CN101312742A - 用于冷冻干燥的疫苗的稳定剂 - Google Patents

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Abstract

总的来说，本发明涉及免疫学和疫苗工艺学领域。更具体而言，本发明涉及用于冷冻干燥的、活的、减毒的免疫原性和/或疫苗组合物的稳定剂，所述免疫原性和/或疫苗组合物尤其可以包含犬副粘病毒。本发明进一步涉及稳定化的、冷冻干燥的、活的、减毒的免疫原性和/或疫苗组合物，例如犬副粘病毒的免疫原性和/或疫苗组合物，其可以包含这些稳定剂。本发明的其他方面在下述公开内容中得到描述，或由于下述公开内容是显而易见的，并且在本发明的范围内。

Description

用于冷冻干燥的疫苗的稳定剂
相关申请的交叉参考
本申请要求于2006年9月16日提交的题目为“Stabilizers ForFreeze-Dried Vaccines”的美国临时申请序列号60/717,640的优先权，其公开内容通过提及而整体引入本文。
本文所引用的这些申请、专利中的每一个和每个文献，以及这些申请、专利和文献中的每一个中所引用的每个文献(“申请引用的文献”)，以及在申请及其专利的文本中或在其审查过程中在申请引用的文献中参考或引用的每个文献，以及在其审查过程中提出的支持专利性的所有争辩，特此通过提及合并入本文。
发明领域
总的来说，本发明涉及免疫学和疫苗工艺学领域。更具体而言，本发明涉及用于冷冻干燥的、活的、减毒的免疫原性和/或疫苗组合物的稳定剂，所述免疫原性和/或疫苗组合物尤其可以包含犬副粘病毒。本发明进一步涉及稳定化的、冷冻干燥的、活的、减毒的免疫原性和/或疫苗组合物，例如犬副粘病毒的免疫原性和/或疫苗组合物，其可以包含这些稳定剂。本发明的其他方面在下述公开内容中得到描述，或由于下述公开内容是显而易见的，并且在本发明的范围内。
发明背景
包含生物成分，例如病毒、细菌、寄生虫、真菌、蛋白质、多肽、糖蛋白和特别是减毒的活微生物的免疫原性组合物和疫苗组合物对于制备、配制和贮藏它们所采用的条件明显敏感。
此类生物成分可以通过化学反应(例如，水解作用、脱氨基作用、美拉反应)进行修饰和降解，所述化学反应中的许多由水介导。液态水允许分子运动并且可以导致包含生物成分的组合物中蛋白质构象的修饰。通过限制对水的接近或通过去除水，减少了修饰和降解的主要因素。赋予生物成分以稳定性的现有方法已主要涉及使水冷冻或通过冷冻干燥去除水。
冻干法或冷冻干燥法是在脱水产品制备中去除水的常用技术。一般而言，使含水组合物“冷冻干燥”涉及3个步骤。首先，在低温条件下使含水组合物冷冻。其次，通过在减压和低温条件下升华来去除冷冻的水。在这个阶段时，组合物通常包含约15％的水。第三，通过在减压和较高温度的条件下解吸来进一步去除残留水。在冻干法结束时，产生冷冻干燥的产品，也称为“软锭(pastille)”或“团块(cake)”。冷冻干燥的产品包含非常少的残留水(约0.5％-约5％重量/重量)和无定形形式的干燥材料。这种特殊状态被描述为“玻璃质的”。
然而，在制备阶段过程中，例如在冻干之前和过程中，以及在免疫原性组合物和疫苗组合物贮藏过程中，观察到生物成分的免疫原性活性的大量丧失。必须保护生物成分的完整性，以确保免疫原性组合物和疫苗组合物的免疫接种功效得到保留。通过在施用于宿主或受试者时诱导并刺激免疫应答的能力来测量生物成分的免疫原性活性。
为了限制受试者的处理和施用的次数，本领域存在提供多价免疫原性组合物或疫苗组合物的强烈需要。根据定义，多价免疫原性组合物或疫苗组合物包含来源于或衍生自至少2种不同病原体的超过一种活性免疫原性组分。在冷冻干燥步骤和随后的贮藏期过程中，来自不同属的病毒在稳定性方面可以改变，导致生存力或感染性丧失。在病毒例如犬副粘病毒的情况下，通常施用的活性免疫原性组分是活的减毒病毒。为了有效刺激免疫系统，活的减毒病毒必须在被免疫的受试者中复制。在使多价免疫原性组合物或疫苗组合物冷冻干燥的过程中、在组合物贮藏期间、或在组合物重构后施用前，可以发生生存力或感染性的丧失。因此，已经向此类冷冻干燥的组合物中添加稳定剂。然而，为了获得保留其感染性和/或生存力的多价免疫原性组合物或疫苗组合物，能够保存不同活的减毒病原体的生存力和感染性的常见稳定剂将是特别有利的。
干燥形式的生物成分的稳定化通常涉及抗毒素、抗原和细菌的保存(Flosodort等人(1935)J.Immunol.29，389)。然而，这个过程中的限制包括在环境温度下从含水状态进行干燥时蛋白质的部分变性。从冷冻状态进行干燥帮助减少变性，并且导致虽然不完全但更佳的生物成分(包括细菌和病毒)的保存(Stamp等人(1947)J.Gen.Microbiol.1，251；Rightsel等人(1967)Cryobiology 3，423；Rowe等人(1971)Cryobiology 8，251)。
近来，在使病毒冻干前以各种组合添加糖例如蔗糖、棉子糖和海藻糖作为稳定剂。已就它们使包含活的减毒生物成分特别是病毒的不同疫苗稳定化的能力测试了大量化合物。此类化合物包括SPGA(蔗糖、磷酸盐、谷氨酸盐和白蛋白；Bovarnick等人(1950)J.Bacteriol.59，509-522；美国专利号4,000,256)，牛或人血清白蛋白，谷氨酸的碱金属盐，铝盐，蔗糖，明胶，淀粉，乳糖，山梨糖醇，Tris-EDTA，酪蛋白水解物，乳糖酸钠和钾，以及单金属或二金属的碱金属磷酸盐。其他化合物包括例如，SPG-NZ胺(例如美国专利号3,783,098)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)混合物(例如美国专利号3,915,794)。
疫苗和免疫原性组合物通过减少由于各种有毒力的病原体而引起的发病率和死亡率对公共卫生具有巨大的影响。然而，起因于免疫原性组合物和疫苗组合物中的添加物的不希望的副作用仍造成潜在危险，所述潜在危险可能超过免疫原性组合物和疫苗组合物的任何保护和治疗属性。
在美国中常用的疫苗形式中，明胶在约2百万剂之一中可以引起严重的过敏反应。过敏反应先前被认为起因于白蛋白(卵蛋白)，并且更可能由相同疫苗中的明胶引起。在人血清白蛋白的情况下，尽管没有疾病曾与疫苗中的人血清白蛋白相关，但存在病毒通过源自人血液的这种蛋白质进行传播的可能性。
牛衍生制品例如牛白蛋白和明胶，具有通过在疫苗制备中使用的牛血液和结缔组织制品传播CJD(克雅病，也称为“疯牛病”)的危险。然而，仍没有其中CJD通过血液或结缔组织制品传播的报道病例，引起CJD的朊病毒仍未在血液或结缔组织中发现，并且使用来自从存在已知的疯牛病病例的国家输入的牛的牛衍生制品被禁止。然而，考虑到这些危险，已努力取消在已观察到引发不希望的免疫效应的免疫原性组合物中使用此类制品。
De Rizzo(de Rizzo等人(1989)Bull.Pan.Am.Health Organ.23(3)，299-305)报道了包含山梨糖醇-明胶或谷氨酸-乳糖溶液的冷冻干燥的麻疹病毒制剂。将这些制剂贮藏于-20℃，并且在21个月的贮藏期期间测定它们的病毒滴度。所得到的数据表明，当经过21个月的时间段于-20℃进行贮藏时，不含稳定剂的冷冻干燥的病毒是稳定的。此外，众所周知，冷冻干燥的麻疹病毒在当贮藏于-20℃时是稳定的，并且可以保持效力很多年而几乎没有损失(Gray A.，(1978)Dev.Biol.Stand.41，265-266)。然而，这些结果是在其中冷冻干燥的麻疹病毒为稳定的-20℃时获得，并且没有证实另外的稳定化效应。这些结果只显示，山梨糖醇-明胶和谷氨酸-乳糖溶液对麻疹病毒的稳定性没有负面影响，所述麻疹病毒以冷冻干燥的形式贮藏于-20℃。
Precausta(Precausta等人(1980)J.Clin.Microbiol.12(4)，483-489)检查了在冷冻干燥后，残留水分和封闭大气对犬瘟热病毒(CDV)和传染性支气管炎病毒(IBV)的感染性滴度的影响。向CDV制剂中添加乳糖溶液至75mg/ml的终浓度，而IBV疫苗包含40mg甘露醇/ml。当将冷冻干燥前的CDV滴度与冷冻干燥后和于6℃贮藏12个月后的滴度进行比较时，CDV滴度从101.6减少至102.0CCID50/ml，这反映了CDR滴度的非常显著的减少。
这些稳定剂通常包含由于安全性问题和不利的副作用而对于给受试者施用来说不希望的组分。因此，需要新型稳定剂和用于保持冷冻干燥形式的生物成分的生存力和感染性的方法，其对于给受试者注射来说是安全和适合的并且具有良好的外观。
本申请中任何文献的引用或指明并非承认此类文献可用作本发明的现有技术。
发明概述
本发明通过尤其是提供用于冷冻干燥的活的减毒免疫原性组合物或疫苗组合物的新型稳定剂解决了本领域的所述需要，所述免疫原性组合物或疫苗组合物可以包含活的减毒犬瘟热病毒(CDV)和犬副流感2型(cPi2)。除了其他病毒、病原体和活性免疫原性组分外，这些稳定剂可以保持这些犬副粘病毒的生存力和感染性，尤其是在冷冻干燥过程中，以及冷冻干燥制品在冷藏温度下或在室温下，特别是约4℃-约25℃的温度下长时间贮藏过程中。重要的是，目前要求保护的、用于冷冻干燥的稳定化的活的减毒免疫原性组合物或疫苗组合物的稳定剂是安全的并且适合于在重构后给受试者注射。这些冷冻干燥的稳定化的免疫原性组合物可以包含具有良好的外观，即具有规则的形状和均匀的颜色的软锭或团块。
本发明的稳定剂有利地不含动物来源的成分，特别是不含来自人或牛来源的血清白蛋白、乳白蛋白和明胶。用这种方式，将例如起因于明胶或白蛋白过敏性的过敏反应例如荨麻疹和过敏症，以及海绵状脑炎疾病特别是克雅病(CJD)或牛海绵状脑炎(BSE；也称为疯牛病)的传播的任何潜在生物学危险降到最低或消除。
因此，在一个方面，本发明提供了用于冷冻干燥的活的减毒犬瘟热(CDV)和犬副流感2型(cPi2)免疫原性组合物或疫苗组合物的稳定剂，所述稳定剂可以包含至少一种还原性单糖和至少一种酸抗氧化剂化合物，其中所述至少一种酸抗氧化剂化合物可以包括天冬氨酸、谷氨酸、抗坏血酸或其组合。
在某些实施方案中，所述至少一种还原性单糖可以包括葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖、山梨糖或其组合。
在另一个实施方案中，稳定剂可以进一步包含至少一种填充剂，所述填充剂可以包括葡聚糖、麦芽糖糊精、聚乙烯吡咯烷酮、羟乙基淀粉或其组合。
在某些实施方案中，稳定剂可以进一步包含至少一种糖醇，所述糖醇可以包括山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇或其组合。
在另一个实施方案中，稳定剂可以进一步包含至少一种非还原性寡糖，所述非还原性寡糖可以包括海藻糖、蔗糖、棉子糖或其组合。
本发明还提供了进一步包含至少一种糖醇和至少一种非还原性寡糖的稳定剂，其中所述糖醇可以包括山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇或其组合，并且其中所述非还原性寡糖可以包括海藻糖、蔗糖、棉子糖或其组合。
在本发明的另一个方面，提供了免疫原性悬浮液或溶液，其可以包含与本发明的稳定剂相混合的活的减毒副粘病毒，包括CDV和cPi2。
一个实施方案提供了多价免疫原性悬浮液或溶液，其可以包含活的减毒副粘病毒(包括CDV和cPi2)，衍生自除副粘病毒外的其他病原体的至少一种活性免疫原性组分，与本发明的稳定剂相混合。所述至少一种免疫原性组分可以衍生自包括腺病毒科、细小病毒科、冠状病毒科、疱疹病毒科、痘病毒科、弹状病毒科或其组合的病原体。
所述至少一种活性免疫原性组分可以有利地包括活的减毒犬腺病毒2型(CAV2)和活的减毒犬细小病毒(CPV)。
在某些实施方案中，所述至少一种活性免疫原性组分可以包括病毒载体，所述病毒载体包含一种或多种异源免疫原。在其他实施方案中，所述至少一种活性免疫原性组分可以包括质粒载体，所述质粒载体包含一种或多种异源免疫原。
本发明的免疫原性悬浮液或溶液提供了这样的稳定剂，所述稳定剂可以包含终浓度为约1％-约5％w/v；约1.5％-约5％w/v；约1.5％-约4％w/v；或约2.5％-约3％的至少一种还原性单糖。
本发明的免疫原性悬浮液或溶液包含本发明的稳定剂，所述稳定剂可以包含终浓度为约0.1％-约0.3％；约0.1％-约0.25％；或约0.2％w/v的至少一种酸抗氧化剂化合物。
本发明的免疫原性悬浮液或溶液包含这样的稳定剂，所述稳定剂可以包含终浓度为约0.5％-约7.5％w/v；或约1.5％-约5％w/v的至少一种填充剂。
本发明的免疫原性悬浮液或溶液包含这样的稳定剂，所述稳定剂可以包含终浓度为约0.5％-约5％w/v的至少一种糖醇，和至少一种还原性单糖，条件是所述至少一种还原性单糖和所述至少一种糖醇的终浓度等于或小于约7.5％w/v。
在另一个实施方案中，提供了包含稳定剂的本发明的免疫原性悬浮液或溶液，所述稳定剂可以包含终浓度为约0.5％-约5％w/v的至少一种非还原性寡糖，和至少一种还原性单糖，条件是所述至少一种还原性单糖和所述至少一种非还原性寡糖的终浓度等于或小于约7.5％w/v。
本发明的另一个实施方案提供了免疫原性悬浮液或溶液，所述稳定剂可以包含终浓度为约0.5％-约5％w/v的至少一种糖醇，终浓度为约0.5％-约5％w/v的至少一种非还原性寡糖，和至少一种还原性单糖，条件是所述至少一种还原性单糖、所述至少一种糖醇和所述至少一种非还原性寡糖的终浓度等于或小于约12.5％w/v。
本发明的免疫原性悬浮液或溶液包含这样的稳定剂，所述稳定剂可以包含(i)终浓度为约1％-约5％w/v的至少一种还原性单糖，和(ii)终浓度为约0.1％-约0.3％w/v的至少一种酸抗氧化剂。
本发明的免疫原性悬浮液或溶液包含这样的稳定剂，所述稳定剂可以包含(i)终浓度为约1％-约5％w/v的两种还原性单糖的混合物，(ii)终浓度为约0.1％-约0.3％w/v的至少一种酸抗氧化剂，和(iii)终浓度为约0.5％-约7.5％w/v的至少一种填充剂。
本发明的免疫原性悬浮液或溶液包含这样的稳定剂，所述稳定剂可以包含(i)终浓度为约1％-约5％w/v的至少一种还原性单糖，(ii)终浓度为约0.5％-约5％w/v的至少一种非还原性寡糖，(iii)终浓度为约0.1％-约0.3％w/v的至少一种酸抗氧化剂，和(i v)终浓度为约0.5％-约7.5％w/v的至少一种填充剂，条件是(i)和(ii)的终浓度等于或小于约7.5％w/v。
本发明的免疫原性悬浮液或溶液包含这样的稳定剂，所述稳定剂可以包含(i)终浓度为约1.5％-约4％w/v的至少一种还原性单糖，(ii)终浓度为约0.5％-约2.5％w/v的至少一种非还原性寡糖，(iii)终浓度为约0.1％-约0.25％w/v的至少一种酸抗氧化剂，和(iv)终浓度为约1.5％-约5％w/v的至少一种填充剂，条件是(i)和(ii)的终浓度等于或小于约5％w/v。
在另一个实施方案中，免疫原性悬浮液或溶液包含这样的稳定剂，所述稳定剂可以包含(i)终浓度为约1％-约5％w/v的至少一种还原性单糖，(ii)终浓度为约0.5％-约5％w/v的至少一种糖醇，(iii)终浓度为约0.1％-约0.3％w/v的至少一种酸抗氧化剂，条件是(i)和(ii)的终浓度等于或小于约7.5％w/v。
本发明的另外一个实施方案提供了包含稳定剂的免疫原性悬浮液或溶液，所述稳定剂可以包含(i)终浓度为约1.5％-约4％w/v的至少一种还原性单糖，(ii)终浓度为约1.5％-约3％w/v的至少一种糖醇，和(iii)终浓度为约0.1％-约0.25％w/v的至少一种酸抗氧化剂，条件是(i)和(ii)的终浓度等于或小于约5％w/v。
本发明的免疫原性悬浮液或溶液包含这样的稳定剂，所述稳定剂可以包含(i)终浓度为约1％-约5％w/v的至少一种还原性单糖，(ii)终浓度为约0.5％-约5％w/v的至少一种糖醇，(iii)终浓度为约0.5％-约5％w/v的至少一种非还原性寡糖，和(iv)终浓度为约0.1％-约0.3％w/v的至少一种酸抗氧化剂，条件是(i)、(ii)和(iii)的终浓度等于或小于约12.5％w/v。
本发明的免疫原性悬浮液或溶液包含这样的稳定剂，所述稳定剂可以包含(i)终浓度为约1.5％-约4％w/v的至少一种还原性单糖，(ii)终浓度为约0.5％-约5％w/v的至少一种糖醇，(iii)终浓度为约0.5％-约2.5％w/v的至少一种非还原性寡糖，和(iv)终浓度为约0.1％-约0.25％w/v的至少一种酸抗氧化剂，条件是(i)、(ii)和(iii)的终浓度等于或小于约10％w/v。
本发明的另一个方面提供了用于使本发明的活的减毒CDV和cPi2免疫原性悬浮液或溶液冷冻干燥的方法，其可以包括(a)使所述悬浮液或溶液与所述稳定剂接触，从而形成稳定化的免疫原性悬浮液或溶液；(b)在大气压下使所述稳定化的免疫原性悬浮液或溶液冷却至低于大约所述稳定化的免疫原性悬浮液的T’g值的温度；(c)通过使冰在低压下升华来干燥所述稳定化的免疫原性悬浮液或溶液；和(d)通过进一步降低压力并增加所述稳定化的免疫原性悬浮液或溶液的温度来去除过量的残留水。
在一个有利的实施方案中，步骤(b)中的所述温度可以低于约-40℃。步骤(c)中的所述压力可以小于或等于约200μbar，而步骤(d)中的所述压力可以小于或等于约100μbar。步骤(d)中的所述温度可以为约20℃-约30℃。
另一个实施方案提供了本发明的方法，所述方法可以包括多价免疫原性组合物或疫苗组合物，其可以包含活的减毒CDV、活的减毒cPi2、和衍生自除副粘病毒外的其他病原体的至少一种活性免疫原性组分。
