CN105636610A - 室温稳定的疫苗的干燥制剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了包含活的减毒病毒、糖稳定剂和氨基酸稳定剂的室温稳定的疫苗的干燥制剂。本发明还公开了此类疫苗的制造和通过施用此类疫苗保护动物的方法。

Description

室温稳定的疫苗的干燥制剂

相关申请的交叉引用

本申请根据35 U.S.C. § 119(e)要求2013年9月27日提交的临时申请美国序列号61/883,611的优先权，其内容在此处以其整体通过引用并入。

发明领域

本发明涉及包含一种或多种活的减毒病毒的疫苗的室温稳定的干燥制剂。本发明还涉及此类疫苗的干燥制剂的制造和用所述疫苗接种动物受试者的方法。

背景

当在室温下储存长时间段时，活的减毒病毒是不稳定的。因此，大多数活的减毒病毒疫苗在使用前冷冻干燥和冷藏。然而，此类疫苗的运输和储存导致必须传递至疫苗诊所、兽医、家畜操作者/农民且最终传递至宠物所有者或消费者的显著额外费用。此类费用可证明在贫困社区和第三世界国家中是禁止性的。因此，对于人BCG疫苗，WHO需要在37℃下28天之后的>20%的最小存活率[参见例如，Jin等人, Vaccine 29:4848-4852 (2011)]。

存在大量可以感染伴侣动物(诸如狗、猫和马)或家畜(诸如家禽、牛和猪)的病毒。例如，虽然由于相应的病毒感染的症状例如可以包括轻度感冒样症状，但其它可以是快速致命的，如犬瘟热病毒(CDV)感染的情况[参见例如US2010/0196420]。事实上，CDV触发可以涉及眼、呼吸道、胃肠道、皮肤和神经系统的多系统感染。来自犬细小病毒(CPV)的死亡率也相对高[参见例如US2009/0010955]。CPV主要是肠病原体，其感染犬，尤其是幼犬，并且特征在于在超过4至5周龄的犬和幼犬中的急性腹泻、发热和白细胞减少症。甚至更年幼的犬可患有心肌疾病。犬瘟热病毒和犬细小病毒是需要保护幼犬/犬不受其害的两种最重要的犬病毒。

其它犬病毒包括：犬副流感(CPI)病毒，其是引起促成上呼吸道疾病和传染性气管支气管炎传染的呼吸系统疾病的高度传染性病毒；导致传染性肝炎的犬1型腺病毒(CAV1)；和高度传染性且可以引起严重类型的呼吸系统疾病的犬流感病毒(CIV)。已报道，CIV能够引起100%感染，伴随80%发病率，和在严重感染中高达5-8%的死亡率[Crawford等人，Science 310 (5747)：482-485 (2005)；U.S. 7,959,929 B2]。类似地，存在困扰猫的许多猫病毒，包括猫杯状病毒(FCV)、猫白血病病毒(FeLV)、猫泛白细胞减少症病毒(FPLV)、猫冠状病毒(FCoV)和猫鼻气管炎(FVR)病毒。

还存在大量可以感染牛的病毒。此类病毒包括牛病毒性腹泻病毒1型和2型(BVDV1和BVDV2)、感染性牛鼻气管炎(IBR)病毒、副流感3型(PI3)、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)和牛呼吸道冠状病毒(BRCV)。此外，存在许多也可以感染牛的细菌，包括多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica)、睡眠嗜组织菌(Histophilus somni)和牛支原体(Mycoplasma bovis)。

类似地，存在大量可以感染家禽的病毒。此类病毒包括感染性支气管炎病毒(IBV)、感染性法氏囊病病毒(IBDV)、鸡新城疫病毒(NDV)、感染性喉气管炎(ILTV)、马立克氏病病毒(MDV)、火鸡疱疹病毒(HVT)(其也被称为MDV3)和禽类偏肺病毒(aMPV)。此外，存在许多也可以感染家禽的细菌，包括多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、沙门氏菌属(Salmonella ssp.)、大肠杆菌、支原体属(Mycoplasma ssp.)、paragallinararum禽杆菌(Avibacterium paragallinararum)、丹毒菌属(Erysipelas ssp.)、弯曲杆菌属(Campylobacter ssp.)、弧菌属(Vibrio ssp.)、产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridiumperfringens)和寄生虫诸如艾美球虫。

而且，存在许多可以感染猪的病毒。此类病毒包括猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRS)、猪圆环病毒(PCV)、传染性胃肠炎病毒(TGE)、猪伪狂犬病病毒(PPRV)、猪细小病毒(PPV)、猪流感病毒(SIV)、猪轮状病毒(PRV)和猪流行性腹泻病毒(PED)。此外，存在许多也可以感染猪的细菌，包括多种血清型的多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、沙门氏菌属(Salmonella ssp.)、多种菌毛(pillus)类型的大肠杆菌、副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis)、胞内劳森氏菌(Lawsonia intracellularis)、支原体属(Mycoplasma ssp.)、支气管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)、丹毒菌属(Erysipelas ssp.)、弯曲杆菌属(Campylobacter ssp.)、胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumonia)、产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridium perfringens)和艰难梭状芽孢杆菌(Clostridiumdifficile)。

目前广泛接受的是，预防由于动物中的病毒感染的疾病的最佳方法是针对这些病毒接种该动物。仅作为一个实例，在狗中，犬瘟热病毒疫苗已显著降低相应疾病的流行率。类似地，传染性犬肝炎已被犬腺病毒-2疫苗(CAV2)极大限制。在疫苗中使用活的减毒CAV2代替紧密相关的CAV1消除了关于以下的担忧，即在已用活的减毒CAV1接种的犬中观察到的间质性肾炎和角膜混浊[Taguchi等人，Can Vet J. 52(9)：983–986(2011)]。此外，可以安全地施用多价活的减毒病毒疫苗，其限制需要的疫苗注射次数。因此，存在几种商购可得的多价活的减毒犬病毒疫苗，其防御犬瘟热、传染性犬肝炎、犬细小病毒和犬副流感病毒。此外，更新的多价疫苗还进一步防御犬流感病毒。然而，仍然非常需要可以在室温下运输和储存的减毒活病毒疫苗，诸如犬病毒疫苗。

本文任何参考文献的引用不应解释为承认此参考文献可用作本申请的“现有技术”。

发明概述

为了克服现有疫苗的缺陷，本发明提供可以在室温下运输和/或储存的活的减毒疫苗(例如病毒疫苗)的新型稳定的干燥制剂，以及其相应的免疫原性组合物。这些干燥制剂在27℃下持续长时间诸如12个月、18个月或甚至更长(例如，1.5至3年)保持有效。

在某些实施方案中，活的减毒疫苗是禽类疫苗。在这种类型的具体实施方案中，活的减毒禽类疫苗是包含活的减毒家禽病毒的家禽疫苗。在这种类型的更具体实施方案中，活的减毒家禽疫苗是包含活的减毒鸡病毒的鸡疫苗。在这种类型的替代实施方案中，活的减毒家禽疫苗是包含活的减毒火鸡病毒的火鸡疫苗。

在某些实施方案中，活的减毒疫苗是哺乳动物疫苗。在这种类型的具体实施方案中，活的减毒哺乳动物疫苗是包含活的减毒人病毒的人疫苗。在其它此类实施方案中，活的减毒哺乳动物疫苗是包含活的减毒牛病毒的牛疫苗。在还有其它实施方案中，活的减毒哺乳动物疫苗是包含活的减毒猪病毒的猪疫苗。

在还有其它实施方案中，活的减毒哺乳动物疫苗是伴侣动物疫苗。在这种类型的具体实施方案中，活的减毒伴侣动物疫苗是犬疫苗。在这种类型的其它实施方案中，活的减毒伴侣动物疫苗是猫疫苗。在还有其它实施方案中，活的减毒伴侣动物疫苗是马疫苗。因此，在具体实施方案中，活的减毒犬疫苗包含活的减毒犬病毒。在其它实施方案中，活的减毒猫疫苗包含活的减毒猫病毒。在还有其它实施方案中，活的减毒马疫苗包含活的减毒马病毒。

在其它实施方案中，活的减毒疫苗包含重组病毒。在这种类型的具体实施方案中，重组病毒被用作编码异源蛋白的重组载体。在这种类型的更具体实施方案中，异源蛋白是病毒或细菌抗原。本发明进一步提供制备本发明的稳定的干燥制剂的方法。本发明进一步提供将本发明的疫苗在使用前在27℃下作为稳定的干燥制剂储存长时间诸如12个月或更长(例如，1.5至3年)的方法。

本发明还提供向动物施用本发明的稳定的干燥制剂的方法。在具体实施方案中，稳定的干燥制剂在施用前重构为液体疫苗。本发明进一步提供通过施用本发明的干燥制剂(例如，以粉末的形式)和/或重构的液体疫苗而预防动物(即，人、伴侣动物或家畜动物)中的疾病的方法。在具体实施方案中，伴侣动物是犬。在相关实施方案中，伴侣动物是猫。在还有其它实施方案中，伴侣动物是马。在还有其它实施方案中，家畜动物是牛。在还有其它实施方案中，家畜动物是猪。在还有其它实施方案中，家畜动物是鸡。在还有其它实施方案中，家畜动物是火鸡。

因此，本发明提供室温稳定的疫苗的干燥制剂，其包含活的减毒病毒。在具体实施方案中，疫苗的干燥制剂包含糖稳定剂。在这种类型的相关实施方案中，所述疫苗包含15%至80% (w/w)糖稳定剂。在具体实施方案中，所述疫苗的干燥制剂包含30％至80% (w/w)糖稳定剂。在其它具体实施方案中，所述疫苗包含40%至80% (w/w)糖稳定剂。在某些实施方案中，所述疫苗包含25%至50% (w/w)糖稳定剂。在相关实施方案中，所述疫苗包含30%至70%(w/w)糖稳定剂。在甚至更具体实施方案中，所述疫苗包含40%至60% (w/w)糖稳定剂。

在某些实施方案中，所述糖稳定剂是非还原性寡糖。在这种类型的具体实施方案中，所述非还原性寡糖是蔗糖。在还有其它实施方案中，所述非还原性寡糖是海藻糖。在还有其它实施方案中，所述非还原性寡糖是棉子糖。在其它实施方案中，所述糖稳定剂是糖醇。在这种类型的具体实施方案中，所述糖醇是山梨糖醇。在其它实施方案中，所述糖醇是木糖醇。在还有其它实施方案中，所述糖醇是麦芽糖醇。

在替代实施方案中，所述糖稳定剂实际上是两种或更多种糖稳定剂的组合。在这种类型的具体实施方案中，所述糖稳定剂是蔗糖和山梨糖醇的组合。在某些实施方案中，所述糖稳定剂是蔗糖和海藻糖的组合。在还有其它实施方案中，所述糖稳定剂是海藻糖和山梨醇的组合。在还有其它实施方案中，所述糖稳定剂是蔗糖、海藻糖和山梨糖醇的组合。

本发明的疫苗的室温稳定的干燥制剂可以进一步包含一种或多种填充稳定剂（bulking stablizer）。在具体实施方案中，所述疫苗中的填充稳定剂的量在疫苗的液体形式中为1％至6% (w/v)，且在干燥制剂中为2％至25% (w/w)。在某些实施方案中，所述填充稳定剂是甘露糖醇。在相关实施方案中，所述填充稳定剂是甘氨酸。在具体实施方案中，所述填充稳定剂是葡聚糖。在某些实施方案中，所述填充稳定剂是麦芽糖糊精。在具体实施方案中，所述填充稳定剂是右旋糖。在其它实施方案中，所述填充稳定剂是聚乙烯吡咯烷酮。在还有其它实施方案中，所述填充稳定剂是羟乙基淀粉。在还有其它实施方案中，所述疫苗包含填充稳定剂的组合。在某些实施方案中，所述填充稳定剂包含以下中的两种或更多种：葡聚糖、甘露糖醇、甘氨酸、麦芽糖糊精、聚乙烯吡咯烷酮和羟乙基淀粉。在这种类型的具体实施方案中，所述填充稳定剂包含甘露糖醇和甘氨酸。在相关实施方案中，所述填充稳定剂包含葡聚糖和甘氨酸。在这种类型的还有其它实施方案中，所述填充稳定剂包含甘露糖醇、葡聚糖和甘氨酸。

在具体实施方案中，所述蛋白稳定剂是明胶。在其它实施方案中，所述蛋白稳定剂是全酪蛋白的水解产物。在具体实施方案中，所述全酪蛋白的水解产物是全酪蛋白的蛋白水解水解产物。在还有其它实施方案中，所述蛋白稳定剂是明胶和全酪蛋白的蛋白水解水解产物两者的组合。

