ES2341362T3 - Procedimiento de produccion de cepas de staphylococus aureus superproductoras. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de producción de una cepa superproductora de Staphylococcus aureus, que comprende: (a) el cultivo de una cepa de Staphylococcus aureus en un medio de cultivo M1 que, por litro de medio de cultivo, comprende: - 5 a 100 g de peptona vegetal, - 0,5 a 20 g de extracto de levadura, - 1 a 30 g de azúcar, - 1 a 200 mg de una sal de hierro seleccionada del grupo consistente en FeCl3 y FeSO4, - 1 a 700 mg de una sal de magnesio seleccionada del grupo consistente en MgCl2 y MgSO4, - 0,1 a 500 mg de CaCl2, - 0 a 50 mg de ZnCl2, - 10 a 250 g de NaCl, preferentemente 58,5 g/l, y cuyo pH está comprendido en un intervalo de valores que va de 6,2 a 7,5, y eventualmente la recuperación de las cepas así producidas a partir del medio de cultivo.
Description
Procedimiento de producción de cepas de
Staphylococcus aureus superproductoras.
La presente invención se refiere a un
procedimiento de producción de cepas superproductoras de
Staphylococcus aureus y a su utilización en un procedimiento
de producción de polisacáridos capsulares.
Los polisacáridos capsulares de
Staphylococcus aureus, en particular los polisacáridos de los
serotipos 5 y 8, se describen en la bibliografía como componentes
de interés para la fabricación de una vacuna destinada a proteger
contra las infecciones debidas a Staphylococcus aureus.
Las cepas T5 y T8 están microcapsuladas y, por
tanto, producen pequeñas cantidades de polisacáridos capsulares de
interés. Las cantidades de polisacáridos capsulares que deben estar
incluidos en una vacuna son importantes debido al hecho del
deficiente sistema inmunitario de las poblaciones objetivo (véase,
por ejemplo, Fattom, A. et al. (1995) Vaccine 13,
1288-1293).
Por tanto, en el marco de un desarrollo
industrial de una vacuna de este tipo es importante poder producir
grandes cantidades de polisacáridos capsulares T5 y T8.
Es bajo esta óptica que los inventores han dado
a conocer un nuevo procedimiento que permite aumentar
sustancialmente la capacidad de secreción de polisacárido capsular
de las cepas de Staphylococcus aureus. Los inventores
proporcionan, por tanto, un procedimiento de producción que permite
obtener polisacárido capsular de Staphylococcus aureus en
grandes cantidades.
Según un primer aspecto, la presente invención
se refiere, por tanto, a un procedimiento de producción de cepas
superproductoras de Staphylococcus aureus, que comprende:
- (a)
- el cultivo de una cepa de Staphylococcus aureus en un medio de cultivo M1 que, por litro de medio de cultivo, comprende:
- \bullet
- 5 a 100 g de peptona vegetal,
- \bullet
- 0,5 a 20 g de extracto de levadura,
- \bullet
- 1 a 30 g de azúcar,
- \bullet
- 1 a 200 mg de una sal de hierro seleccionada del grupo consistente en FeCl_{3} y FeSO_{4},
- \bullet
- 1 a 700 mg de una sal de magnesio seleccionada del grupo consistente en MgCl_{2} y MgSO_{4},
- \bullet
- 0,1 a 500 mg de CaCl_{2},
- \bullet
- 0 a 50 mg de ZnCl_{2},
- \bullet
- 10 a 250 g de NaCl, preferentemente 58,5 g/l, y
cuyo pH está comprendido en un intervalo de
valores que va de 6,2 a 7,5, y
\vskip1.000000\baselineskip
- (b)
- eventualmente la recuperación de las cepas a partir del medio de cultivo.
- \quad
- Según un modo particular del procedimiento de producción de cepas superproductoras, el medio de cultivo M1 de la etapa (a) comprende peptona de trigo.
- \quad
- Según un modo de realización ventajoso del procedimiento de producción de cepas superproductoras, el medio de cultivo M1, por litro de medio de cultivo, comprende:
- \bullet
- 30 g de peptona de trigo,
- \bullet
- 5 g de extracto de levadura,
- \bullet
- 1 g de D-glucosa H_{2}O,
- \bullet
- 120 mg de FeCl_{3}.6H_{2}O,
- \bullet
- 400 mg de MgCl_{2}.6H_{2}O,
- \bullet
- 10 mg de CaCl_{2}.2H_{2}O,
- \bullet
- 58,5 g de NaCl
- \bullet
- 5 mg de ZnCl_{2},
- \bullet
- 6,8 g de (NH_{4})_{2}SO_{4},
- \bullet
- 6 g de NH_{4}Cl y pH=6,5
\vskip1.000000\baselineskip
Según otro modo de realización ventajoso el
medio M1 contiene por litro:
- \quad
- l30 g de peptona de trigo, 5 g de extracto de levadura, 1 g de D-glucosa H_{2}O, 120 mg de FeCl_{3}.6H_{2}O, 400 mg de MgCl_{2}.6H_{2}O, 10 mg de CaCl_{2}.2H_{2}O, 58,5 g de NaCl, 5 mg de ZnCl_{2}, 6,8 g de (NH_{4})_{2}SO_{4} y 6 g de NH_{4}Cl, pH=6,5
\vskip1.000000\baselineskip
Según un modo de realización particular, el
procedimiento de producción de cepas superproductoras comprende una
etapa de precultivo en un medio de precultivo M0 que comprende:
- \bullet
- 3 a 50 g de peptona vegetal,
- \bullet
- 0,5 a 20 g de extracto de levadura,
- \bullet
- 1 a 30 g de azúcar,
- \bullet
- 1 a 200 mg de una sal de hierro seleccionada del grupo consistente en FeCl_{3} y FeSO_{4},
- \bullet
- 1 a 700 mg de una sal de magnesio seleccionada del grupo consistente en MgCl_{2} y MgSO_{4},
- \bullet
- 0,1 a 50 mg de CaCl_{2},
- \bullet
- 0 a 50 mg de ZnCl_{2},
- \bullet
- 2 a 50 g de NaCl, preferentemente 6 g/l, y
cuyo pH está comprendido en un intervalo de
valores que va de 6,2 a 7,5.
\vskip1.000000\baselineskip
Según un modo particular de realización del
procedimiento de producción de cepas superproductoras, la etapa de
precultivo utiliza un medio de precultivo M0 que, por litro,
comprende 3,87 g de peptona de trigo.
Según otro modo de realización del procedimiento
de producción de cepas superproductoras, la etapa de precultivo
utiliza un medio de precultivo M0 que, por litro, comprende 30 g de
peptona de trigo.
Según un modo de realización ventajoso del
procedimiento de producción de cepas superproductoras, la etapa de
precultivo utiliza un medio de precultivo M0 gelosado que contiene:
3,87 g de peptona de trigo, 5 g de extracto de levadura, 1 g de
D-glucosa H_{2}O, 120 mg de FeCl_{3}.6H_{2}O,
400 mg de MgCl_{2}.6H_{2}O, 10 mg de CaCl_{2}.2H_{2}O, 6 g
de NaCl, 5 mg de ZnCl_{2}, 6,8 g de
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 6 g de NH_{4}Cl, 15 g/l de agar
y pH=6,5.
Según otro modo de realización ventajoso del
procedimiento de producción de cepas superproductoras, la etapa de
precultivo utiliza un medio de precultivo M0 líquido que contiene:
30 g de peptona de trigo, 5 g de extracto de levadura, 1 g de
D-glucosa H_{2}O, 120 mg de FeCl_{3}.6H_{2}O,
400 mg de MgCl_{2}.6H_{2}O, 10 mg de CaCl_{2}.2H_{2}O, 6 g
de NaCl, 5 mg de ZnCl_{2}, 6,8 g de
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 6 g de NH_{4}Cl, y pH=6,5.
Según otro aspecto, la presente invención
proporciona por tanto un procedimiento de producción de
polisacáridos capsulares que comprende:
- (a)
- el cultivo de una cepa de Staphylococcus aureus en un medio de cultivo M1 tal como el definido anteriormente,
- (b)
- la inactivación del cultivo así producido, y
- (c)
- la recuperación de los polisacáridos capsulares.
\vskip1.000000\baselineskip
Según un modo de realización del procedimiento
de producción de polisacáridos capsulares, la etapa de cultivo
utiliza un medio de cultivo M1 que comprende peptona de trigo.
Según un modo de realización, el procedimiento
de producción de polisacáridos capsulares comprende una etapa de
precultivo tal como fue definida anteriormente en relación con el
procedimiento de producción de cepas superproductoras.
La presente invención tiene igualmente por
objeto un medio de cultivo M1 adaptado a la superproducción de
polisacárido capsular de Staphylococcus aureus que
comprende:
- \bullet
- 5 a 100 g de peptona vegetal,
- \bullet
- 0,5 a 20 g de extracto de levadura,
- \bullet
- 1 a 30 g de azúcar,
- \bullet
- 1 a 200 mg de una sal de hierro seleccionada del grupo consistente en FeCl_{3} y FeSO_{4},
- \bullet
- 1 a 700 mg de una sal de magnesio seleccionada del grupo consistente en MgCl_{2} y MgSO_{4},
- \bullet
- 0,1 a 500 mg de CaCl_{2},
- \bullet
- 0 a 50 mg de ZnCl_{2},
- \bullet
- 10 a 250 g de NaCl, preferentemente 58,5 g/l, y
cuyo pH está comprendido en un intervalo de
valores que va de 6,2 a 7,5, y de preferencia se refiere a un medio
de cultivo M1 que, por litro y ventajosamente, consiste en: 30 g de
peptona de trigo, 5 g de extracto de levadura, 1 g de
D-glucosa H_{2}O, 120 mg de FeCl_{3}.6H_{2}O,
400 mg de MgCl_{2}.6H_{2}O, 10 mg de CaCl_{2}.2H_{2}O, 5,8
g de NaCl, 5 mg de ZnCl_{2}, 6,8 g de
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 6 g de NH_{4}Cl y pH=6,5.
La presente invención se va a describir con más
detalle en la descripción siguiente en referencia a la figura 1 que
proporciona una representación del protocolo de recuperación de los
polisacáridos.
Los inventores han descubierto, de manera
sorprendente, que el medio de cultivo M1 induce un aumento
sustancial de la capacidad de secreción de polisacárido capsular de
las cepas de Staphylococcus aureus. Dicho aumento se puede
poner de manifiesto por medición de la cantidad de polisacárido
capsular producida, por el método ELISA tal como se describe en el
ejemplo 2,4 siguiente. Dichas cepas de Staphylococcus aureus
que presentan una capacidad de producción acrecentada se denominan
en el marco de la presente invención como cepas
superproductoras.