在一个进一步的方面，提供了冷冻干燥的稳定化的活的减毒CDV和cPi2免疫原性组合物，其通过本发明的方法产生。
另一个方面提供了冷冻干燥的稳定化的活的减毒CDV和cPi2免疫原性组合物，其可以包含(i)终浓度为约20％-约50％w/w的至少一种还原性单糖，(ii)终浓度为约1.5％-约6％w/w的酸抗氧化剂，所述酸抗氧化剂包括天冬氨酸、谷氨酸、抗坏血酸或其组合。
本发明还提供了冷冻干燥的稳定化的活的减毒CDV和cPi2免疫原性组合物，其可以包含(i)终浓度为约20％-约50％w/w的至少一种还原性单糖，(ii)终浓度为约2％-约6％w/w的至少一种酸抗氧化剂，所述至少一种酸抗氧化剂包括天冬氨酸、谷氨酸、抗坏血酸或其组合，和(iii)终浓度为约15％-约70％w/w的至少一种填充剂。
本发明还提供了通过本发明方法产生的冷冻干燥的稳定化的多价免疫原性组合物或疫苗组合物，其包含活的减毒CDV、活的减毒cPi2、和衍生自除副粘病毒外的其他病原体的至少一种活性免疫原性组分，并且其可以包含：(i)终浓度为约20％-约50％w/w的至少一种还原性单糖，(ii)终浓度为约1.5％-约6％w/w的至少一种酸抗氧化剂，所述至少一种酸抗氧化剂包括天冬氨酸、谷氨酸、抗坏血酸或其组合。
本发明的另一个方面提供了冷冻干燥的稳定化的多价免疫原性组合物，其包含活的减毒CDV、活的减毒cPi2和衍生自除副粘病毒外的其他病原体的至少一种活性免疫原性组分，并且包含：(i)终浓度为约20％-约50％w/w的至少一种还原性单糖，(ii)终浓度为约2％-约6％w/w的至少一种酸抗氧化剂，所述至少一种酸抗氧化剂包括天冬氨酸、谷氨酸、抗坏血酸或其组合，和(iii)终浓度为约15％-约70％w/w的至少一种填充剂。
在另外一个方面，本发明提供了试剂盒，所述试剂盒可以包含含有本发明的冷冻干燥的稳定化的免疫原性组合物的第一管形瓶，和含有溶剂的第二管形瓶。
所述溶剂可以选自去矿质水、蒸馏水、注射用水、缓冲液(即，磷酸盐缓冲溶液)和佐剂(即，油包水乳状液、氢氧化铝、卡波姆)。
这些和其他实施方案由下述详细描述公开，或者由于下述详细描述是显而易见的并且由下述详细描述所囊括。
附图简述
作为例子给出但不希望将本发明限制于所描述的具体实施方案的下述详细描述，可以结合通过提及而合并入本文的附图进行理解，其中：
图1A显示了具有规则形状、蛋糖霜(meringue)外观或海绵状外观的冷冻干燥的软锭的照片。
图1B显示了粘着外观、线轴外观和两分式(de-duplicated)外观的照片。
图2描绘了显示在冷冻干燥步骤结束时(在T0时)，(A)非还原性寡糖和(B)还原性单糖的百分比对于以log10 CCID50/ml表示的CDV滴度的影响的图。非还原性寡糖和还原性单糖的终浓度表示为％重量/体积。
图3描绘了表明(A)在冷冻干燥步骤结束时(在T0时)和(B)于+4℃在3个月的贮藏期后(T+3个月)，抗氧化剂化合物对于以log10CCID50/ml表示的cPi2滴度的影响的图，其中终浓度表示为％重量/体积。
发明详述
在本公开内容中，“包含”、“含有”和“具有”等可以具有美国专利法中归于它们的含义，并且可以指“包括”等；“基本上由......组成”同样具有美国专利法中归于其的含义，并且该术语是开放式的，允许存在多于所描述事物的事物，只要所描述事物的基本或新型特征不由于存在多于所描述事物的事物而改变，但排除现有技术实施方案。
本发明背景下的“受试者”可以是脊椎动物，例如哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物或鱼类；更有利地，人、伴侣动物或驯养动物；食品生产性或饲料生产性动物；家畜、游戏、竞赛或运动动物，例如但不限于牛类、犬类、猫类、山羊类、绵羊类、猪类、马类和鸟类。优选地，所述脊椎动物是犬类。
如本文所使用的，“重组的”涉及在体外合成或者进行操作的核酸(例如，“重组核酸”)，使用重组核酸在细胞、受试者或其他生物系统中产生基因产物的方法，或者由重组核酸编码的多肽(“重组蛋白质”)。“重组方式”还包括切割核酸并将其连接到表达盒或载体中以用于例如核酸编码序列的诱导型或组成型表达，所述核酸具有来自不同来源的各种编码区、结构域或启动子序列。
如本文所使用的，术语“可操作地连接”意指所描述的组分处于允许其以其预期方式起作用的关联中。
术语“异源的”在当关于核酸进行使用时，表示核酸位于它在自然界中通常不存在于其中的细胞、病毒、受试者或细菌中；或者包含2个或更多个核酸子序列，所述子序列未发现处于与自然界中通常发现的相同的彼此关联中，或进行重组改造，从而使得其在细胞、受试者或结构中的表达水平或与其他核酸或其他分子的物理关系在自然界中通常未发现。例如，可以重组生产具有2个或更多个来自无关基因的序列的异源核酸，所述序列以自然界中未发现的方式排列；例如，被插入例如痘病毒或腺病毒载体内的与启动子序列可操作地连接的犬类基因。举例来说，目的异源核酸可以编码免疫原性基因产物，其中在载体中包含的目的异源核酸在治疗上或预防上作为免疫原性组合物或疫苗组合物进行施用。异源序列可以包含启动子和序列的各种组合，其众多例子在本文中详细描述。
如本文所使用的，“载体”是允许或促进实体从一种环境转移到另一种环境的工具。举例来说，在重组核酸技术中使用的某些载体允许实体例如核酸区段(例如异源核酸区段，例如异源cDNA区段)被转移到靶细胞内。本文还使用了术语“表达载体”。本发明包括重组载体，所述重组载体可以包括但不限于，病毒载体、细菌载体、真菌载体、原生动物载体、质粒载体或其组合。
关于用于在载体中表达的异源核酸(例如，编码目的表位和/或抗原和/或免疫原和/或治疗剂)和提供此类异源核酸的文献，以及关于用于增强核酸分子表达的转录和/或翻译因子的表达，以及关于术语例如“目的表位”、“治疗剂”、“免疫应答”、“免疫学应答”、“保护性免疫应答”、“免疫学组合物”、“免疫原性组合物”和“疫苗组合物”等等，尤其可以参考1999年11月23日公布的美国专利号5,990,091以及WO 98/00166和WO 99/60164，以及其中引用的文献和在那个专利和那些PCT申请的审查过程中的记录文献；所有所述参考文献通过提及而合并入本文。因此，在本发明实践中可以参考美国专利号5,990,091以及WO 98/00166和WO 99/60164，和其中引用的文献和在那个专利和那些PCT申请的审查过程中的文献或记录，以及在本文中引用或者通过提及而合并入本文的其他文献；并且其中所引用的所有异源核酸分子、启动子和载体可以在本发明的实践中使用。在这点上，还可以提及美国专利号6,706,693；6,716,823；6,348,450；美国专利申请序列号10/424,409；10/052,323；10/116,963；10/346,021；和于1999年2月25日公开的来自PCT/US98/16739的WO99/08713。
“抗原”是由免疫系统识别并诱导免疫应答的物质。抗原可以包括被杀死的、减毒的或活的完整生物；生物的亚单元或部分；包含具有免疫原性性质的插入片段的重组载体；在呈递给宿主动物后能够诱导免疫应答的核酸部分或片段；蛋白质、多肽、肽、糖蛋白、表位、半抗原、碳水化合物、糖或其任何组合。备选地，抗原可以包括毒素或抗毒素。在本文中可互换使用的类似术语是“免疫原”。“病原体”指疾病的特定致病因子，例如细菌、真菌、原生动物、寄生虫或病毒。
如本文所使用的，术语“免疫原性组合物”和“免疫学组合物”和“免疫原性或免疫学组合物”包括引发针对从载体表达的目的抗原或免疫原的免疫应答的任何组合物；例如，在给受试者施用后，引发针对所靶向的目的免疫原或抗原的免疫应答。术语“疫苗性组合物”和“疫苗”和“疫苗组合物”包括诱导针对目的抗原的保护性免疫应答，或针对所述抗原提供有效保护的任何组合物；例如，在给受试者施用或注射后，引发针对所靶向的抗原或免疫原的保护性免疫应答或提供针对从载体表达的抗原或免疫原的有效保护。
如本文所使用的，术语“多价”意指或者包含超过一种来自相同物种、来自不同物种的抗原的免疫原性组合物或疫苗组合物，或者包含来自不同属的抗原的组合的免疫原性组合物或疫苗组合物。
本发明背景下的“活性免疫原性组分”包括活的减毒病原体，例如，活的减毒病毒，活的减毒细菌、真菌或寄生虫。当活性免疫原性组分是本发明的多价活的减毒CDV和cPi2免疫原性组合物、悬浮液或溶液的一部分时，活性免疫原性组分可以有利地衍生自除副粘病毒外的其他病原体。本发明还包括衍生自或来源于本文描述的一种或多种病原体的重组异源免疫原或抗原，其尤其可以在病毒载体、细菌载体、真菌载体和质粒载体中包含并表达。本发明尤其还包括衍生自一种或多种病原体的异源免疫原或抗原的表位，免疫调节剂例如细胞因子，治疗剂，毒素，抗体，抗体的抗原结合片段，佐剂，或其他种类，例如反义RNA、催化性RNA、小干扰RNA。
术语“兽医学组合物”意指包含表达治疗蛋白质如例如促红细胞生成素(EPO)或免疫调节蛋白例如干扰素(IFN)以用于兽医学用途的载体的任何组合物。类似地，术语“药物组合物”意指包含用于表达治疗蛋白质的载体的任何组合物。
本发明的组合物和方法可以适当地应用于下述物质的稳定化：尤其是免疫调节剂例如细胞因子，治疗剂，毒素，抗体，抗体的抗原结合片段，佐剂，或其他种类，例如反义RNA、催化性RNA、小干扰RNA。在重构后，这些化合物可以作为预防免疫接种而用于预防疾病，或者作为治疗免疫接种而提供针对疾病症状的缓解。
本发明包括用于冷冻干燥的活的减毒免疫原性组合物的稳定剂，其包含至少一种还原性单糖和至少一种酸抗氧化剂化合物。在某些实施方案中，稳定剂可以任选包含至少一种非还原性寡糖和/或至少一种填充剂和/或至少一种糖醇。这些稳定剂可以保持或保留生物成分的免疫原性、感染性和生存力，所述生物成分包括但不限于，尤其是病毒、细菌、真菌、寄生虫、蛋白质、多肽。本文描述的本发明的稳定剂还具有良好的外观，即均匀的形状和颜色，并且对于给受试者的施用是安全的。
“还原性单糖”是能够贡献出电子，并因此在氧化还原反应期间能够使另一种化合物还原的糖。一般而言，还原性单糖在其结构中具有醛或酮基。比色测试可用于鉴定还原性糖，例如费林试剂测试，它产生从深蓝色到红色的颜色变化，因为铜离子试剂在还原性糖存在下被还原成铜金属。在本发明中，还原性单糖优选包括葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖、山梨糖或其组合。在本发明的一个实施方案中，提供了至少2种还原性单糖的组合。还原性单糖对于在冷冻干燥过程中保护组合物特别是蛋白质和活的减毒病原体是重要的，特别是在升华步骤(即，第一个和第二个干燥步骤)过程中，其中还原性单糖代替被升华的水并维持生物结构的内聚(cohesion)。
任选地，可以向根据本发明的稳定剂中添加糖醇和/或非还原性寡糖。本发明还包括还原性单糖和糖醇的组合，还原性单糖和非还原性寡糖的组合，以及还原性单糖、糖醇和非还原性寡糖的组合。
糖醇在化学上是醇，更确切地说是多元醇，通过糖醛基的还原而衍生自糖分子。在本发明的背景下，糖醇有利地是单糖醇或二糖醇。糖醇可以有利地包括山梨糖醇、甘露醇、木糖醇或麦芽糖醇。本发明的稳定剂还可以包括至少2种糖醇的混合物。
本发明背景下的“非还原性寡糖”是包含2-10个糖单元的糖，并且在氧化还原反应过程中不能使另一种化合物还原。在本发明中，非还原性寡糖可以是非还原性二糖或非还原性三糖，有利地包括海藻糖、蔗糖或棉子糖。本发明的稳定剂还可以包含至少2种非还原性寡糖的混合物。
酸抗氧化剂化合物被定义为与氧化剂、自由基(即具有未成对电子的分子)或释放自由基的化学制品反应并且使它们中和的化学化合物。在本发明的背景下，抗氧化剂化合物为酸的形式。为了清楚起见，它们在本文中被称为“酸抗氧化剂”。酸抗氧化剂可以包括抗坏血酸和/或酸性氨基酸，例如天冬氨酸和谷氨酸。有利地，酸抗氧化剂是天冬氨酸。稳定剂优选地不包含酸抗氧化剂的盐，例如碱金属盐，例如钠或钾盐，特别是天冬氨酸钠盐、天冬氨酸钾盐、谷氨酸钠盐、谷氨酸钾盐、抗坏血酸钠盐和抗坏血酸钾盐。在本发明中还包括超过一种抗氧化剂化合物的组合。
填充剂可以是药学或兽医学上可接受的聚合物，例如但不限于葡聚糖、麦芽糖糊精、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、交聚维酮和羟乙基淀粉。其他淀粉衍生物包括但不限于，微晶纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟乙基甲基纤维素和羟丙基甲基纤维素。有利地，填充剂可以是葡聚糖或PVP，优选地葡聚糖。本发明还包括至少2种填充剂的组合。填充剂增加免疫原性组合物和疫苗组合物的T’g值，允许在冷冻过程中使用较高的温度。“T’g值”被定义为玻璃化转变温度，这相应于在其下冷冻的组合物变成玻璃质的温度。填充剂主要负责在本发明的冷冻干燥的软锭和团块中观察到的良好的外观，特别是通过保持软锭的固体形状而不产生氢键。
如果使用葡聚糖作为填充剂，那么它的分子量可以为约5000Da-约70000Da，优选地约10,000Da-约40,000Da。如果使用PVP作为填充剂，那么它的分子量可以为约8,000Da-约360,000Da，优选地约10,000Da-约60,000Da。
如果使用麦芽糖糊精作为填充剂，那么它的葡萄糖当量值(DE，这是淀粉聚合物水解程度的定量量度)可以为约3-约20，优选地约5-约18，更优选地约10-约15。如果使用羟乙基淀粉作为填充剂，那么它的分子量可以为约70,000Da-约450,000Da，优选地约130,000Da-约200,000Da。羟乙基淀粉的置换程度可以为约0.4-约0.7，优选地约0.4-约0.6。置换程度被定义为羟乙基的数目/葡萄糖单元。
稳定剂中的某些组分可能是不溶性的。然而，为了获得可溶性稳定剂的目的而替换适当地类似的组分(例如，通过选择更可溶的组分)和/或调整稳定剂中存在的不溶性组分的量或数量，完全在技术人员的能力范围内。组分的溶解度可以通过目视溶解度测试而容易地进行检查。溶解度测试包括在约55℃的温度下添加稳定剂的所有组分并混合约30分钟的步骤。在室温和没有任何搅动下大约24小时后，可以就沉淀物的出现来目视检查稳定剂。如果稳定剂是透明的或清澈的，那么稳定剂的所有组分都是可溶的。
命名为F2、F2B、F6B、F33、F37、A、H、K和U的本发明的稳定剂的具体实施方案在本文实施例中进行描述。
本发明的稳定剂可以贮藏在约10℃-约40℃，并且优选地约15℃-约25℃的温度下。
本发明还提供了稳定化的免疫原性悬浮液或溶液，其包含与根据本发明的稳定剂相混合的免疫原性悬浮液或溶液，所述免疫原性悬浮液或溶液包含活的减毒病毒，例如但不限于副粘病毒。犬副粘病毒尤其包括犬瘟热病毒(CDV)和犬副流感2型(cPi2)，两者都为活的减毒病毒的形式。
本发明的一个有利的实施方案包括活的减毒副粘病毒，特别是犬副粘病毒。犬副粘病毒是副粘病毒科的病毒，所述副粘病毒科包括犬瘟热病毒(CDV)和犬副流感2型病毒(cPi2)。犬副粘病毒是造成许多食肉动物物种中的广泛多样的疾病的原因，特别是驯养动物例如狗，或非驯养动物例如雪貂、狮子、老虎和豹。
在本发明的稳定化的免疫原性悬浮液或溶液中，还原性单糖的终浓度为约1％-约5％w/v，有利地约1.5％-约5％w/v，更有利地约1.5％-约4％w/v，和优选地约2.5％-约3％w/v。
在本发明的背景下，“终浓度”意指在稳定化的免疫原性悬浮液或溶液中的化合物浓度。
本发明的稳定化的免疫原性悬浮液或溶液可以包含终浓度为约0.1％-约0.3％w/v，特别地约0.1％-约0.25％w/v，和更特别地约0.2％w/v的酸抗氧化剂化合物。
当稳定化的免疫原性悬浮液或溶液包含至少一种填充剂时，填充剂的终浓度为约0.5％-约7.5％w/v，和有利地约1.5％-约5％w/v。
当稳定化的免疫原性悬浮液或溶液包含至少一种还原性单糖和至少一种糖醇时，还原性单糖的终浓度为约1％-约5％w/v，有利地约1.5％-约5％w/v，更有利地约1.5％-约4％w/v，和优选地约2.5％-约3％w/v，糖醇的终浓度为约0.5％-约5％w/v，和有利地约1.5％-约3％w/v，条件是还原性单糖和糖醇的混合物的终浓度等于或小于约7.5％w/v，和有利地等于约5％w/v。
当稳定化的免疫原性悬浮液或溶液包含至少一种还原性单糖和至少一种非还原性寡糖时，还原性单糖的终浓度为约1％-约5％w/v，有利地约1.5％-约5％w/v，更有利地约1.5％-约4％w/v和优选地约2.5％-约3％w/v，非还原性寡糖的终浓度为约0.5％-约5％w/v和有利地约0.5％-约2.5％w/v，条件是还原性单糖和非还原性寡糖的混合物的终浓度等于或小于约7.5％w/v，和有利地等于约5％w/v。
当稳定化的免疫原性悬浮液或溶液包含至少一种还原性单糖、至少一种非还原性寡糖和至少一种糖醇时，还原性单糖的终浓度为约1％-约5％w/v，有利地约1.5％-约5％w/v，更有利地约1.5％-约4％w/v，和优选地约2.5％-约3％w/v；非还原性寡糖的终浓度为约0.5％-约5％w/v，和有利地约0.5％-约2.5％w/v；糖醇的终浓度为约0.5％-约5％w/v，和有利地约1.5％-约3％w/v，条件是还原性单糖、非还原性寡糖和糖醇的混合物的终浓度等于或小于约12.5％w/v，有利地约10％w/v，和更有利地等于约7.5％w/v。
在某些实施方案中，将稳定剂F2、F2B、F6B、F33、F37、A、H、K或U与包含活的减毒病毒的免疫原性悬浮液或溶液，或者与包含活的减毒病毒的多价免疫原性悬浮液或溶液相混合。优选地，将1体积的F2、F2B、F6B、F33、F37、A、H、K或U稳定剂与1体积的包含活的减毒病毒的免疫原性悬浮液或溶液，或者与1体积的包含活的减毒病毒的多价免疫原性悬浮液或溶液相混合。它们在稳定化的悬浮液或溶液中的终浓度优选为初浓度的大约一半。
