CN102202688A - 稳定、干燥的轮状病毒疫苗、其组合物和制备其的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了新的冷冻干燥轮状病毒疫苗制剂和它们的制备方法。该制剂包括疫苗稳定剂，其导致疫苗制剂的稳定性提高，并使其效能损失最小。该轮状病毒疫苗制剂包括二糖(例如蔗糖)与氨基酸(例如甘氨酸)的有利的比例。冷冻干燥导致病毒制剂具有100%病毒保存性能，并且残余水份为大约0.8%至1.4%。

Description

稳定、干燥的轮状病毒疫苗、其组合物和制备其的方法
本发明内容关于稳定、干燥的轮状病毒疫苗、其组合物和制备其的方法。
发明领域
本发明涉及轮状病毒疫苗组合物，其可用于预防一种或多种轮状病毒菌株的感染，其中稳定剂和干燥过程可提供具有最小效能损失的固态制剂。
发明背景
在发达和发展中国家两者中，轮状病毒不断地被证明是幼儿和少年严重腹泻的唯一的、最主要的病因。轮状病毒腹泻的后果是令人震惊的，在5岁以下的人群中，它们每年造成最高达592,000个人死亡，在发展中国家尤为突出(Parashar等人Emerg. Infect. Dis., 2003, 9:565-572)。最近，估计在发展中国家中每200个儿童中有1个儿童死于轮状病毒腹泻(Glass等人Lancet, 2004, 363:1547-1550)。在美国，在5岁以下的人群中，据估计每年轮状病毒引起2,730,000例痢疾病的急性发作，410,000例去看医生，160,000例需要急诊观察，50,000例住院治疗，和20例死亡(Tucker等人，JAMA, 1998, 279:1371-1376)。由此，在发达和发展中国家都需要使轮状病毒疫苗，已受到国家和国际的认可。
WO2007009081已经建议发展中国家使用基于六价牛轮状病毒(UK)的疫苗，以便不但覆盖标准血清型G1至G4，而且覆盖新出现的血清型G8和G9。
为了使保护程度更宽，先前已经讨论了开发包括标准G1-G4菌株和G9、G8菌株的六价轮状病毒疫苗，参见Albert Z. Kapikian等人“A Hexavalent human Rotavirus-bovine Rotavirus reassortant vaccine designed for use in developing countries”; National Institutes of Health; Journal of infectious diseases; 2005; 192; S22-9。
轮状病毒菌株在干燥过程和储存期间可能失去生存能力。先前已经报道，冷冻干燥引起高达30%的病毒效能的损失。
Wei Liu等人(“Freeze drying of Proteins from a sucrose-glycine excepient system: Effect of formulation composition on initial recovery of protein activity”; AAPS Pharm Scitech; Feb. 11, 2005; 6(2); E150-E157)已经描述了含有蔗糖-甘氨酸组合的蛋白制剂。
按照US 6616931、US 6403098 和 US 5932223的冷冻干燥的轮状病毒疫苗制剂，包括大约1×105至大约1000×105 pfu/mL的轮状病毒菌株、糖1-20%(w/v)、磷酸盐大约0.05-2M，和a)0.5%-1.25%的重组人血清白蛋白，或b)0.1%-1.25%的氨基酸(谷氨酸盐、谷氨酰胺或精氨酸)。进一步的，这些专利还讨论了通过在蔗糖/甘露糖醇稳定剂中包含甘氨酸(1%)来提高冷冻干燥轮状病毒制剂的稳定性。
对于具有提高的生存能力和稳定性的轮状病毒疫苗制剂，仍然有着显著的需求。现有技术稳定剂中没有能够提高生存能力和稳定性的。进一步的，为了在世界范围内分配轮状病毒疫苗，必须配制疫苗，以使它们在多种环境条件下保持稳定。
