CN112626124A - 一种病毒保存试剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种病毒保存试剂，每1L病毒保存试剂中：NaCl含量为5.85±0.585g、Tris‑base为1.21±0.121g、MgCl₂·6H₂O为0.2±0.02g、甘油为100±10mL、注射用水补足至1000mL。本发明提供的保存试剂成分简单，对细胞毒性小，且能够在不同的环境条件下起到长期稳定病毒，维持病毒活性的作用，能够应用于以病毒为载体的疫苗的制备中，具有很好的应用前景。

Description

一种病毒保存试剂

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种病毒保存试剂。

背景技术

基因治疗(Gene therapy)是一种将外源基因导入靶细胞，以表达相应蛋白的治疗手段。基因治疗能通过纠正或补偿基因缺陷或基因的表达异常，从而达到治疗疾病的目的。近几年来，多项基因治疗项目相继在世界上许多国家获得批准上市或进入临床实验。

目前，基因治疗主要通过将外源基因整合入不同类型的病毒载体中，再利用该重组病毒将其导入靶细胞中。由于其高效性及可改造性，病毒载体目前也成为了疫苗开发的有力工具。

病毒的保存条件相对苛刻，一般需要存储于相对稳定的-80℃环境中。但实际情况中，达到这样的运输条件或储存条件对设备的要求较高，成本较大，且容易发生温度不稳定，造成病毒失活的情况。因此，一款能让病毒在较高温度依然维持活性的病毒保存试剂，对于减少物流成本，维持病毒活性，保证病毒类疫苗和基因治疗产品的效果有着至关重要的作用。

现有的病毒保存试剂成分复杂或含有抗生素，只适用于体外诊断检测。而对于需要注射入人体的疫苗或治疗类的重组病毒，现有的病毒保存试剂多不具备足够的安全性和有效性。

中国专利201711464688.9中公开了一种可稳定保存的丙型肝炎病毒基因检测试剂盒的病毒质控品，该质控品中包括丙型肝炎病毒(HCV)病毒保存剂，保存剂包含金精三甲酸铵盐、防腐剂、苯丁抑制素盐酸盐并进一步控制金精三甲酸铵盐、防腐剂、苯丁抑制素盐酸加入后在质控品中的浓度分别为100-500μM、 80-180mM、20-60nM，有效抑制了质控品病毒颗粒的降解，使其更稳定，更易保存，延长了有效期。但其针对性较强，不适于广泛地应用，且安全性不确定。

中国专利201910611068.6中公开了一种能够长时间有效保存病毒等样本的病毒保存液，由以下成分组成：氯化钙0.1-3.5g、氯化钾0.07-1.49g、氯化钠 0.76-2.76g、氯化镁0.01-0.91g、硫酸镁0.01-1.93g、糖0.1-0.361g、磷酸二氢钾 0.01-0.72g、磷酸氢二钠0.05-0.12g、碳酸氢钠0.007-0.67g、牛血清白蛋白0.1-1g、抗生素0.6-5.3g、4-羟乙基哌嗪乙磺酸0.236-0.96g、酚红0.01-1g、L-半胱氨酸盐酸盐0.01-3.52g、L-谷氨酸0.28-2.95g，水定容至100mL，pH值调节至7.2-7.8。该保存试剂具有众多突出的效果，但成分复杂，且难以应用于治疗类病毒。

中国专利202010571607.0中公开了一种高度兼容磁珠法病毒核酸提取试剂盒的病毒保存液，其包含以下成分：盐酸胍、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、乙二胺四乙酸、异丙醇或乙醇。该病毒保存液的成分简单，原料易得，成本较低，可以长时间室温保存样本，无需高温灭活，对操作人员和环境都非常安全，同时降低RNA被降解的可能性，可以获得较多的核酸，降低漏检率。但该保存液能否应用于注射入人体的疫苗或治疗类的重组病毒还需要进一步地研究。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种病毒保存试剂，本发明提供的保存试剂成分简单，对细胞毒性小，且能够在不同的环境条件下起到长期稳定病毒，维持病毒活性的作用。