Por tanto, en el marco de la presente invención
por "cepas superproductoras" se entiende una cepas de
Staphylococcus aureus que después de su cultivo en el medio
M1 produce una cantidad tal de polisacáridos capsulares en mg/l,
que determinada por el método ELISA descrito en el ejemplo 2.4, es
al menos 3 veces, preferentemente 5 veces y ventajosamente 10 veces
superior a la producida por cultivo de la misma cepa de partida en
el medio de Poutrel (véase Poutrel, B et al. (1995). Clin
Diagn Lab Immunol 2, 166-171 para una descripción
del medio o del ejemplo 1.1 siguiente) en las mismas condiciones de
cultivo.
En el caso de una cepa recombinante, por
"cepas superproductoras" se entiende una cepa de
Staphylococcus aureus recombinante que después de su
cultivo en el medio de cultivo M1 produce una cantidad de
polisacárido capsular en mg/l que, determinada por el método ELISA
descrito en el ejemplo 2.4, es al menos 2 veces superior que la
producida por cultivo de la misma cepa de partida en el medio TSB
(véase ejemplo 1.5 para una descripción del medio) en las mismas
condiciones de cultivo.
Los inventores han puesto de manifiesto, de
forma sorprendente, que el procedimiento de producción de cepas
superproductoras era aplicable a las cepas de Staphylococcus
aureus T5 y a las cepas T8. Los inventores observaron
igualmente que el procedimiento según la invención era igualmente
aplicable a las cepas recombinantes que fueron modificadas
genéticamente para superproducir su polisacárido capsular. Los
inventores han demostrado este aspecto aplicando el procedimiento
según la invención a la cepa CYL770 modificada genéticamente para
producir polisacárido capsular T8 en grandes cantidades. La cepa,
después de su cultivo en el medio M1, aumenta su capacidad de
secreción de polisacárido capsular por un factor 2, tal como se
describe en los ejemplos siguientes.
Por tanto, en el marco de la presente invención,
por "cepas de Staphylococcus aureus" se entiende
cualquier cepa de Staphylococcus aureus que exprese una
cápsula o microcápsula que comprenda un polisacárido de serotipo T5
y/o T8. Como ejemplos no limitativos de cepas apropiadas se pueden
citar las cepas Newman (T5), Reynolds (T5), Lowenstein (T5(),
Becker (T8), Wright (T8) y CYL770 (T8) y CYL1892 (T5).
Estas cepas son disponibles de diversos
institutos o diversas colecciones, se puede citar en particular la
colección del Instituto Pasteur (CIP): Reynolds CIP 103313, Becker
CIP 103314 o la ATCC: Wright ATCC9525, Lowenstein ATCC 49521. En el
marco de la presente invención se utilizan preferentemente las cepas
CYL770 (T8) y Reynolds (T5). La cepa CYL770 es una cepa Becker
modificada genéticamente para producir las mayores cantidades de
polisacárido capsular T8. Esta cepa se puede utilizar ventajosamente
como cepa de partida en el procedimiento de producción de cepas
superproductoras según la invención, así como en el procedimiento de
producción de polisacárido según la invención. Una descripción de
la cepa CYL770 se da en el artículo de Luong, T.T et Lee, C. Y
(2002), Infect. Immun. 70: 3389-3395. La cepa
CYL1892 designa la cepa de S. aureus recombinante, obtenida
a partir de una cepa Reynolds (CIP 103313) en la cual el promotor
del operón cap5 fue reemplazado por el promotor
constitutivamente fuerte del operón cap1 de la cepa M de S.
aureus según el procedimiento descrito por Luong et Lee (2002,
Infect. Immun. 70: 3389-3395) con las modificaciones
siguientes: las secuencias homólogas fueron reemplazadas por
secuencias equivalentes homólogas de la cepa Reynolds, el plásmido
pCL52.2 fue reemplazado por el plásmido pCL10 que contiene un
origen de replicación termosensible y que comprende un marcador cat
(cloroanfenicol acetil transferasa que confiere una resistencia al
cloroanfenicol). Brevemente, un fragmento de ADN de aproximadamente
1 kb que contiene el ORF cap5 de la cepa Reynolds fusionado a
un fragmento de aproximadamente 250 bp que contiene el promotor
Pcap 1 se construye por cabalgamiento, por la técnica de
PCR. Un fragmento de ADN de aproximadamente 1 kb que contiene la
secuencia aguas arriba del gen cap5A se amplifica por PCR a
partir del genoma de la cepa Reynolds. Los dos fragmentos se clonan
a continuación en el plásmido pCL10 que porta un origen de
replicación sensible a la temperatura y que porta un marcador
cat, de manera que el promotor Pcap5 sea reemplazado
por el promotor Pcap1. El plásmido así constituido se somete
a continuación a electroforesis en una cepa RN4220, después se
introduce por transducción en la cepa Reynolds con ayuda del
bacteriófago 52. La sensibilidad del origen de replicación a la
temperatura del plásmido permite a continuación favorecer la
recombinación homóloga bloqueando su replicación y aplicando una
selección por el cloroanfenicol.
Por "polisacárido capsular" en el marco de
la presente invención se entienden los polisacáridos capsulares T5
y/o T8 de las cepas de Staphylococcus aureus, así como los
fragmentos de ellos derivados.
Por "medio de cultivo" en el marco de la
presente invención se entiende un medio exento de proteína de origen
animal.
Por "proteína de origen animal" se
entienden las proteínas obtenidas a partir de materia de origen
animal, así como cualquier producto derivado, tales como los
productos procedentes del tratamiento químico de las proteínas
animales. Se entienden igualmente los productos de la hidrólisis
parcial o total de esas proteínas animales tales como las peptonas,
los polipéptidos, los péptidos o los aminoácidos de ellos
derivados.
El procedimiento de producción de una cepa
superproductora según la invención comprende (a) una etapa de
cultivo de una cepa de Staphylococcus aureus.
Según un modo de realización, la etapa de
cultivo utiliza un medio de cultivo M1 que comprende:
- \bullet
- 5 a 100 g de peptona vegetal,
- \bullet
- 0,5 a 20 g de extracto de levadura,
- \bullet
- 1 a 30 g de azúcar,
- \bullet
- 1 a 200 mg de una sal de hierro seleccionada del grupo consistente en FeCl_{3} y FeSO_{4},
- \bullet
- 1 a 700 mg de una sal de magnesio seleccionada del grupo consistente en MgCl_{2} y MgSO_{4},
- \bullet
- 0,1 a 50 mg de CaCl_{2},
- \bullet
- 0 a 50 mg de ZnCl_{2},
- \bullet
- 10 a 250 g de NaCl, preferentemente 58,5 g/l, y
cuyo pH está comprendido en un intervalo de
valores que va de 6,2 a 7,5.
\vskip1.000000\baselineskip
La fuente de nitrógeno proteico en el medio M1
utilizado es aportada principalmente por una peptona vegetal.
Por "peptona vegetal" en el marco de la
presente invención se entienden las peptonas seleccionadas del grupo
compuesto por: peptona de trigo y peptona de guisante. Las peptonas
vegetales están generalmente en forma de hidrolizados obtenidos por
tratamiento enzimático o químico de las proteínas extraídas
generalmente de partes de la planta que contienen los mayores
contenidos en proteínas tales como, por ejemplo, el germen de
trigo. Preferentemente se utilizan plantas que no fueron modificadas
genéticamente. En el caso de tratamientos químicos, el extracto
proteico es sometido a la acción del ácido clorhídrico en caliente y
a presión. A continuación, el hidrolizado se neutraliza con sosa y
después se libera de los subproductos sólidos. En el caso de
tratamientos enzimáticos, el extracto proteico se digiere
habitualmente con papaína. Las peptonas obtenidas están constituidas
principalmente por una mezcla de aminoácidos y pequeños péptidos
cuyo PM es \leq 1 KD. Los péptidos cuyo PM es > 1 KD
representan menos del 30% de la mezcla. Los preparados comerciales
referenciados bajo los nombres (Hy-Pea 7404 de
Quest ref. 5710565, peptona de trigo E1 de Organotechnie ref. 19559)
son ejemplos de hidrolizados de peptonas vegetales utilizables en
el marco de la presente invención.
La concentración de peptona vegetal utilizada en
el medio M1 se selecciona teniendo en cuenta el contenido en
nitrógeno proteico de la peptona y teniendo en cuenta la
concentración en extracto de levadura. Este contenido se calcula
por el método de Kjeidahl. Para mayores detalles se puede consultar
por ejemplo el artículo de Lynch J.M. et al, J. AOAC Int
(1999) 82 (6): 1389-98. Habitualmente, los
contenidos en nitrógeno proteico de las peptonas vegetales
seleccionadas están comprendidos entre 8% y 15% (peso/peso). En este
intervalo de valores, la concentración en peptona vegetal
utilizable es de 5 a 100 g por litro de medio de cultivo,
preferentemente de 20 a 50 g/l y, en particular, 30 g/l.
La fuente de nitrógeno proteico utilizada en el
medio M1 se aporta igualmente por el extracto de levadura. Los
contenidos en nitrógeno proteico en los extractos de levadura son
generalmente de 9 a 13% (peso/peso). El extracto de levadura se
utiliza en una concentración de 0,5 a 20 g/l de medio de cultivo y,
en particular, a una concentración de 5 g/l. El nitrógeno proteico
del medio de cultivo puede ser aportado igualmente en forma de
sales minerales, como ejemplo se pueden citar las sales de amonio
tales como el cloruro o sulfato. Estas sales minerales se pueden
utilizar a concentraciones que se ajustarán en función de los
aportes suministrados por otras fuentes de nitrógeno.
Las concentraciones en fuentes de nitrógeno
proteico se ajustan de tal manera que el contenido en nitrógeno
proteico total no conduzca a un hipercatabolismo nitrogenado que
pueda ser responsable de la acumulación de desechos tóxicos en el
transcurso del cultivo. Por otra parte, para evitar la aparición de
un efecto inhibidor sustancial de un exceso de vitaminas aportadas
por el extracto de levadura, este último no se utiliza más que como
fuente secundaria de nitrógeno proteico y, de preferencia, a una
concentración de 5 g/l.
Según un modo de realización ventajoso, el medio
de cultivo M1 comprende, por litro de medio, 30 g de peptona,
preferentemente de peptona de trigo y 5 g de extracto de
levadura.
El medio de cultivo comprende igualmente una
fuente de azúcar.
Por "fuente de azúcar" en el marco de la
presente invención se entiende cualquier fuente de azúcar de origen
no animal, metabolizable por la bacteria, tal como fructosa, ribosa,
xilosa, fucosa o glucosa. Se pueden utilizar concentraciones del
orden de 1 a 30 g/l de medio de cultivo. Por ejemplo, para la
glucosa se utiliza ventajosamente una concentración de 1 g/l.
