CN110430867B

CN110430867B - 从水性混合物冷冻干燥的组合物及其制备方法

Info

Publication number: CN110430867B
Application number: CN201880021100.9A
Authority: CN
Inventors: E.布勒斯; O.德斯帕斯; D.纪尧姆; F.玛索; M.瓦塞勒
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 2017-01-25
Filing date: 2018-01-25
Publication date: 2023-04-07
Anticipated expiration: 2038-01-25
Also published as: EP3573598A1; MX2019008798A; CA3050629A1; BE1025187A1; WO2018138667A1; CN110430867A; US11590243B2; BR112019015245A2; JP2020506691A; JP7090089B2; BE1025187B1; US20190365930A1; GB201701239D0

Abstract

本发明涉及在含有山梨醇的组合物与另外的无定形糖的组合中配制腺病毒载体、其制剂以及获得干燥的组合物的方法。

Description

从水性混合物冷冻干燥的组合物及其制备方法

本发明涉及配制冷冻干燥的组合物中的腺病毒载体、其制剂以及用于获得冷冻干燥的组合物的方法。

背景

腺病毒载体代表预防性或治疗性蛋白递送平台，通过其将编码预防性或治疗性蛋白的核酸序列整合入腺病毒基因组中，当将腺病毒颗粒施用于治疗的主体时，所述核酸序列被表达。在本领域中已经存在开发腺病毒载体的稳定制剂的挑战，所述稳定制剂允许在可接受的储存温度下以相当长的储存期限储存。

已经报道了人腺病毒载体的稳定制剂，诸如R.K Evans等人(‘Development ofstable Liquid Formulations for Adenovirus-Based Vaccines’ Journal of Pharmaceutical Sciences (2004) Vol. 93, No. 10, 2458-2475)所述。然而，本领域中仍然需要保留腺病毒载体的稳定性的制剂。

发明概述

本发明人令人惊讶地发现，在猿猴腺病毒载体的制剂中使用山梨醇实质上提高整个冷冻干燥过程中的稳定性，特别是与作为另外的冷冻保护剂的无定形糖海藻糖组合时。因此，本发明提供了用于冷冻干燥的水性混合物和通过冷冻干燥从所述水性混合物获得的冷冻干燥的组合物(下文称为“干燥的组合物”)，其包含山梨醇和充当冷冻保护剂的另外的无定形糖、诸如海藻糖的组合。

此外，已发现具有低盐含量对猿猴腺病毒载体颗粒的稳定性、尤其对在冷冻干燥期间和重构冻干饼后的稳定性具有进一步有利的影响。因此，本发明进一步提供了含有山梨醇和另外的无定形糖、还包含少量的NaCl的腺病毒组合物。本发明还提供了使用所述冷冻干燥的组合物的方法，通过其用低盐水性液体例如注射用水或非离子等张剂(isotonifying agent)的水溶液重构所述组合物。

本发明进一步提供了冻干所述腺病毒载体组合物的方法。

附图简述

图1 –如实施例1中所使用的冷冻干燥循环的说明。

图2 –如对于实施例1中测试的组合物所测定的玻璃化转变温度(Tg)：(1)包含海藻糖23%的组合物，(2)包含蔗糖23%的组合物，(3)包含海藻糖23% +山梨醇2%的组合物，(4)包含蔗糖23% +山梨醇2%的组合物。

图3 –如实施例1中获得的组合物中含有的腺病毒颗粒的感染性：(1)海藻糖23%(由(+)表示，(2)蔗糖23%(由X表示)，(3)海藻糖23% + 山梨醇2%(由(Y)表示，(4)蔗糖23%+山梨醇2%(由(Z)表示)和(5)新鲜纯化的本体对照(由直立三角形表示)和(6)降解的纯化的本体对照(由倒置三角形表示)。

图4 –如实施例2中所使用的冷冻干燥循环的说明。

图5 - 如实施例2中所测定的Tg。

图6 - 如实施例2中所测定的水分含量。

图7 - 如实施例2中所测定的重量摩尔渗透压浓度。

图8 - 如实施例2中所测定的PicoGreen数据。

图9 - 如实施例2中所测定的感染性。

图10 –如实施例2中所测定的超高效液相色谱(UPLC)回收率。

图11 - 如实施例2中对于鉴定优化的组合所确定的关于不同参数的数据的统计分析的说明(实验设计(DOE)图1)。

图12 - 如实施例2中对于鉴定优化的组合(其中允许更高的海藻糖浓度)所确定的关于不同参数的数据的统计分析的说明(DOE图2)。

图13 –如实施例3中所使用的冷冻干燥循环1。

图14 –如实施例3中所使用的冷冻干燥循环2。

图15 - 如实施例3中所测定的PicoGreen数据：(x)使用具有在+10℃下的二次干燥的冷冻干燥条件获得的样品的数据点(冻干循环(2))，(+)使用具有在+25℃下的二次干燥的冷冻干燥条件获得的样品的数据点(冻干循环(1))，(直立三角形) - 对照腺病毒储备物，(倒置三角形) - 阴性对照降解的腺病毒储备物。

图16 - 如实施例3中所测定的感染性数据：(x)使用具有在+10℃下的二次干燥的冷冻干燥条件获得的样品的数据点，(+)使用具有在+25℃下的二次干燥的冷冻干燥条件获得的样品的数据点，(直立三)角形 - 对照腺病毒储备物，(倒置三角形) - 阴性对照降解的腺病毒储备物。

图17 - 如实施例3中所测定的UPLC数据：(x)使用具有在+10℃下的二次干燥的冷冻干燥条件获得的样品的数据点，(+)使用具有在+25℃下的二次干燥的冷冻干燥条件获得的样品的数据点，(直立三角形) - 对照腺病毒储备物，(倒置三角形) - 阴性对照降解的腺病毒储备物。

图18 –如通过由于冷冻干燥导致的损失估计值所确定的猿猴腺病毒的稳定性；在15℃和25℃的二次干燥温度下，海藻糖18%+山梨醇3.5%与海藻糖23%的比较。

图19 –表明在15℃和25℃的干燥温度下持续200天的海藻糖18% + 山梨醇3.5%和海藻糖23%的稳定性的散点图。

图20 - 在模拟两小时公路运输和两小时空运之后，在15℃或25℃的二次干燥温度下用18%海藻糖+ 3.5%山梨醇(左小图)或23%海藻糖(右小图)配制的冻干的腺病毒的方面。小瓶是硅化的(S+)或未硅化的(S-)。将硅化小瓶以50%的超量装载，并将非硅化小瓶以50%或100%的超量装载。(O)=完整的；(+)=裂开的；(X)=破碎的。

图21 - 在模拟两小时公路运输和两小时空运之后，在15℃或25℃的二次干燥温度下用18%海藻糖+ 3.5%山梨醇(左小图)或23%海藻糖(右小图)配制的冻干的腺病毒的稠度。小瓶是硅化的(S+)或未硅化的(S-)。将硅化小瓶以50%的超量装载，并将非硅化小瓶以50%或100%的超量装载。(O)=非粉状；(+)=轻微粉状；(X)=粉状。

详细描述

不同于本领域中关于腺病毒载体的制剂的报道，本发明人发现，对于例如人腺病毒载体开发的稳定制剂不可成功地应用于所有腺病毒载体，例如猿猴腺病毒载体。本发明现在描述腺病毒载体的组合物，其中所述腺病毒颗粒的结构完整性和功能性被更好地保护或维持。

本发明人发现，当配制腺病毒载体且尤其是猿猴腺病毒载体用于冷冻干燥时，添加山梨醇与另外的无定形糖的组合，增加冷冻干燥后和/或进一步储存期间该腺病毒载体的稳定性。

山梨醇和另外的无定形糖两者都被认为是冷冻保护剂。术语“冷冻保护剂”是指一类赋形剂，其防止正在被冷冻的物质(在本发明中，腺病毒载体)的冷冻损伤。

适合用于根据本发明与山梨醇组合使用的无定形糖可以选自选自蔗糖、海藻糖、甘露糖、甘露糖醇、棉子糖、拉克替醇、乳糖酸、葡萄糖、麦芽酮糖、异-麦芽酮糖、乳果糖、麦芽糖、乳糖、异麦芽糖、麦芽糖醇、palatinit、水苏糖、松三糖、葡聚糖或其组合。在一个实施方案中，所述无定形糖选自蔗糖、海藻糖、乳糖、棉子糖、葡聚糖及其组合。

在一个具体实施方案中，与山梨醇组合的另外的无定形糖是海藻糖或蔗糖、或与第二种无定形糖(诸如选自蔗糖、乳糖、棉子糖、葡聚糖和甘露糖醇)组合的海藻糖。或者，所述无定形糖是海藻糖、蔗糖、或蔗糖和海藻糖的组合。在另一个实施方案中，所述无定形糖是海藻糖或与蔗糖组合的海藻糖。在又另一个实施方案中，所述无定形糖是海藻糖。

山梨醇和选择的无定形糖，例如海藻糖，可以以定义的比率存在。在一个实施方案中，山梨醇与无定形糖的比率为4/10或以下，4/12或以下，4/13或以下，4/14或以下。在另一个实施方案中，山梨醇与无定形糖的比率为4/10和3/23之间，4/12和4/23之间，4/13和4/20之间，4/14和4/18之间， 4/14和3.5/16之间，或4/14和4/16之间。在一个具体实施方案中，比率为4/14和4/16之间。在一个进一步具体实施方案中，所述无定形糖是海藻糖，且山梨醇与海藻糖的比率为4/14和4/16之间。

山梨醇可以以定义的量存在于水性混合物中，从所述水性混合物中冷冻干燥组合物。在一个实施方案中，所述水性混合物含有2和4% (w/v)之间、2.5和4% (w/v)之间或3和4% (w/v)之间的山梨醇。在一个具体实施方案中，山梨醇以3和4% (w/v)之间的量存在。

