CN101166819A - 制备高产量金黄色葡萄球菌菌株的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及制备高产量金黄色葡萄球菌菌株的方法。所述方法包括(a)用培养基M1、M2和M3培养金黄色葡萄球菌菌株,以及(b)然后从该培养基中回收这样生产的菌株。本发明还涉及所述菌株用于生产多糖的用途。
Description
本发明涉及制备高产量金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)菌株的方法以及它们在制备荚膜多糖的方法中的应用。
金黄色葡萄球菌荚膜多糖,尤其5和8血清型多糖,在文献中被描述为制备防止由金黄色葡萄球菌引起的感染的疫苗的有意义的组分。
T5和T8菌株被微荚膜,并因此产生少量的有意义的荚膜多糖。由于目标人群的免疫体系的缺乏,制备疫苗中所包含的荚膜多糖的量是比较大的(例如,参见Fattom A等人(1995)Vaccine13,1288-1293)。
在这种疫苗的工业上开发中,重要的是能够产生大量的T5和T8荚膜多糖。
在这种前景下,发明人证实了一种显著提高金黄色葡萄球菌菌株分泌荚膜多糖的能力的新型方法。发明人因此提供了一种可以大量获得金黄色葡萄球菌荚膜多糖的生产方法。
根据第一个方面,本发明因此涉及制备高产量金黄色葡萄球菌菌株的方法,包括:
(a)在培养基M1中培养金黄色葡萄球菌菌株,每升该培养基中包含下列物质:
●5-100g的植物蛋白胨,
●0.5-20g的酵母提取物,
●1-30g的糖,
●1-200mg的选自FeCl3和FeSO4中的铁盐,
●1-700mg的选自MgCl2和MgSO4中的镁盐,
●0.1-500mg的CaCl2,
●0-50mg的ZnCl2,
●10-250g的NaCl,优选58.5g/l和
该培养基的pH值是在6.2-7.5的范围内,
(b)任选地,从该培养基中回收菌株。
根据高产量菌株的制备方法的一个特定实施方式,步骤(a)的培养基M1包括小麦蛋白胨。
根据高产量菌株的制备方法的一个有利的实施方式,以每升培养基为基准,培养基M1包括:
●30g的小麦蛋白胨,
●5g的酵母提取物,
●1g的D-葡萄糖H2O,
●120mg的FeCl3·6H2O,
●400mg的MgCl2·6H2O,
●10mg的CaCl2·2H2O,
●58.5g的NaCl,
●5mg的ZnCl2,
●6.8g的(NH4)2SO4,
●6g的NH4Cl和pH=6.5。
根据另一个有利的实施方式,每升培养基M1包括:
30g的小麦蛋白胨,5g的酵母提取物,1g的D-葡萄糖H2O,120mg的FeCl3·6H2O,400mg的MgCl2·6H2O,10mg的CaCl2·2H2O,58.5g的NaCl,5mg的ZnCl2,6.8g的(NH4)2SO4和6g的NH4Cl,pH=6.5。
根据一个特定实施方式,高产量菌株的制备方法包括用包含下列组分的预培养基M0预培养的步骤:
●3-50g的植物蛋白胨,
●0.5-20g的酵母提取物,
●1-30g的糖,
●1-200mg的选自FeCl3和FeSO4中的铁盐,
●1-700mg的选自MgCl2和MgSO4中的镁盐,
●0.1-50mg的CaCl2,
●0-50mg的ZnCl2,
●2-50g的NaCl,优选6g/l,和
该培养基的pH值是在6.2-7.5的范围内。
根据制备高产量菌株的方法的一个特定实施方式,该预培养步骤采用每升包括3.87g小麦蛋白胨的预培养基M0。
根据制备高产量菌株的方法的另一个实施方式,该预培养步骤采用每升包含30g小麦蛋白胨的预培养基M0。
根据制备高产量菌株的方法的一个有利实施方式,该预培养步骤采用包括下列组分的琼脂预培养基M0:3.87g的小麦蛋白胨,5g的酵母提取物,1g的D-葡萄糖H2O,120mg的FeCl3·6H2O,400mg的MgCl2·6H2O,10mg的CaCl2·2H2O,6g的NaCl,5mg的ZnCl2,6.8g的(NH4)2SO4,6g的NH4Cl,15g/l的琼脂和pH=6.5。
根据制备高产量菌株的方法的另一个有利实施方式,该预培养步骤采用包括下列组分的液体预培养基M0:30g的小麦蛋白胨,5g的酵母提取物,1g的D-葡萄糖H2O,120mg的FeCl3·6H2O,400mg的MgCl2·6H2O,10mg的CaCl2·2H2O,6g的NaCl,5mg的ZnCl2,6.8g的(NH4)2SO4,6g的NH4Cl和pH=6.5。
根据一个实施方式,如以上所定义的方法是高产量金黄色葡萄球菌T5菌株的制备方法。
根据另一个实施方式,如以上所定义的方法是高产量金黄色葡萄球菌T8菌株的制备方法。
本发明还涉及采用如以上所定义的方法获得的高产量菌株以及所述菌株用于产生荚膜多糖的用途。本发明因此特别涉及采用上述方法获得的高产量Reynolds菌株,高产量Becker菌株和高产量CYL770菌株。
根据另一个方面,本发明因此提供了荚膜多糖的制备方法,包括:
(a)用如以上所定义的培养基M1培养金黄色葡萄球菌菌株,
(b)灭活这样形成的培养基,和
(c)回收荚膜多糖。
根据制备荚膜多糖的方法的一个实施方式,该培养步骤采用小麦蛋白胨的培养基M1。
根据一个实施方式,制备荚膜多糖的方法包括如以上关于制备高产量菌株所定义的预培养步骤。
本发明的主题同样为适于培养金黄色葡萄球菌的培养基M0,包括:
●3-50g的植物蛋白胨,
●0.5-20g的酵母提取物,
●1-30g的糖,
●1-200mg的选自FeCl3和FeSO4中的铁盐,
●1-700mg的选自MgCl2和MgSO4中的镁盐,
●0.1-50mg的CaCl2,
●0-50mg的ZnCl2,
●2-50g的NaCl,优选6g/l,和
该培养基的pH值是在6.2-7.5的范围内,
并且,本发明优选涉及每升有利地包括下列组分的琼脂或液体培养基M0:3.87g或30g的小麦蛋白胨,5g的酵母提取物,1g的D-葡萄糖H2O,120mg的FeCl3·6H2O,400mg的MgCl2·6H2O,10mg的CaCl2·2H2O,6g的NaCl,5mg的ZnCl2,6.8g的(NH4)2SO4,6g的NH4Cl和pH=6.5。
本发明的主题同样为适于高产量生产金黄色葡萄球菌荚膜多糖的培养基M1,包括:
●5-100g的植物蛋白胨,
●0.5-20g的酵母提取物,
●1-30g的糖,
●1-200mg的选自FeCl3和FeSO4中的铁盐,
●1-700mg的选自MgCl2和MgSO4中的镁盐,
●0.1-500mg的CaCl2,
●0-50mg的ZnCl2,
●10-250g的NaCl,优选58.5g/l和
该培养基的pH值是在6.2-7.5的范围内,
并且,本发明优选涉及每升包括且有利地由下列组分组成的培养基M1:30g的小麦蛋白胨,5g的酵母提取物,1g的D-葡萄糖H2O,120mg的FeCl3·6H2O,400mg的MgCl2·6H2O,10mg的CaCl2·2H2O,58.5g的NaCl,5mg的ZnCl2,6.8g的(NH4)2SO4,6g的NH4Cl和pH=6.5。
发明人已经证实,上述培养基M1能够有利地用简化培养基M2来替代。本发明因此还涉及如上所定义的高产量金黄色葡萄球菌菌株的制备方法和荚膜多糖的制备方法,其中培养基M1用如上所定义的培养基M2替代。
本发明的主题因此还是每升培养基包括下列组分的培养基M2:
●52.5-100g的植物蛋白胨,有利地小麦蛋白胨,
●0-82.5g的NaCl,有利地为5-82.5g,尤其41g/l的NaCl,
●0-15g/l的镁盐,有利地为0.01-15g/l,尤其15g/l的MgCl2·6H2O,以及
●0-7g/l的糖,有利地为0.25-7g/l,尤其0.25g/l的D-葡萄糖H2O,
该培养基M2的pH值是在6.3-6.7,有利地6.4-6.6的范围内。
根据一个特定实施方式,培养基M2包括,优选地组成为,93g/l的小麦蛋白胨,41g/l的NaCl,0.25g/l的D-葡萄糖·H2O和15g/l的MgCl2·6H2O,它的pH值是在6.3-6.7的范围内。
发明人还已经证实,可以使用培养基M3,其对应于培养基M2,植物蛋白胨用65-85g/l,有利地75g/l的酵母提取物替代的。本发明因此还涉及高产量的金黄色葡萄球菌菌株的制备方法以及如上所定义的荚膜多糖的制备方法,其中培养基M1用上述培养基M3替代。
因此本发明的主题同样为培养基M3,每升该培养基包括下列组分:
●65-85g的酵母提取物,有利地75g/l的酵母提取物,
●0-82.5g的NaCl,有利地5-82.5g,特别地41g/l的NaCl,
●0-15g/l的镁盐,有利地0.01-15g/l,特别地15g/l的MgCl2·6H2O,以及
●0-7g/l的糖,有利地0.25-7g/l,特别地0.25g/l的D-葡萄糖H2O,
该培养基M3的pH值是在6.3-6.7的范围内。
在参考图1的说明中更详细地描述了本发明。图1提供了回收多糖的程序的图示。
发明人令人惊讶地证明,培养基M1、M2和M3诱发了金黄色葡萄球菌菌株分泌荚膜多糖能力的显著增加。所述增加可以通过用如在以下实施例2.4中所述的用ELISA法测定所产生的荚膜多糖的量来证明。所述具有提高的分泌能力的金黄色葡萄球菌菌株在本发明中被称为高产量菌株。