活的减毒疫苗或免疫原性组合物具有下述优点：它可以以低剂量施用，特别是当它是自主复制的时候；它接近地模仿受试者中的天然/野生型感染，并且它同时，即在单次施用中，给受试者提供所有可能的在免疫学上重要的抗原。
一般承认，基于活的减毒微生物的免疫原性组合物或疫苗组合物具有诱导高度有效类型的免疫应答的能力。此类免疫原性组合物或疫苗组合物具有下述优点：一旦已对动物宿主进行免疫后，病原体进入宿主内诱导较早的细胞介导的或体液的免疫的加速回忆，这能够在传染可以呈现临床上显著的比例前控制该生物的进一步生长。基于被杀死的病原体的免疫原性组合物或疫苗组合物(杀死的疫苗)在本领域中一般被认为不能或较不可能达到这种类型的应答。然而，取决于减毒水平，包含活病原体的免疫原性组合物或疫苗组合物，存在经免疫的宿主在免疫接种后可能染上正寻求针对其的保护的疾病的危险。因此这样的免疫原性组合物或疫苗组合物将是高度希望的，即所述免疫原性组合物或疫苗组合物具有活病原体的免疫接种属性，但在给受试者施用后不能引起不希望的副作用。
通过掺入广泛范围的突变可以产生活的减毒病原体，所述突变包括单核苷酸变化、位点特异性突变、插入、置换、删除或重排。取决于突变的性质，这些突变可以影响病原体基因组的小区段，例如，15-30个核苷酸，或病原体基因组的大区段，例如50-1000个核苷酸。例如，可以在消除或消弱其活性的病原体非编码调节区或元件的上游或下游引入突变，从而导致减毒表型。
可以导致病原体基因的复制下调，和/或病原体基因的转录下调的病原体基因组的非编码调节区的突变，可以导致在每轮复制中产生缺陷型病原体；即包含少于完全感染性病原体所需的基因组区域或区段的完整互补物的病原体。因此，改变的病原体将显示减毒特征，因为在每轮复制中病原体将产生比野生型病原体更有缺陷的病原体。然而，因为在每轮中合成的蛋白质、抗原或免疫原的量对于野生型病原体和缺陷型病原体来说是类似的，所以此类减毒的病原体可能能够在受试者中诱导良好的免疫应答。
当病原体基因编码结构蛋白(例如在病原体例如病毒的情况下，衣壳、基质、表面或包膜蛋白)时，在复制期间产生的颗粒数目将减少，从而突变的病原体显示出减毒特征；例如，导致亚临床水平的感染的滴度。例如，病毒衣壳表达的下降将减少在复制期间包装的核衣壳的数目，而包膜蛋白表达的下降可以减少子代病毒粒子的数目和/或感染性。备选地，复制所需的病毒酶例如聚合酶、复制酶、解旋酶等表达的下降将减少在复制期间产生的子代基因组的数目。因为在复制期间产生的感染性颗粒的数目减少，所以改变的病毒显示出减毒特征。然而，产生的抗原病毒颗粒的数目一般将足以在受试者中诱导强烈的免疫应答。
用于改造减毒病原体的备选方法涉及引入突变，包括但不限于，一种或多种氨基酸残基和/或表位插入、删除或置换到一种或多种病原体蛋白质内。这可以通过将合适的突变改造到病原体的相应基因序列中而容易地完成。本发明包括了改变病原体蛋白质的活性从而修饰或减少复制的任何变化。
例如，在减毒病毒的背景下，可以将这样的突变改造到病毒表面抗原或参与加工的病毒蛋白酶内以产生减毒株，所述突变干扰但不完全取消病毒与宿主细胞受体的附着和随之发生的感染。病毒表面抗原或毒力因子可以进行修饰以包含一个或多个氨基酸或表位的插入、置换或删除，其干扰或减少病毒抗原对于宿主细胞受体的结合亲和力。这种方法提供了附加的优点，因为可以产生表达外源或异源表位的嵌合病毒，所述嵌合病毒还显示了减毒特征。此类病毒是用作活的重组疫苗的理想候选物。
被改造到任何病毒酶内的突变包括但不限于，酶的活性位点的氨基酸序列中的插入、删除和置换。举例来说，可以改变酶的结合位点，从而减少其对其底物的结合亲和力，并且因此，该酶更不特异和/或有效。例如，选择的靶是病毒聚合酶复合物，因为温度敏感型突变存在于所有聚合酶蛋白质中。因此，可以将被引入与此类温度敏感性相关的氨基酸位置内的变化改造到病毒聚合酶基因内，从而产生减毒的病毒株。
CDV是直径约100-300nm的有包膜单链RNA病毒，并且属于麻疹病毒属。CDV病毒粒子核心包含与病毒RNA紧密相关的核蛋白(NP)肽。第二种核心肽是磷蛋白(P)。CDV包膜包含3种肽，即M蛋白(基质蛋白)和2种糖蛋白。所述糖蛋白是血凝素糖蛋白(H)和融合(F)糖蛋白。融合糖蛋白被降解成命名为F1和F2的更小亚单位。H蛋白主要负责病毒与靶细胞的吸附，和融合糖蛋白负责细胞与细胞的融合。迄今为止，所有已知的瘟热病毒分离物都包含这些共同的病毒多肽。对于犬的感染途径是通过感染性气溶胶小滴，并且该病毒的传播通过咳嗽，喷嚏和紧密拘限于温暖、潮湿、密闭的环境中而得到促进。研究暗示，病毒感染首先在上口鼻道的呼吸上皮中发生，而随后传播至深肺部薄壁组织(Gorham″Canine Distemper″，(1960)AdvanceVeterinary Science，Brandley和Jungher编辑，6：288-315)。
位于扁桃体中或沿着扁桃体中的呼吸上皮定位的组织巨噬细胞和单核细胞看起来是获得并复制CDV的第一种细胞类型。该病毒随后在血流中传播至远处的淋巴网状组织。这通过病毒血症来完成并且在最初感染后2-4天在任何地方发生。感染后8-9天之间，该病毒传播到淋巴网状组织外从而涉及上皮和间质组织(Appel，(1969)Am.J.Vet.Res.30，1167-1182)。正是在这个病毒感染阶段时，针对病毒抗原的特异性宿主免疫应答影响疾病的后果。疾病的急性致命形式的特征在于病毒不受限制地传播至身体中几乎每种组织。病毒可以在受感染的受试者中的每种排泄物和分泌物中找到，并且通过使用免疫荧光法或抗原追踪技术，在狗体内几乎每种细胞类型中可以观察到抗原的存在。对于这些动物中的大多数，最可能的死亡原因是爆发性的致命性神经病学牵涉和/或脑炎。
某些受CDV感染的狗显示出在临床上延迟的疾病进展和适度的恢复期免疫应答。临床征兆(如果存在)在疾病早期是微妙的，并且是中枢神经系统(CNS)内病毒滞留的反映。超过CNS疾病的后续发展是可变的。大多数受CDV感染的犬基本上不显示出明显的临床病病征兆并且被识别为恢复期的、在临床上正常的犬。最终从CDV感染中恢复的被活跃感染的犬已显示，在感染后第6或7天时或大约在感染后第6或7天显现出游离的循环抗病毒抗体(Krakowka，等人(1975)J.Infect.Dis.132，384-392)。在早期恢复期中滴度快速上升至高水平。
受CDV急性侵袭的狗显示可变程度的抑郁、食欲减退和发热。皮肤可以不定地是脱水的、干燥-粗糙的和无弹性的。这些动物中的一部分显示出畏光和粘液脓性眼-鼻流出物的迹象。间歇性腹泻是常见的临床征兆。在疾病的这个急性病毒血症时期期间，病毒散发到每种分泌物和排泄物中。随着疾病进展，可以发展出通常由于继发性细菌侵入物而引起的肺炎。取决于继发感染的程度或量，在这个疾病阶段中的狗具有适度的至严重的淋巴细胞减少。尽管受急性侵袭的狗可以显示出神经学征兆的基本上每种组合，但是在其最常见的表现中，狗呈现癫痫的小发作或大发作。这些惊厥性发作随着时间过去而发生并且频率逐渐增加。
犬瘟热的第二种神经学形式是伴随老狗脑炎(old dogencephalitis，ODE)发生的那种，或在亚临床感染和看似恢复后发生的那种。CNS征兆在表现方面可以是非常不同的，并且可以被误认为脑肿瘤、头创伤、细菌性脑膜炎、脑积水和脊髓盘疾病(spinal corddisc disease)。CDV感染在狗中的主要非神经性表现是CDV相关的免疫抑制(Krakowka，等人(1980)Am.J.Vet.Res.41，284-292)。狗瘟热病毒感染的许多征兆可归因于在这种虚弱动物中出现的同时发生的继发性感染过程。
狗中的疾病还可以与细菌病原体相关，例如肺部细菌物种，包括但不限于，支气管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)、巴斯德氏菌属(Pasteurella)物种、葡萄球菌属(Staphylococcus)物种和链球菌属(Streptococcus)物种。这些细菌在受CDV感染的狗中是造成临床上显著的化脓性结膜炎、鼻炎和支气管肺炎的原因。主要是呼吸型的混合型病毒感染也是常见的。除了犬腺病毒I I感染之外，呼肠孤病毒、犬副流感病毒和可能其他病毒例如犬疱疹病毒，都可以参与双重或多重混合型感染。
cPi2是诱导呼吸系统疾病的RNA病毒，所述呼吸系统疾病是最常遇到的狗病毒疾病之一。当副流感病毒、犬腺病毒-2和支气管炎博德特氏菌的组合一起出现时，导致“犬舍咳(kennel cough)”。cPi2还引起在某些动物中导致渗出性肺炎的气管支气管炎。咳嗽的征兆在暴露于病毒后7-9天发生。临床征兆是轻微的并且具有短持续时间除非发生继发感染。
cPi2是球状的有包膜病毒，平均直径为150-200nm，具有由脂双层包围的螺旋核衣壳，所述脂双层由糖蛋白刺突(spikes)覆盖。每个病毒颗粒包含单链的非节段的负义RNA基因组，具有核蛋白(NP)和磷蛋白(P)和大(L)蛋白。cPi2感染通过吸入受感染的呼吸飞沫核而获得。鼻和鼻咽是主要的感染部位。该病毒主要通过经由血凝素-神经氨酸酶蛋白质附着至这些区域的纤毛上皮细胞来起始感染，所述血凝素-神经氨酸酶蛋白质与宿主细胞中的神经氨酸受体特异性地结合。随后，该病毒经过由F1和F2受体介导的与细胞膜的融合而进入细胞。该病毒在细胞内和细胞外繁殖并侵入其他细胞。病毒繁殖在气管细支气管组织各处发生，引起粘液产生增强。
喉气管炎是喉和气管的炎症，当在狗中发生时这通常被称为“犬舍咳”。主要症状是表现为短的干“咳”或一系列此类咳嗽的咳嗽。在其最严重时，该咳嗽可以是爆发性的，并且感染涉及整个呼吸道，通常产生肺炎。该咳嗽还表征为深的、持续的、非排痰性的，并且一般伴随流眼泪和鼻涕。温度可以是正常的，尽管它一般是升高的。该疾病的发作可以是突然的并且可以没有预先征兆而发生。因为该疾病是非常具有接触感染性的，所以受感染的狗应当被隔离以防止整个群体的感染。该疾病对狗舍所有者产生较大的经济损失，并且尽管通常不是致命的，但它可以使狗变虚弱，从而产生由于其他疾病引起的严重效应。
活的cPi2病毒和其他病毒例如CDV、狗腺病毒2型(CAV2)和狗细小病毒(CPV)可以在动物组织培养物中进行繁殖，直至两者病毒变为非致病的，即所述病毒变为灭活的或者减毒的。cPi2病毒能够在广泛多样的组织培养系统中繁殖，例如，鸡胚胎、鸭胚胎、猪肾、猪睾丸、胚胎牛肾、猫肾、犬肾和猴肾；以及还能够在建立的细胞系中繁殖，例如马-达二氏牛肾(MDBK)、马-达二氏犬肾(MDCK)和SerumInstitute兔角膜(SIRC)。
对于例如犬腺病毒2型(CAV2)的繁殖，肾组织培养物是优选的，特别是衍生自牛和犬的那些，因为CAV2不像cPi2病毒那样在其他动物组织培养系统中有利地复制。每种病毒的减毒作用可以通过标准连续传代(包括末端稀释传代技术)来完成，其中可以使用在易感组织培养物中足够数目的传代，直至该病毒变为非致病的而不丧失免疫原性。由其制备的免疫原、免疫原性组合物或免疫原性悬浮液或溶液可以在对疾病易感的狗中刺激免疫应答，而不产生任何显著程度的通常由于毒力因子而引起的临床症状。繁殖可以在与如上所述的相同或不同的组织中进行。
传代时间间隔应当足以允许病毒在传与代之间复制，并且温育温度优选维持于约30℃-约38℃。最佳的传代时间间隔取决于所使用的具体培养系统和温度。在任何情况下，病毒的充分复制是否已发生可以通过下述方式容易地进行确定：通过标准技术例如Shelokov，A.(1958)Proc.Soc.Exp.Biol.Med.97，802中描述的血细胞吸附技术(其对于cPi2病毒特别有用)，或者通过致细胞病变观察，例如通过允许病毒在特定传代过程中在这样的点之前生长，在所述点时可以在持续温育同时观察到肉眼可见的致细胞病变效应。
有利的繁殖方法利用犬肾细胞，特别是连续MDCK细胞系。例如，为了免疫原性或疫苗目的，可以以约3天的间隔和约30℃-约38℃的温育温度进行来自通过病毒的狗肾组织培养的分离过程的约至少15代且优选约20-约45代。优选使用较高的传代材料，因为这将有利于在有此需要的受试者中产生有利的免疫应答。
在制备免疫原性组合物或疫苗组合物中，有毒力的CDV可以在培养的哺乳动物细胞中在常规的病毒生长条件下进行生长。宿主细胞可以在细胞种植时用病毒进行接种，或当细胞单层达到90-100％汇合时用包含CDV的培养基替换物进行接种。感染复数(MOI)比率可以为约0.001-约0.05，优选约0.01。任何合适的哺乳动物细胞生长培养基可以用于产生所述病毒，例如但不限于Eagle极限必需培养基、Dulbecco改良的Eagle培养基、Iscove改良的Dulbecco培养基、Ham′sF12培养基、F15培养基、RPMI 1640培养基，其包含约0％-约10％的动物血清例如胎牛血清、小牛血清、马血清、犬血清等，补充物例如L-谷氨酰胺以及必需和非必需的其他氨基酸、Hanks平衡盐溶液(HBSS)、Earle盐溶液、丙酮酸钠、碳酸氢钠、胰岛素、转铁蛋白以及抗生素和抗真菌剂，例如但不限于庆大霉素、青霉素、链霉素、多粘菌素B、两性霉素和
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本发明还包括无血清的细胞培养基。
在接种后，将感染的细胞培养物维持于约35℃-约40℃的温度下约2-约7天，在这时可以收获病毒。受感染的培养物可以用细胞生长培养基进行接种，其可以在2-5天的另外温育期后进行收获。将病毒流体收获到无菌容器中并且可以通过过滤进行澄清。病毒流体可以使用常规的超滤技术(例如，Millipore Pellicon系统)进一步浓缩，使用具有105道尔顿的颗粒大小排阻极限的过滤器。
可以与本发明的稳定剂相混合的其他活的减毒病毒包括但不限于，狂犬病病毒，流感病毒，副流感病毒，腮腺炎病毒，腺病毒例如犬腺病毒2型(CAV2)，呼吸道合胞病毒，EB病毒，鼻病毒，痘病毒例如痘苗病毒，猪痘病毒，浣熊痘病毒，禽痘病毒例如鸡痘病毒，金丝雀痘病毒，鸽痘病毒(dovepox)，家鸽痘病毒(pigeonpox)，脊髓灰质炎病毒，柯萨奇病毒、艾柯病毒、冠状病毒，麻疹病毒，风疹病毒，水痘-带状疱疹病毒，疱疹病毒(人和动物)，单纯疱疹病毒，细小病毒例如犬细小病毒(CPV)，巨细胞病毒，肝炎病毒例如犬接触感染性肝炎病毒，人乳头瘤病毒，甲病毒例如塞姆利基森林病毒，辛德毕斯病毒，罗斯河病毒，东方马脑炎病毒，西方马脑炎病毒，委内瑞拉马脑炎病毒，奥尼永尼永病毒，黄病毒例如登革热病毒和西尼罗河病毒，布亚病毒，沙粒病毒，轮状病毒，嗜肝DNA病毒例如正嗜肝DNA病毒和禽嗜肝DNA病毒，线状病毒，逆转录病毒例如猪内源性逆转录病毒，HTLV-1，HTLV-2，FeLV，BLV，MLV，MMSV，Mason-Pfizer猴病毒，慢病毒例如HIV-1，HIV-2，FIV，SIV，BIV，猫杯状病毒，猫全白细胞减少症病毒，猫感染性腹膜炎病毒，猫鼻气管炎病毒，TGE病毒(猪)和口蹄疫病毒。
将包含例如犬副粘病毒的免疫原性组合物或悬浮液或溶液与根据本发明的稳定剂相混合，以形成稳定化的免疫原性悬浮液或溶液。优选地，将1体积的犬副粘病毒悬浮液或溶液与1体积的稳定剂相混合。
本发明的稳定剂还可以用于稳定多价免疫原性悬浮液或溶液，其可以包含例如犬副粘病毒免疫原性悬浮液或溶液，和来源于或衍生自除副粘病毒外的其他病原体的至少一种活性免疫原性组分。本文所定义的活性免疫原性组分可以包含活的减毒病原体，例如活的减毒病毒、细菌、真菌或寄生虫。然而，活性免疫原性组分还可以包括被杀死的病毒、重组的异源免疫原、抗原、衍生自或来源于本文描述的一种或多种病原体的免疫原或抗原的免疫原性亚单位(例如蛋白质、多肽、肽、表位、半抗原)或表位，其可以从病毒载体、细菌载体、质粒载体等表达。
本发明的活性免疫原性组分可以包括选自犬病原体的一种或多种免疫原，所述犬病原体包括但不限于，狂犬病病毒、犬腺病毒2型(CAV2)、犬疱疹病毒(CHV)、犬细小病毒(CPV)、犬冠状病毒、犬钩端螺旋体(Leptospira canicola)、出血黄疸钩端螺旋体(Leptospira icterohaemorrhagiae)、流感伤寒钩端螺旋体(Leptospira grippotyphosa)、布氏疏螺旋体(Borreliaburgdorferi)、支气管炎博德特氏菌等，包括其组合。
活性免疫原性组分可以尤其包括来自CDV的HA、F、NP基因，来自CPV的衣壳基因，来自犬冠状病毒的刺突、M、N基因，来自cPi2的HN和F基因，来自钩端螺旋体的基因，来自博德特氏菌的基因，来自疏螺旋体的基因，以及来自犬疱疹病毒的gB、gC和gD基因。这些组分可以用作免疫原性组合物或疫苗组合物，以用于保护犬不患由这些病原体引起的疾病。
犬腺病毒2型(CAV2)是分布广泛的并且对于犬是高度接触传染的。它产生类似感冒的症状。一般地，该接触传染性疾病的第一种征兆是发热，这通常在1-2天内消退。受侵袭的狗可以具有扁桃体炎、腹部触痛、肝肿大、呕吐和腹泻。急性疾病通常是致命的。CAV2可以被灭活或减毒并且与CDV(和/或cPi2)相组合，以产生多价疫苗。备选地，可以使用CAV2的免疫原或抗原，或CAV2免疫原的表位，例如衣壳、基质或六邻体蛋白。
犬细小病毒(CPV)是可以在幼犬中引起呕吐、腹泻、胃肠炎、心肌炎和肝炎的常见肠病毒。它已被发现在狗中是分布广泛的。CPV可以作为灭活的，活的减毒的，或CPV免疫原，抗原，或CPV免疫原的表位，例如VP1、VP2(衣壳)基因产物，存在于本发明的免疫原性组合物、悬浮液或溶液中。