如根据本文实施方案选择的无定形糖可以以定义的量存在。在一个实施方案中，所述水性混合物含有至少3% (w/v)、至少5% (w/v)、至少10% (w/v)、至少11% (w/v)、至少12% (w/v)、至少13% (w/v)或至少14% (w/v)的如上文选择的无定形糖。在另一个实施方案中，所述选择的无定形糖以小于23% (w/v)、诸如小于20% (w/v)、小于18% (w/v)、小于17%(w/v)、小于16% (w/v)或小于15% (w/v)的总量存在于所述水性混合物中。换而言之，所述无定形糖以23%或更少(w/v)、诸如20%或更少(w/v)、18%或更少(w/v)、17%或更少(w/v)、16%或更少(w/v)或15%或更少(w/v)的总量存在于所述水性混合物中。换而言之，所述无定形糖以至少12%、至少13%或至少14% (w/v)、但小于18%、小于17%或小于16% (w/v)的总量存在于所述水性混合物中。

在一个具体实施方案中，所述无定形糖是海藻糖，且以12%至18% (w/v)或14%至16.5% (w/v)的量存在。

本发明人进一步发现，盐(诸如氯化钠，当呈干燥形式时或当呈液体形式时)的存在可以实质上影响腺病毒载体。考虑到腺病毒载体对盐(诸如氯化钠)的敏感性，本发明因此进一步涉及制剂，即如本文所述的用于冻干的水性混合物和干燥的组合物。在一个实施方案中，使用本文描述的水性混合物和干燥的组合物配制猿猴腺病毒载体。

如本文所用的术语“盐”是指由酸和碱的中和反应产生的离子化合物，其由有关数目的阳离子和阴离子组成，使得所述产物不具有净电荷，例如氯化钠。组分离子可以是无机的或有机的，且可以是单原子的或多原子的。

根据一个实施方案，存在于水性混合物中的盐的量、尤其是NaCl的量被定义为小于50 mM、小于40 mM、小于30 mM、小于20 mM、小于15 mM、小于10 mM、或小于7.5 mM。换而言之，所述水性混合物中存在的NaCl的量可以被定义为50 mM或更少，40 mM或更少，30 mM或更少，20 mM或更少，15 mM或更少，10 mM或更少，或7.5 mM或更少。优选地，所述组合物没有完全地不含盐或没有完全地不含NaCl。为了避免关于涉及盐和具体地NaCl的含量的每个实施方案的疑问，应理解盐、NaCl分别以可测量的量存在。因此，根据本发明的一个实施方案，盐、尤其是氯化钠以至少0.5 mM、至少1 mM、至少2 mM、至少3 mM或至少4 mM的量存在。或者，氯化钠以1和50 mM之间、2.5和25 mM之间、2.5和15 mM之间、2.5和10 mM之间、或2.5和7.5 mM之间的量存在。根据一个具体实施方案，氯化钠以约5 mM(例如，5 +/- 0.5 mM)的量存在。

为了定义范围的目的，认为如本文所用的术语“在…之间”包括所述范围的端点。例如，当说氯化钠以2.5和10 mM之间的量存在时，包括其中NaCl以2.5 mM或10 mM的浓度存在的那些制剂。

根据进一步实施方案，还定义了用于重构干燥的组合物的水性液体或稀释剂的盐(诸如氯化钠)含量。通过重构冷冻干燥的组合物意指将干燥的组合物再水化以再次获得液体混合物。根据一个实施方案，存在于用于重构的水性液体中的盐(例如氯化钠)的量小于50 mM、小于40 mM、小于30 mM、小于20 mM、小于15 mM、小于10 mM或小于7.5 mM、50 mM或更少、40 mM或更少、30 mM或更少、20 mM或更少、15 mM或更少、10 mM或更少或7.5 mM或更少。

用于重构冻干的组合物的水性液体可以基本上不含盐，诸如基本上不含氯化钠。基本上不含是指，盐或氯化钠的浓度是或非常接近0 mM。在一个具体实施方案中，冷冻干燥的组合物可以用注射用水(WFI)重构。

在一个进一步实施方案中，用于重构所述组合物的水性液体没有完全地不含盐或氯化钠。因此，盐(诸如氯化钠)可以以至少0.5 mM、至少1 mM、至少2 mM、至少3 mM或至少4mM的量存在于用于重构干燥的组合物的水性液体中。或者，盐(诸如氯化钠)以1和50 mM之间、2.5和25 mM之间、2.5和15 mM之间、2.5和10 mM之间、或2.5和7.5 mM之间的量存在于用于重构所述组合物的水性液体中。根据一个具体实施方案，盐(诸如氯化钠)以5 mM的量存在于用于重构所述组合物的水性液体中。

本发明因此也提供了使用如本文所述的干燥的组合物的方法，其中将所述干燥的组合物用用于重构如本文定义的组合物的水性液体重构。

所述水性混合物或干燥的组合物还可以包括表面活性剂，其选自泊洛沙姆表面活性剂(例如泊洛沙姆188)、聚山梨醇酯表面活性剂(例如聚山梨醇酯80和/或聚山梨醇酯20)、octoxinal表面活性剂、聚多卡醇表面活性剂、聚氧乙烯硬脂酸酯表面活性剂、聚氧乙烯蓖麻油表面活性剂、N-辛基-葡萄糖苷表面活性剂、聚乙二醇15羟基硬脂酸酯及其组合。在一个实施方案中，所述表面活性剂选自泊洛沙姆表面活性剂(例如泊洛沙姆188)、聚山梨醇酯表面活性剂(例如聚山梨醇酯80和/或聚山梨醇酯20)，尤其是聚山梨醇酯表面活性剂诸如聚山梨醇酯80。

在一个实施方案中，相对于所述水性混合物计算，所述表面活性剂以至少0.001%、至少0.005%、至少0.01%(w/v)和/或最多达0.5%(w/v)的量存在。所述表面活性剂可以以小于0.25%或小于0.1%(w/v)的量存在。在另一个实施方案中，所述表面活性剂以0.02%(w/v)的量存在。

根据具体实施方案，所述表面活性剂是以0.005%和0.5%(w/v)之间诸如约0.02%(w/v)的量存在于所述水性混合物中的聚山梨醇酯80或泊洛沙姆188。

在一个进一步实施方案中，将缓冲剂加入所述水性混合物或干燥的组合物。考虑到所述组合物的治疗组分，通常调节pH。合适地，所述水性混合物的pH是至少6、至少6.5、至少7或至少7.5。换而言之，所述水性混合物的pH可以小于10、小于9.5、小于9或小于8.5。在其他实施方案中，所述水性混合物的pH是在6和10之间，7和9.5之间，7.5和9.5之间或约7.5，例如7.5+/-0.5或8.5+/-0.5。最佳pH还部分地由配制的具体腺病毒载体和/或在其中整合入的转基因决定。

适当的缓冲剂可以选自Tris、琥珀酸盐、硼酸盐、Tris-马来酸盐、赖氨酸、组氨酸、甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、柠檬酸盐、碳酸盐、磷酸盐或其组合。在一个实施方案中，所述缓冲剂是Tris、琥珀酸盐或硼酸盐。在进一步的实施方案中，所述缓冲剂是Tris。

所述缓冲剂可以以至少0.5 mM、至少1 mM、至少2 mM或至少5 mM的量存在于所述水性混合物中。或者，所述缓冲剂可以以小于50 mM、小于40 mM、小于30 mM或小于20 mM的量存在于所述水性混合物中。例如，所述缓冲剂可以以0.5mM至50 mM、1 mM至50 mM、或2 mM至20 mM的量存在。在一个实施方案中，所述缓冲剂以约10 mM的量存在。

根据具体实施方案，所述缓冲剂是以2和20 mM之间、诸如约10 mM的量存在于所述水性混合物中的Tris。

在一个实施方案中，所述组合物还包含最多达或约20mM的量，诸如在约10 mM的浓度的组氨酸。

根据进一步实施方案，所述组合物也包含盐形式(诸如MgCl₂、CaCl₂或MgSO₄)的二价金属离子，诸如Mg2+、Ca2+、或Mg2+或Ca2+。在一个实施方案中，所述二价金属离子是Mg²⁺。所述二价金属离子存在于所述水性混合物中的典型量是在0.5和10 mM之间，诸如1或2 mM，或特别是1 mM。

为了描述本发明的实施方案的目的且不存在任何相反指示，考虑用于包括在组合物中的赋形剂(即盐、氯化钠、冷冻保护剂、缓冲剂、表面活性剂和本文描述的其他物质)的指定量通常(和除非另外指出)表达为相对于所述水性混合物的体积计算的w/v%。或者，在将所述水性混合物冷冻干燥和重构的情况下，可以将赋形剂的量表达为相对于重构的组合物的体积计算的w/v%。

除了在冷冻干燥过程期间增加的稳定性以外，新型制剂还可以增加在储存冷冻干燥的组合物后腺病毒载体的稳定性。所述新型制剂允许在4℃、25℃或37℃下储存液体或干燥的组合物最多达1个月、3个月、6个月、1年、2年或3年。在一个实施方案中，所述干燥的组合物可以在4℃储存3年，在25℃储存3个月或在37℃储存1个月。应当理解，如果与起始材料的感染性相比至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%的感染性得到保留，则储存是适当的。

本文描述的混合物、组合物和方法允许在37℃至少1个月、或在25℃至少3个月或在4℃至少3年的腺病毒载体储存，同时与起始材料的感染性相比保留至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%的感染性。

通过测量载体的感染性，例如在病毒载体的操作(例如冷冻干燥)或储存之后感染性的保留，可以确定腺病毒载体在其他方法中的稳定性。术语“感染性”是指所述载体进入敏感宿主(即细胞)中并递送它的遗传物质用于被所述宿主表达的能力。可以将感染性表达为“50%细胞培养物感染剂量”(CCID₅₀)，其为在给定的细胞培养物中感染50%的细胞所需的腺病毒载体的量。通过测量在其中表达腺病毒转基因的细胞的比例，可以测量感染性。例如，可以将绿色荧光蛋白用作感染性标志物，由此确定与所述载体一起孵育24小时之后表达绿色荧光蛋白的细胞的数目。或者，通过确定与所述载体一起孵育24小时之后表达腺病毒六邻体衣壳蛋白的细胞的数目，可以测量感染性。

