CN105012947A - 狂犬病病毒的纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的是一种纯化狂犬病病毒的方法，它包括唯一的离子交换色谱法步骤，所述步骤是阳离子交换色谱法步骤，其中：A、让被病毒感染的细胞的培养物的上清液与阳离子交换色谱担体接触，该担体含有接枝磺基异丁基基团的聚甲基丙烯酸酯基体，以便让狂犬病病毒结合在担体上，以及，B、从其担体上洗脱该病毒。

Description

狂犬病病毒的纯化方法
本申请是以下申请的分案申请：申请日2010年4月8日,申请号201080004678.7，发明名称“狂犬病病毒的纯化方法”。
本发明的目的是一种纯化从细胞培养物得到的狂犬病病毒的方法。
通常，从经感染的细胞培养物得到的病毒收获物不仅含有所希望的病毒，而且还含有细胞的蛋白质和DNA，其是应当除去的杂质。因为病毒负责大量的细胞裂解和/或病毒收获物很晚才取得，所以盐析的细胞蛋白质和DNA的量就更加大。除了细胞级的杂质外，其中存在经感染细胞的培养基的蛋白质也是在施行该病毒纯化方法时力图去除的杂质。
在病毒用于疫苗生产时，力图得到尽可能纯的制剂，以避免针对蛋白质杂质的过敏反应的发展。在一些国家，存在这样的法律，其限定在含有从连续细胞系得到的产物的疫苗中100pg/疫苗剂量，甚至更低的所准许的最大细胞DNA量。
在现有技术中已经描述过纯化狂犬病病毒的不同方法。
US 4 664 912描述了在用β-丙醇酸内酯使其失活后通过区带离心法纯化狂犬病病毒的方法。另一种方法在于，当待纯化的病毒收集物的体积很大时联用体积排阻色谱法与阴离子交换色谱法。
US 4 725 547描述了通过在硫酸cellulofine (硫酸和纤维素的酯)上的亲和层析法来纯化狂犬病病毒的方法。
WO 97/06243描述了纯化病毒，特别是纯化来自经感染的Vero细胞的培养物的狂犬病病毒的方法。该方法包括阴离子交换色谱，接着是阳离子交换色谱，最后通过金属螯合亲和色谱完成。在使用这种方法时，通过使用所谓的”总DNA临界值测定”技术，在一个剂量的疫苗中所含的残留DNA的含量≤30-40pg。
Kumar A.P等人在Microbes and Infection(2005)，7，第1110-1116页中对从经感染的Vero细胞的培养物的上清液纯化狂犬病病毒的两种方法进行了比较，所述经感染的Vero细胞在含有胎牛血清的培养基中进行培养。它显示，基于阴离子交换色谱柱(DEAE-琼脂糖CL -6B)的纯化方法表现优于蔗糖梯度区带离心纯化方法，因为在就残留核酸和蛋白质的量而言可比较的纯度等级下，用该色谱方法，狂犬病病毒的得率更好。
Frazatti-Gallina N.M.在“Vaccine”(2004)，23，第511-517页中也描述了一种从在无胎牛血清培养基中培养的经感染的Vero细胞的培养物的上清液中纯化狂犬病病毒的方法。该纯化方法在病毒收获物的澄清和浓缩步骤后还采用了在DEAE-纤维素基担体上的阴离子交换色谱法步骤。采用这种方法时，采用印迹杂交技术测量的残留DNA的量为<23pg/疫苗剂量。
因此，当该狂犬病病毒纯化方法包括离子交换色谱法步骤时，几乎总是看到一个阴离子交换色谱法步骤，为的是将含有待纯化病毒的培养基中的核酸保留在这种色谱担体上。
一种表现特别好的病毒纯化方法应该能够以最佳方式除去细胞的蛋白质和DNA杂质，同时保证所纯化狂犬病病毒的最大得率，并且始终存在寻找符合这些标准的新方法的需要。
本发明的目的是提供一种符合这些标准的新的纯化方法。
本发明的另一个目的是提供一种用于从无动物血清或任何血清蛋白质的病毒收获物纯化狂犬病病毒的方法，更特别地，是提供一种其中仅使用非动物来源产品的纯化方法。
为此，本发明的目的是：
一种狂犬病病毒的纯化方法，它包括唯一的离子交换色谱法步骤，所述步骤是阳离子交换色谱法步骤，根据该步骤：
a. 让被病毒感染的细胞的培养物的上清液(surnageant)与阳离子交换色谱担体接触，该担体含有在其上已通过共价键接枝磺基异丁基基团的聚甲基丙烯酸酯基体，以便这种狂犬病病毒结合在担体上，并在第二步中，
b. 从其担体上洗脱病毒。
根据本发明方法的一个方面，被狂犬病病毒感染的细胞的培养物的上清液没有动物血清或任何血清蛋白质。
根据另一个方面，被狂犬病病毒感染的细胞的培养物的上清液没有任何动物来源的外源蛋白质。
根据另外一个方面，在被狂犬病病毒感染的细胞的培养物的上清液中非动物来源的外源蛋白质的浓度≤15mg/l。
根据另外一个方面，被狂犬病病毒感染的细胞的培养物的上清液没有任何动物来源的外源产品。
依照根据本发明的方法的一个实施方案，在与阳离子交换色谱担体进行接触之前，预先使被狂犬病病毒感染的细胞的培养物的上清液澄清。
根据本发明的纯化方法的特征在于，在洗脱液中测得的病毒量对应于在已与该色谱担体接触的上清液中测得的病毒量的至少70%。
更特别地，根据本发明的纯化方法的特征在于，在洗脱液中测得的总蛋白质量对应于在已与该色谱担体接触的上清液中测得的总蛋白质量的40%以下，并且在该洗脱液中测得的DNA量对应于在已与该色谱担体接触的上清液中测得的DNA量的5%以下，优选地2.5%以下，更加优选地1%以下。
依照根据本发明的方法的另一个实施方案，在从其色谱担体洗脱该病毒之后，任选地对其进行浓缩，然后用核酸酶进行处理。
根据本发明方法的一个方面，该核酸酶是核酸内切酶，例如benzonase。
在本发明的另一个实施方案中，随后对该洗脱液进行蔗糖梯度超离心，并且收集含有纯化病毒的梯度级分。
在本发明的另一个方面中，随后用病毒灭活剂灭活该纯化的狂犬病病毒。
在另一个特别的方面中，所述病毒灭活剂是β-丙醇酸内酯。
根据一个优选的方面，根据本发明方法的所有步骤都是用非动物来源产品来进行的。
本发明的目的还在于一种抗狂犬病疫苗的生产方法，其中：
a) 用狂犬病病毒感染细胞培养物，
b) 根据本发明的方法，从经感染细胞的培养物的上清液开始来纯化狂犬病病毒，
c) 让在b)中得到的纯化病毒的悬浮液在储存缓冲液中进行混合，以及
d) 把在c)中得到的混合物以单剂量或多剂量疫苗剂型进行分配。
根据另一个方面，本发明涉及一种抗狂犬病疫苗的生产方法，其中：
a) 用狂犬病病毒感染细胞培养物，
b) 根据本发明的方法，从经感染细胞的培养物的上清液纯化狂犬病病毒，
c) 让在b)中得到的经纯化病毒的悬浮液在冻干缓冲液中进行混合，
d) 把在c)中得到的经纯化病毒的悬浮液以单剂量或多剂量疫苗剂型进行分配，以及
e) 对这些疫苗剂进行冻干。
最后，本发明的目的在于含有纯化的并灭活的狂犬病病毒的疫苗，其特征在于，存在于有效剂量(根据NIH检测，在含有2.5UI的疫苗剂量中)疫苗中的用定量PCR测定的残留DNA的量与用Bradford法测定的总蛋白质的量分别小于20pg与40µg，优选地小于10pg与20µg。
根据另一个方面，包含在有效剂量疫苗中的总蛋白质的至少70%是狂犬病病毒的蛋白质。
最后，优选地，根据本发明的疫苗没有任何动物来源的外源产品。
发明详述
本发明的狂犬病病毒纯化方法包括唯一的离子交换色谱法步骤，所述色谱法步骤是阳离子交换色谱法步骤。当然，在本发明的范围内，该狂犬病病毒的纯化方法不限于唯一的色谱法步骤，而可以包括一个或多个其它额外步骤，在这些步骤不是离子交换色谱法步骤的情况下。与现有技术所考虑的不同，本发明人已证明，其担体含有在其上已通过共价键接枝磺基异丁基基团的聚甲基丙烯酸酯基体的阳离子交换色谱的性能优于阴离子交换色谱的性能。不受理论的约束，看来这种狂犬病病毒具有正的和负的双重极性，这允许其同时结合在阴离子交换剂担体(DEAE型)和阳离子交换剂担体(SO3 -型)上。相对于在色谱担体的负载量限度内与该色谱担体接触的病毒和DNA的起始量，基于该洗脱液中测得的狂犬病病毒和DNA的量来计算在本发明的范围内的“色谱法性能”。对于相等量的已与该色谱担体接触的病毒和DNA，在洗脱液中测得的病毒的量越大，并且残留DNA的量越低，则色谱担体的性能越好。借助有利于该狂犬病病毒与阳离子交换剂相互作用的柔软聚合物链，将磺基异丁基基团接枝在聚甲基丙烯酸酯基体上。优选地，该聚合物链包括具有下式的单体单元链段：