狗的2种常见的细菌感染也可以以其减毒形式在本发明的稳定化的免疫原性组合物、悬浮液或溶液中相组合；这些是犬钩端螺旋体和出血黄疸钩端螺旋体。钩端螺旋体感染(Lepto infections)在狗中是常见的，并且特别是在受CDV、cPi2或如在患有犬瘟热或犬舍咳的狗中经常观察到的病毒组合感染的狗中是常见的，因此将它们包括在本发明的稳定化的免疫原性组合物、悬浮液或溶液具有显著效用。
在本发明的组合物和方法中有用的其他活性免疫原性组分可以包括选自禽病原体的一种或多种免疫原，所述禽病原体包括但不限于，鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)，肠炎沙门菌(Salmonellaenteritidis)，感染性支气管炎病毒(IBV)，新城疫病毒(NDV)，产蛋下降综合征病毒(EDS)，感染性粘液囊病病毒(IBDV)，火鸡病毒，禽流感病毒，马立克氏病病毒，疱疹病毒例如感染性喉气管炎病毒，禽感染性支气管炎病毒，禽呼肠孤病毒，痘病毒包括禽痘，鸡痘，金丝雀痘，家鸽痘，鹌鹑痘和鸽痘，禽多瘤病毒，禽肺病毒，禽鼻气管炎病毒，禽网状内皮组织增生病病毒，禽逆转录病毒，禽内源性病毒，禽成红细胞增多症病毒，禽肝炎病毒，禽贫血症病毒，禽肠炎病毒，Pacheco病病毒，禽白血病病毒，禽细小病毒，禽轮状病毒，禽造白细胞组织增生病病毒，禽肌腱膜纤维肉瘤病毒，禽成髓细胞白血症病毒，禽成髓细胞白血症相关病毒，禽髓细胞瘤病毒，禽肉瘤病毒，禽脾坏死病毒，及其组合。
关于具体的免疫原，活性免疫原性组分还可以是新城疫病毒的HN和F基因，来自感染性粘液囊病病毒的多蛋白和VP2基因，来自感染性支气管炎病毒的S和N基因，以及来自马立克氏病病毒的gB和gD基因。这些组分可以用作免疫原性组合物或疫苗组合物，以用于保护禽类不患由这些病原体引起的疾病。
备选地，活性免疫原性组分包含来自猫病原体的一种或多种免疫原，所述猫病原体例如为但不限于，猫疱疹病毒(FHV)、猫杯状病毒(FCV)、猫白血病病毒(FeLV)、猫感染性腹膜炎病毒、猫全白细胞减少症病毒、猫免疫缺陷病毒(FIV)、狂犬病病毒等，及其组合。
活性免疫原性组分还可以包括来自猫疱疹病毒的gB、gC和gD基因，来自FeLV的env和gag/pro基因，来自FIV病毒的env、gag/pol和tat基因，来自猫杯状病毒的衣壳基因，来自猫感染性腹膜炎病毒的S修饰基因、M和N基因，和来自猫细小病毒的VP2基因。这些组分可以用作免疫原性或疫苗组合物，以用于保护猫不患由这些病原体引起的疾病。
活性免疫原性组分可以包括来自马病原体的一种或多种免疫原，所述马病原体例如为马疱疹病毒(1型或4型)、马流感病毒、马脑脊髓炎病毒(EEV)、破伤风、西尼罗河病毒等或其组合。
活性免疫原性组分还可以包括来自马疱疹病毒1型的gB、gC、gD和即时早期基因，来自马疱疹病毒4型的gB、gC、gD和即时早期基因，来自马流感病毒的HA、NA、M和NP基因，来自东方马脑炎病毒的基因，来自西方马脑炎病毒的基因，来自委内瑞拉马脑炎病毒的基因，来自西尼罗河病毒的prM--M-E基因，以及来自马动脉炎病毒的基因，但不限于这些序列。这些组分可以用作免疫原性组合物或疫苗组合物，以用于保护马不患由这些病原体引起的疾病。
活性免疫原性组分可以包括来自牛病原体的一种或多种免疫原，所述牛病原体例如为狂犬病病毒、牛轮状病毒、牛副流感病毒3型(bCPI2-3)、牛冠状病毒、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、口蹄疫病毒(FMDV)、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、感染性牛鼻气管炎病毒(IBR)、大肠杆菌(Escherichia coli)、多杀巴斯德氏菌(Pasteurellamultocida)、溶血巴斯德氏菌(Pasteurella haemolytica)等，及其组合。
活性免疫原性组分还可以选自牛疱疹病毒1型的gB、gC、gD和即时早期基因，来自BRSV的F和G基因，来自BVDV的多蛋白、E1、E2基因，来自PI3病毒的HN和F基因或来自轮状病毒的基因。这些组分可以用作免疫原性或疫苗组合物，以用于保护牛不患由这些病原体引起的疾病。
进一步地，活性免疫原性组分可以包括来自猪病原体的一种或多种免疫原，所述猪病原体例如为但不限于，猪流感病毒(SIV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒(HCV)、FMDV、猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)、猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、多杀巴斯德氏菌、支气管炎博德特氏菌、大肠杆菌等，及其组合。
活性免疫原性组分还可以包括来自PRV的gB、gC、gD和即时早期基因，来自猪流感病毒的HA、NA、M和NP基因，来自猪瘟病毒的多蛋白、E1、E2，来自PCV2病毒的ORF1和ORF2基因，来自PRRSV病毒的ORF3、ORF4、ORF5、ORF6或ORF7，或来自猪肺炎支原体的基因。这些组分可以用作免疫原性组合物或疫苗组合物，以用于保护猪不患由这些病原体引起的疾病。
活性免疫原性组分可以包括编码在病原体中表达的蛋白质的序列，所述病原体尤其是例如RNA或DNA病毒，如HIV、HCV、HBV、HPV、EBV、HSV、CMV、HTLV、汉坦病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、立夫特山谷热病毒、拉沙病毒和流感病毒、出血性肠炎病毒(HEV)、感染性鼻气管炎病毒(IBRV)。此类免疫原可以有利地用作免疫原性组合物或疫苗组合物，以保护受试者例如人不患由这些病原体引起的疾病。
活性免疫原性组分还可以例如来自下述病原菌中的任何一种及其抗原：尤其是放线杆菌属(Actinobacillus)物种例如胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)，百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)，副百日咳博德特氏菌(Bordetellaparapertussis)，支气管炎博德特氏菌，鸟博德特氏菌(Bordetellaavium)，砂眼衣原体(Chlamydia trachomatis)，肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)，鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)，克雷伯氏菌属(Klebsiella)物种例如肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)，结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)，假结核分枝杆菌(Mycobacterium pseudotuberculosis)，肺炎分枝杆菌(Mycobacterium pneumoniae)，A群链球菌(Streptococcus)，马链球菌(Streptococcus equi)，肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)，无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)，酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)，绿色链球菌(Streptococcusviridans)，淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)，丹毒丝菌属(Erysipelothrix)物种，肠产毒性大肠杆菌，霍乱弧菌(Vibriocholerae)，炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)，流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)，睡眠嗜血菌(Haemophilus somnus)，副猪嗜血菌(Haemophilus parasuis)，沙门氏菌属(Salmonella)物种，阿哥纳沙门氏菌(Salmonella agona)，布洛克兰沙门氏菌(Salmonella blockley)，肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)，哈达尔沙门氏菌(Salmonella hadar)，海德尔堡沙门氏菌(SalmonellaHeidelberg)，蒙得维的亚沙门氏菌(Salmonella montevideo)，森夫顿堡沙门氏菌(Salmonella senftenberg)，猪霍乱沙门氏菌(Salmonella cholerasuis)，立克次氏体属(Rickettsia)物种，幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)，猫螺杆菌(Helicobacterfelis)，志贺氏菌属(Shigella)物种，李斯特氏菌属(Listeria)物种，肺炎军团菌(Legionella pneumoniae)，假单胞菌属(Pseudomonas)物种，疏螺旋体属(Borrelia)物种，布氏疏螺旋体(Borellia burgdorferi)，脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitides)，梭菌属(Clostridium)物种，难辨梭菌(Clostridiumdifficile)，解脲尿支原体(Ureaplasma urealyticum)，葡萄球菌属(Staphylococcus)物种，金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，鼠疫巴斯德氏菌(Pasteurella pestis)，弯曲杆菌属(Campylobacter)物种，空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)，密螺旋体属(Treponema)物种，钩端螺旋体属(Leptospira)物种，白喉棒杆菌(Corynebacteriumdiphtheria)，杜氏嗜血菌(Hemophilus ducreyi)，流感嗜血杆菌，埃里希氏体(Ehrlichia)物种。
活性免疫原性组分还可以衍生自真菌或霉菌，例如黄曲霉(Aspergillus flavus)，烟曲霉(Aspergillus fumigatus)，青霉菌属(Penicillium)物种，镰刀菌属(Fusarium)物种，假丝酵母属(Candida)物种例如Candida trichophyton，近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)，光滑假丝酵母(Candida glabrata)，杜氏假丝酵母(Candida dubliniensis)和白色假丝酵母(Candidaalbicans)，根霉属(Rhizopus)物种，隐球酵母属(Cryptococcus)物种例如新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)，Cryptococcusgrubii，Cryptococcus gattii，巴西副球孢子菌(Paracoccidioidesbrasiliensis)，荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)，以及其他真菌和霉菌。
活性免疫原性组分还可以选自衍生自寄生虫物种的寄生虫抗原，所述寄生虫物种包括但不限于，尤其是疟原虫属(Plasmodium)物种，锥虫属(Trypanosome)物种，贾第虫属(Giardia)物种，牛蜱属(Boophilus)物种，巴贝虫属(Babesia)物种，内变形虫属(Entamoeba)物种，艾美虫属(Eimeria)物种，利什曼虫属(Leishmania)物种，裂体吸虫属(Schistosoma)物种，布鲁线虫属(Brugia)物种，片形吸虫属(Fasciola)物种，恶丝虫属(Dirofilaria)物种，吴策线虫属(Wuchereria)物种，盘尾丝虫属(Onchocerca)物种，密螺旋体属物种，弓浆虫属(Toxoplasma)物种，隐球酵母属物种，球虫亚纲(Coccidia)物种，组织滴虫属(Histomoniasis)物种，六鞭毛虫属(Hexamitiasis)物种，贾第虫属物种；尤其是线虫类包括蛔虫属(Ascaris)物种，旋毛虫属(Trichinella)物种等，蠕虫例如吸虫，绦虫；以及其他如病原生物。用于制备衍生自病毒、细菌、真菌、霉菌、原生动物、线虫和蠕虫的免疫原的方法是本领域已知的。
其他有用的免疫原可以是例如纯化的分泌的抗原毒力因子，例如毒素、细胞毒素等。可以通过修饰来进行去毒的毒素抗原(类毒素)，其可以与佐剂例如氢氧化铝组合施用，并且可以用于刺激毒素中和抗体的形成。可以用作免疫原的毒素的例子包括细菌内毒素和外毒素例如脂多糖，肠毒素(包括热不稳定肠毒素(LT)、热稳定肠毒素(ST)、Vero细胞毒素(VT)等)。细菌外毒素免疫原被分泌到周围介质中，并且包括例如白喉毒素(白喉棒杆菌)，破伤风毒素(破伤风梭菌(Clostridium tetani))，由金黄色葡萄球菌分泌的肠毒素，肉毒杆菌毒素(肉毒梭菌(Clostridium botulinum))；和由藻类产生的毒素例如神经毒素；等等。通过细菌自溶而释放的热稳定肠毒素包括，例如由革兰氏阴性霍乱弧菌释放的霍乱毒素，由肠道细菌例如大肠杆菌产生的大肠菌素(细菌素)。
衍生自或来源于病毒、细菌、真菌等的免疫原可以使用合适的培养基或宿主细胞系和本领域普通技术人员众所周知的常规方法通过体外培养方法来产生。例如，PRRSV可以在合适的细胞系例如MA-104细胞系中进行培养(参见尤其是美国专利号5,587,164；5,866,401；5,840,563；6,251,404)。以类似方式，PCV-2可以使用PK-15细胞系进行培养(参见美国专利号6,391,314)；SIV可以在蛋上进行培养(美国专利号6,048,537)；和猪肺炎支原体可以在合适的培养基中进行培养(美国专利号5,968,525；5,338,543；Ross R.F.等人(1984)Am.J.Vet.Res.45：1899-1905)。有利地，CDV可以在貂肺细胞中进行培养，例如美国专利号5,178,862中描述的那些。用于制备病毒衍生免疫原的其他技术是本领域已知的，并且例如在Ulmer等人，Science 259：1745(1993)；Male等人，Advanced Immunology，第14.1-14.15页，J.B.Lippincott Co.，Philadelphia，Pa.(1989)中得到描述。
也有用的是模拟抗原肽序列的免疫原性合成肽。此类免疫原可以使用如例如在R.B.Merrifield，Science 85：2149-2154(1963)中描述的固相技术来合成，纯化，并任选地使用双官能偶联剂例如戊二醛等与载体蛋白相偶联，所述载体蛋白例如为胞壁酰二肽(MDP)、牛血清白蛋白(BSA)、匙孔血蓝蛋白(KLH)等。
合成抗原也可以被包括在例如多表位，侧翼表位和其他重组或合成衍生抗原的定义内。参见，例如，Bergmann等人(1993)Eur.J.Immunol.23，2777-2781；Bergmann等人(1996)J.Immunol.157，3242-3249；Suhrbier，A.(1997)Immunol.Cell Biol.75，402-408；Gardner等人(1998)12th World AIDS Conference，Geneva，Switzerland，1998年6月28日-7月3日。为了本发明的目的，免疫原性片段通常可以包含分子的至少约3个氨基酸、优选地至少约5个氨基酸、更优选地至少约10-15个氨基酸、和最优选地25个或更多个氨基酸。关于片段的长度没有严格的上限，它可以包含几乎全长的蛋白质序列，或甚至包含所述蛋白质的2个或更多个、或至少一个表位的融合蛋白。
因此，表达表位的核酸的最低限度结构可以包含编码蛋白质或多蛋白的表位、免疫原或抗原的核苷酸。编更有利地，码总蛋白质或多蛋白的片段的核酸包含编码总蛋白质或多蛋白的序列的最低限度约21个核苷酸，有利地至少约42个核苷酸，和优选地至少约57个、约87个或约150个连续或邻接核苷酸，或基本上由所述核苷酸组成，或由所述核苷酸组成。无需过度实验，可以在本发明的实践中使用表位测定操作程序例如，产生重叠肽文库(Hemmer B.等人(1998)Immunology Today 19(4)，163-168)、Pepscan(Geysen等人(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81，3998-4002；Geysen等人(1985)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 82，178-182；Van der Zee R.等人(1989)Eur.J.Immunol.19，43-47；Geysen H.M.，(1990)Southeast AsianJ.Trop.Med.Public Health 21，523-533；
