CN102028954B

CN102028954B - 一种重组腺病毒的制剂

Info

Publication number: CN102028954B
Application number: CN2009101678124A
Authority: CN
Inventors: 杨艳艳; 郭勇
Original assignee: Chengdu Kanghong Biotechnologies Co Ltd
Current assignee: Beijing Kanghong Biomedical Co., Ltd.
Priority date: 2009-09-29
Filing date: 2009-09-29
Publication date: 2012-11-07
Anticipated expiration: 2029-09-29
Also published as: CN102028954A

Abstract

本发明涉及一种重组腺病毒的制剂，所述制剂含有重组腺病毒、Tris缓冲液、丙二醇和精氨酸；另外，制剂还可以含有抗氧化剂如亚硫酸钠、硫代硫酸钠、谷胱甘肽、硫代水杨酸、半胱氨酸盐酸盐、二硫代甘醇酸、硫脲、硫代山梨醇或硫代葡萄糖的任一种或其组合；该制剂还可以含有抗氧增效剂为枸橼酸钠、琥珀酸钠或次磷酸钠的任一种或其组合。本发明制剂可以在2-8℃长期保存重组腺病毒。

Description

一种重组腺病毒的制剂

技术领域

本发明涉及一种制剂，尤其涉及一种重组腺病毒的制剂。

背景技术

重组腺病毒作为基因治疗领域常用的复制载体，临床用药要求其在保存、运输及使用过程中保持完整的二十面体病毒壳体结构，维持较高的活病毒数量和感染复制能力。然而，腺病毒在高温、低pH、氧化等条件下极不稳定，容易降解。例如，US7202078公开了下述技术内容，当重组腺病毒浓度高于1E12vp/ml时，病毒颗粒通常会聚集成丝状，引发衣壳蛋白裂解，致使感染活性降低。

在实际的临床应用中，传统方法主要选择在-80℃--20℃的低温条件下保存和运输重组腺病毒药物，虽然这种方法能够比较有效地保持腺病毒的结构和活性，但由于需要采用大量的用于保持低温的材料和设备，导致这种保存和运输的成本高昂，且操作存在诸多不便，并存在较大风险。

鉴于这些原因，研究者开始考虑从制剂角度提高用于基因治疗的重组腺病毒贮存的稳定性，开发能在2～8℃甚至25℃下较好地保持腺病毒活性的制剂。

例如，US6689600、US7235391、US20080107631A公开了包括Tris缓冲液、甘油、甘露醇、蔗糖、MgCl₂、吐温-80的重组腺病毒制剂，这些制剂能在2-8℃保存浓度为1E11vp/mL的腺病毒，并维持其6个月的稳定性，但没有考察该制剂是否可以保存1E12vp/mL及更高浓度腺病毒的稳定性。

又如，US7456009和US7351415公开了由Tris缓冲液、非离子表面活性剂吐温-80、二价阳离子MgCl₂、糖类、NaCl、EDTA或无水乙醇组成的制剂，该制剂能在2-8℃较好保存1E10vp/mL腺病毒的活性，也但没有描述该制剂可以保存1E12vp/mL及更高浓度腺病毒的稳定性。

又如，US 2006/0205080A、CN101163794A公开了包含Tris缓冲液、甘氨酸、MgCl₂，及丙二醇、DMSO、PEG、蔗糖、甘油、四氢呋喃乙二醇醚等组成的制剂，该制剂用于保存1E12vp/mL腺病毒，可以较好地保持腺病毒的活性。

可见，这些现有技术公开的改良制剂通过优化重组腺病毒制剂的组成，在较大程度上，改善了腺病毒的保存浓度和保存温度。但是，这些改良制剂尚不能用于保存浓度高于2E12vp/ml的腺病毒制剂，且在2-8℃条件下，不能在较长时间内(2年以上)保持制剂中重组腺病毒的活性。而临床上为了提高疗效，需要浓度不低于2E12vp/ml的重组腺病毒制剂。因此，如何进一步改良重组腺病毒制剂的组成，来改善该制剂的稳定性及保存浓度、保存温度和保存时间，成为一个亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题之一在于，提供一种能够在较高温度下、较长时间内保存高浓度重组腺病毒的药物组合物。本发明组合物不仅提高了制剂中重组腺病毒的稳定性，尤其是提高了高浓度重组腺病毒制剂的稳定性，并延长了其保存时间。本发明目的在于提供一种重组腺病毒制剂，所述制剂含有重组腺病毒、Tris缓冲液、丙二醇和精氨酸。