由于其在多种靶组织中实现高效基因转移的能力和大转基因容量，腺病毒已经被广泛地用于基因转移应用。在本发明中使用的腺病毒载体可以源自许多哺乳动物宿主。已经分离腺病毒的超过100种不同血清型，其感染不同的哺乳动物物种。根据序列同源性和它们的凝集红细胞的能力，已经将这些腺病毒血清型分类为6个亚属(A-F；B细分成B1和B2)(Tatsis和Ertl， Molecular Therapy (2004) 10:616-629)。

在一个实施方案中，本发明的腺病毒载体源自人腺病毒。这样的人衍生的腺病毒的实例是Ad1、Ad2、Ad4、Ad5、Ad6、Ad11、Ad 24、Ad34、Ad35，特别是Ad5、Ad11和Ad35。尽管基于Ad5的载体已经被广泛地用在许多基因治疗试验中，但是由于在一般群体中的预存免疫(归因于天然感染)，关于Ad5和其他人C组腺病毒载体的应用可能存在限制。Ad5和其他人C组成员倾向于属于最血清流行的血清型。另外，由于在治疗过程中向现存载体的暴露，可能发生针对所述载体的免疫。针对血清流行的载体的这些类型的预存免疫或产生的免疫可能限制基因治疗或疫苗接种努力的有效性。替代性腺病毒血清型因此在寻找能够规避宿主免疫应答的基因递送系统中构成非常重要的目标。

因此，在另一个实施方案中，本发明的腺病毒载体源自非人猿猴腺病毒，也简单地称作猿猴腺病毒。已经从非人猿猴诸如黑猩猩、倭黑猩猩、恒河猴和大猩猩分离出众多腺病毒，并且从这些腺病毒衍生出的载体会诱导针对由这些载体编码的转基因的强烈免疫应答(Colloca等人 (2012) Sci. Transl. Med. 4:1-9; Roy 等人 (2004) Virol. 324: 361-372; Roy 等人 (2010) J. Gene Med. 13:17-25)。基于非人猿猴腺病毒的载体的某些优点包括针对这些腺病毒的交叉中和抗体在靶群体中的相对缺乏。例如，与在某些候选人腺病毒载体的情况下的35%相比，具有预存中和抗体应答的某些黑猩猩腺病毒的交叉反应仅存在于2%的靶群体中。

在具体实施方案中，所述腺病毒载体源自非人腺病毒，诸如猿猴腺病毒和尤其是黑猩猩腺病毒诸如ChAd3、ChAd63、ChAd83、ChAd155、ChAd157、Pan 5、Pan 6、Pan 7 (也被称作C7)或Pan 9。这样的毒株的实例描述于WO03/000283、WO2010/086189和GB1510357.5中，并且也可得自美国典型培养物保藏中心, 10801 University Boulevard, Manassas,Virginia 20110-2209，和其他来源。或者，腺病毒载体可以源自从倭黑猩猩分离的非人猿猴腺病毒，诸如PanAd1、PanAd2或PanAd3。本文描述的这样的载体的实例可以参见例如WO2005/071093和WO2010/086189。腺病毒载体也可以源自如在WO2013/52799、WO2013/52811和WO2013/52832中所述的从大猩猩分离的腺病毒。

腺病毒具有含二十面体衣壳的特征形态，所述二十面体衣壳包含三种主要蛋白：六邻体(II)、五邻体基质(III)和有节纤突(IV)、以及许多其他次要蛋白VI、VIII、IX、IIIa和IVa2。所述六邻体占衣壳的结构组分的大部分，所述衣壳由240个三聚的六邻体壳粒和12个五邻体基质组成。所述六邻体具有三个保守双桶(barrel)，而顶部具有三个塔(tower)，每个塔含有来自每个亚基的环，所述亚基形成衣壳的大部分。六邻体的基质在腺病毒血清型之间是高度保守的，而表面环是可变的(Tatsis和Ertl Molecular Therapy (2004) 10:616-629)。五邻体是另一种腺病毒衣壳蛋白，其形成纤突所连接的五聚体基质。三聚的纤突蛋白从在衣壳的12个顶点中的每一个处的五邻体基质伸出且是有节的杆状结构。所述纤突蛋白的主要作用是经由节区域与细胞受体的相互作用而将病毒衣壳与细胞表面拴系，并且纤突的柔性轴以及节区域中的变异是不同血清型的特征(Nicklin等人 Molecular Therapy2005 12:384–393)。

腺病毒载体可以用于递送期望的RNA或蛋白序列(例如异源序列)用于体内表达。载体可以包括任何遗传元件，包括裸露DNA、噬菌体、转座子、粘粒、附加体、质粒或病毒。“表达盒”(或“微基因”)意指选择的异源基因(转基因)和驱动宿主细胞中的基因产物的翻译、转录和/或表达所必需的其他调节元件的组合。

通常，设计腺病毒载体，使得所述表达盒位于这样的核酸分子中，所述核酸分子在对于选择的腺病毒基因的天然区域中含有其他腺病毒序列。如果需要的话，可以将表达盒插入现存的基因区域中以破坏该区域的功能。或者，可以将表达盒插入部分地或完全地缺失的腺病毒基因的位点。例如，所述表达盒可以位于使选自E1A、E1B、E2A、E2B、E3和E4的基因组区域的至少一个基因无功能的突变、插入或缺失的位点。术语“使……无功能”是指，将足够量的基因区域除去或以其他方式破坏，使得所述基因区域不再能够产生基因表达的功能产物。如果需要的话，可以将整个基因区域除去(和合适地用表达盒替换)。合适地，将腺病毒的E1基因缺失并用表达盒替换，从而产生复制缺陷型重组病毒，所述表达盒由选择的启动子、目标基因的cDNA序列和聚腺苷酸信号组成。

在一个实施方案中，由腺病毒载体编码的转基因是编码在生物学和医学中有用的产物(诸如治疗性或免疫原性蛋白、RNA、酶或催化RNA)的序列。期望的RNA分子包括tRNA、dsRNA、核糖体RNA、催化RNA、RNA适体和反义RNA。有用的RNA序列的一个实例是消灭治疗的动物中的靶向核酸序列的表达的序列。

因此，在一个实施方案中，取决于所述腺病毒载体编码的转基因，将如本文所述的混合物或组合物用在主体(诸如哺乳动物或人主体)的预防性(因此免疫原性的或防病的)或治疗性处理中。

所述转基因可以编码用于治疗，例如遗传缺陷，作为癌症治疗剂或疫苗，用于诱导免疫应答，和/或用于预防性疫苗目的的多肽或蛋白。如本文所用的免疫应答的诱导是指蛋白(也称为“抗原”或“免疫原”)诱导针对所述蛋白的T细胞和/或体液免疫应答的能力。

由如本文所述配制的腺病毒载体表达的免疫原可用于针对其他病原体免疫人或非人动物，或者来自癌细胞或肿瘤细胞，所述其他病原体包括，例如，感染人和非人脊椎动物的细菌、真菌、寄生微生物或多细胞寄生物。例如，免疫原可以选自多种病毒科。

在一个实施方案中，所述免疫原来自丝状病毒，例如Ebola(Zaire、Sudan、Reston、Budibugyo和Ivory Coast种)或Marburg。这样的抗原可以源自病毒糖蛋白(跨膜和/或分泌形式)和/或病毒核蛋白。这样的载体的实例尤其可以见于WO2011/130627。

在另一个实施方案中，免疫原可以选自呼吸道病毒诸如呼吸道合胞病毒(RSV)和其他副粘病毒诸如人变性肺病毒、hMPV和副流感病毒(PIV)。可用作免疫原以免疫人或非人动物的RSV的合适的抗原可以选自融合蛋白(F)、附着蛋白(G)、基质蛋白(M2)和核蛋白(N)。这样的载体描述于WO2012/089833和PCT/EP2016/063297中。在一个实施方案中，对于公开的组合物和方法考虑在PCT/EP2016/063297中公开的ChAd155-RSV构建体。

在另一个实施方案中，所述免疫原可以来自逆转录病毒，例如慢病毒诸如人免疫缺陷病毒(HIV)。在这样的一个实施方案中，免疫原可以源自HIV-1或HIV-2序列，诸如Gag、Pol、Nef、Env和其他。这样的载体尤其描述于GB1510357.5和WO2008/107370中。

在另一个实施方案中，所述免疫原可以来自人乳头瘤病毒(HPV)。在这样的实施方案中，免疫原可以衍生自任何HPV类型，且尤其衍生自已知引起病患或疾病的HPV类型，例如引起泌尿生殖系统癌症的高风险HPV类型，HPV16、HPV18等。

可替代地或另外，转基因序列可以包括报告序列，其在表达时产生可检测信号。这样的报告序列包括但不限于，编码以下的DNA序列：β-内酰胺酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、碱性磷酸酶、胸苷激酶、绿色荧光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰基转移酶(CAT)、萤光素酶、膜结合蛋白(包括例如，CD2、CD4、CD8、流感血凝素蛋白)、和本领域众所周知的其他蛋白(存在针对它们的高亲和力抗体或可以通过常规方式生产它们)、和包含合适地与抗原标签结构域(尤其来自血凝素或Myc)融合的膜结合蛋白的融合蛋白。这些编码序列当与驱动它们的表达的调节元件结合时会提供可通过常规手段检测的信号，所述常规手段包括酶测定、放射摄影测定、比色测量测定、荧光测定或其他光谱测定、荧光活化细胞分选测定和免疫学测定，包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)和免疫组织化学。

除了转基因以外，所述表达盒还可以包括以特定方式与所述转基因可操作地连接的常规控制元件，所述方式允许所述转基因在用腺病毒载体转染的细胞中的转录、翻译和/或表达。如本文所用的“可操作地连接的”序列包括与目标基因邻接的表达控制序列和以反式或在一定距离处起作用以控制目标基因的表达控制序列。

