KR20230014737A - 바이러스 안정화제, 바이러스 안정화제용 젤라틴 가수분해물 및 바이러스 함유 조성물 - Google Patents

바이러스 안정화제, 바이러스 안정화제용 젤라틴 가수분해물 및 바이러스 함유 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR20230014737A
KR20230014737A KR1020227044891A KR20227044891A KR20230014737A KR 20230014737 A KR20230014737 A KR 20230014737A KR 1020227044891 A KR1020227044891 A KR 1020227044891A KR 20227044891 A KR20227044891 A KR 20227044891A KR 20230014737 A KR20230014737 A KR 20230014737A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
virus
gelatin
stabilizer
days
sample
Prior art date
Application number
KR1020227044891A
Other languages
English (en)
Inventor
가쓰로 하기와라
마사타카 이다
요스케 히라오카
프랑소와 마리 응가코 카지
가즈키 고타니
히로시 쓰카모토
Original Assignee
니타 젤라틴 가부시키가이샤
각코우호우진 라쿠노 가쿠엔
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 니타 젤라틴 가부시키가이샤, 각코우호우진 라쿠노 가쿠엔 filed Critical 니타 젤라틴 가부시키가이샤
Publication of KR20230014737A publication Critical patent/KR20230014737A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/04—Preserving or maintaining viable microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10321—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
    • C12N2710/16721—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
    • C12N2720/00011—Details
    • C12N2720/12011—Reoviridae
    • C12N2720/12021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18611—Respirovirus, e.g. Bovine, human parainfluenza 1,3
    • C12N2760/18621—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

바이러스 안정화제는, 젤라틴 가수분해물과 수성 미디엄으로 이루어지는 바이러스 안정화제로서, 상기 바이러스 안정화제는, 상기 젤라틴 가수분해물을 1질량% 이상 20질량% 이하 포함하고, 상기 젤라틴 가수분해물은, 중량 평균 분자량이 10000 이하이며, 상기 젤라틴 가수분해물은, 등전점의 pH가 4.0 이상 7.0 이하이다.