本发明的疫苗的室温稳定的干燥制剂pH范围可以为pH 5.5至pH 8.5。在具体实施方案中，pH范围为pH 6.0至pH 8.0。在某些实施方案中，pH范围为pH 6.5至pH 7.8。在具体实施方案中，pH范围为pH 6.8至pH 7.5。在其它实施方案中，pH范围为pH 6.0至pH 7.6。在还有其它实施方案中，pH范围为pH 6.0至pH 6.8。在还有其它具体实施方案中，pH范围为pH7.0至pH 7.4。在更具体实施方案中，pH为7.2。在其它更具体实施方案中，pH为6.5。

本发明的疫苗的室温稳定的干燥制剂可以包含缓冲剂。在这种类型的具体实施方案中，所述缓冲剂包含0.1%至2% (w/w)组氨酸(干燥前为2.5至50 mM)。在相关实施方案中，所述缓冲剂包含0.2%至1% (w/w)组氨酸。在具体实施方案中，所述缓冲剂包含0.25%至0.75% (w/w)组氨酸。在更具体实施方案中，所述缓冲剂包含0.5% (w/w)组氨酸。

在其它实施方案中，所述缓冲剂包含0.1%至2% (w/w)磷酸盐(或磷酸钠、磷酸钾或两者的混合物；在干燥前为2.5至50 mM)。在相关实施方案中，所述缓冲剂包含0.2%至1%(w/w)磷酸盐。在具体实施方案中，所述缓冲剂包含0.25%至0.75% (w/w)磷酸盐。在更具体实施方案中，所述缓冲剂包含0.5% (w/w)磷酸盐。

在还有其它实施方案中，所述缓冲剂可以包含2.5至50 mM Tris。在具体实施方案中，所述缓冲剂包含2.5至50 mM Tris和2.5至50 mM组氨酸。在更具体实施方案中，所述缓冲剂包含5至20 mM Tris和5至20 mM组氨酸。在又更具体实施方案中，所述缓冲剂包含7.5至15 mM Tris和7.5至15 mM组氨酸。

本发明的疫苗的室温稳定的干燥制剂也可以包含氨基酸稳定剂。在具体实施方案中，所述氨基酸稳定剂是精氨酸。在还有其它实施方案中，所述氨基酸稳定剂是谷氨酸。在还有其它实施方案中，所述氨基酸稳定剂是天冬氨酸。在还有其它实施方案中，所述氨基酸稳定剂是赖氨酸。在相关实施方案中，本发明的疫苗的室温稳定的干燥制剂包含两种或更多种氨基酸稳定剂。在这种类型的具体实施方案中，所述氨基酸稳定剂是精氨酸和谷氨酸盐。

在某些实施方案中，所述疫苗中的氨基酸稳定剂的浓度在液体制剂中为0.1-0.4M[在干燥制剂中为10%-40% (w/w)]。在具体实施方案中，所述疫苗中的氨基酸稳定剂的浓度在液体制剂中为0.25-0.35 M。在更具体实施方案中，所述疫苗中的氨基酸稳定剂的浓度在液体制剂中为0.25-0.35 M。在甚至更具体实施方案中，所述氨基酸稳定剂在液体制剂中为0.3 M精氨酸。

本发明的疫苗的室温稳定的干燥制剂也可以包含蛋白稳定剂。所述蛋白稳定剂可以是完整蛋白和/或蛋白水解产物。在具体实施方案中，所述稳定剂蛋白是明胶。在替代实施方案中，所述蛋白稳定剂是全酪蛋白的水解产物。在某些实施方案中，所述全酪蛋白的水解产物是全酪蛋白的蛋白水解水解产物。在具体实施方案中，所述干燥制剂包含2%至20%(w/w)的蛋白稳定剂。在其它具体实施方案中，所述蛋白稳定剂包含1%至10% (w/w)明胶。在还有其它具体实施方案中，所述蛋白稳定剂包含1%至10% (w/w)的全酪蛋白的水解产物。

本发明的疫苗的干燥制剂也可以包含蛋白稳定剂，所述蛋白稳定剂包括明胶和全酪蛋白的水解产物两者。在这种类型的具体实施方案中，所述蛋白稳定剂包含1%至10% (w/w)明胶和1%至10% (w/w)的全酪蛋白的水解产物。在更具体实施方案中，所述蛋白稳定剂包含2%至5% (w/w)明胶和2%至6% (w/w)的全酪蛋白的水解产物。在其它具体实施方案中，所述蛋白稳定剂包含0.4%至3.0% (w/w)明胶和0.5%至3.0% (w/w)的全酪蛋白的水解产物。在具体实施方案中，所述蛋白稳定剂包含2.3% (w/w)明胶和2.8% (w/w)的全酪蛋白的水解产物。在其它具体实施方案中，所述蛋白稳定剂包含3.3% (w/w)明胶和4.2% (w/w)的全酪蛋白的水解产物。

本发明的任何干燥制剂都可以进一步包含0.02%至1% (w/w)的二价阳离子的盐。在具体实施方案中，所述二价阳离子在液体形式中为1 mM - 5 mM，且在干燥制剂中为0.1%-0.5% (w/w)。在某些实施方案中，所述二价阳离子是镁(Mg⁺⁺)。在其它实施方案中，所述二价阳离子是钙(Ca⁺⁺)。在还有其它实施方案中，所述二价阳离子是锌(Zn⁺⁺)。在还有其它实施方案中，所述二价阳离子是Mg⁺⁺和/或Ca⁺⁺和/或Zn⁺⁺的混合物。

本发明的疫苗的任何室温稳定的干燥制剂可以进一步包含一种或多种渗压剂。在具体实施方案中，所述渗压剂是依克多因。在其它具体实施方案中，所述渗压剂是羟基依克多因。在还有其它实施方案中，所述渗压剂是依克多因和羟基依克多因的组合。在具体实施方案中，所述制剂中的渗压剂的百分数为0.2%至7.5% (w/w)。在更具体实施方案中，所述制剂中的渗压剂的百分数为0.5%至5% (w/w)。在还有更具体实施方案中，所述制剂中的渗压剂的百分数为1%至3% (w/w)。

本发明的疫苗的室温稳定的干燥制剂可以包含活的减毒病毒。在本发明的一个方面，所述活的减毒病毒是犬病毒。在相关实施方案中，所述活的减毒病毒是猫病毒。在另一个实施方案中，所述活的减毒病毒是马病毒。

在本发明的又另一个方面，所述活的减毒病毒是家畜动物病毒，例如，食用动物病毒。在一个此类实施方案中，所述活的减毒病毒是家禽病毒。在这种类型的具体实施方案中，所述家禽病毒是鸡病毒。在这种类型的其它实施方案中，所述家禽病毒是火鸡病毒。在其它此类实施方案中，所述活的减毒病毒是牛病毒。在还有其它实施方案中，所述活的减毒病毒是猪病毒。

在某些实施方案中，所述活的减毒病毒是犬瘟热病毒(CDV)。在其它实施方案中，所述活的减毒病毒是腺病毒。在还有其它实施方案中，所述活的减毒病毒是细小病毒。在还有其它实施方案中，所述活的减毒病毒是副流感病毒(CPI)。在还有其它实施方案中，所述活的减毒病毒是流感病毒。

在本发明的又另一个方面，所述活的减毒病毒是犬病毒。在某些实施方案中，所述活的减毒犬病毒是犬瘟热病毒(CDV)。在其它实施方案中，所述活的减毒犬病毒是犬腺病毒2型(CAV2)。在还有其它实施方案中，所述活的减毒犬病毒是犬细小病毒(CPV)。在这种类型的一个具体实施方案中，所述犬细小病毒是犬细小病毒2 (CPV-2)。在这种类型的另一个具体实施方案中，所述犬细小病毒是犬细小病毒2a (CPV-2a)。在这种类型的又另一个具体实施方案中，所述犬细小病毒是犬细小病毒2b (CPV-2b)。在这种类型的又另一个具体实施方案中，所述犬细小病毒是犬细小病毒2c (CPV-2c)。在这种类型的具体实施方案中，所述CPV-2c为ATCC登记号PTA-13492。在又另一个实施方案中，所述犬细小病毒是已被构建为包含异源CPV-2c/CPV-2基因组的重组犬细小病毒，即，编码衣壳蛋白的区域来自CPV-2c分离株且编码非结构蛋白的区域来自CPV-2分离株[参见，U.S. 2012/0328652 A1，其内容在此以其整体通过引用并入，其中编码CPV-2基因组中的衣壳蛋白的核苷酸序列已被替换为编码CPV-2c的衣壳蛋白的核苷酸序列，由此产生异源CPV-2c/CPV-2基因组]。在还有其它实施方案中，所述活的减毒犬病毒是犬副流感病毒(CPI)。

本发明还包括重组病毒载体。在具体实施方案中，所述重组病毒载体是重组副流感病毒载体。在某些实施方案中，所述重组副流感病毒载体是重组犬副流感病毒载体。在具体实施方案中，所述重组副流感病毒(例如，重组犬副流感病毒载体)编码和表达异源蛋白。在这种类型的某些实施方案中，所述异源蛋白是非犬抗原。在更具体实施方案中，所述非犬抗原是家禽病毒或家禽细菌抗原。在其它实施方案中，所述非犬抗原是猪病毒或猪细菌抗原。在还有其它实施方案中，所述非犬抗原是牛病毒或牛细菌抗原。在还有其它实施方案中，所述非犬抗原是猫病毒或猫细菌抗原。在某些实施方案中，所述重组副流感病毒是重组副流感病毒5。

在还有其它实施方案中，所述活的减毒犬病毒是犬冠状病毒。在还有其它实施方案中，所述活的减毒犬病毒是犬肺病毒。在还有其它实施方案中，所述活的减毒犬病毒是传染性犬肝炎病毒。在还有其它实施方案中，所述活的减毒犬病毒是犬疱疹病毒。在还有其它实施方案中，所述活的减毒犬病毒是狂犬病病毒。在还有其它实施方案中，所述活的减毒犬病毒是犬微小病毒(minute virus)。在还有其它实施方案中，所述活的减毒犬病毒是犬流感病毒。在可选的实施方案中，所述活的减毒犬病毒是伪狂犬病病毒。

本发明的疫苗的室温稳定的干燥制剂可以包含活的减毒猫病毒。在某些实施方案中，所述活的减毒猫病毒是猫疱疹病毒(FHV)。在其它实施方案中，所述活的减毒猫病毒是猫杯状病毒(FCV)。在还有其它实施方案中，所述活的减毒猫病毒是猫肺病毒(FPN)。在还有其它实施方案中，所述活的减毒猫病毒是猫细小病毒(FPV)。在还有其它实施方案中，所述活的减毒猫病毒是猫白血病病毒(FeLV)。在还有其它实施方案中，所述活的减毒猫病毒是猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)。在还有其它实施方案中，所述活的减毒猫病毒是猫免疫缺陷病毒(FIV)。在还有其它实施方案中，所述活的减毒猫病毒是博尔纳病病毒(BDV)。在还有其它实施方案中，所述活的减毒猫病毒是猫流感病毒。在还有其它实施方案中，所述活的减毒猫病毒是猫泛白细胞减少症病毒(FPLV)。在还有其它实施方案中，所述活的减毒猫病毒是猫冠状病毒(FCoV)。在还有其它实施方案中，所述活的减毒猫病毒是猫鼻气管炎病毒(FVR)。

此外，本发明提供作为多价疫苗的疫苗的室温稳定的干燥制剂。在具体实施方案中，本发明的多价疫苗仅包含活的减毒病毒疫苗。此类多价疫苗可以含有活的减毒病毒的任何组合。在这种类型的具体实施方案中，所述多价疫苗包含活的减毒犬瘟热病毒和活的减毒犬细小病毒。在相关实施方案中，所述多价疫苗包含活的减毒犬瘟热病毒和活的减毒犬腺病毒2型。在其它实施方案中，所述多价疫苗包含活的减毒犬瘟热病毒和活的减毒犬副流感病毒。在还有其它实施方案中，所述多价疫苗包含活的减毒犬瘟热病毒、活的减毒犬细小病毒和活的减毒犬副流感病毒。在还有其它实施方案中，所述多价疫苗包含活的减毒犬瘟热病毒、活的减毒犬细小病毒和活的减毒犬腺病毒2型。在还有其它实施方案中，所述多价疫苗包含活的减毒犬瘟热病毒、活的减毒犬副流感病毒和活的减毒犬腺病毒2型。在还有其它实施方案中，所述多价疫苗包含活的减毒犬瘟热病毒、活的减毒犬细小病毒、活的减毒犬副流感病毒和活的减毒犬腺病毒2型。