这些聚合物链是在也能使与聚甲基丙烯酸酯基体接枝的铈基催化剂存在下，通过具有化学式CH2=CH-CO-NH-C(CH3)2-CH2-SO3-的单体的聚合得到的。它们平均含有15-25个单体单元。这种色谱担体通常呈微粒状，其尺寸一般在20-100µm，优选地在40-90µm之间变化。具体地，这种类型的担体尤其是由MERCK公司以名称Fractogel ® EMD SO3-进行销售的。这种类型的担体装在色谱柱中，其长度与直径是根据待纯化的收获物的体积进行选择的。实施例1列出的结果表明，在所有已测试的阴离子与阳离子交换剂色谱担体中只有用Fractogel ® EMD SO3-担体才得到良好的性能。用所有其它所测试的强阳离子交换剂色谱担体得到的病毒得率非常低(在洗脱液中回收到少于10%的所引入的病毒)。用阴离子交换剂色谱担体得到的病毒得率较好(40-70%)，然而仍然低于用Fractogel ® EMD SO3-担体得到的病毒得率，后者一般高于70%，往往高于80%。另外，用阴离子交换剂色谱担体除去较少的DNA。令人惊奇地，仅含有在其上已通过共价键接枝磺基异丁基基团(它们起着配体的作用)的聚甲基丙烯酸酯基体的阳离子交换剂色谱担体，允许以良好的性能从经狂犬病病毒感染的细胞的培养物的上清液纯化病毒。在一个色谱法步骤中同时除去多于60%的总蛋白质，至少2.5个log10 DNA，优选地至少3.0个log10 DNA，更优选地至少3.5个log10 DNA(这对应于除去多于99%的细胞DNA)，同时保持至少70%的狂犬病病毒得率(即在该洗脱液中测得的狂犬病病毒量，它至少对应于初始与该色谱担体接触的狂犬病病毒量的70%)，和优选地至少80%。尤其当被狂犬病病毒感染的细胞培养物的上清液不含有动物血清或血清蛋白质(如白蛋白)时，观察到这些性能。因此，在其色谱洗脱液中测得的总蛋白质量和DNA的量分别含有少于总蛋白质量(其与该色谱担体接触的用狂犬病病毒进行感染的细胞的培养物的上清液体积中存在的总蛋白质量)的40%和少于DNA量(已与该色谱担体接触的用狂犬病病毒进行感染的细胞的培养物的上清液体积中存在的DNA量)的5%，优选地少于2.5%，更加优选地少于1%。相反地，在该洗脱液中测得在已与该色谱担体接触的上清液体积中存在的狂犬病病毒量的至少70%和优选地至少80%。
在本发明的范围内的“总蛋白质”表示在所分析的材料中存在的所有蛋白质。这包括狂犬病病毒的蛋白质、细胞的蛋白质、细胞培养基和/或病毒感染培养基的蛋白质以及在实施狂犬病病毒生产和纯化方法时引入的蛋白质(例如胰蛋白质酶和/或benzonase)。细胞的蛋白质和培养基和/或病毒感染培养基的蛋白质以及在狂犬病病毒生产和/或纯化时引入的蛋白质都是力图除去的杂质(蛋白质杂质)，而同时力图最大程度地保留狂犬病病毒的蛋白质。这些狂犬病病毒蛋白质是糖蛋白G、核蛋白 N、磷蛋白P、基质蛋白质M、RNA聚合酶L。
狂犬病病毒的量基于狂犬病病毒的糖蛋白G的测定值来进行评价。通常通过使用优选地识别蛋白G的两个构象型表位的两种抗体，用“夹心”类型的ELISA方法进行狂犬病病毒量的评价，如在实施例1中所描述的那样。例如，可以使用识别位于糖蛋白G抗原位点IIc的构象型表位的中和抗体(Journal of Clinical investigation(1989)，第84卷，第971-975页)作为捕获抗体，以及识别位于糖蛋白G抗原位点III上的构象型表位的中和抗体(Biologicals(2003)，第31卷，第9-16页)作为揭示抗体。这些结果是在以使用参照标准的基础上以UI表达的，该参照标准对照NIBSC国际参照进行了校准。
为了测定总蛋白质的量，使用本领域技术人员熟知的Bradford方法。
为了测定DNA量，优选地使用基于细胞基因组DNA片段(优选地瞄准在细胞基因组中多次重复的DNA片段)定量的定量PCR (qPCR) 方法。当该狂犬病病毒是从Vero细胞产生时，在该病毒纯化方法期间中残留DNA的定量是基于通过使用与由Lebron J.A.等人在Developments in Biologicals (2006)，第123卷，第35-44页中描述的并在实施例1中详述的相似方法对在PCR扩增后非洲绿猴的α卫星DNA片段的定量。该方法是非常有利的，因为它使得能够测量具有多于200个碱基对的所有细胞DNA。
含有狂犬病病毒的培养物的上清液是从已被该狂犬病病毒感染的细胞的培养物产生的。在其中狂犬病病毒进行复制的细胞的任何培养物都适合于本发明的目的。可以是动物组织的原代培养物，如鸡的胚胎原代培养物(例如鸡的胚胎成纤维细胞的原代培养物(PECF))、小鼠的脑原代培养物，猴、兔、仓鼠或狗的肾原代培养，但是优选地，使用来自已建立细胞系的细胞培养物，所述细胞系衍生自动物组织的原代培养物。尤其是来自灵长类的细胞系，例如VERO、WI-38、MRC5、PERC.6细胞系、293细胞系，来自马、奶牛(例如MDBK细胞系)、绵羊、狗(例如MDCK细胞系)、猫、啮齿类(例如BHK21、HKCC或CHO细胞系)的细胞系。
特别优选地，使用Vero细胞系，它有许多优点：它是一种在工业规模下易于培养的连续细胞系，它具有非常低的致突变能力并且对狂犬病病毒非常敏感。
这些细胞可以根据其具有粘附或不粘附的特性以悬浮液或在支持物上，以间歇方式，分批进料(feed batch)方式或按照连续灌流培养方式进行培养。在工业规模下或半工业规模下细胞系培养物的情况下，一般使用生物发生器，其体积大于10升，可以直到2000升以上，其包括搅拌系统、CO2气流注入装置和充氧装置。它们配备有测量该生物发生器的内部参数，例如pH、溶解氧、温度、容器压力或培养物的某些物理化学参数 (例如葡萄糖、谷氨酰胺的消耗量，或乳酸盐和铵离子的产生量) 的探测器。pH、氧和温度的探测器与始终确保这些参数的调整的生物处理器相连。于在生物发生器中培养的粘附细胞系的情况下，培养基含有在其上结合细胞的微珠粒的微载体(microporteur)。这些微载体通过机械搅拌或借助于气流维持悬浮形式。在Vero细胞系的情况下，通常使用这样一些微载体，其粘附性静电基体是以被N，N-二乙基氨基乙基基团取代的葡聚糖(其尤其由Amersham Biosciences公司以名称Cytodex 1或Cytodex 2进行销售)为基础的。还可以使用由Amersham Biosciences销售的Cytodex 3微珠粒作为微载体。