进一步，所述Tris缓冲液的浓度为1mM-100mM，优选为5mM-50mM，更优选为10mM。

进一步，所述丙二醇的浓度为5W/V％-20W/V％，优选为10W/V％-15W/V％。

进一步，所述精氨酸的浓度为50mM-250mM，优选为100mM-200mM，更优选为150mM。

进一步，所述制剂中还含有抗氧化剂。其中，优选所述的抗氧化剂选自亚硫酸钠、硫代硫酸钠、谷胱甘肽、硫代水杨酸、半胱氨酸盐酸盐、二硫代甘醇酸、硫脲、硫代山梨醇或硫代葡萄糖的任一种或其组合，更优选为谷胱甘肽。

进一步，所述谷胱甘肽的浓度为5mM-100mM，优选为10mM-50mM，更优选为20mM。

进一步，所述制剂中还含有抗氧增效剂。其中，优选所述的抗氧增效剂为枸橼酸钠、琥珀酸钠或次磷酸钠的任一种或其组合，更优选为枸橼酸钠。

进一步，所述枸橼酸钠的浓度为5mM-100mM，优选为10mM-50mM，更优选为30mM。

进一步，本发明的制剂由重组腺病毒、10mM的Tris，10W/V％丙二醇和100mM的精氨酸组成，用HCl调节pH7.4-8.6。

进一步，本发明的制剂由重组腺病毒、10mM的Tris，10W/V％丙二醇、100mM的精氨酸、20mM的谷胱甘肽组成，用HCl调节pH7.4-8.6。

进一步，本发明的制剂由重组腺病毒、10mM的Tris，10W/V％丙二醇、100mM精氨酸、20mM的谷胱甘肽、30mM的枸橼酸钠组成，用HCl调节pH7.4-8.6。

为此，本发明的目的在于提供一种重组腺病毒制剂，所述制剂含有重组腺病毒、1-100mMTris缓冲液、保护剂。其中，所述的保护剂选自多羟基化合物或二甲基亚砜的任一种或其组合，优选多羟基化合物选自丙二醇、丙三醇、聚乙二醇400的任一种或其组合，更优选为丙二醇，最优选浓度为5-20W/V％的丙二醇。

本发明的另一目的在于提供一种重组腺病毒制剂，所述制剂含有重组腺病毒、1-100mMTris缓冲液、5-20W/V％的丙二醇、氨基酸类化合物。其中，优选所述的氨基酸类化合物选自甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、蛋氨酸或脯氨酸的任一种或其组合，更优选为精氨酸，最优选浓度为50-250mM的精氨酸。

本发明的另一目的在于提供了一种重组腺病毒制剂，所述制剂含有重组腺病毒、1-100mMTris缓冲液、5-20W/V％的丙二醇、精氨酸、抗氧化剂。其中，优选所述的抗氧化剂选自亚硫酸钠、硫代硫酸钠、谷胱甘肽、硫代水杨酸、半胱氨酸盐酸盐、二硫代甘醇酸、硫脲、硫代山梨醇或硫代葡萄糖的任一种或其组合，更优选为谷胱甘肽，最优选浓度为5-100mM的谷胱甘肽。

本发明的另一目的在于提供了一种重组腺病毒制剂，所述制剂含有重组腺病毒，1-100mMTris缓冲液，5-20W/V％的丙二醇、50-250mM精氨酸、5-100mM的谷胱甘肽、抗氧增效剂。其中，优选所述的抗氧增效剂为枸橼酸钠、琥珀酸钠或次磷酸钠的任一种或其组合，更优选为枸橼酸钠，最优选浓度为30mM的枸橼酸钠。

进一步，本发明制剂的组成为，含有1-100mM的Tris缓冲液、5-20W/V％的丙二醇、50-250mM的精氨酸、5-100mM的谷胱甘肽、5-100mM的枸橼酸钠。

进一步，本发明的制剂组成为，含有10mM的Tris缓冲液、10W/V％的丙二醇、100mM的精氨酸、20mM的谷胱甘肽、30mM的枸橼酸钠。

本发明制剂主要应用于保存基因治疗的重组腺病毒，还可应用于保存任何野生型重组腺病毒或其他用途的重组腺病毒。具体地说，包括所有利用重组DNA技术构建的复制缺陷型腺病毒或增殖型腺病毒，以及所有的人或动物的野生型腺病毒或其突变腺病毒。