意外地，现在已经发现：a)包含蔗糖和甘氨酸组合的稳定剂组合物，和b)最佳冷冻干燥循环导致轮状病毒制剂具有小于3%的含水量和100%的单一病毒保存。
发明概述
本发明涉及含有一种或多种稳定剂的组合物，其能够制备固态的稳定的轮状病毒疫苗。
本发明提供了用作疫苗的新的轮状病毒的制剂和它们的制备方法。
本发明涉及疫苗稳定剂，疫苗制剂，优选赋予提高稳定性和生存能力的冷冻干燥的单价和多价轮状病毒疫苗。
本发明的疫苗制剂包括有利比例的二糖(例如蔗糖)与氨基酸(例如甘氨酸)作为稳定剂组分。
按照本发明，炼韧（annealing）优选在-20℃进行。在低于Tg的条件下进行初始干燥，其中在升华（sublimation）的头1200分钟期间的最大产品温度不越过-32℃。
本发明的优点
· 实现快速和均匀的冷冻干燥。
· 产生象饼块一样的化妆碰撞而反跳弹性碎片（Cosmetically carrom pieces），在抗酸稀释剂中具有良好的溶解性，具有0.8至1.5%的湿度（moisture）范围。残留含水量(moisture content)小于3%。
·通过冷冻干燥和喷雾干燥，稳定剂的组合物显示了出色的保存效果(范围60-100%)。
·在加工和冷藏时，冷冻干燥和喷雾干燥的产物显示了良好的稳定性(生存能力)。
· 快速重组。
本发明的详细说明
本发明包括冷冻干燥的轮状病毒活疫苗制剂，其包含大约2% w/v至大约20% w/v蔗糖和2% w/v至大约20% w/v甘氨酸。在上述范围之内，有用的亚组是大约3% w/v至大约10% w/v的蔗糖和大约3% w/v至大约10% w/v的甘氨酸。意外地，蔗糖与甘氨酸的这种有利的组合导致轮状病毒活疫苗的稳定性提高和生存能力改善。
按照本发明，有利的稳定剂组合物可以用于单价和多价制剂，其中多价制剂可以选自但不局限于：二价、三价、四价和五价制剂。
本发明使用的轮状病毒菌株可以选自但不局限于：血清型G1、G2、G3、G4、G8、G9、P1、P2和P3。
按照本发明的一个方面，疫苗制剂的二糖可以选自但不局限于：蔗糖，甘露糖醇，海藻糖，麦芽糖和乳糖。
本发明的另一个方面是疫苗制剂的氨基酸可以选自但不局限于：亮氨酸，异亮氨酸，组氨酸，甘氨酸，谷氨酰胺，精氨酸或丙氨酸。
另外，本发明的稳定剂组合物可以包括或省略额外的组分，例如蛋白质水解产物，人血清白蛋白和部分水解的凝胶。
公开在本说明书中的优选组分范围可以形成疫苗制剂，连同其它特性一起，显示出提高的生存能力和稳定性(与本领域已知的疫苗制剂相比)。在本说明书中举例说明的稳定剂组合物I-IV，可以引导普通技术人员制出基于同时存在蔗糖和甘氨酸(在本公开范围内)的其它疫苗制剂。换句话说，意在包括每个制剂的比例、浓度和存在其它组分的方面的变化。
各种稳定剂和最终疫苗制剂的范围基于w/v来提供。本领域普通技术人员可以意识到，可以使用不同体积的疫苗稳定剂，以便实践所主张的发明，这也需要改变稳定剂组分的浓度。作为本发明的例子(但绝非限制)，使用1:1.5的稳定剂∶病毒组合，以便制出最终的要加以冷冻干燥的疫苗。然而，技术人员可以选择不同比例的主要化学组分或使用具有改变的主要化学组分浓度的整体病毒制剂(bulk viral preparations)。
因此，本发明的实质集中于蔗糖和甘氨酸在冷冻干燥之前的疫苗制剂中的有利组合。尤其优选的制剂是使用稳定剂组合物I制备的。正如本节以及上述实施例所公开的那样，可以加入比例大约0.5:1至大约1:5的二糖(例如蔗糖)和氨基酸(例如甘氨酸)，以产生与整体病毒制剂(bulk viral preparations)组合的疫苗稳定剂，从而制出用于冷冻干燥的疫苗制剂，其导致上述的稳定性和生存能力。在上述范围内，使用的蔗糖与甘氨酸的比例可以是1:1。