El medio de cultivo M1 comprende igualmente
sales minerales y, en particular, al menos sales, preferentemente
cloruros, de hierro, magnesio, calcio, cinc y de sodio en las
cantidades siguientes:
- -
- 1 a 200 mg de una sal de hierro seleccionada del grupo consistente en FeCl_{3} y FeSO_{4} y en particular 120 mg de FeCl_{3}, por litro de medio de cultivo;
- -
- 1 a 700 mg de una sal de magnesio seleccionada del grupo consistente en MgCl_{2} y MgSO_{4} y en particular 400 mg de MgCl_{2}, por litro de caldo de cultivo;
- -
- 0,5 a 50 mg de CaCl_{2} y en particular 10 mg de CaCl_{2}, por litro de caldo de cultivo;
- -
- 0 a 50 mg de ZnCl_{2} y en particular 5 mg de ZnCl_{2}, por litro de caldo de cultivo; y
- -
- 10 a 250 g de NaCl, preferentemente 58,5 g por litro de caldo de cultivo.
\vskip1.000000\baselineskip
Las sales minerales de Fe, Ca y Mg se utilizan
normalmente en forma hidratada. En el marco de la presente
invención, en los medios de cultivo se utilizaron las sales
hidratadas siguientes: FeCl_{3}.6H_{2}O, MgCl_{2}.6H_{2}O,
CaCl_{2}.2H_{2}O.
El medio M1 presenta un pH inicial comprendido
en un intervalo de valores que va de 6,2 a 7,5, de preferencia un pH
de 6,5, por lo que cualquier sal mineral clásicamente utilizada por
su poder tampón y que permita obtener un pH dentro del intervalo de
valores indicado anteriormente puede ser utilizada si fuera
necesario. Para la determinación del pH, la medición del pH se
efectúa con ayuda de un pH-ímetro a la temperatura ambiente.
El medio M1 puede comprender igualmente agentes
reguladores de la presión osmótica tal como glicerofosfato y/o
glicina-betaína a concentraciones de 1 a 10 mM para
la glicina-betaína y 50 a 100 mM para el
glicerofosfato, el cual puede ser añadido ventajosamente cuando la
concentración de NaCl sea superior a 1 M (50 g/l).
El medio de cultivo M1 utilizado corresponde
preferentemente a un medio líquido. No obstante, se puede presentar
en forma sólida. La forma sólida o gelosada se obtiene por adición
al medio líquido de una sustancia gelificante, habitualmente agar a
una concentración de 10 a 30 g por litro de medio de cultivo.
Según un modo de realización ventajoso, el medio
de cultivo M1 comprende, y preferentemente consiste en, por litro:
30 g de peptona de trigo, 5 g de extracto de levadura, 1 g de
D-glucosa H_{2}O, 120 mg de FeCl_{3}.6H_{2}O,
400 mg de MgCl_{2}.6H_{2}O, 10 mg de CaCl_{2}.2H_{2}O, 58,5
g de NaCl, 5 mg de ZnCl_{2}, 6,8 g de
(NH_{4})_{2}SO_{4} y 6 g de NH_{4}Cl, y presenta un
pH de 6,5.
La etapa de cultivo se puede realizar
inseminando el medio M con un inóculo, por ejemplo con una DO680 nm
inicial de 0,2 e incubación a 37ºC, por ejemplo durante un tiempo de
aproximadamente 48 a 72 horas en una atmósfera que contiene o no
CO_{2} en una concentración de 5 a 10% (para el tipo 5 sin
CO_{2} y, en el caso de la utilización de la cepa Becker, con
CO_{2}). El volumen de cultivo puede variar en función de las
necesidades. Se pueden utilizar volúmenes de 400 mL a 20 L o
volúmenes superiores, por ejemplo de 30 L a 100 L. Preferentemente
se mantiene una relación del volumen de medio de cultivo respecto al
volumen del recipiente de cultivo de 20% (V/V). Para grandes
volúmenes, la oxigenación se controla y regula en el transcurso del
cultivo por un ajuste de la presión de oxígeno y una agitación
apropiada.
En función de las necesidades, la etapa de
cultivo puede comprender cultivos sucesivos en volúmenes crecientes
con objeto de aumentar la biomasa y la cantidad de polisacáridos
producidos.
Según un modo de realización ventajoso, el
procedimiento de producción de cepas superproductoras comprende una
etapa de precultivo en un medio de precultivo M0 que, por litro,
comprende:
- \bullet
- 1 a 30 g de peptona vegetal,
- \bullet
- 0,5 a 20 g de extracto de levadura,
- \bullet
- 1 a 30 g de azúcar,
- \bullet
- 1 a 200 mg de una sal de hierro seleccionada del grupo consistente en FeCl_{3} y FeSO_{4},
- \bullet
- 1 a 700 mg de una sal de magnesio seleccionada del grupo consistente en MgCl_{2} y MgSO_{4},
- \bullet
- 0,1 a 50 mg de CaCl_{2},
- \bullet
- 0,1 a 50 mg de ZnCl_{2},
- \bullet
- 0 a 50 g de NaCl, preferentemente 6 g/l, y
cuyo pH está comprendido en un intervalo de
valores que va de 6,2 a 7,5.
\vskip1.000000\baselineskip
Para las definiciones de los diferentes
componentes podemos remitir a las definiciones dadas anteriormente
en relación con el medio de cultivo M1.
Por el contrario, en el marco de la etapa de
precultivo se utilizan preferentemente 3,87 o 30 g de peptona, en
particular peptona de trigo, por litro de medio de precultivo. La
concentración de NaCl en el medio M0 es preferentemente de 6 g por
litro. El medio de precultivo M0 en la etapa de precultivo es
preferentemente bien un medio gelosado que comprende 3,87 g de
peptona de trigo por litro o bien un medio líquido que comprende 30
g de peptona de trigo por litro.
Según un modo de realización ventajoso, la etapa
de precultivo se emplea para el cultivo de la cepa en un medio de
precultivo M0 que comprende y, de preferencia, consiste en, por
litro: 30 g de peptona de trigo, 5 g de extracto de levadura, 1 g
de D-glucosa H_{2}O, 120 mg de
FeCl_{3}.6H_{2}O, 400 mg de MgCl_{2}.6H_{2}O, 10 mg de
CaCl_{2}.2H_{2}O, 6 g de NaCl, 5 mg de ZnCl_{2}, 6,8 g de
(NH_{4})_{2}SO_{4} y 6 g de NH_{4}Cl, pH=6,5.
Según otro modo de realización ventajoso, la
etapa de precultivo se emplea para el cultivo de la cepa en un
medio de precultivo M0 líquido o gelosado y que comprende y, de
preferencia, consiste en: 3,87 g de peptona de trigo o 30 g/l para
el medio M0 líquido, 5 g de extracto de levadura, 1 g de
D-glucosa H_{2}O, 120 mg de FeCl_{3}.6H_{2}O,
400 mg de MgCl_{2}.6H_{2}O, 10 mg de CaCl_{2}.2H_{2}O, 6 g
de NaCl, 5 mg de ZnCl_{2}, 6,8 g de
(NH_{4})_{2}SO_{4} y 6 g de NH_{4}Cl, pH=6,5.
La etapa de precultivo permite una amplificación
del inóculo. Ésta se puede realizar por inseminación del medio de
precultivo M0 con una cepa de Staphylococcus aureus, por
ejemplo a razón de 1.10^{7} CFUe incubación a 37ºC durante un
tiempo que puede variar por ejemplo entre 5 a 20 horas, en una
atmósfera que contiene o no 5 a 10% en vol. de CO_{2} (sin
CO_{2} para el T5 y en presencia de CO_{2} en el caso de
utilizar la cepa Becker). Con objeto de aumentar la biomasa, la
etapa de precultivo puede comprender sucesivos precultivos en
volúmenes crecientes de medio M0. A continuación, el precultivo
sirve para inseminar el medio líquido M1. Para hacer esto, se puede
utilizar una cantidad de inóculo tal que la DO680 nm inicial sea de
0,2. El volumen de cultivo en la etapa de precultivo puede variar
normalmente de 400 mL a 20 L. Preferentemente, se mantiene una
relación de volumen del medio de precultivo en relación al volumen
del recipiente inferior o igual a 20%.
Después de la etapa de cultivo las cepas así
producidas se pueden recuperar por centrifugación y conservar en
forma de liofilizados o de congelados después de la adición de
glicerol al 20% o se pueden utilizar directamente para inseminar un
mayor volumen de medio de cultivo o también se pueden utilizar
directamente en el procedimiento de producción de polisacárido
capsular según la presente invención.
Según un modo de realización ventajoso, el
procedimiento de producción como el definido anteriormente
corresponde a un procedimiento de producción de una cepa Reynolds
superproductora.
Según otro modo de realización ventajoso, el
procedimiento de producción como el definido anteriormente
corresponde a un procedimiento de producción de una cepa CYL770
superproductora.
Según otro aspecto, la presente invención se
refiere por tanto a un procedimiento de producción de polisacárido
capsular, que comprende:
- (a)
- el cultivo de una cepa de Staphylococcus aureus tal como la definida anteriormente, en un medio de cultivo M1 tal como el definido anteriormente,
- (b)
- la inactivación del cultivo así producido, y
- (c)
- la recuperación del polisacárido capsular.
La etapa (a) de cultivo del procedimiento de
producción de polisacárido capsular se puede realizar en las mismas
condiciones que las descritas anteriormente en relación con la etapa
(a) del procedimiento de producción de cepas superproductoras e,
igualmente, puede estar precedido por una etapa de precultivo tal
como la descrita anteriormente.
El cultivo resultante de la etapa (a) es
sometido a continuación a una etapa de inactivación.
La etapa de inactivación se puede realizar por
tratamiento del cultivo con una mezcla de fenol/etanol (V/V) a
razón de 2% en volumen final, después agitación, por ejemplo con
ayuda de una barrita imantada, a temperatura ambiente durante 6
horas a 48 horas, en función de la biomasa a tratar. La inactivación
se controla mediante un ensayo de mortalidad. Para ello, 100
microlitros del cultivo tratado se extienden sobre una gelosa
Columbia 2% NaCl y, en paralelo, 100 microlitros del cultivo
tratado se inseminan en caldo de tripticasa de soja con adición de
1/30de suero de caballo. Los cultivos se incuban durante 48 h a 37ºC
en posición estática, los tapones de los frascos de caldo
permanecen sueltos. La inactivación de los cultivos se puede
controlar por un método que comprende una etapa de amplificación en
medio TSB (sin adición de suero) bajo agitación a 37ºC durante 16 a
18 h, después una placa de Petri de gelosa Columbia 2% NaCl se
insemina con 150 \mul del cultivo así amplificado. La propia
placa se dispone a 37ºC durante 16 a 18 h y se observa. Una ausencia
de colonias atestigua el éxito de la inactivación de la colonia
tratada. La ausencia de bacterias viables se traduce por una
ausencia de gérmenes después de 24 horas de incubación a 37ºC. Una
vez establecida la mortalidad del cultivo se recupera el
polisacárido capsular. La etapa de recuperación comprende una
extracción del polisacárido a partir de las células. Se han
descrito en la bibliografía diferentes técnicas de extracción y se
pueden utilizar en el marco de la presente invención. Se puede
hacer referencia, por ejemplo, a los artículos de Lee J.C. Infect.
