CN111840535B - 利用无血清Vero细胞和狂犬病病毒rPV-2061制备狂犬病疫苗的工艺 - Google Patents

利用无血清Vero细胞和狂犬病病毒rPV-2061制备狂犬病疫苗的工艺 Download PDF

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Abstract

本发明公开了利用无血清Vero细胞和狂犬病病毒rPV‑2061制备狂犬病疫苗的工艺。本发明的工艺包括：以美国标准菌种保藏中心(ATCC)编号为CCL‑81.5的Vero细胞为病毒培养的宿主，接种狂犬病病毒rPV‑2061株，培养，制备成狂犬病病毒疫苗。本发明的特定宿主、病毒组合，可在无血清培养中大量扩增病毒；疫苗制备过程中，无需添加牛血清、胰酶、明胶和右旋糖酐，能达到极高的生产效率，且疫苗具有很高的效价和热稳定性。

Description

利用无血清Vero细胞和狂犬病病毒rPV-2061制备狂犬病疫苗 的工艺
技术领域
本发明属于疫苗领域。
背景技术
狂犬病是一种致死性疾病，一旦发病，其死亡率接近100％。主要表现为一种急性侵袭性病毒性脑炎，通过暴露于传染性病毒的涎液或其它途径传播，疾病可以从动物传播给动物，或者从动物传播给人类。绝大部分人类狂犬病的发生均源于犬咬伤，但猫、猴也是重要的病毒携带者。狂犬病疫苗是预防和治疗狂犬病的最有效手段之一。
目前我国国内生产使用的人用狂犬病疫苗主要有Vero细胞、原代地鼠肾细胞、人二倍体细胞3种细胞基质；液体和冻干两种成品剂型；1.0ml/剂和0.5ml/剂两种规格，主要使用的毒种为aG、CTN-1V、PV-2061、PM株，其中PM株主要用于人二倍体细胞狂犬病疫苗的生产，aG、CTN-1V、PV-2061株主要用于Vero细胞狂犬病疫苗的生产。
目前上市销售的冻干人用狂犬病疫苗通常在细胞的培养、细胞传代、病毒收获或成品配制过程中添加牛血清、动物源性胰酶、人血白蛋白、明胶及右旋糖酐等添加物。其中牛血清添加于细胞培养基，动物源性胰酶用于将细胞从培养容器表面分离，人血白蛋白经常在β-丙内酯灭活前添加到病毒维持液，明胶和右旋糖酐通常作为疫苗耐热保护剂。但是，这些添加物会带来安全问题。牛血清、动物源性胰酶可能携带多种病原体，人血白蛋白与灭活病毒用的β-丙内酯反应可引起1型(IgE)和3型(IgG-IgM)过敏反应，明胶和右旋糖酐也容易引起严重的过敏反应。因此，减少或杜绝疫苗生产中牛血清、动物源性胰酶、明胶、右旋糖酐的使用，避免人血白蛋白与β-丙内酯反应，可提升疫苗的安全性。
然而，为了保证生产的产量和效价，现有的狂犬病疫苗生产工艺大多数仍在使用牛血清、动物源性胰酶、人血白蛋白、明胶及右旋糖酐等添加剂(例如：专利申请CN102512686A、CN103690943A、CN106237339A等公开的相关工艺)。
现有文献中，有少数报道没有添加前述添加物(对人血白蛋白而言，指未在β-丙内酯处理前添加)的生产工艺。例如：孙燕等报道了一种无血清培养基培养Vero细胞制备狂犬病病毒的工艺，采用无血清培养基VP-S FM并借助微载体cytodex-1培养Vero细胞，培养3天后按MOI＝0.02接种狂犬病病毒CTN-1V株，收获病毒液的平均病毒滴度为6.5lgFFU/ml，与含血清培养基的工艺相当；平均病毒效力(效价)为6.77IU/ml，高于含血清培养基的工艺(无血清培养基培养Vero细胞制备狂犬病病毒工艺的建立，中国生物制品学杂志，2016年10月，第29卷第10期)。专利申请CN104826101A公开了一种冻干人用狂犬病疫苗制备方法，该方法在14L固定床式生物反应器(BIOFLO CELLIGEN 310)内，将Vero细胞粘附在片状载体上培养，完成细胞培养、病毒接种、连续收毒等工作，灭活病毒、纯化后，加入终浓度1％的人血白蛋白，形成原液，在不含明胶、人血白蛋白和右旋糖酐的冻干保护剂(含海藻糖60～90g/L、谷氨酸钠6～14g/L、尿素3～6g/L、L-精氨酸2～3g/L、199培养基10g/L)保护下冻干可得到效价5IU/剂(每剂0.5ml)的疫苗。可以看出，这些生产工艺存在产品效价偏低的问题。