采用国际通用的TCID50法检定的病毒滴度值和紫外法检定的病毒颗粒数之比值(即比活度)来评价本发明的重组腺病毒的稳定性。

本发明采用TCID50方法测定重组腺病毒滴度，其原理是：将经过系列稀释的病毒样品感染293细胞，将每个稀释度所感染一定数量的细胞孔培养10天，在显微镜下观察各细胞孔中的细胞状况，统计病变细胞孔，利用TCID50计算公式，计算病毒滴度。

TCID50/ml＝10^{-[-L-d(s-0.5)]+b}

其中，L：为最低稀释度的对数；d：为稀释对数之间的差；s：为病变阳性孔比率之和；b：为病毒接种量，换算为每毫升体积的倍数的对数。

本发明采用分光光度法检测腺病毒的颗粒数，其原理是：理论上，野生型5型腺病毒的成分是87％蛋白质和13％DNA。因此，腺病毒颗粒的浓度可直接用紫外分光光度计测量。蛋白质的色氨酸和酪氨酸残基在277nm处有紫外吸收，而双链线性DNA在260nm有最大吸收值。本法采用含有0.1％SDS(十二烷基硫酸钠)的制剂缓冲液，将病毒衣壳分解成蛋白质和DNA，再利用双链线性DNA在260nm处具有最大吸收值，在有去垢剂时，颗粒浓度与260nm吸光值成比例，用分光光度计于260nm处测定供试品的吸光度值，采用公式(1AU＝1.1×10¹²VP/mL)计算病毒颗粒数。测试病毒颗数的适用范围为，供试品病毒颗粒数≥2×10¹¹VP/mL。

本发明重组腺病毒稳定性的判断指标为比活度，即病毒比活度＝病毒滴度/病毒颗粒数×100％。

国家药品食品监督管理局(SFDA)在《人基因治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》中规定，临床重组腺病毒比活度应高于3.3％；张晓志等(《中华医学杂志》，2004年，第84卷第10期)，在“重组腺病毒临床级基因治疗制品的质量控制”中提到，评价腺病毒制剂的稳定性时，制剂中腺病毒的比活度应该大于3.3％。

除非另有说明，本发明所述百分含量均为重量体积百分比。

本发明所用的对照制剂为“ARCA”，为US 2006/0205080A、CN200680013299所公开的通常用于保存腺病毒的制剂缓冲液，包含10mM的Tris、1％甘氨酸、1mM的MgCl₂、5％蔗糖、0.05％的吐温-80。

本发明的重组腺病毒的制备方法可以采用本领域通常的重组腺病毒制备方法所得，一般来说包括细胞复苏、种子细胞制备、病毒感染、扩增、细胞裂解、澄清过滤、浓缩换液、原液制备等过程

本发明的重组腺病毒制剂的制备方法可以采用本领域通常制备重组腺病毒的方法，一般来说包括如下步骤：将原液进行换液、检测浓度、用配比好浓度的制剂辅料来稀释、除菌、分装得到成品。

本发明的另一目的在于提供重组腺病毒制剂用于制备基因治疗药物中的应用。

与现有技术相比，本发明的重组腺病毒制剂具有下述优点：

1)本发明的重组腺病毒制剂能够在较高温度(2-8℃甚至25℃)下保存较高浓度的重组腺病毒，甚至是浓度高于2E12vp/mL的重组腺病毒。

2)本发明的制剂具有很好的稳定性，能够在2-8℃下较长时间内保存较高浓度的重组腺病毒，24个月内仍能较好保存2E12vp/mL重组腺病毒。

附图说明

图1在2-8℃条件下，2E12vp/mL重组腺病毒保存在本发明的重组腺病毒制剂中，在0-24个月的比活度变化，所述的重组腺病毒制剂的组成为，有10mM的Tris缓冲液、10W/V％的丙二醇、100mM的精氨酸、20mM的谷胱甘肽、30mM的枸橼酸钠。