在具体实施方案中，所述多价疫苗包含活的减毒犬瘟热病毒、活的减毒犬细小病毒、活的减毒犬副流感病毒、活的减毒犬腺病毒2型和活的减毒犬冠状病毒。在相关实施方案中，所述多价疫苗包含活的减毒犬瘟热病毒、活的减毒犬细小病毒、活的减毒犬副流感病毒、活的减毒犬腺病毒2型和活的减毒猫冠状病毒。在这种类型的具体实施方案中，所述多价疫苗包含活的减毒犬瘟热病毒、活的减毒犬腺病毒2型、活的减毒犬细小病毒、活的减毒犬副流感病毒和活的减毒犬流感病毒。

在其它实施方案中，本发明提供多价疫苗的室温稳定的干燥制剂，其包含活的减毒腺病毒2型和活的减毒犬副流感病毒。在还有其它实施方案中，所述多价疫苗包含活的减毒犬腺病毒2型和活的减毒犬细小病毒。在还有其它实施方案中，所述多价疫苗包含活的减毒犬细小病毒和活的减毒犬副流感病毒。在还有其它实施方案中，所述多价疫苗包含活的减毒犬腺病毒2型、活的减毒犬细小病毒和活的减毒犬副流感病毒。在这种类型的具体实施方案中，所述多价疫苗包含活的减毒犬腺病毒2型、活的减毒犬细小病毒、活的减毒犬副流感病毒和活的减毒犬流感病毒。

在其它实施方案中，本发明提供多价疫苗的室温稳定的干燥制剂，其包含活的减毒犬腺病毒2型和活的减毒犬副流感病毒。在还有其它实施方案中，所述多价疫苗包含活的减毒犬腺病毒2型和活的减毒犬细小病毒。在还有其它实施方案中，所述多价疫苗包含活的减毒犬细小病毒和活的减毒犬副流感病毒。在还有其它实施方案中，所述多价疫苗包含活的减毒犬腺病毒2型、活的减毒犬细小病毒和活的减毒犬副流感病毒。在这种类型的具体实施方案中，所述多价疫苗包含活的减毒犬腺病毒2型、活的减毒犬细小病毒、活的减毒犬副流感病毒和活的减毒犬流感病毒。

在任何前述实施方案中，所述活的减毒犬病毒可以是重组病毒载体。在具体实施方案中，所述重组病毒载体是重组犬副流感病毒载体。在这种类型的具体实施方案中，所述重组犬副流感病毒载体编码和表达异源抗原。在其它具体实施方案中，包含犬细小病毒(CPV)的多价疫苗的干燥制剂可以进一步包含0.5%至5% (w/w)山梨糖醇。

在具体实施方案中，本发明的疫苗的干燥制剂中的活的减毒病毒的(或多价疫苗中的各病毒的)滴度为1 X 10³至1 X 10¹⁰。在更具体实施方案中，所述滴度为1 X 10⁴至1 X10⁹。在还有更具体实施方案中，所述滴度为5 X 10⁴至1 X 10⁸。

因此，本发明提供疫苗的干燥制剂，其包含活的减毒病毒(例如，犬病毒、或猫病毒、或马病毒、或猪病毒、或牛病毒、或家禽病毒)、30%至80% (w/w)的非还原性寡糖、6%至40% (w/w)的氨基酸稳定剂、2%至20% (w/w)的蛋白稳定剂和具有6.0至8.0的pH的缓冲剂。在具体实施方案中，所述干燥制剂在27℃下持续至少18个月保持有效。在相关实施方案中，所述干燥制剂进一步包含2%至25% (w/w)的填充稳定剂。在这种类型的具体实施方案中，所述填充稳定剂与所述非还原性寡糖和/或糖醇的比率为0.025至0.60。在更具体实施方案中，所述填充稳定剂与所述非还原性寡糖和/或糖醇的比率为0.05至0.40。在还有更具体实施方案中，所述填充稳定剂与所述非还原性寡糖和/或糖醇的比率为0.075至0.30。在甚至更具体实施方案中，所述填充稳定剂与所述非还原性寡糖和/或糖醇的比率为0.1至0.25。

在具体实施方案中，本发明的疫苗的干燥制剂的非还原性寡糖包含蔗糖和/或海藻糖，和/或棉子糖。在这种类型的某些实施方案中，所述干燥制剂的pH为6.0至7.6。在本发明的具体实施方案中，所述填充稳定剂是甘露糖醇。在相关实施方案中，所述氨基酸稳定剂是精氨酸。在这种类型的某些实施方案中，所述氨基酸稳定剂进一步包含谷氨酸盐。

在具体实施方案中，本发明的疫苗的干燥制剂包含20%至80% (w/w)蔗糖和18%至66% (w/w)海藻糖的组合作为非还原性寡糖，5%至20% (w/w)甘露糖醇作为填充稳定剂，9%至34% (w/w)氨基酸稳定剂，2%至5% (w/w)明胶和2%至6% (w/w)的全酪蛋白的蛋白水解水解产物的组合作为蛋白稳定剂，和pH 6.2至7.5的缓冲剂。在这种类型的具体实施方案中，所述填充稳定剂与所述非还原性寡糖的比率为0.08至0.37。

在更具体实施方案中，所述非还原性寡糖是45%至60% (w/w)蔗糖和15%至25% (w/w)海藻糖的组合，所述填充稳定剂是5%至17% (w/w)甘露糖醇，所述氨基酸稳定剂是10%至25% (w/w)精氨酸；所述蛋白稳定剂包含1.5%至3.5% (w/w)明胶和2%至4% (w/w)的全酪蛋白的蛋白水解水解产物，和pH 6.2至7.5的缓冲剂。在这种类型的具体实施方案中，所述填充稳定剂与所述非还原性寡糖的比率为0.1至0.3。

在某些实施方案中，本发明的犬疫苗的干燥制剂包含活的减毒犬瘟热病毒(CDV)、犬腺病毒2型(CAV2)和犬副流感病毒(CPI)；15%至80% (w/w)蔗糖和15%至80% (w/w)海藻糖的组合作为非还原性寡糖，其中蔗糖和海藻糖的组合量为30%至80% (w/w)；2%至25% (w/w)甘露糖醇作为填充稳定剂，其中总填充稳定剂与总非还原性寡糖的比率为0.05至0.4；所述蛋白稳定剂为1%至10% (w/w)明胶与1%至10% (w/w)的全酪蛋白的蛋白水解水解产物的组合；6%至40% (w/w)精氨酸作为氨基酸稳定剂；和pH 6.2至7.5的缓冲剂。在这种类型的具体实施方案中，所述干燥制剂进一步包含以下中的一种或多种或所有：(i) 0.5%至5.0%依克多因，(ii) 5%至15%谷氨酸盐，(iii) 0.02%至1% MgSO₄，和(iv) 活的减毒犬细小病毒(CPV)与2%至5%山梨糖醇。在更具体实施方案中，所述缓冲剂是0.1%至2%磷酸钾或磷酸钠，pH 6.2至7.5。

在更具体实施方案中，本发明的犬疫苗的干燥制剂包含活的减毒CDV、CAV2和CPI；20%至80% (w/w)蔗糖和18%至66% (w/w)海藻糖的组合作为非还原性寡糖，其中蔗糖和海藻糖的组合量为45%至79% (w/w)；5%至17% (w/w)甘露糖醇作为填充稳定剂，其中总填充稳定剂与总非还原性寡糖的比率为0.08至0.37；所述蛋白稳定剂为2%至5% (w/w)明胶与2%至6%(w/w)的全酪蛋白的蛋白水解水解产物的组合；所述氨基酸稳定剂为9%至34% (w/w)精氨酸；和pH 6.5至7.2的缓冲剂。

在这种类型的具体实施方案中，所述干燥制剂进一步包含以下中的一种或多种或所有：(i) 1%至3%依克多因，(ii) 7%至12%谷氨酸盐，(iii) 0.05%至0.5% MgSO₄，和(iv)活的减毒CPV与3%至4%山梨糖醇。在具体实施方案中，所述缓冲剂是0.2%至1%磷酸钾或磷酸钠，pH 6.5至7.2。在这些类型的某些实施方案中，所述疫苗的干燥制剂在27℃下持续至少18个月保持有效。

在一个替代方面，本发明提供疫苗的干燥制剂，其包含活的减毒细小病毒，例如，犬细小病毒(CPV)，10%至80% (w/w)的糖醇，10%至70% (w/w)的填充稳定剂，4%至50% (w/w)的蛋白稳定剂，和具有6.8至8.0的pH的缓冲剂。在这种类型的具体实施方案中，所述干燥制剂进一步包含10%至50% (w/w)的氨基酸稳定剂。在某些实施方案中，所述疫苗的干燥制剂在27℃下持续至少18个月保持有效。

在更具体实施方案中，本发明提供疫苗的干燥制剂，其包含活的减毒细小病毒，例如，CPV，23%至49% (w/w)的糖醇，16%至50% (w/w)的填充稳定剂，7%至36% (w/w)的蛋白稳定剂，和具有7.0至7.4的pH的缓冲剂。在这种类型的甚至更具体实施方案中，所述干燥制剂进一步包含25%至36% (w/w)的氨基酸稳定剂。在某些实施方案中，所述疫苗的干燥制剂在27℃下持续至少18个月保持有效。

这些单价细小病毒疫苗(例如，单价CPV疫苗)的干燥制剂的糖醇，可以是山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、麦芽糖醇及其组合，所述填充稳定剂可以是葡聚糖、麦芽糖糊精、聚乙烯吡咯烷酮、羟乙基淀粉、甘氨酸或其任何组合。所述蛋白稳定剂可以是明胶、全酪蛋白的水解产物或两者的组合。在这种类型的某些实施方案中，所述全酪蛋白的水解产物是全酪蛋白的蛋白水解水解产物。在具体实施方案中，所述糖醇是山梨糖醇，所述填充稳定剂是葡聚糖和甘氨酸的组合，且所述蛋白稳定剂是明胶与全酪蛋白的蛋白水解水解产物的组合。

在更具体实施方案中，本发明提供疫苗的干燥制剂，其包含活的减毒细小病毒，例如，CPV，10%至80% (w/w)的山梨糖醇作为糖醇，5%至30% (w/w)的甘氨酸和5%至40% (w/w)的葡聚糖的组合作为填充稳定剂，2%至25% (w/w)明胶与2%至25% (w/w)的全酪蛋白的蛋白水解水解产物的组合作为蛋白稳定剂；和具有6.5至7.8的pH的缓冲剂。在这种类型的某些实施方案中，包括10%至50% (w/w)精氨酸作为氨基酸稳定剂。在具体实施方案中，所述缓冲剂是0.2%至5% (w/w)磷酸钾或磷酸钠，pH 6.5至7.8。在某些实施方案中，所述疫苗的干燥制剂在27℃下持续至少18个月保持有效。

在甚至更具体实施方案中，本发明提供疫苗的干燥制剂，其包含活的减毒细小病毒，例如，CPV，23%至49% (w/w)的山梨糖醇作为糖醇，8%至17% (w/w)的甘氨酸和8%至33%(w/w)的葡聚糖的组合作为填充稳定剂，3%至18% (w/w)明胶与4%至18% (w/w)的全酪蛋白的蛋白水解水解产物的组合作为蛋白稳定剂；和具有7.0至7.4的pH的缓冲剂。在这种类型的某些实施方案中，包括25%至36% (w/w)精氨酸作为氨基酸稳定剂。在具体实施方案中，所述缓冲剂是0.5%至2% (w/w)磷酸钾或磷酸钠，pH 7.0至7.4。在某些实施方案中，所述疫苗的干燥制剂在27℃下持续至少18个月保持有效。

在具体实施方案中，所述犬细小病毒(CPV)是犬细小病毒2 (CPV-2)。在这种类型的另一个具体实施方案中，所述犬细小病毒是犬细小病毒2a (CPV-2a)。在这种类型的又另一个具体实施方案中，所述犬细小病毒是犬细小病毒2b (CPV-2b)。在这种类型的又另一个具体实施方案中，所述犬细小病毒是犬细小病毒2c (CPV-2c)。在这种类型的具体实施方案中，所述CPV-2c为ATCC登记号PTA-13492。在又另一个实施方案中，所述犬细小病毒是已被构建为包含异源CPV-2c/CPV-2基因组的重组犬细小病毒，即，编码衣壳蛋白的区域来自CPV-2c分离株且编码非结构蛋白的区域来自CPV-2分离株[参见，U.S. 2012/0328652 A1，其内容在此以其整体通过引用并入，其中编码CPV-2基因组中的衣壳蛋白的核苷酸序列已被替换为编码CPV-2c的衣壳蛋白的核苷酸序列，由此产生异源CPV-2c/CPV-2基因组]。

作为用于制备本发明的活的减毒疫苗的稳定干燥制剂的方法的一部分，相应的液体疫苗制剂可以应用于膜，和/或冷冻为珠粒，和/或冷冻至容器诸如小瓶中，和/或喷雾干燥，和/或喷雾冷冻干燥，和/或诱导以起泡，和/或置于延迟释放植入物中。