Immunu. 1993; 67: 1853-1858; Dassy B. et al
J. Gen. Microbiol. 1991; 137: 1155-1162. Un método
de extracción por tratamiento en autoclave a 121ºC se describe en
el ejemplo 2.3. Una técnica de extracción que utiliza lisostafina
se describe en el ejemplo 2.5.
En el caso de la cepa CYL770, la mayor parte del
polisacárido es secretada en el sobrenadante de cultivo y, por
tanto, puede ser recuperado directamente a partir de éste último.
Para hacer esto a partir del cultivo, se centrifuga el medio y el
sedimento celular se elimina.
El polisacárido capsular resultante se puede
purificar a continuación, si fuera necesario. Se han descrito en la
bibliografía diferentes técnicas de purificación que pueden ser
utilizadas en el marco de la presente invención. Se puede hacer
referencia, por ejemplo, a los artículos de Lee J.C. et al
1987; 55: 2191-2197; Fattom A. et al.,
Infect. Immun. 1990; 58: 2367-2374. Una técnica de
purificación se describe en el ejemplo 2.5.
El análisis de la composición molar en
monosacárido y el análisis por RMN del protón a 500 MHz muestran que
se obtiene un polisacárido cuya estructura es conforme a la
descrita en la bibliografía, con una tasa de
O-acetilación superior al 70% y una tasa de pureza
de al menos 70%. Los productos residuales están presentes en el
producto final a razón de aproximadamente 0,5 a 3% (p/p) de
residuales de naturaleza proteica y menos de 0,1% (p/p) de ácidos
nucleicos residuales y menos de 5% (p/p) de ácido lipoteicoico y
ácido teicoico residuales.
La cantidad de polisacárido capsular obtenido se
puede evaluar por la técnica ELISA tal como se describe en el
ejemplo 2.4.
Por tanto, el procedimiento de producción de
polisacárido según la invención se puede utilizar ventajosamente
para producir polisacárido T5, de preferencia a partir de una cepa
Reynolds tal como CIP 103313, y de polisacárido T8, de preferencia
a partir de la cepa CYL770.
El medio M0 tal como el definido anteriormente
es un medio adaptado al cultivo de Staphylococcus aureus.
En el marco de la presente invención, por
"medio adaptado al cultivo de Staphylococcus aureus" se
entiende un medio que permite obtener por una parte un aumento de
la biomasa por un factor de al menos 10, tal como se determinó por
la medida de la densidad óptica a 680 nm y, por otra parte, una
viabilidad tal que la relación DO/CFU sea de al menos 1 unidad de
DO=10^{8}CFU/ml. Para determinar esta relación DO/CFU, la
suspensión bacteriana cuya densidad óptica ha sido medida con ayuda
de un espectrofotómetro se diluye en tampón PBS utilizando
diluciones en razón 10. El número de CFU contenidos en estas
diluciones se evalúa después de la inseminación de estos últimos en
una placa de Petri que contiene un medio nutritivo (tal como gelosa
Colombia). Después de una incubación de 24 h a 37ºC, se cuentan las
bacterias viables pudiendo ser establecida así la correspondencia
entre el número de bacterias viables expresado en Unidad que forman
colonias (CFU) y la densidad óptica (DO).
Según otro aspecto, la presente invención se
refiere también al medio de cultivo M1 tal como fue definido
anteriormente, adaptado a la superproducción de polisacárido
capsular de Staphylococcus aureus.
En el marco de la presente invención, por
"medio adaptado a la superproducción de polisacárido capsular"
se entiende a un medio que conduce a un aumento de la capacidad de
secreción de polisacárido capsular de una cepa de Staphylococcus
aureus, que se traduce por una producción tal de polisacárido
capsular, determinada por un ensayo ELISA como el definido en el
ejemplo 2.4, al menos 3 veces, de preferencia al menos 5 veces y en
particular al menos 10 veces superior que la producida por el
cultivo de la misma cepa de partida en las mismas condiciones de
cultivo, pero en el medio de Poutrel.
En el caso de cepas recombinantes, se considera
que el medio se adapta a la superproducción de polisacárido
capsular si conduce a un aumento de la capacidad de secreción de
polisacárido capsular de una cepa de Staphylococcus aureus
recombinante, que se traduce en una producción tal de polisacárido
capsular, determinada por un ensayo ELISA como el definido en el
ejemplo 2.4, al menos 2 veces superior a la producida por el cultivo
de la misma cepa de partida en las mismas condiciones de cultivo,
pero en el medio TSB.
La presente invención se va a describir ahora de
forma más detallada en los ejemplos siguientes, los cuales se dan a
título puramente ilustrativo de la invención y, en ningún caso, se
pueden considerar como limitativos del alcance de ésta última.
En un primer tiempo, se preparan las soluciones
madre de cada uno de los componentes. Para hacer esto, los
componentes se pesan en una balanza de precisión y se disuelven en
agua ultrafiltrada (salvo indicación contraria). Las soluciones así
obtenidas se filtran a continuación sobre estericup 0,22 micras y se
conservan a +4ºC al abrigo de la luz. Las soluciones madre de
peptonas de trigo, de extracto de levadura y de FeCl_{3} se
preparan extemporáneamente.
El medio de Poutrel se prepara como se indica en
el artículo de Poutrel et al., (Poutrel, B et al.
(1995). Clin Diagn Lab Immunol 2, 166-171) por
mezcladura de las diferentes soluciones madre. A continuación, el pH
se ajusta en 7 por adición de NaOH al 30%, después el medio se
filtra sobre 0,22 micras.
La composición final en g/l de medio es:
L-cistina: 0,24 g/L; ácido
L-aspártico 2,4 g/L; ácido
L-glutámico: 2,4 g/L; L-prolina:
2,4 g/L; L-arginina: 0,36 g/L;
L-glicina: 2,4 g/L; L-histidina:
0,48 g/L; L-lisina HCl: 0,6 g/L;
L-serina 2,4 g/L; L-valina: 0,48
g/L; L-tirosina: 0,18 g/L;
L-treonina: 2,4 g/L; L-alanina: 2,4
g/L; L-isoleucina: 0,6 g/L;
L-leucina: 0,6 g/L; L-fenilalanina:
0,2 g/L; L-triptófano: 0,06 g/L;
L-metionina: 0,18 g/L; D-glucosa:
10 g/L; ácido nicotínico: 11,94 mg/L; tiamina HCl: 0,6 mg/L; sulfato
de amonio: 6,84 g/L; dihidrógenofosfato de potasio: 1,34 g/L;
difosfato de sodio; 14,38 g/L; cloruro de calcio: 5 mg/L; cloruro
de cobalto hexahidratado: 2,4 mg/L; sulfato de cobre: 0,5 mg/L;
sulfato de manganeso: 5,6 mg/L; cloruro de sodio: 5,8 mg/L; cloruro
de cinc: 3,4 mg/L; cloruro de hierro: 27 mg/L; sulfato de magnesio:
247 mg/L.
En un primer tiempo, 150 ml de base gelosada se
preparan por disolución de 3 g de agar en 150 mL de H_{2}O
ultrafiltrada. La composición resultante se dispone al
baño-maría en ebullición hasta la desaparición de
los granos de agar (aproximadamente 30 min), después se esteriliza
en autoclave durante 30 minutos a 116ºC.
A continuación, se prepara el medio M0 gelosado
por mezcladura de las diferentes soluciones madre en el orden
indicado en la composición siguiente), filtración de la mezcla
resultante sobre estericup 0,22 micras y adición de la mezcla así
obtenida bajo 50 mL a la base gelosada, de manera a obtener un medio
que contiene, en g por litro:
peptona de trigo: 3,87 g; extracto de levadura:
5 g; D-glucosa H_{2}O: 1 g; NaCl: 6 g;
MgCl_{2}.6H_{2}O: 0,4 g;
(NH_{4})_{2}SO_{4}: 6,8 g; NH_{4}Cl: 6 g; FeCl_{3}.6H_{2}O: 120.10^{-3} g; ZnCl_{2}: 5.10^{-3} g; CaCl_{2}.2H_{2}O: 10.10^{-3} g. Se vierte en 8 placas de Petri.
(NH_{4})_{2}SO_{4}: 6,8 g; NH_{4}Cl: 6 g; FeCl_{3}.6H_{2}O: 120.10^{-3} g; ZnCl_{2}: 5.10^{-3} g; CaCl_{2}.2H_{2}O: 10.10^{-3} g. Se vierte en 8 placas de Petri.
La peptona de trigo utilizada corresponde a la
peptona de trigo de Organotechnie (ref. 19559). El extracto de
levadura utilizado corresponde al extracto de Beckton Dickinson
(ref. 212750):
El medio M0 líquido se prepara por mezcladura de
las diferentes soluciones madre en el orden indicado en la
composición siguiente, y filtración de la mezcla resultante sobre
estericup 0,22 micras, de manera a obtener un medio que contiene,
en g por litro:
peptona de trigo: 30 g; extracto de levadura: 5
g; D-glucosa H_{2}O: 1 g; NaCl: 6 g;
MgCl_{2}.6H_{2}O: 0,4 g; (NH_{4})_{2}SO_{4}: 6,8
g; NH_{4}Cl: 6 g; FeCl_{3}.6H_{2}O: 120.10^{-3} g;
ZnCl_{2}: 5.10^{-3} g; CaCl_{2}.2H_{2}O: 10.10^{-3} g,
pH=6,5.
El medio M1 se prepara por mezcladura de las
diferentes soluciones madre en el orden indicado en la composición
siguiente, y filtración de la mezcla resultante sobre estericup 0,22
micras, de manera a obtener un medio que contiene, en g por
litro:
peptona de trigo: 30 g; extracto de levadura: 5
g; D-glucosa H_{2}O: 1 g; NaCl: 58,5 g;
MgCl_{2}.6H_{2}O: 0,4 g;
(NH_{4})_{2}SO_{4}: 6,8 g; NH_{4}Cl: 6 g; FeCl_{3}.6H_{2}O: 120.10^{-3} g; ZnCl_{2}: 5.10^{-3} g; CaCl_{2}.2H_{2}O: 10.10^{-3} g.
(NH_{4})_{2}SO_{4}: 6,8 g; NH_{4}Cl: 6 g; FeCl_{3}.6H_{2}O: 120.10^{-3} g; ZnCl_{2}: 5.10^{-3} g; CaCl_{2}.2H_{2}O: 10.10^{-3} g.