一方面，本发明提供了一种病毒保存试剂。

所述的病毒保存试剂包括以下成分：NaCl、Tris-base、MgCl₂·6H₂O、甘油、水。

所述的病毒保存试剂每1L中：NaCl含量为5.85±0.585g、Tris-base为1.21 ±0.121g、MgCl₂·6H₂O为0.2±0.02g、甘油为100±10mL、注射用水补足至1000 mL。

优选地，所述的各成分含量为：每1L病毒保存试剂中：NaCl含量为5.85g、 Tris-base为1.21g、MgCl₂·6H₂O为0.2g、甘油为100mL、注射用水补足至1000 mL。

所述的病毒保存试剂pH为7.4-8.4；优选为7.6-8.2；pH值通过HCl调节。

所述的病毒包括但不限于腺病毒、慢病毒、逆转录病毒。

优选地，所述的病毒为重组腺病毒。

另一方面，本发明提供了前述病毒保存试剂在制备疫苗中的应用。

所述的疫苗中包括病毒载体。

所述的疫苗针对的病毒包括但不限于冠状病毒、流感病毒；优选为 SARS-CoV-2冠状病毒。

所述的疫苗中，每1mL病毒保存试剂中含有0.5×10¹¹-1×10¹²vp病毒载体，优选为1×10¹¹vp。

优选地，所述的病毒疫苗为腺病毒载体疫苗。

所述的疫苗为SARS-CoV-2冠状病毒疫苗；所述的SARS-CoV-2冠状病毒疫苗中包括E1、E3区完全缺失、部分缺失或不缺失的C亚类的5型腺病毒。

再一方面，本发明提供了一种疫苗。

所述的疫苗中包括前述的病毒疫苗保存试剂。

所述的疫苗中包括病毒载体。

所述的疫苗针对的病毒包括但不限于冠状病毒、流感病毒；优选为 SARS-CoV-2冠状病毒。

所述的疫苗中，每1mL病毒保存试剂中含有0.5×10¹¹-1×10¹²vp病毒载体，优选为1×10¹¹vp。

优选地，所述的病毒疫苗为腺病毒载体疫苗。

所述的疫苗为SARS-CoV-2冠状病毒疫苗；所述的SARS-CoV-2冠状病毒疫苗中包括E1、E3区完全缺失、部分缺失或不缺失的C亚类的5型腺病毒。

又一方面，本发明提供了前述病毒保存试剂的制备方法。

所述的制备方法包括以下步骤：

(1)准备高压灭菌后的配液桶、储液桶、玻璃接头及0.45μm+0.22μm滤器；

(2)利用电子天平或精密电子天平称按前述病毒保存试剂的种类及配比称取试剂；

加入适量的注射用水，并用磁力搅拌器使其溶解；

(3)利用稀盐酸调整溶液pH，并补充注射用水至相应重量，继续使用磁力搅拌器使其充分溶解；

(4)利用0.45μm+0.22μm滤器将溶液除菌过滤(压力<1bar)至储液桶中，并进行必要项目的检测。

所述的步骤(4)中必要项目包括但不限于：细胞毒性、含菌量、稳定性，复溶稳定性。

又一方面，本发明提供了前述疫苗的制备方法。

所述的制备方法中包括：利用中空纤维柱进行超滤置换的方式将重组冠状病毒疫苗粗产品的溶剂替换为前述病毒保存液。

所述的超滤置换步骤如下：

(1)中空纤维柱准备：先后用注射用水、0.5M NaOH、注射用水、病毒保存液清洗中空纤维柱。

(2)超滤：在层析冷柜中对SARS-CoV-2疫苗精纯产物进行超滤。

(3)溶液置换：在浓缩后样品中，重复3次加入2倍体积的病毒保存液，并重复超滤，直至样品体积缩小至原体积的(50-60)％，并排空中空纤维柱，获得病毒疫苗原液。

(4)清洗中空纤维柱。

附图说明

图1为病毒保存试剂的细胞毒性。

图2为37℃条件下，重组冠状病毒疫苗在不同pH病毒保存试剂中的稳定性检测结果。

图3为4℃条件下，重组冠状病毒疫苗在不同病毒保存试剂中的稳定性检测结果。

图4为25℃条件下，重组冠状病毒疫苗在不同病毒保存试剂中的稳定性检测结果。

图5为37℃条件下，重组冠状病毒疫苗在不同病毒保存试剂中的加速稳定性检测结果。

图6为重组冠状病毒疫苗在不同病毒保存试剂中反复冻融稳定性检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1一种病毒疫苗保存试剂