用于细胞培养的培养基，也称为细胞培养基，可以补加或不补加动物来源血清，或可以含有一种或多种血清蛋白质例如白蛋白，或没有任何动物来源蛋白质，甚至没有任何蛋白质。优选地，使用无任何动物血清或任何血清蛋白质(例如白蛋白，其可以是在被接种的受试者中过敏反应发展的根源)的细胞培养基(Swanson MC等人，Journal of Infectious Disease (1987)，155(5)，第909-913页)。特别优选地，使用无任何动物来源蛋白质或甚至无任何动物来源产品的培养基。“动物来源蛋白质或产品”，理解为这样的蛋白质或产品，其生产方法包括至少一个其中使用来自于动物或人的材料的步骤。这使得能够降低疾病传播的风险，例如BSE，它们可能与使用动物来源生物制品有关。该培养基一般含有非常低量的例如以植物(大豆、大米等)或酵母的重组或提取蛋白质形式产生的蛋白质。采用Bradford法测定的蛋白质浓度一般≤15mg/l。往往，它主要含有事实上是多肽的低分子量(≤10KDA)的蛋白质。特别地，适合于本发明方法，尤其适合于Vero细胞培养物的由Invitrogen销售的VP SFM培养基便是这种情况。还可以列举无血清Opti ProTM(InVitrogen)培养基、Episerf(InVitrogen) 培养基、Ex-cell®MDCK(Sigma-Aldrich) 培养基、Ex-CellTMVero(SAFC biosciences) 培养基、无血清MP-BHK®(MP Biomedicals) 培养基、无血清SFC-10 BHK(Promo cell) 表达培养基、无蛋白质SFC-20 BHK(Promo cell) 表达培养基、HyQ PF Vero(Hyclone 参考号 SH30352.02)培养基、Hyclone SFM4 Megavir培养基，MDSS2培养基(Axcell biotechnology)、改良的DMEM Iscove培养基(Hyclone)、Ham营养培养基(Ham-F10，Ham-F12)、leibovitz L-15培养基(Hyclone)，它们是无任何动物来源产品的培养基，并且一般含有低量的蛋白质(≤15mg/l)。
该狂犬病病毒可以来自于任何来源，只要它在对狂犬病病毒敏感的细胞中繁殖。一般使用狂犬病病毒株，它们已从原代分离株而建立，如Pasteur 2061株、VP-11株、Pitman-Moore 1.503-3 M株。这些非常有毒力的病毒株用于生产抗狂犬病灭活疫苗。还可以使用减毒狂犬病病毒株，其目的在于生产抗狂犬病活疫苗。例如是SAD Bern株或SAD B19株或由它们衍生的株，例如由于在狂犬病病毒的糖蛋白G上点突变的存在而衍生自SAD Bern株的SAG1和SAG2株(EP350398、EP583998)。EP1253197也描述了一些更稳定的其它减毒狂犬病病毒株，它们在该狂犬病病毒的磷蛋白质P和糖蛋白G上有一个或多个点突变。
通过使用在细胞感染的时刻代替细胞培养基并用于由这些经感染的细胞生产狂犬病病毒的培养基，得到被该狂犬病病毒感染的细胞的培养物的上清液。这种病毒感染培养基的化学组成可以与细胞培养基的组成相同或不同。如同细胞培养基，该病毒感染培养基可以补充动物来源血清或一种或多种血清蛋白质，但是优选地，因前面提到的原因，这种病毒感染培养基没有任何动物血清或任何血清蛋白质。特别优选地，这种病毒感染培养基没有任何动物来源蛋白质，甚至没有任何动物来源产品，以防止可能与使用动物来源性生物制品相关的疾病(例如BSE)的传播风险。它一般还含有非常低量的例如以植物(大豆、水稻等)或酵母的重组或提取蛋白质形式产生的蛋白质。采用Bradford法测定的蛋白质浓度一般≤15mg/l。往往，它主要含有事实上为多肽的低分子量 (≤10kDa) 的蛋白质。在一个特别的方面中，这种病毒感染培养基不含有分子量大于10kDa的蛋白质。作为无任何动物来源产品和低剂量蛋白质(浓度≤15mg/l)的病毒感染培养基，可以列举VP SFM培养基(Invitrogen)、leibovitz L-15培养基、MEM培养基(Sigma-Aldrich)、Hyclone SFM4MegavirTM培养基(Hyclone)或任选地基于植物提取物的培养基之一，例如在申请WO 99/4768中描述的培养基。例如，当该狂犬病病毒由Vero细胞系的细胞培养物产生时，一般通过使用无任何血清蛋白质，甚至无任何动物来源产品的培养基(如前面列举的那些)作为病毒感染培养基，得到经感染细胞的培养物的上清液。
根据细胞培养基和病毒感染培养基的组成，被该狂犬病病毒感染的细胞的培养物的上清液有利地可以：
- 没有任何血清蛋白质，或
- 没有任何动物来源的外源蛋白质，甚至
- 没有任何动物来源的外源产品。
当被狂犬病病毒感染的细胞培养物的上清液没有任何外源蛋白质或没有任何动物来源的外源产品时，在该上清液中发现的非动物来源的外源蛋白质一般具有非常低的浓度(≤15mg/l)，其采用Bradford法测得。
“外源蛋白质或产品”，理解为不是该狂犬病病毒或用于该狂犬病病毒生产的细胞的组分的任何产品或任何蛋白质。这些外源蛋白质或产品是在该狂犬病病毒的生产和/或纯化过程中引入的组分。例如，在该培养基组成中存在的蛋白质或产品、在该狂犬病病毒的生产和/或纯化过程中引入的酶(例如胰蛋白酶(trypsine)或benzonase)或引入的产品，是外源蛋白质或产品。当其生产方法包括至少一个其中使用来自动物或人的材料的步骤时，外源蛋白质/产品是动物来源的。当采用其它方法，例如通过使用植物材料，通过化学合成，或通过使用酵母、细菌或植物采用基因重组生产外源蛋白质/产品时，它们是非动物来源的。
一般在感染这些细胞后2-3天开始收获含有该感染性病毒的培养物的上清液，并且可以持续十五天，因为该病毒裂解性小。在每次收获后，用新的病毒感染培养基再培养这些经感染的细胞。在这些培养物的上清液中存在的蛋白质有细胞源的、病毒源的，或来自病毒感染培养基的以及以在非常低的程度上来自于细胞培养基的。可以保管所有这些收获物或只是保管具有高感染滴度的收获物。这些收获物可以各个进行保存。也可以将多个收获物混合起来。通常在温度约+5℃下或以冻干剂型保管这些收获物。
作为预防措施，在阳离子交换色谱法步骤之前，一般要使含有待纯化病毒的培养物的上清液澄清，以便除去这些大的细胞碎片、任选地存在的聚集体以及在微载体进行细胞培养时的残留微载体。在本发明的方法中，可以应用本领域技术人员熟知的任何澄清方法。例如可以让这些上清液进行离心或进行体积排阻色谱以使培养物的上清液澄清。通常地，通过使用一个或多个其孔隙性通常为0.2-1.5µm，优选地0.4-1.0µm的过滤器，采用切向过滤、通过膜的正面过滤(filtration frontale sur membrane)和/或深度过滤进行这种澄清。在碎片和聚集体很少的情况下，可以采用仅过滤培养物的上清液的办法进行这种澄清。也可以将至少两次相继的过滤结合起来进行这种澄清，其中例如使用相对粗的过滤器，像孔隙性为0.3-1.5µm的过滤器进行第一次过滤，而使用相对细的过滤器，像孔隙性为0.2-0.5µm的过滤器进行第二次过滤。预先，还可以考虑一个预过滤步骤，通过使用其孔隙性大(2-10µm)的预过滤器以除去这些大的碎片。作为适合于本发明目的的过滤器，可以列举用纤维素制成的过滤器、再生纤维素纤维、与无机过滤器(例如以硅藻土、珍珠岩或火成二氧化硅为基)合用的纤维素纤维，与无机过滤器或有机树脂合用的纤维素过滤器、以聚合物为基的过滤器，例如像用尼龙、聚丙烯、聚偏氟乙烯或聚醚砜制成的过滤器。这些过滤器尤其由以名称Durapore®、Millipak®、MillidiskTM 进行销售，由Millipore公司提供或是由Pall公司提供的过滤器。作为深度过滤系统，可以列举AP系列(AP01)、CP系列(CP10、CP30、CP50、CP60、CP70、CP90)、HP系列(HP10、HP30、HP50、HP60、HP70、HP90)、CA系列(CA10、CA30、CA50、CA60、CA70、CA90)和SP系列(SP10、SP30、SP50、SP60、SP70、SP90)的深度过滤器，它们是CUNO公司供应的，CUNO Delipid与Delipid Plus过滤器、CE系列(CE15、CE20、CE25、CE30、CE35、CE40、CE45、CE50、CE70、CE75)和DE系列(DE25、DE30、DE35、DE40、DE45、DE50、DE55、DE560、DE65、DE70、DE75)的深度过滤器，它们是由Millipore corp.公司供应的，HC系列(A1HC、B1HC、COHC)过滤器与Millipore corp.公司的Clarigard and Polygard过滤器。作为其它的过滤系统，还可以列举ManCel协会提供的深度过滤器(例如PR 12 UP、PR12、PR 5 UP)或PALL与SeitzShenk Inc公司的过滤器(例如Bio20、SUPRA EKIP，KS-50P)。有利地，可以使用包括两种不同孔隙性的膜的过滤囊进行该澄清步骤，这等于在单个步骤中进行两次相继的过滤。由Sartorius销售的包含0.8µm膜和0.45µm膜的Sartopore-2过滤囊非常适合于澄清该培养物的上清液。如果需要，还可以预先加一个如前面指出的预过滤步骤。
