特别地包括甲基，乙基，异丙基，正丙基，叔丁基，异丁基或正丁基。烃，例如烷基残基可以未被取代或被卤素例如F，OH，OCH3和/或＝O取代。
在两个残基R1形成环的情况下，该环典型地为碳环或杂环3-6元环。
在具体的实施方案中，R1不包含在pH范围为4-9的水溶液中携带电荷即正电荷和/或负电荷的任何基团，例如羧酸基团或氨基基团。
在式(I)的某些实施方案中，2，3或4个R1选自H，未取代或取代的式(II)的羟基乙基酰氨基基团和/或未取代或取代的式(III)的羟基甲基酰氨基基团。在某些实施方案中，2，3或4个R1选自H。在某些实施方案中，2，3或4个R1选自式(II)的基团。在某些实施方案中，2，3或4个R1选自式(III)的基团。
在式(I)的某些实施方案中，全部4个R1选自H，未取代或取代的式(II)的羟基乙基酰氨基基团和/或未取代或取代的式(III)的羟基甲基酰氨基基团。
在式(II)和或式(III)的基团中，每个R2可以独立地选自H和C1-C2烃残基，例如乙基或甲基残基，其中所述烃残基任选地包含至少一个杂原子，例如选自卤素即F，Cl，Br或I；N，O，S和/或P，特别地选自O。在具体的实施方案中，在式(II)和或式(III)的基团中，每个或至少一个R2为H，-CH3，-OH和/或＝O。
在某些实施方案中，R1选自
Figure BDA0003463794110000081
在某些实施方案中，A选自直链或支链C1-C6烃残基或环状C3-C6烃残基，所述烃残基任选地包含至少一个杂原子，例如选自卤素，即F，Cl，Br或I；N，O，S和/或P，特别地选自O。
在具体的实施方案中，R选自
Figure BDA0003463794110000082
m＝1-24
特别地，m＝1-6，例如1，2，3，4，5或6，更具体地，m为3，4或5。在m＝4的情况下，该化合物为己二酸二酰胺。
在另外的具体的实施方案中，R选自
Figure BDA0003463794110000083
其中每个R3独立地选自H，OH和C1-2烃残基，特别地选自H和C1-2烃残基，其中所述烃残基任选地包含至少一个杂原子，所述杂原子可以选自N，O，P和/或S。特别地，如果存在，所述杂原子为O。在某些实施方案中，至少8个，例如8，9或10个残基R3为H。
在一个具体的实施方案中，二酰胺为N,N,N’,N’-四(2-羟基乙基)己二酸酰胺(N1,N1,N6,N6-四(2-羟基乙基)-己二酰胺-CAS#6334-25-4)，根据欧洲药典的分类，其为充分可溶的：
Figure BDA0003463794110000091
N,N,N’,N’-四-(2-羟基乙基)己二酸酰胺和相关化合物的合成为众所周知的(参见，例如，US6235933B1和WO2011/110624，其内容通过引用并入本文)。
二酰胺的其他具体实例包括下列化合物：
N1,N1,N5,N5-四(2-羟基乙基)-戊二酰胺(CAS#114690-06-1)；
N1,N6-双(2-羟基乙基)-N1,N6-二甲基-己二酰胺(CAS#57843-54-6)；
N1,N6-双(2-羟基乙基)-N1,N6-双(2-羟基丙基)-己二酰胺(CAS#1918193-23-3)；
N1,N1,N7,N7-四(2-羟基乙基)-4,4-二甲基-庚二酰胺(CAS#331862-59-0)；和
N1,N1,N6,N6-四(2-羟基丙基)-庚二酰胺(CAS#57843-53-5)。