Para 1 litro de medio se pesan 44 g de Columbia
"Blood Agar Base" (Difco ref. 279240), después se añaden 500
mL de H_{2}O ultrafiltrada estéril. La mezcla obtenida se incuba
al baño-maría a 100ºC durante aproximadamente 30
minutos (hasta la disolución completa y obtención de una solución
límpida). A continuación se añaden 500 ml de H_{2}O ultrafiltrada
estéril.
La solución se reparte en frascos Schotts de 200
ml, después se esteriliza en autoclave a 116ºC durante 30 minutos.
Los medios se mantienen a continuación a 55ºC
(baño-maría) antes de ser vertidos en placas de
Petri (250 mL/placa). Antes de verter en las placas, se añaden 13,3
mL de NaCl 30% (filtrado por 0,22 \mum) por frasco de 200 mL para
obtener una concentración final de 2% (=2 g/100 ml).
Para 1 litro de medio se pesan 40 g de
"Tryptic Soy Agar" (Difco ref. 236950), después se añaden 500
mL de H_{2}O ultrafiltrada estéril. La mezcla obtenida se incuba
al baño-maría a 100ºC durante aproximadamente 30
minutos (hasta la disolución completa y obtención de una solución
límpida). A continuación se añaden 500 ml de H_{2}O ultrafiltrada
estéril. La solución se reparte en frascos Schotts de 200 ml,
después se esteriliza en autoclave a 116ºC durante 30 minutos. Los
medios se mantienen a continuación a 55ºC
(baño-maría) antes de ser vertidos en placas de
Petri (250 mL/placa).
Para 1 litro de medio se pesan 30 g de "Bacto
Tryptic Soy" (Difco ref. 211825), después se añaden 500 mL de
H_{2}O ultrafiltrada estéril. La mezcla obtenida se incuba al
baño-maría a 100ºC durante aproximadamente 30
minutos (hasta la disolución completa y obtención de una solución
límpida). A continuación se añaden 500 ml de H_{2}O ultrafiltrada
estéril. La solución se reparte en frascos Schotts de 200 ml,
después se esteriliza en autoclave a 116ºC durante 30 minutos. Los
medios se mantienen a continuación a 55ºC
(baño-maría) antes de ser vertidos en placas de
Petri (250 mL/placa).
Ejemplo
2
Se prepararon congelados de dos formas
diferentes según que se los deseara disponer en condiciones exentas
de compuestos de origen animal o en condiciones estándar. Para las
condiciones estándar, un liofilizado de origen se recoge sobre una
gelosa Colombia+2% NaCl. Esta última se cultiva durante 18 horas a
37ºC con o sin CO_{2} en función de la cepa. El cultivo se
resiembra en una nueva placa de gelosa durante 4 horas a 37ºC para
obtener gérmenes en fase exponencial de crecimiento. El cultivo se
recupera entonces en caldo tripticasa soja, al cual se ha añadido
20% de glicerol. En el caso en que se requieran condiciones exentas
de compuestos de origen animal, el precultivo se realiza en medio
M0 durante 18 horas a 37ºC, después el inóculo sirve para inseminar
un medio líquido M0. La congelación se efectúa igualmente después de
la adición de glicerol al 20%.
Un congelado Reynolds de 100 \muL obtenido por
el primer método citado anteriormente se recoge en 900 \muL de
PBS.
Dos placas de Petri con medio M0 gelosado y dos
placas de Petri con gelosa Columbia 2% NaCl, de napa, se inseminan
con 150 \muL de suspensión bacteriana por placa y se incuba
18-20 h a 37ºC.
Las napas se raspan y se vuelven a suspender en
5 mL de PBS. Se mide la DO_{680} de las suspensiones, lo que
permite determinar el volumen de precultivo necesario para inseminar
los erlenmeyer de 50 mL a una DO_{680 \ nm}=0,2.
El precultivo sobre gelosa Columbia 2% NaCl se
utiliza para inseminar un erlenmeyer con medio de Poutrel, y el
precultivo en M0 gelosado (18-20 h a 37ºC) se
utiliza para inseminar un erlenmeyer con medio M0 líquido y un
erlenmeyer con medio M1. Los volúmenes son variables en función de
los ensayos, lo más frecuente de 50 mL. Para mantener una buena
oxigenación, el volumen del medio es inferior o igual a 20% del
volumen del erlenmeyer. Después de la verificación de las DO_{680
\ nm} iniciales, los erlenmeyer se disponen bajo agitación (x 100
rpm) a 37ºC.
El seguimiento de los cultivos se hace por
medición de la DO a 680 nm a t_{0}, t_{8h}, t_{24h}, t_{32},
t_{48}, t_{56h}, y t_{72h}, el pH inicial se mide, así como a
las 72 h de cultivo. Los resultados obtenidos en los cultivos de 50
ml se indican en las tablas 1 y 2 siguientes.
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\vskip1.000000\baselineskip
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A las 72 h los cultivos se reparten en 4 frascos
Schott de 1 L que contiene cada uno 750 mL de cultivo.
Se añaden 15 mL de fenol/etanol (v/v) para 750
mL de cultivo, es decir 2% final, y se agita la mezcla con ayuda de
una barrita imantada, a temperatura ambiente durante 48 h
aproximadamente.
El ensayo de mortalidad se realiza de la forma
siguiente:
100 \muL de cultivo tratado se extienden sobre
gelosa Columbia 2% NaCl, y
100 \muL de cultivo tratado se inseminan en
caldo tripcasa soja + 1/30 de suero de caballo, después se incuba
durante 48 h a 37ºC (los tapones de los frascos de caldo tripcasa
soja se sueltan). Los cultivos así inactivados se utilizan para
extraer el polisacárido y evaluar la cantidad producida, por
ELISA.
Los cultivos de 72 h inactivados se centrifugan
a continuación durante 30 min a 3500 rpm a 4ºC, los sobrenadantes
de los cultivos se separan y se conservan a 4ºC. Los sedimentos se
recogen en 5 ml de PBS y se tratan en autoclave 60 min a 121ºC,
después se centrifugan 30 min a 25000 g+4ºC. Se recupera el
sobrenadante (extracto 1). Los sedimentos se recogen en 5 mL de
PBS, se tratan en autoclave 60 min a 121ºC y se centrifugan 30 min a
25000 g+4ºC. El sobrenadante (extracto 2) se recupera. Los
extractos 1 y 2 se reúnen y se tratan con 50 microgramos de
proteinasa K 50/ml durante 1 h a 37ºC, después se inactiva la
proteína 20 minutos a 75ºC.
Los sueros policlonales dirigidos contra la
cápsula de tipo 5 o de tipo 8 fueron producidos según el método
descrito por karakawa et al., J. C.in. Microbiol. 1985,
sept.; 22(3):445-7. Los monoclonales
utilizados fueron producidos por el protocolo tal como se describe
por Hochkeppel et al., J. Clin. Microbiol. 1987 mar;
25(3):526-30 y que nos fueron transmitidos
por el Instituto Pasteur.
La cantidad de polisacárido capsular producido
se determina por ELISA. Para hacer esto, se efectúa un ensayo ELISA
de tipo emparedado sobre placas de 96 pocillos (Nunc, Roskilde,
Dinamarca). En un primer tiempo, se deposita en los pocillos un
anticuerpo monoclonal anti-CP5 (1 microgramo por ml
en un tampón carbonato de sodio 0,05 M, pH=9,6 (sigma) - 100
ng/pocillo), las placas se incuban toda la noche a 4ºC. A
continuación, se lavan las placas 4 veces con 300 mililitros de
tampón PBS por pocillo (Eurobio) al que se añadieron 0,05% de Tween
20 (sigma) (PBS-Tween), después se saturaron durante
una hora a 37ºC con 250 mililitros por pocillo de
PBS-Tween al que se añadió 1% (vol/peso) de BSA
(Eurobio) (PBS-Tween-BSA). Las
placas se lavan a continuación tres veces con la solución
PBS-Tween.
Se efectuaron diluciones en serie por un factor
2 de los extractos de la etapa 2.3 por utilización de la solución
PBS-Tween-BSA y se añadieron a razón
de 100 microlitros por pocillo. Las placas se incuban durante 90
minutos a 37ºC, después se lavan 4 veces con
PBS-Tween. Los anticuerpos policlonales de conejo
anti-CP5 producidos según el protocolo de Karakawa
(Karakawa et al., 1985, J. Clin. Microbiol. 1985, sept.;
22(3):445-7) se diluyen en
PBS-Tween-BSA (1/2000), después se
añaden a los pocillos a razón de 100 microlitros por pocillo, y se
incuban durante 90 minutos a 37ºC. A continuación, las placas se
lavan 4 veces con PBS-Tween. El conjugado IgG de
cabra anti-conejo - peroxidasa (Southern biotech.),
diluido en PBS-Tween-BSA (1/6000) se
añade a razón de 100 microlitros por pocillo y se incuba durante 1
hora a 37ºC. Las placas se lavan 8 veces con 300 mililitros de
PBS-Tween por pocillo y se añaden 100 microlitros
por pocillo de una solución de sustrato TMB (TEBU), después se
incuba a oscuras durante 15 min a temperatura ambiente
(aproximadamente 22ºC).
La reacción enzimática se detiene por adición de
100 microlitros de H_{3}PO_{4} 1 M (sigma) por pocillo.
Un lector de placa automático (Versamax) mide a
continuación la densidad óptica a 450 nm. El valor del testigo se
sustrae y la cantidad se evalúa por comparación con una curva
patrón.
Los resultados se indican en la tabla 3
siguiente.
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\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
La cepa Reynolds se cultiva como se describe en
el punto 2.1 según un protocolo que comprende un precultivo en
medio M0 gelosado, después un cultivo en 400 ml de medio M1 en
erlenmeyer. Los cultivos se reagrupan para obtener 3 litros de
cultivo a partir de los cuales se extrae y purifica el polisacárido
T5 producido.
El cultivo integro se inactiva por tratamiento
con fenol/etanol (V/V 2% final), después se centrifuga 30 min a
25000 g. Se obtiene un sedimento de aproximadamente 10,9 de gérmenes
inactivados húmedos, por litro de cultivo.
Los gérmenes se suspenden a razón de 0,5 g/ml de
Tris 50 mM, MgSO_{4} 2 mM, pH 7,5. Se añade una solución acuosa
de lisostafina de 5 mg/ml de manera a obtener una concentración
final de 100 \mug/ml. Después de una incubación de 4 horas a 37ºC
bajo agitación magnética, se añade una solución de benzonasa de 5
U/ml final y la incubación se efectúa durante 2 horas a 37ºC bajo
agitación magnética.
Después de la centrifugación (25000 g, 30 min),
los sobrenadantes de extracción se recogen, se agrupan y se
ultrafiltran. El sobrenadante se diluye previamente a ¼ en H_{2}O
para obtener un volumen suficiente para el sistema de
ultrafiltración. La ultrafiltración se realiza en 2 casetes UF 50 kD
en las condiciones siguientes: H_{2}O: 10 volúmenes; después Tris
50 mM pH 8,0: 3 volúmenes. El volumen del material retenido
permanece constante en el curso de la ultrafiltración. El material
retenido constituye lo que se denomina extracto CP5.