在需要时，将澄清或未澄清的培养物上清液调节到7-8，优选地7.0-7.6的pH。还证实该上清液的电导率≤20mS/cm，优选地10-20mS/cm，特别优选地14-18mS/cm。然后，把这种培养物的上清液引入阳离子交换色谱柱中，该柱装有Fractogel ® EMD SO3-颗粒(M型)并且其尺寸适合于待纯化上清液的体积。将该柱预先在低离子强度的平衡缓冲液(≤200mM)中进行平衡。然后用洗涤缓冲液洗涤该柱，该缓冲液一般具有与其平衡缓冲液相同的组成。在柱的出口，主要发现蛋白质杂质和核酸。然后通过使用洗脱缓冲液洗脱被保留在柱上的病毒，该洗脱缓冲液的离子强度是至少400mM。作为非常适合于本发明目的的缓冲液的实例，可以列举用于平衡和洗涤该柱的Tris 20mM、NaCl 150mM，pH=7.5缓冲液，以及作为病毒洗脱缓冲液的Tris 20mM、NaCl 600mM，pH=7.5缓冲液，而所有其他的等效缓冲液也适用。当遵守柱的装载容量时，在洗脱液中回收多于70%的在初始引入该柱中的病毒量，而在洗脱液中存在的DNA和总蛋白质的量分别是引入柱中的DNA和总蛋白质的起始量的5%以下和40%以下。在这些感染性培养物的上清液没有动物来源血清，或不含有血清蛋白质，或只含有低浓度非动物来源的外源蛋白质(≤15mg/l)的情况下尤其可以得到这些结果。
本发明人还证明，通过结合使用在含有在其上已通过共价键接枝磺基异丁基基团的聚甲基丙烯酸酯基体的担体上的阳离子交换色谱法步骤与核酸的酶消化步骤，还有可能降低额外的约1.5-2个log10残留DNA比率，因此通过将两个步骤结合，达到除去至少4.0个log10 DNA。作为比较，通过使用基于核酸酶消化(重复两次)的核酸除去方法，得到不超过3.5个log10 DNA除去率，第二次消化不能降低额外的0.5-1log10以上的残留DNA比率(参见实施例2)。作为核酸消化的酶试剂，可以使用一种或多种酶，优选地RNA酶和/或DNA酶，或本领域技术人员已知的核酸内切酶混合物，例如PulmozymeTM。在根据本发明的方法的范围内，一般使用优选地通过基因重组得到的BenzonaseTM，其浓度范围一般是1-50U/ml。它是一种核酸内切酶，它通过快速将细胞DNA和RAN切割成任何小片段的形式而起作用，并且它还降低培养基的粘度。酶处理的温度和时间是本领域技术人员易于控制的参数，并且取决于在反应介质中核酸内切酶的起始浓度。为了避免任何聚集现象，可以向色谱洗脱液中添加非常低量的表面活性剂，它优选地是非离子表面活性剂，如非常低浓度的poloxamer188(Pluronic F68)。在酶处理步骤之前，当该洗脱液体积很大时，可以任选地对其进行浓缩。一般地，采用具有100kDa-300kDa，优选地100kDa-200kDa截留阈值的膜的超滤进行该浓缩步骤。该超滤的特征在于一个对这种膜的切向流，它会诱发一个允许这些分子穿过多孔膜进行扩散的力。由循环泵施加的这个流被分成两个分流：确保这种清扫的循环流(或截留流)与通过膜的滤液流(渗透液)。该膜组成可以非限制性地由再生纤维素、聚醚砜、聚砜或这些产品衍生物组成。它可以以呈带内平板(尤其用于切向超滤)或中空纤维的形式。这些膜尤其由Pall以名称OmégaTM、由Millipore以名称BiomaxTM膜、由Sartorius以名称sartocon®进行销售。还可以在滤液(渗透液)中施加一个反压力，以便降低跨膜压力，如WO 2006/108707所描述的。随着洗脱液通过膜，洗脱液的体积减少，未穿过膜的病毒被浓缩。当对洗脱液进行超过滤时，可以减少从1到100倍，甚至150倍的体积，因此能够得到所希望的最后体积。这个浓缩步骤可以用一个渗滤步骤完成，这个步骤能够改变其缓冲液的组成，而不改变截留流的体积。在该截留流中缓冲液的组成因洗脱液体积减少而不再与核酸内切酶的良好酶活性相容时就建议这样做。这时通过往该截留流的循环流中添加一种其组成与核酸内切酶的良好酶活性相容的缓冲液来进行。作为无限制性特性的实例，列举一些与核酸内切酶(如BenzonaseTM)的良好酶活性相容的缓冲液组成：它们含有摩尔浓度范围为10-50mM的Tris缓冲液、浓度范围一般为1-10mM的MgCl2以及任选地浓度范围为100mM-600mM的其它盐，例如NaCl，这些缓冲溶液的pH在7.0-8.0的pH范围内。如前面所指出的，也可以通过添加浓度范围一般为1-10mM的MgCl2，然后添加核酸内切酶，例如所希望浓度的BenzonaseTM，直接处理在色谱法步骤后所回收的洗脱液。
为了完成蛋白质杂质的去除，并除去尤其是benzonase，让已用该核酸内切酶处理的洗脱液进行蔗糖梯度超离心步骤，这个超离心步骤可以重复一次或多次。该超离心通过对洗脱液中存在的不同实体之间的沉降系数差起作用而能够分离狂犬病病毒：蛋白质杂质迁移入低蔗糖密度(≤35%蔗糖)中，而狂犬病病毒处在最高蔗糖密度中(≥35%蔗糖)。当该待处理体积很大时，或相反地当该体积相对小时，该蔗糖梯度超离心步骤一般按照所谓的“连续流”法进行。通常在约5℃温度下在“蔗糖垫层”上进行其蔗糖梯度超离心。已用核酸内切酶处理的洗脱液可以呈非浓缩的形式或呈10倍、20倍、50倍、100倍、150倍或甚至更高倍浓缩的形式。待超离心的洗脱液的总体积与蔗糖梯度的总体积之间的比例通常是0.5-2.0，优选地0.5-1.5。低密度蔗糖“垫层”的密度通常在10-35%p/p范围内，而高密度蔗糖“垫层”的密度通常在40-60%p/p范围内。低密度蔗糖的体积一般比高密度蔗糖的体积大，经过超离心步骤的洗脱液体积很大，则情况更是如此。通常，高密度蔗糖的体积与低密度蔗糖的体积之间的比例是0.3-0.7。超离心时间随超离心速率(一般为≥30000g)而改变。当超离心速度为≥65000g时，超离心时间为2小时一般就足够了。超离心后，使用蠕动泵取出在该梯度中分配的产物，并进行分级。在每个级分中含有的蔗糖含量是借助折射计测定的。还在采用ELISA测定糖蛋白gpG的基础上，测定在每个级分中的狂犬病病毒量，以及采用Bradford法测定总蛋白质量。如此建立分离曲线。在这些分析后，选取主要含有该狂犬病病毒的梯度级分并合并。在该步骤期间达到除去多于85%，优选地多于90%的总蛋白质，主要是蛋白质杂质，因为狂犬病病毒的得率≥70%，和优选地≥80%。