Description

바이러스 안정화제, 바이러스 안정화제용 젤라틴 가수분해물 및 바이러스 함유 조성물
본 발명은, 바이러스 안정화제, 바이러스 안정화제용 젤라틴 가수분해물 및 바이러스 함유 조성물에 관한 것이다.
바이러스의 보존 및 수송은, 감염력 등의 바이러스의 능력의 유지를 위해, 또는 그 저하를 막기 위해, 일반적으로 -80~-60℃의 환경이 필요하다고 여겨진다. 혹은, 실온에서 바이러스를 보존 및 수송하는 경우, 바이러스를 포함하는 제제(製劑)를 동결 건조품으로 하는 것이 필요해진다. 이와 같이 바이러스의 보존 및 수송은, 종래부터 번잡해지는 것이 알려져 있다. 이에 대해 일본국 특허공개 2013-035861호 공보(특허문헌 1)는, 냉장 온도(예를 들어 2~8℃)에서 안정성을 갖는 냉장고 안정형 인플루엔자 바이러스 조성물을 개시하고 있다.
일본국 특허공개 2013-035861호 공보
상기 특허문헌 1은, 0.5~2% 젤라틴 가수분해물 등을 포함하는 조성물에 의해, 인플루엔자 바이러스주의 냉장 온도에서의 안정적인 보존 및 수송을 달성한 것을 개시하고 있다. 그러나 상기 특허문헌 1은, 25℃ 전후의 실온에서 상기 바이러스주의 안정적인 보존 및 수송이 달성 가능한지 여부에 대해서는 개시하고 있지 않다. 상기 특허문헌 1에 의하면, 등전점이 9 부근인 돼지 A형 젤라틴으로부터 상기의 젤라틴 가수분해물을 얻고 있기 때문에, 당해 젤라틴 가수분해물은, 바이러스 표면의 특정 단백질과 강하게 상호 작용함으로써, 바이러스의 실온에서의 안정적인 보존 및 수송이 곤란해진다고 추정된다. 또한 -80~-60℃의 환경 하에서 보존한 바이러스를 포함하는 제제 등을, 사용하기 위해 가열에 의해 졸화하여, 냉장 온도(2~8℃) 또는 실온으로 되돌린 경우, 감염력 등의 바이러스의 능력의 저하를 피할 수 없는 것이 공지이다. 따라서, 번잡한 조작을 필요로 하지 않으며, 또한 냉장 온도(2~8℃) 및 25℃ 전후의 실온 양자에서 감염력 등의 바이러스의 능력을 저하시키지 않고 바이러스를 포함하는 제제 등을 보존 및 수송하는 것을 가능하게 하는 재료는 아직 실현되지 않아, 그 개발이 갈망되고 있다.
이상의 점에 비추어 보아, 본 발명은, 냉장 온도(2~8℃) 및 25℃ 전후의 실온 양자에 있어서 바이러스의 능력의 저하를 억제함으로써, 냉동 장치 등을 요하지 않고 바이러스를 포함하는 제제 등의 보존 및 수송을 가능하게 하는 바이러스 안정화제, 바이러스 안정화제용 젤라틴 가수분해물 및 바이러스 함유 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 예의 검토한 결과, 본 발명에 도달했다. 즉, 우선 등전점의 pH가 5 부근인 젤라틴을, 소정의 중량 평균 분자량이 되도록 가수분해함으로써 얻은 젤라틴 가수분해물에 주목했다. 또한 당해 젤라틴 가수분해물을 소정 농도로 포함하는 제제에 바이러스를 포함시킨 경우, 냉장 온도(2~8℃) 및 25℃ 전후의 실온 양자에 있어서 감염력 등의 바이러스의 능력의 저하를 억제할 수 있고, 따라서 냉동 장치 등을 요하지 않고 바이러스를 포함하는 제제 등을 안정적으로 보존 및 수송할 수 있는 것을 발견하여, 본 발명을 완성시켰다.
본 발명은, 이하와 같은 특징을 갖는다.
〔1〕 본 발명에 따른 바이러스 안정화제는, 젤라틴 가수분해물과 수성 미디엄으로 이루어지는 바이러스 안정화제로서, 상기 바이러스 안정화제는, 상기 젤라틴 가수분해물을 1질량% 이상 20질량% 이하 포함하고, 상기 젤라틴 가수분해물은, 중량 평균 분자량이 10000 이하이며, 상기 젤라틴 가수분해물은, 등전점의 pH가 4.0 이상 7.0 이하이다.
〔2〕 상기 젤라틴 가수분해물은, 중량 평균 분자량이 6000 이하인 것이 바람직하다.
〔3〕 상기 젤라틴 가수분해물은, 알칼리 처리 젤라틴의 가수분해물인 것이 바람직하다.
〔4〕 상기 바이러스 안정화제는, 상기 젤라틴 가수분해물을 2질량% 초과 10질량% 이하 포함하는 것이 바람직하다.
〔5〕 상기 수성 미디엄은, 완충 작용을 갖는 염을 포함하는 것이 바람직하다.
〔6〕 상기 수성 미디엄은, 자당, 유당, 소르비톨, 이노시톨, 트레할로스, 만니톨, 말티톨, 크실리톨, 에리트리톨 및 글리세롤로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 당류를 포함하는 것이 바람직하다.
〔7〕 상기 수성 미디엄은, 메티오닌, 아르기닌, 트립토판, 글루타민 및 글루탐산으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 아미노산을 포함하는 것이 바람직하다.
〔8〕 본 발명에 따른 바이러스 안정화제용 젤라틴 가수분해물은, 중량 평균 분자량이 10000 이하이며, 또한 등전점의 pH가 4.0 이상 7.0 이하이다.
〔9〕 상기 바이러스 안정화제용 젤라틴 가수분해물은, 액체 또는 분체인 것이 바람직하다.
〔10〕 본 발명에 따른 바이러스 함유 조성물은, 상기 바이러스 안정화제와, 바이러스를 포함한다.
〔11〕 상기 바이러스는, 엔벨로프를 갖는 DNA 바이러스, 엔벨로프를 갖지 않는 DNA 바이러스, 엔벨로프를 갖는 RNA 바이러스 및 엔벨로프를 갖지 않는 RNA 바이러스로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종을 포함하는 것이 바람직하다.
〔12〕 상기 바이러스는, 유전자 도입되어 있는 것이 바람직하다.
〔13〕 상기 바이러스 함유 조성물은, 25℃에서 21일간 보존한 경우의 바이러스 역가의 로그 감소값과, -80℃에서 21일간 보존한 경우의 바이러스 역가의 로그 감소값의 차가 1.5log 이하인 것이 바람직하다.
〔14〕 상기 바이러스 함유 조성물은, 4℃에서 210일간 보존한 경우의 바이러스 역가의 로그 감소값과, -80℃에서 210일간 보존한 경우의 바이러스 역가의 로그 감소값의 차가 1.0log 이하인 것이 바람직하다.
〔15〕 상기 바이러스 함유 조성물은, 동결 융해를 3회 반복한 경우의 바이러스 역가의 로그 감소값이 0.3log 이하인 것이 바람직하다.
상기에 의하면, 냉장 온도(2~8℃) 및 25℃ 전후의 실온 양자에 있어서 바이러스의 능력의 저하를 역제함으로써, 냉동 장치 등을 요하지 않고 바이러스를 포함하는 제제 등의 보존 및 수송을 가능하게 하는 바이러스 안정화제, 바이러스 안정화제용 젤라틴 가수분해물 및 바이러스 함유 조성물을 제공할 수 있다.
이하, 본 발명에 따른 실시 형태(이하, 「본 실시 형태」라고도 기재한다)에 대해서, 더 상세하게 설명한다. 여기서 본 명세서에 있어서 「A~B」라는 형식의 표기는, 범위의 상한 하한(즉 A 이상 B 이하)을 의미하고, A에 있어서 단위의 기재가 없이, B에 있어서만 단위가 기재되어 있는 경우, A의 단위와 B의 단위는 같다. 본 명세서에 있어서 「바이러스 역가」란, 검체(본 명세서에 있어서 「바이러스 함유 조성물」) 중의 바이러스가 세포에 감염 가능해지는 최저 농도, 즉 최고의 희석 배율을 말한다. 또한 바이러스 역가가 「저하」된다는 것은, 상기의 희석 배율이 저하되는 것을 말하며, 감염 가능해지는 상기의 최저 농도가 상승하는 것을 의미한다. 본 명세서에 있어서 「젤라틴」의 용어에 대해서는, 물질명, 젤라틴 겔 및 젤라틴 용액을 말하는 경우에 각각 이용하는 경우가 있다. 또 「젤라틴 가수분해물」의 용어에 대해서도, 상기 젤라틴과 마찬가지로, 젤라틴 가수분해물의 용액을 말하는 경우에 이용하는 경우가 있다.
〔바이러스 안정화제〕
본 실시 형태에 따른 바이러스 안정화제는, 젤라틴 가수분해물과 수성 미디엄으로 이루어지는 바이러스 안정화제이다. 상기 바이러스 안정화제는, 상기 젤라틴 가수분해물을 1질량% 이상 20질량% 이하 포함한다. 또한 상기 젤라틴 가수분해물은, 중량 평균 분자량이 10000 이하이다. 상기 젤라틴 가수분해물은, 등전점의 pH가 4.0 이상 7.0 이하이다. 이러한 특징을 구비함으로써, 본 실시 형태에 따른 바이러스 안정화제는, 냉장 온도(2~8℃) 및 25℃ 전후의 실온 양자에 있어서 바이러스 역가의 저하를 억제할 수 있고, 따라서 바이러스 안정화제와 바이러스를 포함하는 바이러스 함유 조성물을 구성한 경우, 당해 바이러스 함유 조성물을 냉동 장치 등을 요하지 않고 안정적으로 보존 및 수송할 수 있다.
＜젤라틴 가수분해물＞
상기 바이러스 안정화제는, 상술한 바와 같이 젤라틴 가수분해물을 포함한다. 본 명세서에 있어서 「젤라틴 가수분해물」이란, 젤라틴 및 콜라겐 양쪽 또는 어느 한쪽을 가수분해함으로써 얻어지는 펩티드의 집합체(가수분해물)를 말한다. 즉 「젤라틴 가수분해물」은, 일반적으로 콜라겐 펩티드 또는 콜라겐 가수분해물이라고 칭해지는 펩티드의 집합체와 등가인 것을 의미한다. 그 중에서, 본 실시 형태에 따른 바이러스 안정화제에 포함되는 젤라틴 가수분해물은, 상기한 바와 같은 중량 평균 분자량 및 등전점의 pH를 갖는다. 또한 젤라틴 가수분해물은, 상술한 바와 같은 펩티드의 집합체를 의미하기 때문에, 펩티드쇄를 구성하는 아미노산 서열에 있어서, 글리신이 3 잔기마다 반복되는 일차 구조를 갖는 등의 콜라겐 및 젤라틴과 같은 특징을 갖고 있다.
본 명세서에 있어서 「젤라틴」이란, 콜라겐의 삼중 나선 구조가 열 변성, 산 변성 등에 의해 풀린 폴리펩티드, 그 화학 수식체 및 그 약학상 허용되는 염을 의미한다. 구체적으로는, 이하의 제1군~제6군으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종을 유래로 하는 콜라겐을, 탈지 처리, 탈회 처리, 산 또는 알칼리 처리, 열수 추출 처리 등의 종래 공지의 처리를 실시함으로써 얻을 수 있다. 젤라틴은, 미생물을 이용한 발효법에 의해 얻은 폴리펩티드, 화학 합성 또는 유전자 재조합 조작에 의해 얻은 리컴비넌트 폴리펩티드 또는 합성된 폴리펩티드여도 된다. 또 「콜라겐」이란, 이하의 제1군~제6군으로 분류되는 척추동물의 피부 등에 있어서의 세포 외 기질(基質)을 유래로 하는 단백질을 말한다. 콜라겐은, 3개의 펩티드쇄로 이루어지는 오른쪽으로 감긴 나선 구조를 갖고, 그 펩티드쇄를 구성하는 아미노산 잔기는, 글리신 잔기가 3 잔기마다 반복되는 일차 구조(소위 콜라겐 유사 서열)를 갖고 있다.
제1군：소의 가죽, 피부, 뼈, 연골 및 힘줄로 이루어지는 군
제2군：돼지의 가죽, 피부, 뼈, 연골 및 힘줄로 이루어지는 군
제3군：양의 가죽, 피부, 뼈, 연골 및 힘줄로 이루어지는 군
제4군：닭의 가죽, 피부, 뼈, 연골 및 힘줄로 이루어지는 군
제5군：타조의 가죽, 피부, 뼈, 연골 및 힘줄로 이루어지는 군
제6군：물고기의 뼈, 가죽 및 비늘로 이루어지는 군
여기서 상기 폴리펩티드(젤라틴)의 「화학 수식체」란, 젤라틴을 구성하는 아미노산 잔기에 있어서의 아미노기, 카르복실기, 히드록시기 또는 티올기 등이 화학 수식된 폴리펩티드를 의미한다. 화학 수식을 받은 젤라틴은, 물에 대한 용해성, 등전점 등을 변화시킬 수 있다. 구체적으로는, 젤라틴에 있어서의 히드록시프롤린 잔기의 히드록시기에 대해서는, O-아세틸화 등의 화학 수식을 실행할 수 있다. 젤라틴에 있어서의 글리신 잔기의 α-카르복실기에 대해서는, 에스테르화, 아미드화 등의 화학 수식을 실행할 수 있다. 젤라틴에 있어서의 프롤린 잔기의 α-아미노기에 대해서는, 폴리펩티딜화, 숙시닐화, 말레일화, 아세틸화, 탈아미노화, 벤조일화, 알킬술포닐화, 알릴술포닐화, 디니트로페닐화, 트리니트로페닐화, 카르바밀화, 페닐카르바밀화, 티올화 등의 화학 수식을 실행할 수 있다.
젤라틴의 화학 수식의 구체적 수단 및 처리 조건은, 종래 공지의 화학 수식 방법을 적용할 수 있다. 히드록시프롤린 잔기의 히드록시기의 화학 수식에 대해서는, 수용매 중 또는 비수용매 중에서 무수 아세트산을 작용시키는 것 등에 의해, 예를 들어 O-아세틸화를 실행할 수 있다. 글리신 잔기의 α-카르복실기의 화학 수식에 대해서는, 메탄올로의 현탁 후에 건조 염화수소 가스를 통기하는 것 등에 의해, 예를 들어 에스테르화를 실행할 수 있다. 글리신 잔기의 α-카르복실기의 화학 수식에 대해서는, 카르보디이미드 등을 작용시킴으로써 아미드화를 실행할 수 있다.
또한 상기 폴리펩티드(젤라틴)의 「유도체」에는, 젤라틴에 관능기를 도입한 젤라틴 유도체, 및 젤라틴과 락트산, 글리콜산 등과의 공중합체, 젤라틴과 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜의 공중합체 등이 포함되는 경우가 있다. 젤라틴 유도체로서는, 젤라틴에 대해 구아니딜기, 티올기, 아미노기, 카르복실기, 황산기, 인산기, 알킬기, 아실기, 페닐기, 벤질기 등의 관능기를 도입한 유도체를 예시할 수 있다.