表达控制序列包括合适的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号诸如剪接和聚腺苷酸化(聚腺苷酸)信号，包括兔β-珠蛋白聚腺苷酸；稳定胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(例如，Kozak共有序列)；增强蛋白稳定性的序列；和当期望时，增强编码的产物的分泌的序列。在其他序列中，可以使用嵌合的内含子。

“启动子”是允许RNA聚合酶的结合并指导基因的转录的核苷酸序列。通常，启动子位于基因的5'非编码区，在所述基因的转录起始位点的近侧。在转录的起始中起作用的启动子内的序列元件经常特征在于共有核苷酸序列。启动子的实例包括但不限于来自细菌、酵母、植物、病毒和哺乳动物(包括人类)的启动子。大量表达控制序列(包括内部的、天然的、组成性的、可诱导的和/或组织特异性的启动子)是本领域已知的且可以利用。

通过修饰野生型腺病毒以表达异源基因(转基因)和/或缺失或失活不期望的腺病毒序列来生成腺病毒载体。腺病毒载体也可以具有改变的复制能力。例如所述载体可以是复制缺陷型或具有有限的复制，使得它在非互补细胞中具有与野生型病毒相比减少的复制能力。这可以如下实现：突变所述病毒，例如通过缺失参与复制的基因，例如缺失E1a、E1b、E3或E4基因。这样的修饰是技术人员已知的且描述于本领域例如Roy等人, Human Gene Therapy 15:519-530, 2004; Colloca等人(2012) Sci. Transl. Med. 4:1-9; Roy等人(2004) Virol.324: 361-372；或WO 03/000283中。

使用本领域技术人员已知的技术，生成这些载体。这样的技术包括cDNA的常规克隆技术(诸如在教科书中描述的那些)、腺病毒基因组的重叠寡核苷酸序列的应用、聚合酶链式反应、和提供期望的核苷酸序列的任何合适方法。特别合适的方法包括标准的同源重组方法诸如在Colloca等人(2012) Sci.Transl.Med.4:1-9; Roy等人(2004) Virol.324:361-372; Roy等人(2010) J. of Gene Med.13:17-25；和WO2010/085984中提供的那些方法，或在Warming等人. Nuc. Acids Res. (2005) 33:e36中描述的重组工程方法。

可以在任何合适的细胞系(所述病毒在其中能够复制)上生产腺病毒载体。具体地，可以使用互补细胞系，其提供导致它的受损复制特征的、从所述病毒载体缺失的因子(诸如E1)。非限制性地，这样的细胞系尤其可以是HeLa (ATCC登记号CCL 2)、A549 (ATCC登记号CCL 185)、HEK 293、KB (CCL 17)、Detroit (例如，Detroit 510，CCL 72)和WI-38(CCL 75)细胞。这些细胞系都可得自美国典型培养物保藏中心, 10801 UniversityBoulevard, Manassas, Virginia 20110-2209。其他合适的亲本细胞系可以得自其他来源，诸如PER.C6™细胞，其代表为在ECACC编号96022940下保藏在位于Centre for AppliedMicrobiology and Research (CAMR, UK)的European Collection of Animal CellCultures (ECACC)的细胞或Her 96细胞(Crucell)。

一种特别合适的互补细胞系是Procell 92细胞系。Procell 92细胞系是基于表达腺病毒E1基因(在人磷酸甘油酸激酶-1 (PGK)启动子的控制下用Tet阻遏物转染)和G418-抗性基因的HEK 293细胞(Vitelli等人. PLOS One (2013) 8(e55435):1-9)。Procell92.S适合于在混悬条件中生长，且也可用于生产表达毒性蛋白的腺病毒载体(www.okairos.com/e/inners.phpm=00084, 最后一次登录在2015年4月13日)。

腺病毒递送方法和剂量

如本文所述的混合物或组合物可以包含一种或多种重组载体，所述重组载体能够在递送给哺乳动物(合适地人)之后诱导针对由所述载体递送的转基因产物的免疫应答，例如体液(例如，抗体)和/或细胞介导的(例如，细胞毒性的T细胞)应答。重组腺病毒可以包含(合适地在它的基因缺失中的任一个中)编码期望的免疫原的基因，且因此可以用在疫苗中。重组腺病毒可以用作针对任何病原体(已经对其鉴别出对于免疫应答的诱导而言关键性且能够限制病原体的传播的抗原且可得到其cDNA)的预防性或治疗性疫苗。

因此，在一个实施方案中，本文描述的混合物和/或组合物用于主体(诸如人主体)的免疫中。可以监测选择的基因的免疫水平以确定对加强的需要(如果有的话)。在评估血清中的抗体滴度之后，任选的加强免疫可以是期望的。

在一个实施方案中，可以将本文描述的水性混合物和/或(冷冻干燥的)组合物施用于哺乳动物，例如人主体。具体而言，考虑将包含编码转基因(其为治疗性或免疫原性蛋白)的腺病毒载体(即重组腺病毒载体)的那些混合物或组合物用于配制在本文描述的水性混合物或冷冻干燥的组合物中。

任选地，可以将本发明的混合物或组合物配制成含有其他组分，包括例如，另外的免疫原，例如多肽抗原，和/或佐剂。这样的佐剂可以与编码抗原的引发DNA疫苗一起施用，以与仅用编码抗原的DNA疫苗引发后产生的免疫应答相比增强抗原特异性的免疫应答。或者，这样的佐剂可以与多肽抗原一起施用，所述多肽抗原在涉及本发明的腺病毒载体的施用方案中施用。

在一些实施方案中，如本文所述的混合物或组合物通过肌肉内注射、阴道内施用、静脉内注射、腹膜内注射、皮下注射、表皮施用、真皮内施用、鼻施用或经口施用来施用于主体。

如果治疗方案涉及一种或多种腺病毒载体和/或另一种组分的共同施用，则这些可以共同配制(即，在相同的混合物或组合物中)或各自配制在不同的组合物中。当分开配制时，则它们有利地在相同部位处或附近共位置地施用。例如，可以将所述组分施用(例如经由选自肌肉内、透皮、真皮内、皮下的施用途径)至相同侧或肢体(“同侧”施用)或相对侧或肢体(“对侧”施用)。

病毒载体的剂量主要取决于诸如以下因素：正在治疗的病况，患者的年龄、重量和健康，且因此可以在患者之间变化。例如，病毒载体的治疗上有效的成年人或兽医学剂量通常含有1x10⁵至1x10¹⁵个病毒颗粒，诸如1x10⁸至1x10¹² (例如，1x10⁸、5x10⁸、1x10⁹、5x10⁹、1x10¹⁰、2.5x10¹⁰、5x10¹⁰、1x10¹¹、5x10¹¹、1x10¹²个颗粒)。或者，可以以通常为1x10⁵至1x10¹⁰个噬斑形成单位(PFU)的剂量施用病毒载体，诸如1x10⁵ PFU、5x10⁵ PFU、1x10⁶ PFU、5x10⁶PFU、1x10⁷ PFU、5x10⁷ PFU、1x10⁸ PFU、5x10⁸ PFU、1x10⁹ PFU、5x10⁹ PFU或1x10¹⁰ PFU。剂量将随动物的大小和施用途径而变化。例如，对于单个部位，用于肌肉内注射的合适人或兽医学剂量(对于约80 kg动物)是在约1 x 10⁹至约5 x 10¹²个颗粒/mL的范围内。任选地，可以使用多个施用部位。在另一个实例中，对于口服制剂，合适的人或兽医学剂量可以是在约1x 10¹¹至约1 x 10¹⁵个颗粒的范围内。

可以通过定量PCR分析(Q-PCR)，定量腺病毒载体，例如使用在CMV启动子区域上设计的引物和探针，使用含有载体基因组(其含有包括HCMV启动子的表达盒)的质粒DNA的系列稀释物作为标准曲线。通过平行线分析方法确定测试样品中的拷贝数。载体颗粒定量的替代方法可以是分析型HPLC或基于A₂₆₀ nm的分光光度法。

核酸的免疫学有效量可以合适地是在1 ng至100 mg之间。例如，合适的量可以是1µg至100 mg。本领域技术人员可以容易地确定特定核酸(例如，载体)的适当量。核酸组分的示例性有效量可以是在1 ng至100µg之间，诸如在1 ng至1µg之间(例如，100 ng-1µg)，或在1µg至100µg之间，诸如10 ng、50 ng、100 ng、150 ng、200 ng、250 ng、500 ng、750 ng或1µg。核酸的有效量还可以包括1µg至500µg，诸如1µg至200µg之间，诸如10-100µg之间，例如1µg、2µg、5µg、10µg、20µg、50µg、75µg、100µg、150µg或200µg。或者，核酸的示例性有效量可以是在100µg至1 mg之间，诸如100µg至500µg之间，例如，100µg、150µg、200µg、250µg、300µg、400µg、500µg、600µg、700µg、800µg、900µg或1 mg。

通常，人剂量将包含在0.3ml和2 ml之间的体积中。因此，可以配制本文描述的混合物和/或组合物，使得在重构干燥的组合物后，施用例如0.3、0.4、0.5、0.6、1.0、1.5或2.0ml人剂量/单一或组合免疫原性组分的体积。

本领域技术人员可以调节这些剂量，这取决于施用途径和采用重组载体的治疗或疫苗应用。可以监测转基因的表达水平，或对于佐剂而言，循环抗体的水平，以确定剂量施用的频率。

如果使用一个或多个引发和/或加强步骤，该步骤可以包括每小时、每天、每周或每月或每年施用的单一剂量。作为一个实例，哺乳动物可以接受一个或两个含有在载体中的约10 μg至约50 μg质粒的剂量。期望地，基于哺乳动物的特性和病况而选择递送的量或部位。

可以监测由选定的转基因编码的蛋白的治疗水平或针对所述蛋白的免疫应答的水平，以确定对加强的需要(如果有的话)。在评估血清中的CD8+ T细胞应答或任选的抗体滴度之后，任选的加强免疫可能是期望的。任选地，可以在单次施用中或在不同组合方案中递送腺病毒载体，例如，与涉及其他活性成分的方案或疗程组合或在引发-加强方案中。