因此，在根据本发明的纯化方法中，当将被狂犬病病毒感染的细胞培养物的上清液的澄清步骤，与在由在其上已通过共价键接枝磺基异丁基基团的聚甲基丙烯酸酯型基体所构成的担体上的阳离子交换色谱法步骤(其任选地后接通过洗脱液超离心的浓缩和/或渗滤，洗脱液的核酸内切酶处理步骤和蔗糖梯度超离心步骤)结合时，得到纯化的狂犬病病毒的组合物，对于对应于4.5UI(基于通过ELISA的gpG测量) 或对应于一个有效疫苗剂量的狂犬病病毒的量，该组合物含有少于50pg的残留DNA，优选地少于20pg的残留DNA，更优选地少于10pg的残留DNA(采用qPCR测定的)，还含有少于40µg的总蛋白质，优选地少于20µg的总蛋白质(采用Bradford法测定的)。通常，至少70%的总蛋白质是病毒蛋白质。纯化病毒的总得率是至少45%，优选地至少50%，特别优选地至少60%。纯化病毒总得率是基于在超离心后在一个或多个所收集的梯度级分中存在的病毒量与在已处理的病毒上清液体积中存在的初始病毒量之间的比例进行计算的。同时除去多于4个log10 DNA与多于95%的总蛋白质(参见表I)。优选地，被狂犬病病毒感染的细胞培养物的上清液没有任何血清蛋白质或没有任何动物来源的外源蛋白质，甚至没有任何动物来源的外源产品，以便尤其保证疫苗组合物的更高的生物安全性。
作为实例，下表对于从经感染的Vero细胞的培养物的上清液纯化狂犬病病毒的方法的每个步骤列出了所回收病毒的量以及除去的DNA和蛋白质的量。
表I：概括了狂犬病病毒纯化方法不同步骤与相关的病毒得率和除去的DNA和蛋白质量的表
*：狂犬病病毒的量根据实施例1描述的方法，在采用ELISA测定狂犬病病毒的糖蛋白G的基础上进行测定；
**：总蛋白质的量采用Bradford技术进行测定；
***：DNA的量根据实施例1描述的方法，采用qPCR进行测定；
ND：未测定出。
在超离心步骤后收集的纯化狂犬病病毒一般呈过浓形式，为避免在储存时形成病毒聚集体，往往将其进行稀释。通常使用pH约8的磷酸盐缓冲液作为稀释缓冲液，任选地补加一种生理盐水溶液，例如像氯化钠溶液。借助根据本发明的方法，可以将所得到的纯化狂犬病病毒的悬浮液用作活病毒疫苗或减毒病毒疫苗，或用作灭活病毒疫苗。当将这种疫苗用于人医学时，一般将这种纯化病毒的悬浮液进行灭活。
病毒灭活步骤
当这种病毒用于灭活疫苗的生产时，如在本发明中描述的狂犬病病毒纯化方法以病毒灭活步骤为结束。可以使用本领域技术人员熟知的化学试剂，例如甲醛、戊二醛或β-丙醇酸内酯进行病毒灭活。还可以采用如WO 2005/093049描述的灭活法，该方法在于让纯化的病毒溶液与可光活化的疏水性化合物接触，并让该混合物暴露于光照。在这些可光活化的疏水性化合物中，可以列举叠氮苯、1-叠氮萘、4-叠氮-2-硝基-l-(苯硫基)苯、1-叠氮-4-碘苯、1-叠氮-5-碘萘、3-苯基-3H-双环氮乙烯(diazirene)、3-苯基-3-(三氟甲基)-3H-双环氮乙烯、3-(3-碘苯基)-3-(三氟甲基)-3H-双环氮乙烯、1-叠氮芘、金刚烷环氮乙烯、12-(4-叠氮-2-硝基苯氧基)-硬脂酸、w-(m-diazirino苯氧基)脂肪酸、12-[(叠氮羰基)氧] 硬脂酸、12-叠氮硬脂酸、11-(3-叠氮苯氧基)十一酸或w-(m-diazirino苯氧基)十一酸或1,5-碘萘基叠氮化合物。优选地，使用β-丙醇酸内酯(BPL)，因为它同时是病毒灭活剂和在DNA中造成断裂的烷化剂。因此也可有助于降低残留DNA的比例并抑制其生物活性。在温度约12℃下，使用1/3500-1/4000稀释的β-丙醇酸内酯溶液(在含有纯化病毒的溶液中的最终体积浓度)使该狂犬病病毒灭活。β-丙醇酸内酯浓度越低，病毒灭活所必需的时间就越长。一般而言，该病毒灭活作用在12h-48h的时间间隔内进行。通过该溶液在约37℃的温度下简单加热约2h可以中和β-丙醇酸内酯的活性。然后检查该溶液的pH为>7.0。需要时，使用稀释的氢氧化钠溶液调整pH，或备选地，在用β-丙醇酸内酯处理前，用基于磷酸盐缓冲液的溶液(pH~8)对含有该纯化病毒的溶液进行缓冲，这避免了在β-丙醇酸内酯水解过程中该溶液的任何酸化作用。
根据本发明方法纯化的病毒悬浮液一般保存在储存缓冲液中，例如像保存在Tris缓冲液或磷酸盐缓冲液中。虽然可以将纯化病毒悬浮液与储存缓冲液直接进行混合，但一般在超滤渗滤步骤中在储存缓冲液中进行，需要时如果该纯化病毒没有充分浓缩，则通过一个浓缩步骤完成。实施超滤步骤时，使用一种其截留阈值一般为5kDa-100kDa，优选地8kDa-50kDa的膜。最后，通过在具有≤0.2µm的孔隙性的膜上进行过滤使如此制备的纯化病毒储液灭菌，然后保存在约+5℃下或，优选地在分配成单剂量或多剂量疫苗剂型之前以冷冻剂型保存。还可以包括这些疫苗制剂的补充冻干步骤。在这种情况下，选择储存缓冲液组成，以便它能够被冻干。在本文中，基于在最后灭菌过滤步骤后得到的纯化病毒储液中存在的病毒量与在已处理的病毒上清液体积(澄清之前)中初始存在的病毒量之间的比例而计算的灭活纯化病毒的总得率仍然是至少40%，这表明了这样的纯化方法的工业益处。
总之，通过采用一种方法可以生产含有纯化狂犬病病毒的疫苗，具有非常好的得率和非常大的纯度，根据该方法，步骤如下：
- 从细胞库，一般地从工作细胞库生产一批细胞，
- 在感染该批细胞后生产狂犬病病毒，以及
- 从经感染细胞的培养物的上清液纯化狂犬病病毒。
借助于该方法，得到的疫苗没有任何动物来源的外源产品。
因此，本发明的另一个目的还在于生产抗狂犬病疫苗的方法，根据该方法：
a) 生产一批细胞，
b) 用狂犬病病毒感染该批细胞，
c) 从按照本发明方法感染的细胞的培养物的上清液纯化狂犬病病毒，
d) 将该纯化病毒悬浮液在储存缓冲液中进行混合，以及
e) 将混合物以单剂量或多剂量疫苗剂型进行分配。
根据该疫苗生产方法的一种变化形式，储存缓冲液是冻干缓冲液。在这种情况下，将纯化病毒的悬浮液与冻干缓冲液进行混合，将混合物以单剂量或多剂量疫苗剂型进行分配，然后冻干这些疫苗剂。
根据该疫苗生产方法的一个优选的变化形式，该方法的所有这些步骤是通过使用非动物来源产品进行的。在这种情况下，得到的疫苗没有任何动物来源的外源产品，因此提供了更大的生物安全性。
最后，本发明的目的在于含有纯化狂犬病病毒的疫苗，其中，在一个有效疫苗剂量中存在的采用定量PCR测定的残留DNA量和总蛋白质量小于20pg的残留DNA和40µg的总蛋白质。优选地，一个有效剂量含有少于10pg的残留DNA和少于20µg的总蛋白质。非常优选地，在一个有效剂量中包含的总蛋白质的至少70%是狂犬病病毒的蛋白质。有利地，该疫苗组成也可以没有任何动物来源的外源产品。可以将在该疫苗中含有的狂犬病病毒进行灭活或减毒。在聚丙烯酰胺凝胶电泳后得到疫苗样品的电泳曲线光密度分析与用考马斯蓝的揭示表明，事实上多于70%的蛋白质是病毒源的。在2-巯基乙醇存在下进行的聚丙烯酰胺凝胶主要看到5个狂犬病病毒蛋白质(即糖蛋白G、核蛋白质N、磷蛋白质P、基质蛋白质M、RNA聚合酶L)。
此外，使用基于光的“准弹性”散射(动态光散射)测定粒子布朗运动的zetasizer Nano ZS仪器(Malvern Instruments)进行的疫苗样品粒度分析表明，存在唯一的具有180nm平均值的100-300nm粒子群，所述180nm平均值对应于该狂犬病病毒的平均尺寸。通过电子显微镜的疫苗样品分析也揭示具有经典炮弹形状的病毒粒子的存在。因此，根据本发明的疫苗是以完整的纯化狂犬病病毒的均匀悬浮液剂型，其特征在于，使用zetasizer Nano ZS仪器(Malvern Instruments)进行的粒度分析表明，存在唯一的约100-300nm的峰。通过实施如在本发明中所描述的纯化方法，可以得到具有例如所描述纯度特征的纯化狂犬病病毒的均匀悬浮液。
用于评价防狂犬病疫苗的效力的被OMS(世卫组织WHO)认可的正式测试方法是NIH测试(尤其在欧洲药典n°：216中描述过，它涉及从细胞培养物制备的并用于人医学的狂犬病疫苗)。根据NIH测试，为了有效，一个疫苗剂量应该含有至少2.5UI。根据这些通常推荐的疫苗接种方案或血清疫苗接种方案，在人中通过肌内途径给药有效剂量的狂犬病疫苗(即至少2.5UI，根据NIH测试)诱发保护性免疫的发展。另外已证明，当在根据本发明方法得到的疫苗剂量中所含有的狂犬病病毒量为至少4.5UI(基于采用ELISA的糖蛋白G的测定)时，这个量对应于至少一个有效剂量的疫苗(即含有至少2.5UI，根据NIH测试)。
