CN100475268C - 重组腺病毒冻干制剂及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及重组腺病毒冻干制剂及制备方法。本发明公开的重组腺病毒冻干制剂是由体积比为重组腺病毒∶保护剂＝1∶(0.8-1.2)配制成的水溶液经冷冻干燥后获得的制剂，其中保护剂包含动物胶、糖、无机盐及pH为7.2-8.0氨基酸培养平衡盐。本发明解决了现有重组腺病毒制剂的稳定性问题，提供了一种安全、高效、稳定性好、有效期长的冷冻干燥重组腺病毒制剂。
Description
技术领域：
本发明属于生物制剂及制备领域，具体涉及重组腺病毒冻干制剂及制备方法。
背景技术：
随着基因治疗研究的逐渐深入，作为其基础的病毒载体研究有了突飞猛进的发展。采用病毒载体的基因转移技术治疗人类疾病不仅在进行实验室研究，而且已进入到临床试验阶段。腺病毒因其对人致病性小且不诱导癌变，宿主细胞广，繁殖滴度高，装载容量大，而成为近年来病毒载体研究热点。但是即便是含有稳定剂的液体重组腺病毒制剂对温度也较为敏感，给运输、保存带来较大困难，这在很大程度上限制了其在临床上的应用。到目前为止，尚未有能在4-8℃长期保存的冻干重组腺病毒制剂上市。
发明内容：
本发明所要解决的技术问题在于解决现有重组腺病毒制剂的稳定性，提供一种安全、高效、稳定性好、有效期长的冷冻干燥重组腺病毒制剂。
本发明公开的重组腺病毒冻干制剂是由体积比为重组腺病毒∶保护剂＝1∶(0.8-1.2)配制成的水溶液经冷冻干燥后获得的制剂，其中保护剂包含动物胶、糖、无机盐及pH为7.2-8.0氨基酸培养平衡盐。
本发明重组腺病毒是指基因工程改造的腺病毒。
本发明所述的动物胶选自明胶、骨胶或皮胶等；
所述的糖选自蔗糖、甘露醇、海藻糖、乳糖、麦芽糖中的一种或多种；
所述的无机盐选自氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钙、氯化镁中的一种或多种；
所述的氨基酸培养基平衡盐选自市售的基础氨基酸培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium，简称D-MEM)平衡盐。
本发明冻干制剂保护剂中采用的动物胶及糖可起到支架作用，若添加海藻糖可提高活病毒制剂的热稳定性：采用的无机盐为调节制剂的pH值及等渗点，以满足生理适应性要求及药物安全、稳定、有效的要求；采用的pH值为7.2-8.0的氨基酸培养基平衡盐为助溶剂，以增加腺病毒的溶解度，增强稳定性。
在本发明保护剂中还可添加其他成份：助溶剂如尿素、味精等；抗氧增效剂如L-半胱氨酸等；以进一步提高制剂的稳定性。
本发明保护剂各组份优选的最终重量体积(w/v)浓度为动物胶0.5-2.0％，糖1.5～21.5％，无机盐0.1～12％，氨基酸培养平衡盐0.5～2％。
本发明保护剂优选的配方组成为(w/v)蔗糖1.5-5.5％，甘露醇4.5-10.5％，明胶0.5-2.0％，L-半胱氨酸0.03-0.15％，海藻糖1.5-5.5％，氯化钾0.1-0.3％，磷酸二氢钾0.1-0.3％，PH值为7.2-8.0的基础氨基酸培养基(D-MEM)平衡盐0.5～2％，氯化钠3.5～8.5％，磷酸氢二钠1.2～2.9％，尿素0.4～1.2％，味精0.4～1.2％，其余为电阻率＝1 8.2MΩ/cm的纯水。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述重组腺病毒冻干制剂的制备方法。
本发明公开的重组腺病毒冻干制剂的制备包括下列步骤：
按上述保护剂配方，称取各组份，加入纯水至规定体积充分溶解，备用；再将重组腺病毒按内含腺病毒量1.0×1012颗粒数/ml的浓度以1∶(0.8-1.2)加入到上述保护剂的溶液中，灌装，将制剂放入冷冻干燥箱，预冻至-30℃--40℃，保持3-5小时，抽真空，升华，再干燥，使制剂温度由0℃-35℃，即制成冷冻干燥重组腺病毒制剂。
用本发明配方及方法制备获得的重组腺病毒冻干制剂，经感染性滴度检测试验证明，制剂保持了重组腺病毒原有活性；并经30个月的稳定性试验证明稳定性良好。与现有技术相比，本发明工艺合理，安全性和稳定性好，有效期长，为采用重组腺病毒作为载体的基因治疗的临床实验提供良好的应用前景。