本发明进一步提供帮助保护动物(例如，猫或犬)预防临床疾病的方法，所述临床疾病起因于感染(例如，通过猫或犬病毒)，所述方法包括将本发明的重构疫苗施用于动物。在某些实施方案中，所述施用经粘膜进行。在其它实施方案中，所述施用肠胃外进行。在还有其它实施方案中，所述施用皮内进行。在还有其它实施方案中，所述施用经皮进行。在更具体的实施方案中，本发明的疫苗皮下施用于动物。在其它具体实施方案中，本发明的疫苗肌内施用于动物。本发明还包括初始和/或加强疫苗的使用。

在某些实施方案中，治疗有效量的活的减毒病毒是治疗有效量的活的减毒犬病毒。在这种类型的具体实施方案中，治疗有效量的活的减毒犬病毒包括治疗有效量的活的减毒犬瘟热病毒，和/或活的减毒犬腺病毒2型，和/或活的减毒犬细小病毒，和/或活的减毒犬副流感病毒。

在具体实施方案中，动物受试者是犬，且该方法包括向犬施用包含活的减毒病毒的本发明的重构的室温稳定的疫苗。在具体实施方案中，室温稳定的疫苗包含活的减毒犬瘟热病毒、活的减毒犬腺病毒2型和活的减毒犬副流感病毒。在这种类型的某些实施方案中，室温稳定的疫苗包含活的减毒犬瘟热病毒、活的减毒犬腺病毒2型、活的减毒犬副流感病毒、和活的减毒犬流感病毒或活的减毒犬细小病毒或者可替代地，活的减毒犬流感病毒和活的减毒犬细小病毒两者。

因此，本发明进一步提供由如本文提供的任何一种或多种干燥制剂和药学上可接受的载体构成的重构疫苗。在具体实施方案中，本发明提供由三价CDV、CAV2和CPI疫苗的干燥制剂与单价CPV疫苗的单独干燥制剂的组合以及药学上可接受的载体构成的多价疫苗。

还提供制备和/或在室温下(例如，22-27℃)储存任何和所有本发明的疫苗的室温稳定的干燥制剂的方法。在某些实施方案中，所述方法包括通过组合治疗有效量的活的减毒猫或犬病毒与8%至30% (w/v)的非还原性寡糖、0.1M至0.5 M的氨基酸稳定剂、0.9%至10%(w/v)的蛋白稳定剂和具有6.0至8.0的pH的缓冲剂而制备疫苗制剂。通常接下来，但不总是，将所述疫苗制剂冷冻，然后在真空下干燥，以制备室温稳定的干燥制剂。冷冻干燥机内部的温度可以在该过程中上升以加速去除水分。优选地，所述疫苗的干燥制剂当在27℃下储存时持续至少18个月保持有效。

在这种类型的具体实施方案中，所述疫苗制剂进一步包含1%至6% (w/w)的填充稳定剂。在这种类型的更具体实施方案中，所述填充稳定剂与所述非还原性寡糖的比率为0.05至0.40。在某些实施方案中，还包括0.5%至5% (w/v)山梨糖醇。在具体实施方案中，所述填充稳定剂是甘露糖醇。在某些实施方案中，所述氨基酸稳定剂是精氨酸。在其它中，所述氨基酸稳定剂是谷氨酸盐。在还有其它实施方案中，所述氨基酸稳定剂是精氨酸和谷氨酸盐的组合。

制备任何和所有本发明的疫苗的室温稳定的干燥制剂的方法可以包括，在干燥前，将所述液体疫苗制剂应用于膜，和/或将其冷冻为珠粒，和/或将其在小瓶中冷冻，和/或喷雾干燥，和/或喷雾冷冻干燥，和/或将其诱导以起泡。

在制备室温稳定的疫苗的方法的具体实施方案中，所述方法包括组合治疗有效量的活的减毒病毒与所述非还原性寡糖，所述非还原性寡糖是5%至18% (w/v)的蔗糖和5%至18% (w/v)海藻糖、2%至4% (w/v)的填充稳定剂、0.1M至0.3M的氨基酸稳定剂和1.5%至6%(w/v)的蛋白稳定剂的组合。在更具体实施方案中，所述填充稳定剂与所述非还原性寡糖的比率为0.08至0.37。在某些实施方案中，所述活的减毒病毒是活的减毒犬病毒。在相关实施方案中，所述活的减毒病毒是活的减毒猫病毒。

本发明的这些及其它方面通过参考以下详述将得到更好理解。

发明详述

本发明提供安全和有效的活的减毒病毒疫苗和/或免疫原性组合物，其可以在室温下被储存为干燥制剂，且持续12或18、或甚至24个月或更长仍然保持安全和有效。因此，本发明的疫苗的室温稳定的干燥制剂的一个主要优点是它们不需要储存冰箱或冷冻机。这显著降低储存的费用，特别是在偏远地区，此外，不需要猜测所述疫苗在已经制造储存冰箱或冷冻机之后是否保持安全和有效。

此外，令人惊讶地，本发明的活病毒疫苗的室温稳定的干燥制剂可以包括任何类型的活的减毒病毒。因此，本发明的活疫苗的室温稳定的干燥制剂可以包括有包膜和无包膜病毒两者。此外，本发明的活疫苗的室温稳定的干燥制剂可以包括具有单链RNA基因组、单链DNA基因组或双链DNA基因组的活的减毒病毒。在本发明的一个方面，本发明的活的病毒疫苗包括活的减毒犬和/或猫病毒。本发明进一步提供作为多价疫苗的室温稳定的疫苗。此外，本发明的室温稳定的疫苗可以进一步包含灭活的病毒和/或灭活的细菌(例如，菌苗)和/或菌苗的亚级分，和/或病毒或者细菌的亚单位(例如，蛋白抗原)。

此外，本发明的室温稳定的活病毒制剂可以包含重组载体，诸如重组病毒载体(包括重组杆状病毒)，其为单独的和/或连同其它此类重组病毒载体、和/或连同活的减毒病毒和/或与灭活的细菌和/或灭活的病毒(例如，灭活的犬病毒)组合。此类重组病毒载体可以进一步编码一种或多种异源病毒或细菌抗原。此类重组载体的具体实例是重组副流感病毒，例如犬副流感病毒。一种重组副流感病毒载体是重组副流感病毒5，其近来已由Li等人描述 [J. of Virology 87(10) 5985-5993 (2013); 在此以其整体通过并入]。此类重组病毒载体，例如，重组副流感病毒5或重组犬副流感病毒载体，可以编码来自犬病毒、和/或猫病毒、和/或马病毒、和/或人病毒、和/或猿病毒、和/或牛病毒、和/或绵羊病毒、和/或猪病毒、和/或家禽病毒(例如鸡病毒)的异源抗原。在具体实施方案中，本发明的疫苗的室温稳定的干燥制剂包含重组副流感病毒(例如，重组副流感病毒5或重组犬副流感病毒)，其编码来自一种或多种感染鸡的鸡病毒和/或细菌的一种或多种抗原。

在本发明的替代实施方案中，本发明的疫苗的室温稳定的干燥制剂可以包含感染牛的活的减毒牛病毒和/或细菌。在具体实施方案中，所述室温稳定的疫苗包含活的减毒BVDV1、活的减毒BVDV2和活的减毒IBR病毒。在其它实施方案中，所述室温稳定的疫苗包含活的减毒BVDV1、活的减毒BVDV2、活的减毒PI3病毒和活的减毒BRSV。在还有其它实施方案中，所述室温稳定的疫苗包含活的减毒BVDV1、活的减毒BVDV2、活的减毒PI3病毒、活的减毒IBR病毒和活的减毒BRSV。在还有其它实施方案中，所述室温稳定的疫苗包含活的减毒BVDV1、活的减毒BVDV2、活的减毒PI3病毒、活的减毒IBR病毒、活的减毒BRSV和活的减毒BRCV。本发明的任何室温稳定的疫苗也可以在施用前与一种或多种减毒或灭活的细菌抗原诸如多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、溶血性曼氏杆菌(Mannheimiahaemolytica)、睡眠嗜组织菌(Histophilus somni)和牛支原体(Mycoplasma bovis)组合。一个此类实施方案是室温稳定的疫苗，其包含活的减毒BVDV1、活的减毒BVDV2、活的减毒PI3病毒、活的减毒IBR病毒和活的减毒BRSV(有或无活的减毒BRCV)与活的减毒多杀性巴氏杆菌、活的减毒溶血性曼氏杆菌和活的减毒睡眠嗜组织菌。在具体实施方案中，本发明提供包括向牛施用本发明的室温稳定的疫苗的方法，所述本发明的室温稳定的疫苗包含活的减毒牛病毒。

本发明的疫苗的室温稳定的干燥制剂或者可以包含感染家禽的活的减毒家禽病毒和/或细菌。在某些实施方案中，所述活的减毒家禽病毒是感染性支气管炎病毒(IBV)。在其它实施方案中，所述活的减毒家禽病毒是感染性法氏囊病病毒(IBDV)。在其它实施方案中，所述活的减毒家禽病毒是新城疫病毒(NDV)。在还有其它实施方案中，所述活的减毒家禽病毒是感染性喉气管炎病毒(ILTV)。在还有其它实施方案中，所述活的减毒家禽病毒是禽偏肺病毒(aMPV)。在还有其它实施方案中，所述活的减毒家禽病毒是马立克氏病病毒(MDV)。在还有其它实施方案中，所述活的家禽病毒是火鸡疱疹病毒(HVT)。[HVT在鸡中不致病。]

所述活的家禽病毒也可以是重组载体。这对于HVT和两种其它MDV(即，MDV1和MDV2)尤其如此。编码来自新城疫病毒或感染性喉气管炎的抗原的重组HVT载体已经是商售的。最近，已经描述了编码来自NDV和ILTV两者或来自NDV和IBDV两者的抗原的两种独特的重组HVT载体 [分别参见，U.S. 2013/0101619 A1和WO2013057235 A1，其两者的内容在此以其整体通过引用并入]。本发明的室温稳定的疫苗可以包含任何如本文所述单独或任意组合的这些重组家禽病毒载体。而且，包含一种或多种活的家禽病毒疫苗的本发明的任何室温稳定的疫苗可以进一步包含灭活的病毒和/或灭活的细菌和/或菌苗的亚级分，或者甚至减毒或不减毒的寄生虫诸如活的艾美球虫。在具体实施方案中，本发明提供包括向家禽(例如，鸡)施用本发明的室温稳定的疫苗的方法，所述本发明的室温稳定的疫苗包含活的减毒家禽病毒。

在又另一个方面，本发明的疫苗的室温稳定的干燥制剂可以包含活的减毒猪病毒。在某些实施方案中，所述活的减毒猪病毒是传染性胃肠炎病毒(TGE)。在其它实施方案中，所述活的减毒猪病毒是猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRS)。在其它实施方案中，所述活的减毒猪病毒是猪流行性腹泻病毒(PED)。在还有其它实施方案中，所述活的减毒猪病毒是猪流感病毒(SIV)。在还有其它实施方案中，所述活的减毒猪病毒是猪轮状病毒(PRV)。在还有其它实施方案中，所述活的减毒猪病毒是猪细小病毒(PPV)。在还有其它实施方案中，所述活的减毒猪病毒是猪伪狂犬病病毒(PPRV)。在还有其它实施方案中，所述活的减毒猪病毒是猪圆环病毒(PCV)。

本发明的多价疫苗可以含有猪病毒的任何组合。在某些实施方案中，本发明的多价疫苗包含灭活的猪病毒和活的减毒猪病毒两者。在这种类型的具体实施方案中，所述多价疫苗包含灭活的猪流感病毒SIV、灭活的或亚单位猪圆环病毒(PCV)[其包括杆状病毒表达的PCV抗原，参见，US 8,008,001，其内容在此通过引入]，连同活的减毒传染性胃肠炎病毒(TGE)和活的减毒猪细小病毒(PPV)。在相关实施方案中，所述多价疫苗包含灭活的猪圆环病毒抗原(PCV)，多种血清型的灭活的猪流感病毒(SIV)，和灭活的，连同活的减毒传染性胃肠炎病毒(TGE)，和活的减毒猪轮状病毒(PRV)。在具体实施方案中，本发明提供包括向猪施用本发明的室温稳定的疫苗的方法，所述本发明的室温稳定的疫苗包含活的减毒猪病毒。在相关实施方案中，所述多价疫苗包含活的减毒的和/或灭活的和/或亚单位猪圆环病毒抗原(PCV)，活的减毒的和/或灭活的和/或亚单位猪生殖呼吸综合征病毒(PRRS)抗原，和/或活的减毒的和/或灭活的或亚单位猪流行性腹泻病毒(PED)抗原。