在某些实施方案中，二酰胺可以用作制剂中活性剂的稳定剂。制剂可以是任何物理形式，例如液体制剂，例如溶液，乳液，悬浮液或气雾剂，或固体或半固体制剂。二酰胺和含有它们的制剂也可以用作薄膜包衣衣料或其他种类的表面包衣衣料。
二酰胺通常通过溶解在水性介质中来添加到制剂中，但也可以以悬浮液的形式添加。这些实例不是最终的或限制性的，因为还有其他可能的方式将二酰胺和活性剂组合以稳定化。
在一个具体实施方案中，制剂是液体制剂，特别是水性制剂，且更特别地是水溶液。在进一步的具体实施方案中，所述制剂为液体制剂，其已经被干燥，例如通过冷冻干燥，风干，喷雾干燥，冷冻-喷雾干燥或泡沫干燥。这种干燥的制剂可以用适合的液体例如水性液体重构，并在重构后最终用于其预期目的。
制剂可以具有任意适合的pH。典型地，pH约为pH 4至约pH 9或约pH 6至约pH 8，例如约pH 7。
制剂还可以包含另外的赋形剂，例如防腐剂，洗涤剂，缓冲物质或等渗剂。
在某些实施方案中，制剂包含二酰胺作为稳定剂且不含另外的稳定剂。在某些实施方案中，制剂包含作为稳定剂的二酰胺与至少一种另外的稳定剂(即不同于二酰胺的稳定剂)的组合。所述至少一种另外的稳定剂可以选自糖例如葡萄糖，蔗糖或海藻糖，糖醇例如甘露糖醇或山梨糖醇，盐例如NaCl，氨基酸例如组氨酸，甲硫氨酸或精氨酸，和/或抗氧化剂例如含硫羟基的试剂，例如甲硫氨酸。
在本发明的一个具体的实施方案中，制剂不含表面活性剂。特别地，制剂不含聚山梨醇酯，泊洛沙姆，solutol HS15和/或离子表面活性剂例如SDS。
用于本发明的二酰胺的适合量易于由本领域普通技术人员确定。典型地，液体制剂中二酰胺的浓度可以在约1μmol/l至约1mol/l，约100mmol/l至约500mmol/l，约1mmol/l至约250mmol/l或约10mmol/l至约100mmol/l的范围内。
本发明中使用的活性剂的适合量可以由本领域普通技术人员容易地确定。典型地，液体制剂中活性剂的浓度范围可以在约0.01mg/ml至约300mg/ml，约0.1mg/ml至约200mg/ml或约1mg/ml至约150mg/ml的活性剂的范围内。在一个具体的实施方案中，活性剂的浓度为10mg/ml至100mg/ml。在更高浓度的活性剂中，防止聚集的稳定化极为重要，且还可以由新的赋形剂提供。
下列示例性实施方案为本说明书的组成部分：
1.二羧酸二酰胺作为活性剂的稳定剂的用途，其中所述二酰胺包含至少一个N-H酰氨基基团，至少一个未取代或取代的N-羟基乙基酰氨基基团和/或至少一个未取代或取代的N-羟基甲基酰氨基基团，
其中所述活性剂选自肽，多肽，核酸，病毒或病毒样颗粒，质子泵抑制剂和抗生素。
2.项目1的用途，其中所述二酰胺为式(I)的化合物：
Figure BDA0003463794110000111
其中每个R1独立地选自H和C1-C10烃残基，所述烃残基任选地包含至少一个杂原子，
并且其中两个R1一起可以形成环，
条件是至少一个R1为H，式(II)的基团或式(III)的基团：
Figure BDA0003463794110000112
其中每个R2独立地选自H和C1-8烃残基，所述烃残基任选地包含至少一个杂原子，
且
其中A选自直链，支链或环状C1-C24烃残基，所述烃残基任选地包含至少一个杂原子。
3.项目1或2的用途，其中所述活性剂稳定在液体制剂中，特别是在水溶液中。