图2在2-8℃条件下，本发明制剂与参比制剂用于保存2E12vp/mL重组腺病毒，其比活度随时间的变化情况。

具体实施方式

以下将结合实施例具体说明本发明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明的实质。

实施例1 pH值对制剂中重组腺病毒稳定性的影响

为了研究pH值对制剂中重组腺病毒稳定性的影响，在25℃条件下，我们研究了pH6.8-8.6范围内，pH值分别为6.8、7.2、7.4、7.6、7.8、8.2、8.6时，pH值对制剂中重组腺病毒稳定性的影响。

通过检测制剂中重组腺病毒的病毒滴度(TCID50/mL)和比活度，研究了pH值对制剂中重组腺病毒稳定性的影响，结果见表1。

表1pH值对制剂中重组腺病毒稳定性的影响

注：制剂组成为10mMTris+10w/v％丙二醇，用HCl调节pH。

由表1可见，在pH低于7.4时，制剂中的重组腺病毒较不稳定；pH为7.4-8.6时，制剂中重组腺病毒的稳定性较好。因此，选择本发明制剂的pH为7.4-8.6。其中pH为7.8时腺病毒的稳定性很好，且接近于人体的PH值，药品不良反应较少。

实施例2保护剂对制剂中重组腺病毒稳定性的影响

在25℃条件下，研究了保护剂(丙二醇、丙三醇、聚乙二醇400、二甲基亚砜、山梨醇、甘露醇、蔗糖、海藻糖)对制剂中重组腺病毒稳定性的影响。其中，对照制剂为ARCA制剂。

通过检测制剂中重组腺病毒的病毒滴度(TCID50/mL)和比活度，研究了保护剂对制剂中重组腺病毒制剂稳定性的影响，制剂的组成和研究结果见表2。

表2保护剂对制剂中重组腺病毒稳定性的影响

注：Tris-HCl缓冲液中Tris浓度为10mM，配制时用HCl调节pH至7.8；各保护剂的浓度百分比为w/v％。

由表2可见，与对照制剂相比，本发明的重组腺病毒制剂均可较好保存制剂中的重组腺病毒，提高其稳定性，尤其是添加丙二醇、二甲基亚砜、聚乙二醇400的制剂，制剂中重组腺病毒的稳定性提高最为显著。

实施例3氨基酸对制剂中重组腺病毒稳定性的影响

在25℃条件下，本发明研究了氨基酸(甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、蛋氨酸、脯氨酸)对制剂中重组腺病毒稳定性的影响。

通过检测制剂中重组腺病毒的病毒滴度(TCID50/mL)和比活度，研究了氨基酸对制剂中重组腺病毒制剂稳定性的影响，制剂的组成和研究结果见表3。

表3氨基酸对制剂中重组腺病毒稳定性的影响

注：Tris-HCl缓冲液中Tris浓度为10mM，配制时用HCl调节pH至7.8；丙二醇浓度为10w/v％。

由表3可见，与不添加氨基酸的制剂相比，添加氨基酸的制剂可以较好保存制剂中的重组腺病毒，提高其稳定性，尤其是添加精氨酸的制剂，制剂中腺病毒稳定性的提高最为显著，其次是添加了甘氨酸和脯氨酸的制剂。

实施例4抗氧化剂对制剂中重组腺病毒稳定性的影响

在25℃条件下，本发明研究了抗氧化剂(亚硫酸钠、硫代硫酸钠、谷胱甘肽、硫代水杨酸、半胱氨酸盐酸盐、二硫代甘醇酸、硫脲、硫代山梨醇、硫代葡萄糖)对制剂中重组腺病毒稳定性的影响。

通过检测制剂中重组腺病毒的病毒滴度(TCID50/mL)和比活度，研究了抗氧化剂对制剂中重组腺病毒制剂稳定性的影响，制剂的组成和研究结果见表4。

表4抗氧化剂对制剂中重组腺病毒稳定性的影响

注：Tris-HCl缓冲液中Tris浓度为10mM，配制时用HCl调节pH至7.8；丙二醇浓度为10％(w/v)；精氨酸浓度为100mM。

由表4可见，与不添加抗氧化剂的制剂相比，添加抗氧化剂的制剂可以较好保存制剂中的重组腺病毒，提高其稳定性，尤其是添加谷胱甘肽或盐酸半胱氨酸的制剂，制剂中重组腺病毒的稳定性提高最为显著，其次是添加硫脲的制剂。