상기 폴리펩티드(젤라틴)의 「약학상 허용되는 염」이란, 약학상 허용되며, 또한 원래의 폴리펩티드(젤라틴)의 원하는 활성(예를 들어, 겔화능)을 갖는 염을 의미한다. 약학상 허용되는 염으로서는, 예를 들어 염산염, 황산염, 인산염 및 브롬화수소산염 등의 무기산염, 아세트산염, 메탄술폰산염, 벤젠술폰산염, p-톨루엔술폰산염, 숙신산염, 옥살산염, 푸마르산염 및 말레산염 등의 유기산염, 나트륨염, 칼륨염 및 칼슘염 등의 무기 염기염, 트리에틸암모늄염 등의 유기 염기염 등을 예시할 수 있다. 상법에 따라 젤라틴 중의 특정 펩티드를 약학상 허용되는 염으로 할 수 있다.
젤라틴은, 많은 생물이 보유하는 콜라겐에서 유래하는 폴리펩티드이기 때문에, 생체 적합성이 우수하다. 이 때문에 상기 콜라겐 및 젤라틴을 가수분해함으로써 얻어지는 젤라틴 가수분해물도, 생체 적합성이 우수하여, 의약 용도의 바이러스 안정화제의 일 성분으로서 적합하다.
젤라틴 가수분해물은, 용매(예를 들어 물)에 용해한 경우, 25℃ 전후의 실온 하에서는 물론, 2~8℃의 환경 하에서도 겔화하지 않고, 졸의 상태를 유지한다. 따라서 상기 바이러스 안정화제는, 25℃ 전후의 실온에서 사용할 때에 졸화를 위한 가열 조작이 불필요해진다. 본 실시 형태에 있어서 「졸」이란, 분산질과 분산매로 이루어지는 분산계에 있어서, 분산매가 액체 상태인 분산계를 의미한다. 「겔」이란, 분산질과 분산매로 이루어지는 분산계에 있어서, 분산질이 가교 구조를 형성하고, 분산계 전체로서 유동성을 잃은 상태를 의미한다.
젤라틴 가수분해물은, 상술한 바와 같이 젤라틴 및 콜라겐 양쪽 또는 어느 한쪽을 가수분해함으로써 얻어진다. 이 경우의 「가수분해」에는, 산을 이용하는 가수분해, 염기를 이용하는 가수분해, 효소를 이용하는 가수분해, 및 열을 이용하는 가수분해가 모두 포함된다. 젤라틴 가수분해물은, 불순물의 오염을 방지하는 관점에서, 열을 이용하는 가수분해에 의해 얻는 것이 바람직하다. 또한 젤라틴 및 콜라겐 양쪽 또는 어느 한쪽을 효소를 이용하여 가수분해하는 경우, 상기 효소로서는, 예를 들어 콜라게나제, 티올프로테아제, 세린프로테아제, 산성 프로테아제, 알칼리성 프로테아제, 메탈로프로테아제 등을 들 수 있다. 상술한 효소는, 이들을 단독으로 또는 복수 조합하여 이용할 수 있다. 상기 티올프로테아제로서는, 식물 유래의 키모파파인, 파파인, 브로멜라인, 피신, 동물 유래의 카텝신, 칼슘 의존성 프로테아제 등을 들 수 있다. 상기 세린프로테아제로서는, 트립신, 카텝신 D 등을 들 수 있다. 상기 산성 프로테아제로서는, 펩신, 키모트립신 등을 들 수 있다.
사용하는 효소로서는, 젤라틴 가수분해물을 의약에 이용하는 것을 고려하면, 병원성 미생물 유래의 효소 이외의 효소(예를 들어, 비병원성 미생물에서 유래하는 효소)를 이용하는 것이 바람직하다. 상기 효소의 유래가 되는 비병원성 미생물로서는, Bacillus Iicheniforms, Bacillus subtillis, Aspergillus oryzae, Streptomyces, Bacillus amyloliquefaciens 등을 들 수 있다. 상기 효소는, 1종의 상술한 비병원성 미생물에서 유래하는 효소를 이용해도 되고, 복수 종의 상술한 비병원성 미생물에서 유래하는 효소를 조합하여 이용해도 된다. 효소 처리의 구체적인 방법은, 종래부터 알려져 있는 방법을 이용하면 된다.
또한 「젤라틴 가수분해물」을, 상기 젤라틴으로부터 1종의 효소를 단독으로 이용한 가수분해에 의해 얻는 경우, 당해 효소는 콜라게나제가 아닌 것이 바람직하다. 상기 젤라틴을 콜라게나제 단독으로 가수분해한 경우, 아미노산 서열의 N 말단이 글리신이 되는 특정 펩티드가 주성분(50질량% 초과)이 될 가능성이 있기 때문이다. 상기 젤라틴 가수분해물은, 2종 이상의 펩티드로 이루어지는 집합체인데, 그 조성에 있어서 상기의 특정 펩티드는 50질량% 미만이 된다.
젤라틴 가수분해물은, 상술한 방법에 의해 젤라틴 및 콜라겐 양쪽 또는 어느 한쪽을 가수분해한 후, 정제함으로써 액체로서 얻을 수 있다. 또한 상기 액체를 공지의 수단에 의해 가열 건조 또는 동결 건조함으로써 분체로서 얻는 것도 가능하다.
(농도)
바이러스 안정화제는, 상기 젤라틴 가수분해물을 1질량% 이상 20질량% 이하 포함한다. 바이러스 안정화제에 포함되는 상기 젤라틴 가수분해물의 농도가 1질량% 미만인 경우, 당해 바이러스 안정화제와 바이러스를 포함하는 바이러스 함유 조성물을 구성했을 때, 바이러스 역가의 저하를 억제하는 작용이 사소해지므로, 원하는 효과를 나타내는 것이 곤란해진다. 바이러스 안정화제에 포함되는 상기 젤라틴 가수분해물의 농도가 20질량%를 초과하는 경우, 당해 바이러스 안정화제는, 조작성이 악화될 우려가 있다. 바이러스 안정화제는, 바이러스 역가의 저하를 보다 억제하는 관점에서, 상기 젤라틴 가수분해물을 2질량% 초과 10질량% 이하 포함하는 것이 바람직하다. 바이러스 안정화제 중의 상기 젤라틴 가수분해물의 농도는, 하이드록시프롤린 정량 등의 공지의 방법에 의해 측정할 수 있다.
(중량 평균 분자량)
상기 젤라틴 가수분해물은, 중량 평균 분자량이 10000 이하이다. 상기 젤라틴 가수분해물은, 중량 평균 분자량이 6000 이하인 것이 바람직하다. 상기 젤라틴 가수분해물은, 중량 평균 분자량이 5000 이하인 것이 더 바람직하다. 이로 인해 바이러스 안정화제는, 2~30℃ 정도의 환경에 있어서 졸 상태를 유지할 수 있다. 또한 바이러스 안정화제와 바이러스를 포함하는 바이러스 함유 조성물을 구성한 경우, 상기 조성물 중에서 젤라틴 가수분해물은, 바이러스가 응집하는 것을 억제할 수 있고, 따라서 바이러스 역가의 저하를 억제할 수 있다. 상세한 메커니즘은 불분명하지만, 젤라틴 가수분해물은, 중량 평균 분자량이 상술한 범위인 경우, 분자 중의 친수성 영역 및 소수성 영역 양자가 분자 표면측(외측)에 노출되어, 엔벨로프의 유무와는 관계없이 바이러스의 표면과 적당한 강도의 상호작용을 하는 것이 가능해지기 때문에, 젤라틴 가수분해물이 바이러스의 표면을 피복함으로써 보호할 수 있다고 추정되기 때문이다.
상기 젤라틴 가수분해물의 중량 평균 분자량이 10000을 초과하는 경우, 2~8℃에 있어서 겔화 할 우려가 있다. 젤라틴 가수분해물의 중량 평균 분자량의 하한은, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 글리신의 분자량인 75이다.
상기 젤라틴 가수분해물의 중량 평균 분자량은, 이하의 측정 조건 하에서 겔 여과 크로마토그래피를 실행함으로써 구할 수 있다.
기기：고속 액체 크로마토그래피(HPLC)(도소 주식회사 제조)
컬럼：TSKGel(등록상표) G2000SWXL
컬럼 온도：30℃
용리액：40질량% 아세토니트릴(0.05질량% TFA를 포함한다)
유속：0.5mL/min
주입량：10μL
검출：UV220nm
분자량 마커：이하의 3종을 사용
Cytochrom C Mw：12384
Aprotinin Mw：6512
Bacitracin Mw：1423
구체적으로는, 상기 젤라틴 가수분해물을 포함하는 0.5g 상당의 바이러스 안정화제를 약 100ml의 증류수에 첨가하고, 교반한 후, 0.2μm 필터를 이용하여 여과함으로써, 중량 평균 분자량을 측정하는 시료(피측정물)를 조제한다. 이 피측정물을 상술한 겔 여과 크로마토그래피의 조건에 의거하여 측정함으로써, 상기 젤라틴 가수분해물의 중량 평균 분자량을 구할 수 있다.
(등전점)
상기 젤라틴 가수분해물은, 등전점의 pH가 4.0 이상 7.0 이하이다. 상기 젤라틴 가수분해물의 등전점의 pH는 4.0~5.5인 것이 바람직하고, pH 4.0 이상 4.8 이하인 것이 보다 바람직하다. 그러한 범위의 등전점의 pH를 갖는 젤라틴 가수분해물은, 알칼리 처리를 실시한 콜라겐을 가수분해함으로써, 혹은 알칼리 처리를 실시한 콜라겐으로부터 얻어진 젤라틴(소위 알칼리 처리 젤라틴)을 가수분해함으로써 효율적으로 얻을 수 있다. 즉 상기 젤라틴 가수분해물은, 알칼리 처리 젤라틴의 가수분해물인 것이 바람직하다. 특히 상기 젤라틴 가수분해물은, 등전점이 pH 4.8~5.5 정도인 알칼리 처리 젤라틴의 가수분해물인 것이 바람직하다. 일반적으로, 콜라겐을 무기산을 이용하여 처리함으로써 얻은 젤라틴을 산 처리 젤라틴이라고 칭하고, 콜라겐을 무기 염기를 이용하여 처리함으로써 얻은 젤라틴을 알칼리 처리 젤라틴이라고 칭한다. 알칼리 처리 젤라틴은, 구체적으로는 콜라겐을 수산화 나트륨, 수산화 칼슘 또는 수산화 칼륨 등의 무기 염기를 이용하여 처리함으로써 얻을 수 있다. 산 처리 젤라틴은, 등전점의 pH가 8~9이다. 이에 반해, 알칼리 처리 젤라틴은, 등전점의 pH는 4.0~7.0이다. 이러한 알칼리 처리 젤라틴으로서는, 예를 들어 돈피 유래 알칼리 처리 젤라틴(상품명：「beMatrix(등록상표) 젤라틴 LS-H」, 니타 젤라틴 주식회사 제조)을 예시할 수 있다.
상기 범위의 등전점의 pH를 갖는 젤라틴 가수분해물을 포함하는 바이러스 안정화제와, 바이러스로 바이러스 함유 조성물을 구성한 경우, 상기 조성물 중에서 젤라틴 가수분해물은, 바이러스가 응집하는 것을 억제할 수 있고, 따라서 바이러스 역가의 저하를 억제할 수 있다. 상세한 메커니즘은 불분명하지만, 이러한 범위의 등전점의 pH를 갖는 젤라틴 가수분해물은, 분자 내에 있어서 음의 전하가 양의 전하보다 상대적으로 많이 존재하기 때문에, 전체적으로는 음의 전하를 나타내지만, 양의 전하를 나타내는 부위 및 음의 전하를 나타내는 부위 양자를 갖게 된다. 이 때문에 젤라틴 가수분해물은, 양의 전하를 나타내는 부위와, 바이러스에 있어서 음의 전하를 나타내는 캡시드 단백질, 스파이크 단백질 및 바이러스 표면의 엔벨로프 단백질 등의 사이에서 약한 정전 상호 작용을 나타냄으로써, 바이러스와 결합할 수 있다. 한편, 젤라틴 가수분해물은, 음의 전하를 나타내는 부위에 있어서 바이러스 및 젤라틴 가수분해물을 구성하는 다른 펩티드쇄와 서로 반발한다. 이상으로 인해, 젤라틴 가수분해물은, 바이러스의 응집을 억제하면서, 바이러스의 표면을 피복함으로써, 이것을 보호할 수 있다고 추정된다. 한편, 등전점의 pH가 9 부근인 산 처리 젤라틴으로부터 얻은 젤라틴 가수분해물(예를 들어 상기 특허문헌 1에 개시된 젤라틴 가수분해물)은, 양의 전하를 갖기 때문에, 음의 전하를 나타내는 캡시드 단백질 등과 강하게 정전 상호 작용을 나타냄으로써 바이러스를 응집시킬 가능성이 있다. 산 처리 젤라틴으로부터 얻은 젤라틴 가수분해물은, 특히 25℃ 전후의 온도 환경에 있어서, 바이러스를 응집시키는 작용이 현저하게 드러난다고 추정된다.
젤라틴 가수분해물의 등전점의 pH는, 젤라틴 가수분해물의 원료가 되는 젤라틴 및 콜라겐 양쪽 또는 어느 한쪽의 등전점의 pH를 종래 공지의 방법을 이용하여 측정함으로써 구할 수 있는데, 이하의 제타 전위를 지표로 한 등전점의 측정 방법을 이용하는 것이, 보다 정확하게 등전점의 값을 구할 수 있으므로 바람직하다. 즉, 우선 아세트산 완충액(pH 4.0~5.5)에 측정 대상으로 하는 젤라틴 가수분해물을 용해하여, 0.4w/v％의 피측정 용액을 얻는다. 다음에 당해 피측정 용액을 0.22μm의 필터(Merck사 제조)로 여과한 후, 피측정 용액 0.8mL를 기포가 들어가지 않도록 하여 캐필러리 셀에 충전한다. 계속해서, 상기 피측정 용액이 충전된 당해 캐필러리 셀을 제타 전위 측정 장치(Malvern Panalytical사 제조)에 세팅하고, 25℃의 각 pH에 있어서의 제타 전위를 측정한다. 이 때, 제타 전위가 0이 되는 pH값을 피측정 용액(측정 대상으로 한 젤라틴 가수분해물)의 등전점으로서 구할 수 있다.
＜수성 미디엄＞
바이러스 안정화제는, 상술한 바와 같이 수성 미디엄을 포함한다. 본 명세서에 있어서 「수성 미디엄」이란, 젤라틴 가수분해물을 용해 또는 분산시키는 매체를 말하여, 후술하는 아미노산, 당류 및 완충 작용을 갖는 염 등의 물 이외의 성분을 포함할 수 있는 매체를 의미한다. 예를 들어 수성 미디엄은, 완충 작용을 갖는 염을 포함하는 완충액인 경우가 있다. 구체적으로는, 수성 미디엄은, GTS 버퍼인 경우가 있다. 즉 상기 수성 미디엄은, 완충 작용을 갖는 염을 포함하는 것이 바람직하다. 이로 인해 바이러스 안정화제는, 바이러스를 포함함으로써 바이러스 함유 조성물을 구성한 경우, 상기 완충 작용에 의해 바이러스의 안정화에 기여할 수 있다.