本实施例的病毒疫苗保存试剂包括以下成分：NaCl、Tris-base、MgCl₂·6H₂O、甘油、水。

其配制方法为：

(1)准备20L Nalgene配液桶和储液桶。储液桶连接玻璃接头和0.45μm +0.22μm滤器，高压灭菌。

(2)将磁力搅拌器置于电子秤上，将20L配液桶放在磁力搅拌器上，去皮。

(3)按下表中配方，用电子天平称取氯化钠，用精密电子天平称取氨基丁三醇、六水氯化镁，将称好的试剂置于3000mL烧杯中。加注射用水1L，用药匙将烧杯中试剂搅拌起来，倒进配液桶，用2000mL烧杯接注射用水冲洗3000mL 烧杯，冲洗水倒入配液桶中。

序号	名称	20L标准配方
			1	氨基丁三醇Tris	24.22g±0.024g
2	六水氯化镁MgCl<sub>2</sub>·6H<sub>2</sub>O	4.06g±0.012g
			3	甘油	2000mL±2.0g
4	氯化钠NaCl	116.88g±0.1g
			5	稀盐酸HCl	调至pH 8.0
6	注射用水	定容至20L

(4)用3000mL烧杯在电子天平称取甘油，倒入配液桶中搅拌，用2000mL 烧杯接注射用水冲洗3000mL烧杯三次，冲洗水倒入配液桶中。

(5)边搅拌边加注射用水至15kg。

(6)用pH计在线检测溶液pH，用移液管吸取稀盐酸，缓慢滴加至配液桶，调节pH至8.0±0.1后，加注射用水至最终重量(18.145kg+甘油重量±0.02kg)，搅拌至少5分钟。

(7)盖好桶盖，在超净台中连接储液桶上的0.45μm+0.22μm滤器，除菌过滤(压力<1bar)至储液桶中，在储液桶上标记溶液名称，批号，配制日期，有效期6个月，室温保存。取3支样品检测无菌、支原体，确保无外源污染。

实施例2病毒保存试剂的细胞毒性检测

对实施例1提供的病毒疫苗保存试剂的细胞毒性进行检测，并设置对比例。

对比例的病毒保存试剂成分如下：

对比例1(PBS保存液)：Na₂HPO₄ 8mM、KH₂PO₄ 42mM、NaCl 136mM和 KCl 2.6mM。

对比例2(Hank's保存液，常规配方)：NaCl、KCl、KH₂PO4、Na₂HPO₄、 NaHCO₃、CaCl₂、MgCl₂、MgSO₄。

细胞毒性检测具体步骤如下：

(1)准备细胞：

取293细胞消化传代培养至约90％汇合度。常规消化细胞，收集细胞悬液计数。用10％FBS DMEM(FBS购于YOSHI，货号为A1025；DMEM购于Gibco，货号为C11995500BT)制备4mL1×10⁵/mL 293细胞悬液，混匀接种于96孔板 7-11列B-G行，100μL/孔，即每孔有1×10⁴个细胞。余下四边每孔只加培养基 100μL，置于37℃、5％CO₂条件下培养24h。

(2)准备样品：

A组：(10％FBS DMEM 100μL)×8

B组：(10％FBS DMEM 95μL+PBS保存液5μL)×8

C组：(10％FBS DMEM 95μL+Hank’s保存液5μL)×8

D组：(10％FBS DMEM 95μL+病毒保存液5μL)×8

分别混匀，备用。

(3)吸弃孔内培养基，每孔按不同组各加入100μL样品，置于37℃、5％CO₂条件下培养直至A组达到80％汇合度左右。

(4)检测：

培养48h后对照组细胞汇合度达到80％。每孔加入10μL CCK-8，轻敲板壁混匀，置于37℃、5％CO₂条件下培养。1h后达到橘黄色，放入酶标仪在450nm 下读取数值并记录结果。

