KR20080003904A - 과잉생산성 스타필로코커스 아우레우스 균주의 제조 방법 - Google Patents
과잉생산성 스타필로코커스 아우레우스 균주의 제조 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 스타필로코커스 아우레우스의 과잉생산성 균주의 제조 방법에 관한 것이다. 상기 방법에 따라 (a) 스타필로코커스 아우레우스의 균주를 배양 배지 M1 또는 M2 또는 M3 상에서 증식시키고, (b) 이어서 상기와 같이 생산된 균주를 상기 배양 배지로부터 회수할 수 있다. 본 발명은 또한 폴리사카라이드의 제조를 위한 상기 균주의 용도에 관한 것이다.
스타필로코커스 아우레우스
Description
본 발명은 과잉 생산성 스타필로코커스 아우레우스(STAPHYLOCOCCUS AUREUS) 균주의 제조 방법 및 캡슐 폴리사카라이드의 제조 방법에서의 그의 용도에 관한 것이다.
스타필로코커스 아우레우스 캡슐 폴리사카라이드, 특히 5 및 8 혈청형 폴리사카라이드는 스타필로코커스 아우레우스로 인한 감염에 대한 보호를 목적으로 백신을 생산하는 관심 성분으로서 문헌에 개시되어 있다.
상기 T5 및 T8 균주는 미세캡슐화되어 있으며 따라서 소량의 관심 캡슐 폴리사카라이드를 생산한다. 백신에 포함되어야 하는 캡슐 폴리사카라이드의 양은 표적 집단의 불충분한 면역 시스템으로 인해 상당하다(예를 들어 Fattom, A., et al(1995) Vaccine 13, 1288-1293 참조).
상기와 같은 백신의 산업적인 개발의 경우에, 따라서 다량의 T5 및 T8 캡슐 폴리사카라이드를 제조할 수 있는 것이 중요하다.
이러한 전망을 갖고, 본 발명자들은 캡슐 폴리사카라이드를 분비하는 스타필로코커스 아우레우스 균주의 능력을 실질적으로 증가시키기 위한 신규의 방법을 입 증하였다. 따라서 본 발명자들은 스타필로코커스 아우레우스 캡슐 폴리사카라이드를 다량으로 수득할 수 있게 하는 제조 방법을 제공한다.
발명의 요약
따라서 첫 번째 태양에 따라, 본 발명은
(a) 배양 배지의 리터 당
·5 내지 100 g의 식물 펩톤,
·0.5 내지 20 g의 효모 추출물,
·1 내지 30 g의 당,
·1 내지 200 ㎎의, FeCl3 및 FeSO4로 이루어진 그룹 중에서 선택된 철 염,
·1 내지 700 ㎎의, MgCl2 및 MgSO4로 이루어진 그룹 중에서 선택된 마그네슘 염,
·0.1 내지 500 ㎎의 CaCl2,
·0 내지 50 ㎎의 ZnCl2
·10 내지 250 g의 NaCl, 바람직하게는 58.5 g/ℓ
를 포함하고 pH가 6.2 내지 7.5 값의 범위 내에 있는 배양 배지 M1 상에서 스타필로코커스 아우레우스 균주를 배양하고,
(b) 임의로 상기 균주를 상기 배양 배지로부터 회수함
을 포함하는, 과잉생산성 스타필로코커스 아우레우스 균주의 제조 방법에 관한 것이다.
상기 과잉생산성 균주의 제조 방법의 특정한 실시태양에 따라, 상기 단계 (a)의 배양 배지 M1은 밀 펩톤을 포함한다.
상기 과잉 생산성 균주의 제조 방법의 유리한 실시태양에 따라, 상기 배양 배지 M1은 배양 배지의 리터 당
·30 g의 밀 펩톤,
·5 g의 효모 추출물,
·1 g의 글루코스,
·120 ㎎의 FeCl3 염,
·400 ㎎의 MgCl2 염,
·10 ㎎의 CaCl2,
·58.5 g의 NaCl,
·5 ㎎의 ZnCl2,
·6.8 g의 (NH4)2SO4,
·6 g의 NH4Cl 및 pH = 6.5
를 포함한다.
