CN106755580A - 一种快速检测伪狂犬病病毒的试剂盒及其检测方法 - Google Patents

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吕素芳
韩强
刘吉山
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Abstract

本发明涉及病原微生物检测技术领域，特别公开了一种快速检测伪狂犬病病毒的试剂盒及其检测方法。该快速检测伪狂犬病病毒的试剂盒，其特征为，包括如下内容：棉棒、EP管、病毒保存液、病毒提取液Ⅰ、病毒提取液Ⅱ、PCR mix、PCR引物、灭菌双蒸水、PCR反应管、阴性对照与阳性对照、琼脂糖、50×TAE 核酸电泳缓冲液，操作说明书。本发明检测方便快速，省时省力，简单易学，最大程度上保护了实验人员和环境的生物安全，降低了采样成本和运输成本，符合环保要求，易于在基层实验室推广使用。

Description

一种快速检测伪狂犬病病毒的试剂盒及其检测方法
（一）技术领域
本发明涉及病原微生物检测技术领域，特别涉及一种快速检测伪狂犬病病毒的试剂盒及其检测方法。
（二）背景技术
目前，检测伪狂犬病病毒的传统方法是采集生病动物的组织，经组织匀浆器研磨、离心机高速离心，再对离心后的上清液进行病毒核酸DNA提取，或者是直接采集生病动物血液样本病理新后进行核酸DNA提取，最后是进行PCR反应和电泳检测。整个过程不仅费时费力，而且采集的病料组织或血液样本需要低温冷冻或冷藏保存，运输成本增加，不符合环保要求；其次，病料组织或血液，还有核酸提取用到的邮寄溶剂等都容易对实验人员和环境造成二次污染或威胁，不利于生物安全要求。如果是购买试剂盒进行核酸提取的话，更是增加了检测成本，还有操作流程要求实验人员具备较高的专业技术水平和业务素养，对于一线养殖场或基层实验室来说不易普及。
（三）发明内容
本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种省时省力、减少二次污染的快速检测伪狂犬病病毒的试剂盒及其检测方法。
本发明是通过如下技术方案实现的：
一种快速检测伪狂犬病病毒的试剂盒，其特征为，包括如下内容：棉棒、EP管、病毒保存液、病毒提取液Ⅰ、病毒提取液Ⅱ、PCR mix、PCR引物、灭菌双蒸水、PCR反应管、阴性对照与阳性对照、琼脂糖、50×TAE 核酸电泳缓冲液，操作说明书。
所述棉棒为不同规格大小的若干个。
所述病毒保存液为1×PBS缓冲液；配置方法为称取8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4和0.24gKH2PO4，溶于800ml蒸馏水中，用盐酸调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可；在15lbf/in2高压下蒸气灭菌，保存于室温或4℃冰箱中。
所述50×TAE 核酸电泳缓冲液，每个试剂盒装量1瓶，20mL/瓶；Tris 242g，Na2EDTA.2H2O 37.2g，加入800mL的去离子水，搅拌溶解后加入57.1mL醋酸，搅拌，定容至1L，室温保存。
所述PCR引物为根据伪狂犬基因序列Genbank号：KX147097保守区域设计而来。
所述阴性对照为双蒸水，阳性对照为猪伪狂犬病病毒感染BHK-21细胞后收获的细胞毒提取的核酸DNA。
本发明的试剂盒不仅省时省力，大大缩短了等待结果的时间，而且不需要对生病动物采集血液或剖检取病料组织等繁琐复杂的操作，减少对操作人员和环境的二次污染；只需用棉棒沾取动物的鼻试子即可，节约动物成本；鼻试子进入专用病毒保存溶液中后，可常温保存6-7天，不像病料组织和血液样本那样需要低温冷冻或冷藏保存运输，常温运输即可，节约资源成本，符合环保要求，省去了提取病毒核酸DNA繁琐的步骤，鼻试子病毒液采用专用的病毒提取溶液，只需要两步离心即可，上清液可直接进行后续PCR检测等步骤，不需要购买核酸提取试剂盒等，节约检测成本和时间，操作简单易学，尤其适用于基层技术人员熟练掌握和推广。
本发明所述的快速检测伪狂犬病病毒的试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
（1）采样时，选择合适大小的棉棒，伸入待测动物鼻腔中旋转一圈，即可取出；
（2）掐断长柄后，将棉棒头放入EP管中，加入病毒保存液，盖上EP管盖，即可常温保存运输或放置在4℃下保存，即为鼻拭子样本；
（3）按照操作说明书，进行鼻拭子样本的核酸提取试验；
（4）进行PCR反应及核酸电泳检测，观察结果；
（5）当阳性对照出现800bp大小条带，而阴性对照没有出现800bp大小条带时，本次试验结果成立；如待测样品出现与阳性对照大小一致条带则为伪狂犬病毒感染，否则为未感染伪狂犬病毒的样品。
步骤（3）中，核酸提取试验的步骤为，在40μlAD1 Buffer 中加入10μl的AD2Buffer，用枪头吸打均匀，将10μl鼻试子样本直接加入AD1和AD2的混合液中，用枪头吸打均匀；室温孵育10min，之后95℃孵育3min；加入40uμl AD3 Buffer，混匀后可直接作为PCR模板使用。