综上，继续对现有的生产工艺进行改进，在不添加无牛血清、动物源性胰酶、人血白蛋白、明胶及右旋糖酐的情况下，高效制备得到高效价的狂犬病疫苗，具有显著的现实意义。
发明内容
本发明要解决的问题是：提供一种新的制备狂犬病疫苗的工艺。
本发明的技术方案如下：
一种制备狂犬病疫苗的工艺，所述工艺包括：
以美国标准菌种保藏中心(ATCC)编号为CCL-81.5的Vero细胞为病毒培养的宿主，接种狂犬病病毒rPV-2061株，培养，制备成狂犬病病毒疫苗。
如前述的工艺，所述工艺包括原液配制步骤：
(1)细胞培养：在生物反应器内无血清培养基灌流培养Vero细胞至0.6～0.7×107cells/ml，开始病毒接种；
(2)病毒接种：将狂犬病病毒rPV-2061按0.0025～0.01MOI接种到细胞，培养6h以上，开始使用无血清病毒维持液灌流培养；
(3)收毒：病毒接种后，从第3天开始收获病毒，得病毒收获液；
(4)灭活：使用β-丙内酯灭活病毒；
(5)酶切：使用核酸酶对Vero细胞宿主DNA进行酶切；
(6)纯化：分子筛层析纯化病毒；
(7)配制原液：加入终浓度0.5～3％(m/v)人血白蛋白和终浓度3～5％(m/v)的麦芽糖作为稳定剂，即为原液；
步骤(1)所述无血清培养液的组成为：
Vero细胞无血清培养基15.0～17.6g/L，谷丙二肽2～4mmol/L，果糖0.5～2.0g/L，Tricine 0.5～2.0g/L；
步骤(2)所述无血清病毒维持液的组成为：
Vero细胞无血清培养基15.0～17.6g/L，谷丙二肽2～4mmol/L，果糖0.5～2.0g/L，Tricine 0.5～2.0g/L，碳酸氢钠2～3g/L。
优选地，Vero细胞无血清培养基为Gibco公司的VP-SFM。
如前述的工艺，所述步骤(4)的β-丙内酯用量为病毒液的1/4000。
如前述的工艺，所述步骤(5)酶切条件为：45～180U/ml的非限制性核酸内切酶，于5～37℃酶切24小时以上。
如前述的工艺，所述步骤(6)的分子筛层析的填料是琼脂糖4FF；，流动相为pH 7.4～7.8的磷酸盐缓冲液。
如前述的工艺，所述步骤(7)的人血白蛋白用量为3％(m/v)。
如前述的工艺，所述步骤(7)的麦芽糖的用量为5％(m/v)。
如前述的工艺，所述工艺还包括向原液中加入冻干保护剂进行冷冻干燥；
所述冻干保护剂为含有3～5％(m/v)麦芽糖、0.5～3％(m/v)人血白蛋白的磷酸缓冲盐，缓冲液的pH为7.2～8.0。
如前述的工艺，所述冻干保护剂含有5％(m/v)麦芽糖、3％(m/v)人血白蛋白。
前述工艺制备得到的狂犬病疫苗。
本发明通过优化细胞株、病毒毒株、培养基等条件，达到了如下有益效果：
1)疫苗产品安全性高。疫苗无牛血清、动物源性胰酶、明胶及右旋糖酐等添加物，Vero细胞DNA和蛋白残留低。
2)疫苗产品效价高。每剂效价可达10IU以上。
3)疫苗产品热稳定性高。在37摄氏度放置28天后效价仍可维持在6.6IU/剂以上。
4)工艺生产效率高。30L生物反应器，每罐可生产16万剂。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