在本发明中,术语“高产量菌株”可以理解为在用培养基M1或M2或M3培养后金黄色葡萄球菌菌株产生的荚膜多糖的量(按mg/l计),,如实施例2.4中所述的ELISA法的所测定结果,为相同培养条件下在Poutrel培养基(关于培养基的说明,参见Poutrel B等人(1995)。ClinDiagn Lab Immunol 2,166-171,或以下实施例1.1)中培养相同起始菌株所产生的量的至少3倍,优选5倍,有利地10倍。
在重组菌株的情况下,术语“高产量菌株”可以理解为重组金黄色葡萄球菌菌株,在用培养基M1或M2或M3培养后,其产生的荚膜多糖量(按mg/l计)为,如实施例2.4中所述的ELISA法的测定结果,在相同培养条件下用TSB培养基(关于培养基的说明,参见实施例1.5)培养的相同起始菌株所产生的量的至少大于2倍。
发明人令人惊讶地证实,制备高产量菌株的方法适用于金黄色葡萄球菌T5和T8菌株。发明人还观察到,根据本发明的方法还适用于已进行基因修饰以超额产生荚膜多糖的重组菌株。发明人通过将根据本发明的方法应用于经过基因修饰的CYL770菌株来大量产生T8荚膜多糖而证明了这个方面。用培养基M1或M2或M3培养后,如以下实施例中所述,该菌株分泌T8荚膜多糖的能力提高了2倍。
在本发明中,术语“金黄色葡萄球菌菌株”因此可以理解为表达包括T5和/或T8血清型多糖的荚膜或微荚膜的所有金黄色葡萄球菌菌株。作为适合的菌株的非限制性实例,可以提到Newman(T5),Reynolds(T5),Lowenstein(T5),Becker(T8),Wright(T8),CYL770(T8)和CYL1892(T5)菌株。
这些菌株可以从许多研究所或各个收藏机构获得;尤其可以提到巴斯德研究所的收藏(CIP):Reynolds CIP 103313,Becker CIP 103314,或ATCC:Wright ATCC 9525,Loweinstein ATCC 49521。在本发明中,优选使用CYL770(T8)和Reynolds(T5)菌株。CYL770菌株是经过基因修饰以产生更大量T8荚膜多糖的Becker菌株。该菌株可以在根据本发明的高产量菌株的制备方法中以及根据本发明的多糖的制备方法中用作起始菌株。Luong,T.T.和Lee,C.Y.(2002)在文章Infect.Immun.70:3389-3395中给出了CYL770菌株的说明。CYL1892菌株表示由Reynolds菌株(CIP103313)获得的重组金黄色葡萄球菌菌株,其中根据Luong和Lee所述的方法(2002 Infect.Immun.70:3389-3395),cap5操纵子启动子用金黄色葡萄球菌M菌株的cap1操纵子的强组成型启动子替换,具有以下改变:同源序列用Reynolds菌株的等效同源序列替代,质粒pCL52.2用含有热敏性复制起点且包括cat标记物(提供氯霉素耐药性的氯霉素乙酰转移酶)的质粒pCL10替代。简要的说,与含有Pcap1启动子的大约250bp的片段融合的含有Reynolds菌株的cap5ORF的大约1kp的DNA片段通过交叠PCR技术来构建。含有cap5A基因上游序列的大约1kb的DNA片段通过PCR由Reynolds菌株的基因组扩增。随后将该两个片段克隆到携带温度敏感性复制起点并且包括cat标记物的质粒pCL10中,使得Pcap5启动子被Pcap1启动子所替换。这样构建的质粒随后电穿孔到菌株RN4220内,然后通过采用噬菌体52的转导引入到Reynolds菌株内。该质粒的复制起点的温度敏感性随后使得可以通过阻断其复制和同时应用通过氯霉素的选择作用而促进同源重组。
在本发明中,术语“荚膜多糖”可以理解为金黄色葡萄球菌菌株的T5和/或T8荚膜多糖以及由此衍生的片段。
在本发明中,术语“培养基”可以理解为不含动物来源的蛋白的培养基。
表述“动物来源的蛋白”可以理解为由动物来源的材料获得的蛋白以及衍生的所有产物,例如由动物蛋白的化学处理所获得的衍生物。它还可以理解为这些动物蛋白的部分或完全水解产物,例如蛋白胨,多肽,肽或由此衍生的氨基酸。
根据本发明的高产量菌株的制备方法包括(a)培养金黄色葡萄球菌菌株的步骤。根据一个实施方式,该培养步骤采用含有下列组分的培养基M1:
●5-100g的植物蛋白胨,
●0.5-20g的酵母提取物,
●1-30g的糖,
●1-200mg的选自FeCl3和FeSO4中的铁盐,
●1-700mg的选自MgCl2和MgSO4中的镁盐,
●0.1-50mg的CaCl2,
●0-50mg的ZnCl2,
●10-250g的NaCl,优选58.5g/l和
该培养基的pH值是在6.2-7.5的范围内。
所使用的培养基M1中的蛋白氮源主要由植物蛋白胨提供。
在本发明中,术语“植物蛋白胨”可以理解为选自小麦蛋白胨和豌豆蛋白胨的蛋白胨。该植物蛋白胨通常为水解产物形式,该水解产物通过通常由含有最高蛋白含量的植物部分(例如小麦胚芽)提取的蛋白的酶或化学处理所获得。优选采用未进行基因改性的植物。在化学处理的情况下,蛋白提取物用盐酸在热条件和压力下作用。水解产物然后用氢氧化钠中和,然后除去固体副产物。在酶处理的情况下,蛋白提取物通常用木瓜蛋白酶消化。所得蛋白胨主要由氨基酸和MW≤1KD的小肽的混合物组成。MW>1KD的肽占该混合物的低于30%。商品名为Hy-Pea7404(出自Quest ref 5710565)和Peptone de ble E1(出自Organotechnieref.19559)的商品制剂是可以在本发明中可使用的植物蛋白胨水解产物的实例。
培养基M1中所用的植物蛋白胨的浓度通过考虑蛋白胨的蛋白氮含量和考虑酵母提取物的浓度来选择。该含量通过Kjeldahl方法来计算。关于详细情况,例如可以参考Lynch J.M等人,J.AOAC Int.(1999)82(6):1389-98。通常,所选择的植物蛋白胨的蛋白氮含量为8-15%(重量/重量)。在值的该范围内,可以使用的植物蛋白胨的浓度为5-100g/l的培养基,优选20-50g/l,特别是30g/l。
所用培养基M1中的蛋白氮源也通过酵母提取物来提供。酵母提取物中的蛋白氮含量通常是9-13%(重量/重量)。酵母提取物以0.5-20g/l培养基的浓度,特别地以5g/l培养基的浓度使用。培养基中的蛋白氮还可以无机盐的形式提供;举例而言,可以提到铵盐,例如氯化物或硫酸盐。该无机盐的使用浓度可以根据由其它氮源提供的量来调节。
调节蛋白氮源的浓度,使得总蛋白氮含量不导致氮代谢过度,这可以造成有毒废物在培养期间积聚。此外,为了防止出现由酵母提取物所提供的过量维生素造成的显著抑制效应,酵母提取物仅作为次要蛋白氮源使用,优选浓度为5g/l。
根据一个有利的实施方式,每升培养基M1包括30g蛋白胨,优选小麦蛋白胨和5g的酵母提取物。
培养基还包括糖源。
在本发明中,术语“糖源”可以理解为所有非动物来源的糖源,可以通过细菌代谢,例如果糖,核糖,木糖,岩藻糖或葡萄糖。可以使用大约1-30g/l的培养基的浓度。例如对于葡萄糖,有利地使用1g/l的浓度。
培养基M1还包括无机盐,特别地至少这些盐,优选铁、镁、钙、锌和钠的氯化物:
-1-200mg的选自FeCl3和FeSO4中的铁盐,特别地120mg的FeCl3/升的培养基;
-1-700mg的选自MgCl2和MgSO4中的镁盐,特别地400mg的MgCl2/升的培养基;
-0.5-50mg的CaCl2,特别地10mg的CaCl2/升的培养基;
-0-50mg的ZnCl2,特别地5mg的ZnCl2/升的培养基;和
-10-250g的NaCl,优选地58.5g/l的NaCl/升的培养基。
Fe、Ca和Mg的无机盐通常以水合形式使用。在本发明中,在培养基中使用下列水合盐:FeCl3·6H2O,MgCl2·6H2O,CaCl2·2H2O。
培养基M1具有在6.2-7.5的值范围内的初始pH值,优选地6.5;为此,如果需要,可以使用所有因其缓冲能力而被使用的和可以获得在上述范围内的pH值的任何常用的无机盐。为了测定pH,使用pH计在环境温度下测量。
培养基M1还可以包括渗透压调节剂,例如甘油磷酸盐和/或甘氨酸-甜菜碱,甘氨酸-甜菜碱的浓度为1-10mM,甘油磷酸盐的浓度为50-100mM;当NaCl浓度高于1M(58g/l)时,可以有利地加入渗透压调节剂。
所使用的培养基M1优选对应于液体培养基。然而,它可以是固体形式。固体或琼脂形式通过将凝胶形成物质加入到液体培养基中来获得,通常地为添加浓度为10-30g琼脂/升的培养基。
根据一个有利的实施方式,每升培养基M1包括,优选组成为:30g的小麦蛋白胨,5g的酵母提取物,1g的D-葡萄糖·H2O,120mg的FeCl3·6H2O,400mg的MgCl2·6H2O,10mg的CaCl2·2H2O,58.5g的NaCl,5mg的ZnCl2,6.8g的(NH4)2SO4和6g的NH4Cl,并且具有6.5的pH。
培养步骤可以通过用接种体,例如具有0.2的初始OD680nm,在培养基M1上接种,并且在37℃和在含有或者不含有浓度为5-10%的CO2的气氛下(对于5型,没有CO2,而在使用Becker菌株的情况下,有CO2)孵育一段时间,例如大约48-72小时。培养容积视需要可以改变,可以使用400ml-20l的容积或更大的容积,例如30l-100l。优选地,保持20%(V/V)的培养基容积与培养容器容积的比率。对于更大的容积,通过调节氧压和适当的搅拌在培养期间控制和调节氧化作用。