또 다른 유리한 실시태양에 따라서, 상기 배지 M1은 리터 당 30 g의 밀 펩톤, 5 g의 효모 추출물, 1 g의 D-글루코스 H2O, 120 ㎎의 FeCl3 ·6H2O, 400 ㎎의 MgCl2·6H2O, 10 ㎎의 CaCl2·2H2O, 58.5 g의 NaCl, 5 ㎎의 ZnCl2, 6.8 g의 (NH4)2SO4, 및 6 g의 NH4Cl, pH = 6.5로 이루어진다.
특정한 실시태양에 따라, 과잉생산성 균주의 제조 방법은
·3 내지 50 g의 식물 펩톤,
·0.5 내지 20 g의 효모 추출물,
·1 내지 30 g의 당,
·1 내지 200 ㎎의, FeCl3 및 FeSO4로 이루어진 그룹 중에서 선택된 철 염,
·1 내지 700 ㎎의, MgCl2 및 MgSO4로 이루어진 그룹 중에서 선택된 마그네슘 염,
·0.1 내지 50 ㎎의 CaCl2,
·0 내지 50 ㎎의 ZnCl2
·2 내지 50 g의 NaCl, 바람직하게는 6 g/ℓ
를 포함하고 pH가 6.2 내지 7.5 값의 범위 내에 있는 예비배양 배지 M0 상에서 예비 배양하는 단계를 포함한다.
상기 과잉생산성 균주의 제조 방법의 특정한 실시태양에 따라, 상기 예비배양 단계는 리터 당 3.87 g의 밀 펩톤을 포함하는 예비배양 배지 M0을 사용한다.
상기 과잉생산성 균주의 제조 방법의 또 다른 실시태양에 따라, 상기 예비배양 단계는 리터 당 30 g의 밀 펩톤을 포함하는 예비배양 배지 M0을 사용한다.
과잉생산성 균주의 제조 방법의 유리한 실시태양에 따라서, 상기 예비배양 단계는 3.87 g의 밀 펩톤, 5 g의 효모 추출물, 1 g의 D-글루코스 H2O, 120 ㎎의 FeCl3 ·6H2O, 400 ㎎의 MgCl2·6H2O, 10 ㎎의 CaCl2·2H2O, 6 g의 NaCl, 5 ㎎의 ZnCl2, 6.8 g의 (NH4)2SO4, 6 g의 NH4Cl, 15 g/ℓ의 아가 및 pH = 6.5를 포함하는 아가 예비배양 배지 M0를 사용한다.
과잉생산성 균주의 제조 방법의 또 다른 유리한 실시태양에 따라서, 상기 예비배양 단계는 30 g의 밀 펩톤, 5 g의 효모 추출물, 1 g의 D-글루코스 H2O, 120 ㎎의 FeCl3 ·6H2O, 400 ㎎의 MgCl2·6H2O, 10 ㎎의 CaCl2·2H2O, 6 g의 NaCl, 5 ㎎의 ZnCl2, 6.8 g의 (NH4)2SO4, 6 g의 NH4Cl, 및 pH = 6.5를 포함하는 액체 예비배양 배지 M0를 사용한다.
하나의 실시태양에 따라, 상기 정의한 바와 같은 방법은 스타필로코커스 아우레우스 T5의 과잉생산성 균주의 제조 방법이다.
또 다른 실시태양에 따라, 상기 정의한 바와 같은 방법은 스타필로코커스 아우레우스 T8의 과잉생산성 균주의 제조 방법이다.
본 발명은 또한 상기 정의한 바와 같은 방법에 의해 수득한 과잉생산성 균주 및 캡슐 폴리사카라이드의 제조를 위한 상기 균주의 용도에 관한 것이다. 따라서 본 발명은 특히 상술한 바와 같은 방법에 의해 수득한 과잉생산성 레이놀즈(Reynolds) 균주, 과잉생산성 벡커(Becker) 균주 및 과잉생산성 CYL770 균주에 관한 것이다.
따라서 또 다른 태양에 따라, 본 발명은
(a) 상기 정의한 바와 같은 배양 배지 M1 상에서 스타필로코커스 아우레우스 균주를 배양하고,
(b) 상기와 같이 생성된 배양물을 불활성화시키고,
(c) 캡슐 폴리사카라이드를 회수함
을 포함하는, 캡슐 폴리사카라이드의 제조 방법을 제공한다.
캡슐 폴리사카라이드의 제조 방법의 하나의 실시태양에 따라서, 상기 배양 단계는 밀 펩톤을 포함하는 배양 배지 M1을 사용한다.