Figure A20068004302900391
PeptideSynthesis Kits de Chiron)和算法(De Groot A.等人(1999)Nat.Biotechnol.17，533-561)，以及在PCT申请序列号PCT/US2004/022605中；所有所述参考文献通过提及整体合并入本文。关于测定免疫原或抗原的表位并因此测定编码此类表位的核酸分子的方法，还可以参考本文引用和合并入的其他文献。
在本发明中，活性免疫原性组分还可以包括治疗剂、细胞因子、毒素、免疫调节剂、蛋白质、肽、抗体、抗体的抗原结合片段、佐剂、或可由DNA编码并且对于递送给动物或动物细胞或组织来说所希望的任何其他分子。
本发明还考虑了在本发明的免疫原性组合物和疫苗组合物中包括反义、催化性或小干扰RNA种类，其可以靶向地针对存在于受者细胞内，或可能存在于受者细胞内的任何分子。这些包括但不限于，编码细胞调节分子例如白介素-6的RNA种类，癌症致病因子例如人乳头瘤病毒，酶，病毒RNA和病原体衍生的RNA，例如HIV-1RNA。RNA还可以靶向非转录的DNA序列，例如启动子或增强子区，或者靶向受者细胞中存在的任何其他分子，例如但不限于，参与DNA合成的酶或tRNA分子。
此外，细胞因子和免疫调节剂可以在本发明的免疫原性组合物和疫苗组合物中共表达。例子包括但不限于，IL-2、IL-4、TNF-α、GM-CSF、IL-10、IL-12、IGF-1、IFN-α、IFN-β和IFN-γ。
可以将特异性的序列基序例如RGD基序插入到病毒或质粒载体的H-I环内，以增强其感染性。该序列已显示是某些细胞外基质和粘着蛋白与称为整联蛋白的细胞表面受体超家族相互作用所必需的。RGD基序的插入可以有利地在无免疫应答的受试者中是有用的。通过将特异性抗原或免疫原或其片段克隆到任何载体例如本文描述的那些中可以构建重组载体。所述重组载体可以用于转导脊椎动物的细胞以用作免疫剂。(参见，例如，通过提及合并入本文中的美国专利申请序列号10/424,409)。
优选地，编码活性免疫原性组分例如抗原、免疫原和表位的密码子是“优化的”密码子，即该密码子是在即高度表达的犬类基因中频繁出现的那些，而不是被例如CDV或cPi2常用的那些密码子。此类密码子的使用提供了活性免疫原性组分在细胞中的有效表达。在其他实施方案中，例如，当活性免疫原性组分在细菌、酵母或其他表达系统中进行表达时，密码子使用模式被改变从而关于在其中表达抗原或免疫原的生物中高度表达的基因表现出密码子偏爱。关于许多物种的高度表达基因的密码子使用模式在文献中是已知的(例如，Nakamura等人，1996；Wang等人，1998；McEwan等人，1998)。
在某些情况下，可能必需修改编码序列从而使得它可以与具有合适方向的控制序列连接；即，以维持合适的读码框。还可以希望产生所需活性免疫原性组分的突变体或类似物。通过删除编码蛋白质的序列的一部分，通过插入序列，和/或通过置换序列内的一个或多个核苷酸可以制备突变体或类似物。用于修饰核苷酸序列的技术例如定点诱变在例如Sambrook等人(同上)；DNA Cloning(同上)；Nucleic AcidHybridization(同上)中得到描述。
用作根据本发明的活性免疫原性组分的免疫原可以被包含在载体中。此类载体包括但不限于，体内重组表达载体例如核酸载体或质粒(EP申请号1001025；Chaudhuri P，(2001)Res.Vet.Sc i.70，255-6)，病毒载体例如但不限于腺病毒载体、痘病毒载体例如鸡痘(美国专利序列号5,174,993；5,505,941；和5,766,599)和金丝雀痘病毒载体(美国专利序列号5,756,103)、逆转录病毒载体、疱疹病毒载体、基于甲病毒的载体，真菌载体，或细菌载体(大肠杆菌或沙门氏菌属物种)。在本发明中有用的载体的具体例子在本文中得到描述。
载体可以是包含至少一种活性免疫原性组分或其表位或其片段的病毒载体，有利地禽痘病毒载体。在一个特别有利的实施方案中，禽痘病毒载体是金丝雀痘病毒载体，有利地，减毒的金丝雀痘病毒载体例如ALVAC。减毒的金丝雀痘病毒在美国专利号5,756,103(ALVAC)和WO01/05934中得到描述。禽痘病毒载体可以是鸡痘病毒载体，有利地，减毒的鸡痘病毒载体例如TROVAC。还可以参考涉及减毒的鸡痘病毒毒株TROVAC的美国专利号5,766,599。在这点上，可以参考在登记号VR-111下可从ATCC获得的金丝雀痘病毒。许多鸡痘病毒免疫接种毒株也是可获得的，例如，由Merial销售的DIFTOSEC CT毒株，和由Intervet销售的NOBILIS VARIOLE疫苗；并且，还可以参考涉及减毒的鸡痘病毒毒株TROVAC的美国专利号5,766,599。
也可用于递送活性免疫原性组分的病毒载体包括痘病毒，例如痘苗病毒或减毒的痘苗病毒(例如，MVA，其是Ankara疫苗株在鸡胚成纤维细胞上传代超过570次后获得的修饰的Ankara株；参见Stickl &Hochstein-Mintzel，(1971)Munch.Med.Wschr.113，1149-1153；Sutter等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89，10847-10851；可作为ATCC VR-1508获得；或NYVAC，参见美国专利号5,494,807，例如讨论了NYVAC的构建的美国专利号5,494,807的实施例1-6，以及NYVAC的变异体，其具有从Copenhagen株痘苗病毒基因组中删除的另外ORF，和将异源核酸编码序列插入到这种重组体的位点内，还使用匹配的启动子；也可参见WO96/40241)，禽痘病毒或减毒的禽痘病毒(例如，金丝雀痘、鸡痘、鸽痘、牛痘、家鸽痘、鹌鹑痘、ALVAC或TROVAC；参见，例如美国专利号5,505,941、5,494,807)，猪痘，浣熊痘，骆驼痘，或粘液瘤病病毒。
关于用于产生其重组体以及如何施用其重组体的方法的信息，技术人员可以参考本文引用的文献和WO90/12882，例如关于痘苗病毒，尤其可以提及美国专利号4,769,330、4,722,848、4,603,112、5,110,587、5,494,807和5,762,938；关于鸡痘，尤其可以提及美国专利号5,174,993、5,505,941和US-5,766,599；关于金丝雀痘，尤其可以提及美国专利号5,756,103；关于猪痘，尤其可以提及美国专利号5,382,425；和关于浣熊痘，尤其可以提及WO00/03030。
当表达载体是痘苗病毒时，用于待表达的一种或多种核酸的一个或多个插入位点有利地在胸苷激酶(TK)基因或插入位点、血凝素(HA)基因或插入位点、编码A型内含体(ATI)的区域处，所述核酸编码活性免疫原性组分例如免疫原、抗原、表位等；还可参见本文引用的文献，特别是涉及痘苗病毒的那些。在金丝雀痘的情况下，有利地所述一个或多个插入位点是ORF C3、C5和/或C6；还可参见本文引用的文献，特别是关于金丝雀痘病毒的那些。在鸡痘的情况下，有利地所述一个或多个插入位点是ORF F7和/或F8；还可参见本文引用的文献，特别是涉及鸡痘病毒的那些。关于MVA病毒区域的所述一个或多个插入位点有利地如在各种出版物中一样，包括Carroll M.W.等人(1997)Vaccine 15(4)，387-394；Stittelaar K.J.等人(2000)J.Virol.，2000，74(9)，4236-4243；Sutter G.等人(1994)Vaccine 12(11)，1032-1040；并且，在这点上还应当指出完整MVA基因组在Antoine G.，(1998)Virology 244，365-396中得到描述，所述参考文献使得技术人员能够使用其他插入位点或其他启动子。
有利地，待表达的核酸可以插入置于特异性痘病毒启动子的控制下，例如，尤其是痘苗启动子7.5kDa(Cochran等人(1985)J.Virology54，30-35)、痘苗启动子I3L(Riviere等人(1992)J.Virology 66，3424-3434)、痘苗启动子HA(Shida，(1986)Virology 150，451-457)、痘苗启动子42K(Cooper J.A.等人，(1981)J.Virol.37(1)，284-94)、牛痘启动子ATI(Funahashi等人(1988)J.Gen.Virol.69，35-47)、痘苗11K启动子(美国专利号5,017,487)、痘苗启动子H6(Taylor J.等人(1988)Vaccine 6，504-508；Guo P.等人(1989)J.Virol.63，4189-4198；Perkus M.等人(1989)J.Virol.63，3829-3836)、或合成的痘苗或痘病毒启动子。
有利地，对于哺乳动物的免疫接种，表达载体可以是金丝雀痘或鸡痘载体。以这种方式，可以存在具有有限的或非生产性复制的异源蛋白质的表达。
可用于递送并表达活性免疫原性组分的另一种病毒载体是腺病毒。腺病毒是无包膜的DNA病毒。衍生自腺病毒的载体具有使得它们特别可用于基因转移的许多特征。重组腺病毒载体是携带一种或多种异源核苷酸序列(例如，2种、3种、4种、5种或更多种异源核苷酸序列)的腺病毒载体。例如，详细地表征了腺病毒的生物学，该病毒在将其DNA引入宿主细胞内方面是极其有效的，该病毒可以感染广泛多样的细胞并且具有广泛的宿主范围，该病毒可以以大的量并且相对容易地产生，并且该病毒可以通过病毒基因组的早期区1(“E1”)中的缺失而变成复制缺陷的。
与例如逆转录病毒不同，腺病毒不会整合到宿主细胞的基因组内，能够感染非分裂性的细胞，并且能够在体内有效转移重组基因(Brody等人，1994)。这些特征使得腺病毒成为用于将例如目的异源核酸体内基因转移到有此需要的细胞、组织或受试者内的吸引人的候选物。
包含多重缺失的腺病毒载体是优选的，以增加载体的容纳量，并且减少产生可复制腺病毒(RCA)的重组可能性。当腺病毒包含多重缺失时，每种缺失在单独存在时不一定必需产生复制缺陷型腺病毒。只要这些缺失之一使得腺病毒变成复制缺陷的，就可以包括另外的缺失用于其他目的，例如，用于增加腺病毒基因组对于异源核苷酸序列的容纳量。优选地，超过一种的缺失阻止功能蛋白质的表达，并且使得腺病毒变成复制缺陷的。更优选地，所有缺失都是将会使得腺病毒变成复制缺陷的缺失。
使用腺病毒重组体的本发明的实施方案可以包括E1缺陷或删除的，E3缺陷或删除的，和/或E4缺陷或删除的腺病毒载体，或者其中所有病毒基因被删除的“空”腺病毒载体。腺病毒载体可以包含在E1、E3或E4基因中的突变，或者在这些或所有腺病毒基因中的缺失。E1突变增加了载体的安全限度，因为E1缺陷型腺病毒突变体据说在非许可细胞中是复制缺陷的，并且至少来说是高度减毒的。E3突变通过破坏这样的机制来增强抗原的免疫原性，腺病毒通过此机制下调I类MHC分子。E4突变通过抑制晚期基因表达来降低腺病毒载体的免疫原性，从而可以允许利用相同载体进行重复的再次免疫接种。本发明考虑了在E1、E3、E4、E1和E3、以及E1和E4中进行了删除或突变的任何血清型或血清群的腺病毒载体。
“空”腺病毒载体是腺病毒载体家族中的最新模型，并且衍生自人腺病毒序列。它的复制需要辅助病毒以及表达E1a和Cre的特定人293细胞系，这是在天然环境中不存在的条件；该载体失去了所有病毒基因，因此该载体作为疫苗载体是非免疫原性的并且可以进行多次接种以用于再次免疫接种。“空”腺病毒载体还包含36kb空间以用于容纳一种或多种目的异源核酸，从而允许将大量抗原或免疫原共递送到细胞内。
因此，本发明中的载体可以是任何合适的重组病毒或病毒载体，包括但不限于，痘病毒(例如，痘苗病毒、禽痘病毒、金丝雀痘病毒、鸡痘病毒、浣熊痘病毒、猪痘病毒等)、腺病毒(例如，犬腺病毒)、疱疹病毒、杆状病毒、逆转录病毒(如在通过提及合并入本文中的文献之中)；或者载体可以是质粒。本文引用的和通过提及合并入本文中的文献，除了提供在本发明实践中有用的载体的例子外，还可以提供了关于由一种或多种载体表达的其他活性免疫原性组分的来源，所述载体在本发明的稳定化的免疫原性组合物、悬浮液或溶液中，或包括在本发明的稳定化的免疫原性组合物、悬浮液或溶液中。
用于表达活性免疫原性组分的元件可以有利地存在于质粒载体中。术语质粒包括任何DNA转录单元，其包含根据本发明的核酸以及对于其在所希望宿主或靶的细胞中的体内表达来说所需的元件；并且在这点上，应当指出超螺旋或非超螺旋的环状质粒以及线性形式，希望在本发明的范围内。
最低限度地，活性免疫原性组分例如抗原、免疫原和表位的表达包含起始密码子(ATG)、终止密码子和启动子，以及任选地还包含多腺苷酸化序列(对于某些载体例如质粒和某些病毒载体例如除痘病毒外的其他病毒载体)。当核酸在载体中编码多蛋白片段时，将ATG置于读码框的5’末端处，和将终止密码子置于3’末端处。可以存在用于控制表达的其他元件，例如允许蛋白质的表达、修饰和分泌的增强子序列、稳定化序列和信号序列。
核酸“编码序列”或“编码特定蛋白质的核苷酸序列”是当置于合适的调节元件的控制下时，在体外或体内被转录和翻译成多肽的DNA序列。编码序列的边界由在5’末端处的起始密码子和在3’末端处的翻译终止密码子确定。编码序列可以包括但不限于，原核生物序列、来自真核mRNA的cDNA、来自真核生物(例如，哺乳动物)DNA的基因组DNA序列、和甚至合成的DNA序列。转录终止序列通常将位于编码序列的3’。
核酸“控制元件”总的来说指启动子，RNA剪接位点，核糖体结合位点，多腺苷酸化信号(例如衍生自牛生长激素的多腺苷酸化信号、SV40多腺苷酸化信号)，转录终止序列，上游调节结构域，增强子，复制起点(这可以是细菌来源的，例如衍生自细菌载体例如pBR 322，或真核生物来源的，例如自主复制序列(ARS))，包装信号，可以被包含或不被包含在活性免疫原性组分例如免疫原、抗原或表位的编码序列中的前导序列。如果包括信号序列，那么它可以是天然的同源序列或异源序列。前导序列可以通过宿主在翻译后加工中去除。参见，例如，美国专利号4,431,739；4,425,437；4,338,397等，所述专利总的来说提供了编码序列在宿主细胞中的转录和翻译。
并非所有这些控制序列都必须始终存在于重组载体中，只要所需基因能够进行转录和翻译。控制序列例如启动子“指导”编码序列在细胞中的转录，当RNA聚合酶与启动子结合并且将编码序列转录成mRNA时。所得到的mRNA随后被翻译成由该编码序列编码的多肽。
取决于所需水平和组织特异性表达，可以使用各种启动子/增强子元件。取决于所需的表达模式，启动子可以是组成型或诱导型的(例如，尤其是金属硫蛋白启动子、四环素诱导型启动子和蜕皮激素诱导型启动子)。启动子可以是本来的或异源的，并且可以是天然或合成的序列。在这种背景下，“异源的”描述了这样的转录起始区，所述转录起始区在它所引入其内的野生型宿主中未发现。选择启动子从而使得它将在一种或多种目的靶细胞或组织中起作用。本发明考虑了脑特异性、肝特异性和肌肉特异性(包括骨骼、心、平滑和/或横隔特异性)启动子。哺乳动物和鸟类启动子也是优选的，特别是犬启动子。
启动子可以有利地是“早期”启动子。“早期”启动子是本领域已知的并且被定义为驱动这样的基因表达的启动子，所述基因在不存在蛋白质从头合成的情况下快速并瞬时表达。启动子还可以是“强”或“弱”启动子。术语“强启动子”和“弱启动子”是本领域已知的，并且可以通过在启动子处的转录起始的相对频率(次数/分钟)进行限定。“强”或“弱”启动子还可以通过其与RNA聚合酶的亲和力进行限定。
异源基因可以置于启动子、核糖体结合位点(对于细菌表达)和任选地增强子或操纵子的控制下，从而使得编码所需蛋白质的DNA序列在由包含所述活性免疫原性组分的载体转化的宿主细胞或受试者中被转录成RNA。
控制元件及其他调节序列可以在插入至载体中之前与编码序列相连接，所述载体例如为上文描述的克隆载体。备选地，编码序列可以直接克隆到已包含控制序列和合适的限制位点的表达载体中。
更优选地，抗原或免疫原与下述启动子可操作地连接：例如人巨细胞病毒(CMV)主要即时早期启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子、β-肌动蛋白启动子、白蛋白启动子、延伸因子1-α(EF1-α)启动子、PγK启动子、MFG启动子或劳斯肉瘤病毒启动子。其他表达控制序列包括衍生自免疫球蛋白基因、腺病毒、牛乳头瘤病毒、疱疹病毒等的启动子。除了任何犬病毒启动子外，任何哺乳动物病毒启动子也可以在本发明的实践中使用。在病毒来源的犬启动子中，感染性犬疱疹病毒的即时早期基因的启动子，早期(即，胸苷激酶、DNA解旋酶、核糖核苷酸还原酶)或晚期启动子，可以在本发明的方法和载体中使用。其他启动子包括犬腺病毒的E1启动子，以及犬主要组织相容性复合物I启动子。此外，选择合适启动子，所述启动子使目的抗原或免疫原以足够高的水平表达，从而诱导或引发针对所述抗原或免疫原的免疫应答，这完全在技术人员的能力范围内，而无需过度实验。
已推测，用CMV启动子驱动异源核苷酸转录可以导致免疫活性动物中的表达下调(参见，例如，Guo等人，1996)。因此，还优选使抗原或免疫原序列与例如经修饰的CMV启动子可操作地连接，所述经修饰的CMV启动子不导致抗原或免疫原表达的这种下调。
本发明的载体还可以包含多接头或多克隆位点(“MCS”)，其可以有利地位于启动子的下游。多接头提供了用于插入与启动子序列一起“在框内”的抗原或免疫原分子的位点，导致将启动子序列与目的抗原或免疫原“可操作地连接”。多克隆位点和多接头是本领域技术人员众所周知的。