根据需要,培养步骤可以包括在增大容积中的接连培养,以便增加生物量和所产生的多糖量。
根据一个有利的实施方式,高产量菌株的制备方法包括用预培养基M0预培养的步骤,每升预培养基M0包括:
●1-30g的植物蛋白胨,
●0.5-20g的酵母提取物,
●1-30g的糖,
●1-200mg的选自FeCl3和FeSO4中的铁盐,
●1-700mg的选自MgCl2和MgSO4中的镁盐,
●0.1-50mg的CaCl2,
●0.1-50mg的ZnCl2,
●0-50g的NaCl,优选6g/l和
该培养基的pH值是在6.2-7.5的范围内
关于各种成分的定义,可以参考以上关于培养基M1所给出的定义。
另一方面,在预培养步骤中,优选使用3.87g或30g的蛋白胨,特别为小麦蛋白胨/升的预培养基。培养基M0中的NaCl的浓度优选为6g/l。预培养步骤中的预培养基M0优选是含有3.87g小麦蛋白胨/升的琼脂培养基,或含有30g小麦蛋白胨/升的液体培养基。
根据一个有利的实施方式,预培养步骤通过用预培养基M0培养菌株来进行,每升预培养基M0包括,优选地,每升的组成为:30g的小麦蛋白胨,5g的酵母提取物,1g的D-葡萄糖H2O,120mg的FeCl3·6H2O,400mg的MgCl2·6H2O,10mg的CaCl2·2H2O,6g的NaCl,5mg的ZnCl2,6.8g的(NH4)2SO4和6g的NH4Cl,pH=6.5。
根据另一个有利的实施方式,预培养步骤通过用液体或琼脂预培养基M0培养菌株来进行,该预培养基包括,优选地,每升的组成为:3.87g的小麦蛋白胨,或对于液体培养基M0来说为30g/l的小麦蛋白胨,5g的酵母提取物,1g的D-葡萄糖H2O,120mg的FeCl3·6H2O,400mg的MgCl2·6H2O,10mg的CaCl2·2H2O,6g的NaCl,5mg的ZnCl2,6.8g的(NH4)2SO4和6g的NH4Cl,pH=6.5。
该预培养步骤可以扩增接种体。它可以通过用金黄色葡萄球菌菌株接种于预培养基M0(例如,比例为1×107CFU)并且在37℃下和含有或者没有5-10体积%CO2的气氛中(对于T5,没有CO2,而在使用Becker菌株时,存在CO2)孵育一段时间,例如可以为5-20小时。为了增加生物量,该预培养步骤可以包括在容积递增的培养基M0中接连预培养。然后使用该预培养物来接种液体培养基M1。为此,可以采用一定量的接种体,例如初始的OD680nm为0.2。预培养步骤中的培养容积通常可以为400ml到20l。优选地保持低于或等于20%的预培养基容积与容器容积的比率。
培养步骤后,这样生产的菌株可以通过离心来回收,并以冻干产物的形式或添加20%甘油后的冷冻产物的形式保藏,或者可以直接用于接种更大容积量的培养基,或者仍可以直接用于根据本发明的荚膜多糖的制备方法中。
根据一个有利的实施方式,上面所定义的制备方法与高产量Reynolds菌株的制备方法相应。
根据另一个有利的实施方式,如上所定义的制备方法与制备高产量CYL770菌株的方法相应。
本发明还涉及用如上所定义的方法生产的高产量金黄色葡萄球菌菌株,特别是Reynolds,Becker和CYL770菌株。
发明人已经实施的实验计划表明,培养基M1可以简化,在根据本发明的方法中用如以下定义的培养基M2替代。
根据另一个实施方式,步骤(a)因此采用培养基M2,每升该培养基包括:
●52.5-100g的植物蛋白胨,有利地为小麦蛋白胨,
●0-82.5g的NaCl,有利地5-82.5g,特别地41g/l的NaCl,
●0-15g/l的镁盐,有利地0.01-15g/l,特别地15/l的MgCl2·6H2O,以及
●0-7g/l的糖,有利地0.25-7g/l,特别地0.25g/l的D-葡萄糖H2O,
●该培养基M2的pH值是在6.3-6.7的范围内。
关于所使用的术语的定义,参考以上与培养基M1相关的所给出的定义。
实验计划的结果表明,当植物蛋白胨含有至少5%的总糖含量时,不需要在培养基M2中添加糖。植物蛋白胨可以含有例如果糖、葡萄糖、甘露三糖、棉子糖、蔗糖或水苏糖的糖的混合物。如果情况不是这样,那么需要在培养基中再添加另一糖源。糖那么能够根据0.25g/l-7g/l再添加。
根据一个有利的实施方式,培养基M2包括0.25/l的糖,特别地D-葡萄糖H2O。
培养基M2可以有利地含有选自MgCl2和MgSO4中的镁盐。发明人证实,添加镁盐可以提高培养基的稳健性(在存在MgCl2的情况下,成分的变动范围是明显更窄的)。氯化镁,尤其MgCl2·6H2O,因此能够有利地以0.01/l到15g/l的培养基的范围加入到培养基M2。当培养基M2含有15g/l的MgCl2·6H2O时,观察到最佳的稳健性。更高浓度的镁盐没有带来稳健性的进一步提高。
发明人还已经证实,用具有宽NaCl浓度范围的培养基M2,观察到了改进的多糖生产能力。事实上,NaCl可以不存在,或者以培养基的5g/l到100g/l,有利地5g/l到82.5g/l的浓度范围使用。
而且,该实验计划可以显示出,在蛋白胨的浓度和NaCl的浓度之间具有强烈的相互作用。这样,在本发明的方法中,可以确定可以有利地使用的浓度范围。
根据一个特别有利的实施方式,如上所定义的培养基M2包括52.5-70g的植物蛋白胨,有利地小麦蛋白胨以及5-37g的NaCl。
根据另一个特别有利的实施方式,如上所定义的培养基M2包括66-82.5g的植物蛋白胨,有利地小麦蛋白胨以及22-74g的NaCl。
根据另一个特别有利的实施方式,如上所定义的培养基M2包括60-90.5g的植物蛋白胨,有利地小麦蛋白胨以及35-63.5g的NaCl。
根据另一个特别有利的实施方式,如上所定义的培养基M2包括79-95g的植物蛋白胨,有利地小麦蛋白胨以及46-82.5g的NaCl。
根据这四个实施方式的培养基M2能够有利地含有0.25g/l的葡萄糖,尤其D-葡萄糖和15g/l的MgCl2·6H2O。
根据一个特定实施方式,培养基M2包括,有利地组成为:93g/l的小麦蛋白胨,4g/l的NaCl,0.25g/l的D-葡萄糖·H2O和15g/l的MgCl2·6H2O,它的pH值是在6.3-6.7的范围内。例如这种培养基由Reynolds菌株获得了40mg/l的多糖T5的产率。
通过实验计划,发明人还揭示出,其中植物蛋白胨被65-85g/l有利地75g/l的酵母提取物所替代的如以上定义的培养基M2可以在根据本发明的方法中使用。该培养基被称为培养基M3。因此每升根据本发明的培养基M3包括:
●65-80g的酵母提取物,有利地75g/l的酵母提取物,
●0-82.5g的NaCl,有利地5-82.5g,尤其41g/l的NaCl,
●0-15g/l的镁盐,有利地0.01-15g/l,尤其15g/l的MgCl2·6H2O,以及
●0-7g/l的糖,有利地0.25-7g/l尤其0.25g/l的D-葡萄糖H2O,
●该培养基M3的pH值是在6.3-6.7的范围内。
附加的实验已经表明,植物蛋白胨范围(如以上所定义)可以延伸至200g/l的培养基的值。因此,含有比例为52.5-200g/l的植物蛋白胨的如上所定义的M2和M3培养基包括在在本发明的范围内。
本发明因此还涉及通过应用如上所定义的培养基M2或M3中的方法而制备的高产量金黄色葡萄球菌菌株,尤其Reynolds,Becker,CYL770和CYL1892菌株。
根据另一个方面,本发明因此涉及荚膜多糖的制备方法,包括:
(a)用如上所定义的培养基M1或M2或M3培养如上所定义的金黄色葡萄球菌菌株,
(b)灭活这样生产的培养物,以及
(c)回收该荚膜多糖。
荚膜多糖的制备方法的培养步骤(a)可以在与上述制备高产量菌株的方法的步骤(a)相同的条件下进行,并且还可以之前进行如上述的预培养步骤。
由步骤(a)获得的培养物然后进行灭活步骤。
该灭活步骤可以通过用2%的终体积比例的苯酚/乙醇(V/V)混合物处理培养物,然后用例如磁力搅拌棒在环境温度下搅拌6-48小时来进行,其搅拌时间取决于所要处理的生物量。灭活用致死率试验来检验。为此,将100微升的处理后的培养物淀积在哥伦比亚琼脂2%NaCl上,同时平行地,将100微升的处理后的培养物在加有1/30马血清的胰胨豆胨培养液中接种。将培养物在37℃下在静止位置孵育48小时,培养瓶的瓶塞保持旋松。培养物的灭活可以通过一种方法来控制,该方法包括在TSB培养基中的扩增步骤(不添加血清),在37℃下振荡16-18小时,然后将哥伦比亚琼脂2%NaCl的陪替氏培养皿用150μl的这样扩增的培养物接种。将该培养皿本身在37℃下放置16-18小时,然后观察。菌群体的缺乏证明成功灭活所处理的培养物。活菌的缺乏通过在37℃下孵育24小时后没有生长得到反映。培养物的死亡率一旦确立,回收荚膜多糖。回收步骤包括从细胞中提取荚膜多糖。文献中描述了各种提取技术,并且可以在本发明中使用。例如可以参考Lee J.C.Infect.Immunu.1993;67:1853-1858;Dassy B.等人,J.Gen.Microbiol.1991;137:1155-1162。实施例2.3举例说明了通过在121℃下高压灭菌来提取的方法。实施例2.5描述了采用溶葡萄球菌素的提取技术。
在CYL770菌株的情况下,大多数的多糖被分泌到培养物上清液中,因此可以直接从上清液中回收。为此,在培养结束时,将培养基离心,回收细胞粒状沉淀(pellet)。