4.项目3的用途，其中制剂中活性剂的浓度在约0.01mg/ml至约300mg/ml，约0.1mg/ml至约200mg/ml或约1mg/ml至约150mg/ml的范围内。
5.项目3-4中任一项的用途，
其中制剂中二酰胺的浓度在约1μmol/l至约1mol/l，约100mmol/l至约500mmol/l，约1mmol/l至约250mmol/l或约10mmol/l至约100mmol/l的范围内。
6.项目1-5中任一项的用途，
其中所述活性剂选自肽和多肽。
7.项目6的用途，
其中所述活性剂选自抗体例如IgG抗体，免疫球蛋白融合蛋白，干扰素例如干扰素-α，白细胞介素，白细胞介素受体，白细胞介素和白细胞介素受体的激动剂和拮抗剂，TNF家族和TNF家族受体成员的激动剂和拮抗剂，细胞因子和酶。
8.项目7的用途，
其中所述活性剂选自曲妥珠单抗，利妥昔单抗，奥马珠单抗，干扰素-α，G-CSF和阿那白滞素。
9.项目1-8中任一项的用途，作为药物，化妆品，诊断和/或分析中的稳定剂。
10.项目2-9中任一项的用途，
其中2，3或4个R1为H，式(II)的基团和/或式(III)的基团。
11.项目2-10中任一项的用途，
其中2，3或4个R1为式(II)的基团。
12.项目2-11中任一项的用途，
其中在式(II)和/或式(III)的基团中，每个R2独立地选自H和C1-2烃残基，所述烃残基任选地包含至少一个杂原子。
13.项目12的用途，
其中在式(II)和/或式(III)的基团中，每个R2为H。
14.项目2-13中任一项的用途，
其中在式(I)的化合物中，A选自直链或支链C1-C6烃残基或环状C3-C6烃残基，所述烃残基任选地包含至少一个杂原子。
15.项目1-14中任一项的用途，
其中所述二酰胺在20℃在水中具有至少约0.02％(w/v)，至少约0.05％(w/v)，至少约0.1％(w/v)，至少约0.5％(w/v)或至少约1％(w/v)的溶解度。
16.项目1-15中任一项的用途，
其中羟基烷基酰胺为N,N,N’,N’-四-(2-羟基乙基)己二酸酰胺。
17.项目1-16中任一项的用途，作为防止聚集和/或颗粒形成的稳定剂。
18.项目1-17中任一项的用途，作为防止因冷冻/融化应力，摇动应力和/或搅拌应力导致的聚集和/或颗粒形成的稳定剂。
19.制剂，包含活性剂和式(I)的化合物：
Figure BDA0003463794110000131
其中每个R1独立地选自H和C1-C10烃残基，所述烃残基任选地包含至少一个杂原子，
并且其中两个R1一起可以形成环，
条件是至少一个R1为H，式(II)的基团或式(III)的基团：
Figure BDA0003463794110000132
其中每个R2独立地选自H和C1-8烃残基，所述烃残基任选地包含至少一个杂原子，
其中A选自直链，支链或环状C1-C24烃残基，所述烃残基任选地包含至少一个杂原子，且
其中所述活性剂选自肽，多肽，核酸，病毒或病毒样颗粒，质子泵抑制剂和抗生素。
20.项目19的制剂，其为液体制剂，特别是水溶液。
21.项目19或20的制剂，
其中所述式(I)的化合物根据项目10-15中任一项定义。
22.项目19-21中任一项的制剂，
其中所述式(I)的化合物为N,N,N’,N’-四-(2-羟基乙基)己二酸酰胺。
23.项目19-22中任一项的制剂，
其中所述活性剂根据项目6-8中任一项定义。