附图说明：
图1 4-8℃条件下冻干制剂和液体制剂的稳定性对比曲线
具体实施方式：
实施例1
将含有冻干保护剂的的重组腺病毒制剂，按内含腺病毒量0.5×1012颗粒数/ml的浓度分装，1ml/瓶，一部分加塞压盖4℃保存作为制剂冻干前感染性滴度检测用，另一部分制剂加丁基胶并塞加至1/3处，再进行冷冻干燥。3个不同批号含有冻干保护剂的重组腺病毒制剂经冷冻干燥后，感染性滴度检测证明：按本发明方法制成的冻干重组腺病毒制剂，制剂冷冻干燥后感染性滴度比冷冻干燥前仅下降在0.03-0.05logTCID50/ml之间。(表1)
表1：重组腺病毒制剂冻干前后感染性滴度测定
实施例2
同一批号的，含有蔗糖、甘露醇、明胶、L-半胱氨酸、海藻糖、氯化钾、磷酸二氢钾、基础氨基酸培养基(Dulbecco’s ModifiedEagle Medium，简称D-MEM)平衡盐的重组腺病毒冻干制剂和未经冻干的液体对照制剂，存放在同一个4-8℃冰箱内，定期随机取样测定制剂感染性滴度，结果证明：按本发明方法制成的冻干重组腺病毒制剂，具有良好的稳定性，在4-8℃条件下存放30个月，制剂感染性滴度下降在0.5logTCID50/ml以内，而未经冷冻干燥的液体对照制剂在4-8℃存放30个月感染性滴度明显下降，达到3logTCID50/ml。本结果证明：未经冷冻干燥的液体对照制剂在4-8℃条件下存放30个月的感染性滴度与冻干制剂存放30个月的感染性滴度下降幅度相差甚远。(表2，图1)
表2：冻干重组腺病毒制剂4-8℃保存感染性滴度测定
实施例3：
将含有蔗糖、甘露醇、明胶、L-半胱氨酸、海藻糖、氯化钾、磷酸二氢钾的冻干保护剂和基础氨基酸培养基(Dulbecco’s ModifiedEagle Medium，简称D-MEM)平衡盐的重组腺病毒制剂和不含有蔗糖、甘露醇、明胶、L-半胱氨酸、海藻糖、氯化钾、磷酸二氢钾的冻干保护剂和基础氨基酸培养基(Dulbecco’s Modified EagleMedium，简称D-MEM)平衡盐溶液，用PBS稀释的重组腺病毒制剂，在同一真空冷冻干燥条件下进行冷冻干燥，然后随机取样测定制剂感染性滴度。结果证明未加保护剂的制剂经冷冻干燥后，病毒活性基本丧失。(表3)
表3：冻干保护剂对重组腺病毒冻干制剂感染性滴度的影响
实施例4
保护剂配方：蔗糖1.5g，甘露醇5g，明胶1.6g，L-半胱氨酸0.08g，海藻糖1.5g，氯化钾0.2g，磷酸二氢钾0.2g，PH值为7.2-8.0的基础氨基酸培养基(D-MEM)平衡盐2g(购自GIBCO公司)，氯化钠8.0g，磷酸氢二钠2.9g，尿素1.2g，味精0.5g
制备：
按配方将各组分混合，加纯水至100ml，再将重组腺病毒按内含腺病毒量1.0×1012颗粒数/ml的浓度以1∶0.8加入到上述保护剂中，混合均匀进行灌装，采用真空冷冻干燥法，将制剂放入冷冻干燥箱，预冻至-38℃，保持4小时，抽真空，升华，再干燥，使制剂温度由0℃-35℃，即制成冷冻干燥重组腺病毒制剂。
实施例5
保护剂配方：蔗糖5.5 g，甘露醇10 g，明胶1.2 g，L-半胱氨酸0.03 g，海藻糖5.5 g，氯化钾0.3 g，磷酸二氢钾0.1 g，PH值为7.2-8.0的基础氨基酸培养基(D-MEM)平衡盐0.5 g(购自GIBCO公司)，氯化钠4.0 g，磷酸氢二钠1.3 g，尿素0.8 g，味精0.8 g
制备：
按配方将各组分混合，加纯水至100ml，再将重组腺病毒按内含腺病毒量1.0×1012颗粒数/ml的浓度以1∶0.9加入到上述保护剂中，混合均匀进行灌装，采用真空冷冻干燥法，将制剂放入冷冻干燥箱，预冻至-30℃，保持3小时，抽真空，升华，再干燥，使制剂温度由0℃-35℃，即制成冷冻干燥重组腺病毒制剂。
实施例6
保护剂配方配方：蔗糖4.0g，甘露醇7.5g，明胶0.8g，L-半胱氨酸0.15g，海藻糖4.0g，氯化钾0.1g，磷酸二氢钾0.3g，PH值为7.2-8.0的基础氨基酸培养基(D-MEM)平衡盐1g(购自GIBCO公司) ，氯化钠6.0g，磷酸氢二钠2.0g，尿素0.5g，味精1.2g
制备：
按配方将各组分混合，加纯水至100ml，再将重组腺病毒按内含腺病毒量1.0×1012颗粒数/ml的浓度以1∶1.1加入到上述保护剂中，混合均匀进行灌装，采用真空冷冻干燥法，将制剂放入冷冻干燥箱，预冻至-35℃，保持3.5小时，抽真空，升华，再干燥，使制剂温度由0℃-35℃，即制成冷冻干燥重组腺病毒制剂。