(완충 작용을 갖는 염)
완충 작용을 갖는 염으로서는, 인산 나트륨, 인산 칼륨, 인산 칼슘, 인산 마그네슘, 인산 수소 나트륨, 인산 수소 칼륨, 인산 수소 칼슘, 인산 수소 마그네슘, 염화 나트륨, 염화 칼륨 등을 예시할 수 있다. 수성 미디엄은, 상기 완충 작용을 갖는 염을 1종 단독으로 포함해도 되고, 2종 이상을 조합하여 포함해도 된다. 상기 완충 작용을 갖는 염을 포함하는 수성 미디엄으로서는, 상기 GTS 버퍼, PBS 버퍼, Tris 버퍼, HEPES 버퍼, 구연산 버퍼 등을 예시할 수 있다. GTS 버퍼의 조성으로서는, 예를 들어 2.5질량% 글리세롤, 20mM Tris pH 8, 25mM NaCl로 할 수 있다.
(아미노산)
수성 미디엄은, 메티오닌, 아르기닌, 트립토판, 글루타민 및 글루탐산으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 아미노산을 포함하는 것이 바람직하다. 수성 미디엄은, 이들 군에서 선택되는 1종의 아미노산을 단독으로 포함해도 되고, 2종 이상을 조합하여 포함해도 된다. 수성 미디엄은, 메티오닌, 아르기닌 양자 또는 어느 한쪽의 아미노산을 포함하는 것이 보다 바람직하다. 이로 인해 바이러스 안정화제는, 바이러스를 포함함으로써 바이러스 함유 조성물을 구성한 경우, 바이러스의 안정화에 보다 기여할 수 있다.
(당류)
상기 수성 미디엄은, 자당, 유당, 소르비톨, 이노시톨, 트레할로스, 만니톨, 말티톨, 크실리톨, 에리트리톨 및 글리세롤로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 당류를 포함하는 것이 바람직하다. 수성 미디엄은, 이들 군에서 선택되는 1종의 당류를 단독으로 포함해도 되고, 2종 이상을 조합하여 포함해도 된다. 수성 미디엄은, 자당, 유당 또는 소르비톨 중 어느 하나를 적어도 포함하는 것이 보다 바람직하다. 이로 인해 바이러스 안정화제는, 바이러스를 포함함으로써 바이러스 함유 조성물을 구성한 경우, 바이러스의 안정화에 보다 기여할 수 있다. 본 명세서에 있어서 「당류」에 포함되는 화합물로서는, 일반적으로 당류로서 분류되는 유기 화합물뿐만 아니라, 당 알코올로 분류되는 유기 화합물을 포함하는 것으로 한다. 상기의 군의 당류에 있어서 당 알코올로 분류되는 유기 화합물은, 상기 소르비톨, 만니톨, 말티톨, 크실리톨, 에리트리톨 및 글리세롤이다.
(그 외의 성분)
수성 미디엄은, 본 발명의 효과가 나타나는 한에 있어서, 그 외의 성분을 포함하고 있어도 된다. 그 외의 성분으로서는, 예를 들어 성장 인자, 분화 인자, 호르몬, 케모카인, 사이토카인, 세포 접착 분자, 주화(走化) 인자, 효소, 효소 인히비터, 보효소(비타민류), 광물, 지방, 지질, 안정제 및 보존제 등을 들 수 있다.
＜작용 효과＞
본 실시 형태에 따른 바이러스 안정화제는, 상술한 바와 같이 수성 미디엄과, 1질량% 이상 20질량% 이하의 농도로 포함되는 젤라틴 가수분해물로 이루어진다. 젤라틴 가수분해물은, 중량 평균 분자량이 10000 이하이며, 또한 등전점의 pH가 4.0 이상 7.0 이하이다. 본 실시 형태에 따른 바이러스 안정화제는, 바이러스를 포함함으로써 후술하는 바이러스 함유 조성물을 구성한 경우, 당해 바이러스 함유 조성물 중에서 바이러스가 응집하는 것을 억제하여, 바이러스의 감염력 등에 악영향이 미치는 것을 막을 수 있다. 따라서 바이러스 역가의 저하를 억제할 수 있으므로, 당해 바이러스 함유 조성물을 냉장 온도(2~8℃) 및 25℃ 전후의 실온 양자에 있어서 안정적으로 보존 및 수송할 수 있다.
〔바이러스 안정화제용 젤라틴 가수분해물〕
본 실시 형태에 따른 바이러스 안정화제용 젤라틴 가수분해물은, 중량 평균 분자량이 10000 이하이며, 또한 등전점의 pH가 4.0 이상 7.0 이하이다. 상기 바이러스 안정화제용 젤라틴 가수분해물은, 중량 평균 분자량이 6000 이하이고, 혹은 등전점의 pH는 4.0~5.5인 것이 바람직하다. 구체적으로는, 바이러스 안정화제용 젤라틴 가수분해물에 대해서는, 젤라틴 가수분해물로서 ＜젤라틴 가수분해물＞ 항목에서 설명한 바와 같은 특징을 가지므로, 중복되는 설명은 반복하지 않는다. 바이러스 안정화제용 젤라틴 가수분해물은, 젤라틴 가수분해물의 종래 알려지지 않은 속성, 즉 미지의 속성으로서, 바이러스를 포함함으로써 후술하는 바이러스 함유 조성물을 구성한 경우, 당해 바이러스 함유 조성물 중에서 바이러스가 응집하는 것을 억제하는 작용을 구비한다. 따라서 바이러스 안정화제용 젤라틴 가수분해물은, 바이러스 안정화제의 용도에 쓰이도록 할 수 있고, 냉장 온도(2~8℃) 및 25℃ 전후의 실온 양자에 있어서 상기 바이러스 함유 조성물을 냉동 장치 등을 요하지 않고 안정적으로 보존 및 수송할 수 있다.
상기 바이러스 안정화제용 젤라틴 가수분해물은, 액체 또는 분체인 것이 바람직하다. 이로 인해, 바이러스 안정화제용 젤라틴 가수분해물이 액체인 경우, 바이러스를 수성 미디엄과 함께 첨가함으로써 바이러스 함유 조성물을 용이하게 조제할 수 있다. 바이러스 안정화제용 젤라틴 가수분해물이 분체인 경우, 수성 미디엄에 용해 또는 분산시켜 바이러스 안정화제를 조제하고, 이것에 바이러스를 첨가함으로써 바이러스 함유 조성물을 용이하게 조제할 수 있다. 바이러스 안정화제용 젤라틴 가수분해물은, 젤라틴 및 콜라겐 양쪽 또는 어느 한쪽을 가수분해한 후, 정제함으로써 액체로서 조제할 수 있다. 바이러스 안정화제용 젤라틴 가수분해물은, 상술한 바와 같이 하여 조제한 바이러스 안정화제용 젤라틴 가수분해물의 액체를, 공지의 방법에 의해 가열 건조 또는 동결 건조함으로써 분체로서 조제할 수 있다.
〔바이러스 함유 조성물〕
본 실시 형태에 따른 바이러스 함유 조성물은, 상기 바이러스 안정화제와, 바이러스를 포함한다. 바이러스 함유 조성물은, 바이러스 안정화제를 포함함으로써, 상기 조성물 중에서 바이러스가 응집하는 것을 억제할 수 있으므로, 바이러스 역가의 저하를 억제할 수 있다. 따라서 냉장 온도(2~8℃) 및 25℃ 전후의 실온 양자에 있어서 당해 바이러스 함유 조성물을 냉동 장치 등을 요하지 않고 안정적으로 보존 및 수송할 수 있다. 여기서 바이러스 함유 조성물에 포함되는 바이러스 안정화제는, 구체적으로는, 〔바이러스 안정화제〕 항목에서 설명한 바와 같은 특징을 가지므로, 중복되는 설명은 반복하지 않는다.
＜바이러스＞
바이러스 함유 조성물은, 상술한 바와 같이 바이러스를 포함한다. 상기 바이러스는, 엔벨로프를 갖는 DNA 바이러스, 엔벨로프를 갖지 않는 DNA 바이러스, 엔벨로프를 갖는 RNA 바이러스 및 엔벨로프를 갖지 않는 RNA 바이러스로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종을 포함하는 것이 바람직하다. 즉 바이러스 함유 조성물을 구성하는 바이러스는, 그 종류에 따라 이용하는 것이 제한되지 않는다. 또한 바이러스 함유 조성물은, 상기의 군에서 선택되는 1종의 바이러스를 단독으로 포함해도 되고, 2종 이상의 바이러스를 조합하여 포함해도 된다. 이러한 경우여도 바이러스 함유 조성물은, 바이러스 안정화제를 포함함으로써 당해 바이러스를 냉장 온도(2~8℃) 및 25℃ 전후의 실온 양자에 있어서 안정적으로 보존 및 수송할 수 있다.
상기 바이러스는, 구체적으로는, 인플루엔자 바이러스, 로타 바이러스 등의 생백신 또는 불활화 백신으로서 이용되는 바이러스, 종양을 용해하는 작용을 갖는 종양 용해성 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 우두 바이러스, 아데노 바이러스, 콕사키 바이러스, 폭스 바이러스, 파라믹소 바이러스, 피코르나 바이러스, 랍도 바이러스, 레오 바이러스, 파르보 바이러스, 고사리 바이러스, 오르토믹소 바이러스, 레트로 바이러스 등을 예시할 수 있다. 또한 상기 바이러스는, 유전자 도입되어 있어도 된다.
＜그 외의 성분＞
바이러스 함유 조성물은, 본 발명의 효과가 나타나는 한에 있어서, 그 외의 성분을 포함하고 있어도 된다. 그 외의 성분으로서는, 예를 들어 성장 인자, 분화 인자, 호르몬, 케모카인, 사이토카인, 세포 접착 분자, 주화 인자, 효소, 효소 인히비터, 보효소(비타민류), 광물, 지방, 지질, 안정제 및 보존제 등을 들 수 있다.
＜바이러스 역가의 로그 감소값(LRV)＞
바이러스 함유 조성물은, 25℃에서 21일간 보존한 경우의 바이러스 역가의 로그 감소값(이하, 「LRV」라고도 기재한다)과, -80℃에서 21일간 보존한 경우의 바이러스 역가의 LRV의 차가 1.5log 이하인 것이 바람직하다. 상기의 차는, 1.0log 이하인 것이 보다 바람직하다. 바이러스 함유 조성물은, 상기의 차의 하한값으로서는 0인 것이 바람직하다.
바이러스 함유 조성물은, 4℃에서 210일간 보존한 경우의 바이러스 역가의 LRV와, -80℃에서 210일간 보존한 경우의 바이러스 역가의 LRV의 차가 1.0log 이하인 것이 바람직하다. 상기의 차는 0.5log 이하인 것이 보다 바람직하다. 바이러스 함유 조성물은, 상기의 차의 하한값으로서는 0인 것이 바람직하다.
바이러스 함유 조성물은, 상술한 바와 같은 바이러스 역가의 LRV에 관한 특징을 구비하는 경우, 냉장 온도(2~8℃) 및 25℃ 전후의 실온 양자에 있어서 바이러스를 안정적으로 보존 및 수송할 수 있는 능력이 담보된다.
또한 바이러스 함유 조성물은, 25℃에서 21일간 보존한 경우의 바이러스 역가의 LRV와, -80℃에서 21일간 보존한 경우의 바이러스 역가의 LRV의 차가 1.5log 이하이며, 또한 4℃에서 21일간 보존한 경우의 바이러스 역가의 LRV와, -80℃에서 21일간 보존한 경우의 바이러스 역가의 LRV의 차가 1.0log 이하인 것도 바람직하다.
상기 바이러스 함유 조성물은, 동결 융해를 3회 반복한 경우의 바이러스 역가의 로그 감소값이 0.3log 이하인 것이 바람직하다. 이로 인해 상기 바이러스 함유 조성물은 동결 융해를 3회까지 반복하여 행한 경우여도, 바이러스 역가를 유지할 수 있다. 따라서 바이러스 함유 조성물을 유연하게 사용할 수 있으므로, 극히 편리해진다.
(바이러스 역가의 로그 감소값(LRV)의 측정 방법)
바이러스 함유 조성물에 있어서 바이러스 역가의 LRV는, 바이러스 역가를 측정하는 종래의 방법을 이용하여 구할 수 있으며, 예를 들어 바이러스 함유 조성물 중의 바이러스의 TCID50을 구함으로써 얻을 수 있다. 「TCID50」이란, 미리 세포를 배양하여 부착시킨 시험관 또는 96웰 평저(平底) 플레이트 등의 배양 접시 상에 바이러스 희석액(본 명세서에 있어서는 「바이러스 함유 조성물」의 희석액)을 접종한 경우에, 50%의 감염이 확인되는 바이러스의 희석도를 말한다. 상기 감염은, 예를 들어 세포 변성 효과(CPE)를 지표로 하여 현미경에 의해 확인할 수 있다. 바이러스 역가의 LRV는, Beherens-Karber법의 계산식에 따른 TCID50을 토대로 산출할 수 있다.
바이러스 역가의 LRV의 측정 방법은, 다음과 같이 할 수 있다. 구체적으로는, 우선 소정 기간 보존한 후의 바이러스 함유 조성물의 희석에, 희석액으로서 DMEM 배지를 이용할 수 있다. 세포 배양은, 소정의 세포 현탁액 100μL/well(약 104개/well)을 96웰 평저 플레이트(TPP사 제조)에 뿌려, 37℃의 CO2 인큐베이터(CO2 농도 5%)에서 하룻밤 인큐베이트 함으로써 행할 수 있다.
그 후, DMEM 배지에서 바이러스 함유 조성물을 10배 단계 희석한다. 희석한 바이러스는, 96웰 평저 플레이트 내의 소정의 세포(바이러스 함유 조성물에 포함되는 바이러스종에 대응한 여러 가지 세포(예를 들어 LCC-MK2 세포, MDBK 세포, HEK293 세포 등))에 50μL/well 첨가하여, 37℃의 CO2 인큐베이터(CO2 농도 5%)에서 배양하고, 7일째에 CPE를 지표로 하며, 또한 상술한 계산식에 따름으로써 바이러스 역가(TCID50)를 구하고, 당해 TCID50의 값에 의거하여 LRV를 산출할 수 있다.