实施例5抗氧增效剂对制剂中重组腺病毒稳定性的影响

在25℃条件下，本发明研究了抗氧增效剂(枸橼酸钠、琥珀酸钠和次磷酸钠)对制剂中重组腺病毒稳定性的影响。

通过检测制剂中重组腺病毒的病毒滴度(TCID50/mL)和比活度，研究了抗氧增效剂对制剂中重组腺病毒制剂稳定性的影响，制剂的组成和研究结果见表5。

表5抗氧增效剂对制剂中重组腺病毒稳定性的影响

注：Tris浓度为10mM，丙二醇浓度为10％(w/v)，精氨酸浓度为100mM，谷胱甘肽浓度为20mM，用HCl调节pH7.8。

由表5可见，与不添加抗氧增效剂的制剂相比，添加抗氧增效剂的制剂可以较好保存制剂中的重组腺病毒，提高其稳定性，尤其是添加枸橼酸钠的制剂稳定性，制剂中腺病毒的稳定性提高最为显著，其次是添加了琥珀酸钠的制剂。

实施例6本发明制剂在2-8℃保存2E12vp/mL重组腺病毒的稳定性研究

本发明制剂组成为：病毒颗粒数2.24E12vp/mL，10mMTris+10％丙二醇+100mM精氨酸+20mM谷胱甘肽+30mM枸橼酸钠，用HCl调节pH7.4-8.6。

将本发明制剂在2-8℃保存，分别于0、1、3、6、9、12、15、18个月取样检测病毒滴度，计算比活度，结果见图1。

由图1可见，本发明制剂在2-8℃条件下，保存浓度高达2E12vp/mL的重组腺病毒2年后，仍能保持其比活度为8.9％，显示了本发明制剂可在2-8℃保存2E12vp/mL重组腺病毒不低于2年的稳定性，即长期稳定性。

实施例7本发明制剂保存高浓度重组腺病毒的稳定性研究

为了研究本发明制剂(其组成为10mMTris+10％丙二醇+100mM精氨酸+20mM谷胱甘肽+30mM枸橼酸钠，pH 7.8)与保存重组腺病毒浓度(2E12vp/mL、4E12vp/mL、6E12vp/mL、8E12vp/mL、10E12vp/mL、14E12vp/mL)之间的关系，将制备样品于25℃保存，分别于0、1、2、3个月取样检测病毒滴度和颗粒数，计算比活度，结果见下表6。

表6本发明制剂25℃保存高浓度重组腺病毒的稳定性研究

由表6可见，腺病毒的稳定性与其浓度呈显著的线性关系，在25℃条件下，本发明制剂可保存浓度高达2-8E12vp/mL的重组腺病毒较好的稳定性，并能维持和保存浓度高达8-14E12vp/mL的重组腺病毒1-2个月的稳定性。

另外，为了研究本发明制剂(其组成为10mMTris+10％丙二醇+100mM精氨酸+20mM谷胱甘肽+30mM枸橼酸钠，pH 7.8)与保存重组腺病毒浓度(2E12vp/mL、4E12vp/mL、6E12vp/mL、8E12vp/mL、10E12vp/mL)之间的关系，将制备样品于2-8℃保存，分别于0、1、3、6、9、12个月取样检测病毒滴度和颗粒数，计算比活度，结果见下表7。

表7本发明制剂2-8℃保存高浓度重组腺病毒的稳定性研究

由表7可见，腺病毒的稳定性与其浓度呈显著的线性关系，在2-8℃条件下，本发明制剂可保存1E13vp/mL浓度重组腺病毒较好的稳定性，保存1年后，仍保持其比活度在3.3％以上，提示本发明制剂可在2-8℃保存高浓度(如1E13vp/mL)重组腺病毒较好的稳定性。

实施例8Tris浓度对制剂中重组腺病毒稳定性的影响

在37℃条件下，本发明研究了Tris浓度(1mM、5mM、10mM、50mM、100mM)对制剂中重组腺病毒稳定性的影响。

通过检测制剂中重组腺病毒的病毒滴度(TCID50/mL)和比活度，研究了Tris浓度对制剂中重组腺病毒制剂稳定性的影响，制剂的组成和研究结果见表8。

表8Tris浓度对制剂中重组腺病毒稳定性的影响

注：丙二醇浓度为10％(w/v)，精氨酸浓度为100mM，谷胱甘肽浓度为20mM，枸橼酸钠浓度为30mM，用HCl调节pH7.8。

由表8可见，制剂中Tris的浓度不低于10mM时，即可较为理想地保存制剂中重组腺病毒的稳定性；当制剂中Tris的浓度在10mM以上，制剂中重组腺病毒的稳定性基本上没有差异。

