CN112057603A - 一种白喉毒素无毒突变体crm197蛋白的冻干方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白的冻干方法，其包括S1、预冻，预冻条件为：冷阱温度≤‑80℃，气压为一个大气压，用时30～40min升温至‑55℃～‑45℃，并维持230～260min；S2、升华干燥，S2.1、一阶升华，一阶升华条件为：冷阱温度≤‑80℃，真空度8‑10pa，用时55～70min升温至‑35～‑30℃，并维持300～330min；S2.2、二阶升华，二阶升华条件为：冷阱温度≤‑80℃，真空度8‑10pa，用时30～40min升温至‑25～‑20℃，并维持1500～1600min；S3、解析干燥，解析干燥条件为：冷阱温度≤‑80℃，真空度0pa，用时60～90min升温至26～30℃，并维持400～600min，制得CRM197蛋白冻干粉。本发明具有CRM197蛋白冻干粉的各项质量与冻干前皆无明显差异，同时具有较高的稳定性的特点。
Description
技术领域
本发明涉及疫苗冻干的技术领域，尤其是涉及一种白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白的冻干方法。
背景技术
CRM197是白喉毒素的无毒变异体，与天然白喉毒素相比，CRM197蛋白在结构上仅是A片段上第52位的甘氨酸残基被谷氨酸残基取代，从而使得其酶催化活性丧失，因而不能对细胞产生毒性作用；但由于其B片段的蛋白序列及结构未发生任何变化，没有毒性的CRM197蛋白仍然可与敏感细胞的受体结合。即CRM197蛋白在丧失酶活性及毒性的同时仍保留白喉毒素的免疫原性，且其与其它多种白喉毒素及变异体相比，具有完全无毒，完整性最高、突变最少、结构最接近，受体阻断能力最强的优点。因此CRM197成为一种理想的多糖结合疫苗载体蛋白。
但是针对CRM197蛋白的保存，现有技术基本采用液体冻存的方式进行保存，与液体冻存前的CRM197蛋白原液降相比，其质量明显降低且稳定性不高。
现有中国专利授权公告号为：CN103627758B的专利文件公开了一种CRM197蛋白的生产方法，包括1)采用白喉棒杆菌(Corynebacteriumdiphtheriae)进行发酵培养；2)发酵液通过连续流或者杯式离心机离心后，过中空纤维进行进澄清处理；3)经过澄清之后的发酵液用10kDa超滤膜进行超滤浓缩；4)浓缩液经硫酸铵两次盐析后对沉淀进行复溶；5)复溶液经离子交换捕获CRM197蛋白；6)捕获后的蛋白经疏水分离进行进一步纯化；7)浓缩至所需浓度保存；步骤7中所述浓缩为步骤6所得的纯化后的蛋白液，采用10kDa或30kDa超滤膜进行超滤浓缩，浓缩后保存方法为，加入1～5％的抑肽酶和10～20umol/LEDTA后，-20℃冻存或者加入1～5％的抑肽酶和10～20umol/LEDTA后再加入1～5％的蔗糖乳糖或麦芽糖冻干保存。
但是上述方法中并没有公开其相关冻干配方及冻干工艺，更未凸显冻干后蛋白的有效期，冻干后的CRM197蛋白冻干粉与冻干前的CRM197蛋白原液相比，其蛋白纯度明显降低。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白的冻干方法，具有CRM197蛋白冻干粉的蛋白纯度与冻干前皆无明显差异的特点。
本发明的上述发明目的是通过以下技术方案得以实现的：
一种白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白的冻干方法，包括以下步骤：
S1、预冻
将白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白半成品原液，按照0.5mL/cm2平铺于冻干不锈钢盘，将所述冻干不锈钢盘置于真空冷冻干燥机隔板上，预冻条件为：冷阱温度≤-80℃，气压为一个大气压，用时30～40min升温至-55℃～-45℃，并维持230～260min；
S2、升华干燥
S2.1、一阶升华
所述冻干不锈钢盘仍置于真空冷冻干燥机隔板上，一阶升华条件为：冷阱温度≤-80℃，真空度8～10pa，用时55～70min升温至-35～-30℃，并维持300～330min；
S2.2、二阶升华