制剂的冷冻干燥循环可以包括：a)在20至5℃之间的温度下进行产物加载；b)逐步冷冻，同时在每个温度下保持，其中冷冻可以在低于-32℃的条件下进行，优选-30℃至-45℃，冷冻速度为0.5至1℃/min；c)在-20℃炼韧（annealing）5小时，而后在-45℃冷冻1小时；d)在初始干燥期间的逐步升温可以包括在每个温度下充分地保持，导致在大约55μbar的压力下、在-32℃升华（sublimation）20小时；e)二次干燥可以包括：在55μbar的压力下、在25℃至30℃、以0.5至1℃/min的速率将产物加热6-10小时。冷冻干燥循环的全部时间可以是48小时。还意味着涉及按照管瓶说明和冻干器设计的温度和循环时间的变化。
轮状病毒的一个或多个菌株（需要针对其进行保护），可以在合适的培养基中培养，并使其生长至所需要的水平。收集的病毒液体培养基（broth）可以以合适的比例与稳定剂组合物混合，而后可以进行干燥过程。干燥可以用冷冻干燥器或喷雾干燥器进行。
实施例1
样品收集和病毒分离
从私人医务所获得腹泻幼儿的十个粪便样品。将粪便收集在无菌容器中，收集之后，在4℃保存6-10小时，或在-20℃长时间保存。对于用ELISA(使用得自于Generic Assay，Germany的轮状病毒抗原检测试剂盒)试验的A组轮状病毒，三个粪便样品是阳性的。试验所有三个样品，以分离在MA104(猴子肾脏)细胞上。三个当中的一个在MA104细胞单层上显示了明显的细胞病变效应，在-70℃冷冻，并在37℃解冻之后，将其采集。将采集的病毒在-70℃保存在10ml等分样品中。相同的病毒用于进一步感染MA104细胞(如果和当需要时)。将该分离物命名为SIIL-ROTA-02。该SIIL-ROTA-02分离物使用血清型特异引物用RT-PCR表征，并且称为G1血清型。
实施例2
将106.3克MEM粉末溶于9升（lit）注射用水中。将3克谷氨酰胺和15克碳酸氢钠溶于MEM溶液中。
使用MEM(MEM组合物，参考表1)培养轮状病毒菌株SIIL-ROTA-02(G1)。含有MEM的单一病毒库用于制备最终整体病毒制剂（final bulk）(参考表2，最终整体病毒制剂（final bulk）中的病毒组合物)。研究四个不同的稳定剂混合物(具有下面列出的加入浓度)。用大约10ml 0.1N HCl将培养基的pH值调节至6.0-8.5，更具体地说，调节至7.4。将稳定剂溶液以2-10 X浓度进行高压处理，或进行膜式过滤。将60份病毒与40份的各个稳定剂组合物结合。
为了冷冻干燥，将1 ml的最终病毒制剂（final bulk）填充在小玻璃管(4 ml)(USP 1型)中，每个病毒制剂（bulk）装入200个管瓶中，用于冷冻干燥。
表1：MEM组合物
组分 浓度
氯化钙(无水) 140 mg/l
硫酸镁(无水) 98 mg/l
氯化钾 400 mg/l
磷酸二氢钾(无水) 60 mg/l
氯化钠 8000 mg/l
磷酸氢二钠(无水) 48 mg/l
L-精氨酸HCl 126 mg/l
L-胱氨酸2HCl 31 mg/l
L-谷氨酰胺 292 mg/l
L-组氨酸.HCl.H20 42 mg/l
L-异亮氨酸 52 mg/l
L-亮氨酸 52 mg/l
L-赖氨酸.HCl 73 mg/l
L-甲硫氨酸 15 mg/l
L-苯丙氨酸 32 mg/l
L-苏氨酸 48 mg/l
L-色氨酸 10 mg/l
L-酪氨酸.2NA.2H2O 52 mg/l
L-缬氨酸 46 mg/l
氯化胆碱 1 mg/l
叶酸 1 mg/l
I-肌醇 2 mg/l
烟酰胺 1 mg/l
D-泛酸(半钙) 1 mg/l
吡哆醛.HCl 1 mg/l
核黄素 0.1 mg/l
硫胺素.HCl 1 mg/l
葡萄糖 1000 mg/l
酚红.NA 10 mg/l
NaHCO3(额外的) 0.75gm/l
谷氨酰胺(额外的) 350mg/l
HCL(1N) 1.25ml/l
表2：最终整体病毒制剂（final bulk）的病毒组合物
血清型 颗粒数 相应的滴度
血清型G1 8713560 6.9