또, 바이러스 함유 조성물에 포함되는 바이러스종이, rNDV-GFP인 경우, 다음과 같이 하여 바이러스 역가의 LRV를 산출할 수 있다. 즉 희석한 상기 바이러스를, 24웰 평저 플레이트 내의 Vero 세포에 50μL/well 첨가하고, 37℃의 CO2 인큐베이터(CO2 농도 5%)에서 24~48시간 배양하여, 상기 세포를 0.25질량% 트립신 EDTA(SIGMA 알드리치사 제조)에 의해 회수한다. 그 후, DMEM 배지 및 PBS에 의해 세정한다. 또한 상기 세포를 0.5질량% 포르말린 첨가 PBS에 부유시켜, FCM 해석 혹은 형광 현미경에 의해 감염 세포수를 계측하며, 또한 상술한 계산식에 따름으로써 바이러스 역가(FFU/mL)를 구한다. 그 후, 당해 바이러스 역가(FFU/mL)에 의거하여 LRV를 산출할 수 있다.
＜바이러스 안정화제의 조제 방법＞
본 실시 형태에 따른 바이러스 안정화제는, 바람직하게는 다음의 방법에 의해 얻을 수 있다. 즉 젤라틴 가수분해물을 조제하는 공정(제1 공정)과, 상기 젤라틴 가수분해물과 수성 미디엄으로 이루어지는 바이러스 안정화제를 조제하는 공정(제2 공정)을 거침으로써, 바이러스 안정화제를 얻을 수 있다.
(제1 공정)
제1 공정은, 젤라틴 가수분해물을 조제하는 공정이다. 젤라틴 가수분해물은, 상술한 바와 같이, 등전점의 pH가 4.0 이상 7.0 이하인 젤라틴, 또는 알칼리 처리함으로써 등전점의 pH를 4.0 이상 7.0 이하로 한 콜라겐 양쪽 또는 어느 한쪽을, 중량 평균 분자량이 10000 이하가 되도록 가수분해함으로써 조제할 수 있다. 등전점의 pH가 4.0 이상 7.0 이하인 젤라틴으로서는, 알칼리 처리 젤라틴을 이용하는 것이 바람직하다. 또한 시판품(예를 들어 상품명：「beMatrix(등록상표) 젤라틴 LS-H」, 니타 젤라틴 주식회사 제조)에 의해, 젤라틴 가수분해물을 준비할 수도 있다.
(제2 공정)
제2 공정은, 상기 젤라틴 가수분해물과 수성 미디엄으로부터 바이러스 안정화제를 조제하는 공정이다. 바이러스 안정화제는, 상기 젤라틴 가수분해물과 상기 수성 미디엄을 상기 젤라틴 가수분해물의 농도가 1질량% 이상 20질량% 이하가 되는 질량 비율로 혼합함으로써 조제할 수 있다. 구체적인 혼합 방법은, 종래 공지의 방법을 이용할 수 있다. 수성 미디엄에 대해서도, 완충 작용을 갖는 염을 소정의 농도가 되도록 이온 교환수에 첨가하는 등의 종래 공지의 방법에 의해 조제할 수 있다.
＜바이러스 함유 조성물의 조제 방법＞
바이러스 함유 조성물의 조제는, 상기 바이러스 안정화제에 바이러스를 첨가함으로써 행할 수 있다. 바이러스는, 상기 바이러스 안정화제에 종래 공지의 방법에 의해 첨가할 수 있다. 바이러스는, 상기 바이러스 안정화제에 통상, 바이러스 역가(TCID50)가 최종적으로 105/mL 이상이 되도록 첨가할 수 있다. 이상으로 인해, 본 실시 형태에 따른 바이러스 함유 조성물을 얻을 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 들어 본 발명을 보다 상세하게 설명하는데, 본 발명은 이들로 한정되는 것은 아니다.
〔시료의 준비〕
후술하는 각종 실험(실험 1~실험 6)에 이용하는 바이러스 함유 조성물의 각 시료(시료 1~시료 17)를, 다음에 설명하는 바와 같이 하여 준비했다. 시료 1~시료 4, 시료 9~시료 12 및 시료 14~시료 17이 실시예이고, 시료 5~시료 8 및 시료 13이 비교예이다.
＜시료 1＞
등전점의 pH가 5인 돈피 유래 알칼리 처리 젤라틴 「beMatrix(등록상표) 젤라틴 LS-H(니타 젤라틴 주식회사 제조)」를 중량 평균 분자량이 3800이 되도록 열에 의해 가수분해함으로써 젤라틴 가수분해물을 얻었다. 이어서 상기 젤라틴 가수분해물을 5질량% 포함하도록 수성 미디엄인 GTS 버퍼에 용해함으로써 바이러스 안정화제를 얻었다. 상기 바이러스 안정화제에, 엔벨로프를 갖는 DNA 바이러스인 소 헤르페스 바이러스(BHV-1)를 TCID50이 2×108.1/mL가 되도록 첨가함으로써 바이러스 함유 조성물을 얻었다. 또한 상기 바이러스 함유 조성물을 7개의 검체로 나누어, 각각 4℃에서 21일간, 56일간 및 210일간, 25℃에서 21일간, 그리고 -80℃에서 21일간, 56일간 및 210일간 보존했다.
＜시료 2＞
등전점의 pH가 5인 돈피 유래 알칼리 처리 젤라틴 「beMatrix(등록상표) 젤라틴 LS-H(니타 젤라틴 주식회사 제조)」를 중량 평균 분자량이 650이 되도록 열에 의해 가수분해함으로써 젤라틴 가수분해물을 얻었다. 이어서 상기 젤라틴 가수분해물을 5질량% 포함하도록 상기 GTS 버퍼에 용해함으로써 바이러스 안정화제를 얻었다. 그 후, 시료 1과 같은 방법에 의해 상기 바이러스 안정화제에 바이러스를 첨가함으로써, 바이러스 함유 조성물을 얻었다. 상기 바이러스 함유 조성물을 4개의 검체로 나누어, 각각 4℃에서 56일간, 25℃에서 21일간, 그리고 -80℃에서 21일간 및 56일간 보존했다.
＜시료 3＞
등전점의 pH가 5인 돈피 유래 알칼리 처리 젤라틴 「beMatrix(등록상표) 젤라틴 LS-H(니타 젤라틴 주식회사 제조)」를 중량 평균 분자량이 1980이 되도록 열에 의해 가수분해함으로써 젤라틴 가수분해물을 얻었다. 이어서 상기 젤라틴 가수분해물을 5질량% 포함하도록 상기 GTS 버퍼에 용해함으로써 바이러스 안정화제를 얻었다. 그 후, 시료 1과 같은 방법에 의해 상기 바이러스 안정화제에 바이러스를 첨가함으로써, 바이러스 함유 조성물을 얻었다. 상기 바이러스 함유 조성물을 4개의 검체로 나누어, 각각 4℃에서 56일간, 25℃에서 21일간, 그리고 -80℃에서 21일간 및 56일간 보존했다.
＜시료 4＞
등전점의 pH가 5인 돈피 유래 알칼리 처리 젤라틴 「beMatrix(등록상표) 젤라틴 LS-H(니타 젤라틴 주식회사 제조)」를 중량 평균 분자량이 9890이 되도록 열에 의해 가수분해함으로써 젤라틴 가수분해물을 얻었다. 이어서 상기 젤라틴 가수분해물을 5질량% 포함하도록 상기 GTS 버퍼에 용해함으로써 바이러스 안정화제를 얻었다. 그 후, 시료 1과 같은 방법에 의해 상기 바이러스 안정화제에 바이러스를 첨가함으로써, 바이러스 함유 조성물을 얻었다. 상기 바이러스 함유 조성물을 4개의 검체로 나누어, 각각 4℃에서 56일간, 25℃에서 21일간, 그리고 -80℃에서 21일간 및 56일간 보존했다.
＜시료 5＞
등전점의 pH가 5인 돈피 유래 알칼리 처리 젤라틴 「beMatrix(등록상표) 젤라틴 LS-H(니타 젤라틴 주식회사 제조)」를 중량 평균 분자량이 59800이 되도록 열에 의해 가수분해함으로써 젤라틴 가수분해물을 얻었다. 이어서 상기 젤라틴 가수분해물을 5질량% 포함하도록 상기 GTS 버퍼에 용해함으로써 바이러스 안정화제를 얻었다. 그 후, 시료 1과 같은 방법에 의해 상기 바이러스 안정화제에 바이러스를 첨가함으로써, 바이러스 함유 조성물을 얻었다. 또한 상기 바이러스 함유 조성물을 4개의 검체로 나누어, 각각 4℃에서 56일간, 25℃에서 21일간, 그리고 -80℃에서 21일간 및 56일간 보존했다.
＜시료 6＞
등전점의 pH가 9인 돈피 유래 산 처리 젤라틴으로부터 얻은 젤라틴 가수분해물(니타 젤라틴 주식회사 제조)을 중량 평균 분자량이 2060이 되도록 열에 의해 가수분해함으로써 젤라틴 가수분해물을 얻었다. 이어서 상기 젤라틴 가수분해물을 5질량% 포함하도록 상기 GTS 버퍼에 용해함으로써 바이러스 안정화제를 얻었다. 그 후, 시료 1과 같은 방법에 의해 상기 바이러스 안정화제에 바이러스를 첨가함으로써, 바이러스 함유 조성물을 얻었다. 상기 바이러스 함유 조성물을 4개의 검체로 나누어, 각각 4℃에서 56일간, 25℃에서 21일간, 그리고 -80℃에서 21일간 및 56일간 보존했다.
＜시료 7＞
등전점의 pH가 5인 돈피 유래 알칼리 처리 젤라틴 「beMatrix(등록상표) 젤라틴 LS-H(니타 젤라틴 주식회사 제조)」를 중량 평균 분자량이 3800이 되도록 열에 의해 가수분해함으로써 젤라틴 가수분해물을 얻었다. 이어서 상기 젤라틴 가수분해물을 0.1질량% 포함하도록 상기 GTS 버퍼에 용해함으로써 바이러스 안정화제를 얻은 것 이외에, 시료 1과 같은 방법에 의해 바이러스 함유 조성물을 얻었다. 상기 바이러스 함유 조성물을 4개의 검체로 나누어, 각각 4℃에서 56일간, 25℃에서 21일간, 그리고 -80℃에서 21일간 및 56일간 보존했다.
＜시료 8＞
등전점의 pH가 5인 돈피 유래 알칼리 처리 젤라틴 「beMatrix(등록상표) 젤라틴 LS-H(니타 젤라틴 주식회사 제조)」를 중량 평균 분자량이 3800이 되도록 열에 의해 가수분해함으로써 젤라틴 가수분해물을 얻었다. 이어서 상기 젤라틴 가수분해물을 0.5질량% 포함하도록 상기 GTS 버퍼에 용해함으로써 바이러스 안정화제를 얻은 것 이외에, 시료 1과 같은 방법에 의해 바이러스 함유 조성물을 얻었다. 상기 바이러스 함유 조성물을 4개의 검체로 나누어, 각각 4℃에서 56일간, 25℃에서 21일간, 그리고 -80℃에서 21일간 및 56일간 보존했다.
＜시료 9＞
등전점의 pH가 5인 돈피 유래 알칼리 처리 젤라틴 「beMatrix(등록상표) 젤라틴 LS-H(니타 젤라틴 주식회사 제조)」를 중량 평균 분자량이 3800이 되도록 열에 의해 가수분해함으로써 젤라틴 가수분해물을 얻었다. 이어서 상기 젤라틴 가수분해물을 1질량% 포함하도록 상기 GTS 버퍼에 용해함으로써 바이러스 안정화제를 얻은 것 이외에, 시료 1과 같은 방법에 의해 바이러스 함유 조성물을 얻었다. 상기 바이러스 함유 조성물을 4개의 검체로 나누어, 각각 4℃에서 56일간, 25℃에서 21일간, 그리고 -80℃에서 21일간 및 56일간 보존했다.
＜시료 10＞
등전점의 pH가 5인 돈피 유래 알칼리 처리 젤라틴 「beMatrix(등록상표) 젤라틴 LS-H(니타 젤라틴 주식회사 제조)」를 중량 평균 분자량이 3800이 되도록 열에 의해 가수분해함으로써 젤라틴 가수분해물을 얻었다. 이어서 상기 젤라틴 가수분해물을 2.5질량% 포함하도록 상기 GTS 버퍼에 용해함으로써 바이러스 안정화제를 얻은 것 이외에, 시료 1과 같은 방법에 의해 바이러스 함유 조성물을 얻었다. 상기 바이러스 함유 조성물을 4개의 검체로 나누어, 각각 4℃에서 56일간, 25℃에서 21일간, 그리고 -80℃에서 21일간 및 56일간 보존했다.
＜시료 11＞
등전점의 pH가 5인 돈피 유래 알칼리 처리 젤라틴 「beMatrix(등록상표) 젤라틴 LS-H(니타 젤라틴 주식회사 제조)」를 중량 평균 분자량이 3800이 되도록 열에 의해 가수분해함으로써 젤라틴 가수분해물을 얻었다. 이어서 상기 젤라틴 가수분해물을 10질량% 포함하도록 상기 GTS 버퍼에 용해함으로써 바이러스 안정화제를 얻은 것 이외에, 시료 1과 같은 방법에 의해 바이러스 함유 조성물을 얻었다. 상기 바이러스 함유 조성물을 4개의 검체로 나누어, 각각 4℃에서 56일간, 25℃에서 21일간, 그리고 -80℃에서 21일간 및 56일간 보존했다.
＜시료 12＞
등전점의 pH가 5인 돈피 유래 알칼리 처리 젤라틴 「beMatrix(등록상표) 젤라틴 LS-H(니타 젤라틴 주식회사 제조)」를 중량 평균 분자량이 3800이 되도록 열에 의해 가수분해함으로써 젤라틴 가수분해물을 얻었다. 이어서 상기 젤라틴 가수분해물을 20질량% 포함하도록 상기 GTS 버퍼에 용해함으로써 바이러스 안정화제를 얻은 것 이외에, 시료 1과 같은 방법에 의해 바이러스 함유 조성물을 얻었다. 상기 바이러스 함유 조성물을 4개의 검체로 나누어, 각각 4℃에서 56일간, 25℃에서 21일간, 그리고 -80℃에서 21일간 및 56일간 보존했다.
＜시료 13＞
재조합 인간 알부민 「Recombumin(등록상표) Elite(Albumedix사 제조)를 1질량% 포함하도록 상기 GTS 버퍼에 용해함으로써 바이러스 안정화제를 얻었다. 그 후, 시료 1과 같은 방법에 의해 상기 바이러스 안정화제에 바이러스를 첨가함으로써, 바이러스 함유 조성물을 얻었다. 또한 상기 바이러스 함유 조성물을 4개의 검체로 나누어, 각각 4℃에서 56일간, 25℃에서 21일간, 그리고 -80℃에서 21일간 및 56일간 보존했다. 시료 13은, 종래 공지의 바이러스 안정화제이다.
＜시료 14＞
바이러스 안정화제에, 엔벨로프를 갖는 RNA 바이러스인 파라인플루엔자 바이러스(PI-3)를 TCID50이 2×105.5/mL가 되도록 첨가한 것 이외에, 시료 1과 같은 방법에 의해 바이러스 함유 조성물을 얻었다. 상기 바이러스 함유 조성물을 7개의 검체로 나누어, 각각 4℃에서 21일간, 56일간 및 210일간, 25℃에서 21일간, 그리고 -80℃에서 21일간, 56일간 및 210일간 보존했다.
＜시료 15＞