24.项目19-23中任一项的制剂，其具有约pH 4至约pH 9或约pH 6至约pH 8的pH。
25.项目19-23中任一项的制剂，其包含二酰胺作为稳定剂且不包含另外的稳定剂。
26.项目19-23中任一项的制剂，其包含作为稳定剂的二酰胺与至少一种另外的稳定剂的组合，所述另外的稳定剂可以选自糖例如葡萄糖，蔗糖或海藻糖，糖醇例如甘露糖醇或山梨糖醇，盐例如NaCl，氨基酸例如组氨酸，甲硫氨酸或精氨酸，和/或抗氧化剂例如含硫羟基的试剂例如甲硫氨酸。
27.项目19-26中任一项的制剂，
其不含表面活性剂，特别是选自聚山梨醇酯，泊洛沙姆，solutol HS15或SDS的表面活性剂。
28.项目19-27中任一项的制剂，
其已经被干燥并且任选地已经被重构。
29.权利要求28的制剂，
其已经通过下列方式被干燥：
(a)冷冻干燥，
(b)风干，
(c)喷雾干燥，
(d)冷冻-喷雾干燥，或
(e)泡沫干燥。
30.项目19-29中任一项的制剂，用于药物，化妆品，诊断和/或分析。
31.项目30的制剂，用于药物。
本发明应通过下列实施例和附图更详细地解释。
图例
图1：3个冷冻/融化循环后的颗粒量。50mM磷酸盐缓冲液，pH 7.0；5mg/ml抗体IgG曲妥珠单抗。
图2：搅拌应力后的颗粒量。50mM磷酸盐缓冲液，pH 7.0；5mg/ml抗体IgG曲妥珠单抗。
图3：3个冷冻/融化循环后的颗粒量。50mM磷酸盐缓冲液，pH 7.0；1mg/ml干扰素-α-2a。
实施例
实施例1：材料和方法
测试溶液的生产：缓冲溶液由pH 7.0的50mM磷酸钠组成。通过IEX色谱法去除潜在的杂质和表面活性剂，并通过在100-200倍体积的缓冲溶液中透析历时24h，使蛋白质储备溶液从其他赋形剂中释放出来。3小时后和14小时后更新缓冲溶液。通过将500mM赋形剂溶于90％所需量的缓冲溶液中来制备测试赋形剂的储备溶液。此后，调节pH并加入剩余体积的缓冲溶液。然后，用0.22μm过滤器过滤溶液。加入相应量的蛋白质储备溶液。提供足够的均化。
冷冻/融化-循环：将含蛋白质的溶液填充入清洁的2R小瓶中并旋紧。将样品在Christ 2D-6冷冻干燥机中以2K/min的速率在3个循环中从20℃冷冻至-50℃，然后在室温下融化，直至整个样品达到液态，然后再开始该循环。
搅拌应力：将含蛋白质的溶液填充入清洁的2R小瓶中并旋紧。此后，将样品用磁力搅拌器(Variomag Poly 15，Thermofisher，3mm聚四氟乙烯-涂覆的搅拌棒)以200rpm搅拌2h。
流式成像显微镜检查：使用流式成像显微镜(FlowCam，Fluid ImagingTechnologies，Inc.，Scarborough，ME，USA)以10倍放大倍数测量165μl的样品溶液。
尺寸排阻色谱法(抗体)：通过Dionex Summit色谱系统分析样品。作为固相，使用Superdex 200Increase 10/300GL柱(GE Healthcare)。流动相为50mM磷酸盐溶液和200mMNaCl，pH 7.0。通过在280nm波长的UV信号的吸收来检测单体洗脱液。将回收率定义为应力前后单体峰吸收曲线下面积的比例。
尺寸排阻色谱法(干扰素-α-2a)：通过Dionex Summit色谱系统分析样品。作为固相，使用Superose 12 10/300GL柱(GE Healthcare)。流动相为50mM磷酸盐溶液和200mMNaCl，pH 7.0。通过在280nm波长的UV检测蛋白质浓度。