El extracto CP5 se incuba a 37ºC bajo agitación
en presencia de MgCl_{2} (1 mM al final) y de benzonasa (5 U/ml
final, es decir 40 U por gramo de gérmenes húmedos tratados).
Después de 3 horas de incubación se añade la benzonasa en una
concentración final de 5 U/ml, la incubación se continúa durante 3
horas. Se añade una solución acuosa de pronasa de 10 mg/ml, de
manera a obtener una concentración final de 4 U/ml (es decir 30 U
por gramo de gérmenes húmedos tratados), a la que se añadió
CaCl_{2} hasta una concentración final 1 mM. La mezcla se incuba
entonces durante 15 horas a 37ºC. Se efectúa una ultrafiltración 50
kD con el fin de eliminar los fragmentos de ácidos nucleicos y de
proteínas sobre 2 casetes UF 50 kD en las condiciones siguientes:
H_{2}O: 10 volúmenes; después Tris 50 mM pH 8,0: 3 volúmenes. El
volumen del material retenido permanece constante en el curso de la
ultrafiltración. Al material retenido anteriormente obtenido se
añade MgCl_{2} 1 mM al final, benzonasa 0,1 U/ml al final, y se
incuba 3 horas bajo agitación magnética.
Se añade una solución acuosa de pronasa de 10
mg/ml a una concentración final de 0,1 U/ml, a la que se añadió
CaCl_{2} a una concentración final 1mM, después se incuba durante
2 horas a 37ºC.
Se efectúa entonces una ultrafiltración sobre 2
casetes UF 30 KD en las condiciones siguientes: H_{2}O: 10
volúmenes; después Tris 50 mM pH 7,5: 3 volúmenes.
El material retenido presenta un precipitado /
turbidez blanquecina que se elimina por centrifugación a 8000 g/30
min.
A continuación, se efectúa una etapa de
purificación por cromatografía de intercambio de iones.
Ésta permite la eliminación de sustancias
residuales, especialmente ácido teicoico (TA) y ácido lipoteicoico
(LTA).
Se utilizan las condiciones siguientes: tres
columnas Hi Trap Q HP de 5 ml se conectan en serie (ref: Amersham
17-1154-01); tampón de equilibrado:
Tris 20 mM pH 7,5; caudal: 2 ml/min; inyección de la muestra en
tampón de equilibrado.
- -
- Tris 20 mM pH 7,5: 5 volúmenes de columna
- -
- gradiente Tris 20 mM pH 7,5 NaCl 0-0,5 M: 10 volúmenes de columna
- -
- Tris 20 mM, NaCl 0,5 M pH 7,5: 5 volúmenes de columna
- -
- gradiente Tris 20 mM pH 7,5 NaCl 0,5-1 M: 5 volúmenes de columna
- -
- Tris 20 mM, NaCl 1 M pH 7,5: 5 volúmenes de columna
- -
- Tris 20 mM, pH 7,5: 5 volúmenes de columna
\vskip1.000000\baselineskip
La elución se sigue por medición de la absorción
a 206 y 280 nm. Un análisis por CZE permite identificar los
diferentes componentes eluídos en el transcurso de la
cromatografía.
\newpage
El polisacárido CP5 se eluye en NaCl a una
concentración comprendida entre 0,2 M y 0,3 M. En las condiciones
cromatográficas utilizadas, éste se separa bien de las sustancias
residuales. Especialmente el ácido teicoico que se eluye entre 0,36
M y 0,48 M en NaCl y el ácido lipoteicoico que se eluye entre 0,74 M
y 0,86 M en NaCl. Las fracciones que contienen el CP5 se reúnen y
se dializan a +4ºC frente a 20 volúmenes de una solución acuosa de
NaCl 0,5 M (2-3 baños) y después frente 20 volúmenes
de agua ultrafiltrada (3-4 baños). Así, se elimina
el Tris.
El producto purificado se liofiliza y se
conserva a -20ºC.
A partir de 3 litros de cultivo, al final de la
purificación se obtienen 74 mg de polisacárido capsular T5. Las
características del producto se indican en la Tabla 4 siguiente.
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La evaluación se realiza en las cepas Becker y
CYL770.
Se prepararon congelados de dos formas
diferentes según que se los deseara disponer en condiciones sin
compuestos de origen animal o en condiciones estándar. Para las
condiciones estándar, un liofilizado de origen se recoge sobre una
gelosa Colombia+2% NaCl. Esta última se cultiva durante 18 horas a
37ºC con o sin CO_{2}, en función de la cepa. El cultivo se
resiembra de nuevo sobre una nueva placa de gelosa durante 4 horas a
37ºC para obtener gérmenes en fase exponencial de crecimiento. El
cultivo se recupera entonces en caldo tripticasa soja, al cual se
ha añadido 20% de glicerol. En el caso en que se requieran
condiciones exentas de compuestos de origen animal, el precultivo
se realiza en medio M0 durante 18 horas a 37ºC, después el inóculo
sirve para resembrar un medio líquido M0. La congelación se efectúa
igualmente después de la adición de glicerol al 20%.
Un congelado de 100 \muL Becker preparado por
el método del caldo tripticase soja se recoge en 900 \muL de PBS.
Tres placas de Petri con M0 gelosado y dos placas de Petri con
gelosa Columbia 2% NaCl y una placa de Petri GTS se inseminan en
napa con 150 \muL de suspensión bacteriana por placa. Las placas
se incuban durante 18/20 h a 37ºC + 5% de CO_{2}.
Las napas se raspan y se vuelven a suspender en
5 mL de PBS.
Se mide la DO_{680} de las suspensiones lo que
permite determinar el volumen de precultivo necesario para
inseminar los erlenmeyer de 50 mL a DO_{680 \ nm}=0,2.
El precultivo sobre gelosa Columbia 2% NaCl se
utiliza para inseminar un erlenmeyer con medio de Poutrel, el
precultivo en GTS se utiliza para inseminar un erlenmeyer con TSB, y
el precultivo en medio M0 gelosado se utiliza para inseminar un
erlenmeyer con medio M0 líquido y un erlenmeyer con medio M1.
Para mantener una buena oxigenación, el volumen
del medio es inferior o igual a 20% del volumen del erlenmeyer.
Después de la verificación de las DO_{680 \
nm} iniciales, los erlenmeyer se disponen bajo agitación x 100 rpm
a 37ºC.
Se realizan experiencias similares en los
erlenmeyer que contienen 400 ml de cultivo.
Para la cepa recombinante CYL770, el método para
la preparación de los
congelados utiliza una resiembra del congelado
inicial en medio TSB o en un medio M0 líquido. El cultivo se
efectúa durante 5 horas a 37ºC bajo agitación. La congelación se
realiza después de la adición al medio de 20% de glicerol.
Un congelado de 1 ml de CYL770 así obtenido se
recoge en 10 ml de medio M0 líquido, después se dispone en
erlenmeyer de 50 ml y se incuba durante 18/20 h a 37ºC bajo
agitación x 100 rpm. Un segundo congelado CYL770 se recoge en 10 ml
de medio TSB, después se dispone bajo agitación en las mismas
condiciones que anteriormente.
Se mide la DO_{680} de los precultivos
líquidos, que permite determinar el volumen de precultivo necesario
para inseminar los erlenmeyer con 50 mL a DO_{680 \ nm}=0,2.
El precultivo en TSB permite inseminar un
erlenmeyer con TSB y el precultivo en M0 líquido permite inseminar
un erlenmeyer con medio M1. Para mantener una buena oxigenación, el
volumen del medio es inferior o igual a 20% del volumen del
erlenmeyer.
Después de la verificación de las DO_{680 \
nm} iniciales, los erlenmeyer se disponen bajo agitación x 100 rpm
a 37ºC.
Se realizan experiencias similares en los
erlenmeyer que contienen 400 ml de cultivo.
El seguimiento de los cultivos se hace por
medición de las DO a 680 nm a t_{0}, t_{8h}, t_{24h},
t_{32}, t_{48}, t_{56h}, y t_{72h}.
Se mide el pH inicial, así como a las 72 h de
cultivo. Los resultados de los cultivos en 50 ml se indican en la
tabla 5 siguiente.
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
Los cultivos se inactivan según el mismo
protocolo que el descrito en el punto 2.2 anterior. La extracción
del polisacárido producido se realiza según el mismo protocolo que
el descrito en el punto 2.3 anterior.
La evaluación de la cantidad de polisacárido
producido se realiza utilizando el mismo ensayo ELISA que el
descrito en el punto 2.4 anterior, salvo que los anticuerpos
utilizados son anticuerpos anti-CP8 y el ensayo se
realiza sobre extractos de los sedimentos y sobre el sobrenadante de
cultivo. La absorción fue realizada con un ascitis que contiene el
monoclonal K8-24 diluido a 1/20000, y el anticuerpo
policlonal de conejo es un suero adsorbido diluido a 1/1000.
Los resultados obtenidos para los cultivos de 50
ml y de 400 ml se indican en la tabla 6 siguiente. Para los
cultivos de 400 ml el análisis se hace cada vez en una sola muestra
de 50 ml de un cultivo y, a continuación, se calcula la cantidad
total y se indica en la tabla 6.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La recuperación del polisacárido T8 fue
realizada a partir de cultivos en erlenmeyer de 400 ml de la cepa
Becker en medio M1 utilizando un procedimiento tal como el descrito
en el ejemplo 2 para la obtención del polisacárido T5.
La purificación del polisacárido T8 se realizó
igualmente a partir de cultivos en erlenmeyer de 400 ml de la cepa
CYL770 en medio M1 y de cultivos en medio TSB. Para hacer esto, se
inactivaron 800 ml de cultivo por tratamiento con fenol/etanol
según el procedimiento descrito anteriormente, después se centrifugó
30 min a 25000 g. Se obtuvieron 720 ml de sobrenadante.
A 500 ml de este sobrenadante se añadió una
cantidad de acetato de sodio, de manera a obtener una concentración
final de 4% en acetato de sodio. La suspensión se pone en agitación
durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después, se añade una
cantidad de etanol de manera a obtener una concentración final en
etanol de 50%. La suspensión se agita entonces a temperatura
ambiente durante 30 min, después se mantiene sin agitación una
noche a +4ºC.
Después de la centrifugación a 15000 g durante
30 min se recoge el sobrenadante. A este sobrenadante se añade
acetato de sodio y etanol de manera a obtener una concentración
final de 4% en acetato de sodio y de 85% en etanol. La suspensión
se pone en agitación 30 min a temperatura ambiente, después se
mantiene sin agitación una noche a 4ºC. Después de la
centrifugación a 15000 g durante 30 min se recoge el sedimento.