实施例7
保护剂配方：乳糖1.5g，甘露醇5g，明胶1.6g，海藻糖5.5g，磷酸二氢钾0.2g，PH值为7.2-8.0的基础氨基酸培养基(D-MEM)平衡盐2g(购自GIBCO公司)，氯化钠8.0g，磷酸氢二钠2.9g
制备：
按配方将各组分混合，加纯水至100ml，再将重组腺病毒按内含腺病毒量1.0×1012颗粒数/ml的浓度以1∶1.2加入到上述保护剂中，混合均匀进行灌装，采用真空冷冻干燥法，将制剂放入冷冻干燥箱，预冻至-37℃，保持3.5小时，抽真空，升华，再干燥，使制剂温度由0℃-35℃，即制成冷冻干燥重组腺病毒制剂。
实施例8
配方：麦芽糖1.5g，蔗糖5g，明胶1.2g，L-半胱氨酸0.08g，海藻糖1.5g，氯化钾0.2g，磷酸二氢钾0.2g，PH值为7.2-8.0的基础氨基酸培养基(D-MEM)平衡盐2g(购自GIBCO公司)，氯化钠8.0g，尿素1.2g
制备：
按配方将各组分混合，加纯水至100ml，再将重组腺病毒按内含腺病毒量1.0×1012颗粒数/ml的浓度以1∶1.0加入到上述保护剂中，混合均匀进行灌装，采用真空冷冻干燥法，将制剂放入冷冻干燥箱，预冻至-36℃，保持5小时，抽真空，升华，再干燥，使制剂温度由0℃-35℃，即制成冷冻干燥重组腺病毒制剂。
实施例9
配方：蔗糖1.5g，皮胶1.6g，海藻糖1.5g，氯化钾0.2g，磷酸二氢钾0.2g，PH值为7.2-8.0的基础氨基酸培养基(D-MEM)平衡盐2g(购自GIBCO公司)，氯化钠8.0g
制备：
按配方将各组分混合，加纯水至100ml，再将重组腺病毒按内含腺病毒量1.0×1012颗粒数/ml的浓度以1∶1.1加入到上述保护剂中，混合均匀进行灌装，采用真空冷冻干燥法，将制剂放入冷冻干燥箱，预冻至-39℃，保持4小时，抽真空，升华，再干燥，使制剂温度由0℃-35℃，即制成冷冻干燥重组腺病毒制剂。
Claims (7)
1.重组腺病毒冻干制剂，其特征在于该制剂是由颗粒浓度为1.0×1012颗粒数/ml的重组腺病毒和保护剂以体积比为1∶(0.8-1.2)配制成的水溶液经冷冻干燥后获得的制剂，其中保护剂包含动物胶、糖、无机盐及pH为7.2-8.0的基础氨基酸培养基平衡盐。
2.根据权利要求1所述的重组腺病毒冻干制剂，其特征在于其中所述的保护剂所含各组分的最终重量体积浓度为动物胶0.5-2.0％，糖1.5～21.5％，无机盐0.1～12％，基础氨基酸培养基平衡盐0.5～2％。
3.根据权利要求1或2所述的重组腺病毒冻干制剂，其特征在于其中所述的动物胶选自明胶、骨胶或皮胶。
4.根据权利要求1或2所述的重组腺病毒冻干制剂，其特征在于其中所述的糖选自蔗糖、甘露醇、海藻糖、乳糖、麦芽糖中的一种或多种。
5.根据权利要求1或2所述的重组腺病毒冻干制剂，其特征在于其中所述的无机盐选自氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钙、氯化镁中的一种或多种。
6.根据权利要求1或2所述的重组腺病毒冻干制剂，其特征在于其中所述保护剂的重量体积百分组成为蔗糖1.5-5.5％，甘露醇4.5-10.5％，明胶0.5-2.0％，L-半胱氨酸0.03-0.15％，海藻糖1.5-5.5％，氯化钾0.1-0.3％，磷酸二氢钾0.1-0.3％，pH值为7.2-8.0的基础氨基酸培养基平衡盐溶液0.5～2％，氯化钠3.5～8.5％，磷酸氢二钠1.2～2.9％，尿素0.4～1.2％，味精0.4～1.2％，其余为电阻率＝18.2MΩ/cm的纯水。
7.根据权利要求1所述的重组腺病毒冻干制剂的制备方法，其特征在于该制剂的制备包括下列步骤：
按保护剂配方，称取各组分，加入纯水至规定体积充分溶解，备用；再将重组腺病毒按内含腺病毒量1.0×1012颗粒数/ml的浓度以1∶(0.8-1.2)加入到上述保护剂的溶液中，灌装，将制剂放入冷冻干燥箱，预冻至-30℃--40℃，保持3-5小时，抽真空，升华，再干燥，使制剂温度由0℃-35℃，即制成冷冻干燥重组腺病毒制剂。
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