实施例2：用N,N,N’,N’-四-(2-羟基乙基)己二酸酰胺对IgG抗体(曲妥珠单抗)的稳定
分别向包含重组IgG抗体曲妥珠单抗的水溶液中添加N,N,N’,N’-四-(2-羟基乙基)己二酸酰胺(Ark Pharm Inc.)，L-精氨酸(J.T.Baker)或D(+)海藻糖(Sigma-Aldrich)，使得得到的溶液具有5mg/ml的IgG浓度并且包含50mM的赋形剂。使得到的溶液经受冷冻/融化应力和搅拌应力。
结果表明，经受应力的包含N,N,N’,N’-四-(2-羟基乙基)己二酸酰胺(化合物A)的制剂比包含标准赋形剂如甘油，NaCl或D(+)海藻糖的制剂或不含任何赋形剂的制剂含有更少的颗粒，且类似于L-精氨酸。聚山梨醇酯20在冷冻/融化实验之后产生甚至更少的颗粒，但这类赋形剂并不是优选的(图1和2)。
实施例3：用N,N,N’,N’-四-(2-羟基乙基)己二酸酰胺对干扰素-α-2a的稳定
将N,N,N’,N’-四-(2-羟基乙基)己二酸酰胺加入到包含干扰素-α-2a的水溶液中，使得得到的溶液具有1mg/ml的浓度并且包含50mM的赋形剂。使得到的溶液经受冷冻/融化应力。结果表明，经受应力的包含N,N,N’,N’-四-(2-羟基乙基)己二酸酰胺(化合物A)的制剂比不含任何赋形剂的制剂和含有精氨酸或聚山梨醇酯20的制剂含有更少的颗粒并含有与海藻糖类似的量(图3)。
实施例4：用N,N,N’,N’-四-(2-羟基乙基)己二酸酰胺对IgG抗体奥马珠单抗和利妥昔单抗的混合物的稳定
测试溶液的生产：缓冲溶液由20mM组氨酸缓冲液pH 6.0组成。通过在100-200倍体积的缓冲溶液中透析历时24h，使蛋白质储备溶液从其他赋形剂中释放出来。6小时后和20小时后更新缓冲溶液。通过将500mM赋形剂溶于90％所需量的缓冲溶液中来制备测试赋形剂的储备溶液。此后，调节pH并加入剩余体积的缓冲溶液。然后，用0.22μm过滤器过滤溶液。加入相应量的蛋白质储备溶液。提供足够的均化。
冷冻/融化-循环：将含蛋白质的溶液填充入清洁的6R小瓶中并旋紧。将样品在冰箱中从20℃冷冻至-70℃，分5个循环，然后在室温下融化，直到整个样品达到液态，然后再次开始该循环。
搅拌应力：将含蛋白质的溶液填充入清洁的6R小瓶中并旋紧。此后，将样品用磁力搅拌器(Variomag Poly 15，Thermofisher，5mm聚四氟乙烯-涂覆的搅拌棒)以200rpm搅拌2h。
视觉检查：根据欧洲药典中所述的方法目视检查每种制剂的3支小瓶。特别给予强调浊度的检测。
分别向包含重组IgG抗体利妥昔单抗或奥马珠单抗的水溶液中添加N,N,N’,N’-四-(2-羟基乙基)己二酸酰胺(Ark Pharm Inc.)，D(+)海藻糖(Sigma-Aldrich)，蔗糖和海藻糖或蔗糖与甲硫氨酸的混合物(Sigma-Aldrich)。得到的溶液具有10mg/ml的IgG浓度并且包含75mM的赋形剂。在蔗糖或海藻糖与甲硫氨酸的混合物的情况中，糖的浓度为50mM，且甲硫氨酸的浓度为20mM。使得到的溶液经受冷冻/融化应力和搅拌应力。
发现经受应力的包含N,N,N’,N’-四-(2-羟基乙基)己二酸酰胺(化合物A)的制剂比包含标准赋形剂如D(+)海藻糖或蔗糖的制剂或含有海藻糖与甲硫氨酸或蔗糖与甲硫氨酸的混合物的制剂含有更少的颗粒且具有更小的浊度。