这种NIH测试是在小鼠中进行的试验测试，根据该测试，确定为获得与用参照狂犬病疫苗制剂的量观察到的相同的保护小鼠免于预先滴定和通过脑内途径给药的狂犬病病毒制剂的致死效应所必需的试验疫苗量。这个参照狂犬病疫苗制剂是以国际单位(UI)进行校准的。国际单位(UI)是在国际标准确定量中含有的活性。该国际标准的UI等效值由OMS建立。在验证了效力测试的控制参数得到很好遵守后，从已测试疫苗和参照制剂的50%保护剂量(以UI标定)确定在该测试疫苗中含有的UI数。为了在接种中有效，它应该是至少2.5UI /剂量。
在人中通过肌内途径注射的有效疫苗剂量通常包含在0.5-1ml体积的液体悬浮液中，所述液体悬浮液是即用的或通过简单解冻得到或通过用溶剂的冻干物重构即时得到。
用于保护人免于狂犬病的疫苗接种方案是众所周知的，并且根据它是预防性疫苗接种或治疗性疫苗接种而不同。通常，在预防性接种的情况下，初次疫苗接种方案包括二次或三次有效剂量疫苗的肌内注射。然后，通过给药有效单一剂量的疫苗，以有规律的间隔进行疫苗补种。在治疗性接种的情况下，疫苗接种方案根据已接触狂犬病病毒的个体是否已经进行疫苗接种或根据国家而不同。在未经免疫或免疫不好的受试者中，与给药抗狂犬病血清同时地，通常推荐的疫苗接种方案包括在1个月期间通过肌内途径相继5次注射有效剂量的疫苗，接着在3个月时补种。当这些接触狂犬病病毒的个体预先接受了完全的预防性疫苗接种时，注射次数减到3次，甚至1次。在本发明的背景下，在未经免疫或免疫不好的受试者中，可以使用在治疗性疫苗接种背景下的其他疫苗接种方案，其允许减少注射的次数和/或所给药的接种抗原的量。尤其是“Zagreb”方案，它包括4次通过肌内途径的有效剂量疫苗的注射 (在第0天进行的在不同部位的2次注射，接着在第7天，然后在第21天的注射)，或是皮内途径的疫苗接种方案。
通过阅读下述实施例将更好地理解本发明，这些实施例用于说明本发明而不因此限制其内容。
实施例 1 ：在狂犬病病毒纯化方法中不同色谱担体的比较
1-1) 在无血清培养基中在VERO细胞中生产狂犬病病毒
在已适应如在WO 01/40443所描述的无血清培养基的培养条件后，将VERO细胞系细胞转移入10-20升的生物发生器中，该生物发生器包含在VP SFM培养基中的cytodex-1微载体(Invitrogen)。在37℃下培养3-4天时间，同时保持约7.2 ± 0.2的pH，25% ± 10%的氧饱和度，并且对这种培养基进行轻微搅拌，然后在含有VP SFM培养基(Invitrogen)的病毒感染培养基中，用该狂犬病病毒以感染复数0.01感染细胞。在用Fractogel EMD-SO3-色谱担体进行的试验情况下，通过使用150升的生物发生器以150升的规模进行了狂犬病病毒的生产。在第7天(R1)、第11天(R2)和第15天(R3)收获了经感染细胞的培养物的上清液。每次收获后，再引入新的病毒感染培养基。
1-2) 收获物的澄清与分析
通过使用两次相继的正面过滤进行澄清步骤；第一次通过使用8µm聚丙烯的预过滤器(Sartopure PP2，SARTORIUS)，该预过滤器除去在收获过程中吸入的一些微载体、从担体上脱落的Vero细胞和大尺寸细胞碎片；第二次通过使用由0.8µm和0.45µm两个过滤器的组合组成的PES过滤器(Sartopore 2，SARTORIUS)，它除去聚集体。
通过测定糖蛋白G(gpG)的量，确定了在澄清的收获物中存在的狂犬病病毒的量，这是采用下述ELISA法进行测定的：
在ELISA微孔板孔中分配约0.12µg/100µl的抗-gpG单克隆抗体1112-1的溶液(在Journal of Clinical investigation，(1989)，第84卷，第971-975页中描述了其特性)，该溶液已预先在“包被”缓冲液(0.2M碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液，pH 9.6)中进行了稀释。在冷室中温育过夜后，接着用洗涤缓冲液(添加有0.05%吐温20的磷酸盐缓冲液)洗涤几次，在每个孔中分配100µl的饱和缓冲液(添加有1%牛白蛋白血清的磷酸盐缓冲液)。在37℃下温育一小时后，接着洗涤几次，将每个待测试样品在稀释缓冲液 (添加有0.05%吐温20和1%白蛋白血清的磷酸盐缓冲液)中进行一系列的稀释。同时，在每个微孔板中对参照标准也进行一系列的稀释，参照标准是对照NIBSC国际标准(例如PISRAV)进行了校准的。在37℃下进行新的温育一小时后，接着洗涤几次，在每个孔中分配100µl 抗-gpG的小鼠单克隆抗体D1的溶液(其特性在Biologicals(2003)，第31卷，第9-16页中作了描述)，所述抗体已进行了生物素化并在稀释缓冲液中稀释至1/5000后使用。让这些板在37℃下1小时，然后在每个孔中分配100µl偶联至过氧化物酶的链霉抗生物素蛋白溶液(Southern Biotechnology Associates)之前反复洗涤，而这种溶液在稀释缓冲液中预先被稀释至1/5000。在37℃进行新的温育一小时后，接着洗涤几次，在每个孔中分配100µl含有揭示底物(O-苯二胺)的0.05M柠檬酸盐缓冲液(pH5)。在避光下在环境温度下温育30分钟的时间后，通过添加50µl/孔的2N H2SO4溶液中止揭示反应。在两个波长(492nm和620nm)处进行微孔板的分光光度计读取。测得的光密度是两个读数之差，以便考虑塑料的光吸收。根据欧洲药典建议通过平行直线法计算相对活性。样品的狂犬病病毒滴度基于在狂犬病病毒的糖蛋白G浓度的测定，它以相对于参照的UI/ml表示。
存在于澄清收获物中的总蛋白质量是通过使用由Biorad以试剂盒形式销售的Bradford经典方法(参考号: 500-0006) 测定的。
存在于澄清收获物中的DNA量是采用qPCR测定的。该操作方案与由Lebron J.A.等人在Developments in Biologicals(2006)，第123卷，第35-44页中描述的方案相似。在使用DNA Extractor de Wako Pure Chemicals商品试剂盒从澄清的收获物提取残留DNA后，往每个样品中加入固定量的外源DNA，它用作PCR扩增的内控制。同时，制备来自裂解的Vero细胞的基因组DNA样品：通过连续的冷冻/解冻，接着按照每2.5×105个细胞2mg 核糖核酸酶 A用核糖核酸酶 A处理，最后通过使用QIAamp Virus BioRobot 9604试剂盒(QIAGEN)进行纯化。将纯化的DNA采用分光光度法在260nm处进行定量。通过使用10倍的稀释，从该纯化的DNA(标准DNA)获得一个校准系列。然后，对于每个试验，在没有任何核酸酶的水体积(适量至50µl)中再添加α–MPr3荧光探针、两种引发剂、2X QuantiTect Probe Master Mix预混合物(Qiagen)后，对来自澄清收获物的样品以及校准系列的样品进行用PCR的扩增循环。使用Light Cycler 480仪器(Roche Applied Science)，同时采用95℃、15分钟；包括95℃、15秒与60℃、60秒两个阶段的40个循环这样的程序进行扩增循环。然后在相对于用标准DNA建立的校准系列所观测的荧光测定结果的基础上，采用内插法计算从澄清收获物提取的残留DNA量。将该残留DNA量用一个校正因子进行调整，这个校正因子对应于借助外源DNA进行定量对于样品所测得的载量产率(rendement de charge)。一般而言，在澄清收获物中的糖蛋白G浓度(对应于狂犬病病毒滴度)、总蛋白质浓度和DNA浓度，对于糖蛋白G在1-3UI/ml的范围内，对于总蛋白质在50-100µg/ml的范围内和对于DNA在5-50ng/ml的范围内。