本文描述的载体还可以包含抗生素抗性基因。可以掺入本发明的载体内的此类抗生素抗性基因的例子包括但不限于，尤其是氨苄青霉素、四环素、新霉素、zeocin、卡那霉素、博来霉素、潮霉素、氯霉素。
在其中存在超过一种抗原或免疫原的实施方案中，抗原或免疫原序列可以与单个上游启动子和一种或多种下游内部核糖体进入位点(IRES)序列(例如，小RNA病毒EMC IRES序列)可操作地连接。IRES序列允许从单个mRNA序列进行2个或更多个编码序列的多顺反子翻译。
本发明的载体随后可以用于转化合适的宿主细胞或受试者。许多哺乳动物细胞系是本领域已知的，并且包括可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的永生化细胞系，例如但不限于，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，Hep G2)、马-达二氏牛肾(“MDBK”)细胞、马-达二氏犬肾(“MDCK”)细胞，以及其他。类似地，细菌宿主例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、沙门氏菌属物种、志贺氏菌属物种和链球菌属物种，将可用于本发明中。在本发明中有用的酵母宿主尤其包括，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、白色假丝酵母、麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromycesfragilis)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。在本发明中有用的昆虫宿主包括但不限于，草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。
备选地，载体可以用于感染培养中的细胞以表达所需基因产物，例如，以产生目的蛋白质或肽。优选地，蛋白质或肽被分泌到介质中并且可以使用本领域已知的常规技术而从其中进行纯化。指导蛋白质的直接胞外分泌的信号肽序列是本领域已知的，并且编码其的核苷酸序列可以通过本领域已知的常规技术与编码目的肽或蛋白质的核苷酸序列可操作地连接。备选地，可以使细胞裂解，并且可以从细胞裂解物中纯化出表达的重组蛋白质。优选地，细胞是脊椎动物细胞，更优选地哺乳动物细胞。
用于制备和/或施用载体或重组体或质粒以用于在体内或体外表达本发明基因的基因产物的方法可以是任何所需方法，例如由下述参考文献公开的方法或与之类似的方法，或者由在下述参考文献中引用的文献公开的方法或与之类似的方法：美国专利号4,603,112；4,769,330；4,394,448；4,722,848；4,745,051；4,769,331；4,945,050；5,494,807；5,514,375；5,744,140；5,744,141；5,756,103；5,762,938；5,766,599；5,990,091；5,174,993；5,505,941；5,338,683；5,494,807；5,591,639；5,589,466；5,677,178；5,591,439；5,552,143；5,580,859；6,130,066；6,004,777；6,130,066；6,497,883；6,464,984；6,451,770；6,391,314；6,387,376；6,376,473；6,368,603；6,348,196；6,306,400；6,228,846；6,221,362；6,217,883；6,207,166；6,207,165；6,159,477；6,153,199；6,090,393；6,074,649；6,045,803；6,033,670；6,485,729；6,103,526；6,224,882；6,312,682；6,348,450和6；312,683；1986年10月16日提交的美国专利申请序列号920,197；WO 90/01543；WO 91/11525；WO 94/16716；WO 96/39491；WO 98/33510；EP 265785；EP 0 370 573；Andreansky等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，11313-11318；Ballay等人(1993)EMBO J.4，3861-65；Felgner等人(1994)J.Biol.Chem.269，2550-2561；Frolov等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93，11371-11377；Graham，F.L.(1990)Trends Biotechnol.8，85-87；Grunhaus等人(1992)Sem.Virol.3，237-52；Ju等人(1998)Diabetologia 41，736-739；Kitson等人(1991)J.Virol.65，3068-3075；McClements等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，11414-11420；Moss，B.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，11341-11348；Paoletti，E.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93，11349-11353；Pennock等人(1984)Mol.Cell.Biol.4，399-406；Richardson(编辑)，(1995)Methods in Molecular Biology 39，“Baculovirus Expression Protocols，”Humana Press Inc.；Smith等人(1983)Mol.Cell.Biol.3，2156-2165；Robertson等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，11334-11340；Robinson等人(1997)Sem.Immunol.9，271；和Roizman，B.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，11307-11312。
异源序列在受试者中的表达可以在受试者中导致针对抗原或免疫原的表达产物的免疫应答。因此，本发明的活性免疫原性组分可以在免疫原性组合物或疫苗组合物中使用，以提供诱导免疫应答的手段，所述免疫应答可以是但无需是保护性的。在本发明的背景下使用的分子生物学技术由Sambrook等人(2001)描述。
再进一步备选地或另外地，在由本发明所包括的免疫原性或疫苗组合物中，可以从编码抗原或免疫原的核苷酸序列中删除编码跨膜结构域的部分。另外再进一步备选地或另外地，载体或免疫原性组合物可以进一步包含核苷酸序列并在宿主细胞中表达核苷酸序列，所述核苷酸序列编码异源tPA信号序列，例如哺乳动物tPA，和/或稳定化内含子，例如兔β-珠蛋白基因的内含子II。
可以以一定的量给受试者施用载体，以达到对于基因产物(例如，表位、抗原、治疗剂和/或抗体)组合物所规定的量。本发明设想了在本文例示的那些之下和之上的剂量，并且对于待施用给受试者的任何组合物，包括其组分，以及对于任何具体施用方法，优选测定毒性，例如通过测定在合适的受试者中的半数细胞培养感染剂量(CCID50)、致死剂量(LD)和LD50；以及引发合适应答的组合物的剂量、其中组分的浓度和施用组合物的时机，例如通过血清滴定及其分析，例如通过ELISA和/或血清中和分析。根据技术人员的知识、本公开内容和本文中引用的文献，此类测定无需过度实验。
包含活的减毒CAV2、活的减毒CDV、活的减毒cPi2和活的减毒CPV，并且包含根据本发明的稳定剂的多价免疫原性组合物和/或疫苗组合物和/或免疫原性悬浮液或溶液，已在本文的实施例中进行测试。这些多价疫苗显示了关于CDV、cPi2、CAV2和CPV的良好稳定性。这证实了本发明的稳定剂能够保持CDV、cPi2、CAV2和CPV的生存力和感染性。这还证实了本发明的稳定剂能够保持除犬副粘病毒外的其他各种病毒，特别是犬细小病毒和犬腺病毒的生存力和感染性。根据本发明的稳定剂还可以用作包含CAV、CPV、CDV或cPi2的单价免疫原性组合物或疫苗组合物。
优选地，使1体积的多价悬浮液或溶液(即犬副粘病毒和衍生自除副粘病毒外的其他病原体的至少一种活性免疫原性组分)与1体积的稳定剂相混合。
本发明还提供了用于产生包含例如犬副粘病毒的、冷冻干燥的、稳定化的活的减毒免疫原性组合物或疫苗组合物的方法，所述方法包括使稳定化的悬浮液或溶液冻干的步骤，所述稳定化的悬浮液或溶液通过使活的减毒犬副粘病毒悬浮液或溶液与根据本发明的稳定剂相混合而形成。
本发明的另一个方面是用于产生冷冻干燥的稳定化的多价免疫原性组合物或疫苗组合物的方法，所述方法包括使稳定化的多价悬浮液或溶液冻干的步骤，所述稳定化的多价悬浮液或溶液包含例如活的减毒犬副粘病毒悬浮液或溶液和衍生自除副粘病毒外的其他病原体的至少一种活性免疫原性组分，与根据本发明的稳定剂相混合。
“冷冻干燥”涉及冻干，并且指这样的方法，即通过其来冷冻悬浮液，这之后通过在低压下升华来去除水。如本文所使用的，术语“升华”指组合物的物理性质的变化，其中组合物直接从固态变为气态而不变成液体。如本文所使用的，“T’g值”被定义为玻璃化转变温度，这相应于在其下冷冻的组合物变成玻璃质的温度。
用于使根据本发明的免疫原性悬浮液或溶液冷冻干燥的方法可以包括下述步骤：(a)使所述免疫原性悬浮液或溶液与本发明的稳定剂接触，从而形成稳定化的免疫原性悬浮液或溶液；(b)在大气压下使所述稳定化的免疫原性悬浮液或溶液冷却至低于大约所述稳定化的免疫原性悬浮液或溶液的T’g值的温度；(c)通过使冰在低压下升华来干燥所述稳定化的免疫原性悬浮液或溶液(即，初次脱水或升华步骤)；和(d)通过进一步降低压力并增加所述稳定化的免疫原性悬浮液或溶液的温度来去除过量的残留水(即，二次干燥或解吸步骤)。
冷却步骤(b)可以在低于约-40℃的温度下进行(水冷冻步骤)。通过使冰在低压下升华来干燥稳定化的免疫原性悬浮液或溶液(c)可以在例如低于或等于约200μbar的压力下进行，而压力的进一步降低可以在低于或等于约100μbar的压力处进行。最后，在过量的残留水去除(d)期间，稳定化的免疫原性悬浮液或溶液的温度可以为例如约20℃-约30℃的温度。
冷冻干燥方法还可以用这样的免疫原性悬浮液或溶液来进行，其包含与根据本发明的稳定剂相混合的活的减毒犬副粘病毒和衍生自除副粘病毒外的病原体的至少一种活性免疫原性组分，以获得冷冻干燥的稳定化的多价免疫原性或疫苗组合物。
冷冻干燥的材料的含湿量可以为约0.5％-约5％w/w，优选地约0.5％-约3％w/w，和更优选地约1.0％-约2.6％w/w。
有利地，包含至少一种填充剂的稳定化的免疫原性悬浮液或溶液具有约-36℃至约-30℃的高T’g值。高T’g值允许在冷冻方法和/或冷冻干燥方法的水冷冻步骤期间更高的温度，从而减少活的减毒病毒和活性免疫原性组分对于应激的暴露，避免活性的大量丧失。
每个步骤，包括水冷冻及其在初次和二次脱水期间的去除，使在本发明的免疫原性悬浮液或溶液中的生物成分例如病原体经历机械、物理和生物化学冲击，所述冲击对于病原体或生物成分的结构、外观、稳定性、免疫原性、感染性和生存力潜在地具有不利影响。
本发明的稳定剂允许活的减毒病原体如犬副粘病毒的良好的稳定性，并且在冷冻干燥过程中和贮藏期间维持特别是CDV和cPi2的感染性。通过冷冻干燥步骤前的感染性滴度和冷冻干燥的稳定化的免疫原性组合物或疫苗组合物于4℃贮藏12个月后的感染性滴度之间的差异可以计算出稳定性。良好的稳定性可以有利地包括仅1.2log10，和优选地仅1.0log10的差异。用于测定感染性滴度的方法是本领域技术人员众所周知的。用于测定感染性滴度的某些方法在本文的实施例中得到描述。此外，通过使用线性回归计算和/或算法使在贮藏期间的log10滴度和滴定时间点相拟合，也可以估计稳定性。
进一步，本发明的稳定剂允许冷冻干燥的软锭具有良好的外观，换言之，具有规则的形状和均匀的颜色。不规则的形状的特征可以在于存在全部或部分软锭与容器的底部粘着，并且在翻转和剪切后保持不动(粘着外观)。此外，具有线轴形状的软锭(线轴外观)，或沿水平面分开成两个部分的软锭(两分式外观)，或具有有着不规则小孔的木司(mousse)外观的软锭(海绵状外观)，或具有容器内的泡沫外观的软锭(蛋糖霜外观)具有不规则的形状并且不被接受(图1A和1B)。
本发明包括了使用根据本发明的稳定剂并且通过上述冷冻干燥方法获得的稳定化的冷冻干燥的免疫原性组合物或疫苗组合物。
在一个实施方案中，冷冻干燥的稳定化的活的减毒免疫原性或疫苗组合物或冷冻干燥的稳定化的多价免疫原性组合物或疫苗组合物包含：(i)终浓度为约20％-约50％w/w的至少一种还原性单糖，和(ii)终浓度为约1.5％-约6％w/w的至少一种酸抗氧化剂。
在另一个实施方案中，冷冻干燥的稳定化的活的减毒免疫原性或疫苗组合物或冷冻干燥的稳定化的多价免疫原性或疫苗组合物包含：(i)终浓度为约20％-约50％w/w的至少一种还原性单糖，(ii)终浓度为约1.5％-约6％w/w的至少一种酸抗氧化剂，和(iii)终浓度为约15％-约70％w/w的至少一种填充剂。
根据本发明的稳定化的冷冻干燥的免疫原性组合物或疫苗组合物可以在干燥气氛中于冷藏温度和室温特别是约2℃-约35℃，和更特别地约4℃-约25℃下进行贮藏。
本发明的一个进一步方面提供了试剂盒，其包含含有本发明的冷冻干燥的稳定化的活的减毒免疫原性组合物或疫苗组合物或者冷冻干燥的稳定化的多价免疫原性组合物或疫苗组合物的第一个管形瓶，和含有溶剂的第二个管形瓶。
关于其的用途和给受试者的施用，冷冻干燥的稳定化的免疫原性组合物或疫苗组合物可以通过用溶剂再水化来进行重构。溶剂通常是水，例如去矿质水或蒸馏水、注射用水，但还可以包括生理溶液或缓冲液，例如磷酸盐缓冲溶液(PBS)，或者佐剂，包括但不限于，油包水乳状液、小棒杆菌(Corynebacterium parvum)、卡介苗、氢氧化铝、葡聚糖、硫酸葡聚糖、氧化铁、藻酸钠、Bacto-Adjuvant、某些合成聚合物例如聚氨基酸和氨基酸共聚物、皂苷、″REGRESSIN″(Vetrepharm、Athens、Ga.)、″AVRIDINE″(N，N-双十八烷基-N′，N′-二(2-羟乙基)-丙二胺)、石蜡油、胞壁酰二肽等。佐剂和佐剂组合物的其他具体例子在本文中得到描述。
合适的佐剂包括fMLP(N-甲酰基-甲硫氨酰基-亮氨酰基-苯丙氨酸；美国专利号6,017,537)和/或丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物和/或马来酸酐与烯基衍生物的共聚物。丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物可以是例如与糖或多元醇的聚烯基醚交联的。这些化合物已知位于术语“卡波姆”下(Pharmeuropa，第8卷，No.2，1996年6月)。本领域技术人员还可以参考美国专利号2,909,462(通过提及而合并入本文)，所述专利讨论了与包含至少3个羟基的多羟基化的化合物交联的此类丙烯酸聚合物；多羟基化的化合物包含不超过8个的羟基；作为另一个例子，至少3个羟基的氢原子被包含至少2个碳原子的不饱和脂肪族原子团替换。原子团可以包含约2-约4个碳原子，例如乙烯基、烯丙基及其他烯键式不饱和基团。不饱和的原子团自身可以包含其他取代基，例如甲基。在名称
Figure A20068004302900541
(Noveon Inc.，Ohio，USA)下出售的产品特别适合于作为佐剂使用。它们与烯丙基蔗糖或与烯丙基季戊四醇交联，关于这个可以提及产品974P、934P和971P。
关于马来酸酐与烯基衍生物的共聚物，可以提及的是
Figure A20068004302900552
产品(Monsanto)，它是马来酸酐与乙烯的共聚物，它可以是线性或交联的，例如与二乙烯基醚交联。此外，还可以参考美国专利号6,713,068和Regelson，W.等人，1960；(通过提及而合并入本文)。
包含季铵盐的阳离子脂质在美国专利号6,713,068中得到描述(所述专利的内容通过提及而合并入本文)也可以在本发明的方法和组合物中使用。在这些阳离子脂质中，优选的是DMRIE(N-(2-羟乙基)-N，N-二甲基-2，3-二(十四烷氧基)-1-丙烷铵；WO96/34109)，有利地与中性脂质结合，有利地与DOPE(二油酰-磷脂酰乙醇胺；Behr J.P.等人，1994)结合从而形成DMRIE-DOPE。
在重构的即注型(ready-to-inject)本发明免疫原性组合物或疫苗组合物中的组分总含量可以用于提供等渗浓度的注射液，例如，在约100-600mOsm内，一般地在约250-450mOsm内，和优选地约330mOsm。
在冷冻干燥的稳定化的免疫原性组合物或疫苗组合物中或在重构的即注型免疫原性组合物或疫苗组合物中的活的减毒病原体特别是CDV和cPi 2的剂量，可以为约102-约107CCID50/剂。关于在冷冻干燥的稳定化的多价免疫原性组合物或疫苗组合物中或在重构的即用型多价免疫原性组合物或疫苗组合物中的蛋白质、多肽或糖蛋白，在灭活前可以为约105-约109CCID50/剂，优选地约106-约108CCID50/剂的等价滴度。