El sedimento así obtenido se recoge en 100 ml de
agua ultrafiltrada (concentración por un factor 5 en relación al
volumen de sobrenadante de cultivo centrifugado). Después de la
agitación magnética hasta la disolución completa del sedimento a
temperatura ambiente, la suspensión obtenida se dializa frente a 2
litros de agua ultrafiltrada con tres cambios del baño por día, a
temperatura ambiente, seguido de una etapa de una noche a 4ºC. A
continuación, a la suspensión así obtenida se añade Tris y
MgCl_{2} con el fin de obtener una concentración final en Tris de
50 mM y de MgCl_{2} de 1 mM. Esta solución se incuba a 37ºC en
presencia de benzonasa (5 U/ml final) bajo agitación. Después de 3
horas de incubación, se añade benzonasa a una concentración final
de 5 U/ml, y la incubación se continúa durante 3 horas.
Se añade una solución acuosa de pronasa de 10
mg/ml, de manera a obtener una concentración final de 4 U/ml, a la
que se añadió CaCl_{2} a una concentración final de 1 mM. Esta
etapa se incuba ahora durante 15 horas a 37ºC. Si aparece una
turbidez/opalescencia visible, se efectúa una centrifugación a 8000
g durante 30 min. Se efectúa una ultrafiltración 30 kDa con el fin
de eliminar los fragmentos de ácidos nucleicos y de proteínas en
las condiciones siguientes: H_{2}O: 10 volúmenes; después Tris 20
mM pH 7,5: 3 volúmenes.
El volumen del material retenido permanece
constante en el curso de la ultrafiltración y se obtiene una
solución límpida, muy ligeramente coloreada.
Si el material retenido obtenido presenta una
turbidez/opalescencia, ésta se elimina por centrifugación a 8000 g
durante 30 min.
A continuación se efectúa una etapa de
cromatografía de intercambio de iones para completar la eliminación
de las sustancias residuales, especialmente ácido teicoico (TA) y
ácido lipoteicoico (LTA) en las condiciones siguientes: gel Q
sefarosa HP: columna Hi Trap Q HP de 20 ml; tampón de equilibrado:
Tris 20 mM pH 7,5; caudal: 2 ml/min; inyección de la muestra en
tampón de equilibrado. Inyección del equivalente de 125 ml de
sobrenadante de cultivo para 20 ml de gel;
- -
- Tris 20 mM pH 7,5: 5 volúmenes de columna
- -
- gradiente Tris 20 mM pH 7,5 NaCl 0-0,5 M: 20 volúmenes de columna
- -
- Tris 20 mM, NaCl 0,5 M pH 7,5: 5 volúmenes de columna
- -
- Tris 20 mM, NaCl 1 M pH 7,5: 5 volúmenes de columna
- -
- Tris 20 mM, pH 7,5: 5 volúmenes de columna
\vskip1.000000\baselineskip
La elución se sigue por medición de la absorción
a 206 y 280 nm. Un análisis por CZE permite identificar los
diferentes componentes eluídos en el transcurso de la
cromatografía.
Así, pudimos determinar que el polisacárido CP8
se eluye a una concentración de NaCl comprendida entre 0,2 M y 0,3
M. En las condiciones cromatográficas utilizadas, éste se separa
bien de las sustancias residuales, cuya cantidad es ínfima después
de esta etapa de cromatografía. Especialmente el ácido teicoico que
se eluye entre 0,36 M y 0,48 M en NaCl y el ácido lipoteicoico que
se eluye entre 0,74 M y 0,86 M en NaCl.
Las fracciones que contienen el CP5 se reúnen y
se dializan a +4ºC frente a 20 volúmenes de una solución acuosa de
NaCl 0,5 M (2-3 baños) y después frente 20 volúmenes
de agua ultrafiltrada (3-4 baños). La etapa con
fuerte concentración de NaCl permite una buena eliminación del
Tris.
El producto así purificado se liofiliza y se
conserva a -20ºC.
Los resultados obtenidos se indican en la tabla
7 siguiente.
El congelado de la cepa Reynolds preparada por
el primer método del punto 2.1 se inocula a razón de 0,5% en vol.
en dos erlenmeyer con obstáculos de 2 L (E1 y E2) que contiene cada
uno 200 ml de medio caldo Triptona soja al que se añadió NaCl (55
g/L). Los erlenmeyer se incuban a 37ºC durante 5\pm1 horas (E1) o
48 horas (E2) bajo una agitación de 175 rpm.
La fermentadora Braun de 30 litros que contiene
20 litros del mismo medio se inocula con 70 ml de precultivo (E1)
estimado en aprox. 1,38.10^{11} CFU (aprox. 5 h de cultivo y
DO_{600\ nm} final en el erlenmeyer próxima a 4). El cultivo se
realiza en las condiciones siguientes: temperatura: 37ºC; duración
de cultivo: 48\pm 2 horas; regulación del pH a 6,50 con
NH_{4}OH 25% y H_{3}PO_{4} 10%; PO_{2} 30% (regulación en
cascada: agitación 20 a 80%, aire de 20 (1 vvm) a 60% (3 vvm),
enriquecimiento en oxígeno de 0 a 100%); presión: 100 mbar;
regulación antiespuma por struktol 1/50.
El seguimiento del cultivo se realiza las
primeras horas con tomas regulares, así como a 20\pm2 horas de
cultivo, 24\pm2 horas de cultivo, 42\pm2 horas de cultivo para
controlar la DO a 600 nm; determinar el peso seco; determinar la
viabilidad; observar la morfología; dosificar la glucosa; dosificar
el acetato y determinar la productividad en polisacárido por el
ensayo ELISA en 6 sedimentos de DO=50, después 4\pm2 horas,
18\pm2 horas, 24\pm3 horas, 44\pm3 horas y 48\pm2 horas de
cultivo.
Las células se recogen después de 48\pm2 horas
de cultivo en vasos de centrifugación de 1L (12 vasos/20 L de
cultivo) y se centrifugan 20 minutos a 7000 g a 4ºC. El peso húmedo
se determina después de eliminar el sobrenadante. Los sedimentos se
conservan a \leq -20ºC hasta la etapa de inactivación de los
gérmenes con fenol/etanol, seguida de la recuperación y
purificación del polisacárido T5 según el procedimiento del ejemplo
2. El segundo erlenmeyer (E2) se observa durante 48 horas con el fin
de seguir la productividad de la cápsula CP5 a las 10 h, 24 h y 48
h de cultivo.
El congelado de la cepa Staphylococcus
aureus Reynolds tipo 5 preparado según el primer método del
punto 2.1 se inocula a razón de 1% en vol. en dos erlenmeyer con
obstáculos de 2 L (E1 y E2) que contiene cada uno 200 ml de medio
Poutrel. Los erlenmeyer se incuban a 37ºC durante 16\pm1 horas a
una agitación de 175 rpm. Los precultivos se agrupan y se utilizan
para inocular la fermentadora. El cultivo en la fermentadora B.
Braun de 30 L que contiene 20 litros de medio Poutrel se realiza en
las condiciones siguientes: temperatura: 37ºC; duración de cultivo:
48\pm 2 horas; regulación del pH a 6,50 con NH_{4}OH 25% y
H_{3}PO_{4} 10%; PO_{2} 30% (regulación en cascada: agitación
20 a 80%, aire de 20 (1 vvm) a 60% (3 vvm), enriquecimiento en
oxígeno de 0 a 100%); presión: 100 mbar; regulación antiespuma por
struktol 1/5.
El cultivo se observa las primeras horas, así
como a 24\pm2 horas de cultivo y 30\pm2 horas de cultivo con
tomas para controlar la DO a 600 nm; determinar el peso seco;
determinar la viabilidad; observar la morfología; dosificar la
glucosa; dosificar el acetato, dosificar los aminoácidos libres y
determinar la productividad en polisacárido por el ensayo
ELISA.
Las células se recogen después de 48\pm2 horas
de cultivo Se recogieron 2 L de recolección en un Schott de 2 L y
se trataron con fenol/etanol (v/v) a una concentración final de 2%
(v/v). Esta mezcla se pone en agitación durante 6 h\pm1 horas a
22ºC\pm3ºC. Después de eliminar el sobrenadante del resto de
cultivo, los sedimentos bacterianos se recogen en un volumen mínimo
de tampón PBS, después se tratan en autoclave para la inactivación
y recuperación del polisacárido según el procedimiento descrito en
el ejemplo 2 anterior.
El resto del cultivo se recoge en vasos de
centrifugación de 1 L (12 vasos/18 L de cultivo) y se centrifuga 20
minutos a 7000 g a 4ºC. El peso húmedo se determina después de
eliminar el sobrenadante. 2 litros de sobrenadante se conservan a
\leq -20ºC después de la filtración 0,45 \mum y de 55 minutos en
autoclave a 121ºC.
Los 12 sedimentos se vuelven a suspender en un
volumen mínimo de tampón PBS (aproximadamente 650 mL) con ayuda del
Ultraturax. Las suspensiones se agrupan, homogeneizan y reparten
equitativamente en 3 Schott de 500 mL (aproximadamente 300
mL/schott) antes del tratamiento en autoclave durante 55 min a
121ºC. A continuación, las suspensiones del autoclave se agrupan y
el polisacárido se recupera según el protocolo descrito en el
ejemplo 2 anterior.
Un congelado de Staphylococcus aureus
Reynolds tipo 5 preparado según el primer método del punto 2.1 se
inocula a razón de 1% en vol. en dos erlenmeyer con obstáculos de 2
L que contiene cada uno 200 ml de medio Columbia + 20 g/l de NaCl
(difco ref. 294420). Los erlenmeyer se incuban a 37ºC durante
24\pm1 horas a una agitación de 175 rpm. Tras 24\pm1 horas, los
precultivos se agrupan y se utilizan para inocular la fermentadora.
El cultivo en la fermentadora de 30 L B. Braun que contiene 20 L del
mismo medio se realiza en las condiciones siguientes: temperatura:
37ºC; duración de cultivo: 24\pm2 horas; regulación del pH a 7,00
con NH_{4}OH 25% y H_{3}PO_{4} 10%; PO_{2} 30% (regulación
en cascada: agitación 20 a 80%, aire de 20 (1 vvm) a 60% (3 vvm),
enriquecimiento en oxígeno de 0 a 100%); presión: 100 mbar;
regulación antiespuma por struktol 1/50.
El cultivo se observa regularmente por tomas
regulares para controlar la DO a 600 nm; determinar el peso seco;
determinar la viabilidad; observar la morfología; dosificar la
glucosa; dosificar el acetato y determinar la productividad en
polisacárido por el ensayo ELISA.