除非另有说明，否则“治疗”或“治疗性”可以涉及预防性和治愈性治疗中的任一种或两种。

可以将所述水性混合物或干燥的组合物包含在硅化或未硅化的玻璃小瓶中。在一个实施方案中，将所述水性混合物或干燥的组合物提供在未硅化的小瓶中。合适地，可以将水性混合物包含在未硅化的小瓶中并当被包含在该小瓶中时冷冻干燥。

本发明还提供了包含两个容器的试剂盒，其中第一容器包含如本文所定义的腺病毒组合物，且第二容器包含如本文所定义的用于重构干燥的组合物的液体。

本发明还提供了一种用于冻干或冷冻干燥含有腺病毒载体的液体(诸如如本文定义的水性混合物)以得到如本文所定义的冷冻干燥的组合物的方法，所述方法包括退火步骤。冻干或冷冻干燥循环经常由三个过程阶段组成。

在所述过程的第一个阶段中，将大部分水溶液或混合物冷冻。随后，首先通过在初次干燥中升华除去水。在第三个阶段中，通过在二次干燥中的扩散和解吸除去未冷冻的水。本发明人还发现，退火步骤在冻干循环的冷冻阶段中的引入对腺病毒载体的稳定性具有意外的积极影响。因此，本发明还提供了一种用于冷冻干燥含有腺病毒载体的液体(诸如如本文所述的水性混合物)的方法，其中冷冻干燥循环的冷冻步骤包含退火步骤。

冷冻和干燥温度和时间将最终确定冷冻干燥的组合物的水分含量。在一个实施方案中，冷冻干燥的组合物的水分含量为1.4% (w/w)或更高，例如，1.4和10% (w/w)之间，1.4和8% (w/w)之间，1.7和8% (w/w)之间，1.9和8% (w/w)之间，1.4和5% ( w/w)之间，1.7和5%(w/w)之间，1.9和5% (w/w)之间，1.4和3% (w/w)之间，1.7和3% (w/w)之间，或1.9和3% (w/w)之间。在一个具体实施方案中，所述冷冻干燥的组合物的水分含量为1.7% (w/w)或更高，1.8% (w/w)或更高，或1.9% (w/w)或更高。

为了定义描述的方法的目的，使用下述术语，因为它们是本领域已知的。术语“玻璃化转变温度”或“Tg”是无定形固体在加热后变软或在冷却后变脆时的温度。术语“Tg’”是指在冷冻状态的玻璃化转变温度。术语“塌陷温度”或“Tc”是指无定形物软化至它不再可以支持它自身的结构的程度时的温度。术语“冷冻干燥”和“冻干”与“冷冻干燥的”和“冻干的”可互换使用，且表示将湿物质快速冷冻、随后在减压下脱水的相同过程。

如本文所用的术语“退火步骤”是指组合物的冷冻干燥循环中的一个方法步骤，其中在冷冻阶段中，将产物在指定的低于冰点的温度维持预定的时间段。如技术人员已知的，退火将导致冰晶的Oswald熟化和无定形基质的低温浓缩。通常，退火温度是(稍微)高于Tg’。在一个实施方案中，在(Tg’+ 0.5℃)和(Tg’+ 20℃)之间的温度，例如在-15℃+/-9℃或-15℃+/-6℃的温度，或在(Tg’+ 0.5℃)和(Tg’+ 10℃)之间的温度完成退火。在任何情况下，在退火过程中的退火温度应当是在Tg’和熔化温度(Tm)之间。在具体实施方案中，在-4℃和-24℃之间的温度，可替换地在-4℃和-20℃之间的温度，可替换地在-4℃和-15℃之间的温度，或可替换地在-8℃和-15℃之间(例如，在-10℃ +/-0.5℃)的温度完成退火。在产物的冷冻过程中，即当形成冷冻的样品时，可以进行退火，只要所述产物是冷冻的(固态)和处于玻璃态(低于Tg’)。或者，在产物的冷冻之后进行退火。

在一个具体实施方案中，所述退火温度是约-10℃(例如-10℃+/-1℃)，更具体地，其中所述水性混合物包含山梨醇与海藻糖的比率在4/14和4/16.5之间的山梨醇和海藻糖。

在一个实施方案中，在退火步骤之前将产物冷冻(即产物温度低于Tg’)。在一个实施方案中，通过在低于Tg’的冷冻温度将样品或水性混合物暴露于恒定搁板温度而实现冷冻。在一个替代实施方案中，通过应用搁板-逐渐冷冻(shelf-ramp freezing)，即将搁板温度逐渐降低至低于Tg’的冷冻温度，可以将产物冷冻。根据实施方案，所述冷冻温度是低于Tg’减去5℃、低于Tg’减去7.5℃、或低于Tg’减去10℃的温度，诸如等于或低于-50℃。根据一个实施方案，在开始冷冻干燥循环时的产物温度(即在冷冻干燥器中的样品的温度)是在+2℃和+8℃之间。

当应用搁板-逐渐冷冻时，以至少0.1℃/min、至少0.2℃/min、至少0.3℃/min或至少0.5℃/min的速率，和/或小于10℃/min、7.5℃/min、5℃/min或小于3℃/min的速率，降低温度。或者，以0.1-10℃/min、0.1-5℃/min、0.2-3℃/min或0.3-1℃/min的速率降低温度。根据其他实施方案，将达到的搁板温度维持约或至少1小时(或60分钟)。

在其中在将样品或产物初步冷冻之后、在应用退火步骤之前将产物冷冻的情形的另一个实施方案中，将搁板温度增加至高于Tg’的温度以开始退火步骤，诸如至高于Tg’+0.5℃、高于Tg’+ 1℃、高于Tg’+ 3℃、高于Tg’+ 5℃、高于Tg’+ 10℃或高于Tg’+ 20℃的温度。在任何情况下，在退火过程中将温度保持低于Tm。在一个实施方案中，以至少0.1℃/min、至少0.2℃/min、至少0.3℃/min或至少0.5℃/min的速率和/或小于10℃/min、7.5℃/min、5℃/min或小于3℃/min的速率升高温度。或者，以0.1-10℃/min、0.1-5℃/min、0.2-3℃/min或0.3-1℃/min的速率升高温度。根据其他实施方案，将退火温度维持至少2小时和/或最多达4小时。

在另一个实施方案中，在退火步骤之后，在开始减压干燥之前将搁板温度降低至低于Tg’的温度，诸如至低于Tg’减去5℃、低于Tg’减去7.5℃或低于Tg’减去10℃的温度，诸如等于或低于-50℃。在一个实施方案中，为了实现该目的，以至少0.1℃/min、至少0.2℃/min、至少0.3℃/min或至少0.5℃/min的速率，和/或小于10℃/min、小于7.5℃/min、小于5℃/min或小于3℃/min的速率降低温度。或者，以0.1-10℃/min、0.1-5℃/min、0.2-3℃/min或0.3-1℃/min的速率降低温度。根据其他实施方案，将达到的搁板温度维持约或至少1小时(或60分钟)。

在本文描述的冷冻干燥方法的步骤b.ii.中构想的减压干燥通常在两个阶段中完成，即初次干燥和二次干燥。在一个实施方案中，所述方法的步骤b.ii. 将包括：

- 步骤b.ii.1.，用于在低于产物的Tc的温度初次干燥，和，

- 步骤b.ii.2.，用于在高于产物的Tc且低于产物的Tg的温度二次干燥。

在具体实施方案中，本文所述的组合物的初次干燥在-30℃+/-5℃下进行，本文所述的组合物的二次干燥在10℃+/-5℃下进行，或本文所述的组合物的初次干燥在-30℃+/-5℃下进行，且二次干燥在10℃+/-5℃下进行。

在具体实施方案中，当冷冻干燥本文所述的组合物时，将初次干燥条件应用24小时或更长，24至40小时，或30至40小时。

在另一个实施方案中，在低于90微巴(µbar)和/或高于40微巴的压强进行初次干燥。可以应用初次干燥条件达最多24小时或更久。

另一个实施方案涉及通过以0.1℃/min、至少0.2℃/min、至少0.3℃/min或至少0.5℃/min的速率和/或小于3℃/min、小于2℃/min或小于1℃/min的速率升高搁板温度而实现二次干燥温度。或者，通过以0.1-3℃/min、0.2-2℃/min或0.3-1℃/min的速率升高搁板温度而实现二次干燥温度。根据又另一个实施方案，所述二次干燥温度是至少-10℃和/或低于30℃。在一个具体实施方案中，含有山梨醇的组合物的二次干燥温度为25℃+/-5℃。在一个替代实施方案中，当冷冻干燥本文所述的组合物时，二次干燥温度为10℃+/-5℃。

可以应用二次干燥条件至少或约3小时、至少约4小时、至少约5小时或至少或约6小时。

本发明的具体实施方案包括：

实施方案1：组合物，其包含(i)腺病毒载体，(ii) 10 mM TRIS，(iii) 10 mM组氨酸，(iv) 5 mM NaCl，(v) 1 mM MgCl₂，(vi) 2% (w/v)蔗糖，(vii) 18% (w/v)海藻糖和(viii) 3.5% (w/v)山梨醇。

实施方案2：组合物，其包含(i)腺病毒载体，(ii) 10 mM TRIS，(iii) 10 mM组氨酸，(iv) 5 mM NaCl，(v) 1 mM MgCl₂，(vi) 2% (w/v)蔗糖和(vii) 23% (w/v)海藻糖。

实施方案3：组合物，其包含(i)腺病毒载体，(ii) 10 mM TRIS，(iii) 10 mM组氨酸，(iv) 5 mM NaCl，(v) 1 mM MgCl₂，(vi) 2% (w/v)蔗糖，(vii) 18% (w/v)海藻糖，(viii) 3.5% (w/v)山梨醇和(ix) 0.02% (w/v) TWEEN 80。

实施方案4：组合物，其包含(i)腺病毒载体，(ii) 10 mM TRIS，(iii) 10 mM组氨酸，(iv) 5 mM NaCl，(v) 1 mM MgCl₂，(vi) 2% (w/v)蔗糖，(vii) 23% (w/v)海藻糖和(ix) 0.02% (w/v) TWEEN 80。