实施例3
a)稳定剂混合物I
将25克蔗糖溶于100ml注射用水中。类似地，将25克甘氨酸溶于100ml注射用水中。利用存在的盐(0.88% NaCl)来帮助甘氨酸溶解。这些是5X溶液。该混合溶液产生2.5X的每个组分。使用0.2μm膜过滤2.5 X稳定剂溶液。
将60份收集的病毒与40份的各个稳定剂组合物结合。
b)最佳的冷冻干燥循环
“单价制剂所使用的冷冻干燥循环还可以用于多价制剂”
表3∶冷冻干燥循环
Figure 518749DEST_PATH_IMAGE001
c)图1结果∶冷冻干燥
Figure 435890DEST_PATH_IMAGE002
结果表明，在管瓶的底部获得均匀柱形饼块。最终饼块可以溶于枸橼酸钠缓冲液以及注射用水中。没有可溶性微营养素的迁移或沉积，表明均匀的升华。此外，残余水份是0.8%至1.4%，即低于3%，且重组时间小于30秒。观察到100%的病毒保存。
表4∶轮状病毒冷冻干燥疫苗的病毒滴度
病毒血清型 冷冻干燥之前的设定滴度(颗粒数目) 冷冻干燥之后的滴度(颗粒数目) 保存效果
Rota-G1 7.14(1.40 x107) 7.18(1.53 x107) 101 %
d)稳定性试验∶
表5∶单价轮状病毒疫苗在25℃(6个月)时的保存期限
Figure 215627DEST_PATH_IMAGE003
没有发现显著的损失；表明单价多价疫苗在25℃可以稳定高达6个月。
表6∶单价轮状病毒疫苗在37℃(15个月)的保存期限
Figure 548519DEST_PATH_IMAGE004
没有发现显著的损失；表明单价轮状病毒疫苗在37℃可以稳定高达15个月。
轮状病毒血清型基于单一VP7蛋白，其在决定病毒的稳定性方面的作用较小或没有作用，由此，用于单价疫苗的制剂还可以用于多价组合物。进一步的，饼块在柠檬酸盐缓冲液以及注射用水中的溶解性不受单或多菌株存在的影响。由此，上面说明的制剂可以用于任何单价以及多价轮状病毒疫苗。
实施例4
稳定剂混合物II和它的冷冻干燥循环说明
二糖：2-25% w/v(选自甘露糖醇、蔗糖、海藻糖中的一种或多种)
蛋白水解物(LAH)：1-20% w/v，
或者，使用5-100 mM浓度的氨基酸(选自亮氨酸、异亮氨酸、组氨酸、甘氨酸或丙氨酸中的一种或多种)替代蛋白水解物。将管瓶快速地冷却至-40至-50℃，保持2-8小时。无论何时需要结晶，将混合物在-20至-30℃充分地炼韧。将管瓶在低于共晶（eutectic）温度下、在小于300μbar的压力下初始干燥7至30小时。在25℃、在小于300μbar的压力下进行蒸发干燥2-12小时。
结果表明获得了不均匀的饼块。在上述制剂的整个冷冻干燥和填充过程中，观察到相当大的效能损失。%残余水份的接受标准是NMT 3%。然而，这种制剂的%水分是4%，由此不符合接受标准。由此，不再进一步研究这种制剂。
实施例5
稳定剂混合物III和它的冷冻干燥循环说明
人血清白蛋白：1-20% w/v
甘露糖醇：1-20% w/v
两种二糖(甘露糖醇和蔗糖)的等当量混合物可以用作单独甘露糖醇的替代品。
将管瓶快速地冷却至-30℃，并保持6小时。将冷冻进一步持续至-55℃，并保持5小时。在低于共晶温度条件下、在小于300μbar的压力下，将管瓶初始干燥7-25小时。在32℃、在小于175μbar的压力下，进行蒸发干燥4-8小时。
结果表明获得了不均匀的饼块。在上述制剂的整个冷冻干燥和填充过程中，观察到相当大的效能损失。%残余水份的接受标准是NMT 3%。然而，这种制剂的%残余水份是4%，由此不符合接受标准。由此，不再进一步研究这种制剂。
实施例6
稳定剂混合物IV和它的冷冻干燥循环说明
部分水解的凝胶：3-15% w/v
山梨糖醇：5-20% w/v
以0.2℃/min的冷冻速度将管瓶冷冻达到-45℃，并保持至少10小时。将管瓶在低于共晶温度下、在小于200μbar的压力下初始干燥30小时。在37℃、在小于100μbar的压力下，进行蒸发干燥4-10小时。