实施例1本发明的狂犬病疫苗的制备工艺
1.生产用细胞
无血清Vero细胞(Vero-SF-ACF)，从ATCC(American type culture collection，美国标准菌种保藏中心)引进，ATCC编号为CCL-81.5。
2.毒种
生产用毒种为狂犬病病毒固定毒rPV-2061株，从美国CDC引进。
3.原液制备
(1)细胞培养：无血清Vero细胞置于37℃培养，按1:5扩增传代，接种至片状载体反应器(属于固定床生物反应器，简称“生物反应器”，下同)内，生物反应器内细胞接种密度为6×105cells/ml，用无血清培养液进行灌流培养。所述无血清培养液配方为：
Figure BDA0002623428360000041
培养参数为：37℃、pH7.20、溶氧60％、转速100rpm灌流培养。
(2)病毒接种：当生物反应器内细胞密度达到0.7×107cells/ml时，将狂犬病病毒rPV-2061工作种子批毒种按0.005MOI接种，培养6～8h，开始灌流细胞维持液。
维持液配方：
Figure BDA0002623428360000042
培养参数为：34℃、pH7.50、溶氧60％、转速100rpm灌流培养。
(3)收毒：病毒连续收获15天(种毒后第3天至第17天)。单次病毒收获液(病毒滴度为6.5～7.5lgLD50/ml)，经0.65μm滤芯粗滤，通过300kD膜包进行20～30倍浓缩。
(4)灭活：于浓缩后的病毒收获液中按1:4000的比例加入β-丙内酯，置4℃，24小时灭活狂犬病病毒；于37℃下放置2小时，以水解β-丙内酯。
(5)纯化：加入140U/ml的核酸酶(非限制性核酸内切酶)，于37℃消化24小时。选择琼脂糖4FF作为填料进行分子筛层析纯化，以pH 7.6的磷酸盐缓冲液作为流动相，上样体积不超过柱体积的5％。
(6)配制原液：纯化后加入终浓度3％(m/v)人血白蛋白和终浓度5％(m/v)的麦芽糖作为稳定剂，配制成原液。
4.成品配制
(1)加入适量冻干保护剂作为稳定剂，得到半成品。
所述冻干保护剂为：含有5％(m/v)麦芽糖、3％(m/v)人血白蛋白的磷酸缓冲盐，缓冲液的pH为7.2～8.0。
(2)将半成品分装及冻干后制备成成品。
步骤(1)中，冻干保护剂的体积取决于原液中抗原含量，需调节冻干保护剂的体积，使得半成品中抗原含量为30IU/剂，且蛋白质含量应不高于80μg/剂(不包括人血白蛋白含量)；每剂1mL。
实施例2本发明的狂犬病疫苗的制备工艺
1.生产用细胞
同实施例1。
2.毒种
同实施例1。
3.原液制备
(1)细胞培养：无血清Vero细胞置于38℃培养，按1:6扩增传代，接种至生物反应器内，生物反应器内细胞接种密度为5×105cells/ml，用无血清培养液进行灌流培养。所述无血清培养液配方为：
Figure BDA0002623428360000051
培养参数为：37℃、pH7.30、溶氧40％、转速110rpm灌流培养。
(2)病毒接种：当生物反应器内细胞密度达到0.6×107cells/ml时，将狂犬病病毒rPV-2061工作种子批毒种按0.0025MOI接种，培养6h，开始灌流细胞维持液。
维持液配方：
Figure BDA0002623428360000052
Figure BDA0002623428360000061
培养参数为：35℃、pH7.50、溶氧40％、转速90rpm灌流培养。
(3)收毒：病毒连续收获15天(种毒后第3天至第17天)。单次病毒收获液(病毒滴度为6.5～7.5lgLD50/ml)，经0.65μm滤芯粗滤，通过300kD膜包进行20～30倍浓缩。