1-3) 就除去核酸与保留狂犬病病毒的能力而言对于不同色谱担体的性能的测定
对于下述色谱担体，评价在澄清收获物中细胞DNA的除去：
阴离子担体：
- Fractogel ® EMD TMAE (Merck) (强阴离子交换剂)
- Fractogel ® EMD DEAE (Merck) (弱阴离子交换剂)
- 带正电荷的膜Sartobind ® Q (Sartorius)
- 带正电荷的膜 Mustang ® Q (Pall)。
阳离子担体：
- Fractogel ® EMD SO3-(Merck) (强阳离子交换剂)
使用Sartobind®带正电荷的膜进行了一些预备性试验，以便确定用于通过阴离子交换色谱法洗脱该病毒的更好盐浓度。这些试验表明，该病毒在其中包括1M在内的整个盐梯度范围内都被洗脱。对于已试验的其它阴离子担体，这也是真实的。所得到的洗脱曲线让我们选择高NaCl浓度以洗脱最大量的病毒。DNA从350-400mM起开始洗脱，折衷选择450mM的NaCl浓度。
这些阴离子担体已在TRIS 20mM，NaCl 150mM pH 7.5缓冲液中进行了平衡。然后让澄清收获物与所研究的不同担体进行接触。然后在TRIS 20mM，NaCl 150mM，pH 7.5缓冲液中漂洗阴离子担体。然后使用TRIS 20mM，NaCl 450mM，pH 7.5洗脱缓冲液从担体解脱病毒。
通过使用澄清收获物R1进行了Fractogel ®柱试验。每ml凝胶注入了35-50UI狂犬病病毒和13-25µg DNA。
使用澄清收获物R2进行了膜试验。每cm2膜注入了13UI狂犬病病毒和350-450ng DNA。
还对用于在Fractogel®EMD SO3-担体上的阳离子交换剂色谱的操作条件进行了优化。用TRIS 20mM，NaCl 150mM， pH 7.5缓冲液对Fractogel® EMD SO3-担体进行了平衡。使用澄清收获物R1进行了对 Fractogel® EMD SO3-担体的试验。控制该培养基的电导率(14mS/cm-18mS/cm)和pH(7.5-7.7)。每ml凝胶注入了约50UI (基于糖蛋白G的含量测定) 的狂犬病病毒。在已收获滤液以测定未结合在柱上的病毒量后，再用Tris 20mM，NaCl 150mM，pH=7.5缓冲液洗涤担体。然后，将病毒洗脱入Tris 20mM，NaCl 600mM，pH=7.5缓冲液中，回收以独立级分的病毒峰。最后，将担体在Tris 20mM，NaCl 1M，pH=7.5缓冲液中进行再生。得到的结果列于下面表II中。
表II：不同色谱担体的性能
色谱担体的特征 病毒得率t 残留DNA滴度(ng/ml) 除去DNA 的量(%)
Mustang Q 47% 4** 93%
Sartobind Q 50% 1** 98%
Fractogel EMD-TMAE 54% 196** 48%
Fractogel EMD-DEAE 70% 161** 73%
Fractogel EMD-SO3- 89% 4.15*** 99.7%***
*：狂犬病病毒滴度采用ELISA在糖蛋白G的测定的基础上进行测定；
**：残留DNA的滴度采用qPCR在回收产物上直接进行测定；
***：残留DNA的滴度通过超滤在浓缩洗脱液6倍后采用qPCR进行测定。
带正电荷的膜担体(Sartobind®(Sartorius)或Mustang®Q(Pall))有利于DNA的除去(在所收集的级分中多于90%的DNA被除去)，但是相反地，所收获病毒的得率相对低(≤50%)。关于以带正电荷凝胶为基的担体(Fractogel® EMD TMAE(Merck)、Fractogel® EMD DEAE(Merck))，更确切地说，观察到相反的趋势，即所收获病毒的更好得率 (≥ 50%)，但不利于DNA的除去 (在最好的情况下73%DNA被除去)。相反地，使用Fractogel® EMD SO3-阳离子担体时，同时观察到非常好的DNA 除去(在所回收的部分中多于95%的DNA被除去)与所收获病毒的非常好的得率(≥70%)。因此，Fractogel® EMD SO3-阳离子担体的色谱性能优于用阴离子色谱担体所观察的色谱性能。
1-4) 不同阳离子色谱担体的色谱性能的测定
前面这些试验已表明，强阳离子交换剂色谱担体具有优于阴离子担体的性能，通过测试不同强阳离子交换剂色谱担体，我们试图确定能赋予最好性能的强阳离子交换剂色谱担体的特性，所述不同强阳离子交换剂色谱担体尤其通过它们的基体和它们的基团(配体)相区别。下面描述了所测试的不同担体的特性：
- Sartobind® S(Sartorius) 带负电荷的膜：在其上已接枝磺酸基团(配体)的纤维素膜；
- MustangTM S(Pall) 带负电荷膜：在其上已接枝磺酸基团(配体)的聚醚砜膜；
- CaptoTM S凝胶(GE Healthcare)：其基体基于琼脂糖的凝胶，在所述琼脂糖上已借助基于葡聚糖的间隔臂(bras espaceurs)接枝了磺基乙基基团(配体)；
- SP Sepharose XL凝胶(GE Healthcare)：其基体基于琼脂糖的凝胶，在所述琼脂糖上已借助基于葡聚糖的间隔臂接枝了磺基丙基基团(配体)；
- Toyopearl® SP-650 C(Tosoh)：其基体基于聚甲基丙烯酸酯的树脂，在所述聚甲基丙烯酸酯上已接枝了磺基丙基基团(配体)；
- Fractogel® EMD SO3 -(Merck)：其基体基于聚甲基丙烯酸酯的凝胶，在所述聚甲基丙烯酸酯上已借助间隔臂接枝了磺基异丁基基团，所述间隔臂是由具有化学式CH2=CH-CO-NH-C(CH3)2-CH2-SO3-的单体经聚合反应得到的聚合物链组成的。
一般而言，其配体借助间隔臂在其基体上接枝的凝胶具有所谓“触手”的结构，而这种结构通常有利于配体/蛋白质相互作用。
对在Sartobind® S膜(Sartorius)上的色谱(担体体积：7ml)曾评价了不同参数。注入的澄清收获物的pH，其在7.5-8.0的范围内；注入的澄清收获物的电导率，其在4.5mS/cm-17.9mS/cm范围内；注入的病毒载量，其在4-11UI/ml担体的范围内。无论这些研究的参数怎样，所得到的病毒得率始终≤35%。
在MustangTM S(Pall)膜上的色谱(担体体积10ml)的情况下，该澄清收获物的pH和电导率分别是7.5和14mS/cm，而注入的病毒载量是32UI/ml担体。所得到的病毒得率非常低(≤10%)。
应用与用于Fractogel® EMD SO3-担体上的色谱的操作方案相同的操作方案，以进行其它凝胶色谱分离(参见第1-3段)。唯一的不同涉及在Tris 20mM，NaCl 2M，pH 7.5缓冲液中进行Toyopearl® SP-650C凝胶再生。采用了与Fractogel® EMD SO3 -色谱同样的pH和电导率条件。在注入在澄清上清液中含有的病毒载量时，也遵守不同色谱担体的担载量容量限度。
除Fractogel® EMD SO3-担体(其中在滤液中测得所注入病毒总量的约5%)外，在3个其它类型担体(CaptoTM S 凝胶、SP Sepharose XL凝胶和Toyopearl® SP-650 C凝胶)上进行的色谱的滤液中测得的病毒量占所注入病毒总量的80-99%。因此从洗脱液中得到的病毒得率非常低(<10%)。