하나의 실시태양에 따라서, 캡슐 폴리사카라이드의 제조 방법은 상기 과잉생산성 균주의 제조 방법과 관련하여 정의한 바와 같은 예비배양 단계를 포함한다.
본 발명의 주제는 또한
·3 내지 50 g의 식물 펩톤,
·0.5 내지 20 g의 효모 추출물,
·1 내지 30 g의 당,
·1 내지 200 ㎎의, FeCl3 및 FeSO4로 이루어진 그룹 중에서 선택된 철 염,
·1 내지 700 ㎎의, MgCl2 및 MgSO4로 이루어진 그룹 중에서 선택된 마그네슘 염,
·0.1 내지 50 ㎎의 CaCl2,
·0 내지 50 ㎎의 ZnCl2
·2 내지 50 g의 NaCl, 바람직하게는 6 g/ℓ
를 포함하고 pH가 6.2 내지 7.5 값의 범위 내에 있는, 스타필로코커스 아우레우스의 배양에 적합한 배지 M0이며, 바람직하게는 리터 당 3.87 g 또는 30 g의 밀 펩톤 및 5 g의 효모 추출물, 1 g의 D-글루코스 H2O, 120 ㎎의 FeCl3 ·6H2O, 400 ㎎의 MgCl2·6H2O, 10 ㎎의 CaCl2·2H2O, 6 g의 NaCl, 5 ㎎의 ZnCl2, 6.8 g의 (NH4)2SO4, 6 g의 NH4Cl 및 pH = 6.5를 포함하고 유리하게는 상기로 이루어진 아가 또는 액체 배지 M0에 관한 것이다.
본 발명의 주제는 또한
·5 내지 100 g의 식물 펩톤,
·0.5 내지 20 g의 효모 추출물,
·1 내지 30 g의 당,
·1 내지 200 ㎎의, FeCl3 및 FeSO4로 이루어진 그룹 중에서 선택된 철 염,
·1 내지 700 ㎎의, MgCl2 및 MgSO4로 이루어진 그룹 중에서 선택된 마그네슘 염,
·0.1 내지 50 ㎎의 CaCl2,
·0 내지 50 ㎎의 ZnCl2
·10 내지 250 g의 NaCl, 바람직하게는 58.5 g/ℓ
를 포함하고 pH가 6.2 내지 7.5 값의 범위 내에 있는, 스타필로코커스 아우 레우스 캡슐 폴리사카라이드의 과잉생산에 적합한 배양 배지 M1이며, 바람직하게는 리터 당 30 g의 밀 펩톤, 5 g의 효모 추출물, 1 g의 D-글루코스 H2O, 120 ㎎의 FeCl3 ·6H2O, 400 ㎎의 MgCl2·6H2O, 10 ㎎의 CaCl2·2H2O, 58.5 g의 NaCl, 5 ㎎의 ZnCl2, 6.8 g의 (NH4)2SO4, 6 g의 NH4Cl 및 pH = 6.5를 포함하고 유리하게는 상기로 이루어진 배양 배지 M1에 관한 것이다.
본 발명자들은 상기 정의한 바와 같은 배지 M1을 유리하게는 단순화된 배지 M2로 대체시킬 수 있음을 입증하였다. 따라서 본 발명은 또한 과잉생산성 에스 아우레우스 균주의 제조 방법 및 배지 M1을 하기 정의하는 바와 같은 배지 M2로 대체시킨 상기 정의한 바와 같은 캡슐 폴리사카라이드의 제조 방법에 관한 것이다.
따라서 본 발명의 주제는 또한 배양 배지의 리터 당
·52.5 내지 100 g의 식물 펩톤, 유리하게는 밀 펩톤,
·0 내지 82.5 g의 NaCl, 유리하게는 5 내지 82.5 g, 특히 41 g/ℓ의 NaCl,
·0 내지 15 g/ℓ의 마그네슘 염, 유리하게는 0.01 내지 15 g/ℓ, 특히 15 g/ℓ의 MgCl2·6H2O, 및
·0 내지 7 g/ℓ의 당, 유리하게는 0.25 내지 7 g/ℓ, 특히 0.25 g/ℓ의 D-글루코스 H2O
를 포함하고 pH가 6.3 내지 6.7, 유리하게는 6.4 내지 6.6 값의 범위 내에 있는 배양 배지 M2이다.