结果表明获得了不均匀的饼块。在上述制剂的整个冷冻干燥和填充过程中，观察到相当大的效能损失。%残余水份的接受标准是NMT 3%。然而，这种制剂的%残余水份是5%，由此不符合接受标准。由此，不再进一步研究这种制剂。
尽管冷冻干燥是干燥上述轮状病毒组合物的优选模式，但喷雾干燥和/或真空干燥也可以产生所需要的结果。
参考文献∶
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Claims (15)

1. 冷冻干燥的轮状病毒疫苗制剂，包括∶
a)大约1至大约1000×105pfu/mL的至少一个轮状病毒菌株；
b) 大约2至大约20%(w/v)的糖；
c) 大约2至大约20%(w/v)的至少一种氨基酸。
2. 按照权利要求1的组合物，其中所述轮状病毒在37℃储存15个月之后，保持其效能的大约100%。
3. 按照权利要求1的组合物，其中所述轮状病毒在25℃储存6个月之后，保持其效能的大约100%。
4. 按照权利要求1的组合物，其中所述轮状病毒在2至8℃储存6个月之后，保持其效能的大约100%。
5. 权利要求1的疫苗，其中以生物学有效浓度加入细胞培养基。
6. 权利要求5的疫苗，其中所述细胞培养基是最小必需培养基。
7. 按照权利要求1的制剂，其中所述至少一种糖选自一组蔗糖，甘露糖醇，海藻糖，麦芽糖，乳糖，山梨糖醇，葡萄糖和岩藻糖。
8. 按照权利要求1的制剂，其中所述至少一种氨基酸选自一组亮氨酸，异亮氨酸，组氨酸，甘氨酸，谷氨酰胺，精氨酸和丙氨酸。
9. 按照权利要求1的制剂，其中一旦与稀释剂进行重组，pH值在大约pH5.5至大约pH7.5之间。
10. 权利要求1的制剂，包括
a)大约5%(w/v)的蔗糖；
b)大约5%(w/v)的甘氨酸。
11. 制备按照权利要求1的稳定轮状病毒疫苗制剂的方法，包括∶
a)在额外含有谷氨酰胺和碳酸氢钠的MEM中培养轮状病毒；
b)制备稳定剂，该稳定剂含有大约0.5:1至大约1:5比例的蔗糖和甘氨酸；
c)将病毒和稳定剂以大约1.5:1的比例混合；
d)将稳定剂和病毒的混合物冷冻干燥大约30小时至60小时，产生疫苗的冷冻干燥形式，其残留含水量为大约0.8%至大约1.4%。
12. 权利要求11的制剂，其中蔗糖与甘氨酸的比例是1:1。
13. 权利要求11的方法，其中冷冻干燥是在搁板温度下进行的，并且包括∶
a)在25至-50℃之间的温度下加载产物；
b)逐步冷冻，同时在每个温度下保持，其中冷冻是在低于-32℃的条件下进行的，优选-30℃至-45℃，冷冻速度范围为大约0.5至5℃/min；
c)在大约-15℃至-25℃的温度范围内炼韧5小时，而后在-45℃冷冻1小时；
d)在初始干燥期间逐步升温，包括：在每个温度下充分保持，导致在-32℃、在大约55μbar的压力下进行升华大约10至30小时；
e)二次干燥包括：在25℃至30℃，在55μbar的压力下，以0.5至1℃/min的速率加热产物6-10小时。
14. 权利要求13的方法，其中冷冻干燥是在搁板温度下进行的，并且包括∶
a)在20至5℃之间的搁板温度下加载产物；
b) 逐步冷冻，同时在每个温度下保持，其中冷冻是在低于-32℃的条件下进行的，优选-30℃至-45℃，冷冻速度范围为大约0.5至1℃/min；
c)在-20℃的温度下炼韧5小时，而后在-45℃冷冻1小时；
d)在初始干燥期间逐步升温，包括：在每个温度下充分保持，导致在-32℃、在大约55μbar的压力下进行升华大约20小时；
e)二次干燥包括：在25℃至30℃，在55μbar的压力下，以0.5至1℃/min的速率加热产物6-10小时。
15. 权利要求13的方法，其中冷冻干燥循环时间范围是大约30至大约60小时，优选48小时。
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