本发明检测方便快速，省时省力，简单易学，最大程度上保护了实验人员和环境的生物安全，降低了采样成本和运输成本，符合环保要求，易于在基层实验室推广使用。
（四）附图说明
下面结合附图对本发明作进一步的说明。
图1为猪伪狂犬病病毒快速检测试剂盒检测猪鼻试子的PCR结果示意图；
图2为牛伪狂犬病病毒快速检测试剂盒检测牛鼻试子的PCR结果示意图。
图1中，S1、S2、S3为猪鼻试子样品1、2、3，N为阴性对照，P为阳性对照，M为2000Marker；其中S1、S2、S3和阳性对照有一样大小条带，即为感染伪狂犬病病毒的样品；
图2中，S1、S2、S3为牛鼻试子样品1、2、3，N为阴性对照，P为阳性对照，M为2000 Marker；其中S1、S2和阳性对照有一样大小条带，即为感染伪狂犬病病毒的样品；S3和阴性对照结果相同，即为未感染伪狂犬病病毒的样品。
（五）具体实施方式
附图为本发明的一种具体实施例。该实施例包括如下内容：棉棒、EP管、病毒保存液、病毒提取液Ⅰ、病毒提取液Ⅱ、PCR mix、PCR引物、灭菌双蒸水、PCR反应管、阴性对照与阳性对照、琼脂糖、50×TAE 核酸电泳缓冲液，操作说明书。
实施例1：上述快速检测猪、牛、羊、犬等伪狂犬病病毒的试剂盒的检测方法，包括步骤：
（1）采样时，选择合适大小的棉棒，深入猪、牛、羊、犬等鼻腔中旋转一圈，即可取出；
（2）掐断长柄后将棉棒头放入EP管中，加入适量病毒保存液，盖上EP管盖即可常温保存运输或放置4℃保存，即为鼻腔试子样本；
（3）按照北京全式金生物技术有限公司Trans Direct Animal Tissue PCR Kit操作说明书，进行鼻试子样本的核酸提取试验，步骤如下：
A:在40μlAD1 Buffer 中加入10μl的AD2 Buffer，用枪头吸打均匀（如需提取样品过多，可将AD1 和AD2按照4:1的比例混合，两个小时内使用）；
B:将10μl鼻试子直接加入AD1和AD2的混合液中，用枪头吸打均匀；
C：室温孵育10min，之后95℃孵育3min，加入40μlAD3 Buffer，混匀后可直接作为PCR模板使用。
（4）进行PCR反应及核酸电泳检测，观察结果；
（5）判断：当阳性对照出现800bp左右大小条带而阴性对照没有出现800bp左右大小条带时，本次试验结果成立；如待测样品出现与阳性对照大小一致条带则为伪狂犬病毒感染，否则为未感染伪狂犬病毒的样品。
所述试剂盒中的病毒保存液、PCR mix、PCR引物、琼脂糖、50×TAE 核酸电泳缓冲液，其成分及配制方法如下：
（1）病毒保存液：1×PBS缓冲液；称取8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4和0.24gKH2PO4，溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可；在15lbf/in2(1034×105Pa)高压下蒸气灭菌（至少20分钟），保存存于室温或4℃冰箱中；
（2）PCR mix：购自大连宝生物公司，名称Premix TaqTM (LA TaqTM Version 2.0),货号为RR900A；置冰箱-20℃冷冻长期保存；
（3）PCR引物：通过对Genbank中登录的国内不同伪狂犬病毒分离株的基因序列比较分析，设计一对特异性PCR引物，置冰箱-20℃冷冻长期保存；
（4）琼脂糖：购自Amerasco公司，室温保存；
（5）50×TAE 核酸电泳缓冲液：每个试剂盒装量1瓶，20mL/瓶。Tris242 g，Na2EDTA.2H2O 37.2g，加入800mL的去离子水，搅拌溶解后加入57.1mL醋酸，搅拌，定容至1L，室温保存。
实施例2：伪狂犬病毒基因的克隆与扩增
（1）目的基因选择
在试验中选取伪狂犬病毒基因组上保守的gB基因全长上一段保守序列作为目的基因，选取目的基因大小为1300bp左右。
（2）引物设计
F：ATGGCGGCCGTGACGCGGGCCGCCTCGGCCT；
R：CTAGCTCCACCTGCTGGAAGCGCCCGGG；
由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
（3）PCR模板
阳性模板选取猪伪狂犬病病毒SA株基因组；样品模板用病料提取基因组。
（4）PCR体系
Premix TaqTM(LA TaqTM Version 2.0) 5ul；
Forward Premier 0.5ul；
Reserve Premier 0.5ul；
模板 1ul；
ddH2O 3ul。
（5）PCR程序
96℃ 5min；
；
72℃ 10min；
10℃ forever。
（6）试验结果
见附图1和附图2.
实施例3：快速检测猪、牛、羊、犬等伪狂犬病病毒的试剂盒组装
试剂盒的组装：将棉棒、EP管、病毒保存液、AD1 Buffer、AD2 Buffer、AD3 Buffer、Premix TaqTM(LA TaqTM Version 2.0)、PCR引物、灭菌双蒸水、PCR反应管、阴性对照与阳性对照、琼脂糖、50×TAE 核酸电泳缓冲液、操作说明书组装入试剂盒。
注：试剂盒4℃保存；Premix TaqTM(LA TaqTM Version 2.0) -20℃保存；50×TAE需用蒸馏水稀释至1×TAE使用。