实施例9丙二醇浓度对制剂中重组腺病毒稳定性的影响

在37℃条件下，本发明研究了丙二醇浓度(5w/v％、10w/v％、15w/v％、20w/v％)对制剂中重组腺病毒稳定性的影响。

通过检测制剂中重组腺病毒的病毒滴度(TCID50/mL)和比活度，研究了丙二醇浓度对制剂中重组腺病毒制剂稳定性的影响，制剂的组成和研究结果见表9。

表9丙二醇浓度对制剂中重组腺病毒稳定性的影响

注：Tris浓度为10mM，精氨酸浓度为100mM，谷胱甘肽浓度为20mM，枸橼酸钠浓度为30mM，用HCl调节pH7.8。

由表9可见，丙二醇浓度和重组腺病毒稳定性基本呈线性相关，即丙二醇浓度越高，制剂中重组腺病毒的稳定性越好。并且，当丙二醇的浓度不低于10w/v％时，即可很好保存制剂中重组腺病毒的稳定性。

实施例10精氨酸浓度对制剂中重组腺病毒稳定性影响

在37℃条件下，本发明研究了精氨酸浓度(50mM、100mM、150mM、200mM、250mM)对制剂中重组腺病毒稳定性的影响。

通过检测制剂中重组腺病毒的病毒滴度(TCID50/mL)和比活度，研究了精氨酸浓度对制剂中重组腺病毒制剂稳定性的影响，制剂的组成和研究结果见表10。

表10精氨酸浓度对制剂中重组腺病毒稳定性的影响

注：Tris浓度为10mM，丙二醇含量为10％(w/v)，谷胱甘肽浓度为20mM，枸橼酸钠浓度为30mM，用HCl调节pH7.8。

由表10可见，精氨酸浓度和重组腺病毒稳定性基本呈线性相关，即精氨酸浓度越高，制剂中重组腺病毒的稳定性越好。并且，当精氨酸的浓度不低于100mM时，即可很好保存制剂中重组腺病毒的稳定性。

实施例11谷胱甘肽浓度对制剂中重组腺病毒稳定性的影响

在37℃条件下，本发明研究了谷胱甘肽浓度(5mM、10mM、20mM、50mM、100mM)对制剂中重组腺病毒稳定性的影响。

通过检测制剂中重组腺病毒的病毒滴度(TCID50/mL)和比活度，研究了谷胱甘肽浓度对制剂中重组腺病毒制剂稳定性的影响，制剂的组成和研究结果见表11。

表11谷胱甘肽浓度对制剂中重组腺病毒稳定性的影响

注：Tris浓度为10mM，丙二醇含量为10％(w/v)，精氨酸浓度为100mM，枸橼酸钠浓度为30mM，用HCl调节pH7.8。

由表11可见，谷胱甘肽浓度和重组腺病毒稳定性基本呈线性相关，即谷胱甘肽浓度越高，制剂中重组腺病毒的稳定性越好。并且，当谷胱甘肽的浓度不低于10mM时，即可很好保存制剂中重组腺病毒的稳定性。

实施例12枸橼酸钠浓度对制剂中重组腺病毒稳定性的影响

在37℃条件下，本发明研究了枸橼酸钠浓度(5mM、10mM、30mM、50mM、100mM)对制剂中重组腺病毒稳定性的影响。

通过检测制剂中重组腺病毒的病毒滴度(TCID50/mL)和比活度，研究了枸橼酸钠浓度对制剂中重组腺病毒制剂稳定性的影响，制剂的组成和研究结果见表12。

表12枸橼酸钠浓度对制剂中重组腺病毒稳定性的影响

注：Tris浓度为10mM，丙二醇含量为10％(w/v)，精氨酸浓度为100mM，谷胱甘肽浓度为20mM，用HCl调节pH7.8。

由表12可见，枸橼酸钠浓度和重组腺病毒稳定性基本呈线性相关，即枸橼酸钠浓度越高，制剂中重组腺病毒的稳定性越好。并且，当枸橼酸钠的浓度不低于30mM时，即可很好保存制剂中重组腺病毒的稳定性。