结果如下：

每100μL完全培养基中加入5μL PBS后，对细胞生长平均抑制率为6.0％；每100μL完全培养基中加入5μL Hank's液后，对细胞生长平均抑制率为13.2％；每100μL完全培养基中加入5μL本病毒保存液后，对细胞生长平均抑制率为 12.0％；详细数据见下表及附图1。

分组	平均吸光值	细胞存活率(％)	抑制率(％)
				A(对照组)	0.743	100.0	0
B(PBS保存液)	0.696	93.7	6.0
				C(Hank's保存液)	0.644	86.6	13.2
D(病毒保存液)	0.652	87.8	12.0

Hank's平衡盐溶液与PBS是细胞分离或培养中常用的磷酸盐缓冲液，均集缓冲液的缓冲能力与生理盐水的等渗性为一体，具有维持渗透压、保持pH稳定的作用。Hank's平衡盐溶液对细胞基本没有伤害作用。本病毒保存液加入细胞后，对细胞生长的抑制率为12％，小于Hank's液13.2％的抑制率。综合而言，本病毒保存液对细胞的毒性较低，低于Hank's平衡盐溶液，略高于PBS。

实施例3一种重组冠状病毒疫苗

采用实施例1提供的病毒疫苗保存试剂制备重组冠状病毒疫苗，主要通过超滤置换的方式。

本实施例采用的重组冠状病毒疫苗为SARS-CoV-2冠状病毒疫苗，所述的疫苗在超滤置换前的制备步骤如下：

(1)对SARS-CoV-2冠状病毒的S基因进行优化，优化后的S基因的序列为SEQ IDNO：3。

(2)取得SARS-CoV-2S基因的优化序列后，用PCR方法对进行扩增。扩增引物为V1与V2，其各自的序列如SEQ ID NO：1-2所示，VI和V2为一对，扩增S1基因C端片段S1C。

(3)PCR产物经跑胶鉴定与切胶回收后，用SmaI与HindIII在37℃条件下进行酶切。同时用这两种酶对pShuttle载体进行酶切。

(4)用T4连接酶将酶切后的PCR产物与pShuttle在16℃条件进行过夜连接。

(5)将连接产物转化大肠杆菌DH5a，利用氨苄抗性筛选阳性克隆，并挑选克隆进行菌落PCR鉴定。阳性菌落经培养后提取质粒，并送测序以确认序列。

(6)获得正确的重组SARS-CoV-2S1C基因的pShuttle质粒后，将其与腺病毒骨架质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共同转染至293细胞中以包装重组腺病毒。

(7)病毒的收集采用挑空斑的方式：在培养液中加入低溶点琼脂糖，转染后一般在第10-21天可以在显微镜下看到小的空斑。空斑形成后将空斑与琼脂糖一起挑起，放入1mL新鲜培养基中过夜。通常挑取3-6个空斑不等，然后比较滴度，使用滴度最高的一个空斑进行后续实验。

(8)将培养基中病毒加入新鲜293细胞培养液中进行病毒少量扩增。至细胞再次出现空斑，收集细胞及上清，反复冻融三次收集病毒，以此病毒为P1代病毒。

(9)以P1代病毒感染293细胞，连续进行三代感染，至P4代进行病毒的大量扩增，待空斑形成后收集病毒并对病毒进行柱层析纯化和浓缩。

(10)纯化后获得的产物即为SARS-CoV-2疫苗精纯产物。SARS-CoV-2疫苗包含SARS-CoV-2病毒S1C基因和缺陷型腺病毒。缺陷型腺病毒为E1与E3 区完全缺失的C亚类的5型腺病毒，不能在普通的人体细胞内复制。