所述冻干不锈钢盘仍置于真空冷冻干燥机隔板上，二阶升华条件为：冷阱温度≤-80℃，真空度8～10pa，用时30～40min升温至-25～-20℃，并维持1500～1600min；
S3、解析干燥
所述冻干不锈钢盘仍置于真空冷冻干燥机隔板上，解析干燥条件为：冷阱温度≤-80℃，真空度0pa，用时60～90min升温至26～30℃，并维持400～600min，制得CRM197蛋白冻干粉；所述白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白半成品原液包括以下原料组分：CRM197蛋白溶液、蔗糖、氢氧化钠、盐酸、注射用水；
所述白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白半成品原液的配制方法为：量取一定量CRM197蛋白溶液，按照测定的蛋白浓度，计算出蛋白总量M；按照9M的重量称量蔗糖，溶解于CRM197蛋白溶液中，使用注射用水稀释至蛋白浓度为2～10mg/mL；使用氢氧化钠或盐酸，调节最终pH为6.5～7.5，即为冻干半成品原液。
通过采用上述方案，蔗糖的加入，可增加水分子的表面张力，促使蛋白质分子优先与水分子相互作用，进而使蛋白质分子外表面比蛋白质分子体相中有相对较多的水分子，保护了蛋白质的天然构象。另外，在干燥过程中，蛋白质的水合层被除去，容易导致蛋白质构象被破坏。蔗糖上的羟基能够替代蛋白质表面上水的羟基，使蛋白质表面形成一层“水合层”，这样就可以保护氢键的联合位置不直接暴露在周围环境中，从而保持了蛋白质天然结构和功能的完整性。因此，蔗糖在本申请的冻干半成品原液中，不仅能起到低温保护剂的功能，又能起到冻干保护剂的功能。
氢氧化钠和盐酸用于调节蛋白质溶液的pH在6.5～7.5的范围内，一方面有利于蛋白质在溶液中的稳定性和溶解性，保护蛋白质的天然结构，防止蛋白质变性；另一方面提升冻干后蛋白质的物理和化学稳定性。
注射用水则可调节蛋白浓度，优化蔗糖以及蛋白质之间的最大相容性，一方面可形成结实的蛋白质冻干粉，另一方面便于冷冻干燥以及复水。
在实际生产中，由本申请的CRM197蛋白冻干配方，进一步通过本申请的配制方法进行配制冻干前原液，并通过本申请确定的冻干工艺，可使CRM197蛋白由液体转化为固体，冻干后的蛋白冻干粉储存有效期更久；且CRM197蛋白冻干粉的蛋白纯度与冻干前皆无明显差异，稳定性高。
综上，本申请的冻干配方简约易操作，成本低廉；冻干工艺流程简洁，经冻干后蛋白质量无明显差异；经真空冷冻干燥将蛋白由液体转变为蛋白粉，易于储存及后期使用；冻干粉经长期稳定性考察，有效期更久。
本发明进一步配置为：预冻条件为：冷阱温度≤-80℃，气压为一个大气压，用时30min升温至-45℃，并维持240min。
通过采用上述方案，进一步优选预冻条件，使CRM197蛋白由液体转化为固体，冻干后的蛋白冻干粉储存有效期更久，稳定性更高。
本发明进一步配置为：一阶升华条件为：冷阱温度≤-80℃，真空度8pa，用时60min升温至-30℃，并维持300min。
通过采用上述方案，进一步优选一阶升华条件，使CRM197蛋白由液体转化为固体，冻干后的蛋白冻干粉储存有效期更久，稳定性更高。
本发明进一步配置为：二阶升华条件为：冷阱温度≤-80℃，真空度8pa，用时30min升温至-25℃，并维持1500min。
通过采用上述方案，进一步优选二阶升华条件，使CRM197蛋白由液体转化为固体，冻干后的蛋白冻干粉储存有效期更久，稳定性更高。
本发明进一步配置为：解析干燥条件为：冷阱温度≤-80℃，真空度0pa，用时60min升温至26℃，并维持600min。
通过采用上述方案，进一步优选解析干燥条件，使CRM197蛋白由液体转化为固体，冻干后的蛋白冻干粉储存有效期更久，稳定性更高。
本发明进一步配置为：使用注射用水稀释至蛋白浓度为5～8mg/mL。
通过采用上述方案，进一步优选蛋白浓度，使CRM197蛋白由液体转化为固体，冻干后的蛋白冻干粉储存有效期更久，稳定性更高。
本发明进一步配置为：使用注射用水稀释至蛋白浓度为6mg/mL。
通过采用上述方案，进一步优选蛋白浓度，使CRM197蛋白由液体转化为固体，冻干后的蛋白冻干粉储存有效期更久，稳定性更高。
本发明进一步配置为：使用氢氧化钠或盐酸，调节最终蛋白质溶液的pH为7.0。
通过采用上述方案，进一步优选蛋白质溶液的pH为7.0，使CRM197蛋白由液体转化为固体，冻干后的蛋白冻干粉储存有效期更久，稳定性更高。