如果需要,可以提纯所得荚膜多糖。文献中描述了许多提纯技术,并且可以在本发明中使用。例如,可以参考Lee J.C.等人,1987;55:2191-2197;Fattom A.等人,Infect.Immun.1990;58:2367-2374。实施例2.5举例说明了提纯技术。
单糖的摩尔组成分析和500MHz质子NMR分析显示,获得了多糖,它的结构符合文献中所述的结构,具有大于70%的O-乙酰化度和至少70%的纯度。残留材料以大约0.5-3%(w/w)的蛋白类残留材料和低于0.1%(w/w)残留核酸和低于5%(w/w)残留脂磷壁酸质和残留磷壁酸的存在于最终产物中。
所得荚膜多糖的量可以通过如实施例2.4中所述的ELISA技术来评价。
根据本发明的生产PS的方法因此可以有利地用于生产T5多糖,优选由Reynold菌株,如CIP103313,以及用于生产T8多糖,优选由CYL770菌株。
根据另一个方面,本发明因此涉及适合于培养金黄色葡萄球菌的如上所定义的培养基M0。
在本发明的中,“适合于培养金黄色葡萄球菌的培养基”可以理解为一方面可以获得生物量增加至少10倍(通过测定680nm下的光学密度来确定)和另一方面可以获得OD/CFU比率为至少1OD单位=108CFU/ml的成活率。为了测定该OD/CFU比率,将其光学密度已采用分光光度计测定的细菌悬液在PBS缓冲液中按10倍稀释度稀释。在含有营养液(如哥伦比亚琼脂)的陪替氏培养皿上接种这些稀释液后,估算这些稀释液中含有的CFU的数目。在37℃下孵育24小时后,对活菌计数,这样可以确定活菌数(表示为形成菌群落单位(CFU))和光学密度(OD)之间的一致性。
根据另一个方面,本发明还涉及适合于超额生产金黄色葡萄球菌荚膜多糖的如上所定义的培养基M1、M2和M3。
在本发明中,“适合于超额生产荚膜多糖的培养基”理解为使金黄色葡萄球菌菌株分泌荚膜多糖的能力提高的培养基,该培养基表现出其荚膜多糖的产生量(通过如实施例2.4中所定义的ELISA分析法测定)比在相同培养条件下,但用Poutrel培养基培养相同起始菌株所产生的量高至少3倍,优选至少5倍,尤其至少10倍。
在重组菌株的情况下,认为该培养基如果使重组金黄色葡萄球菌菌株分泌荚膜多糖的能力提高,则适合于超额生产荚膜多糖,该培养基表现出荚膜多糖的生产量(通过如实施例2.4中所定义的ELISA分析法测定)为通过在相同培养条件下,但用TSB培养基培养相同起始菌株所生产的量的至少2倍。
现将在以下实施例中更详细地说明本发明,它们为了纯粹举例说明本发明而给出的,决不能认为限制本发明的范围。
实施例1:培养基的制备
首先,制备每一种成分的母液。为此,用精密天平称量出各种成分,溶于超滤水(除非另有规定)。然后用0.22微米Stericup过滤器过滤这样获得的溶液,在+4℃下避光贮存。临时制备小麦蛋白胨、酵母提取物和FeCl3的母液。
1.1-Poutrel培养基
如Poutrel等人在文章(Poutrel,B等人,(1995)。Clin Diagn LabImmunol 2,166-171)中所述,通过混合各种母液来制备Poutrel培养基。通过添加30%NaOH将pH调至7,然后用0.22微米滤器过滤培养基。
培养基的最终组成(按g/l计)为:L-胱氨酸:0.24g/l;L-天冬氨酸:2.4g/l;L-谷氨酸2.4g/l;L-脯氨酸:2.4g/l;L-精氨酸:0.36g/l;L-甘氨酸:2.4g/l;L-组氨酸:0.48g/l;L-赖氨酸HCl:0.6g/l;L-丝氨酸:2.4g/l;L-缬氨酸:0.48g/l;L-酪氨酸:0.18g/l; L-苏氨酸:2.4g/l;L-丙氨酸:2.4g/l;L-异亮氨酸:0.6g/l;L-亮氨酸:0.6g/l;L-苯丙氨酸:0.2g/l;L-色氨酸:0.06g/l;L-甲硫氨酸:0.18g/l;D-葡萄糖:10g/l;烟酸:11.94mg/l;盐酸硫胺素:0.6mg/l;硫酸铵:6.84g/l;磷酸二氢钾:1.34g/l;二磷酸钠:14.38g/l;氯化钙:5mg/l;氯化钴六水合物:2.4mg/l;硫酸铜:0.5mg/l;硫酸锰:5.6mg/l;氯化钠:5.8mg/l;氯化锌:3.4mg/l;氯化铁:27mg/l;硫酸镁:247mg/l。
12-琼脂培养基M0,液体培养基M0、M1培养基
琼脂培养基M0:
首先,通过将3g的琼脂溶于150ml超滤水中来制备150ml的琼脂基础液。将所得组合物置于沸水浴中,直至琼脂颗粒消失为止(大约30分钟),然后在高压灭菌器内在116℃下灭菌30分钟。
然后通过将各种贮备溶液按照在以下组成中指定的顺序混合,用0.22微米Stericup过滤器过滤所得混合物,然后将50ml这样获得的混合物加入到琼脂基础液中来制备琼脂培养基M0,以便获得含有下列组分的培养基(按g/l计):
小麦蛋白胨:3.87g;酵母提取物:5g;D-葡萄糖H2O:1g;NaCl:6g;MgCl2·6H2O:0.4g;(NH4)2SO4:6.8g;NH4Cl:6g;FeCl3·6H2O:120×10-3g,ZnCl2:5×10-3g;CaCl2·2H2O:10×10-3g。
然后注入8个陪替氏培养皿。
所使用的小麦蛋白胨对应于Organotechnie(参考号19559)的小麦蛋白胨。所使用的酵母提取物对应于Beckton Dickinson(参考号212750)的提取物。
液体培养基M0:
液体培养基M0通过按在以下组成中指定的顺序混合各种母液以及用0.22微米Stericup过滤器过滤所得混合物来制备,以便获得含有下列组分(按g/l计)的培养基:
小麦蛋白胨:30g;酵母提取物:5g;D-葡萄糖H2O:1g;NaCl:6g;MgCl2·6H2O:0.4g;(NH4)2SO4:6.8g;NH4Cl:6g;FeCl3·6H2O:120×10-3g,ZnCl2:5×10-3g;CaCl2·2H2O:10×10-3g;pH=6.5。
对于培养基M1:
培养基M1通过按在以下组成中指定的顺序混合各种贮备溶液以及用0.22微米Stericup过滤器过滤所得混合物来制备,以便获得含有下列组分(按g/l计)的培养基:
小麦蛋白胨:30g;酵母提取物:5g;D-葡萄糖H2O:1g;NaCl:58.5g;MgCl2·6H2O:0.4g;(NH4)2SO4:6.8g;NH4Cl:6g;FeCl3·6H2O:120×10-3g,ZnCl2:5×10-3g;CaCl2·2H2O:10×10-3g。
13-哥伦比亚琼脂2%NaCl
对于1升的培养基,称量出44g的哥伦比亚“血琼脂基础”(Difco参考号279240),然后添加500ml的无菌超滤水。所得混合物在100℃的水浴中孵育大约30分钟(直到完全溶解和获得透明溶液)。然后添加500ml的无菌超滤水。将该溶液分配到200ml的Schott烧瓶内,然后通过在116℃下高压灭菌30分钟来灭菌。然后将该培养基在55℃下(水浴)保持,之后倒入陪替氏培养皿内(25ml/皿)。在倒入培养皿之前,每200ml烧瓶添加13.3ml的30%NaCl(用0.22μm过滤器过滤),以便获得2%的终浓度(=2g/100ml)。
14-胰胨豆胨琼脂(GTS)
对于1升的培养基,称量出40g的“胰胨豆胨琼脂”(Difco参考号236950),然后添加500ml的无菌超滤水。所得混合物在100℃的水浴中孵育大约30分钟(直到完全溶解和获得透明溶液为)。然后添加500ml的无菌超滤水。将该溶液分配到200ml的Schott烧瓶内,然后通过在116℃下高压灭菌30分钟来灭菌。然后将该培养基在55℃下(水浴)保持,之后倒入陪替氏培养皿内(25ml/皿)。
1.5-“细菌用胰胨豆胨”培养液(TSB)
对于1升的培养基,称量出30g的“细菌用胰胨豆胨”(Difco参考号211825),然后添加500ml的无菌超滤水。所得混合物在100℃的水浴中孵育大约30分钟(直到完全溶解和获得透明溶液)。然后添加500ml的无菌超滤水。将该溶液分配到200ml的Schott烧瓶内,然后通过在116℃下高压灭菌30分钟来灭菌。然后将该培养基在55℃下(水浴)保持,之后倒入陪替氏培养皿内(25ml/皿)。
实施例2:5型荚膜多糖(CP5)在各种培养条件下的产生的评价
2.1-Reynolds菌株的培养
根据希望放置在没有动物来源的化合物的条件下或放置在标准条件下,以两种不同方式制备冷冻材料。对于标准条件,将起始冻干材料置于哥伦比亚琼脂+2%NaCl上。取决于菌株,哥伦比亚琼脂+2%NaCl用或不用CO2在37℃下培养18小时。将该培养物再次在新琼脂培养皿上在37℃下移种培养4小时,以便获得指数生长期的微生物。然后在添加了20%的甘油的胰胨豆胨培养液中回收该培养物。如果需要不含动物来源的化合物的条件时,用培养基M0在37℃下预培养18小时,然后使用接种体来移种培养液体培养基M0。在添加20%的甘油后,也进行冷冻。
将100μl的通过上述第一种方法获得的Reynolds冷冻材料溶于900μl的PBS中。
两个琼脂培养基M0的陪替氏培养皿和两个哥伦比亚琼脂2%NaCl的陪替氏培养皿用150μl细菌悬液/皿以层的形式进行接种,在37℃下孵育18-20小时。
刮取各层,再悬浮于5ml PBS中。测定悬液的OD680nm,使得可以测定在OD680nm=0.2时用于接种50ml锥形瓶所需的预培养物的体积。