超滤置换步骤如下：

(1)中空纤维柱准备：先后用注射用水、0.5M NaOH、注射用水、病毒保存液清洗中空纤维柱。

(2)超滤：在层析冷柜中对SARS-CoV-2疫苗精纯产物进行超滤。

(3)溶液置换：在浓缩后样品中，重复3次加入2倍体积的病毒保存液，并重复超滤，直至样品体积缩小至原体积的(50-60)％，并排空中空纤维柱，获得病毒疫苗原液。

(4)清洗中空纤维柱。

实施例4在37℃条件下，重组冠状病毒疫苗在不同pH病毒保存试剂中的稳定性检测

含不同pH病毒保存试剂的重组冠状疫苗的制备方法：

参考实施例1，区别为在第(6)步，将未调整pH的病毒保存试剂分为5组，分别加入不同量的HCl，同时用pH计进行监测，以获取pH分别为7.63、7.79、 8.03、8.21、8.43的病毒保存试剂。

参考实施例3，区别为超滤置换步骤(3)溶液置换步骤中，分别用不同pH 的病毒保存液对超滤浓缩后样品进行溶液置换，以获取溶液pH不同的重组冠状病毒疫苗，并对该系列重组冠状病毒疫苗进行稳定性检测。

对上述重组冠状病毒疫苗分组，每组各置于37℃条件下24h，并检测相应的病毒感染滴度。

检测方法如下：

(1)取一瓶293细胞，弃去原瓶中培养液，加入胰酶把细胞消化下来，用完全培养基(含10％血清的DMEM)终止消化；

(2)细胞悬液计数，稀释至10⁵/mL；

(3)将293细胞接种到12孔板中，每孔1mL，37℃，5％CO₂培养24h-48h；

(4)转染病毒前，取孔板其中一孔吸干培养液，加入胰酶(购自AMRESCO，货号为0458-25G)消化，待显微镜下观察到细胞脱落壁面，加入完全培养基终止消化，取细胞悬液计数，记录孔中细胞数量，此孔保留细胞悬液，当做空白对照孔；

(5)将待测样品稀释，根据估测的样品浓度作1:100稀释(若样品浓度高， 可进行1:1000稀释)，按照下表加入不同量的病毒稀释液，72h观察结果；

(6)计算感染滴度，公式为：滴度＝(细胞数×20÷体积)×10×1000

结果如下表及附图2：

pH	7.63	7.79	8.03	8.21	8.43
						病毒感染滴度	3.51×10<sup>10</sup>	3.51×10<sup>10</sup>	3.51×10<sup>10</sup>	3.51×10<sup>10</sup>	2.83×10<sup>10</sup>

根据以上结果可知：

病毒保存液pH在7.63-8.21之间时，病毒均能维持较高的活性。

实施例5在4℃条件下，重组冠状病毒疫苗在不同病毒保存试剂中的稳定性检测

对实施例3提供的重组冠状病毒疫苗进行稳定性检测，并设置对比例。

对比例的病毒保存试剂成分同实施例2中对比例1和对比例2。

对实施例3提供的重组冠状病毒疫苗分组，每组各置于4℃条件下3天、7 天、14天，并检测相应天数下的病毒感染滴度。

检测方法参考实施例4。

结果如下表及附图3。下表为病毒感染滴度检测结果。

	本申请病毒保存液	PBS保存液	Hank's保存液
				第3天	100.2％	100％	100％
第7天	98％	75.8％	82.3％
				第14天	95％	39.5％	39.7％

根据以上结果可知：

4℃条件下，重组冠状病毒疫苗在本申请病毒保存液中保存14天，病毒感染滴度仅下降5％。而同样条件下，重组冠状病毒疫苗在PBS保存液中保存14天，病毒感染滴度下降了60.5％；在Hank's保存液中保存14天，病毒感染滴度下降了60.3％。