本发明的有益效果：本申请的冻干配方简约易操作，成本低廉；冻干工艺流程简洁，经冻干后蛋白质量无明显差异；经真空冷冻干燥将蛋白由液体转变为蛋白粉，易于储存及后期使用；冻干粉经长期稳定性考察，有效期更久。蛋白冻干粉的各项质量与冻干前皆无明显差异，同时具有较高的稳定性。
附图说明
图1是本发明提供的方法的流程图。
具体实施方式
原料与来源
CRM197蛋白溶液由艾美卫信生物药业(浙江)有限公司生产；
由艾美卫信生物药业(浙江)有限公司生产；
蔗糖由国药集团化学试剂有限公司生产；
氢氧化钠由国药集团化学试剂有限公司生产；
盐酸由国药集团化学试剂有限公司生产；
注射用水由艾美卫信生物药业(浙江)有限公司生产。
白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白半成品原液制备例
制备例1
量取541ml CRM197蛋白溶液，按照测定的蛋白浓度6.618mg/ml，计算出蛋白总量M＝3.58g；按照9M的重量称量蔗糖32.22g，溶解于CRM197蛋白溶液中，使用注射用水稀释至蛋白浓度为2mg/mL；使用氢氧化钠或盐酸，调节最终pH为6.5，即为冻干半成品原液。
制备例2
量取378ml CRM197蛋白溶液，按照测定的蛋白浓度8.327mg/ml，计算出蛋白总量M＝3.15g；按照9M的重量称量蔗糖28.35g，溶解于CRM197蛋白溶液中，使用注射用水稀释至蛋白浓度为4mg/mL；使用氢氧化钠或盐酸，调节最终pH为7.0，即为冻干半成品原液。
制备例3
量取428ml CRM197蛋白溶液，按照测定的蛋白浓度8.582mg/ml，计算出蛋白总量M＝3.67g；按照9M的重量称量蔗糖33.06g，溶解于CRM197蛋白溶液中，使用注射用水稀释至蛋白浓度为6mg/mL；使用氢氧化钠或盐酸，调节最终pH为7.0，即为冻干半成品原液。
制备例4
量取892ml CRM197蛋白溶液，按照测定的蛋白浓度6.891mg/ml，计算出蛋白总量M＝6.15g；按照9M的重量称量蔗糖55.35g，溶解于CRM197蛋白溶液中，使用注射用水稀释至蛋白浓度为8mg/mL；使用氢氧化钠或盐酸，调节最终pH为7.5，即为冻干半成品原液。
制备例5
量取755ml CRM197蛋白溶液，按照测定的蛋白浓度7.113mg/ml，计算出蛋白总量M＝5.37g；按照9M的重量称量蔗糖48.33g，溶解于CRM197蛋白溶液中，使用注射用水稀释至蛋白浓度为10mg/mL；使用氢氧化钠或盐酸，调节最终pH为6.5，即为冻干半成品原液。
实施例
实施例1
一种白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白的冻干方法，包括以下步骤：
S1、预冻
将制备例1的白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白的冻干半成品原液，按照0.5mL/cm2平铺于冻干不锈钢盘，将冻干不锈钢盘置于真空冷冻干燥机隔板上，预冻条件为：冷阱温度≤-80℃，气压为一个大气压，用时30min升温至-55℃，并维持230min；
S2、升华干燥
S2.1、一阶升华
所述冻干不锈钢盘仍置于真空冷冻干燥机隔板上，一阶升华条件为：冷阱温度≤-80℃，真空度8pa，用时55min升温至-35℃，并维持300min；
S2.2、二阶升华
所述冻干不锈钢盘仍置于真空冷冻干燥机隔板上，二阶升华条件为：冷阱温度≤-80℃，真空度8pa，用时30min升温至-25℃，并维持1500min；
S3、解析干燥
所述冻干不锈钢盘仍置于真空冷冻干燥机隔板上，解析干燥条件为：冷阱温度≤-80℃，真空度0pa，用时60min升温至24℃，并维持400min，制得CRM197蛋白冻干粉。
实施例2
实施例2与实施例1的区别在于选用制备例2的白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白半成品原液。
实施例3
实施例3与实施例1的区别在于选用制备例3的白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白半成品原液。
实施例4
实施例4实施例1的区别在于选用制备例4的白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白半成品原液。