重构的即用型免疫原性组合物或疫苗组合物可以通过经由肠胃外或粘膜途径的注射，优选地肌内和皮下注射施用给动物。然而，此类重构的即用型免疫原性组合物或疫苗组合物的施用也可以包括鼻内、表皮、局部或口部施用。用于注射的剂量体积可以为约0.1ml-约2.0ml，并优选地约1.0ml。
本发明现在将通过下述非限制性实施例进一步描述，所述实施例为了举例说明本发明的各种实施方案而给出并且不意欲以任何方式限制本发明。
实施例
实施例1：稳定剂的制备
稳定剂的组成和稳定剂中组分的量显示于表1中。“葡聚糖”包括具有40,000Da的分子量的葡聚糖-40,000。
表1：稳定剂的组成
  稳定剂   还原性单糖或混合物   酸抗氧化剂   填充剂   溶剂
  F2   葡萄糖(5％w/v)棉子糖(5％w/v)   天冬氨酸(0.50％w/v)   葡聚糖(10％w/v)   注射用水(足量100％v/v)
  F2B   葡萄糖(3％w/v)棉子糖(3％w/v)   天冬氨酸(0.20％w/v)   葡聚糖(6％w/v)   注射用水(足量100％v/v)
  F6B   半乳糖(3％w/v)甘露醇(6％w/v)   天冬氨酸(0.40％w/v)   -   注射用水(足量100％v/v)
  F33   葡萄糖(5％w/v)果糖(5％w/v)   天冬氨酸(0.50％w/v)   葡聚糖(10％w/v)   注射用水(足量100％v/v)
  F37   葡萄糖(5％w/v)棉子糖(5％w/v)山梨糖醇(10％w/v)   天冬氨酸(0.50％w/v)   -   注射用水(足量100％v/v)
  A   葡萄糖(1％w/v)半乳糖(5％w/v)   天冬氨酸(0.50％w/v)   葡聚糖(6％w/v)   注射用水(足量100％v/v)
  H   葡萄糖(5％w/v)棉子糖(5％w/v)   天冬氨酸(0.50％w/v)   葡聚糖(6％w/v)   注射用水(足量100％v/v)
  K   葡萄糖(5％w/v)蔗糖(1％w/v)   天冬氨酸(0.50％w/v)   葡聚糖(6％w/v)   注射用水(足量100％v/v)
  U   葡萄糖(1％w/v)半乳糖(1％w/v)   天冬氨酸(0.50％w/v)   葡聚糖(6％w/v)   注射用水(足量100％v/v)
对于每种稳定剂，在搅动下将1升蒸馏水加热至约55℃的温度。随后在保持经由磁性棒的搅动下同时将化合物缓慢地加入至热水中，以促进其溶解。在最后一次添加后维持搅动约30分钟，从而导致获得均质的溶液。
然后使溶液冷却至室温。溶液冷却后，稳定剂通过经由具有0.22μm的孔径截止值的过滤器(Optiscale Durapore)进行无菌过滤来灭菌。然后，将稳定剂F2、F2B、F6B、F33、F37、A、H、K和U的灭菌溶液贮藏于室温。
实施例2：冷冻干燥方法
将实施例1中获得的每种稳定剂用于使病毒悬浮液稳定化。在室温和搅动下，将4体积的稳定剂加入至6体积的4种活的减毒犬病毒的混合物中。所述活的减毒犬病毒是犬副流感病毒2型(cPi2)、犬瘟热病毒(CDV)、犬腺病毒2型(CAV2)和犬细小病毒(CPV)。
这些稳定化的悬浮液的T’g值用差示扫描量热计(MettlerToledo；Viroflay、France)进行测量并且显示于表2中。
表2：稳定化的悬浮液的T’g值
  稳定剂   T’g值(℃)   稳定剂   T’g值(℃)
  F2   -30.8   A   -36.2
  F2B   -33.0   H   -34.9
  F6B   -46.8   K   -36.2
  F33   -34.2   U   -33.0
  F37   -42.9   ---------   ----------
将用所述稳定剂配制的稳定化的悬浮液进一步冷冻干燥。冷冻干燥循环包括3个阶段：
(1)冷冻阶段：将汇集在小瓶中的稳定化的悬浮液置于冷冻干燥器内，并且通过在大气压下与架子接触进行冷却，直至它们被完全冷冻。架子的温度低于或等于约-50℃。
(2)升华阶段(或初次脱水)：将冷冻干燥器中的压力调整至足够低的压力，以获得冰的升华(低于或等于120μbar的压力)。调节温度从而使得在低于或等于-22℃的产品温度下，在升华期间没有发生融化。将由于升华而产生的蒸汽冷冻到位于真空泵之前的冰冷凝器中。
(3)解吸阶段(或二次脱水)：在升华结束时，当所有的冰从待冷冻干燥的产品中消失时，通过进一步使冷冻干燥器中的压力再次降低至低于或等于30μbar和通过使温度增至约30℃，来消除过量的游离和/或结合的残留水。
冷冻干燥后，使用无菌氮气破坏真空。随后将瓶关闭，并从冷冻干燥器中取出。测量每种稳定化的冷冻干燥的疫苗的含湿量，并且显示于表3中。
表3：稳定化的冷冻干燥的疫苗的含湿量
稳定剂 含湿量(％) 稳定剂 含湿量(％)
F2 1.32 A 2.01
F2B 2.16 H 2.60
F6B 3.63 K 2.58
F33 2.03 U 1.08
F37 3.27 ------------ ------------
实施例3：冷冻干燥后的稳定性研究
观察在如实施例2中所述进行稳定化的悬浮液的冷冻干燥后获得的冷冻干燥的软锭，以区分异常的软锭与具有规则的形状的那些。包含本发明稳定剂并进一步包含填充剂的冷冻干燥的软锭(即F2、F2B、F33、A、H、K和U)具有良好的外观；110个中只有5个含F2稳定剂的软锭具有粘着外观(4.5％)。随后将冷冻干燥的稳定化的疫苗贮藏于+4℃。
通过计算对于相同疫苗重复进行的3次滴定的平均滴度来测定冷冻干燥的疫苗的病毒滴度。将在如实施例2中所述进行冷冻干燥后获得的冷冻干燥的疫苗在1ml注射用水中进行再水化。每种疫苗随后进行稀释以获得约-3.8log10至-6.8log10的稀释物。
对于cPi2滴定，将每种稀释物以50l/孔的量6次置于滴定平板上，与50μl抗肝炎抗体的溶液和以150μl浓度为100,000细胞/ml的马-达二氏犬肾细胞(MDCK细胞)的细胞悬浮液一起。MDCK细胞在补充有2％胎牛血清的F15培养基中进行培养。作为对照，将100μl稀释物和150μl MDCK细胞置于相同孔中。将所有滴定斑于37℃保持7天。温育后，从滴定平板的每个孔中取出上清液并置于具有圆锥形孔的新滴定平板中。将豚鼠红细胞(Alsever sp.)加入至每个包含上清液的孔中。红细胞溶液的稀释度在所有孔中都是相同的。于+4℃3-4小时后，通过将平板置于白纸上而获得结果。随后通过可容易鉴定的粒状沉淀的存在来检测病毒攻击。
对于CDV滴定，将每种稀释物以50μl/孔的量6次置于滴定平板上，与50μl抗cPi2抗体的溶液和150μl浓度为120,000细胞/ml的VERO细胞(猴肾细胞)的细胞悬浮液一起。Vero细胞在补充有2％胎牛血清的Eagle极限必需培养基(MEM培养基)中进行培养。作为对照，将100μl稀释物和150μl VERO细胞置于相同孔中。将所有滴定斑于37℃保持7天。温育后，将滴定平板置于显微镜下。随后通过VERO细胞的降解来检测病毒攻击。病毒滴度以50％细胞培养感染剂量/毫升(CCID50/ml)的log10来表示。
表4显示了在冷冻干燥步骤和于4℃12个月的贮藏期后，以log10CCID50/ml表示的cPi2和CDV滴度的减少。
表4：在冷冻干燥和于4℃贮藏12个月后，cPi2和CDV滴度的减少。
  稳定剂   cPi2滴度减少   CDV滴度减少
  F2   -0.36   -0.60
  F2B   -0.43   -1.06
  F6B   -0.93   -0.56
  F33   -0.81   -0.15
  F37   -1.06   -0.91
  A   -0.69   -0.69
  H   -0.51   -0.64
  K   -0.73   -1.00
  U   -0.50   +0.15
结果显示，CDV和cPi2病毒对于在4℃下的长贮藏期均具有非常良好的稳定性。对于这些冷冻干燥的稳定化的疫苗中的一些，一式三份地进行CAV2和CPV的滴定。这些滴定的结果作为由3次滴定获得的平均值的减少在表5中给出，以log10CCID50/ml表示，紧在冷冻干燥步骤后和在于4℃3个月的贮藏期(T0+3)后。
表5：在冷冻干燥和于4℃贮藏3个月后，CAV2和CPV滴度的减少。
  稳定剂   CAV2滴度减少   CPV滴度减少
  A   -0.20   -0.10
  H   -0.47   -0.20
  K   -0.36   +0.10
研究了稳定剂的各种化合物对于在冷冻干燥步骤期间和之后CDV和cPi2的稳定性的影响。特别地，检查了非还原性寡糖对于CDV的稳定性的影响。结果在图2A和表6中通过统计分析而给出。
表6：用包含非还原性寡糖的稳定剂进行稳定化的CDV在冷冻干燥步骤结束时(在T0时)的平均滴度和标准差(n＝72)。
  非还原性寡糖(％w/v终浓度)   计数   CDV的平均滴度(log10CCID50/ml)   标准差
  0   18   4.78   0.20
  0.5   27   4.69   0.25
  2.5   27   4.76   0.34
稳定剂中非还原性寡糖的存在对于CDV滴度没有影响(ANOVA广值＝0.5142)。
检查了还原性单糖对于CDV的稳定性的影响。对结果实施统计分析，并且显示于图2B和表7中。
表7：用包含还原性单糖的稳定剂进行稳定化的CDV在冷冻干燥步骤结束时(在T0时)的平均滴度和标准差(n＝72)。
  还原性单糖(％w/v终浓度)   计数   CDV的平均滴度(log10CCID50/ml)   标准差
  0.5   30   4.58   0.27
  1   6   4.61   0.13
  2.5   24   4.90   0.22
  3   6   4.92   0.20
  5   6   4.82   0.12
如表7和图2B中所示，稳定剂中还原性单糖的存在对于CDV滴度具有正面影响(ANOVAp＝0.0000)。
还研究了抗氧化剂化合物对于cPi2的稳定性的影响。在图3A和3B以及表8和9中，对结果实施统计分析。
表8：在冷冻干燥步骤结束时(在T0时)，用含或不含天冬氨酸的稳定剂进行稳定化的cPi2的平均滴度和标准差(n＝15)。
  天冬氨酸(％w/v终浓度)   计数   cPi2的平均滴度(log10CCID50/ml)   标准差
  0   5   4.39   1.04
  0.1   5   5.41   0.96
  0.2   5   6.09   0.13
表9：在冷冻干燥步骤和于4℃3个月的贮藏期后(在T0+3个月时)，用含或不含天冬氨酸的稳定剂进行稳定化的cPi2的平均滴度和标准差(n＝15)。
  天冬氨酸(％w/v终浓度)   计数   cPi2的平均滴度(log10CCID50/ml)   标准差
  0   5   4.27   0.81
  0.1   5   4.92   1.00
  0.2   5   5.82   0.35
已发现稳定剂中抗氧化剂化合物的存在对于在冷冻干燥步骤期间和贮藏期间cPi2滴度具有正面影响(ANOVA p＝0.0000)。
实施例4：稳定剂组分的比较研究
F2稳定剂(实施例1)用作参照，以测量与其他稳定化的冷冻干燥的制剂相比较，冷冻干燥的疫苗的滴度的下降。这些制剂通过如表10中所示的每种组分的修饰来获得。
稳定剂F63等同于F2，但缺乏抗氧化剂化合物。
稳定剂F62等同于F2，但包括苯丙氨酸而不是天冬氨酸。
稳定剂F42等同于F2，但包括天冬氨酸单钠盐而不是天冬氨酸。
稳定剂F32等同于F2，但包括甜菜碱而不是还原性单糖。
表10：制剂的组成
  稳定剂   包含还原性单糖或变体的混合物   酸抗氧化剂或变体   填充剂   溶剂
  F63   葡萄糖(5％w/v)棉子糖(5％w/v)   -   葡聚糖(10％w/v)   注射用水(足量100％v/v)
  F62   葡萄糖(5％w/v)棉子糖(5％w/v)   苯丙氨酸(0.50％w/v)   葡聚糖(10％w/v)   注射用水(足量100％v/v)
  F42   葡萄糖(5％w/v)棉子糖(5％w/v)   天冬氨酸单钠盐(0.50％w/v)   葡聚糖(10％w/v)   注射用水(足量100％v/v)
  F32   甜菜碱(5％w/v)棉子糖(5％w/v)   天冬氨酸(0.50％w/v)   葡聚糖(10％w/v)   注射用水(足量100％v/v)
这些制剂已用于使实施例2的疫苗稳定化，并且根据本文描述的方法进行冷冻干燥。冷冻干燥的疫苗在1ml注射用水中进行再水化。如实施例3中所做的，通过计算对于相同疫苗重复进行的3次滴定的平均滴度来测定疫苗的cPi2滴度和CDV滴度。对于每种制剂在冷冻干燥过程后测量滴度。以log10CCID50/ml表示的这些滴度在表11中给出。
表11：用各种制剂稳定化的冷冻干燥/再水化的疫苗在冷冻干燥步骤期间滴度的减少。
  稳定剂   cPi2滴度   CDV滴度
  F63   -2.22   -0.46
  F62   -2.42   -0.74
  F32   -3.29   -1.86
  F42   -1.12   -0.83
  F42，于4℃贮藏12个月后   -1.60   -1.98
这些结果显示，抗氧化剂化合物的不存在产生cPi2的滴度的显著损失。缺乏抗氧化剂效应的氨基酸苯丙氨酸的包含也导致cPi2和CDV的滴度的损失。类似地，抗氧化剂天冬氨酸的单钠盐的包含产生cPi2和CDV的滴度的损失。这些结果还证实，还原性单糖的不存在导致cPi2以及CDV的滴度的高度损失。
实施例5：稳定化的疫苗在狗中的安全性评估
在将某些在实施例2中描述的冷冻干燥的疫苗在无菌注射水中再水化后，将其施用给狗。所述疫苗包含在实施例1中描述的A、H、K和F2B稳定剂。
4只年龄3-5个月大的无特定病原体(SPF)的狗和4只年龄3-5个月大的普通狗被随机分配到具有2只动物的4个组内，其中每个组具有1只SPF狗和1只普通狗。对于每个组，在第0天时用加倍剂量(2ml)的其相应的稳定化的疫苗皮下免疫2只狗。在第14天时，用单剂量(1ml)的相同的稳定化的疫苗皮下免疫狗。
观察了立即的局部反应和立即的全身反应、直肠温度、局部反应、全身反应和临床症状。在施用后没有观察到局部或全身反应。因此，所述稳定化的疫苗的安全性看起来很高。
尽管本发明的优选实施方案因此已得到详细描述，但应当理解，由所附权利要求限定的本发明不受上文说明书中所述的具体细节限制，因为其许多显而易见的变化是可能的而不背离其精神或范围。
本发明将通过下述经编号的段落进一步描述：
1.用于冷冻干燥的活的减毒犬瘟热病毒(CDV)和犬副粘病毒2型(cPi2)免疫原性组合物的稳定剂，其包含至少一种还原性单糖和至少一种酸抗氧化剂化合物，其中所述至少一种酸抗氧化剂化合物包括天冬氨酸、谷氨酸、抗坏血酸或其组合。
2.段落1的稳定剂，其中所述至少一种还原性单糖包括葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖、山梨糖或其组合。
3.段落1或2的稳定剂，其进一步包含至少一种填充剂。
4.段落3的稳定剂，其中所述至少一种填充剂包括葡聚糖、麦芽糖糊精、聚乙烯吡咯烷酮、羟乙基淀粉或其组合。
5.段落1-4中任一项的稳定剂，其进一步包含至少一种糖醇。
6.段落5的稳定剂，其中所述至少一种糖醇包括山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇或其组合。
7.段落1-6中任一项的稳定剂，其进一步包含至少一种非还原性寡糖。
8.段落7的稳定剂，其中所述至少一种非还原性寡糖包括海藻糖、蔗糖、棉子糖或其组合。
9.段落1-8中任一项的稳定剂，其进一步包含至少一种糖醇和至少一种非还原性寡糖。
10.段落9的稳定剂，其中所述至少一种糖醇包括山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇或其组合，并且其中至少一种非还原性寡糖包括海藻糖、蔗糖、棉子糖或其组合。
11.免疫原性悬浮液或溶液，其包含与段落1-10中任一项的稳定剂相混合的活的减毒副粘病毒，包括CDV和cPi2。
12.段落11的免疫原性悬浮液或溶液，其中所述免疫原性悬浮液或溶液是多价免疫原性悬浮液或溶液，其进一步包含衍生自除副粘病毒外的其他病原体的至少一种活性免疫原性组分。
13.段落12的免疫原性悬浮液或溶液，其中所述至少一种活性免疫原性组分衍生自包括腺病毒科、细小病毒科、冠状病毒科、疱疹病毒科、痘病毒科、弹状病毒科或其组合的病原体。
14.段落12或13的免疫原性悬浮液或溶液，其中所述至少一种活性免疫原性组分包括活的减毒犬腺病毒2型(CAV2)和活的减毒犬细小病毒(CPV)。
15.段落12-14中任一项的免疫原性悬浮液或溶液，其中所述至少一种活性免疫原性组分包括病毒载体，所述病毒载体包含一种或多种异源免疫原。
16.段落12-15中任一项的免疫原性悬浮液或溶液，其中所述至少一种活性免疫原性组分包括质粒载体，所述质粒载体包含一种或多种异源免疫原。
17.段落11-16中任一项的免疫原性悬浮液或溶液，其中所述稳定剂包含终浓度为约1％-约5％w/v的至少一种还原性单糖。
18.段落11-16中任一项的免疫原性悬浮液或溶液，其中所述稳定剂包含终浓度为约1.5％-约5％w/v的至少一种还原性单糖。