使用哥伦比亚琼脂2%NaCl上的预培养物来接种含有Poutrel培养基的锥形瓶,使用琼脂化的M0(在37℃下18-20小时)上的预培养物接种液体培养基M0的锥形瓶和培养基M1的锥形瓶。体积可以根据试验而改变,最通常是50ml。为了保持适当的氧化,培养基的体积小于或等于锥形瓶体积的20%。
确定初始OD680nm值之后,将锥形瓶在37℃下振荡(×100rpm)。
通过在t0、t8h、t24h、t32h、t48h、t56h和t72h时测定OD680nm来监控培养物,并且在初始和培养72小时的时候测定pH,用50ml培养物获得的结果在以下表1和2中报告。
表1:
菌株 | 预培养基 | OD/CFU,用于OD680=1 | 标准偏差 |
Reynolds | 哥伦比亚琼脂2%NaCl | 5.3E+08 | 8.2E+07 |
Reynolds | 琼脂化M0 | 4.2E+08 | 1.7E+08 |
表2:OD68nm测定
时间,小时 | Poutrel | 液体培养基M0 | M1 |
0 | 0.2 | 0.2 | 0.2 |
8 | 2.8 | 2.6 | 2.7 |
24 | 6.7 | 6.2 | 4.0 |
32 | 9.1 | 8.0 | 4.7 |
48 | 10.1 | 8.4 | 6.1 |
56 | 8.6 | 8.7 | 6.4 |
72 | 8.1 | 8.6 | 5.7 |
初始pH | 7 | 6.5 | 6.5 |
最终pH | 8.5 | 8.5 | 8.5 |
2.2-培养物的灭活
72小时的时候,将培养物分配到四个1升Schott烧瓶内,各自含有750ml培养物。
对于750ml的培养物,添加15ml的苯酚/乙醇(v/v),即,2%的终浓度,将该混合物用磁力搅拌棒在环境温度下搅拌大约48小时。
按以下方式进行致死率试验:
将100μl的处理后的培养物平铺在哥伦比亚琼脂2%NaCl上,以及将100μl的处理后的培养物在胰胨豆胨培养液+1/30马血清中接种,然后在37℃下孵育48小时(胰胨豆胨培养液的烧瓶的塞子旋松)。使用这样被灭活的培养物来提取多糖和通过ELISA法估计产生的量。
2.3-所产生的多糖的提取
然后在+4℃下,将灭活的72小时培养物在3500rpm下离心30分钟,分离培养物的上清液,在+4℃下贮存。将粒状沉淀溶于5ml PBS中,在121℃下高压灭菌60分钟,然后在+4℃下25000g离心30分钟。回收上清液(提取物1)。将粒状沉淀溶于5ml的PBS中,在121℃下高压灭菌60分钟,然后在+4℃下25000g离心30分钟。回收上清液(提取物2)。将提取物1和2合并,用50微克/ml的蛋白酶K在37℃下处理1小时,然后将蛋白在75℃下灭活20分钟。
2.4-用ELISA法估计所产生的多糖的量
根据Karakawa等人,J Clin Microbiol.1985年9月;22(3):445-7所述的方法制备针对5型或8型荚膜的多克隆血清。所使用的单克隆通过如Hockeppel等人,J Clin Microbiol.1987年3月;25(3):526-30所述的程序来制备,并且由巴斯德研究所转交给我们。
通过ELISA测定所生产的荚膜多糖的量。为此,用96孔板(Nunc,Roskilde,Denmark)进行夹层ELISA分析。在第一步中,在孔内沉积抗-CP5单克隆抗体(1微克/ml,在0.05M碳酸钠缓冲液中,pH=9.6(ε)-100ng/孔),将板在4℃下孵育过夜。然后,这些板以每孔用300μl的补充了0.05%Tween 20(ε)的PBS缓冲液(Eurobio)(PBS-Tween)清洗4次,然后这些板用250微升/孔的补加了1%(体积/重量)的BSA的PBS-Tween(Eurobio)(PBS-Tween-BSA)在37℃下浸透1小时。然后用TBS-Tween溶液将这些板反复三次清洗。
使用PBS-Tween-BSA溶液对步骤23的提取物进行2倍系列稀释,并以100微升/孔添加。将这些板在37℃下孵育90分钟,然后用PBS-Tween清洗4次。根据Karakawa的程序生产的抗-CP5兔多克隆抗体(Karakawa等人,1985,J.Clin.Microbiol.1985年9月;22(3):445-7)在PBS-Tween-BSA(1/2000)中稀释,然后以100微升/孔加入到孔内,将这些板在37℃下孵育90分钟。然后这些板用PBS-Tween清洗4次。在PBS-Tween-BSA中稀释(1/6000)的山羊抗兔-过氧化物的酶缀合物IgG(Southern biotech.),以100微升/孔添加,并将该板在37℃下孵育1小时。将这些板用300微升的PBS-Tween/孔清洗8次,再添加100微升/孔的TMB底物(TEBU)的溶液,随后在环境温度下(大约22℃)黑暗中孵育15分钟。酶反应通过添加100微升的1M H3PO4 1M(ε)/孔来停止。
然后自动板读数器(Versamax)测定450nm下的光学密度。减去对照值,通过与标准曲线比较来评价量。
结果记录在以下表3中。
表3:
CP5 ELISA定量(X3)(在沉淀物中) | ||||||
培养基 | 预培养物 | 培养物体积(ml) | 初始OD680 | 最终OD680 | 平均(μg/ml的培养物) | 标准偏差 |
Poutrel | 哥伦比亚琼脂2%NaCl | 50 | 0.2 | 8.1 | 3.6 | 0.3 |
液体M0 | 琼脂化的M0 | 50 | 0.2 | 8.6 | 9.7 | 1.2 |
M1 | 琼脂化的M0 | 50 | 0.2 | 5.7 | 36.0 | 1.5 |
2.5-多糖CP5的提取和提纯
如项2.1所述,按照包括用琼脂化培养基M0预培养和然后在锥形瓶内的400ml的培养基M1中培养的程序培养Reynolds菌株。将培养物合并,获得3升的培养物,由此提取和提纯所产生的T5多糖。
整个培养物通过周苯酚-乙醇(终浓度2%V/V)处理来灭活,然后在25000g下离心30分钟。每升培养物获得了大约10.9g的灭活的湿微生物的粒状沉淀。
微生物以0.5g/ml的比例悬浮于50mM Tris、2mM MgSO4(pH7.5)中。添加5mg/ml的溶葡萄球菌酶的水溶液,以便获得100μg/ml的终浓度。在磁力搅拌下在37℃孵育4小时后,添加终浓度为5U/ml的benzonase核酸酶的溶液,在磁力搅拌下于37℃孵育2小时。
离心后(25000g,30min),收获提取的上清液,合并,超滤。上清液在H2O中预先稀释至1/4,以便获得足够用于超滤体系的体积。用2UF 50kD超滤盒在下列条件下进行超滤:H2O:10倍体积;然后50mMTris,pH 8.0:3倍体积。保留物的体积在超滤过程中保持恒定。该保留物构成所谓的CP5提取物。
在搅拌的同时,将CP5提取物在MgCl2(终浓度1mM)和benzonase核酸酶(终浓度5U/ml,即~40U/g的处理的湿微生物)的存在下于37℃孵育。孵育3小时后,添加终浓度为5U/mlbenzonase核酸酶,继续孵育3小时。添加10mg/ml的链霉蛋白酶的水溶液,以便获得4U/ml的终浓度(即,~30U/g的处理的湿微生物),补充终浓度为1mM的CaCl2。然后将该混合物在37℃下孵育15小时。用两个UF 50KD超滤盒在下列条件下进行50kD超滤,以便除去核酸和蛋白片段:H2O:10倍体积;然后50mM Tris,pH 8.0:3倍体积。保留物的体积在超滤过程中保持恒定。将下列物质加入到所获得的保留物中:终浓度为1mM的MgCl2,终浓度为0.1U/ml的benzonase核酸酶,再将该混合物在磁力搅拌下孵育3小时。
添加10mg/ml的链霉蛋白酶的水溶液到0.1U/ml的终浓度,并补充CaCl2到终浓度为1mM,然后将该混合物在37℃下孵育2小时。
然后在下列条件下用两个UF 30KD超滤盒进行超滤:H2O:10倍体积;然后50mM Tris,pH 7.5:3倍体积。所得保留物呈现为发白的沉淀/云絮状物,这通过在8000g下离心30分钟来除去。
然后周离子交换色谱法进行提纯步骤。这可以除去残留材料,尤其磷壁酸(TA)和脂磷壁酸质(LTA)。
采用下列条件:三根5ml Hi Trap Q HP柱子串联连接(参考号:Amersham 17-1154-01);平衡缓冲液:20mM Tris,pH 7.5;流速:2ml/min;样品在平衡缓冲液中注入。
洗脱:
-20mM Tris,pH 7.5:5倍柱体积
-20mM Tris,pH 7.5,0-0.5M NaCl的梯度:10倍柱体积
-20mM Tris,0.5M NaCl,pH 7.5:5倍柱体积
-20mM Tris,pH 7.5,0.5-1M NaCl的梯度:5倍柱体积
-20mM Tris,1M NaCl,pH 7.5:5倍柱体积
-20mM Tris,pH 7.5:5倍柱体积
洗脱通过测定206和280nm的吸收率来监控。CZE分析可以鉴定色谱法期间洗脱的各种成分。
CP5多糖在0.2M和0.3M之间的NaCl浓度下洗脱。在所使用的色谱条件下,所述多糖很好地从残留材料分离出来。特别地磷壁酸在0.36M和0.48M的NaCl之间被洗脱,而脂磷壁酸质在0.74M和0.86M的NaCl之间被洗脱。
将含有CP5的部分合并,在+4℃下用20倍体积的0.5M NaCl水溶液(2-3次浴)渗析,然后用20倍体积(3-4次浴)的超滤水渗析。