总体而言，4℃条件下，相对于其它类型病毒保存液，重组冠状病毒疫苗在本申请提供的病毒保存液中14天内仍能够维持较高的感染活性。

实施例6 25℃条件下，重组冠状病毒疫苗在不同病毒保存试剂中的稳定性检测

对实施例3提供的重组冠状病毒疫苗进行稳定性检测，并设置对比例。

对比例的疫苗的病毒保存试剂成分同实施例2中对比例1和对比例2。

对实施例3提供的重组冠状病毒疫苗分组，每组各置于25℃条件下2h、4h、 8h、24h，并检测相应时间点的病毒感染滴度。

检测方法参考实施例4。

结果如下表及附图4。下表为病毒感染滴度检测结果。

	本申请病毒保存液	PBS保存液	Hank's保存液
				2h	99.2％	100％	100％
4h	99.2％	100％	80％
				8h	99.2％	75.1％	64.3％
24h	93％	62.5％	32％

根据以上结果可知：

25℃条件下，重组冠状病毒疫苗在本病毒保存液中保存8h，病毒感染滴度基本维持不变；保存24h后，病毒感染滴度也仅下降7％。而同样条件下，重组冠状病毒疫苗在PBS保存液中保存4h后，在Hank's保存液中保存2h后，病毒感染滴度便低于80％，且感染滴度下降速率较高。

总体而言，25℃条件下，相对于其它类型病毒保存液，重组冠状病毒疫苗在本病毒保存液中24h内仍能够维持较高的感染活性。

实施例7 37℃条件下，重组冠状病毒疫苗在不同病毒保存试剂中的加速稳定性检测

对实施例3提供的重组冠状病毒疫苗进行稳定性检测，并设置对比例。

对比例的疫苗中病毒保存试剂成分同实施例2中对比例1和对比例2。

对实施例3提供的重组冠状病毒疫苗分组，每组各置于37℃条件下1天、3 天、5天、7天，并检测相应时间点的病毒感染滴度。

检测方法参考实施例4。

结果如下表及附图5。下表为病毒感染滴度检测结果。

	本申请病毒保存液	PBS保存液	Hank's保存液
				1天	98％	83.5％	62.8％
3天	91.2％	69.7％	62.8％
				5天	91.2％	69.7％	50.3％

根据以上结果可知：

37℃条件下，重组冠状病毒疫苗在本发明提供的病毒保存液中保存5天，病毒感染滴度基本维持不变，均能够维持在90％以上。而同样条件下，重组冠状病毒疫苗在PBS或Hank's保存液中保存5天后，病毒感染滴度急剧下降。

总体而言，37℃条件下，相对于其它类型病毒保存液，重组冠状病毒疫苗在本申请病毒保存液中5天内仍能够维持较高的感染活性；而在其它类型保存液中，重组冠状病毒疫苗保存1天后，病毒感染滴度活性便大幅度下降。

实施例8重组冠状病毒疫苗在不同病毒保存试剂中反复冻融稳定性检测

对实施例3提供的重组冠状病毒疫苗进行反复冻融稳定性检测，并设置对比例。

对比例的疫苗中病毒保存试剂成分同实施例2中对比例1和对比例2。

对实施例3提供的重组冠状病毒疫苗分组，每组冻融3次、5次、10次后，检测相应的病毒感染滴度。

检测方法参考实施例4。

结果如下表及附图6。下表为病毒感染滴度检测结果。

	本病毒保存液	PBS保存液	Hank's保存液
				3次	99.2％	85.9％	85.9％
5次	101.2％	89.8％	89.8％
				10次	98.6％	89.8％	79％

根据以上结果可知：

重组冠状病毒疫苗在本病毒保存液中反复冻融10次后，病毒感染滴度基本维持不变。而重组冠状病毒疫苗在PBS或Hank's保存液中冻融3次、5次、10 次后，病毒感染滴度均有不同程度的下降。