实施例13本发明制剂对2E12vp/mL重组腺病毒稳定性的影响

本发明采用对比试验，比较研究了本发明制剂与参比参比实施例对制剂中重组腺病毒稳定性的影响，各制剂组成见表13。

表13本发明制剂与参比制剂的组成

注：参比实施例1和2为US 2006/0205080 A1的表8 H5&H18所列制剂，参比实施例3为US6689600实施例6表13第二组液体制剂AQF2-7所列制剂，参比实施例4为US7351415实施例1所述的制剂编号和组成表中[A173]号所列的制剂。

样品制备后于2-8℃保存，分别于0、1、2、3、6、9、12、15、18、24个月取样检测病毒滴度和颗粒数，计算比活度，结果见图2。

由图2可见，在2-8℃条件下，本发明制剂1保存2E12vp/mL重组腺病毒稳定性与参比制剂1制剂相当，但本发明制剂具有制剂组分更加简单的优点；本发明制剂2-4保存2E12vp/mL重组腺病毒稳定性明显优于参比实施例1-4，参比实施例2-4保存2E12vp/mL重组腺病毒稳定性2个月，参比实施例1保存2E12vp/mL重组腺病毒稳定性18个月，而本发明制剂2-4保存2E12vp/mL重组腺病毒24个月，其比活度仍在3.3％以上。

Claims

1.一种重组腺病毒的药物制剂，所述制剂含有重组腺病毒、Tris缓冲液、丙二醇和精氨酸，其中，Tris缓冲液的浓度为5mM-50mM，丙二醇的浓度为10W/V％-15W/V％，精氨酸的浓度为100mM-200mM。

2.根据权利要求1所述的重组腺病毒的药物制剂，所述Tris缓冲液的浓度为10mM。

3.根据权利要求1所述的重组腺病毒的药物制剂，所述精氨酸的浓度为150mM。

4.根据权利要求1-3任一项所述的重组腺病毒的药物制剂，所述制剂中还含有抗氧化剂。

5.根据权利要求4所述的重组腺病毒的药物制剂，所述的抗氧化剂选自亚硫酸钠、硫代硫酸钠、谷胱甘肽、硫代水杨酸、半胱氨酸盐酸盐、二硫代甘醇酸、硫脲、硫代山梨醇或硫代葡萄糖的任一种或其组合。

6.根据权利要求5所述的重组腺病毒的药物制剂，所述的抗氧化剂为谷胱甘肽。

7.根据权利要求6所述的重组腺病毒的药物制剂，所述谷胱甘肽的浓度为10mM-50mM。

8.根据权利要求7所述的重组腺病毒的药物制剂，所述谷胱甘肽的浓度为20mM。

9.根据权利要求5-8任一项所述的重组腺病毒的药物制剂，所述制剂中还含有抗氧增效剂。

10.根据权利要求9所述的重组腺病毒的药物制剂，所述的抗氧增效剂为枸橼酸钠、琥珀酸钠或次磷酸钠的任一种或其组合。

11.根据权利要求10所述的重组腺病毒的药物制剂，所述的抗氧增效剂为枸橼酸钠。

12.根据权利要求11所述的重组腺病毒的药物制剂，所述枸橼酸钠的浓度为5mM-100mM。

13.根据权利要求12所述的重组腺病毒的药物制剂，所述枸橼酸钠的浓度为10mM-50mM。

14.根据权利要求13所述的重组腺病毒的药物制剂，所述枸橼酸钠的浓度为30mM。

15.根据权利要求1所述的重组腺病毒的药物制剂，所述制剂由重组腺病毒、10mM的Tris，10W/V％丙二醇和100mM的精氨酸组成，用HCl调节pH7.4-8.6。

16.根据权利要求1所述的重组腺病毒的药物制剂，所述制剂由重组腺病毒、10mM的Tris，10W/V％丙二醇、100mM的精氨酸、20mM的谷胱甘肽组成，用HCl调节pH7.4-8.6。

17.根据权利要求1所述的重组腺病毒的药物制剂，所述制剂由重组腺病毒、10mM的Tris，10W/V％丙二醇、100mM精氨酸、20mM的谷胱甘肽、30mM的枸橼酸钠组成，用HCl调节pH7.4-8.6。

18.权利要求1-17任一项所述的重组腺病毒的药物制剂用于制备基因治疗药物中的应用。