특정한 실시태양에 따라, 상기 배양 배지 M2는 93 g/ℓ의 밀 펩톤, 41 g/ℓ의 NaCl, 0.25 g/ℓ의 D-글루코스 H2O 및 15 g/ℓ의 MgCl2·6H2O를 포함하고, 유리하게는 상기로 구성되며, 그의 pH는 6.3 내지 6.7 값의 범위 내에 있다.
본 발명자들은 또한 식물 펩톤이 65 내지 85 g/ℓ, 유리하게는 75 g/ℓ의 효모 추출물로 대체된 배지 M2에 상응하는 배양 배지 M3을 사용할 수 있음을 입증하였다. 따라서 본 발명은 또한 과잉생산성 에스 아우레우스 균주의 제조 방법 및 배지 M1을 하기 정의하는 바와 같은 배지 M3로 대체시킨 상기 정의한 바와 같은 캡슐 폴리사카라이드의 제조 방법에 관한 것이다.
따라서 본 발명의 주제는 또한 배양 배지의 리터 당
·65 내지 85 g의 효모 추출물, 유리하게는 75 g/ℓ의 효모 추출물,
·0 내지 82.5 g의 NaCl, 유리하게는 5 내지 82.5 g, 특히 41 g/ℓ의 NaCl,
·0 내지 15 g/ℓ의 마그네슘 염, 유리하게는 0.01 내지 15 g/ℓ, 특히 15 g/ℓ의 MgCl2·6H2O, 및
·0 내지 7 g/ℓ의 당, 유리하게는 0.25 내지 7 g/ℓ, 특히 0.25 g/ℓ의 D-글루코스H2O
를 포함하고 pH가 6.3 내지 6.7 값의 범위 내에 있는 배양 배지 M3이다.
본 발명을, 상기 폴리사카라이드를 회수하기 위한 프로토콜의 표현을 제공하는 도 1을 참고로, 하기의 설명에서 보다 상세히 개시할 것이다.
본 발명자들은 놀랍게도 상기 배양 배지 M1, M2 및 M3이 캡슐 폴리사카라이드를 분비하는 스타필로코커스 아우레우스의 능력의 상당한 증가를 유도함을 입증하였다. 상기 증가는 하기 실시예 2.4에 개시된 바와 같은 ELISA 방법에 의해, 생산된 캡슐 폴리사카라이드의 양을 측정함으로써 입증될 수 있다. 상기 증가된 분비 능력을 나타내는 스타필로코커스 아우레우스를 본 발명과 관련하여 과잉생산성 균주라 칭한다.
본 발명과 관련하여, "과잉생산성 균주"란 용어는 따라서 배지 M1 또는 M2 또는 M3 상에서 배양 후에 실시예 2.4에 개시된 ELISA 방법에 의해 측정 시, 상기 동일한 출발 균주를 푸트렐(Poutrel) 배지(상기 배지 또는 하기 실시예 1.1의 설명에 대해서 Poutrel, B et al.(1995). Clin Diagn Lab Immunol 2, 166-171 참조) 상에서 동일한 배양 조건 하에 배양시켜 생산된 것보다 3 배 이상, 바람직하게는 5 배 이상, 및 유리하게는 10 배인 캡슐 폴리사카라이드의 양(㎎/ℓ)을 생산하는 스타필로코커스 아우레우스를 의미한다.
재조합 균주의 경우에, "과잉생산성 균주"란 용어는 배지 M1 또는 M2 또는 M3 상에서 배양 후에 실시예 2.4에 개시된 ELISA 방법에 의해 측정 시, 상기 동일한 출발 균주를 TSB 배지(상기 배지에 대한 설명에 대해서 실시예 1.5를 참조하시오) 상에서 동일한 배양 조건 하에 배양시켜 생산된 것보다 2 배 이상 많은 양의 캡슐 폴리사카라이드(㎎/ℓ)를 생산하는 재조합 스타필로코커스 아우레우스를 의미한다.