总体而言，重组冠状病毒疫苗在本病毒保存液中反复冻融3-10次均能够保持较高的病毒活性。

序列表

<110> 广州达博生物制品有限公司

<120> 一种病毒保存试剂

<130> 20201010

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

tcccccggga tgagggtgca gccaaccgag 30

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

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<210> 3

<211> 3822

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

atgttcgtct tcctggtcct gctgcctctg gtctcctcac agtgcgtcaa tctgacaact 60

cggactcagc tgccacctgc ttatactaat agcttcacca gaggcgtgta ctatcctgac 120

aaggtgttta gaagctccgt gctgcactct acacaggatc tgtttctgcc attctttagc 180

aacgtgacct ggttccacgc catccacgtg agcggcacca atggcacaaa gcggttcgac 240

aatcccgtgc tgccttttaa cgatggcgtg tacttcgcct ctaccgagaa gagcaacatc 300

atcagaggct ggatctttgg caccacactg gactccaaga cacagtctct gctgatcgtg 360

aacaatgcca ccaacgtggt catcaaggtg tgcgagttcc agttttgtaa tgatcccttc 420

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ggcgctgccg cctactatgt gggctacctc cagccccgga ccttcctgct gaagtacaac 840

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tgtacactga agtcctttac cgtggagaag ggcatctatc agacatccaa tttcagggtg 960

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gtgttcaacg caacccgctt cgccagcgtg tacgcctgga ataggaagcg gatcagcaac 1080