实施例5：用N,N,N’,N’-四-(2-羟基乙基)己二酸酰胺和另外的赋形剂的混合物对IgG抗体利妥昔单抗和奥马珠单抗的混合物的稳定
测试溶液的生产，冷冻/融化-循环，搅拌应力的测量和视觉检查基本上如实施例4中所述进行。
将30mM浓度的N,N,N’,N’-四-(2-羟基乙基)己二酸酰胺(Ark Pharm Inc.)与30mM浓度的D(+)海藻糖(Sigma-Aldrich)的混合物或与30mM浓度的蔗糖的混合物分别制备成测试赋形剂水溶液，并且将在20mM组氨酸缓冲液pH 6.0中的重组IgG抗体利妥昔单抗或奥马珠单抗透析入这些溶液。作为对比，制备包含30mM或60mM浓度的海藻糖或蔗糖的溶液，并且将在20mM组氨酸缓冲液pH 6.0中的抗体透析入这些溶液。得到的溶液具有10mg/ml的IgG1浓度并且包含60mM的赋形剂，且经受冷冻/融化应力和搅拌应力。
发现经受应力的包含N,N,N’,N’-四-(2-羟基乙基)己二酸酰胺(化合物A)的制剂比包含标准赋形剂如单独的D(+)海藻糖或蔗糖的制剂含有更少的颗粒且具有更小的浊度。
实施例6：N,N,N’,N’-四-(2-羟基乙基)己二酸酰胺对G-CSF的稳定
测试溶液的生产，冷冻/融化-循环，搅拌应力的测定和视觉检查基本上如实施例4中所述进行。
缓冲溶液由10mM乙酸酸盐缓冲液pH 4.5组成，4小时后和16小时后更新。对于冷冻/融化循环和搅拌应力测定，使用2R小瓶。
分别向包含重组G-CSF的水溶液中添加N,N,N’,N’-四-(2-羟基乙基)己二酸酰胺(Ark Pharm Inc.)，D(+)海藻糖(Sigma-Aldrich)，蔗糖和海藻糖或蔗糖与甲硫氨酸的混合物(Sigma-Aldrich)作为测试赋形剂。得到的溶液具有1mg/ml的G-CSF浓度并且包含50mM的赋形剂。在蔗糖或海藻糖与甲硫氨酸的混合物的情况下，糖的浓度为50mM，且甲硫氨酸的浓度为20mM。使得到的溶液经受冷冻/融化应力和搅拌应力。
发现经受应力的包含N,N,N’,N’-四-(2-羟基乙基)己二酸酰胺(化合物A)的制剂比包含标准赋形剂如D(+)海藻糖或蔗糖的制剂或含有海藻糖与甲硫氨酸或蔗糖与甲硫氨酸的混合物的制剂含有更少的颗粒且具有更小的浊度。
实施例7：N,N,N’,N’-四-(2-羟基乙基)己二酸酰胺对阿那白滞素的稳定
测试溶液的生产，冷冻/融化-循环，搅拌应力的测定和视觉检查基本上如实施例4中所述进行。
缓冲溶液由20mM柠檬酸盐缓冲液pH 6.5组成。将样品搅拌3h。
向包含重组阿那白滞素的水溶液中添加N,N,N’,N’-四-(2-羟基乙基)己二酸酰胺(Ark Pharm Inc.)，D(+)或海藻糖(Sigma-Aldrich)或聚山梨醇酯80作为测试赋形剂。得到的溶液具有50mg/ml的阿那白滞素浓度并且包含50mM赋形剂。在聚山梨醇酯80的情况下，其浓度为0,05％。得到的溶液经受冷冻/融化应力和搅拌应力。
发现经受应力的包含N,N,N’,N’-四-(2-羟基乙基)己二酸酰胺(化合物A)的制剂比包含海藻糖的制剂含有更少的颗粒且具有更小的浊度，并且比包含聚山梨醇酯80的制剂含有约同样低量的颗粒且具有约同样低的浊度。
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doi:10.1021/acs.molpharmaceut.5b00311.