Claims (8)

1.一种快速检测伪狂犬病病毒的试剂盒，其特征为，包括如下内容：棉棒、EP管、病毒保存液、病毒提取液Ⅰ、病毒提取液Ⅱ、PCR mix、PCR引物、灭菌双蒸水、PCR反应管、阴性对照与阳性对照、琼脂糖、50×TAE 核酸电泳缓冲液，操作说明书。
2.根据权利要求1所述的快速检测伪狂犬病病毒的试剂盒，其特征在于：所述棉棒为不同规格大小的若干个。
3.根据权利要求1所述的快速检测伪狂犬病病毒的试剂盒，其特征在于：所述病毒保存液为1×PBS缓冲液；配置方法为称取8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4和0.24gKH2PO4，溶于800ml蒸馏水中，用盐酸调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可；在15lbf/in2高压下蒸气灭菌，保存于室温或4℃冰箱中。
4.根据权利要求1所述的快速检测伪狂犬病病毒的试剂盒，其特征在于：所述50×TAE核酸电泳缓冲液，每个试剂盒装量1瓶，20mL/瓶；Tris 242g，Na2EDTA.2H2O 37.2g，加入800mL的去离子水，搅拌溶解后加入57.1mL醋酸，搅拌，定容至1L，室温保存。
5.根据权利要求1所述的快速检测伪狂犬病病毒的试剂盒，其特征在于：所述PCR引物为根据伪狂犬基因序列Genbank号：KX147097保守区域设计而来。
6.根据权利要求1所述的快速检测伪狂犬病病毒的试剂盒，其特征在于：所述阴性对照为双蒸水，阳性对照为猪伪狂犬病病毒感染BHK-21细胞后收获的细胞毒提取的核酸DNA。
7.根据权利要求1所述的快速检测伪狂犬病病毒的试剂盒的检测方法，其特征为，包括如下步骤：（1）采样时，选择合适大小的棉棒，伸入待测动物鼻腔中旋转一圈，即可取出；（2）掐断长柄后，将棉棒头放入EP管中，加入病毒保存液，盖上EP管盖，即可常温保存运输或放置在4℃下保存，即为鼻拭子样本；（3）按照操作说明书，进行鼻拭子样本的核酸提取试验；（4）进行PCR反应及核酸电泳检测，观察结果；（5）当阳性对照出现800bp大小条带，而阴性对照没有出现800bp大小条带时，本次试验结果成立；如待测样品出现与阳性对照大小一致条带则为伪狂犬病毒感染，否则为未感染伪狂犬病毒的样品。
8.根据权利要求1所述的快速检测伪狂犬病病毒的试剂盒的检测方法，其特征在于：步骤（3）中，核酸提取试验的步骤为，在40μlAD1 Buffer 中加入10μl的AD2 Buffer，用枪头吸打均匀，将10μl鼻试子样本直接加入AD1和AD2的混合液中，用枪头吸打均匀；室温孵育10min，之后95℃孵育3min；加入40uμl AD3 Buffer，混匀后可直接作为PCR模板使用。
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