这样消除了Tris。
将提纯的产物冻干,在-20℃下保藏。
提纯结束时,从3L的培养物获得了74mg的T5荚膜多糖。在以下表4中记录了产物的特性。
表4:
CP5分析 | O-乙酰基(粉末的CP,按重量计) | O-乙酰基(CP CE定量) | 蛋白 | DNA | |||
分析方法 | NMR | 比色法 | Micro BCA直接法 | Picogreen法 | |||
单位 | 相对于粉末重量的% | Mmol/mgCP | Mol/molUR | Mmol/mgCP | Mol/molUR | 相对于粉末重量的%W/W | 相对于粉末重量的%W/W |
结果 | 80% | 1.32 | 0.87 | 1.65 | 1.08 | 2.7% | <0.1% |
实施例3:在各种培养条件下的8型荚膜多糖(CP8)生产能力的估计
该估计用Becker和CYL770菌株进行。
3.1-Becker菌株的培养
根据希望将冻干材料放置在没有动物来源的化合物的条件下或在标准条件下,以两种不同方式制备冰冻材料。对于标准条件,将初始冻干材料置于哥伦比亚琼脂+2%NaCl上。取决于菌株,哥伦比亚琼脂+2%NaCl在有或没有CO2的条件下,在37℃时培养18小时。将该培养物再次在新琼脂培养皿上在37℃下移种培养4小时,以便获得指数生长期的微生物。然后在其中添加了20%的甘油的胰胨豆胨培养液中回收该培养物。当要求不含动物来源的化合物的条件时,用培养基M0在37℃下预培养18小时,然后使用接种体来移种培养液体培养基M0上。在添加20%的甘油后,也进行冷冻。
将100μl的根据胰胨豆胨培养液方法获得的Becker冷冻材料溶于900μl的PBS中。三个琼脂化培养基M0的陪替氏培养皿、两个哥伦比亚琼脂2%NaCl的陪替氏培养皿和一个GTS陪替氏培养皿用150μl的细菌悬液/皿以层的形式接种。将培养皿在37℃+5%CO2下孵育18/20小时。
刮取各层,再悬浮于5ml PBS中。
测定悬液的OD680nm,使得可以测定在OD680nm=0.2时接种50ml锥形瓶所需的预培养物的体积。
使用哥伦比亚琼脂2%NaCl上的预培养物用来接种含有Poutrel培养基的锥形瓶,使用GTS上的预培养物接种含有TSB的锥形瓶,以及使用琼脂化培养基M0上的预培养物来接种含有液体培养基M0的锥形瓶和含有培养基M1的锥形瓶。
为了保持适当的氧化,培养基的体积小于或等于锥形瓶体积的20%。
确定初始OD680nm值之后,将锥形瓶在37℃和×100rpm下振荡。
用含有400ml的培养基的锥形瓶进行类似的实验。
3.2-CYL770菌株的培养
对于重组CYL770菌株,冷冻材料的制备方法采用初始冷冻材料在TSB培养基或液体培养基M0上的移种培养。培养在振荡的同时在37℃下进行5小时。冷冻在将20%的甘油加入到培养基中之后进行。
将1ml的这样获得的一种冷冻CYL770材料用10ml的液体培养基M0溶解,然后放置于50ml锥形瓶内,在×100rpm下振荡的同时于37℃孵育18/20小时。第二种冰冻CYL770材料溶解在10ml的TSB培养基中,然后在振荡的同时在与先前相同的条件下放置。
测定液体预培养物的OD680nm,使得可以测定在OD680nm=0.2时接种50ml锥形瓶所需的预培养物的体积。
TSB中的预培养物可以接种含有TSB的锥形瓶,而液体培养基M0中的预培养物可以接种含有培养基M1的锥形瓶。为了保持适当的氧化,培养基的体积小于或等于锥形瓶体积的20%。
在确定初始OD680nm值之后,将锥形瓶在37℃和×100rpm下振荡。
用含有400ml的培养基的锥形瓶进行类似的实验。
3.3-培养的监控
通过在t0、t8h、t24h、t32h、t48h、t56h和t72h时测定OD680nm来监控培养物。
在初始和培养72小时的时候测定pH。以下表5中报告了50ml培养物的结果。
表5:
Becker | CYL770 | |||||
时间,小时 | Poutrel | 液体培养基M0 | M1 | TSB | TSB | M1 |
0 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.2 | 0.2 | 0.2 |
8 | 3.3 | 3.2 | 3.6 | 5.7 | 3.3 | 2.3 |
24 | 7.4 | 8.0 | 4.9 | 7.1 | 5.6 | 3.4 |
32 | 7.8 | 8.6 | 5.9 | 7.4 | 5.9 | 4.0 |
48 | 8.3 | 8.6 | 6.3 | 7.5 | 4.7 | 5.8 |
56 | 8.1 | 8.5 | 5.3 | 5.7 | 3.9 | 5.1 |
72 | 7.0 | 7.5 | 6.6 | 5.8 | 2.9 | 5.4 |
初始pH | 7 | 6.5 | 6.5 | 7 | 7 | 6.5 |
最终pH | 9 | 8.5 | 8.5 | 9 | 9 | 8.5 |
3.4-培养物的灭活
按照上面项2.2所述的相同程序灭活培养物。按照上面项2.3所述程序的相同程序提取所生产的多糖。
3.5-用ELISA法估算所生产的多糖的量
采用与以上项2.4所述相同的ELISA分析来估算所生产的多糖的量,除了所使用的抗体是抗-CP8抗体,和在用颗粒提取物和培养物上清液进行试验。用含有稀释到1/20000的单克隆K8-24的腹水进行吸附,兔多克隆抗体是稀释到1/1000的吸附血清。
对于50ml和400ml的培养物,以下表6报告了用获得的结果。对于400ml培养物,每一次用50ml的培养物的单一样品进行分析,然后计算总量,在表6中报告。
表6:
CP8的ELISA分析(X2) | ||||||
粒状沉淀 | 上清液 | |||||
菌株 | 培养物 | 预培养物 | 平均(μg/ml培养物) | 标准偏差 | 平均(μg/ml培养物) | 标准偏差 |
Becker(50ml) | Poutrel | 哥伦比亚琼脂2%NaCl | 1.3 | 0 | 1.8 | 0 |
液体培养基M0 | 琼脂化M0 | 1.9 | na | 3.6 | na | |
M1 | 琼脂化M0 | 14.0 | 1.6 | 43.2 | 2.2 | |
TBS | GTS | 0 | 0 | 0 | 0 | |
Becker(400ml) | M1 | 琼脂化M0 | 23.04 | 57.6 | ||
CYL 770(50ml) | M1 | 液体培养基M0 | 8.7 | 0.5 | 534.2 | 75.2 |
TSB | TSB | 4.7 | 1.3 | 244 | na | |
CYL 770(400ml) | M1 | 液体培养基M0 | 27.18 | na | 579.6 | na |
TSB | TSB | 3.6 | na | 216 | na |
na:不可用。
3.6-所生产的PS的回收和提纯
采用实施例2中所述用于获得T5多糖的方法,从在培养基M1中的Becker菌株的400ml锥形瓶培养物中回收T8多糖。
还从在培养基M-1中CYL770菌株的400ml锥形瓶中的培养物和从TSB培养基上的培养物中提纯T8多糖。为此,800ml的培养物按照上述方法通过用苯酚-乙醇处理被灭活,然后在25000g下离心30分钟。获得了720ml的上清液。
在500ml的该上清液中添加一定量的醋酸钠,以获得醋酸钠的终浓度为4%。将该悬浮液在环境温度下搅拌30分钟。然后,添加一定量的乙醇,使得乙醇的终浓度为50%。将该悬浮液在环境温度下搅拌30分钟,然后不用搅拌在+4℃下储存一晚。
在15000g下离心30分钟后,收获上清液。将醋酸钠和乙醇加入到该上清液中,以便获得4%醋酸钠和85%的乙醇的最终浓度。将该悬浮液在环境温度下搅拌30分钟,然后不用搅拌在+4℃下储存一晚。在15000g下离心30分钟后,收获粒状沉淀。
这样获得粒状沉淀用100ml超滤水(相对于离心的培养物上清液体积的5倍浓度)溶解。在环境温度下磁力搅拌至粒状沉淀完全溶解后,所得悬浮液用2升的超滤水进行渗析,白天在环境温度下更换三次浴,随后在4℃下过夜。然后将Tris和MgCl2加入到这样获得的悬浮液中,以便获得50mM的Tris和1mM的MgCl2的终浓度。将该溶液在37℃下在搅拌的同时在benzonase核酸酶(终浓度5U/ml)的存在下孵育。孵育3小时后,添加benzonase核酸酶到终浓度为5U/ml,继续孵育3小时。
添加10mg/ml的链霉蛋白酶的水溶液,以便获得4U/ml的终浓度,补加CaCl2到终浓度为1mM。该步骤之后在37℃下孵育15小时。如果出现可见混浊/可见乳光,进行8000g离心30分钟。
在下列条件下进行30kDa超滤,以便除去蛋白和核酸片段:H2O:10倍体积;然后20mM Tris,pH 7.5:3倍体积。
保留物的体积在超滤过程中保持恒定。获得了轻微着色的透明溶液。
如果所得保留物表现了任何混浊/乳白光,那么通过8000g离心30分钟来消除。
然后在下列条件下进行离子交换色谱步骤,以便完全除去残留材料,尤其磷壁酸(TA)和脂磷壁酸质(LTA):Q琼脂糖凝胶HP;20mlHi Trap Q HP柱子;平衡缓冲液:20mM Tris,pH 7.5;流量:2ml/min;样品在平衡缓冲液中注入。对于20ml凝胶,注入125ml培养物上清液;洗脱:
-20mM Tris,pH 7.5:5倍柱体积
-20mM Tris,pH 7.5,0-0.5M NaCl的梯度:20倍柱体积
-20mM Tris,0.5M NaCl,pH 7.5:5倍柱体积
-20mM Tris,1M NaCl,pH 7.5:5倍柱体积
-20mM Tris,pH 7.5:5倍柱体积
洗脱通过测定在206和280nm的吸收率来监控。CZE分析可以鉴定色谱法期间被洗脱的各种成分。
我们因此可以确定,CP8多糖用浓度在0.2M和0.3M之间的NaCl进行洗脱。在所使用的色谱条件下,在该色谱法步骤之后,所述多糖很好地地从残留材料分离出来,残留材料的量很少。磷壁酸在NaCl的浓度为0.36M和0.48M之间洗脱,而脂磷壁酸质在NaCl的浓度为0.74M和0.86M之间洗脱。
将含有CP8的部分合并,在+4℃下用20倍体积的0.5M NaCl水溶液(2-3次浴)进行渗析,然后用20倍体积(3-4次浴)的超滤水渗析。在高NaCl浓度下的该步骤可以有效去除Tris。
将这样提纯的产物冻干,在-20℃下保藏。
以下表7报告了所得结果。
表7:
CP5定量 | O-乙酰基(粉末的CP,按重量计) | O-乙酰基(CP CE定量) | 蛋白 | DNA | |||
分析方法 | CZE | 比色法 | Micro BCA直接法 | Picogreen法 | |||
单位 | 相对于粉末重量的% | Mmol/mgCP | Mol/molUR | Mmol/mgCP | Mol/molUR | 相对于粉末重量的%W/W | 相对于粉末重量的%W/W |
Becker(P0005)粒状沉淀液体M0/M1 | 71% | 0.93 | 0.61 | 1.31 | 0.86 | 2.2% | nd |
CYL770(P006)上清液液体M0/M1 | 85% | 1.03 | 0.68 | 1.22 | 0.80 | 0.5% | <0.1% |
CYL770(P006)上清液TSB/TSB | 62% | 1.08 | 0.71 | 1.75 | 1.14 | 3.5% | nd |
nd=未测定
实施例4:在30升发酵罐内培养Reynolds 5型金黄色葡萄球菌菌株
4.1-用BTS培养基+NaCl培养
以0.5体积%的比例将由项2.1的第一种方法制备的冰冻Reynolds菌株材料接种到两个各自含有200ml补加了NaCl(55g/l)的胰胨豆胨培养液的2L带挡板的锥形瓶内(E1和E2)。将锥形瓶在37℃下孵育5±1小时(E1)或在175rpm下振荡的同时孵育48小时(E2)。
将含有20L相同培养基的30L Braun发酵罐用估计为~1.38×1011CFU(~5h的培养和锥形瓶内的OD600nm接近4)的70ml的预培养物(E1)接种。培养在下列条件下进行:温度:37℃;培养期:48±2小时;用25%NH4OH和10%H3PO4调节pH在6.50;30%PO2(级联调节:搅拌20-80%;空气从20(1vvm)到60%(3vvm),0-100%的氧富有率);压力:100毫巴;用1/50 Struktol消泡调节。
在前几个小时通过规律取样以及在培养的20±2小时、培养的24±2小时和培养的42±2小时取样来对培养进行监控,以便检验600nm处的OD;测定干重;测定成活率;观察形态;定量葡萄糖;定量乙酸盐以及在培养的4±2小时、18±2小时、24±3小时和48±2小时之后,对OD=50的6个粒状沉淀用ELISA分析法测定多糖生产能力。
在1L离心桶内(12个桶/20L培养物)内在48±2小时的培养后收获细胞,4℃下进行7000g离心20分钟。除去上清液后测定湿重。在≤-20℃下保藏粒状沉淀,直至进行包括用苯酚/乙醇灭活微生物和然后根据实施例2的方法和回收提纯T5多糖。
第二个锥形瓶(E2)监控48小时,以便跟踪培养10小时、24小时和48小时后的CP5荚膜的生产量。
4.2-用Poutrel培养基培养
以1体积%的比例将按照项2.1中所述的第一种方法制备的冰冻Reynolds 5型金黄色葡萄球菌菌株材料接种到两个各自含有200mlPoutrel培养基的2L带挡板的锥形瓶内(E1和E2)。将锥形瓶在37℃下在175rpm下孵育16±2小时。将这些预培养物合并,用于接种发酵罐。含有20L Poutrel培养基的30L B.Braun发酵罐内的培养在下列条件下进行:温度:37℃;培养期:48±2小时;pH用25%NH4OH和10%H3PO4调节在6.50;30%PO2(级联调节:20-80%搅拌;空气从20(1vvm)到60%(3vvm),0-100%的氧气富有率);压力:100毫巴;用1/50Struktol进行消泡调节。
在前几个小时以及在培养的24±2小时和培养的30±2小时通过取样来对培养进行监控,以便检验600nm处的OD;测定干重;测定成活率;观察形态;定量葡萄糖;定量乙酸盐;定量游离氨基酸以及用ELISA分析法测定多糖生产量。
在48±2小时的培养后收获细胞。
在2L的Schott烧瓶内收获2L的产物,用终浓度为2%(V/V)的苯酚/乙醇(v/v)处理。将该混合物在22±3℃下搅拌6±1小时。从剩余培养物中除去上清液后,细菌粒状沉淀用最小体积的PBS缓冲液溶解,然后高压灭菌,以便按照以上实施例2所述的方法灭活和回收多糖。
剩余培养物在1L离心桶内收获(12个桶/18L的培养物),4℃下7000g离心20分钟。除去上清液后测定湿重。2L的上清液在0.45μm过滤和121℃高压灭菌55分钟后在≤-20℃下保藏。
采用ultraturax将12个粒状沉淀再悬浮于最小体积的PBS缓冲液(大约650ml)中。将悬浮液合并,均匀化,等份分配到三个500ml Schott烧瓶内(大约300ml/Schott烧瓶),之后在121℃下高压灭菌55分钟。然后合并高压灭菌后的悬液,按照以上实施例2中所述的程序回收多糖。
4.3-用哥伦比亚培养基+NaCl培养
以1体积%的比例将按照项2.1的第一种方法制备的冰冻Reynolds5型金黄色葡萄球菌材料接种到两个各自含有200ml哥伦比亚培养基+20g/l的NaCl(Difco参考号2944201)的2L带挡板的锥形瓶内。将锥形瓶在37℃下在175rpm振荡的同时孵育24±2小时。在24±2小后,将这些预培养物合并,用于接种发酵罐。含有20L相同培养基的30LB.Braun发酵罐内的培养在下列条件下进行:温度:37℃;培养期:24±2小时;pH用25%NH4OH和10%H3PO4调节在7.00;30%PO2(级联调节:20-80%搅拌;空气从20(1vvm)到60%(3vvm),0-100%的氧富有率);压力:100毫巴;用1/50 Struktol进行消泡调节。
通过定期取样而规律地监控培养,以便检验600nm处的OD;测定干重;测定成活率;观察形态;分析葡萄糖;分析乙酸盐以及用ELISA分析法测定多糖生产量。
在24±2小时的培养后收获细胞。将最终培养物转移到1L的离心桶内(12个桶/20L的培养物),4℃下7000g离心20分钟。除去上清液后测定湿重。离心后,采用ultraturax将12个粒状沉淀再悬浮于1-1.2L之间的最小体积的PBS缓冲液中。将悬浮液合并,均匀化,等份分配到三个500ml Schott烧瓶内,之后在121℃下高压灭菌55分钟。然后合并高压灭菌后的悬液,按照以上实施例2中所述的程序回收多糖。
44-用培养基M1培养
以1ml的冰冻材料/9ml的缓冲液的比例将按照以上项2.1中所述的第一种方法制备的冰冻Reynolds 5型金黄色葡萄球菌材料溶解在1CPBS缓冲液中,以便以150μl/培养皿的比例接种大约10个培养皿的琼脂培养基M0。
将培养皿在37℃下孵育15-18小时。在37℃下孵育15-18小时后,刮取所形成的各层,之后再悬浮于培养基M1中,以便接种两个相同组成的锥形瓶(200ml/21-E1和E2),使得在各锥形瓶内具有接近0.2的初始OD600nm。将锥形瓶在175rpm的振荡的同时于37℃孵育大约5小时(指数期培养,E1)或72小时(E2)。
使用E1培养物的一部分(OD600nm接近3)接种含有20L培养基M1的30L B.Braun发酵罐,使得具有接近0.02的初始OD600nm。培养在下列条件下进行:温度:37℃;培养期:72±4小时;pH用25%NH4OH和10%H3PO4调节在6.50;30%PO2(级联调节:20-80%搅拌;空气从20(1vvm)到60%(3vvm),0-100%氧富有率);压力:100毫巴;用1/50 Struktol进行消泡调节。
然后在离心桶内收获1L的培养物,4℃下7000g离心20分钟,以便在除去上清液后测定湿重。粒状沉淀在≤-20℃下保藏。
剩余培养物收集在50L Nalgen中,用苯酚/乙醇(终浓度2%V/V)灭活,按照以上实施例2所述的程序回收多糖。
所获得的全部结果记录在以下表8中。
表8:
培养基 | 哥伦比亚+NaCl | Poutrel | BTS+NaCl | M1 |
最终OD | 21 | 16 | 17 | 16 |
[CP5]溶葡萄球菌酶提取 | nd | 6.6mg/l | nd | 130mg/l |
[CP5]高压灭菌提取 | 0.2mg/l | 3.7mg/l | 3.5mg/l | 40mg/l |
单位产率(μg/OD) | 0.01 | 0.23 | 0.21 | 2.5 |