바이러스 안정화제에, 엔벨로프를 갖지 않는 RNA 바이러스인 레오 바이러스(Reo-3)를 TCID50이 2×106.5/mL가 되도록 첨가한 것 이외에, 시료 1과 같은 방법에 의해 바이러스 함유 조성물을 얻었다. 상기 바이러스 함유 조성물을 7개의 검체로 나누어, 각각 4℃에서 21일간, 56일간 및 210일간, 25℃에서 21일간, 그리고 -80℃에서 21일간, 56일간 및 210일간 보존했다.
＜시료 16＞
바이러스 안정화제에, 엔벨로프를 갖지 않는 DNA 바이러스인 아데노 바이러스(Ad5)를 TCID50이 2×108/mL가 되도록 첨가한 것 이외에, 시료 1과 같은 방법에 의해 바이러스 함유 조성물을 얻었다. 상기 바이러스 함유 조성물을 7개의 검체로 나누어, 각각 4℃에서 21일간, 56일간 및 210일간, 25℃에서 21일간, 그리고 -80℃에서 21일간, 56일간 및 210일간 보존했다.
＜시료 17＞
바이러스 안정화제에, GFP를 유전자 도입한 종양 용해성 바이러스로서, 엔벨로프를 갖는 RNA 바이러스인 파라믹소 바이러스(뉴캐슬병 바이러스：rNDV-GFP)를 FFU가 4×106/mL 포함하도록 첨가한 것 이외에, 시료 1과 같은 방법에 의해 바이러스 함유 조성물을 얻었다. 상기 바이러스 함유 조성물을 4개의 검체로 나누어, 각각 4℃에서 56일간, 25℃에서 21일간, 그리고 -80℃에서 21일간 및 56일간 보존했다. 표 1에, 시료 1~시료 17의 일람을 나타낸다. 여기서 시료 1~시료 4, 시료 9~시료 12 및 시료 14~시료 17의 바이러스 안정화제에 포함되는 젤라틴 가수분해물의 등전점의 pH는, 상술한 제타 전위를 지표로 한 등전점의 측정 방법에 의해 측정한 값을 나타냈다.
Figure pct00001
〔실험 1：젤라틴 가수분해물의 적절한 중량 평균 분자량의 검토〕
시료 1, 시료 2, 시료 3, 시료 4 및 시료 5에 관하여, 4℃에서 56일간 및 25℃에서 21일간 보존한 각 검체의 TCID50을 각각 구하고, 당해 TCID50의 값에 의거하여 4℃에서의 바이러스 역가의 LRV, 및 25℃에서의 바이러스 역가의 LRV를 산출했다. 또한 시료 1, 시료 2, 시료 3, 시료 4 및 시료 5에 관하여, -80℃에서 21일간 및 56일간 보존한 각 검체의 TCID50을 각각 구하고, 당해 TCID50의 값에 의거하여 -80℃에서의 바이러스 역가의 LRV를 산출했다. 이들에 의거하여, 시료 1, 시료 2, 시료 3, 시료 4 및 시료 5에 관하여, 25℃에서 21일간 보존한 각 검체에 있어서의 바이러스 역가의 LRV와 -80℃에서 21일간 보존한 각 검체에 있어서의 바이러스 역가의 LRV의 차를 산출했다. 결과를 표 2에 나타낸다. 또한 표 3에 있어서, 시료 1, 시료 2, 시료 3 및 시료 4에 관하여, 4℃에서 56일간 보존한 각 검체에 있어서의 바이러스 역가의 LRV와 -80℃에서 56일간 보존한 각 검체에 있어서의 바이러스 역가의 LRV의 차를 산출한 결과를 나타낸다.
Figure pct00002
Figure pct00003
상기 표 2 및 표 3에 의하면, 시료 1, 시료 2, 시료 3 및 시료 4는, 각각 상기 LRV의 차가 1.0log 이하 및 1.5log 이하이기 때문에, 4℃(냉장 온도) 및 25℃(실온)에 있어서 바이러스를 안정적으로 보존 및 수송할 수 있다고 평가할 수 있다. 시료 5는, 겔화 함으로써 상기 LRV의 차가 25℃에 있어서 1.5log를 초과했다. 또한 시료 5에 대해서는, 겔화를 이유로 4℃ 56일간에 있어서의 평가를 행하지 않았다.
〔실험 2：젤라틴 가수분해물의 적절한 등전점의 검토〕
시료 1, 시료 2, 시료 3, 시료 4 및 시료 6에 관하여, 4℃에서 56일간 및 25℃에서 21일간 보존한 각 검체의 TCID50을 각각 구하고, 당해 TCID50의 값에 의거하여 4℃에서의 바이러스 역가의 LRV, 및 25℃에서의 바이러스 역가의 LRV를 산출했다. 또한 시료 1, 시료 2, 시료 3, 시료 4 및 시료 6에 관하여, -80℃에서 21일간 및 56일간 보존한 각 검체의 TCID50을 각각 구하고, 당해 TCID50의 값에 의거하여 -80℃에서의 바이러스 역가의 LRV를 산출했다. 이들에 의거하여, 시료 1, 시료 2, 시료 3, 시료 4 및 시료 6의 바이러스 함유 조성물에 관하여, 25℃에서 21일간 보존한 각 검체에 있어서의 바이러스 역가의 LRV와 -80℃에서 21일간 보존한 각 검체에 있어서의 바이러스 역가의 LRV의 차를 산출했다. 결과를 표 4에 나타낸다. 또한 표 5에 있어서, 시료 1, 시료 2, 시료 3, 시료 4 및 시료 6에 관하여, 4℃에서 56일간 보존한 각 검체에 있어서의 바이러스 역가의 LRV와 -80℃에서 56일간 보존한 각 검체에 있어서의 바이러스 역가의 LRV의 차를 산출한 결과를 나타낸다.
Figure pct00004
Figure pct00005
상기 표 4 및 표 5에 의하면, 시료 1, 시료 2, 시료 3 및 시료 4는, 각각 상기 LRV의 차가 1.0log 이하 및 1.5log 이하이기 때문에, 4℃(냉장 온도) 및 25℃(실온)에 있어서 바이러스를 안정적으로 보존 및 수송할 수 있다고 평가할 수 있다. 시료 6은, 상기 LRV의 차가 25℃에 있어서 1.5log를 초과하고, 4℃에 있어서 1.0log를 초과했다.
〔실험 3：바이러스 안정화제 중의 젤라틴 가수분해물의 적절한 농도의 검토〕
시료 1, 시료 7, 시료 8, 시료 9, 시료 10, 시료 11 및 시료 12에 관하여, 4℃에서 56일간 및 25℃에서 21일간 보존한 각 검체의 TCID50을 각각 구하고, 당해 TCID50의 값에 의거하여 4℃에서의 바이러스 역가의 LRV, 및 25℃에서의 바이러스 역가의 LRV를 산출했다. 또한 시료 1, 시료 7, 시료 8, 시료 9, 시료 10, 시료 11 및 시료 12에 관하여, -80℃에서 21일간 및 56일간 보존한 각 검체의 TCID50을 각각 구하고, 당해 TCID50의 값에 의거하여 -80℃에서의 바이러스 역가의 LRV를 산출했다. 이들에 의거하여, 시료 1, 시료 7, 시료 8, 시료 9, 시료 10, 시료 11 및 시료 12에 관하여, 25℃에서 21일간 보존한 각 검체에 있어서의 바이러스 역가의 LRV와 -80℃에서 21일간 보존한 각 검체에 있어서의 바이러스 역가의 LRV의 차를 산출했다. 결과를 표 6에 나타낸다. 또한 표 7에 있어서, 시료 1, 시료 7, 시료 8, 시료 9, 시료 10, 시료 11 및 시료 12에 관하여, 4℃에서 56일간 보존한 각 검체에 있어서의 바이러스 역가의 LRV와 -80℃에서 56일간 보존한 각 검체에 있어서의 바이러스 역가의 LRV의 차를 산출한 결과를 나타낸다.
Figure pct00006
Figure pct00007
상기 표 6 및 표 7에 의하면, 시료 1, 시료 9, 시료 10, 시료 11 및 시료 12는, 각각 상기 LRV의 차가 1.0log 이하 및 1.5log 이하이기 때문에, 4℃(냉장 온도) 및 25℃(실온)에 있어서 바이러스를 안정적으로 보존 및 수송할 수 있다고 평가할 수 있다. 시료 7 및 시료 8은, 모두 상기 LRV의 차가 25℃에 있어서 1.5log를 초과하고, 4℃에 있어서 1.0log를 초과했다.
〔실험 4：종래의 바이러스 안정화제와의 비교〕
시료 1 및 시료 13에 관하여, 4℃에서 56일간 및 25℃에서 21일간 보존한 각 검체의 TCID50을 각각 구하고, 당해 TCID50의 값에 의거하여 4℃에서의 바이러스 역가의 LRV, 및 25℃에서의 바이러스 역가의 LRV를 산출했다. 또한 시료 1 및 시료 13에 관하여, -80℃에서 21일간 및 56일간 보존한 각 검체의 TCID50을 각각 구하고, 당해 TCID50의 값에 의거하여 -80℃에서의 바이러스 역가의 LRV를 산출했다. 이들에 의거하여 시료 1 및 시료 13에 관하여, 25℃에서 21일간 보존한 각 검체에 있어서의 바이러스 역가의 LRV와 -80℃에서 21일간 보존한 각 검체에 있어서의 바이러스 역가의 LRV의 차를 산출했다. 결과를 표 8에 나타낸다. 또한 표 9에 있어서, 시료 1 및 시료 13에 관하여, 4℃에서 56일간 보존한 각 검체에 있어서의 바이러스 역가의 LRV와 -80℃에서 56일간 보존한 각 검체에 있어서의 바이러스 역가의 LRV의 차를 산출한 결과를 나타낸다.
Figure pct00008
Figure pct00009
상기 표 8 및 표 9에 의하면, 시료 1은 시료 13에 비해, 4℃(냉장 온도) 및 25℃(실온)에 있어서 바이러스 역가의 저하를 억제할 수 있다고 평가할 수 있다.
〔실험 5：바이러스의 종류별 바이러스 안정화제의 효과의 검토〕
시료 1, 시료 14, 시료 15, 시료 16 및 시료 17에 관하여, 25℃에서 21일간 보존한 각 검체의 TCID50을 각각 구하고, 당해 TCID50의 값에 의거하여 25℃에서의 바이러스 역가의 LRV를 산출했다. 또한 시료 1, 시료 14, 시료 15, 시료 16 및 시료 17에 관하여, -80℃에서 21일간 보존한 각 검체의 TCID50을 각각 구하고, 당해 TCID50의 값에 의거하여 -80℃에서의 바이러스 역가의 LRV를 산출했다. 이들에 의거하여 시료 1, 시료 14, 시료 15, 시료 16 및 시료 17에 관하여, 25℃에서 21일간 보존한 각 검체에 있어서의 바이러스 역가의 LRV와 -80℃에서 21일간 보존한 각 검체에 있어서의 바이러스 역가의 LRV의 차를 산출했다. 또한, 시료 17에 대해서는 TCID를 대신하여 FFU를 구했다. 결과를 표 10에 나타낸다.
또한 시료 1, 시료 14, 시료 15 및 시료 16에 관하여, 4℃에서 21일간, 56일간 및 210일간 보존한 각 검체의 TCID50을 각각 구하고, 당해 TCID50의 값에 의거하여 4℃에서의 바이러스 역가의 LRV를 산출했다. 시료 1, 시료 14, 시료 15 및 시료 16에 관하여, -80℃에서 21일간, 56일간 및 210일간 보존한 각 검체의 TCID50도 각각 구하고, 당해 TCID50의 값에 의거하여 -80℃에서의 바이러스 역가의 LRV를 산출했다. 이들에 의거하여 시료 1, 시료 14, 시료 15 및 시료 16에 관하여, 4℃에서 21일간, 56일간 및 210일간 보존한 각 검체에 있어서의 바이러스 역가의 LRV와 -80℃에서 21일간, 56일간 및 210일간 보존한 각 검체에 있어서의 바이러스 역가의 LRV의 차를 산출했다. 결과를 표 11에 나타낸다.
Figure pct00010
Figure pct00011
상기 표 10 및 표 11에 의하면, 시료 1, 시료 14, 시료 15, 시료 16 및 시료 17은, 각각 상기 LRV의 차가 1.0log 이하 및 1.5log 이하이기 때문에, 4℃(냉장 온도) 및 25℃(실온)에 있어서 바이러스를 안정적으로 보존 및 수송할 수 있다고 평가할 수 있다. 또한, 상기 표 10 및 표 11에 의하면, 25℃에서 3주간 활성을 유지한 시료 1, 시료 14~시료 16은, 모두 4℃에서 30주간까지 활성을 유지할 수 있기 때문에, 시료 17도 마찬가지로 4℃(냉장 온도)에서 30주간까지 활성을 유지할 수 있을 가능성이 높다고 추정된다.
상술한 실험 1~5의 결과를 고려하면, 시료 1~시료 4, 시료 9~시료 12 및 시료 14~시료 17의 각 실시예는, 4℃의 환경 하에서 21일간, 바이러스를 안정적으로 보존 및 수송할 수 있다고 평가할 수 있다.
〔실험 6：바이러스 안정화제의 동결 융해를 반복한 경우의 영향〕
시료 1을 -80℃에서 동결한 후, 이것을 빙수 안에서 융해했다. 이러한 조작을 3회 반복했다. 융해할 때 마다(동결 융해 1회째, 2회째 및 3회째) 각각 시료 1의 바이러스 역가를 측정하고, 시료 1의 동결 융해 전의 바이러스 역가와 비교하기 위한 로그 감소값(LRV)을 산출했다. 결과를 표 12에 나타낸다.
Figure pct00012
상기 표 12에 의하면, 시료 1은, 1~3회의 동결 융해에서 모두 상기 LRV가 0 부근으로 유지되었기 때문에, 동결 융해를 행한 경우도 바이러스 역가를 유지할 수 있다고 평가할 수 있다.
이상과 같이 본 발명의 실시 형태 및 실시예에 대해서 설명을 행했는데, 상술한 각 실시 형태 및 실시예의 구성을 적절히 조합하는 것도 당초부터 예정하고 있다.
이번에 개시된 실시 형태 및 실시예는 모든 점에서 예시이며 제한적인 것은 아니라고 생각되어야 할 것이다. 본 발명의 범위는 상술한 설명이 아니라 청구의 범위에 의해 나타내어지며, 청구의 범위와 균등한 의미 및 범위 내에서의 모든 변경이 포함되는 것이 의도된다.