本发明的室温稳定的活的减毒猪病毒疫苗可以进一步包含灭活的病毒和/或灭活的细菌(例如，菌苗)和/或菌苗的亚级分。在这种类型的具体实施方案中，所述多价疫苗包含产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)灭活的类毒素，从来自任何以下血清型的大肠杆菌细菌提取的菌毛抗原：K99、K88、987P或F41，连同活的减毒传染性胃肠炎病毒(TGE)和活的减毒猪细小病毒(PPV)。在相关实施方案中，所述多价猪疫苗包含灭活的或亚单位猪圆环病毒抗原(PCV)、灭活的猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumonia，M. hyo)、灭活的或活的减毒胞内劳森氏菌(Lawsonia intracellularis)菌苗，连同活的减毒和/或灭活的猪生殖呼吸综合征病毒(PRRS)和/或活的减毒或灭活的猪流行性腹泻(PED)病毒。

本发明的疫苗的室温稳定的干燥制剂包括至少一种糖稳定剂、至少一种蛋白稳定剂和至少一种缓冲剂以便将疫苗的液体形式维持在pH 5.5至8.5的pH。也可以添加至少一种填充稳定剂。本发明的室温稳定的疫苗因此储存为干燥制剂。此类干燥制剂可以通过包括以下的方法来制备：在珠粒例如诸如已知为通过前述方法[参见例如，WO 2010/125084；US 2012/0049412 A1；和US 2014/0017318，其所有内容在此以其整体通过引用并入]产生的冻干球(lyospheres)和/或球状体(sphereons)的球体中或作为块饼(例如，在小瓶中)冷冻干燥，或者在固体基质上(例如在膜或滤膜上)干燥，或者可替代地，如作为粉末干燥，或喷雾干燥，或喷雾冷冻干燥，或诱导以起泡。

所述单价或多价疫苗的活性免疫原性组分可以包含一种或多种病毒和/或细菌。因此，本发明的室温稳定的疫苗可以被冷冻干燥(或以其它方式液体体积减少)用于储存，然后在施用前或施用时，重构在液体载体中，例如，用药学上可接受的载体诸如疫苗级水或其它稀释剂。在具体实施方案中，所述稀释剂包含一种或多种其它病毒和/或细菌抗原。或者，本发明的室温稳定的疫苗可以作为固体注射，例如，当固体是粉末且注射器是无针粉末注射器(诸如PowderJect^®)时。

为了方便起见在说明书中使用单数术语绝非期望是如此限制性的。因此，例如，除非另有说明，提及“糖稳定剂”包括提及此类糖稳定剂中的一种或多种。除非另有说明，复数术语的使用也不期望是限制性的。

类似地，除非另有说明，当在本文中指示为任一时，可以被称为酸或其相应碱的化学化合物意指该化合物的任一形式。因此，术语谷氨酸的使用意欲包括谷氨酸盐，并且反之亦然。

如本文所使用，“疫苗”是适合于应用于动物(在某些实施方案中，包括人)的组合物，在施用于动物后，所述组合物诱导免疫应答，其强度足以最低限度地帮助防御起因于由野生型微生物感染的临床疾病，即强度足以帮助预防临床疾病，和/或预防、改善或治愈临床疾病。除非另有明确说明，术语疫苗的使用包括多价疫苗。

如本文所使用，“有效的”疫苗对于给定抗原保留足够滴度以符合该抗原对于施用所述疫苗的管辖的法规要求，例如，美国的动物疫苗的施用由美国农业部(USDA)管理。

如本文所使用，“多价疫苗”是包含两种或更多种不同抗原的疫苗。在这种类型的具体实施方案中，所述多价疫苗刺激受体的免疫系统预防两种或更多种不同病原体。

如本文所使用，疫苗的“室温稳定的”干燥制剂是当储存于27℃时，持续至少一年保持有效的疫苗的干燥制剂(包括多价疫苗)。在具体实施方案中，疫苗的室温稳定的干燥制剂当储存于27℃至少1.5年时保持有效。在更具体的实施方案中，疫苗的室温稳定的干燥制剂当储存于27℃至少2年时保持有效。在仍更具体的实施方案中，疫苗的室温稳定的干燥制剂当储存于27℃至少2.5至3年时保持有效。

如本文所使用，疫苗的“干燥制剂”通过去除已经在溶液中配制的疫苗的液体来制备。液体的去除可以通过例如蒸发，诸如通过将液体疫苗应用于固体基材和蒸发液体和/或通过升华诸如通过冻干(冷冻干燥)来实现。本发明的疫苗作为通常具有0.5%至10.0% (w/w)残留水分含量(RMC)的干燥制剂来储存。所述干燥制剂可以在施用前在药学上可接受的载体中重构。在具体实施方案中，本发明的疫苗作为包含0.5%至5% (w/w)残留水分含量的干燥制剂来储存。在更具体实施方案中，本发明的疫苗作为包含0.5%至3% (w/w)残留水分含量的干燥制剂来储存。

因为本发明的疫苗作为干燥制剂储存，本发明的“疫苗”也指作为干燥制剂储存的包含一种或多种抗原的制剂。如上所述，在施用前一段时间，这些干燥制剂可以与药学上可接受的载体组合。用于多价疫苗的抗原可以储存于相同的干燥制剂或分开的干燥制剂中。因此对于某些多价疫苗，将单独疫苗抗原作为单一干燥制剂分开储存，然后在施用前与药学上可接受的载体一起组合以形成多价疫苗。或者，多种疫苗抗原可以组合且作为单一干燥制剂储存，然后在施用前可以与药学上可接受的载体和已经储存于一种或多种分开的干燥制剂中的一种或多种其它疫苗抗原一起混合。

如本文所用，术语“载体”指与化合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。

如本文所使用，术语“药学上可接受的”作为形容词使用，以意指被修饰的名词适合于用于药物产品中。当其例如用于描述药物疫苗中的赋形剂时，其将赋形剂表征为与组合物的其它成分相容，并且不对预期受体不利地有害，例如药学上可接受的载体。药学上可接受的载体可以是无菌液体，诸如水和/或油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。水或水溶液盐水溶液，和右旋糖和甘油的水溶液可以用作载体，特别是用于可注射溶液。在具体实施方案中，所述药学上可接受的载体是佐剂和/或含有佐剂。在某些实施方案中，药学上可接受的载体可以进一步包含一种或多种疫苗抗原，所述疫苗抗原在施用前，可以与本发明的疫苗的干燥制剂组合。

如本文所使用，“佐剂”是这样的物质，其能够有利于或放大免疫学事件级联，最终导致更好的免疫应答，即针对抗原的整合的身体应答。佐剂通常不是免疫应答发生所需的，但有利于或放大该应答。

如本文所使用，术语“保护”("protect", "protecting")、“提供保护”("provideprotection to", "providing protection to")和“帮助防御”("aids in theprotection")不要求免于任何感染指征的完全保护。例如，“帮助防御”可以意指保护是足够的，使得在攻击之后，潜在感染的症状至少被减少，和/或引起症状的潜在细胞、生理学或生物化学原因或机制中的一种或多种被减少和/或被消除。如本文所使用，应当理解“减少的”意指相对于感染状态，包括感染的分子状态，而不只是感染的生理学状态。

如本文所使用，术语“治疗有效量”是给定抗原(例如活的减毒病毒)的量，当在单一施用中提供时和/或当预期，作为伴随一个或多个后续加强施用的初始施用提供时，所述量足以提供保护和/或帮助防御施用该抗原以防御的病原体。

如本文所使用，“全身施用”是施用至身体的循环系统(包含心血管和淋巴系统)内，其影响作为整体的身体而不是特定部位，诸如胃肠道(经由例如经口或直肠施用)和呼吸系统(经由例如鼻内施用)。全身施用可以例如通过施用到肌肉系统内(肌内)、真皮内(皮内、经皮或真皮上(supradermal))、皮肤下方(皮下)、粘膜下方(粘膜下)、静脉中(静脉内)等来进行。

“肠胃外施用”包括皮下注射、粘膜下注射、静脉内注射、肌内注射、皮内注射和输注。

如本文所使用，术语“家畜”和“家畜动物”包括牛、猪和家禽。如本文所使用，术语“牛(bovine)”和“牛(cattle)”可互换使用，除非另有说明。类似地，术语“猪(porcine)”、“猪(swine)”和“猪(pig)”可互换使用，除非另有说明。如本文所使用,术语“禽类(avian)”和“禽类(fowl)”两个术语可互换使用，并且两术语均意欲包括家禽。如本文所使用，术语“家禽”可以包括鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑和野鸡。

如本文所使用，术语“伴侣动物”包括犬、猫和马。

如本文所使用，术语“猫/猫科动物”是指猫(Felidae)科的任何成员。该科的成员包括野生、动物园和驯养成员，诸如猫(Felinae)亚科的任何成员，例如猫、狮子、老虎、美洲狮、美洲虎、豹、雪豹、黑豹、北美山狮、猎豹、猞猁、山猫、狞猫或其任何杂交种。猫还包括驯养猫、纯种和/或杂种伴侣猫、展示猫、实验室猫、克隆猫和野生或野猫。

除非另有说明，如本文所使用，术语“犬/犬科动物”包括所有驯养犬、家犬(Canislupus familiaris)或家犬(Canis familiaris)。

犬细小病毒“CPV”在1978年被首次分离，并且命名为CPV-2，以使其与犬细小病毒微小病毒(CMV或CPV-1)区分。在最初分离CPV-2之后大约一年，鉴定出遗传变体CPV-2a。在1980年代中期，鉴定出第二种遗传变体CPV-2b。CPV-2a和CPV-2b很快完全替代CPV-2。今天，在美国不再检测到CPV-2a [Parrish和Kawaoka，Annu Rev.Microbiol.，59：553-586(2005)]。该家族中的第四种CPV变体，CPV-2c，在2000年首次得到描述[参见U.S. 8,227,593；U.S. 8,258,274；Hong等人，J.Vet.Diagn.Invest.(5)：535-9(2007)]。于2012年12月19日提交的美国临时申请61/739,067和2013年3月16日提交的美国临时申请61/778,751(其两者内容在此以其整体通过引用并入)，描述了特定减毒的CPV-2c分离株(ATCC登录号PTA-13492)，其随后根据满足国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约(theBudapest Treaty on the International Recognition of the Deposit ofMicroorganisms for the Purposes of Patent Procedure)要求的条件，于2013年1月24日保藏于美国典型培养物中心(ATCC；10801 University Boulevard，Manassas，Va.20110-2209，U.S.A.)。此外，已构建了重组犬细小病毒，其包含异源CPV-2c/CPV-2基因组，即编码衣壳蛋白质的区域来自CPV-2c分离株，且编码非结构蛋白质的区域来自CPV-2分离株[WO2011107534(A1)；US 20120328652；WO2012007589(A1)，其内容在此以其整体通过引用并入，其中编码CPV-2基因组中的衣壳蛋白的核苷酸序列已被替换为编码CPV-2c的衣壳蛋白的核苷酸序列，由此产生异源CPV-2c/CPV-2基因组]。如本文所使用，包含“犬细小病毒”的本发明的疫苗可以包含这些CPV类型/变体/分离株中的一种或多种，包括近期构建的包含异源CPV-2c/CPV-2基因组的重组犬细小病毒。

如本文所使用，“非还原性寡糖”是由通过糖苷键连接的二至十个单糖残基组成且其在碱性水性介质中不生成含有醛基的任何化合物的碳水化合物。本发明的非还原性寡糖的实例包括蔗糖、海藻糖和棉子糖。

如本文所使用，“糖稳定剂”是非还原性寡糖(例如，参见上文)或“糖醇”/多元醇(例如，山梨糖醇、甘露糖醇、阿糖醇、肌醇、麦芽糖醇)。

如本文所使用，“填充稳定剂”是有助于在高温(即25℃-30℃或更高)下稳定疫苗的化合物。此类填充稳定剂的实例是甘露糖醇、甘氨酸、葡聚糖、麦芽糖糊精、聚乙烯吡咯烷酮、羟乙基淀粉、聚乙二醇(PEG，分子量范围为400道尔顿至20千道尔顿)，或其任何组合。在具体实施方案中，“填充稳定剂”是甘露糖醇。

如本文所使用，除非另有具体相反说明，疫苗中的固体添加剂(例如，非还原性寡糖或蛋白稳定剂)的百分比(%)可以作为重量/重量(w/w)给出，和/或基于1%溶液，其为1g固体/100 ml疫苗体积，重量/体积(w/v)。