19.段落11-16中任一项的免疫原性悬浮液或溶液，其中所述稳定剂包含终浓度为约1.5％-约4％w/v的至少一种还原性单糖。
20.段落11-16中任一项的免疫原性悬浮液或溶液，其中所述稳定剂包含终浓度为约2.5％-约3％w/v的至少一种还原性单糖。
21.段落11-20中任一项的免疫原性悬浮液或溶液，其中所述稳定剂包含终浓度为约0.1％-约0.3％w/v的至少一种酸抗氧化剂化合物。
22.段落11-20中任一项的免疫原性悬浮液或溶液，其中所述稳定剂包含终浓度为约0.1％-约0.25％w/v的至少一种酸抗氧化剂化合物。
23.段落11-20中任一项的免疫原性悬浮液或溶液，其中所述稳定剂包含终浓度为约0.2％w/v的至少一种酸抗氧化剂化合物。
24.段落11-23中任一项的免疫原性悬浮液或溶液，其中所述稳定剂包含终浓度为约0.5％-约7.5％w/v的至少一种填充剂。
25.段落11-24中任一项的免疫原性悬浮液或溶液，其中所述稳定剂包含终浓度为约1.5％-约5％w/v的至少一种填充剂。
26.段落11的免疫原性悬浮液或溶液，其中所述稳定剂包含终浓度为约0.5％-约5％w/v的至少一种糖醇，和至少一种还原性单糖，条件是所述至少一种还原性单糖和所述至少一种糖醇的终浓度等于或小于约7.5％w/v。
27.段落11的免疫原性悬浮液或溶液，其中所述稳定剂包含终浓度为约0.5％-约5％w/v的至少一种非还原性寡糖，和至少一种还原性单糖，条件是所述还原性单糖和所述非还原性寡糖的终浓度等于或小于约7.5％w/v。
28.段落11的免疫原性悬浮液或溶液，其中所述稳定剂包含终浓度为约0.5％-约5％w/v的至少一种糖醇，终浓度为约0.5％-约5％w/v的至少一种非还原性寡糖，和至少一种还原性单糖，条件是还原性单糖、糖醇和非还原性寡糖的终浓度等于或小于约12.5％w/v。
29.段落11的免疫原性悬浮液或溶液，其中所述稳定剂包含：(i)终浓度为约1％-约5％w/v的两种还原性单糖的混合物，(ii)终浓度为约0.1％-约0.3％w/v的至少一种酸抗氧化剂，和(iii)终浓度为约0.5％-约7.5％w/v的至少一种填充剂。
30.段落11的免疫原性悬浮液或溶液，其中所述稳定剂包含：(i)终浓度为约1％-约5％w/v的至少一种还原性单糖，(ii)终浓度为约0.5％-约5％w/v的至少一种非还原性寡糖，(iii)终浓度为约0.1％-约0.3％w/v的至少一种酸抗氧化剂，和(iv)终浓度为约0.5％-约7.5％w/v的至少一种填充剂，条件是(i)和(ii)的终浓度等于或小于约7.5％w/v。
31.段落11的免疫原性悬浮液或溶液，其中所述稳定剂包含：(i)终浓度为约1.5％-约4％w/v的至少一种还原性单糖，(ii)终浓度为约0.5％-约2.5％w/v的至少一种非还原性寡糖，(iii)终浓度为约0.1％-约0.25％w/v的至少一种酸抗氧化剂，和(iv)终浓度为约1.5％-约5％w/v的至少一种填充剂，条件是(i)和(ii)的终浓度等于或小于约5％w/v。
32.段落11的免疫原性悬浮液或溶液，其中所述稳定剂包含：(i)终浓度为约1％-约5％w/v的至少一种还原性单糖，(ii)终浓度为约0.5％-约5％w/v的至少一种糖醇，(iii)终浓度为约0.1％-约0.3％w/v的至少一种酸抗氧化剂，条件是(i)和(ii)的终浓度等于或小于约7.5％w/v。
33.段落11的免疫原性悬浮液或溶液，其中所述稳定剂包含：(i)终浓度为约1.5％-约4％w/v的至少一种还原性单糖，(ii)终浓度为约1.5％-约3％w/v的至少一种糖醇，和(iii)终浓度为约0.1％-约0.25％w/v的至少一种酸抗氧化剂，条件是(i)和(ii)的终浓度等于或小于约5％w/v。
34.段落11的免疫原性悬浮液或溶液，其中所述稳定剂包含：(i)终浓度为约1％-约5％w/v的至少一种还原性单糖，(ii)终浓度为约0.5％-约5％w/v的至少一种糖醇，(iii)终浓度为约0.5％-约5％w/v的至少一种非还原性寡糖，和(iv)终浓度为约0.1％-约0.3％w/v的至少一种酸抗氧化剂，条件是(i)、(ii)和(iii)的终浓度等于或小于约12.5％w/v。
35.段落11的免疫原性悬浮液或溶液，其中所述稳定剂包含：(i)终浓度为约1.5％-约4％w/v的至少一种还原性单糖，(ii)终浓度为约0.5％-约5％w/v的至少一种糖醇，(iii)终浓度为约0.5％-约2.5％w/v的至少一种非还原性寡糖，和(iv)终浓度为约0.1％-约0.25％w/v的至少一种酸抗氧化剂，条件是(i)、(ii)和(iii)的终浓度等于或小于约10％w/v。
36.用于使段落11-35中任一项的活的减毒CDV和cPi2免疫原性悬浮液或溶液冷冻干燥的方法，其包括(a)使所述悬浮液或溶液与所述稳定剂接触，从而形成稳定化的免疫原性悬浮液或溶液；(b)在大气压下使所述稳定化的免疫原性悬浮液或溶液冷却至低于大约所述稳定化的免疫原性悬浮液或溶液的T’g值的温度；(c)通过使冰在低压下升华来干燥所述稳定化的免疫原性悬浮液或溶液；和(d)通过进一步降低压力并增加所述稳定化的免疫原性悬浮液或溶液的温度来去除过量的残留水。
37.段落36的方法，其中步骤(b)中的所述温度低于约-40℃。
38.段落36或37的方法，其中步骤(c)中的所述压力小于或等于约200μbar。
39.段落36或37的方法，其中步骤(d)中的所述压力小于或等于约100μbar。
40.段落36-39中任一项的方法，其中步骤(d)中的所述温度为约20℃-约30℃。
41.段落36-40中任一项的方法，其进一步包括衍生自除副粘病毒外的其他病原体的至少一种活性免疫原性组分。
42.段落41的方法，其中所述至少一种活性免疫原性组分衍生自包括腺病毒科、细小病毒科、冠状病毒科、疱疹病毒科、痘病毒科、弹状病毒科或其组合的病原体。
43.段落41或42的方法，其中所述至少一种活性免疫原性组分包括活的减毒犬腺病毒2型(CAV2)和活的减毒犬细小病毒(CPV)。
44.段落41-43中任一项的方法，其中所述至少一种活性免疫原性组分包括病毒载体，所述病毒载体包含一种或多种异源免疫原。
45.段落41-44中任一项的方法，其中所述至少一种活性免疫原性组分包括质粒载体，所述质粒载体包含一种或多种异源免疫原。
46.冷冻干燥的稳定化的活的减毒CDV和cPi2免疫原性组合物，其通过段落36-45中任一项的方法产生。
47.冷冻干燥的稳定化的活的减毒CDV和cPi2免疫原性组合物，其包含：(i)终浓度为约20％-约50％w/w的至少一种还原性单糖，(ii)终浓度为约1.5％-约6％w/w的至少一种酸抗氧化剂，所述至少一种酸抗氧化剂包括天冬氨酸、谷氨酸、抗坏血酸或其组合。
48.冷冻干燥的稳定化的活的减毒CDV和cPi2免疫原性组合物，其包含：(i)终浓度为约20％-约50％w/w的至少一种还原性单糖，(ii)终浓度为约2％-约6％w/w的至少一种酸抗氧化剂，所述至少一种酸抗氧化剂包括天冬氨酸、谷氨酸、抗坏血酸或其组合，和(iii)终浓度为约15％-约70％w/w的至少一种填充剂。
49.冷冻干燥的稳定化的多价免疫原性组合物，其包含活的减毒CDV、活的减毒cPi2和衍生自除副粘病毒外的其他病原体的至少一种活性免疫原性组分，并且包含：(i)终浓度为约20％-约50％w/w的至少一种还原性单糖，(ii)终浓度为约1.5％-约6％w/w的至少一种酸抗氧化剂，所述至少一种酸抗氧化剂包括天冬氨酸、谷氨酸、抗坏血酸或其组合。
50.段落49或50的多价免疫原性组合物，其中所述至少一种活性免疫原性组分衍生自包括腺病毒科、细小病毒科、冠状病毒科、疱疹病毒科、痘病毒科、弹状病毒科或其组合的病原体。
51.段落49的多价免疫原性组合物，其中所述至少一种活性免疫原性组分包括活的减毒犬腺病毒2型(CAV2)和活的减毒犬细小病毒(CPV)。
52.段落49-51中任一项的多价免疫原性组合物，其中所述至少一种活性免疫原性组分包括病毒载体，所述病毒载体包含一种或多种异源免疫原。
53.段落41-52中任一项的多价免疫原性组合物，其中所述至少一种活性免疫原性组分包括质粒载体，所述质粒载体包含一种或多种异源免疫原。
54.冷冻干燥的稳定化的多价免疫原性组合物，其包含活的减毒CDV、活的减毒cPi2和衍生自除副粘病毒外的其他病原体的至少一种活性免疫原性组分，并且包含：(i)终浓度为约20％-约50％w/w的至少一种还原性单糖，(ii)终浓度为约2％-约6％w/w的至少一种酸抗氧化剂，所述至少一种酸抗氧化剂包括天冬氨酸、谷氨酸、抗坏血酸或其组合，和(iii)终浓度为约15％-约70％w/w的至少一种填充剂。
55.段落54的多价免疫原性组合物，其中所述至少一种活性免疫原性组分衍生自包括腺病毒科、细小病毒科、冠状病毒科、疱疹病毒科、痘病毒科、弹状病毒科或其组合的病原体。
56.段落54或55的多价免疫原性组合物，其中所述至少一种活性免疫原性组分包括活的减毒犬腺病毒2型(CAV2)和活的减毒犬细小病毒(CPV)。
57.段落54-56中任一项的多价免疫原性组合物，其中所述至少一种活性免疫原性组分包括病毒载体，所述病毒载体包含一种或多种异源免疫原。
58.段落54-57中任一项的多价免疫原性组合物，其中所述至少一种活性免疫原性组分包括质粒载体，所述质粒载体包含一种或多种异源免疫原。
59.试剂盒，其包含含有段落46-58中任一项的冷冻干燥的稳定化的免疫原性组合物的第一管形瓶，和含有溶剂的第二管形瓶。
60.段落59的试剂盒，其中所述溶剂选自去矿质水、蒸馏水、注射用水、缓冲液和佐剂。

Claims (14)

1.用于冷冻干燥的活的减毒犬瘟热病毒(CDV)和犬副粘病毒2型(cPi2)免疫原性组合物的稳定剂，其包含至少一种还原性单糖和至少一种酸抗氧化剂化合物，其中所述至少一种酸抗氧化剂化合物包括天冬氨酸、谷氨酸、抗坏血酸或其组合。
2.权利要求1的稳定剂，其中所述至少一种还原性单糖包括葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖、山梨糖或其组合。
3.权利要求1的稳定剂，其进一步包含
(a)至少一种填充剂，或
(b)至少一种填充剂，其中所述至少一种填充剂包括葡聚糖、麦芽糖糊精、聚乙烯吡咯烷酮、羟乙基淀粉或其组合，或
(c)至少一种糖醇，或
(d)至少一种糖醇，其中所述糖醇包括山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇或其组合，或
(e)至少一种非还原性寡糖，或
(f)至少一种非还原性寡糖，其中所述至少一种非还原性寡糖包括海藻糖、蔗糖、棉子糖或其组合，或
(g)至少一种糖醇和至少一种非还原性寡糖，或
(h)至少一种糖醇和至少一种非还原性寡糖，其中所述至少一种糖醇包括山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇或其组合，和其中所述至少一种非还原性寡糖包括海藻糖、蔗糖、棉子糖或其组合。
4.免疫原性悬浮液或溶液，其包含与权利要求1的稳定剂相混合的活的减毒副粘病毒，包括CDV和cPi2。
5.权利要求4的免疫原性悬浮液或溶液，其中所述免疫原性悬浮液或溶液是多价免疫原性悬浮液或溶液，其进一步包含衍生自除副粘病毒外的其他病原体的至少一种活性免疫原性组分。
6.权利要求5的免疫原性悬浮液或溶液，其中
(a)所述至少一种活性免疫原性组分衍生自包括腺病毒科、细小病毒科、冠状病毒科、疱疹病毒科、痘病毒科、弹状病毒科或其组合的病原体，或
(b)所述至少一种活性免疫原性组分包括活的减毒犬腺病毒2型(CAV2)和活的减毒犬细小病毒(CPV)，或
(c)所述至少一种活性免疫原性组分包括病毒载体，所述病毒载体包含一种或多种异源免疫原，或
(d)所述至少一种活性免疫原性组分包括质粒载体，所述质粒载体包含一种或多种异源免疫原。
7.权利要求4的免疫原性悬浮液或溶液，其中所述稳定剂包含
(a)至少一种还原性单糖，其终浓度为
约1％-约5％w/v，或
约1.5％-约5％w/v，或
约1.5％-约4％w/v，或
约2.5％-约3％w/v，或
约0.1％-约0.3％w/v，或
(b)至少一种酸抗氧化剂化合物，其终浓度为
约0.1％-约0.25％w/v，或
约0.2％w/v，或
约0.5％-约7.5％w/v，或
(c)终浓度为约1.5％-约5％w/v的至少一种填充剂，或
(d)终浓度为约0.5％-约5％w/v的至少一种糖醇，和至少一种还原性单糖，条件是所述至少一种还原性单糖和所述至少一种糖醇的终浓度等于或小于约7.5％w/v。
(e)终浓度为约0.5％-约5％w/v的至少一种非还原性寡糖，和至少一种还原性单糖，条件是所述还原性单糖和所述非还原性寡糖的终浓度等于或小于约7.5％w/v，或
(f)终浓度为约0.5％-约5％w/v的至少一种糖醇，终浓度为约0.5％-约5％w/v的至少一种非还原性寡糖，和至少一种还原性单糖，条件是还原性单糖、糖醇和非还原性寡糖的终浓度等于或小于约12.5％w/v。
8.权利要求4的免疫原性悬浮液或溶液，其中所述稳定剂包含：
(a)(i)终浓度为约1％-约5％w/v的两种还原性单糖的混合物，(ii)终浓度为约0.1％-约0.3％w/v的至少一种酸抗氧化剂，和(iii)终浓度为约0.5％-约7.5％w/v的至少一种填充剂，或
(b)(i)终浓度为约1％-约5％w/v的至少一种还原性单糖，(ii)终浓度为约0.5％-约5％w/v的至少一种非还原性寡糖，(iii)终浓度为约0.1％-约0.3％w/v的至少一种酸抗氧化剂，和(iv)终浓度为约0.5％-约7.5％w/v的至少一种填充剂，条件是(i)和(ii)的终浓度等于或小于约7.5％w/v，或
(c)(i)终浓度为约1.5％-约4％w/v的至少一种还原性单糖，(ii)终浓度为约0.5％-约2.5％w/v的至少一种非还原性寡糖，(iii)终浓度为约0.1％-约0.25％w/v的至少一种酸抗氧化剂，和(iv)终浓度为约1.5％-约5％w/v的至少一种填充剂，条件是(i)和(ii)的终浓度等于或小于约5％w/v，或
(d)(i)终浓度为约1％-约5％w/v的至少一种还原性单糖，(ii)终浓度为约0.5％-约5％w/v的至少一种糖醇，(iii)终浓度为约0.1％-约0.3％w/v的至少一种酸抗氧化剂，条件是(i)和(ii)的终浓度等于或小于约7.5％w/v，或
(e)(i)终浓度为约1.5％-约4％w/v的至少一种还原性单糖，(ii)终浓度为约1.5％-约3％w/v的至少一种糖醇，和(iii)终浓度为约0.1％-约0.25％w/v的至少一种酸抗氧化剂，条件是(i)和(ii)的终浓度等于或小于约5％w/v，或
(f)(i)终浓度为约1％-约5％w/v的至少一种还原性单糖，(ii)终浓度为约0.5％-约5％w/v的至少一种糖醇，(iii)终浓度为约0.5％-约5％w/v的至少一种非还原性寡糖，和(iv)终浓度为约0.1％-约0.3％w/v的至少一种酸抗氧化剂，条件是(i)、(ii)和(iii)的终浓度等于或小于约12.5％w/v，或
(g)(i)终浓度为约1.5％-约4％w/v的至少一种还原性单糖，(ii)终浓度为约0.5％-约5％w/v的至少一种糖醇，(iii)终浓度为约0.5％-约2.5％w/v的至少一种非还原性寡糖，和(iv)终浓度为约0.1％-约0.25％w/v的至少一种酸抗氧化剂，条件是(i)、(ii)和(iii)的终浓度等于或小于约10％w/v。
9.冷冻干燥的稳定化的活的减毒CDV和cPi2免疫原性组合物，其包含(i)终浓度为约20％-约50％w/w的至少一种还原性单糖，(ii)终浓度为约1.5％-约6％w/w的至少一种酸抗氧化剂，所述至少一种酸抗氧化剂包括天冬氨酸、谷氨酸、抗坏血酸或其组合。
10.权利要求9的免疫原性组合物，其中包括天冬氨酸、谷氨酸、抗坏血酸或其组合的至少一种酸抗氧化剂(ii)的终浓度为约2％-约6％w/w的包括天冬氨酸、谷氨酸、抗坏血酸或其组合的至少一种酸抗氧化剂，并进一步包含(iii)终浓度为约15％-约70％w/w的至少一种填充剂。
11.权利要求9的免疫原性组合物，其进一步包含衍生自除副粘病毒外的其他病原体的至少一种活性免疫原性组分。
12.权利要求11的免疫原性组合物，其中所述至少一种活性免疫原性组分
(a)衍生自包括腺病毒科、细小病毒科、冠状病毒科、疱疹病毒科、痘病毒科、弹状病毒科或其组合的病原体，或
(b)包括活的减毒犬腺病毒2型(CAV2)和活的减毒犬细小病毒(CPV)，或
(c)包括病毒载体，所述病毒载体包含一种或多种异源免疫原，或
(d)包括质粒载体，所述质粒载体包含一种或多种异源免疫原。
13.冷冻干燥的稳定化的多价免疫原性组合物，其包含活的减毒CDV、活的减毒cPi2和衍生自除副粘病毒外的其他病原体的至少一种活性免疫原性组分，并且包含：(i)终浓度为约20％-约50％w/w的至少一种还原性单糖，(ii)终浓度为约2％-约6％w/w的至少一种酸抗氧化剂，所述至少一种酸抗氧化剂包括天冬氨酸、谷氨酸、抗坏血酸或其组合，和(iii)终浓度为约15％-约70％w/w的至少一种填充剂。
14.权利要求13的多价免疫原性组合物，其中所述至少一种活性免疫原性组分
(a)衍生自包括腺病毒科、细小病毒科、冠状病毒科、疱疹病毒科、痘病毒科、弹状病毒科或其组合的病原体，或
(b)包括活的减毒犬腺病毒2型(CAV2)和活的减毒犬细小病毒(CPV)，或
(c)包括病毒载体，所述病毒载体包含一种或多种异源免疫原，或
(d)包括质粒载体，所述质粒载体包含一种或多种异源免疫原。
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