본 발명자들은 놀랍게도 상기 과잉생산성 균주의 제조 방법을 스타필로코커스 아우레우스 T5 및 T8 균주에 적용할 수 있음을 입증하였다. 본 발명자들은 또한 본 발명에 따른 방법을 캡슐 폴리사카라이드를 과잉생산하기 위해서 유전자 변형시킨 재조합 균주에도 또한 적용할 수 있음을 알게 되었다. 본 발명자들은 본 발명에 따른 방법을 T8 캡슐 폴리사카라이드를 다량으로 생산하도록 유전자 변형시킨 CYL770 균주에 적용시킴으로써 상기 태양을 입증하였다. 상기 균주를 배지 M1 또는 M2 또는 M3 상에서 배양시킨 후에, T8 캡슐 폴리사카라이드를 분비하는 그의 능력은 하기 실시예에 개시되는 바와 같이 2의 인자에 의해 증가한다.
본 발명과 관련하여, 따라서 "스타필로코커스 아우레우스 균주"란 용어는 혈청형 T5 및/또는 T8 폴리사카라이드를 포함하는 캡슐 또는 미세캡슐을 발현하는 임의의 스타필로코커스 아우레우스 균주를 의미한다. 적합한 균주의 비 제한적인 예로서, 뉴만(T5), 레이놀즈(T5), 로웬스타인(T5), 벡커(T8), 라이트(T8), CYL770(T8) 및 CYL1892(T5) 균주를 언급할 수 있다.
이들 균주를 각종 연구소 또는 각종 콜렉션으로부터 입수할 수 있으며; 특히 파스퇴르 인스티튜트 콜렉션(Pasteur Institute Collection(CIP)): 레이놀즈 CIP 103313, 벡커 CIP 103314, 또는 ATCC: 라이트 ATCC9525, 로웨인스타인 ATCC 49521을 언급할 수 있다. 본 발명과 관련하여, 상기 CYL770(T8) 및 레이놀즈(T5) 균주를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 CYL770 균주는 보다 많은 양의 T8 캡슐 폴리사카라이드를 생산하도록 유전자 변형시킨 벡커 균주이다. 상기 균주를 유리하게는 본 발명에 따른 과잉생산성 균주의 제조 방법 및 또한 본 발명에 따른 폴리사카라이드의 제조 방법에 출발 균주로서 사용할 수 있다. 상기 CYL770 균주의 설명은 문헌[Luong, T.T. and Lee, C.Y(2002), Infect.Immun. 70:3389-3395]에 제공되어 있다. 상기 CYL1892 균주는 cap5 오페론 프로모터가 문헌[Luong and Lee(2002 Infect. Immun. 70:3389-3395)]에 개시된 방법에 따라, 하기의 변형과 함께 에스 아우레우스의 M 균주의 cap1 오페론의 강한 구성 프로모터로 치환된 레이놀즈 균주(CIP 103313)로부터 수득한 재조합 에스 아우레우스를 나타낸다: 동종 서열이 상기 레이놀즈 균주의 동등한 동종 서열로 치환되었고, 플라스미드 pCL52.2가 온도감수성 복제 기원을 함유하고 cat 마커(클로람페니콜에 대한 내성을 부여하는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제)를 포함하는 플라스미드 pCL10으로 치환되었다. 간단히, Pcap1 프로모터를 함유하는 대략 250 bp의 단편에 융합된 상기 레이놀즈 균주의 cap5 ORF를 함유하는 대략 1 kb의 DNA 단편을 중복 PCR 기법에 의해 제작하였다. 상기 cap5A 유전자의 상부 서열을 함유하는 대략 1 kb의 DNA 단편을 상기 레이놀즈 균주의 게놈으로부터 PCR에 의해 증폭시킨다. 상기 두 단편을 후속적으로 온도 감수성 복제 기원을 수반하고 상기 Pcap5 프로모터를 Pcap1 프로모터로 치환시키기 위해 cat 마커를 포함하는 상기 플라스미드 pCL10 내로 클로닝시킨다. 상기와 같이 제작된 플라스미드를 후속적으로 균주 RN4220으로 일렉트로포레이션시키고 이어서 박테리오파지 52를 사용하여 상기 레이놀즈 균주 내로 형질도입에 의해 도입시킨다. 상기 플라스미드의 복제 기원의 온도 감수성은 후속적으로 동일한 시간에 클로람페니콜에 의한 선택을 적용하면서 그의 복제를 차단시킴으로써 동종 재조합을 촉진되게 할 수 있다.
본 발명과 관련하여, "캡슐 폴리사카라이드"란 용어는 스타필로코커스 아우레우스 균주의 T5 및/또는 T8 캡슐 폴리사카라이드, 및 또한 그로부터 유도된 단편을 의미한다.