如本文所使用，除非另有具体相反说明，疫苗中的液体添加剂(例如，乙醇)的百分数(％)，基于作为1 ml的液体添加剂/100 ml的疫苗体积(v/v)的1％溶液。

如本文所提供，给定制剂中的两种试剂的比率，例如，所述填充稳定剂与所述非还原性糖和/或所述糖醇的比率，基于具有相同单位(例如，(w/w))的试剂。

如本文所使用，“氨基酸稳定剂”是带电荷的氨基酸，即，精氨酸、赖氨酸、谷氨酸和天冬氨酸。

如本文所使用，“蛋白稳定剂”可以是全蛋白和/或蛋白水解产物。在具体实施方案中，本发明的“蛋白稳定剂”可以是水解酪蛋白或胶原/胶原衍生物，诸如明胶。可以用于本发明的室温稳定的疫苗中的全酪蛋白的水解产物可以通过许多程序获得，包括例如作为酸性水解产物或酶促水解产物获得。此类水解产物含有混合的氨基酸和肽的形式，所有氨基酸最初均存在于酪蛋白中。可以用于本发明的室温稳定的疫苗中的全酪蛋白的一种胰水解产物作为CASEIN HYDROLYSATE ENZYMATIC^®由MP Biomedicals销售。相当产品以NZ-AMINE^®、NZ-AMINE^® A、NZ-AMINE^® AS、NZ-AMINE^® B和Tryptone的名称由Sigma-Aldrich销售。

因为本发明的室温稳定的疫苗理想的pH范围为pH 5.5-pH 8.5，所以本发明的室温稳定的疫苗包含缓冲试剂，即缓冲剂。用于本发明的室温稳定的疫苗中的缓冲剂包括但不限于：组氨酸、磷酸(phosposphate)钾和/或钠、焦磷酸钠或钾、咪唑、Tris、Tris-组氨酸、BIS-Tris和Good缓冲剂；BIS-Tris-丙烷(BTP)、PIPES、ACES、MOPS、MOPSO、BES、TES、三(羟甲基)甲基甘氨酸、甘氨酰甘氨酸和HEPES。可以使用任何合适的抗衡离子，使缓冲剂达到期望的pH。

如本文所使用，当提供本发明的疫苗的干燥制剂的缓冲剂中的pH时，该pH是在从所述疫苗去除基本上所有液体(即，干燥)以使其为干燥制剂前包含缓冲剂的疫苗制剂的pH。如本文所使用，除非另有具体相反说明，提供的pH值是在25℃测定/测量的pH值。

多价疫苗：本发明提供了室温稳定的多价疫苗，其包含如本文详述的人、家畜或伴侣动物病毒。本发明的室温稳定的多价犬疫苗的实例包括但不限于：以下活的减毒病毒活重组载体中的两种或更多种：犬瘟热病毒、犬腺病毒2型、犬细小病毒、犬副流感病毒、犬流感病毒、犬肺病毒、犬冠状病毒、犬疱疹病毒、传染性犬肝炎病毒、犬微小病毒、狂犬病病毒、伪狂犬病病毒、重组病毒载体，例如，重组犬或猫病毒载体，其编码和表达来自犬病原体和/或猫病原体的异源抗原。

此外，本发明的室温稳定的犬疫苗可以进一步含有以下和/或随后在施用前与以下组合：一种或多种减毒的或灭活的抗原诸如支气管炎博德特菌、支原体属物种、犬埃立克体、无浆体属物种、犬钩端螺旋体、感冒伤寒型钩端螺旋体、哈德焦钩端螺旋体、黄疸出血型钩端螺旋体、波摩那钩端螺旋体、问号钩端螺旋体、秋令热钩端螺旋体或布拉迪斯拉发钩端螺旋体；或灭活的犬流感病毒或灭活的犬冠状病毒。

本发明进一步提供室温稳定的多价疫苗，其包含重组病毒载体，诸如重组犬副流感病毒载体，其编码从人病原体，和/或猿病原体，和/或牛病原体，和/或绵羊病原体，和/或猪病原体，和/或家禽病原体(例如，鸡病毒)获得的异源抗原。

类似地，本发明的室温稳定的多价猫疫苗可以包含以下活的减毒猫病毒中的两种或更多种：猫疱疹病毒、猫杯状病毒、猫肺病毒、猫细小病毒、猫白血病病毒、猫传染性腹膜炎病毒、猫免疫缺陷病毒、博尔纳病病毒、猫流感病毒和禽流感。此类室温稳定的疫苗可以进一步含有以下和/或在施用前与以下组合：减毒的或灭活的猫衣原体(Chlamydophilafelis)和/或巴尔通氏体属物种(Bartonella spp.)(例如汉赛巴尔通氏体(B.henselae))。

本发明的室温稳定的疫苗和多价疫苗被存储为干燥制剂，因此，单独抗原可以在与药学上可接受的载体混合和施用于动物受体之前单独或以任何组合进行包装和储存。在一个此类实例中，包含犬瘟热病毒抗原、犬副流感病毒和犬腺病毒2型抗原的多价疫苗储存于单一干燥制剂中，且犬细小病毒抗原储存于第二干燥制剂中。施用于犬受体前，将两种干燥制剂与载体组合以制备多价犬瘟热病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒2型和犬细小病毒疫苗。

疫苗施用：与载体混合之后，本发明的室温稳定的疫苗可以通过任何方便方式施用，例如通过全身施用，或者通过肠胃外施用，诸如但不限于皮下或肌内施用。与载体混合之后，本发明的室温稳定的疫苗还可以通过粘膜施用，诸如通过鼻内、经口、气管内、直肠和/或眼施用。或者，所述疫苗可以经由皮肤贴剂、划痕或局部施用进行施用。考虑本发明的室温稳定的疫苗还可以经由受体的饮用水和/或食物进行施用。进一步考虑到此类疫苗可以以处理物(treat)或玩具的形式施用。

本发明的疫苗(包括多价疫苗)还可以作为组合疗法的一部分施用，所述组合疗法即除了疫苗自身之外，还包括施用一种或多种额外的活性剂、疗法等的疗法。在该情况下，应认识到构成“治疗有效”量的疫苗量可以多于或少于疫苗单独施用时将构成“治疗有效”量的疫苗量。其它疗法可以包括本领域已知的那些，诸如，例如止痛药、退烧药、祛痰药、抗炎药、抗组胺剂、和/或流体的施用。

免疫原性水平可以通过本领域通常已知的攻击剂量滴度研究技术实验测定。此类技术通常包括用不同剂量的疫苗接种许多动物受试者，并且然后用剧毒病毒攻击动物受试者，以测定最低保护剂量。

影响优选剂量方案的因素可以包括例如受试者的物种或品种(例如犬或猫)、年龄、重量、性别、饮食、活动、肺大小，和状况；施用途径；使用的特定疫苗的功效、安全性和免疫持续时间概况；是否使用递送系统；以及疫苗是否作为药物和/或疫苗组合的一部分施用。因此，实际上采用的剂量可以对于特定动物不同，并且因此可以偏离上文所述的典型剂量。此类剂量调整的确定通常在使用常规方法的疫苗开发领域技术人员的技术内。

类似地，可以与此类剂量一起施用的体积通常在0.1 mL (通常用于皮内或经皮施用)和5.0 mL之间。对于肌内或皮下施用，施用体积的典型范围在0.2-2.0 mL之间，并且为1.0-2.0 mL。

考虑疫苗可以单次施用，或替代地经数天、数周、数月或数年两次或更多次施用于疫苗受体。在一些实施方案中，所述疫苗施用至少两次。在某些此类实施方案中，例如，所述疫苗施用两次，其中第二剂量(例如加强剂量)在第一剂量后至少2周施用。在具体实施方案中，所述疫苗施用两次，其中第二剂量在第一剂量后不长于8周施用。在其它实施方案中，第二剂量在第一剂量后1周至2年、在第一剂量后1.5周至8周、或在第一剂量后2周至4周施用。在其它实施方案中，第二剂量在第一剂量后3周施用。

在上述实施方案中，第一和后续剂量可以诸如在量和/或形式方面不同。然而，通常，剂量在量和形式方面是相同的。当仅施用单一剂量时，该单独剂量中的疫苗量通常包含治疗有效量的疫苗。然而，当施用超过一个剂量时，那些剂量中的疫苗量一起可以构成治疗有效量。此外，可以初始施用疫苗，并且然后可以施用加强剂量。疫苗的后续施用可以在每年(1年)或每两年(2年)基础上进行，无论是否施用加强剂量。

通过参考以下非限制性实施例，本发明可以得到更好理解，所述实施例作为本发明的示例提供。呈现以下实施例以便更完全地说明本发明的实施方案。然而，它们决不应解释为限制本发明的宽范围。

实施例

材料和方法

材料：最小ACS级别蔗糖和山梨糖醇购自Fisher Scientific。纯度超过98%的分子级别L-精氨酸盐酸盐、L-甲硫氨酸、L-组氨酸、甘露糖醇、硫酸镁、依克多因、羟基依克多因、甘氨酸和氯化钠购自Sigma。纯度> 95%的具有平均分子量70,000的葡聚糖购自Sigma。分子生物学级别1.0M Tris (pH 8.0)和EDTA (pH 8.0)溶液购自Sigma。20%明胶bloom 250 溶液和NZ胺 AS溶液由最佳可得的商业供应商制备。

储存溶液制剂：已制备以下溶液且通过0.2 µm过滤灭菌：80%蔗糖、70%山梨糖醇、1.0M L-精氨酸(pH 7.2)、5% L-甲硫氨酸和5mM硫酸葡聚糖。具有6.5-9.5之间的滴度的散装抗原CDV、CAV2、CPV和CPI在-80℃下冷冻，以在临共混前解冻。

疫苗共混、填充和干燥：如制剂表中所列出，将病毒抗原和稳定剂共混至各组分的最终浓度。去离子水用于使溶液至靶体积。通过在搅拌板上搅拌至少10分钟而彻底混合疫苗共混物中的所有组分。对于小瓶中干燥的疫苗，将共混物以0.5mL/小瓶分配至2.2 cc玻璃小瓶中，然后使用如表4中所示开发的干燥循环在冻干机中冷冻干燥。对于珠粒(例如，冻干球(lyospheres)/球状体(sphereons))中干燥的疫苗，将共混物以100 uL/滴分配至超冷不锈钢模具中以获得冷冻的球状珠粒。将冷冻的珠粒转移至托盘，且使用如表5中所示的优化干燥循环在冻干机中冷冻干燥。对于膜上干燥的疫苗，将疫苗共混物分配至膜上，然后将膜在25℃下用控制在100至1000毫托的真空在室中干燥约16小时。

在加速温度和实时下的稳定性测试：

在45℃和37℃下的加速稳定性测试用于筛选不同的制剂。当需要时,在27℃下的长期实时稳定性测试中监测领先的制剂。在指定时间点，从各制剂取回3个样品，并且各抗原的滴度通过基于细胞培养的滴定进行测量，且被报道为中值组织培养感染剂量(TCID₅₀)和/或50%荧光抗体感染剂量(FAID₅₀)。

分析方法：

CPI效价：将病毒样品的稀释物接种到犬肾(DK)细胞上。4-6天之后，将单细胞层固定且用荧光素缀合的CPI抗血清染色，并且通过Spearman-Karber方法计算病毒滴度[Cunningham, C.H. A Laboratory Guide in Virology,第7版, Burgess PublishingCo., Minneapolis, MN. (1973); Kaplan, M.M.和Koprowski, H., LaboratoryTechniques in Rabies, World Health Organization, Switzerland,(1973)]。

CDV效价：将病毒样品的稀释物接种到Vero细胞上。5-7天之后，针对细胞病理效应观察单细胞层，并且通过如上引用的Spearman-Karber方法计算病毒滴度。

CAV2效价：将病毒样品的稀释物接种到DK细胞上。7天之后，针对细胞病理效应观察单细胞层，并且通过如上引用的Spearman-Karber方法计算病毒滴度。

CPV效价：将病毒样品的稀释物接种到DK细胞上。3天之后，用荧光素缀合的CPV抗血清染色单细胞层，并且通过如上引用的Spearman-Karber方法计算病毒滴度。

干燥疫苗的水分和热分析：小瓶或珠粒中的冷冻干燥疫苗的水分使用传统的真空烘箱重量法或Karl-Fischer方法进行测定。[发现冷冻干燥样品的残留水分含量(RMC)从0.5%改变至3% (w/w)。]小瓶中的冷冻干燥珠粒或块饼的玻璃转换温度在差示扫描量热(DSC)仪器上测定。除非另有说明，RMC被提供为冷冻干燥制剂中的百分数(w/w)。