(4)灭活：于浓缩后的病毒收获液中按1:4000的比例加入β-丙内酯，置2℃，22小时灭活狂犬病病毒；于37℃下放置3小时，以水解β-丙内酯。
(5)纯化：加入90U/ml的核酸酶(非限制性核酸内切酶)，于37℃消化24小时。选择琼脂糖4FF作为填料进行分子筛层析纯化，以pH 7.4的磷酸盐缓冲液作为流动相，上样体积不超过柱体积的5％。
(6)配制原液：纯化后加入终浓度0.5％(m/v)人血白蛋白和终浓度5％(m/v)的麦芽糖作为稳定剂，配制成原液。4.成品配制
(1)加入适量冻干保护剂作为稳定剂，得到半成品。
所述冻干保护剂为：含有5％(m/v)麦芽糖、0.5％(m/v)人血白蛋白的磷酸缓冲盐，缓冲液的pH为7.2。
(2)将半成品分装及冻干后制备成成品。
步骤(1)中，冻干保护剂的体积取决于原液中抗原含量，需调节冻干保护剂的体积，使得半成品中抗原含量为30IU/剂，且蛋白质含量应不高于80μg/剂(不包括人血白蛋白含量)；每剂1mL。
实施例3本发明的狂犬病疫苗的制备工艺
1.生产用细胞
同实施例1。
2.毒种
同实施例1。
3.原液制备
(1)细胞培养：无血清Vero细胞置于36℃培养，按1:3扩增传代，接种至生物反应器内，生物反应器内细胞接种密度为7×105cells/ml，用无血清培养液进行灌流培养。所述无血清培养液配方为：
Figure BDA0002623428360000062
培养参数为：37℃、pH7.10、溶氧80％、转速90rpm灌流培养。
(2)病毒接种：当生物反应器内细胞密度达到0.7×107cells/ml时，将狂犬病病毒rPV-2061工作种子批毒种按0.01MOI接种，培养8h，开始灌流细胞维持液。
维持液配方：
Figure BDA0002623428360000071
培养参数为：33℃、pH7.50、溶氧80％、转速110rpm灌流培养。
(3)收毒：病毒连续收获15天(种毒后第3天至第17天)。单次病毒收获液(病毒滴度为6.5～7.5lgLD50/ml)，经0.65μm滤芯粗滤，通过300kD膜包进行20～30倍浓缩。
(4)灭活：于浓缩后的病毒收获液中按1:4000的比例加入β-丙内酯，置8℃，26小时灭活狂犬病病毒；于37℃下放置3小时，以水解β-丙内酯。
(5)纯化：加入180U/ml的核酸酶(非限制性核酸内切酶)，于37℃消化24小时。选择琼脂糖4FF作为填料进行分子筛层析纯化，以pH 7.8的磷酸盐缓冲液作为流动相，上样体积不超过柱体积的5％。
(6)配制原液：纯化后加入终浓度3％(m/v)人血白蛋白和终浓度3％(m/v)的麦芽糖作为稳定剂，配制成原液。
4.成品配制
(1)加入适量冻干保护剂作为稳定剂，得到半成品。
所述冻干保护剂为：含有3％(m/v)麦芽糖、3％(m/v)人血白蛋白的磷酸缓冲盐，缓冲液的pH为8.0。
(2)将半成品分装及冻干后制备成成品。
步骤(1)中，冻干保护剂的体积取决于原液中抗原含量，需调节冻干保护剂的体积，使得半成品中抗原含量为30IU/剂，且蛋白质含量应不高于80μg/剂(不包括人血白蛋白含量)；每剂1mL。
以下用实验例的形式对本发明的有益效果做进一步说明。
实验例1本发明工艺与其他厂家的比较
本实验例对市售狂犬疫苗(来自厂家A、B、C、D)进行检测，并与实施例1工艺所制备产品相比较。
检测方法如下：
1.效价测定
按《中华人民共和国药典》2015年版通则3503人用狂犬病疫苗效价测定法(NIH法)：
(1)稀释参考疫苗、供试品
将参考疫苗、供试品分别用无菌PBS稀释成1：25、1：125、1：625等稀释度(冻干制品复溶后再稀释)。
(2)初免小鼠
用上述不同稀释度的供试品及参考疫苗分别免疫12～14g小鼠16只，每只小鼠腹腔注射0.5ml。
(3)二免小鼠