实施方案5：冻干或冷冻干燥的组合物，其包含(i)腺病毒载体，(ii) 10 mM TRIS，(iii) 10 mM组氨酸，(iv) 5 mM NaCl，(v) 1 mM MgCl₂，(vi) 2% (w/v)蔗糖，(vii) 18%(w/v)海藻糖和(viii) 3.5% (w/v)山梨醇。

实施方案6：冻干或冷冻干燥的组合物，其包含(i)腺病毒载体，(ii) 10 mM TRIS，(iii) 10 mM组氨酸，(iv) 5 mM NaCl，(v) 1 mM MgCl₂，(vi) 2% (w/v)蔗糖和(vii) 23%(w/v)海藻糖。

实施方案7：冻干或冷冻干燥的组合物，其包含(i)腺病毒载体，(ii) 10 mM TRIS，(iii) 10 mM组氨酸，(iv) 5 mM NaCl，(v) 1 mM MgCl₂，(vi) 2% (w/v)蔗糖，(vii) 18%(w/v)海藻糖，(viii) 3.5% (w/v)山梨醇和(ix) 0.02% (w/v) TWEEN 80。

实施方案8：冻干或冷冻干燥的组合物，其包含(i)腺病毒载体，(ii) 10 mM TRIS，(iii) 10 mM组氨酸，(iv) 5 mM NaCl，(v) 1 mM MgCl₂，(vi) 2% (w/v)蔗糖，(vii) 23%(w/v)海藻糖和(ix) 0.02% (w/v) TWEEN 80。

实施方案9：组合物，其基本上由以下组成：(i)腺病毒载体，(ii) 10 mM TRIS，(iii) 10 mM组氨酸，(iv) 5 mM NaCl，(v) 1 mM MgCl₂，(vi) 2% (w/v)蔗糖，(vii) 18%(w/v)海藻糖和(viii) 3.5% (w/v)山梨醇。

实施方案10：组合物，其基本上由以下组成：(i)腺病毒载体，(ii) 10 mM TRIS，(iii) 10 mM组氨酸，(iv) 5 mM NaCl，(v) 1 mM MgCl₂，(vi) 2% (w/v)蔗糖和(vii) 23%(w/v)海藻糖。

实施方案11：组合物，其基本上由以下组成：(i)腺病毒载体，(ii) 10 mM TRIS，(iii) 10 mM组氨酸，(iv) 5 mM NaCl，(v) 1 mM MgCl₂，(vi) 2% (w/v)蔗糖，(vii) 18%(w/v)海藻糖，(viii) 3.5% (w/v)山梨醇和(ix) 0.02% (w/v) TWEEN 80。

实施方案12：组合物，其基本上由以下组成：(i)腺病毒载体，(ii) 10 mM TRIS，(iii) 10 mM组氨酸，(iv) 5 mM NaCl，(v) 1 mM MgCl₂，(vi) 2% (w/v)蔗糖，(vii) 23%(w/v)海藻糖和(ix) 0.02% (w/v) TWEEN 80。

实施方案13：冻干或冷冻干燥的组合物，其基本上由以下组成：(i)腺病毒载体，(ii) 10 mM TRIS，(iii) 10 mM组氨酸，(iv) 5 mM NaCl，(v) 1 mM MgCl₂，(vi) 2% (w/v)蔗糖，(vii) 18% (w/v)海藻糖和(viii) 3.5% (w/v)山梨醇。

实施方案14：冻干或冷冻干燥的组合物，其基本上由以下组成：(i)腺病毒载体，(ii) 10 mM TRIS，(iii) 10 mM组氨酸，(iv) 5 mM NaCl，(v) 1 mM MgCl₂，(vi) 2% (w/v)蔗糖和(vii) 23% (w/v)海藻糖。

实施方案15：冻干或冷冻干燥的组合物，其基本上由以下组成：(i)腺病毒载体，(ii) 10 mM TRIS，(iii) 10 mM组氨酸，(iv) 5 mM NaCl，(v) 1 mM MgCl₂，(vi) 2% (w/v)蔗糖，(vii) 18% (w/v)海藻糖，(viii) 3.5% (w/v)山梨醇和(ix) 0.02% (w/v) TWEEN80。

实施方案16：冻干或冷冻干燥的组合物，其基本上由以下组成：(i)腺病毒载体，(ii) 10 mM TRIS，(iii) 10 mM组氨酸，(iv) 5 mM NaCl，(v) 1 mM MgCl₂，(vi) 2% (w/v)蔗糖，(vii) 23% (w/v)海藻糖和(ix) 0.02% (w/v) TWEEN 80。

实施方案17：组合物，其由以下组成：(i)腺病毒载体，(ii) 10 mM TRIS，(iii) 10mM组氨酸，(iv) 5 mM NaCl，(v) 1 mM MgCl₂，(vi) 2% (w/v)蔗糖，(vii) 18% (w/v)海藻糖，(viii) 3.5% (w/v)山梨醇和(ix)注射用水。

实施方案18：组合物，其由以下组成：(i)腺病毒载体，(ii) 10 mM TRIS，(iii) 10mM组氨酸，(iv) 5 mM NaCl，(v) 1 mM MgCl₂，(vi) 2% (w/v)蔗糖，(vii) 23% (w/v)海藻糖和(ix)注射用水。

实施方案19：组合物，其由以下组成：(i)腺病毒载体，(ii) 10 mM TRIS，(iii) 10mM组氨酸，(iv) 5 mM NaCl，(v) 1 mM MgCl₂，(vi) 2% (w/v)蔗糖，(vii) 18% (w/v)海藻糖，(viii) 3.5% (w/v)山梨醇，(ix) 0.02% (w/v) TWEEN 80和(ix)注射用水。

实施方案20：组合物，其由以下组成：(i)腺病毒载体，(ii) 10 mM TRIS，(iii) 10mM组氨酸，(iv) 5 mM NaCl，(v) 1 mM MgCl₂，(vi) 2% (w/v)蔗糖，(vii) 23% (w/v)海藻糖，(ix) 0.02% (w/v) TWEEN 80和(ix)注射用水。

实施方案21：冻干或冷冻干燥的组合物，其由以下组成：(i)腺病毒载体，(ii) 10mM TRIS，(iii) 10 mM组氨酸，(iv) 5 mM NaCl，(v) 1 mM MgCl₂，(vi) 2% (w/v)蔗糖，(vii) 18% (w/v)海藻糖和(viii) 3.5% (w/v)山梨醇。

实施方案22：冻干或冷冻干燥的组合物，其由以下组成：(i)腺病毒载体，(ii) 10mM TRIS，(iii) 10 mM组氨酸，(iv) 5 mM NaCl，(v) 1 mM MgCl₂，(vi) 2% (w/v)蔗糖和(vii) 23% (w/v)海藻糖。

实施方案23：冻干或冷冻干燥的组合物，其由以下组成：(i)腺病毒载体，(ii) 10mM TRIS，(iii) 10 mM组氨酸，(iv) 5 mM NaCl，(v) 1 mM MgCl₂，(vi) 2% (w/v)蔗糖，(vii) 18% (w/v)海藻糖，(viii) 3.5% (w/v)山梨醇和(ix) 0.02% (w/v) TWEEN 80。

实施方案24：冻干或冷冻干燥的组合物，其由以下组成：(i)腺病毒载体，(ii) 10mM TRIS，(iii) 10 mM组氨酸，(iv) 5 mM NaCl，(v) 1 mM MgCl₂，(vi) 2% (w/v)蔗糖，(vii) 23% (w/v)海藻糖和(ix) 0.02% (w/v) TWEEN 80。

实施方案25：实施方案1至24中任一项的组合物，其中所述腺病毒载体是猿猴腺病毒载体，诸如黑猩猩腺病毒载体。具体地，腺病毒载体选自ChAd3、ChAd63、ChAd83、ChAd155、ChAd157、Pan 5、Pan 6、Pan 7或Pan 9，又更具体地腺病毒载体选自ChAd3、ChAd63、ChAd83、ChAd155、ChAd157和PanAd3，且仍又更具体地，所述腺病毒载体是ChAd155。

现在将借助于下述非限制性实施例进一步描述本发明。

实施例

实施例1 - 山梨醇作用的评估以及海藻糖和蔗糖的比较

该实验的目的是评估山梨醇在冷冻干燥期间对腺病毒的保护作用，并评估用蔗糖代替总海藻糖负荷的影响。实验中使用的ChAd155载体编码呼吸道合胞病毒蛋白(ChAd155-RSV)，并描述于PCT/EP2016/063297中。将ChAd155颗粒配制于水性混合物中，所述水性混合物进一步包含赋形剂Tris 10 mM-组氨酸10 mM - MgCl2.6H2O 1 mM - Tween 80 0.02%(w/v) - NaCl 5 mM –海藻糖或蔗糖23% (w/v) –山梨醇2% (w/v)。计算糖浓度以达到对于儿科注射所允许的最大重量摩尔渗透压浓度，即900 mOsm/kg。病毒颗粒的浓度为1.1x10¹¹pU/ml。该组成被计算为在填充有0.5 ± 0.02 ml的非硅化型玻璃小瓶中用0.625 ml注射用水重构冷冻干燥的材料后达到。然后，将小瓶用在冷冻干燥位置插入的Helvoet FM460溴丁基塞子部分地密封(部分地插入以允许水蒸汽在冷冻干燥循环中逃逸)。

使用的冷冻干燥循环包括以下步骤(如图1中所示)：

1. 冷冻：

○将搁板温度设定在-52℃。当搁板温度为或低于-45℃时，将填充的小瓶装载进冷冻干燥器中。然后将样品在-52℃冷却最少1小时。

2. 退火步骤：

○使搁板温度升高以在1小时内达到靶退火温度(-10℃)