实施例5
实施例5实施例1的区别在于选用制备例5的白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白半成品原液。
实施例6
一种白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白的冻干方法，包括以下步骤：
S1、预冻
将制备例3的白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白的冻干半成品原液，按照0.5mL/cm2平铺于冻干不锈钢盘，将冻干不锈钢盘置于真空冷冻干燥机隔板上，预冻条件为：冷阱温度≤-80℃，气压为一个大气压，用时35min升温至-50℃，并维持240min；
S2、升华干燥
S2.1、一阶升华
所述冻干不锈钢盘仍置于真空冷冻干燥机隔板上，一阶升华条件为：冷阱温度≤-80℃，真空度9pa，用时60min升温至-33℃，并维持320min；
S2.2、二阶升华
所述冻干不锈钢盘仍置于真空冷冻干燥机隔板上，二阶升华条件为：冷阱温度≤-80℃，真空度9pa，用时35min升温至-22℃，并维持1550min；
S3、解析干燥
所述冻干不锈钢盘仍置于真空冷冻干燥机隔板上，解析干燥条件为：冷阱温度≤-80℃，真空度0pa，用时70min升温至29℃，并维持500min，制得CRM197蛋白冻干粉。
实施例7
一种白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白的冻干方法，包括以下步骤：
S1、预冻
将制备例3的白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白的冻干半成品原液，按照0.5mL/cm2平铺于冻干不锈钢盘，将冻干不锈钢盘置于真空冷冻干燥机隔板上，预冻条件为：冷阱温度≤-80℃，气压为一个大气压，用时30min升温至-45℃，并维持240min；
S2、升华干燥
S2.1、一阶升华
所述冻干不锈钢盘仍置于真空冷冻干燥机隔板上，一阶升华条件为：冷阱温度≤-80℃，真空度8pa，用时60min升温至-30℃，并维持300min；
S2.2、二阶升华
所述冻干不锈钢盘仍置于真空冷冻干燥机隔板上，二阶升华条件为：冷阱温度≤-80℃，真空度8pa，用时30min升温至-25℃，并维持1500min；
S3、解析干燥
所述冻干不锈钢盘仍置于真空冷冻干燥机隔板上，解析干燥条件为：冷阱温度≤-80℃，真空度0pa，用时60min升温至26℃，并维持600min，制得CRM197蛋白冻干粉。
实施例8
一种白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白的冻干方法，包括以下步骤：
S1、预冻
将制备例3的白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白的冻干半成品原液，按照0.5mL/cm2平铺于冻干不锈钢盘，将冻干不锈钢盘置于真空冷冻干燥机隔板上，预冻条件为：冷阱温度≤-80℃，气压为一个大气压，用时30min升温至-45℃，并维持240min；
S2、升华干燥
S2.1、一阶升华
所述冻干不锈钢盘仍置于真空冷冻干燥机隔板上，一阶升华条件为：冷阱温度≤-80℃，真空度10pa，用时70min升温至-35℃，并维持330min；
S2.2、二阶升华
所述冻干不锈钢盘仍置于真空冷冻干燥机隔板上，二阶升华条件为：冷阱温度≤-80℃，真空度10pa，用时40min升温至-20℃，并维持1600min；
S3、解析干燥
所述冻干不锈钢盘仍置于真空冷冻干燥机隔板上，解析干燥条件为：冷阱温度≤-80℃，真空度0pa，用时90min升温至30℃，并维持400min，制得CRM197蛋白冻干粉。
实施例9
一种白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白的冻干方法，包括以下步骤：
S1、预冻
将制备例3的白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白的冻干半成品原液，按照0.5mL/cm2平铺于冻干不锈钢盘，将冻干不锈钢盘置于真空冷冻干燥机隔板上，预冻条件为：冷阱温度≤-80℃，气压为一个大气压，用时40min升温至-55℃，并维持230min；