实施例1

稳定剂的制备

各制剂的最终干燥疫苗中的各成分的最终目标浓度(w/w)显示于表1a和2a中。各制剂的疫苗共混物中的各成分的最终浓度显示于表1b和2b中。对于在塑料托盘中作为珠粒(例如，冻干球(lyospheres)/球状体(sphereons))干燥的疫苗，疫苗的各剂量的体积为100µL或250µL。对于在玻璃小瓶中作为块饼(cake)干燥的疫苗，剂量体积为250µL或500µL或1000µL。对于表1a和2a中显示的干燥疫苗中的稳定剂，所有浓度单位为重量/重量(w/w)，除了总剂量疫苗重量以mg计。对于表1b和2b中显示的疫苗共混物中的稳定剂：糖和蛋白的浓度为重量/体积% (w/v)，氨基酸、阳离子和缓冲液的浓度为摩尔浓度(M)或毫摩尔浓度(mM)，依克多因和羟基依克多因的浓度为重量/体积(w/v)。表1b和2b中显示的所有浓度是与病毒抗原的疫苗共混物中的最终浓度。制剂SP33和SP34中的L-精氨酸分别为磷酸盐或乙酸盐。所有其它L-精氨酸制剂是氯盐。pH是与病毒抗原的疫苗共混物的最终pH。制剂中的所有缓冲剂都具有10mM的最终浓度。KPO4是包含磷酸二氢钾和磷酸氢二钾的磷酸钾缓冲液，其中目标pH为7.2。将表1b和2b中列出的稳定剂与适量水彻底混合，然后添加病毒抗原且彻底混合，然后确保疫苗共混物被分配，冷冻，和冷冻干燥成珠粒或在小瓶中冷冻干燥。

实施例2

27℃稳定性与37℃和45℃研究的关联

高温下的加速稳定性测试用于筛选不同的稳定剂。45℃和37℃的高温用于在这些研究中的加速稳定性测试。实时长期稳定性测试在27℃下进行。为了研究在45℃和37℃下的加速稳定性测试是否可用于筛选不同的稳定剂或制剂，比较在45℃、37℃和27℃下的各病毒的至少三种制剂的稳定性概况(表3)。基于在各时间点的病毒滴度和还有滴度损失的总体趋势将不同制剂的相对病毒稳定性进行排序。类似的排序用于在不同温度的相同制剂。如表3中可见，在所有3个温度间在加速和实时稳定性测试之间存在紧密关联。对于不同制剂中的所有四种病毒，在45℃、37℃和27℃下的相对稳定性表现始终是一致的。对于大多数制剂，排序在所有三种温度间是一致的。因此，数据表明，45℃和37℃可以是可靠的加速制剂筛选方法，特别是区分组别中的最好和最差的制剂。对于在45℃和37℃的高温下具有非常相似的稳定性概况的一些制剂，不容易预测哪一种将在27℃(实时)下得到更好的稳定性。在用于DHPPi (CDV、CAV2、CPV和CPI)的制剂筛选中，在45℃和37℃下的加速稳定性测试用于筛选不同的稳定剂和赋形剂以鉴定领先的制剂。当需要时,领先的制剂然后可以用在27℃下的长期实时稳定性测试进行证实。

实施例3

用于不同制剂中的病毒的干燥方法

彻底混合稳定剂和病毒抗原之后，在差示扫描量热仪(Perkin Elmer)上测量疫苗共混物的玻璃转换温度(Tg)prime。表1和2中的所有制剂都具有高于-40℃的Tg prime。基于这些结果，表4和5中的干燥循环分别用于在小瓶中干燥冷冻的疫苗珠粒和液体。为了制备干燥珠粒中的疫苗，首先通过将疫苗共混物滴至预冷的不锈钢板(-110℃至-130℃)中的孔中而制备100µL/珠粒的冷冻的疫苗珠粒。将冷冻的珠粒收集在托盘中且储存于-80℃，直至在冻干机中干燥。临冷冻干燥疫苗珠粒之前，将冷冻干燥机的架子预冷至-20℃，且将托盘中的疫苗珠粒快速装载于架子上。在具有表4中显示的干燥循环的冷冻干燥之后，使用干燥的氩气或干燥的氮气释放真空。将干燥的珠粒的托盘用干燥的氩气或氮气密封于箔囊(foilpouches)中。

为了在小瓶中将疫苗制备为块饼，以250µL/小瓶将疫苗共混物分配至2.2cc玻璃小瓶中。然后将填充的小瓶加塞，且转移至冷冻干燥机中的4℃预冷的架子。表5中的干燥循环用于在小瓶中冷冻干燥疫苗。冷冻干燥之后，释放真空且用干燥的氩气或氮气填充小瓶。然后用橡胶塞完全密封小瓶，然后用摺缝机(crimper)进一步加盖。

实施例4

冷冻干燥的CDV、CAV2、CPI和CPV的稳定性结果

对于珠粒中干燥的病毒，在具有干燥氮气[<1.0%相对湿度(RH)]的手套箱中将冷冻干燥的具有抗原的珠粒包装至容器中，然后在不同温度下测试稳定性。对于在小瓶中作为块饼干燥的样品，将密封小瓶置于储存箱中，然后在不同温度下在培养箱中测试稳定性。在不同的时间点，从培养箱中取回样品，且使用基于细胞培养的滴定测定法滴定各疫苗的效价。

在各时间点，取回至少三个小瓶的相同制剂，且以1mL PBS/小瓶进行重构，用于效价测定。使用基于细胞培养的TCID₅₀和/或FAID₅₀方法测定病毒的效价。在不同的研究中逐步实施制剂筛选。各研究包括至少一种基线制剂以便与其它研究比较。在各研究内，不同的制剂用一个或多个“+”评分，然后基于在多个时间点的相对稳定性数据进行排序。+的数目越大，样品中测试的特定病毒的相对稳定性越好。

对于大多数SPxx制剂，珠粒(例如，冻干球(lyospheres)/球状体(sphereons))的物理稳定性是可接受的，而在长期储存过程中没有珠粒或块饼外观的变化，因此没有列出物理稳定性的排序。对于SPCPVxx制剂，物理稳定性根据制剂中的组分而变化。干燥疫苗的物理稳定性通过Tg和通过视觉检查物理外观进行排序。

表6显示不同制剂中的四种病毒在27℃下的稳定性和它们在27℃下的预期保质期。在这些测试中，CDV、CPI、CAV2和CPV的靶抗原投入滴度[Log₁₀ (TCID₅₀)]分别为7.0、7.0、4.0和5.0。各抗原在到期时的最低滴度对于CDV、CPI、CAV2和CPV分别设定为4.7、5.0、3.3和4.5。从稳定性研究过程中在多个时间点的滴度变化的趋势来计算不同制剂中DHPPi病毒的估计保质期。CPI的估计保质期基于到期时的最小滴度(其为5.0)，且CPI的抗原的投入量高0.5 log。在其它研究中，几种领先的制剂与表6中列出的制剂相比显示在45℃和37℃改进的稳定性。这些领先的制剂可以通过在27℃下的长期实时稳定性测试进行重新测试。表6中显示的数据表明，使用当前的疫苗制造规范，SP10制剂可以最低限度地为CDV、CAV2和CPI提供在27℃下的18个月或更长的保质期(CPI抗原投入量高0.5 log)。

表7显示使用45℃加速稳定性测试鉴定的几种领先的制剂。将CDV、CAV2、CPI和CPV病毒共混于这些制剂中，然后冷冻干燥为珠粒。将珠粒用干燥氮气密封于小瓶中，然后在45℃下进行稳定性测试。类似地，稳定性排序基于各时间点的滴度和随着时间过程的滴度变化率。如表7中显示，与SP10相比，制剂SP43和SP44为CDV和CPI提供明显更高的稳定性。相对于SP10中的CDV和CPI两者，SP44中的CDV和CPI两者在第1、2和4周时存在多于半log改进。类似地，与SP10相比，SP44还为CAV2提供明显更高的稳定性。当从SP44在45℃下的加速研究获得的数据与SP10在27℃下获得的数据进行比较时，可以将制剂SP44相对于SP10的稳定性改进外推以得到在27℃下具有24个月或更长的保质期的稳定的CDV、CAV2和CPI疫苗(DHPi疫苗)。

已经在CDV、CPI、CAV2和CPV的制剂筛选过程中彻底评估了稳定剂或赋形剂对病毒稳定性的影响。几种筛选实例列于表8-13中。

缓冲剂和pH对病毒稳定性的影响显示于表8中。在表8中描述的研究中，疫苗在小瓶中冷冻干燥为块饼。将所有四种病毒如表中共混于制剂中，填充于玻璃小瓶中，然后如方法中所述使用表5中显示的干燥循环在冷冻干燥机中冷冻干燥。除了所列的缓冲剂[磷酸钾缓冲剂(KPO4)、组氨酸、二-三丙烷缓冲剂(BTP)和MOPS (3-(N-吗啉代)丙磺酸)]和pH的差异，本研究中的所有制剂都含有4％甘露糖醇、5％蔗糖、0.8％明胶、1.0％NZ胺和2mMMgSO4。本研究中的所有制剂还含有具有表中所列的最终pH的10mM缓冲剂。各病毒在45℃和37℃下的稳定性数据用于将制剂排序。

表8中提供的数据表明，与在中性或较高pH相比，CDV、CPI和CAV2在较低pH (6.5)具有更高的稳定性，而CPV在中性至较高pH(7.6)具有更高的稳定性。与所测试的其它两种缓冲剂相比，CDV和CPI在KPO4或组氨酸中更稳定，而CAV2和CPV的稳定性似乎不那么依赖于所用的缓冲剂。

研究糖浓度和组合对病毒的稳定性的影响，如表9a和9b中所示。糖浓度列于表9a中，且在45℃和37℃下病毒在这些制剂中的稳定性列于表9b中。在本研究中，所有制剂都具有相同的病毒散装抗原投入量，且将这些制剂中的病毒冷冻干燥为珠粒。相对稳定性排序基于不同制剂中各病毒在45℃和37℃下和在多个时间点的稳定性数据。表9a和9b中的数据表明，CDV、CPI和CAV2的稳定性对糖浓度具有强依赖性，其中病毒在4-30%范围内的较高浓度糖下具有更高的稳定性。该数据还表明，蔗糖和海藻糖(Suc +TrH)的组合似乎比单独的蔗糖或海藻糖表现更好。

还研究L-精氨酸浓度对病毒的稳定性的影响(表10)。制剂SP02B、SP26和SP27的差异仅在于L-精氨酸盐酸盐的浓度。[对于一些数据点，数据由于测定无效(n/a)而不可用]。基于在45℃和37℃下获得的数据，CDV、CPI和CAV2的稳定性似乎取决于精氨酸浓度，其中精氨酸的较高浓度是更稳定的(表10)。

进一步研究不同的精氨酸盐或精氨酸以及谷氨酸的浓度的影响(表11a和11b)。表11a显示各制剂中的精氨酸的浓度和盐和谷氨酸的浓度和干燥疫苗的相应的起始Tg。所有制剂都是相同的，除了精氨酸和谷氨酸的上述差异。用不同的酸将L-精氨酸调节至pH 7.2以产生不同的精氨酸盐。起始Tg是制剂中的冷冻干燥的疫苗珠粒的起始玻璃转换温度。起始Tg通过差示扫描量热法测定，且是至少3个重复的平均值。表11a中列出的制剂在45℃和37℃下的稳定性数据显示于表11b中。还将相对稳定性排序且列于表11b中。如表11a和11b中所示，不同的L-精氨酸盐可具有不同的稳定性影响。尽管制剂SP33中的精氨酸磷酸盐提供高得多的Tg，所有3种病毒的稳定性相对于其它精氨酸盐降低。与SP10中发现的所有三种病毒的稳定性相比，在制剂SP35中组合0.15M精氨酸氯化物与0.15M一元谷氨酸钠略微改善所有三种病毒的稳定性。

依克多因和羟基依克多因是嗜盐微生物中发现的天然化合物。两者都是相容性溶质，其通过充当渗压剂而充当保护性物质，且因此帮助生物体在极端渗透胁迫后存活，赋予对盐和温度胁迫的抗性。依克多因和羟基依克多因两者已显示是蛋白以及许多其它生物品的有效稳定剂。因此，测试它们对CDV、CPI和CAV2的稳定性的稳定化效果。制剂SP39和SP40与制剂SP10是相同的，除了此外它们分别含有依克多因或羟基依克多因(表13)。在三种储存温度下的稳定性数据用于评估其稳定化效果。使用相同的干燥循环在珠粒中冷冻干燥含有这3种病毒级分的疫苗共混物。

稳定性排序基于来自3种温度(在45℃、37℃和27℃下)的稳定性数据。表13中的稳定性数据和稳定性排序表明，依克多因和羟基依克多因两者可以改进CDV和CPI在37℃和27℃下的稳定性，尽管在45℃下的稳定化效果不是那么显著。依克多因和羟基依克多因对CAV2的稳定化作用由于其低降解曲线而难以测定。

实施例5

冷冻干燥的CPV的稳定性结果

也已经评估单价CPV在不同制剂中的稳定性。尽管CPV可以与其它三种犬病毒一起包括于活性的室温稳定的制剂中，例如，SPCPV-02和SPCPV-03制剂可以提供所测试的四种不同的犬病毒的CPV在27℃下的约18个月的保质期，CPV就其最佳室温稳定性而言最不同。