初免7天后同法再免疫一次小鼠。
(4)CVS攻击小鼠
(5)攻击毒的计算
假设用每0.03ml含31LD50的病毒量进行脑内攻击，所用CVS的病毒滴度为C(lgLD50/0.03ml)，lg31≈1.50，则将CVS稀释10C-1.50倍即为每0.03ml含31LD50病毒量的病毒悬液。
(6)注射小鼠
小鼠初免后第14天，用病毒稀释液将预先滴定的CVS稀释为每0.03ml含5～100LD50病毒量的悬液，作为攻击毒。用攻击毒进行脑内攻击，每只小鼠0.03ml；同时将攻击毒稀释至100、10-1、10-2和10-3进行毒力滴定，每个稀释度均不少于8只小鼠，注射完后将装有小鼠的笼具置于笼架上逐日观察14天，并记录死亡情况，统计第5天后死亡和呈典型狂犬病脑症状的小鼠数。
(7)效价P公式：
Figure BDA0002623428360000081
dT为供试品的1次人用剂量，ml；dS为参考疫苗的1次人用剂量，ml；D为参考疫苗的效价，IU/ml。
2.热稳定性试验
在37℃放置28天后，检测效价。
3.Vero细胞蛋白质残留检测
依法(《中华人民共和国药典》2020年版，酶联免疫法)，使用Cygnus试剂盒“VeroCell Host Cell Proteins”对Vero细胞蛋白质残留量进行检测。
4.Vero细胞DNA残留检测
4.1药典法
取培养细胞上清不少于1ml，按中华人民共和国药典三部(2015年版)外源性DNA残留量测定(通则3407)外源性DNA残留量测定法-DNA探针杂交法进行。
4.2qPCR法(已纳入2020版药典)
试验分2步进行，第一步提取宿主细胞DNA，第二步将DNA荧光定量PCR。取100μl培养细胞上清，加入裂解液裂解释放宿主细胞DNA；用磁珠吸附释放的DNA，保留磁珠，弃去裂解液；洗涤磁珠；使用洗脱液将吸附于磁珠上的宿主细胞DNA洗脱下来，转移洗脱液，进行荧光定量PCR。整个试验设置阴性对照、空白提取对照、提取回收率控制对照、标准曲线，以确保结果的准确可靠。
另外，发明人还通过询问厂家A、B、C、D，以及通过中国食品药品检定研究院官网查阅其每批上市产品数量进行核实，得到其单罐产量信息。
结果如下：
单罐产量及效价如表1所示。实施例1的工艺生产制剂数远高于厂家A、C、D，厂家B的培养器体积是实施例1的8倍，但单罐产量不到实施例1的2倍。实施例1所得制剂效价也远高于厂家A、B、C。
表i生产效率比较
Figure BDA0002623428360000091
注：ND，未检测。
可见，实施例1的工艺的生产的疫苗制剂数量大，单位制剂的效价高，总体生产效率远高于本领域的普通水平。
对产品质量的检测结果如表2所示。
效价方面，实施例1的工艺制备得到的狂犬病疫苗初始效价显著高于其他厂家，经过热稳定试验后，效价保留更多，免疫原性更强；残留方面，实施例1的疫苗无牛血清白蛋白残留，Vero细胞DNA及蛋白残留低于其他厂家，安全性更高。
表2产品质量比较
Figure BDA0002623428360000101
注：ND，未检测；
本实验例的结果表明，实施例1的疫苗具有更高的免疫原性和更高的安全性，整体质量远高于行业一般水平。
本发明的疫苗生产全过程中不添加牛血清、动物源性胰酶、抗生素及其它动物源性原辅料；病毒灭活前不添加人血白蛋白，有效避免了人血白蛋白经β-丙内酯作用而产生的致敏原；成品配方不添加已知的明胶、右旋糖酐等致敏原，提高了安全性。另外，本发明的疫苗生产工艺的生产效率高于行业水平，疫苗产品单剂效价高，热稳定性高。
总之，本发明的狂犬病疫苗在毒株、细胞、生产工艺、产品质量上均具有先进性、创新性，提高了人用狂犬病疫苗的质量标准和疫苗接种的安全性。