○将退火温度维持2小时

○使搁板温度在1小时过程中再次从-10℃降低至-50℃

○将产物在-50℃维持至少1小时。

3. 初次干燥：

○将室压强设定在80微巴，并使搁板温度在3小时中从-50℃升高至-25℃。将搁板温度和室压强维持24小时。

4. 二次干燥：

○使搁板温度在6小时中从-25℃升高至+10℃，同时使室压强降低至40微巴。当搁板温度达到+10℃时，将这些条件维持6小时。

在冷冻干燥循环结束时，将所述室用干燥的氮气填充直到达到825毫巴的室压强，且然后将塞子完全插入小瓶中(塞塞子)。一旦塞塞子完成，就将室压强平衡至大气压用于卸载(unloading)。将室温度维持在+2至+8℃直至将小瓶卸载。然后将小瓶卸载并用铝翻转盖(aluminium flip off caps)顶封(over seal)。

该实验的结果呈现在下表中:

在60℃下处理30分钟之前和之后分别使用稀释至达到重构疫苗的浓度的纯化的本体ChAd155的两个样品作为阳性(新鲜纯化的本体对照)和阴性对照(降解的纯化的本体对照)。

						AEX-HPLC
							1	海藻糖23%	44.4	3.2	5.3	72.1	71.3
2	蔗糖23%	21.2	5.4	9.5	63.5	61.7
							3	海藻糖23% + 山梨醇2%	40.0	4.2	3.6	94.3	77.0
4	蔗糖23% + 山梨醇2%	5.3	7.1	2.6	72.6	82.0
							5	新鲜纯化的本体对照	/	/	0.0	100.0	102.9
6	降解的纯化的本体对照	/	/	100.0	0.0	5.6

PicoGreen测定测量病毒颗粒的降解。Quant-iTTM PicoGreen dsDNA试剂是用于定量溶液中的双链DNA的超敏荧光核酸染色剂。

通过针对腺病毒六邻体衣壳蛋白染色的细胞的流式细胞术检测来测量腺病毒颗粒的感染性HEXON。还使用与荧光检测器偶联的阴离子交换高效液相色谱(AEX-HPLC)系统和使用商业腺病毒标准品作为参考来测量腺病毒颗粒单位浓度。使用的色谱系统是DionexUltimate 3000和Waters Acquity UPLC生物相容的(H-级)。

含有海藻糖的组合物显示玻璃化转变温度的增加，其在产物的高温储存下诱导更好的稳定性。而且，与蔗糖制剂相比，海藻糖制剂中的感染性增加(10-20%)。

对于含有山梨醇的制剂，注意到山梨醇的存在导致玻璃化转变温度(Tg)的降低，这可能影响所得饼的外观。如图3中所示，含有山梨醇的组合物的感染性提高10-20%。

实施例2 - 含有海藻糖、山梨醇和NaCl的制剂的统计学DOE的测定

该实验的目的是评估海藻糖、山梨醇和NaCl的几个浓度范围，以确定冷冻干燥的腺病毒候选物的最佳条件。使用的腺病毒是ChAd155-RSV。进一步评估如实施例1中观察到的海藻糖和山梨醇的保护作用连同NaCl的影响。

将ChAd155-RSV颗粒配制于水性混合物中，所述水性混合物进一步包含赋形剂Tris 10 mM-组氨酸10 mM - MgCl2.6H2O 1mM - Tween 80 0.02% (w/v) - NaCl (变量：5、25或45 mM) –海藻糖(14、18.5或23% (v/w) )–山梨醇(0、2或4% (v/w) )。评估的病毒颗粒的浓度为1.1x10¹¹ pU/ml。该组成被计算为在填充有0.5 ± 0.02 ml的非硅化型玻璃小瓶中用0.625 ml注射用水重构冷冻干燥的组合物后达到。然后，将小瓶用在冷冻干燥位置插入的Helvoet FM460溴丁基塞子部分地密封(部分地插入以允许水蒸汽在冷冻干燥循环中逃逸)。

测试以下组合物：

- 样品1：海藻糖(T) 18.5% (v/w) –山梨醇(S) 0% (v/w) - NaCl (N) 25 mm

- 样品2：T 14% - S 0% - N 5 mm

- 样品3：T 18.5% - S 4% - N 25 mm

- 样品4：T 18.5% - S 2% - N 25 mm

- 样品5：T 23% - S 0% - N 5 mm

- 样品6：T 23% - S 4% - N 45 mm

- 样品7：T 18.5% - S 2% - N 25 mm

- 样品8：T 14% - S 4% - N 5 mm

- 样品9：T 23% - S 0% - N 45 mm

- 样品10：T 14% - S 2% - N 25 mm

- 样品11：T 18.5% - S 2% - N 5 mm

- 样品12：T 14% - S 0% - N 45 mm

- 样品13：T 18.5% - S 2% - N 25 mm

- 样品14：T 14% - S 4% - N 45 mm

- 样品15：T 23% - S 2% - N 25 mm

- 样品16：T 18.5% - S 2% - N 45 mm

- 样品17：T 23% - S 4% - N 5 mm

- 样品18：新鲜纯化的本体对照

- 样品19：降解的纯化的本体对照。

使用的冷冻干燥循环包括以下步骤(如图4中所示)：

1. 冷冻：

2. 退火步骤：

○使搁板温度升高以在1小时内达到靶退火温度(-10℃)

○将退火温度维持2小时

○使搁板温度在1小时过程中再次从-10℃降低至-50℃

○将产物在-50℃维持至少1小时。

3. 初次干燥：

○将室压强设定在80微巴，并使搁板温度在3小时中从-50℃升高至-30℃。将搁板温度和室压强维持24小时。

4. 二次干燥：

○使搁板温度在6小时中从- 25℃升高至+10℃，同时使室压强降低在40微巴。当搁板温度达到+10℃时，将这些条件维持6小时。

在冷冻干燥循环结束时，将所述室用干燥的氮气填充直到达到825毫巴的室压强，且然后将塞子完全插入小瓶(塞塞子)。一旦塞塞子完成，就将室压强平衡至大气压用于卸载。将室温度维持在+2至+8℃直至将小瓶卸载。然后将小瓶卸载并用铝翻转盖(aluminiumflip off caps)顶封(over seal)。

所有样品都在T0时和在+4℃、+25℃(T1W25)或+30℃下储存一周后进行分析。

该实验的结果呈现在下表中：

PicoGreen测定和感染性HEXON如对于实施例1所述。如本文报道的定量PCR(qPCR)允许技术人员测定病毒含量。该测试靶向腺病毒中存在的hCMV启动子。用Quiagen QIAmp96 DNA Blood提取DNA样品。结果表示为每毫升的基因组当量(genome equivalents)(gE/ml)。考虑总体参数的最佳结果(例如PicoGreen值处于最低，感染性和HPLC含量处于最高，重量摩尔渗透压浓度低于900 mOsm/kg)用包含14至18.5%海藻糖、4%山梨醇和NaCl < 25mm的组合物实现。

在统计分析后，基于不同的参数限制集合鉴定以下优化的组合物(对于实验设计(DOE)图1，参见图11)：

- 不考虑关于Tg的限制，最佳候选物是海藻糖= 14%/山梨醇= 4%/NaCl = 5mM。

- 考虑Tg应当≥25℃，最佳候选物是海藻糖= 14%-16%/山梨醇= 3%/NaCl = 5mM。

对于其中期望较高海藻糖含量的组合物，鉴定以下优化的组合物(对于DOE图2，参见图12)：

- 海藻糖= 22%，山梨醇= 2%，且NaCl = 5 mM。

山梨醇含量对冷冻干燥的组合物的Tg的作用影响所得饼的外观和其中储存的腺病毒颗粒的稳定性。包括山梨醇的候选物在其组合物中的玻璃化转变温度的降低导致在+25℃和+30℃下一周后饼的不良外观(熔化/塌陷)。观察到降低的玻璃化转变温度与冷冻干燥步骤后在饼中测量的水分含量(残余湿度)直接相关。然而，令人惊讶地，同时观察到具有较高水分含量(通过Karl Fisher滴定测量)的样品在储存后更好地维持腺病毒颗粒的感染性。如果维持至少1.8% w/w的最小水分含量，尽管饼的外观熔化，但感染性保持较高。

实施例3 - 制剂海藻糖/山梨醇/NaCl的统计DOE

实施例2的结果支持海藻糖(14-16%)、山梨醇(3-4%)和NaCl (5 mm)的最佳范围。

使用相同的ChAd155-RSV测试另外的组合物以补充实施例2的数据。对于评估的组合物，NaCl的体积摩尔浓度固定在5 mm。海藻糖和蔗糖含量变化如下：


			1	14%	3%
2	14%	4%
			3	16%	3%
4	16%	3.5%
			5	16%	4%
6	18%	3%
			7	18%	4%
8*	20%	3.5%

* 910 mOsm/kg的所得重量摩尔渗透压浓度。

在60℃下处理30分钟之前和之后分别使用稀释至达到重构疫苗的浓度的纯化的本体ChAd155的两个样品作为阳性和阴性对照。

还评估冷冻干燥循环，以便改善储存(特别是在+25℃(室温)以便覆盖在低温下储存后重构和施用于患者的时间)之后的饼外观的稳定性。

在实施例2中，确定在山梨醇存在下降低的Tg的影响与在冷冻干燥步骤后在饼中测量的水分含量(残余湿度)直接相关。尽管数据显示水分含量在稳定性后对腺病毒的感染性具有保护作用，但饼的不良外观(熔化的方面)是不期望的。为了该目的，冷冻干燥或冻干循环进一步优化如下：

- 冻干循环(1)：较长的初次干燥阶段(+10H)与较高的二次干燥温度(在+25℃)组合使用(参见图13)。

- 冻干循环(2)：较长的初次干燥阶段(+10H)与+10℃的二次干燥温度组合使用(参见图14)。

在T0时和在+4℃(T1W4)、+25℃(T1W25)和+30℃(T1W30)下稳定一周后评估冷冻干燥的产物。

该实验的结果呈现在下表中:

PicoGreen测定、感染性HEXON和AEX-HPLC如对于实施例1所述。CCID50感染性是腺病毒滴度的量度。细胞培养感染剂量50 (CCID50)是终点稀释测定，其定量在特定体积中的50%细胞中产生细胞病变效应所需的病毒量。在本实施例中，滴度以log 10标度(LogCCID50/ml)表示。其通过在指示细胞上接种稀释系列样品来测量。在孵育时间(对于腺病毒为在37℃下7天)之后，将腺病毒六邻体免疫染色，并用显微镜确定结果。

考虑总体参数的最佳结果(例如PicoGreen值处于最低，感染性和HPLC含量处于最高，重量摩尔渗透压浓度低于900 mOsm/kg)使用冷冻干燥循环2实现。组合物2(海藻糖14%- 山梨醇4%)、4(海藻糖16% - 山梨醇3.5%)和5(海藻糖16% - 山梨醇4%)在整体参数上表现最佳。

实施例4 - 冻干的腺病毒的稳定性

冻干的组合物的稳定性研究经在25℃下5个月或在15℃下7个月的过程进行。还使用统计模型基于降解将遵循类似概况的假设，进行实时数据外推至三年。使用两种稳定性模型来外推病毒含量，其通过HPLC和感染性测量，通过荧光活化的细胞分选(FACS)测量，以国际单位(IU)表示。(1)线性模型：；(2)一阶衰减模型：和(2)一阶衰减(具有渐近线)：。测量和外推的数据均显示在下表中。

与在25℃下的二次干燥相比，在15℃下的二次干燥导致更高的稳定性，如腺病毒的损失所测量。观察到两种概况，如图18和19中所示。图18显示在15℃的二次干燥温度下，在4℃下经200天的用18%海藻糖 + 3.5%山梨醇或23%海藻糖配制的腺病毒的稳定性。图19显示在25℃的二次干燥温度下，在4℃下经200天的过程的用18%海藻糖 + 3.5%山梨醇或23%海藻糖配制的腺病毒的稳定性。

如图18和19中所示，在冷冻干燥后，23%海藻糖的浓度导致比18%海藻糖+ 3.5%山梨醇的浓度相对更高的损失(近似45%)，随后在4℃下随时间几乎没有损失。相反，18%海藻糖 + 3.5%山梨醇导致腺病毒载体损失为仅近似30%。

实施例5 - 冻干的腺病毒的物理稳定性

检查机械应力、由通过道路和/或空中的运输产生的复制振动应力对冻干的组合物的稳定性的影响。更具体地，在暴露于振荡应力后测试冻干状态下组合物的物理稳定性。

如前所述制备两种制剂并测试：

(1) 蔗糖18% + 山梨醇3.5%

(2) 海藻糖23%。

对于每种测试条件，将10个含有冻干的组合物的硅化或非硅化的玻璃小瓶在4℃下在轻质隔热容器(Sofribox)的内侧用胶布水平粘贴。对于每次测试使用三次重复。使用Lansmont Model 1000振动测试系统，将样品在'2级'下剧烈摇动2小时，随后在'1级'下再摇动2小时。实验设计旨在分别复制在两小时的公路运输和两小时的空运期间遇到的振动应力。

取决于饼组成、振动的强度和持续时间，预计振动逐渐将饼分解成粉末。冻干的组合物的物理完整性通过使用Axiovision (CQR & photo)在时间0、2小时和4小时通过视觉分析来确定(图20和21)。

图20显示在模拟经由公路运输运输2小时和经由空运运输2小时后保持完整(O)、裂开(+)或破碎(X)的冻干的样品的比例。与具有23%海藻糖的制剂相比，具有18%海藻糖+3.5%山梨醇的制剂导致冻干的组合物受振动应力影响较小。15℃的二次干燥温度也导致冻干的组合物受运输期间的振动应力影响较小。具有18%海藻糖+ 3.5%山梨醇的制剂、15℃的二次干燥温度和硅化小瓶的使用产生用于保存冻干饼完整的最佳条件。

图21显示在模拟经由公路运输运输2小时和经由空运运输2小时后保持非粉状(O)、轻微粉状(+)或粉状(X)的冻干的样品的稠度。与具有23%海藻糖的制剂相比，具有18%海藻糖+ 3.5%山梨醇的制剂导致冻干的组合物受振动应力影响较小。15℃的二次干燥温度也导致冻干的组合物受运输期间的振动应力影响较小。当用18%海藻糖+ 3.5%山梨醇配制时，15℃的二次干燥温度产生比25℃的二次干燥温度更少的粉末形成。

Claims

1.组合物，其包含猿猴腺病毒载体、山梨醇和无定形糖，其中所述无定形糖是海藻糖，其中山梨醇与无定形糖的比率为4/14至3/18。

2.根据权利要求1所述的组合物，其为冷冻干燥的组合物。

3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中山梨醇与无定形糖的比率为小于4/14。

4.根据权利要求1或2所述的组合物，其中山梨醇与无定形糖的比率为4/14至3.5/16。

5.根据权利要求1或2所述的组合物，其进一步包含盐。

6.根据权利要求1或2所述的组合物，其进一步包含NaCl。

7.从水性混合物冷冻干燥的组合物，所述水性混合物包含猿猴腺病毒载体、山梨醇和无定形糖，其中所述无定形糖是海藻糖，其中山梨醇与无定形糖的比率为4/14至3/18。

8.根据权利要求7所述的组合物，其中山梨醇与无定形糖的比率为4/14至3.5/16。

9.根据权利要求7或8所述的组合物，其中所述水性混合物具有低于25 mM的NaCl浓度。

10.根据权利要求7或8所述的组合物，其中所述水性混合物具有低于20 mM的NaCl浓度。

11.根据权利要求7或8所述的组合物，其中所述水性混合物具有低于15 mM的NaCl浓度。

12.根据权利要求7或8所述的组合物，其中所述水性混合物具有低于10 mM的NaCl浓度。

13.根据权利要求7或8所述的组合物，其中所述水性混合物具有2至10 mM的NaCl浓度。

14.根据权利要求7或8所述的组合物，其中所述水性混合物中的无定形糖浓度为低于18% (w/v)。

15.根据权利要求7或8所述的组合物，其中所述水性混合物中的无定形糖浓度为10至20% (w/v)。

16.根据权利要求7或8所述的组合物，其中所述水性混合物中的无定形糖浓度为14至18% (w/v)。

17.根据权利要求7或8所述的组合物，其中所述水性混合物中的山梨醇浓度为3至4%(w/v)。

18.根据权利要求7或8所述的组合物，其中NaCl以对应于3至20 mM的水性混合物中的浓度的量存在。

19.根据权利要求7或8所述的组合物，其中NaCl以对应于3至10 mM的水性混合物中的浓度的量存在。

20.根据权利要求7或8所述的组合物，其中NaCl以对应于4至6 mM的水性混合物中的浓度的量存在。

21.根据权利要求1-2和7-8中任一项所述的组合物，其中所述猿猴腺病毒载体是黑猩猩腺病毒载体。

22.根据权利要求1-2和7-8中任一项所述的组合物，其中所述猿猴腺病毒载体选自ChAd3、ChAd63、ChAd83、ChAd155、ChAd157、Pan 5、Pan 6、Pan 7或Pan 9。

23.根据权利要求1-2和7-8中任一项所述的组合物，其中所述猿猴腺病毒载体选自ChAd3、ChAd63、ChAd83、ChAd155、ChAd157和PanAd3。

24.根据权利要求1-2和7-8中任一项所述的组合物，其中所述猿猴腺病毒载体是ChAd155。

25.根据权利要求1-2和7-8中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包含表面活性剂、缓冲剂和/或二价金属盐。

26.根据权利要求1-2和7-8中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含选自以下的表面活性剂：泊洛沙姆表面活性剂、聚山梨醇酯表面活性剂、octoxinal表面活性剂、聚多卡醇表面活性剂、聚氧乙烯硬脂酸酯表面活性剂、聚氧乙烯蓖麻油表面活性剂、N-辛基-葡萄糖苷表面活性剂、聚乙二醇15羟基硬脂酸酯及其组合。

27.根据权利要求26所述的组合物，其中所述泊洛沙姆表面活性剂是泊洛沙姆188，且所述聚山梨醇酯表面活性剂选自聚山梨醇酯80和聚山梨醇酯20。

28.根据权利要求1-2和7-8中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含表面活性剂，所述表面活性剂为泊洛沙姆表面活性剂或聚山梨醇酯表面活性剂。

29.根据权利要求1-2和7-8中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含表面活性剂，所述表面活性剂为泊洛沙姆188或聚山梨醇酯80。

30.根据权利要求1-2和7-8中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含表面活性剂，所述表面活性剂为聚山梨醇酯80。

31.根据权利要求1-2和7-8中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含选自以下的缓冲剂：Tris、琥珀酸盐、硼酸盐、Tris-马来酸盐、赖氨酸、组氨酸、甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、柠檬酸盐、碳酸盐、磷酸盐或其组合。

32.根据权利要求1-2和7-8中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含选自以下的缓冲剂：Tris、琥珀酸盐、硼酸盐或其组合。

33.根据权利要求1-2和7-8中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含Tris。

34.根据权利要求1-2和7-8中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含选自MgCl₂、CaCl₂或MgSO₄的二价金属离子盐。

35.根据权利要求1-2和7-8中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含MgCl₂。

36.根据权利要求1-2和7-8中任一项所述的组合物，其是冷冻干燥的且具有1.40% (w/w)或更高的水分含量。

37.根据权利要求1-2和7-8中任一项所述的组合物，其是冷冻干燥的且具有1.40至10%(w/w)的水分含量。

38.根据权利要求1-2和7-8中任一项所述的组合物，其用于用注射用水再水化/重构。

39.试剂盒，其包含两个容器，其中第一容器含有冷冻干燥的权利要求1-38中任一项所述的组合物，且第二容器含有注射用水。

40.根据权利要求39所述的试剂盒，其中所述第二容器的内容物用于再水化/重构所述第一容器的内容物。

41.用于制备根据权利要求7至38中任一项所述的组合物的方法，其包括通过如下冷冻干燥所述水性混合物的步骤：

a. 冷冻所述水性混合物，包括退火步骤，和

b. 在减压下干燥冷冻的水性混合物。