Claims (15)

  1. 젤라틴 가수분해물과 수성 미디엄으로 이루어지는 바이러스 안정화제로서,
    상기 바이러스 안정화제는, 상기 젤라틴 가수분해물을 1질량% 이상 20질량% 이하 포함하고,
    상기 젤라틴 가수분해물은, 중량 평균 분자량이 10000 이하이며,
    상기 젤라틴 가수분해물은, 등전점의 pH가 4.0 이상 7.0 이하인, 바이러스 안정화제.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 젤라틴 가수분해물은, 중량 평균 분자량이 6000 이하인, 바이러스 안정화제.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 젤라틴 가수분해물은, 알칼리 처리 젤라틴의 가수분해물인, 바이러스 안정화제.
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 바이러스 안정화제는, 상기 젤라틴 가수분해물을 2질량% 초과 10질량% 이하 포함하는, 바이러스 안정화제.
  5. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 수성 미디엄은, 완충 작용을 갖는 염을 포함하는, 바이러스 안정화제.
  6. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 수성 미디엄은, 자당, 유당, 소르비톨, 이노시톨, 트레할로스, 만니톨, 말티톨, 크실리톨, 에리트리톨 및 글리세롤로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 당류를 포함하는, 바이러스 안정화제.
  7. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 수성 미디엄은, 메티오닌, 아르기닌, 트립토판, 글루타민 및 글루탐산으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 아미노산을 포함하는, 바이러스 안정화제.
  8. 중량 평균 분자량이 10000 이하이며, 또한 등전점의 pH가 4.0 이상 7.0 이하인, 바이러스 안정화제용 젤라틴 가수분해물.
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 바이러스 안정화제용 젤라틴 가수분해물은, 액체 또는 분체인, 바이러스 안정화제용 젤라틴 가수분해물.
  10. 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 기재된 바이러스 안정화제와, 바이러스를 포함하는, 바이러스 함유 조성물.
  11. 청구항 10에 있어서,
    상기 바이러스는, 엔벨로프를 갖는 DNA 바이러스, 엔벨로프를 갖지 않는 DNA 바이러스, 엔벨로프를 갖는 RNA 바이러스 및 엔벨로프를 갖지 않는 RNA 바이러스로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종을 포함하는, 바이러스 함유 조성물.
  12. 청구항 10 또는 청구항 11에 있어서,
    상기 바이러스는, 유전자 도입되어 있는, 바이러스 함유 조성물.
  13. 청구항 10 내지 청구항 12 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 바이러스 함유 조성물은, 25℃에서 21일간 보존한 경우의 바이러스 역가의 로그 감소값과, -80℃에서 21일간 보존한 경우의 바이러스 역가의 로그 감소값의 차가 1.5log 이하인, 바이러스 함유 조성물.
  14. 청구항 10 내지 청구항 13 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 바이러스 함유 조성물은, 4℃에서 210일간 보존한 경우의 바이러스 역가의 로그 감소값과, -80℃에서 210일간 보존한 경우의 바이러스 역가의 로그 감소값의 차가 1.0log 이하인, 바이러스 함유 조성물.
  15. 청구항 10 내지 청구항 14 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 바이러스 함유 조성물은, 동결 융해를 3회 반복한 경우의 바이러스 역가의 로그 감소값이 0.3log 이하인, 바이러스 함유 조성물.
KR1020227044891A 2021-01-19 2021-11-16 바이러스 안정화제, 바이러스 안정화제용 젤라틴 가수분해물 및 바이러스 함유 조성물 KR20230014737A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JPJP-P-2021-006669 2021-01-19
JP2021006669 2021-01-19
PCT/JP2021/042018 WO2022158097A1 (ja) 2021-01-19 2021-11-16 ウイルス安定化剤、ウイルス安定化剤用ゼラチン加水分解物およびウイルス含有組成物