Claims (29)
1.高产量金黄色葡萄球菌菌株的制备方法,包括:
(a)用每升培养基中包含下列物质的培养基M1培养金黄色葡萄球菌菌株:
●5-100g的植物蛋白胨,
●0.5-20g的酵母提取物,
●1-30g的糖,
●1-200mg的选自FeCl3和FeSO4中的铁盐,
●1-700mg的选自MgCl2和MgSO4中的镁盐,
●0.1-500mg的CaCl2,
●0-50mg的ZnCl2,
●10-250g的NaCl,优选58.5g/l,和
该培养基的pH值包括在6.2-7.5的范围内,
(b)任选地,从该培养基中回收这样生产的菌株。
2.根据权利要求1的高产量菌株的制备方法,其中步骤(a)的培养基M1包括小麦蛋白胨。
3.根据权利要求1或2的高产量菌株的制备方法,其中,以每升培养基M1包括:
●30g的小麦蛋白胨,
●5g的酵母提取物,
●1g的D-葡萄糖H2O,
●120mg的FeCl3·6H2O,
●400mg的MgCl2·6H2O,
●10mg的CaCl2·2H2O,
●58.5g的NaCl,
●5mg的ZnCl2,
●6.8g的(NH4)2SO4,
●6g的NH4Cl和pH=6.5。
4.根据权利要求4的制备方法,其中每升培养基M1的组成:30g的小麦蛋白胨,5g的酵母提取物,1g的D-葡萄糖H2O,120mg的FeCl3·6H2O,400mg的MgCl2·6H2O,10mg的CaCl2·2H2O,58.5g的NaCl,5mg的ZnCl2,6.8g的(NH4)2SO4,6g的NH4Cl和pH=6.5。
5.根据前面权利要求的任一项高产量菌株的制备方法,该方法包括用包含下列组分的培养基M0预培养的步骤:
●3-50g的植物蛋白胨,
●0.5-20g的酵母提取物,
●1-30g的糖,
●1-200mg的选自FeCl3和FeSO4中的铁盐,
●1-700mg的选自MgCl2和MgSO4中的镁盐,
●0.1-50mg的CaCl2,
●0-50mg的ZnCl2,
●2-50g的NaCl,优选6g/l和
该培养基的pH值包括在6.2-7.5的范围内。
6.根据权利要求5的制备方法,其中预培养步骤的培养基M0包括3.87g或30g的小麦蛋白胨。
7.根据权利要求5或6的任一项制备方法,其中预培养步骤的培养基M0包括:
●3.87g或30g的小麦蛋白胨,和
●5g的酵母提取物,
●1g的D-葡萄糖H2O,
●120mg的FeCl3·6H2O,
●400mg的MgCl2·6H2O,
●10mg的CaCl2·2H2O,
●6g的NaCl,
●5mg的ZnCl2,
●6.8g的(NH4)2SO4,
●6g的NH4Cl和pH=6.5。
8.高产量金黄色葡萄球菌菌株的制备方法,包括:
(a)在培养基M2上培养金黄色葡萄球菌菌株,其中每升培养基M2中包含:
●52.5-100g的植物蛋白胨,有利地小麦蛋白胨,
●0-82.5g的NaCl,有利地5-82.5g,尤其41g/l的NaCl,
●0-15g/l的选自MgCl2和MgSO4的镁盐,有利地0.01-15g/l,
尤其15g/l的MgCl2·6H2O,以及
●0-7g/l的糖,有利地0.25-7g/l,尤其0.25g/l的D-葡萄糖H2O,该培养基M2的pH值包括在6.3-6.7的范围内,
(b)任选地,从该培养基中回收这样生产的菌株。
9.根据权利要求8的高产量菌株的制备方法,其中培养基M2包括,且优选组成为,93g/l的小麦蛋白胨,41g/l的NaCl,0.25g/l的D-葡萄糖H2O和15g/l的MgCl2·6H2O,培养基的pH值是在6.3-6.7的范围内。
10.高产量金黄色葡萄球菌菌株的制备方法,包括:
(a)在培养基M3上培养金黄色葡萄球菌菌株,其中每升培养基中包含:
●65-85g的酵母提取物,有利地为75g
●0-82.5g的NaCl,有利地5-82.5g,尤其41g/l的NaCl,
●0-15g/l的选自MgCl2和MgSO4的镁盐,有利地0.01-15g/l,尤其15g/l的MgCl2·6H2O,以及
●0-7g/l的糖,有利地0.25-7g/l,尤其0.25g/l的D-葡萄糖·H2O,该培养基M3的pH值包括在6.3-6.7的范围内,
(b)任选地,从该培养基中回收这样生产的菌株。
11.根据前面权利要求的任一项高产量金黄色葡萄球菌T5菌株的制备方法。
12.根据前面权利要求的任一项高产量金黄色葡萄球菌T8菌株的制备方法。
13.荚膜多糖的制备方法,包括:
(a)用如权利要求1-4的任一项所定义的培养基M1或用如权利要求8或9的任一项所定义的培养基M2或用如权利要求10所定义的培养基M3培养金黄色葡萄球菌菌株,
(b)灭活这样生产的培养基,和
(c)回收荚膜多糖。
14.荚膜多糖的制备方法,其中培养步骤的培养基M1包括小麦蛋白胨。
15.根据权利要求13或14的任一项荚膜多糖的制备方法,其中以每升培养基为基准计,培养步骤的培养基M1包括:30g的小麦蛋白胨,5g的酵母提取物,1g的D-葡萄糖H2O,120mg的FeCl3·6H2O,400mg的MgCl2·6H2O,10mg的CaCl2·2H2O,58.5g的NaCl,5mg的ZnCl2,6.8g的(NH4)2SO4,6g的NH4Cl和pH=6.5。
16.根据权利要求15的荚膜多糖的制备方法,其中以每升培养基为基准计,培养基M1的组成:30g的小麦蛋白胨,5g的酵母提取物,1g的D-葡萄糖H2O,120mg的FeCl3·6H2O,400mg的MgCl2·6H2O,10mg的CaCl2·2H2O,58.5g的NaCl,5mg的ZnCl2,6.8g的(NH4)2SO4,6g的NH4Cl和pH=6.5。
17.根据权利要求13-16的任一项荚膜多糖的制备方法,包括如权利要求5-7的任一项所定义的预培养步骤。
18.用如在权利要求13-17的任一项中所定义的方法获得的高产量金黄色葡萄球菌菌株。
19.根据权利要求18的高产量Reynolds菌株。
20.根据权利要求18的高产量Becker菌株。
21.根据权利要求18的高产量CYL770菌株。
22.根据权利要求18的高产量CYL1892菌株。
23.适于培养金黄色葡萄球菌的培养基M0,包括:
●3-50g的植物蛋白胨,
●0.5-20g的酵母提取物,
●1-30g的糖,
●1-200mg的选自FeCl3和FeSO4中的铁盐,
●1-700mg的选自MgCl2和MgSO4中的镁盐,
●0.1-50mg的CaCl2,
●0-50mg的ZnCl2,
●2-50g的NaCl,优选6g/l,和
该培养基的pH值包括在6.2-7.5的范围内。
24.根据权利要求23的培养基M0,包括:
(a)3.87g或30g的小麦蛋白胨,
(b)5g的酵母提取物,
(c)1g的D-葡萄糖H2O,
(d)120mg的FeCl3·6H2O,
(e)400mg的MgCl2·6H2O,
(f)10mg的CaCl2·2H2O,
(g)6g的NaCl,
(h)5mg的ZnCl2,
(i)6.8g的(NH4)2SO4,
(j)6g的NH4Cl和pH=6.5。
25.适于超额产生荚膜多糖的培养基M1,包括:
●5-100g的植物蛋白胨,
●0.5-20g的酵母提取物,
●1-30g的糖,
●1-200mg的选自FeCl3和FeSO4中的铁盐,
●1-700mg的选自MgCl2和MgSO4中的镁盐,
●0.1-500mg的CaCl2,
●0-50mg的ZnCl2,
●10-250g的NaCl,优选58.5g/l,和
该培养基的pH值包括在6.2-7.5的范围内。
26.根据权利要求22所述的培养基M1,包括:
●30g的小麦蛋白胨,
●5g的酵母提取物,
●1g的D-葡萄糖·H2O,
●120mg的FeCl3·6H2O,
●400mg的MgCl2·6H2O,
●10mg的CaCl2·2H2O,
●58.5g的NaCl,
●5mg的ZnCl2,
●6.8g的(NH4)2SO4,
●6g的NH4Cl和pH=6.5。
27.适于超额生产荚膜多糖的培养基M2,每升培养基包括:
●52.5-100g的植物蛋白胨,有利地小麦蛋白胨,
●0-82.5g的NaCl,有利地5-82.5g,尤其4g/l的NaCl,
●0-15g/l的镁盐,有利地0.01-15g/l,尤其15g/l的MgCl2·6H2O,以及
●0-7g/l的糖,有利地0.25-7g/l,尤其0.25g/l的D-葡萄糖·H2O,
该培养基M2的pH值包括在6.3-6.7的范围内。
28.根据权利要求27的培养基M2,每升培养基包括:93g/l的小麦蛋白胨,41g/l的NaCl,0.25g/l的D-葡萄糖·H2O和15g/l的MgCl2·6H2O,它的pH值包括在6.3-6.7的范围内。
29.适于超额生产荚膜多糖的培养基M3,每升培养基包括:
●65-85g的酵母提取物,有利地75g的酵母提取物,
●0-82.5g的NaCl,有利地5-82.5g,尤其41g/l的NaCl,
●0-15g/l的镁盐,有利地0.01-15g/l尤其15g/l的MgCl2·6H2O,以及
●0-7g/l的糖,有利地0.25-7g/l,尤其0.25g/l的D-葡萄糖·H2O,
该培养基M3的pH值包括在6.3-6.7的范围内。
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