这些强阳离子交换剂色谱担体中的配体和基体的结构因此起到非常重要的作用，因为仅含有在其上接枝磺基异丁基基团的聚甲基丙烯酸酯基体的担体使得能够得到在其中回收至少70%狂犬病病毒的洗脱液。总之，对于所有经测试的阴离子和阳离子色谱担体，Fractogel® EMD SO3 -担体(Merck)是唯一在工业方面具有真正可开发性能的担体，因为狂犬病病毒的得率≥70%，而除去多于95%的DNA。
实施例 2 ：在该狂犬病病毒纯化方法中，将 Fractogel® EMD SO3 - 担体色谱法步骤与用 benzonase 处理步骤相结合的益处
为了评价这种联合的益处，将这种方法与通过benzonase双重处理来纯化狂犬病病毒的方法进行比较。传统上，使用benzonase处理以除去在生物制品中存在的核酸。重复该酶处理时，进一步增加了DNA的去除。
将使用“benzonase双重处理”的狂犬病病毒纯化方法与本发明的实验方案进行了比较，根据本发明的方案，将在Fractogel® EMD SO3 -担体上阳离子交换色谱法步骤与用benzonase处理的步骤结合起来。
在使用benzonase双重处理(UF-Bz-UF-Bz)的情况下，已采用的纯化方案对应于在下面表III中描述的方案。
表III：采用benzonase双重处理(UF-Bz-UF-Bz) 纯化狂犬病病毒
在将Fractogel® EMD SO3 -担体阳离子交换色谱与benzonase处理 (CEX-UF-Bz) 相结合的处理的情况下，已采用的纯化方法对应于在下面表IV中描述的方法。
表IV
通过Fractogel® EMD SO3 -担体阳离子交换色谱与benzonase处理(CEX-UF-Bz)相结合纯化狂犬病病毒
在这两种情况下，纯化方法是通过从已分成两个相等部分的体积约20升的相同澄清收获物R1开始来进行的。
在UF-Bz-UF-Bz方法的情况下，与在Tris 20mM，NaCl 150mM，pH=7.5缓冲液中的超滤渗滤结合，在PES Medium Screen 100KDA膜(PALL)上进行了两次浓缩，第一个超滤步骤导致该澄清收获物体积约20倍的减少，而第二个超滤步骤造成该澄清收获物体积总共约100倍的减少。在每次benzonase处理之前，添加MgCl2溶液，以便在该滞留物中的浓度是2mM。通过往反应介质中添加15U/ml粗收获物，并且让反应介质在实验室温度下2小时来施行benzonase处理。
在CEX-UF-Bz方法的情况下，根据在第1-3段中描述的方法进行色谱法步骤。然后含有纯化病毒的洗脱液浓缩约5倍并进行渗滤，随后通过使用与在UF-Bz-UF-Bz方法中已使用的同样实验步骤用benzonase进行处理。
在这两种方法中，超离心步骤在34-60 %蔗糖垫层上，用45型Ti转子以21000rpm在+5℃下进行2h。收集含有纯化病毒的梯度级分，合并，然后对其DNA、病毒和总蛋白质含量进行分析。
下面的表V列出在不同纯化阶段，根据所使用的方法得到的DNA、gpG和总蛋白质的滴度。
表V：两种纯化方法的总结
UF/Bz/UF：对应于在UF-Bz-UF-Bz方案中在第二次超滤后并刚好用benzonase第二次处理之前得到的滞留物；
CEX/UF：对应于在CEX-UF-Bz方案中在超滤步骤之后并刚好用benzonase处理之前得到的滞留物；
UC后：对应于这个阶段，其中在超离心后并在调节总体积以使其比澄清收获物的体积浓缩12.5倍之后合并含有纯化病毒的梯度级分；
*：病毒得率在ELISA gpG滴度的基础上进行计算。
表V的结果表明，Fractogel® EMD SO3 -担体色谱法后接benzonase处理的组合(CEX-UF-Bz方法)在除去DNA中比benzonase双重处理(UF-Bz-UF-Bz方法)要有效得多。采用CEX-UF-Bz方法可以达到将残留DNA量减少至少额外1个log10。这些结果在不同的体积规模下也得到证实。
还注意到，CEX-UF-Bz方法还比UF-Bz-UF-Bz方法更有效地除去污染蛋白质，因为发现每病毒单位几乎一半的总蛋白质 (以UI gpG的形式表达)(CEX-UF-Bz方法中的5.4µg/UI gpG，而不是UF-Bz-UF-Bz方法中的8µg /UI gpG)。由此事实得出在Fractogel® EMD SO3 -担体色谱法步骤中多于65%的蛋白质被除去。这些结果表明，在狂犬病病毒纯化方法中，Fractogel® EMD SO3 -担体色谱法步骤与benzonase处理步骤的组合对除去狂犬病病毒澄清收获物中的DNA起到联合作用，其远优于在benzonase双重处理中所观察的效果。

Claims (12)

1.含有经纯化与灭活的狂犬病病毒的疫苗，其中在一个有效剂量的疫苗中或在一个根据欧洲药典专论n°：216测试含有2.5UI的疫苗剂量中存在的采用定量PCR测定的DNA残留量和总蛋白质量分别低于20pg与40µg，优选地DNA残留量低于10pg，和其中在一个有效剂量的疫苗中存在的总蛋白质量的至少70%是狂犬病病毒的蛋白质。
2.根据权利要求1的疫苗，其中该疫苗不含有任何动物来源的外源产品。
3. 根据权利要求1的疫苗，其中该疫苗通过一种狂犬病病毒的纯化方法获得，该方法包括唯一的离子交换色谱法纯化步骤，所述离子交换色谱法纯化是阳离子交换色谱法纯化，包括：
a)让被这种狂犬病毒感染的细胞的培养物的上清液与阳离子交换色谱担体接触，以便让狂犬病病毒结合在该担体上，所述担体含有在其上已通过共价键接枝磺基异丁基基团的聚甲基丙烯酸酯基体，以及，
b)从担体上洗脱该病毒。
4. 根据权利要求3的疫苗，其中被狂犬病病毒感染的细胞的培养物的上清液没有任何动物来源的外源蛋白质。
5. 根据权利要求4的疫苗，其中在被狂犬病病毒感染的细胞的培养物的上清液中包含的非动物来源的外源蛋白质浓度≤15mg/l。
6. 根据权利要求3的疫苗，其中在洗脱液中测得的病毒量对应于在已与色谱担体接触的上清液中所测得病毒量的至少70%，优选地至少80%。
7. 根据权利要求6的疫苗，其中在洗脱液中测得的总蛋白质量对应于在已与色谱担体接触的上清液中所测得总蛋白质量的40%以下，并且在于在洗脱液中所测得的DNA量对应于在已与色谱担体接触的上清液中所测得DNA量的5%以下。
8. 根据权利要求3的疫苗，其中该方法还包括用核酸酶处理洗脱液，所述洗脱液任选地是浓缩的。
9. 根据权利要求8的疫苗，其中然后让经处理的洗脱液经受蔗糖梯度超离心，并且收集含有纯化病毒的所述一种或多种梯度级分。
10. 根据权利要求9的疫苗，其中该方法还包括借助病毒灭活剂灭活经纯化的狂犬病病毒。
11. 含有经纯化与灭活的狂犬病病毒的疫苗，其中该疫苗通过制备狂犬病疫苗的方法获得，该方法包括：
a) 用狂犬病病毒感染细胞培养物，
b) 根据在权利要求3中所描述的方法，从经感染细胞的培养物的上清液开始来纯化狂犬病病毒，
c) 将在b)中得到的悬浮液在储存缓冲液中进行混合，以及
d) 将在c)中得到的混合物以单剂量或多剂量疫苗剂型进行分配。
12. 含有经纯化与灭活的狂犬病病毒的疫苗，其中该疫苗通过制备狂犬病疫苗的方法获得，该方法包括：
a) 用狂犬病病毒感染细胞培养物，
b) 根据在权利要求3中所描述的方法，从经感染细胞的培养物的上清液开始来纯化狂犬病病毒，
c) 将在b)中得到的纯化病毒的悬浮液与冻干缓冲液进行混合，
d) 将在c)中得到的混合物以单剂量或多剂量疫苗剂型进行分配，以及
e) 对这些疫苗剂进行冻干。
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