tgcgtggccg actatagcgt gctgtacaac tccgcctctt tcagcacctt taagtgctat 1140

ggcgtgtccc ccacaaagct gaatgacctg tgctttacca acgtctacgc cgattctttc 1200

gtgatcaggg gcgacgaggt gcgccagatc gcccccggcc agacaggcaa gatcgcagac 1260

tacaattata agctgccaga cgatttcacc ggctgcgtga tcgcctggaa cagcaacaat 1320

ctggattcca aagtgggcgg caactacaat tatctgtacc ggctgtttag aaagagcaat 1380

ctgaagccct tcgagaggga catctctaca gaaatctacc aggccggcag caccccttgc 1440

aatggcgtgg agggctttaa ctgttatttc ccactccagt cctacggctt ccagcccaca 1500

aacggcgtgg gctatcagcc ttaccgcgtg gtggtgctga gctttgagct gctgcacgcc 1560

ccagcaacag tgtgcggccc caagaagtcc accaatctgg tgaagaacaa gtgcgtgaac 1620

ttcaacttca acggcctgac cggcacaggc gtgctgaccg agtccaacaa gaagttcctg 1680

ccatttcagc agttcggcag ggacatcgca gataccacag acgccgtgcg cgacccacag 1740

accctggaga tcctggacat cacaccctgc tctttcggcg gcgtgagcgt gatcacaccc 1800

ggcaccaata caagcaacca ggtggccgtg ctgtatcagg acgtgaattg taccgaggtg 1860

cccgtggcta tccacgccga tcagctgacc ccaacatggc gggtgtacag caccggctcc 1920

aacgtcttcc agacaagagc cggatgcctg atcggagcag agcacgtgaa caattcctat 1980

gagtgcgaca tcccaatcgg cgccggcatc tgtgcctctt accagaccca gacaaactct 2040

cccagaagag cccggagcgt ggcctcccag tctatcatcg cctataccat gtccctgggc 2100

gccgagaaca gcgtggccta ctctaacaat agcatcgcca tcccaaccaa cttcacaatc 2160

tctgtgacca cagagatcct gcccgtgtcc atgaccaaga catctgtgga ctgcacaatg 2220

tatatctgtg gcgattctac cgagtgcagc aacctgctgc tccagtacgg cagcttttgt 2280

acccagctga atagagccct gacaggcatc gccgtggagc aggataagaa cacacaggag 2340

gtgttcgccc aggtgaagca aatctacaag acccccccta tcaaggactt tggcggcttc 2400

aatttttccc agatcctgcc tgatccatcc aagccttcta agcggagctt tatcgaggac 2460

ctgctgttca acaaggtgac cctggccgat gccggcttca tcaagcagta tggcgattgc 2520

ctgggcgaca tcgcagccag ggacctgatc tgcgcccaga agtttaatgg cctgaccgtg 2580

ctgccacccc tgctgacaga tgagatgatc gcacagtaca caagcgccct gctggccggc 2640

accatcacat ccggatggac cttcggcgca ggagccgccc tccagatccc ctttgccatg 2700

cagatggcct ataggttcaa cggcatcggc gtgacccaga atgtgctgta cgagaaccag 2760

aagctgatcg ccaatcagtt taactccgcc atcggcaaga tccaggacag cctgtcctct 2820

acagccagcg ccctgggcaa gctccaggat gtggtgaatc agaacgccca ggccctgaat 2880

accctggtga agcagctgag cagcaacttc ggcgccatct ctagcgtgct gaatgacatc 2940

ctgagccggc tggacaaggt ggaggcagag gtgcagatcg accggctgat caccggccgg 3000

ctccagagcc tccagaccta tgtgacacag cagctgatca gggccgccga gatcagggcc 3060

agcgccaatc tggcagcaac caagatgtcc gagtgcgtgc tgggccagtc taagagagtg 3120

gacttttgtg gcaagggcta tcacctgatg tccttccctc agtctgcccc acacggcgtg 3180

gtgtttctgc acgtgaccta cgtgcccgcc caggagaaga acttcaccac agcccctgcc 3240

atctgccacg atggcaaggc ccactttcca agggagggcg tgttcgtgtc caacggcacc 3300

cactggtttg tgacacagcg caatttctac gagccccaga tcatcaccac agacaacacc 3360

ttcgtgagcg gcaactgtga cgtggtcatc ggcatcgtga acaataccgt gtatgatcca 3420

ctccagcccg agctggacag ctttaaggag gagctggata agtatttcaa gaatcacacc 3480

tcccctgacg tggatctggg cgacatcagc ggcatcaatg cctccgtggt gaacatccag 3540

aaggagatcg accgcctgaa cgaggtggct aagaatctga acgagagcct gatcgacctc 3600

caggagctgg gcaagtatga gcagtacatc aagtggccct ggtacatctg gctgggcttc 3660

atcgccggcc tgatcgccat cgtgatggtg accatcatgc tgtgctgtat gacatcctgc 3720

tgttcttgcc tgaagggctg ctgtagctgt ggctcctgct gtaagtttga cgaggatgac 3780

tctgaacctg tgctgaaggg cgtgaagctg cattacacct aa 3822

Claims (10)

1.一种病毒保存试剂，其特征在于，包括以下成分：NaCl、Tris-base、MgCl₂·6H₂O、甘油、水，并用HCl调整溶液pH。

2.根据权利要求1所述的病毒保存试剂，其特征在于，每1L病毒保存试剂中：NaCl含量为5.85±0.585g、Tris-base为1.21±0.121g、MgCl₂·6H₂O为0.2±0.02g、甘油为100±10mL、注射用水补足至1000mL。

3.根据权利要求1所述的病毒保存试剂，其特征在于，所述的试剂的pH为7.4-8.4。

4.根据权利要求1所述的病毒保存试剂，其特征在于，所述的病毒为腺病毒、慢病毒、逆转录病毒。

5.根据权利要求2所述的病毒保存试剂，其特征在于，每1L病毒保存试剂中：NaCl含量为5.85g、Tris-base为1.21g、MgCl₂·6H₂O为0.2g、甘油为100mL、注射用水补足至1000mL。

6.根据权利要求4所述的病毒保存试剂，其特征在于，所述的病毒为腺病毒。

7.权利要求1-6任一项所述的病毒保存试剂在制备疫苗中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的疫苗为重组冠状病毒疫苗；所述的疫苗为SARS-CoV-2冠状病毒疫苗；所述的SARS-CoV-2冠状病毒疫苗中包括E1、E3区完全缺失、部分缺失或不缺失的C亚类的5型腺病毒。

9.一种重组冠状病毒疫苗，其特征在于，所述的疫苗中包括权利要求1-6任一项所述的病毒保存试剂。

10.一种重组冠状病毒疫苗的制备方法，其特征在于，所述的制备方法中包括：利用中空纤维柱进行超滤置换的方式将重组冠状病毒疫苗粗产品的溶剂替换为前述病毒保存液。

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