Las células se recogen a continuación después de
24\pm2 horas de cultivo. El cultivo final se transfiere a vasos
de centrifugación de 1 L (12 vasos/20 L de cultivo) y se centrifuga
20 minutos a 7000 g a 4ºC. El peso húmedo se determina después de
eliminar el sobrenadante. Después de la centrifugación, los 12
sedimentos se suspenden en un volumen mínimo de tampón PBS
comprendido entre 1 y 1,2 L con ayuda del Ultraturax. Las
suspensiones se agrupan, homogeneizan y reparten equitativamente en
frascos Schott de 500 mL después se tratan en autoclave durante 55
min a 121ºC. A continuación, las suspensiones tratadas en autoclave
se agrupan y el polisacárido se recupera según el protocolo
descrito en el ejemplo 2 anterior.
Un congelado de Staphylococcus aureus
Reynolds tipo 5 preparado según el primer método descrito en el
punto 2.1 anterior se recoge en tampón PBS 1C a razón de 1% mL de
congelado por 9 mL de tampón para inseminar aproximadamente 10
placas con medio M0 gelosado, a razón de 150 \muL/placa.
Las placas se incuban a 37ºC durante 15 a 18
horas. Tras una incubación de 15-18 h a 37ºC, las
napas formadas se raspan antes de ser suspendidas en medio M1 para
inocular dos erlenmeyer de composición idéntica (200 mL/2 L - E1 y
E2) de manera a obtener una DO_{600 \ nm} inicial próxima a 0,2 en
cada erlenmeyer. Los erlenmeyer se incuban a 37ºC bajo agitación de
175 rpm durante aproximadamente 5 h (cultivo en fase exponencial E1)
o 72 h (E2).
Una parte del cultivo de E1 (DO_{600 \ nm}
próxima a 3) se utiliza para inocular la fermentadora B. Braun de
30L que contiene 20 L de medio M1, de manera a obtener una DO_{600
\ nm} inicial próxima a 0,02).
El cultivo se realiza en las condiciones
siguientes: temperatura: 37ºC; duración de cultivo: 72\pm 4 horas;
regulación del pH a 6,50 con NH_{4}OH 25% y H_{3}PO_{4} 10%;
PO_{2} 30% (regulación en cascada: agitación 20 a 80%, aire de 20
(1 vvm) a 60% (3 vvm), enriquecimiento en oxígeno de 0 a 100%);
presión: 100 mbar; regulación antiespuma por struktol 1/50.
1 L de cultivo se recoge a continuación en vasos
de centrifugación y se centrifuga 20 minutos a 7000 g a 4ºC con el
fin de determinar el peso húmedo después de eliminar el
sobrenadante. Los residuos se conservan a \leq -20ºC.
El resto del cultivo se recoge en Nalgeno de 50
L y se inactiva con fenol/etanol (2% final v/v), y el polisacárido
se recupera según el protocolo descrito en el ejemplo 2
anterior.
El conjunto de resultados obtenidos se indica en
la tabla 8 siguiente.
Claims (14)
1. Procedimiento de producción de una cepa
superproductora de Staphylococcus aureus, que comprende:
- (a)
- el cultivo de una cepa de Staphylococcus aureus en un medio de cultivo M1 que, por litro de medio de cultivo, comprende:
- \bullet
- 5 a 100 g de peptona vegetal,
- \bullet
- 0,5 a 20 g de extracto de levadura,
- \bullet
- 1 a 30 g de azúcar,
- \bullet
- 1 a 200 mg de una sal de hierro seleccionada del grupo consistente en FeCl_{3} y FeSO_{4},
- \bullet
- 1 a 700 mg de una sal de magnesio seleccionada del grupo consistente en MgCl_{2} y MgSO_{4},
- \bullet
- 0,1 a 500 mg de CaCl_{2},
- \bullet
- 0 a 50 mg de ZnCl_{2},
- \bullet
- 10 a 250 g de NaCl, preferentemente 58,5 g/l, y
cuyo pH está comprendido en un intervalo de
valores que va de 6,2 a 7,5, y
eventualmente la recuperación de las cepas así
producidas a partir del medio de cultivo.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un procedimiento de producción de una cepa
superproductora según la reivindicación 1, en la cual el medio de
cultivo M1 de la etapa (a) comprende peptona de trigo.
3. Un procedimiento de producción de una cepa
superproductora según la reivindicación 1 o 2, en la cual el medio
de cultivo M1, por litro de medio de cultivo, comprende:
- \bullet
- 30 g de peptona de trigo,
- \bullet
- 5 g de extracto de levadura,
- \bullet
- 1 g de D-glucosa H_{2}O,
- \bullet
- 120 mg de FeCl_{3}.6H_{2}O,
- \bullet
- 400 mg de MgCl_{2}.6H_{2}O,
- \bullet
- 10 mg de CaCl_{2}.2H_{2}O,
- \bullet
- 58,5 g de NaCl
- \bullet
- 5 mg de ZnCl_{2},
- \bullet
- 6,8 g de (NH_{4})_{2}SO_{4},
- \bullet
- 6 g de NH_{4}Cl y pH=6,5.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Un procedimiento de producción según la
reivindicación 3, en el cual el medio M1 consiste por litro en: 30
g de peptona de trigo, 5 g de extracto de levadura, 1 g de
D-glucosa H_{2}O, 120 mg de FeCl_{3}.6H_{2}O,
400 mg de MgCl_{2}.6H_{2}O, 10 mg de CaCl_{2}. 2H_{2}O, 58,5
g de NaCl, 5 mg de ZnCl_{2}, 6,8 g de
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 6 g de NH_{4}Cl y pH=6,5.
5. Un procedimiento de producción de una cepa
superproductora según una cualquiera de las reivindicaciones
precedentes, que comprende una etapa de precultivo en un medio de
cultivo M0 que comprende:
- \bullet
- 3 a 50 g de peptona vegetal,
- \bullet
- 0,5 a 20 g de extracto de levadura,
- \bullet
- 1 a 30 g de azúcar,
- \bullet
- 1 a 200 mg de una sal de hierro seleccionada del grupo consistente en FeCl_{3} y FeSO_{4},
- \bullet
- 1 a 700 mg de una sal de magnesio seleccionada del grupo consistente en MgCl_{2} y MgSO_{4},
- \bullet
- 0,1 a 50 mg de CaCl_{2},
- \bullet
- 0 a 50 mg de ZnCl_{2},
- \bullet
- 2 a 50 g de NaCl, preferentemente 6 g/l, y
cuyo pH está comprendido en un intervalo de
valores que va de 6,2 a 7,5.
\vskip1.000000\baselineskip
6. Un procedimiento de producción según la
reivindicación 5 en el cual el medio M0 de la etapa de precultivo
comprende 3,87 g o 30 g de peptona de trigo.
7. Un procedimiento de producción según una
cualquiera de las reivindicaciones 5 o 6, en el cual el medio M0 de
la etapa de precultivo comprende:
- \bullet
- 3,87 o 30 g de peptona de trigo y vegetal,
- \bullet
- 5 g de extracto de levadura,
- \bullet
- 1 g de D-glucosa H_{2}O,
- \bullet
- 120 mg de FeCl_{3}.6H_{2}O,
- \bullet
- 400 mg de MgCl_{2}.6H_{2}O,
- \bullet
- 10 mg de CaCl_{2}.2H_{2}O,
- \bullet
- 6 g de NaCl,
- \bullet
- 5 mg de ZnCl_{2},
- \bullet
- 6,8 g de (NH_{4})_{2}SO_{4},
- \bullet
- 6 g de NH_{4}Cl, y pH=6,5.
\vskip1.000000\baselineskip
8. Un procedimiento de producción de
polisacárido capsular que comprende:
- (a)
- el cultivo de una cepa de Staphylococcus aureus en un medio de cultivo M1 tal como el definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4,
- (b)
- la inactivación del cultivo así producido, y
- (c)
- la recuperación del polisacárido capsular.
\vskip1.000000\baselineskip
9. Un procedimiento de producción de
polisacárido capsular según la reivindicación 8, en el cual el medio
M1 de la etapa de cultivo comprende peptona de trigo.
10. Un procedimiento de producción de
polisacárido capsular según una cualquiera de las reivindicaciones 8
o 9, en el cual el medio M1 de la etapa de cultivo comprende por
litro de medio de cultivo: 30 g de peptona de trigo, 5 g de
extracto de levadura, 1 g de D-glucosa H_{2}O,120
mg de FeCl_{3}.6H_{2}O, 400 mg de MgCl_{2}.6H_{2}O, 10 mg
de CaCl_{2}.2H_{2}O, 58,5 g de NaCl, 5 mg de ZnCl_{2}, 6,8 g
de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 6 g de NH_{4}Cl y pH=6,5.
11. Un procedimiento de producción de
polisacárido capsular según la reivindicación 10, en el cual el
medio M1, por litro de medio de cultivo, consiste en: 30 g de
peptona de trigo, 5 g de extracto de levadura, 1 g de
D-glucosa H_{2}O, 120 mg de FeCl_{3}.6H_{2}O,
400 mg de MgCl_{2}.6H_{2}O, 10 mg de CaCl_{2}.2H_{2}O, 58,5
g de NaCl, 5 mg de ZnCl_{2}, 6,8 g de
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 6 g de NH_{4}Cl y pH=6,5.
12. Un procedimiento de producción de
polisacárido capsular según una cualquiera de las reivindicaciones 8
a 11 que comprende una etapa de precultivo tal como se define en
una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7.
\newpage
13. Medio de cultivo M1 adaptado a la
superproducción de polisacárido capsular que comprende:
- \bullet
- 5 a 100 g de peptona vegetal,
- \bullet
- 0,5 a 20 g de extracto de levadura,
- \bullet
- 1 a 30 g de azúcar,
- \bullet
- 1 a 200 mg de una sal de hierro seleccionada del grupo consistente en FeCl_{3} y FeSO_{4},
- \bullet
- 1 a 700 mg de una sal de magnesio seleccionada del grupo consistente en MgCl_{2} y MgSO_{4},
- \bullet
- 0,1 a 500 mg de CaCl_{2},
- \bullet
- 0 a 50 mg de ZnCl_{2},
- \bullet
- 10 a 250 g de NaCl, preferentemente 58,5 g/l, y
cuyo pH está comprendido en un intervalo de
valores que va de 6,2 a 7,5.
\vskip1.000000\baselineskip
14. Un medio de cultivo M1 según la
reivindicación 13 que comprende:
- \bullet
- 30 g de peptona de trigo,
- \bullet
- 5 g de extracto de levadura,
- \bullet
- 1 g de D-glucosa H_{2}O,
- \bullet
- 120 mg de FeCl_{3}.6H_{2}O,
- \bullet
- 400 mg de MgCl_{2}.6H_{2}O,
- \bullet
- 10 mg de CaCl_{2}.2H_{2}O,
- \bullet
- 58,5 g de NaCl,
- \bullet
- 5 mg de ZnCl_{2},
- \bullet
- 6,8 g de (NH_{4})_{2}SO_{4},
- \bullet
- 6 g de NH_{4}Cl y pH=6,5.
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