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230014737A true KR20230014737A (ko) 2023-01-30

Family

ID=82548688

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227044891A KR20230014737A (ko) 2021-01-19 2021-11-16 바이러스 안정화제, 바이러스 안정화제용 젤라틴 가수분해물 및 바이러스 함유 조성물

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20230183657A1 (ko)
EP (1) EP4282955A1 (ko)
JP (1) JPWO2022158097A1 (ko)
KR (1) KR20230014737A (ko)
CN (1) CN115836123A (ko)
CA (1) CA3174826A1 (ko)
WO (1) WO2022158097A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117070476B (zh) * 2023-10-13 2023-12-19 金宇保灵生物药品有限公司 一株牛疱疹病毒4型毒株及其在灭活疫苗制备中的应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013035861A (ja) 2004-10-06 2013-02-21 Medimmune Llc 冷蔵温度安定型インフルエンザワクチン組成物

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1073858C (zh) * 1998-10-28 2001-10-31 浙江普康生物技术股份有限公司 含有稳定剂的甲型肝炎减毒活疫苗及制备方法
EP1651272A1 (en) * 2003-08-05 2006-05-03 Fuji Photo Film B.V. Use of recombinant or synthetic gelatin as a stabiliser in vaccines
EP2968515B1 (en) * 2013-03-14 2019-05-08 Takeda Vaccines, Inc. Compositions and methods for live, attenuated alphavirus formulations
EP3344293A4 (en) * 2015-09-04 2019-01-16 Inventprise, LLC. STABILIZED VACCINE COMPOSITIONS OF VLP
TWI670371B (zh) * 2016-10-04 2019-09-01 全崴生技股份有限公司 用於細胞冷凍保存的組成物和方法
JPWO2021020446A1 (ko) * 2019-07-30 2021-02-04

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013035861A (ja) 2004-10-06 2013-02-21 Medimmune Llc 冷蔵温度安定型インフルエンザワクチン組成物

Also Published As

Publication number Publication date
US20230183657A1 (en) 2023-06-15
EP4282955A1 (en) 2023-11-29
JPWO2022158097A1 (ko) 2022-07-28
WO2022158097A1 (ja) 2022-07-28
CN115836123A (zh) 2023-03-21
CA3174826A1 (en) 2022-07-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2299275T3 (es) Procedimiento y composiciones para conservar adenovirus.
US8313897B2 (en) Method for preserving viral particles
JP2008532977A (ja) 化学的に定義された安定剤組成物
US10588957B2 (en) Method for the production of stabile vaccines
EP2968112B2 (en) Stable aqueous formulations of adenovirus vectors
US7914979B2 (en) Stable and filterable enveloped virus formulations
US20200222524A1 (en) Viral formulations containing amino acids
JP2005515245A (ja) アデノウィルスの安定化された配合物
KR20230014737A (ko) 바이러스 안정화제, 바이러스 안정화제용 젤라틴 가수분해물 및 바이러스 함유 조성물
JP2015109874A (ja) エンベロープ型ｒｎａまたはｄｎａウイルスを製造する方法
Kadji et al. Stability of enveloped and nonenveloped viruses in hydrolyzed gelatin liquid formulation
EP3127550A1 (en) Stabilizing composition for dry formulation of virus
JP2009203223A (ja) 凍結乾燥用保護剤及び生理活性物質の製造方法
CN115337408A (zh) 腺相关病毒制剂
JP4253688B2 (ja) 凍結乾燥用保護剤及び生理活性物質の製造方法
Kadji et al. Stability of Enveloped and Nonenveloped Viruses in a Stable Gelatin Liquid Formulation
WO2023023371A1 (en) Formulations containing amino acids for stabilizing lipid enveloped viral and non-viral vectors
BR112020021358A2 (pt) Métodos de proteção da atividade biológica de uma molécula biologicamente ativa, de uma pluralidade de moléculas de uma molécula biologicamente ativa, e, da atividade biológica de uma proteína biologicamente ativa
CN108619521A (zh) 一种动物非灭活疫苗冷冻干燥保护剂及其使用方法
NZ554550A (en) Stable and filterable enveloped virus formulations