因此，CPV与CDV、CPI或CAV2相比具有不同的针对糖的偏好，例如，与还原糖相比，对于糖醇诸如山梨糖醇更稳定。然而，甚至在山梨糖醇存在的情况下，冷冻干燥的珠粒或块饼的物理稳定性有时导致干燥珠粒在储存过程中的收缩或塌陷。因此，在制剂筛选过程中监测效价的稳定性和干燥的CPV制剂的物理稳定性两者。值得注意的是，单价CPV疫苗制剂的筛选证明是实现疫苗产品的模型研究，其平衡病毒效价稳定性与干燥产物物理稳定性。

表14显示五种不同的制剂中CPV在45℃、37℃和27℃下的稳定性数据。将单价CPV共混入这些制剂中，然后冷冻干燥为100uL大小珠粒。本研究中的所有制剂含有10mM KPO4(pH 7.2)作为缓冲剂，和2% 葡聚糖70k和2％甘氨酸作为填充稳定剂。各制剂的山梨糖醇浓度(w/v)显示于表中。所有制剂还含有稳定蛋白“GN”(明胶和NZ-胺)。1xGN是：0.8%明胶和1.0% NZ胺；而2.5x GN是：2.5%明胶和2.5% NZ胺。效价稳定性排序基于在45℃、37℃和27℃下的病毒滴度变化。

物理稳定性排序基于冷冻干燥之后和稳定性研究过程中的冷冻干燥珠粒的玻璃转换温度(Tg)和物理结构外观。较高Tg和更强的维持珠粒的物理结构的趋势得到物理稳定性的更高得分。

表14中的稳定性数据表明，山梨糖醇的较高浓度有益于CPV效价稳定性，但减轻疫苗物理稳定性；而较高的蛋白浓度对于物理稳定性是有益的。此外，包括L-精氨酸对CPV稳定性没有负面影响。

在表15中概述的研究中进一步评估葡聚糖和不同浓度的山梨糖醇的效果。表15中的所有制剂都含有2％甘氨酸、2.5％明胶、2.5％NZ胺和10mM KPO4缓冲剂(pH 7.2)。此外，所有制剂都含有山梨糖醇和葡聚糖70k。将单价CPV共混入这些制剂中，然后冷冻干燥为100uL大小珠粒。将这些制剂的效价和物理稳定性与表15的研究中类似地排序。表15中的数据表明，较高浓度的葡聚糖70k有益于冷冻干燥的CPV珠粒物理稳定性，但损害效价稳定性(6%)。同时，较高浓度的山梨糖醇对于效价稳定性是有益的，但需要中等浓度的葡聚糖70k来维持其结构。本研究中的数据表明，山梨糖醇和葡聚糖70k的最佳组合对于具有高效价和高物理稳定性两者的最佳冷冻干燥的CPV疫苗是需要的。

实施例6

不同的干燥形式对病毒稳定性的影响

为了研究以不同形式干燥的疫苗是否具有不同的稳定性概况，将相同制剂中的病毒在小瓶中干燥为块饼或在托盘中干燥为珠粒，然后比较它们的稳定性。表16显示SP02B中的珠粒中和FDIV-03中的块饼中的CDV、CAV2和CPI的稳定性测试结果。(SP02B和FDIV-03实际上是相同的制剂)。如从表16可见，CDV、CPI和CAV2在小瓶中的稳定性与在小瓶中观察到的稳定性是相当的(或略好)。本研究中的数据表明，珠粒中鉴定的最佳制剂也可用于在小瓶中干燥为块饼的病毒疫苗。

表4

用于冷冻珠粒疫苗的疫苗的冷冻干燥循环

N/A：不适用。

表5

用于小瓶中的疫苗的冷冻干燥循环

N/A：不适用。

表6

不同制剂中的CDV、CPI、CAV2和CPV在27℃的估计保质期

表7

使用45℃加速稳定性测试鉴定的几种领先制剂

表8

缓冲剂和pH对病毒稳定性的影响

表9a

表9b中使用的共混物制剂的非还原性寡糖含量和总非还原性寡糖

表9b

糖浓度对冷冻干燥的CDV、CPI和CAV2的稳定性的影响

n/a：数据不可用。

表10

共混物中的L-精氨酸浓度对病毒稳定性的影响

n/a：数据不可用。

表11a

与不同的精氨酸盐以及与谷氨酸组合冷冻干燥的珠粒的起始Tg

表11b

不同的精氨酸盐和谷氨酸对CDV、CAV2和CPI稳定性的影响

表12

甘露糖醇和甘氨酸作为用于4路疫苗的稳定剂的影响

• D0是冻干之后的病毒的滴度，且w2是在45℃储存2周之后的病毒滴度。

• 制剂IB1-02、IB1-06和IB1-10之间的差异是填充稳定剂。

IB1-02含有4％甘露糖醇，IB1-06含有2％甘氨酸，然而，IB1-10不含任何填充稳定剂。

表13

依克多因和羟基依克多因对病毒稳定性的影响

Claims (34)

1.疫苗的干燥制剂，其包含活的减毒病毒、30%至80% (w/w)的非还原性寡糖、5%至40%(w/w)的氨基酸稳定剂、2%至20% (w/w)的蛋白稳定剂和具有6.0至8.0的pH的缓冲剂。

2.权利要求1的干燥制剂，其进一步包含2%至25% (w/w)的填充稳定剂，且其中所述填充稳定剂与所述非还原性寡糖的比率为0.05至0.40。

3.权利要求1或2的干燥制剂，其中所述活的减毒病毒是选自犬瘟热病毒、腺病毒、副流感病毒、编码和表达异源抗原的重组病毒载体及其任何组合的活的减毒病毒。

4.权利要求3的干燥制剂，其中所述活的减毒病毒是选自犬瘟热病毒(CDV)、犬腺病毒2型(CAV2)、犬副流感病毒(CPI)和编码和表达异源抗原的重组犬副流感病毒载体(rCPI)及其任何组合的活的减毒犬病毒。

5.权利要求4的干燥制剂，其进一步包含犬细小病毒(CPV)和2%至5% (w/w)山梨糖醇。

6.权利要求3的干燥制剂，其进一步包含细小病毒(CPV)和2%至5% (w/w)山梨糖醇。

7.权利要求1至6的干燥制剂，其中所述非还原性寡糖选自蔗糖、海藻糖、棉子糖及其任何组合；且其中pH为6.2至7.5。

8.权利要求1至7的干燥制剂，其中所述填充稳定剂是甘露糖醇。

9.权利要求1至8的干燥制剂，其中所述氨基酸稳定剂是精氨酸。

10.权利要求9的干燥制剂，其中所述氨基酸稳定剂进一步包含谷氨酸盐。

11.权利要求1至10的干燥制剂，其进一步包含0.02%至1% (w/w)的二价阳离子的盐，所述二价阳离子选自Mg⁺⁺、Ca⁺⁺和Zn⁺⁺。

12.权利要求1至11的干燥制剂，其在被干燥之前，所述疫苗已经通过选自以下的方法处理：将其应用于膜，将其冷冻为珠粒，将其在小瓶中冷冻，喷雾干燥，喷雾冷冻干燥，和将其诱导以起泡。

13.权利要求1至12的干燥制剂，其中所述蛋白稳定剂选自明胶、全酪蛋白的蛋白水解水解产物及其组合。

14.权利要求1至13的干燥制剂，其中所述非还原性寡糖是20%至80% (w/w)蔗糖和18%至66% (w/w)海藻糖的组合；所述填充稳定剂是5%至17% (w/w)甘露糖醇；所述氨基酸稳定剂是9%至34% (w/w)；其中所述蛋白稳定剂包含2%至5% (w/w)明胶和2%至6% (w/w)的全酪蛋白的蛋白水解水解产物；且其中所述填充稳定剂与所述非还原性寡糖的比率为0.08至0.37。

15.权利要求14的干燥制剂，其中所述非还原性寡糖是45%至60% (w/w)蔗糖和15%至25% (w/w)海藻糖的组合；所述填充稳定剂是5%至17% (w/w)甘露糖醇；所述氨基酸稳定剂是10%至25% (w/w)精氨酸；且其中所述蛋白稳定剂包含1.5%至3.5% (w/w)明胶和2%至4%(w/w)的全酪蛋白的蛋白水解水解产物。

16.针对选自犬瘟热病毒、腺病毒、副流感病毒和细小病毒的病毒接种动物的方法，其包括将权利要求1至15的干燥制剂与药学上可接受的载体混合以形成液体疫苗，然后将所述液体疫苗施用于犬。

17.针对选自犬瘟热病毒(CDV)、犬腺病毒2型(CAV2)、犬副流感病毒(CPI)和犬细小病毒(CPV)的犬病毒接种犬的方法，其包括将权利要求1至15的干燥制剂与药学上可接受的载体混合以形成液体疫苗，然后将所述液体疫苗施用于犬。

18.制备室温稳定的疫苗的干燥制剂的方法，其包括：

a. 通过组合治疗有效量的活的减毒犬病毒与8%至30% (w/v)的非还原性寡糖、1%至6%(w/v)的填充稳定剂、0.1M至0.5 M的氨基酸稳定剂、0.9%至10% (w/v)的蛋白稳定剂和具有6.0至8.0的pH的缓冲剂而制备疫苗制剂；其中所述填充稳定剂与所述非还原性寡糖的比率为0.05至0.40；且

b. 在真空下干燥步骤a.的疫苗制剂以制备室温稳定的干燥制剂。

19.权利要求18的制备干燥制剂的方法，其中所述制备包括组合治疗有效量的活的减毒犬病毒与所述非还原性寡糖，所述非还原性寡糖是5%至18% (w/v)的蔗糖和5%至18% (w/v)海藻糖、2%至4% (w/v)的填充稳定剂、0.1M至0.3M的氨基酸稳定剂、1.5%至6% (w/v)的蛋白稳定剂的组合；且其中所述填充稳定剂与所述非还原性寡糖的比率为0.08至0.37。

20.权利要求18或19的制备干燥制剂的方法，其进一步包含包括选自依克多因、羟基依克多因或其组合的渗压剂。

21.权利要求18至20的制备干燥制剂的方法，其中所述活的减毒犬病毒选自犬瘟热病毒、犬腺病毒2型、犬副流感病毒及其任何组合。

22.权利要求18至21的制备干燥制剂的方法，其进一步包括犬细小病毒和0.5%至5%(w/v)山梨糖醇。

23.权利要求18至22的制备干燥制剂的方法，其中所述填充稳定剂是甘露糖醇。

24.权利要求18至23的制备干燥制剂的方法，其中所述氨基酸稳定剂是精氨酸或精氨酸和谷氨酸盐的组合。

25.权利要求18至24的制备干燥制剂的方法，其中在干燥之前，所述疫苗制剂通过选自以下的程序处理：将其应用于膜，将其冷冻为珠粒，将其在小瓶中冷冻，喷雾干燥，喷雾冷冻干燥，和将其诱导以起泡。

26.疫苗的干燥制剂，其包含活的减毒细小病毒、10%至80% (w/w)的糖醇、10%至70%(w/w)的填充稳定剂、4%至50% (w/w)的蛋白稳定剂和具有6.8至8.0的pH的缓冲剂。

27.权利要求26的疫苗的干燥制剂，其中所述活的减毒细小病毒是活的减毒犬细小病毒(CPV)。

28.权利要求26或27的干燥制剂，其中所述糖醇选自山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、麦芽糖醇及其组合，其中所述填充稳定剂选自葡聚糖、麦芽糖糊精、聚乙烯吡咯烷酮、羟乙基淀粉、甘氨酸、甘露糖醇或其组合，其中所述蛋白稳定剂选自明胶、全酪蛋白的蛋白水解水解产物或其组合。

29.权利要求28的干燥制剂，其中所述糖醇是山梨糖醇，所述填充稳定剂是葡聚糖和甘氨酸的组合，且所述蛋白稳定剂是明胶和全酪蛋白的蛋白水解水解产物的组合。

30.权利要求26至29的干燥制剂，其中所述CPV选自CPV-2、CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c和包含异源CPV-2c/CPV-2基因组的重组CPV。

31.权利要求30的干燥制剂，其中所述CPV-2c具有ATCC登记号PTA-13492。

32.权利要求1至15和26至31的干燥制剂，其进一步包含选自依克多因、羟基依克多因或其组合的渗压剂。

33.疫苗，其包含权利要求1至15的干燥制剂与权利要求26至32的干燥制剂和液体药学上可接受的载体的组合。

34.针对选自选自犬瘟热病毒、犬腺病毒2型、犬副流感病毒、犬细小病毒及其任何组合的犬病毒接种犬的方法，其包括将权利要求1至15的干燥制剂与权利要求26至32的干燥制剂和药学上可接受的载体混合以形成液体疫苗，然后将所述液体疫苗施用于所述犬。