S2、升华干燥
S2.1、一阶升华
所述冻干不锈钢盘仍置于真空冷冻干燥机隔板上，一阶升华条件为：冷阱温度≤-80℃，真空度8pa，用时60min升温至-30℃，并维持300min；
S2.2、二阶升华
所述冻干不锈钢盘仍置于真空冷冻干燥机隔板上，二阶升华条件为：冷阱温度≤-80℃，真空度8pa，用时30min升温至-25℃，并维持1500min；
S3、解析干燥
所述冻干不锈钢盘仍置于真空冷冻干燥机隔板上，解析干燥条件为：冷阱温度≤-80℃，真空度0pa，用时60min升温至26℃，并维持600min，制得CRM197蛋白冻干粉。
实施例10
一种白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白的冻干方法，包括以下步骤：
S1、预冻
将制备例3的白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白的冻干半成品原液，按照0.5mL/cm2平铺于冻干不锈钢盘，将冻干不锈钢盘置于真空冷冻干燥机隔板上，预冻条件为：冷阱温度≤-80℃，气压为一个大气压，用时30min升温至-45℃，并维持240min；
S2、升华干燥
S2.1、一阶升华
所述冻干不锈钢盘仍置于真空冷冻干燥机隔板上，一阶升华条件为：冷阱温度≤-80℃，真空度10pa，用时55min升温至-35℃，并维持330min；
S2.2、二阶升华
所述冻干不锈钢盘仍置于真空冷冻干燥机隔板上，二阶升华条件为：冷阱温度≤-80℃，真空度8pa，用时30min升温至-25℃，并维持1500min；
S3、解析干燥
所述冻干不锈钢盘仍置于真空冷冻干燥机隔板上，解析干燥条件为：冷阱温度≤-80℃，真空度0pa，用时60min升温至26℃，并维持600min，制得CRM197蛋白冻干粉。
对比例
对比例1
量取541ml CRM197蛋白溶液，采用10kDa超滤膜进行超滤浓缩，进一步加入5％的抑肽酶和20umol/LEDTA，-20℃冻存。
性能检测
鉴别试验：采用《中国药典》现行版通则3403方法进行；
检测标准为：应与白喉类毒素免疫血清形成明显的沉淀线。
细菌内毒素：采用《中国药典》现行版通则1143方法进行；
检测标准为：蛋白含量≤5EU/μg。
无菌试验：采用《中国药典》现行版通则1101方法进行；
检测标准为：合格。
蛋白纯度：使用液相色谱仪；
检测标准为：＞90％。
水分含量：水分分析仪；
检测标准为：≤10.0％。
具体检测结果见表1。
表1性能检测结果表
另外，对实施例1-10的CRM197蛋白冻干粉以及对比例1的CRM197蛋白冻存物进行长期性考察。具体包括蛋白质纯度长期性考察以及水分含量长期性考察，考察周期均为24个月。其中，蛋白纯度长期性考察结果见表2；水分含量长期性考察结果见表3。
表2蛋白纯度长期性考察结果表
表3水分含量长期性考察结果表
结合表1-3可得，实施例1-10制得的CRM197蛋白冻干粉，进行24个月长期稳定性考察后，蛋白纯度皆高于90％，因此CRM197蛋白冻干粉的蛋白纯度与冻干前皆无明显差异；水分含量皆不高于10.0％，因此CRM197蛋白冻干粉的稳定性高。
本具体实施方式的实施例均为本发明的较佳实施例，并非依此限制本发明的保护范围，故：凡依本发明的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白的冻干方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、预冻
将白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白半成品原液，按照0.5mL/cm2平铺于冻干不锈钢盘中，将所述冻干不锈钢盘置于真空冷冻干隔板上，预冻条件为：冷阱温度≤ -80℃，气压为一个大气压，用时30～40min升温至-55 ℃～-45℃，并维持230～260min；
S2、升华干燥
S2.1、一阶升华
所述冻干不锈钢盘仍置于真空冷冻干燥机隔板上，一阶升华条件为：冷阱温度≤ -80℃，真空度8-10pa，用时55～70min升温至-35～-30℃，并维持300～330min；
S2.2、二阶升华