Claims (9)

1.一种制备狂犬病疫苗的方法，其特征在于：所述方法包括：
以美国标准菌种保藏中心（ATCC）编号为CCL-81.5的Vero细胞为病毒培养的宿主，接种狂犬病病毒rPV-2061株，培养，制备成狂犬病病毒疫苗；所述培养采用无血清培养基培养；
Vero细胞培养的工艺为：在生物反应器内无血清培养基灌流培养Vero细胞至0.6~0.7×107cells/ml，开始病毒接种；所述生物反应器为固定床生物反应器；
病毒接种的工艺为：将狂犬病病毒rPV-2061株按0.0025~0.01 MOI接种到细胞，培养6h以上，开始使用无血清病毒维持液灌流培养；
所述无血清培养液的组成为：
Vero细胞无血清培养基15.0~ 17.6 g/L，谷丙二肽2~4 mmol/L，果糖0.5~2.0 g/L，Tricine 0.5~2.0 g/L；
所述无血清病毒维持液的组成为：
Vero细胞无血清培养基15.0~ 17.6 g/L，谷丙二肽2~4 mmol/L，果糖0.5~2.0 g/L，Tricine 0.5~2.0 g/L，碳酸氢钠2~3g/L。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
（1）细胞培养：在生物反应器内无血清培养基灌流培养Vero细胞至0.6~0.7×107cells/ml，开始病毒接种；
（2）病毒接种：将狂犬病病毒rPV-2061株按0.0025~0.01 MOI接种到细胞，培养6h以上，开始使用无血清病毒维持液灌流培养；
（3）收毒：病毒接种后，从第3天开始收获病毒，得病毒收获液；
（4）灭活：使用β-丙内酯灭活病毒；
（5）酶切：使用核酸酶对Vero细胞宿主DNA进行酶切；
（6）纯化：分子筛层析纯化病毒；
（7）配制原液：加入终浓度0.5~3%（m/v）人血白蛋白和终浓度3~5%（m/v）的麦芽糖作为稳定剂，即为原液。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤（4）的β-丙内酯用量为病毒液的1/4000。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤（5）酶切条件为：45~180 U/ml的非限制性核酸内切酶，于5~37 ℃酶切24 小时以上。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤（6）的分子筛层析的填料是琼脂糖凝胶4FF，流动相为pH 7.4~7.8的磷酸盐缓冲液。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤（7）的人血白蛋白用量为3%（m/v）。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤（7）的麦芽糖的用量为5%（m/v）。
8.如权利要求2~7任一所述的方法，其特征在于：所述方法还包括向原液中加入冻干保护剂进行冷冻干燥；
所述冻干保护剂为含有3~5%（m/v）麦芽糖、0.5~3%（m/v）人血白蛋白的磷酸缓冲盐，缓冲液的pH为7.2~8.0。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：
所述冻干保护剂含有5%（m/v）麦芽糖、3%（m/v）人血白蛋白。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112195149B (zh) * 2020-10-20 2022-05-17 成都柏奥特克生物科技股份有限公司 一种制备人用狂犬病疫苗的方法
CN113117067A (zh) * 2021-04-16 2021-07-16 深圳市卫光生物制品股份有限公司 一种用于去除狂犬病疫苗制品中鸡胚宿主蛋白的方法
CN115011566B (zh) * 2022-05-25 2024-01-23 辽宁成大生物股份有限公司 一种人用狂犬病疫苗中残留dna的去除方法
CN115287269A (zh) * 2022-09-16 2022-11-04 江苏康润生物科技有限公司 一种微载体高密度培养Vero细胞生产狂犬病病毒的方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1966076A (zh) * 2006-11-14 2007-05-23 广州市嘉合生物技术有限公司 大规模生产狂犬病疫苗的方法
CN101028514A (zh) * 2006-06-30 2007-09-05 辽宁成大生物股份有限公司 一种应用生物反应器生产人用疫苗的方法
CN106834239A (zh) * 2017-01-20 2017-06-13 江苏中慧元通生物科技有限公司 一种无血清Vero细胞制备狂犬病疫苗原液的方法以及无血清狂犬病疫苗制品
CN110382687A (zh) * 2017-03-09 2019-10-25 赢创德固赛有限公司 包含二肽的培养基

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2659161C1 (ru) * 2017-11-17 2018-06-28 Общество С Ограниченной Ответственностью "Ива Фарм" Фармацевтическая композиция, включающая дисульфид глутатиона и глутатион дисульфид s-оксид

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101028514A (zh) * 2006-06-30 2007-09-05 辽宁成大生物股份有限公司 一种应用生物反应器生产人用疫苗的方法
CN1966076A (zh) * 2006-11-14 2007-05-23 广州市嘉合生物技术有限公司 大规模生产狂犬病疫苗的方法
CN106834239A (zh) * 2017-01-20 2017-06-13 江苏中慧元通生物科技有限公司 一种无血清Vero细胞制备狂犬病疫苗原液的方法以及无血清狂犬病疫苗制品
CN110382687A (zh) * 2017-03-09 2019-10-25 赢创德固赛有限公司 包含二肽的培养基

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Vero-cell rabies vaccine produced using serum-free medium";Neuza M. Frazatti-Gallina et al.;《Vaccine》;20040725;第23卷;第511-517页 *

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