Claims (15)

1.二羧酸二酰胺作为活性剂的稳定剂的用途，其中所述二酰胺包含至少一个N-H酰氨基基团，至少一个未取代或取代的N-羟基乙基酰氨基基团和/或至少一个未取代或取代的N-羟基甲基酰氨基基团，
其中所述活性剂选自肽，多肽，核酸，病毒或病毒样颗粒，质子泵抑制剂和抗生素。
2.权利要求1的用途，其中所述二酰胺为式(I)的化合物：
Figure FDA0003463794100000011
其中每个R1独立地选自H和C1-C10烃残基，所述烃残基任选地包含至少一个杂原子，
并且其中两个R1一起可以形成环，
条件是至少一个R1，例如1，2，3或4个R1为H，式(II)的基团或式(III)的基团：
Figure FDA0003463794100000012
其中每个R2独立地选自H和C1-8烃残基，特别地选自C1-C2烃残基，所述烃残基任选地包含至少一个杂原子，
且
其中A选自直链，支链或环状C1-C24烃残基，特别地选自直链或支链C1-C6烃残基或环状C3-C6残基，所述烃残基任选地包含至少一个杂原子。
3.权利要求1或2的用途，其中所述活性剂稳定在液体制剂中，特别是在水溶液中，特别地，其中(i)制剂中活性剂的浓度在约0.01mg/ml至约300mg/ml，约0.1mg/ml至约200mg/ml或约1mg/ml至约150mg/ml的范围内，和/或其中(ii)制剂中二酰胺的浓度在约1μmol/l至约1mol/l，约100mmol/l至约500mmol/l，约1mmol/l至约250mmol/l或约10mmol/l至约100mmol/l的范围内。
4.权利要求1-3中任一项的用途，
其中所述活性剂选自抗体例如IgG抗体，抗体衍生物，免疫球蛋白融合蛋白，干扰素，白细胞介素，白细胞介素受体，白细胞介素和白细胞介素受体的激动剂和拮抗剂，TNF家族和TNF家族受体成员的激动剂和拮抗剂，细胞因子和酶。
5.权利要求4的用途，
其中所述活性剂选自曲妥珠单抗，利妥昔单抗，奥马珠单抗，干扰素-α，G-CSF和阿那白滞素。
6.权利要求1-5中任一项的用途，作为药物，化妆品，诊断和/或分析中的稳定剂。
7.权利要求1-6中任一项的用途，
其中所述二酰胺在20℃在水中具有至少约0.02％(w/v)，至少约0.05％(w/v)，至少约0.1％(w/v)，至少约0.5％(w/v)或至少约1％(w/v)的溶解度。
8.权利要求1-7中任一项的用途，
其中所述二酰胺为N,N,N’,N’-四-(2-羟基乙基)己二酸酰胺。
9.权利要求1-8中任一项的用途，作为防止聚集和/或颗粒形成的稳定剂，特别是作为防止因冷冻/融化应力，摇动应力和/或搅拌应力导致的聚集和/或颗粒形成的稳定剂。
10.制剂，包含活性剂和式(I)的化合物：
Figure FDA0003463794100000031
其中每个R1独立地选自H和C1-C10烃残基，所述烃残基任选地包含至少一个杂原子，
并且其中两个R1一起可以形成环，
条件是至少一个R1，例如1，2，3或4个R1为H，式(II)的基团或式(III)的基团：
Figure FDA0003463794100000032
其中每个R2独立地选自H和C1-8烃残基，例如1，2，3或4个R1为H，所述烃残基任选地包含至少一个杂原子，
其中A选自直链，支链或环状C1-C24烃残基，特别地选自直链或支链C1-C6烃残基或环状C3-C6残基，所述烃残基任选地包含至少一个杂原子，且
其中所述活性剂选自肽，多肽，核酸，病毒或病毒样颗粒，质子泵抑制剂和抗生素。
11.权利要求10的制剂，其为液体制剂，特别是水溶液。
12.权利要求10或11的制剂，
其中式(I)的化合物为N,N,N’,N’-四-(2-羟基乙基)己二酸酰胺。
13.权利要求10-12中任一项的制剂，
其中所述活性剂根据权利要求4或5中任一项定义。
14.权利要求10-13中任一项的制剂，
其不含表面活性剂，特别是选自聚山梨醇酯，泊洛沙姆，solutol HS15或SDS的表面活性剂。
15.权利要求10-14中任一项的制剂，用于药物。
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