所述冻干不锈钢盘仍置于真空冷冻干燥机隔板上，二阶升华条件为：冷阱温度≤ -80℃，真空度8～10pa，用时30～40min升温至-25～-20℃，并维持1500～1600min；
S3、解析干燥
所述冻干不锈钢盘仍置于真空冷冻干燥机隔板上，解析干燥条件为：冷阱温度≤ -80℃，真空度0pa，用时60～90min升温至26～30℃，并维持400～600min，制得CRM197蛋白冻干粉；
所述白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白半成品原液包括以下原料组分：CRM197蛋白溶液、
蔗糖、氢氧化钠、盐酸、注射用水；
所述白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白半成品原液的配制方法为：量取一定量 CRM197蛋白溶液，按照测定的蛋白浓度，计算出蛋白总量M；按照9M的重量称量蔗糖，溶解于CRM197蛋白溶液中，使用注射用水稀释至蛋白浓度为2～10mg/mL；使用氢氧化钠或盐酸，调节最终pH为6.5～7.5，即为冻干半成品原液。
2.根据权利要求1所述的白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白的冻干方法，其特征在于，预冻条件为：冷阱温度≤-80℃，气压为一个大气压，用时30min升温至-45℃，并维持240min。
3.根据权利要求1所述的白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白的冻干方法 ，其特征在于，一阶升华条件为：冷阱温度≤-80℃，真空度8pa，用时60min升温至-30℃，并维持300min。
4.根据权利要求1所述的白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白的冻干方法 ，其特征在于：二阶升华条件为：冷阱温度≤-80℃，真空度8pa，用时30min升温至-25℃，并维持1500min。
5.根据权利要求1所述的白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白的冻干方法 ，其特征在于：解析干燥条件为：冷阱温度≤-80℃，真空度0pa，用时60min升温至26℃，并维持600min。
6.根据权利要求1所述的白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白的冻干方法 ，其特征在于：使用注射用水稀释至蛋白浓度为5～8mg/mL。
7.根据权利要求1所述的白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白的冻干方法 ，其特征在于：使用注射用水稀释至蛋白浓度为6mg/mL。
8.根据权利要求1所述的白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白的冻干方法 ，其特征在于：使用氢氧化钠或盐酸，调节最终pH为7.0。
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Legal Events
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Address after: No. 29 Zhuquan Road, Science and Technology Industrial Park, Ninghai County, Ningbo City, Zhejiang Province, 315615 Patentee after: Aimei Persist Biopharmaceutical Co.,Ltd. Address before: 315600 No.29, Zhuquan Road, science and Technology Industrial Park, Ninghai County, Ningbo City, Zhejiang Province Patentee before: AIMEI WEIXIN BIOPHARMACEUTICAL (ZHEJIANG) Co.,Ltd. |
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