본 발명가 관련하여, "배양 배지"란 용어는 동물 기원의 단백질이 없는 배지를 의미한다.
"동물 기원의 단백질"이란 표현은 동물 기원의 물질로부터 수득된 단백질 및 또한 상기로부터 유도된 임의의 생성물, 예를 들어 동물 단백질의 화학적 처리로부터 기원하는 유도체를 의미한다. 상기는 또한 상기 동물 단백질의 부분 또는 전체 가수분해의 산물, 예를 들어 펩톤, 폴리펩타이드, 펩타이드, 또는 그로부터 유도된 아미노산을 의미한다.
본 발명에 따른 과잉생산성 균주의 제조 방법은 (a) 스타필로코커스 아우레우스 균주의 배양 단계를 포함한다. 하나의 실시태양에 따라, 상기 배양 단계는
·5 내지 100 g의 식물 펩톤,
·0.5 내지 20 g의 효모 추출물,
·1 내지 30 g의 당,
·1 내지 200 ㎎의, FeCl3 및 FeSO4로 이루어진 그룹 중에서 선택된 철 염,
·1 내지 700 ㎎의, MgCl2 및 MgSO4로 이루어진 그룹 중에서 선택된 마그네슘 염,
·0.1 내지 50 ㎎의 CaCl2,
·0 내지 50 ㎎의 ZnCl2
·10 내지 250 g의 NaCl, 바람직하게는 58.5 g/ℓ
를 포함하고 pH가 6.2 내지 7.5 값의 범위 내에 있는, 배양 배지 M1을 사용한다.
상기 사용된 배지 M1에서 단백질 질소원은 주로 식물 펩톤에 의해 제공된다.
본 발명과 관련하여, "식물 펩톤"이란 용어는 밀 펩톤 및 완두콩 펩톤으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 펩톤을 의미한다. 상기 식물 펩톤은 일반적으로는 최고의 단백질 함량을 함유하는 식물, 예를 들어 맥아의 부분으로부터 추출된 단백질의 효소 또는 화학 처리에 의해 수득되는 가수분해산물의 형태이다. 화학적으로 개질되지 않은 식물을 사용하는 것이 바람직하다. 화학적 처리의 경우, 상기 단백질 추출물에 고온 및 가압 조건 하에 염산의 작용을 가한다. 이어서 상기 가수분해산물을 수산화 나트륨으로 중화시키고 이어서 고체 부산물을 상기로부터 제거한다. 효소 처리의 경우, 상기 단백질 추출물을 통상적으로는 파파인에 의해 절단한다. 상기 수득된 펩톤은 주로 아미노산, 및 MW가 ≤1 KD인 작은 펩타이드의 혼합물로 이루어진다. MW가 >1 KD인 펩타이드는 상기 혼합물의 30% 미만을 차지한다. Hy-Pea 7404(Quest ref 5710565로부터) 및 Peptone de ble E1(Organotechnie ref. 19559로부터)이라는 이름 하에 언급되는 상업적인 제제가 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 식물 펩톤 가수분해산물의 예이다.
상기 배지 M1에 사용되는 식물 펩톤의 농도를 상기 펩톤의 단백질 질소 함량 및 효모 추출물의 농도를 고려함으로써 선택한다. 상기 함량을 켈달법에 의해 계산한다. 추가의 상세한 내용에 대해서, 예를 들어 문헌[Lynch J.M. et al, J. AOAC Int.(1999)82(6):1389-98]을 참고로 할 수 있다. 대개, 상기 선택된 식물 펩톤의 단백질 질소 함량은 8 내지 15%(중량/중량)이다. 상기 범위의 값에서, 사용될 수 있는 식물 펩톤의 농도는 배양 배지의 리터 당 5 내지 100 g, 바람직하게는 20 내지 50 g/ℓ, 및 특히 30 g/ℓ이다.
상기 사용된 배지 M1 중의 단백질 질소원을 또한 효모 추출물에 의해 제공한다. 상기 효모 추출물 중의 단백질 질소 함량은 일반적으로는 9 내지 13%(중량/중량)이다. 상기 효모 추출물을 배양 배지의 리터 당 0.5 내지 20 g의 농도, 및 특히 5 g/ℓ의 농도로 사용한다. 상기 배양 배지 중의 단백질 질소를 또한 무기 염의 형태로 제공할 수 있으며, 예를 들어 암모늄염, 예를 들어 클로라이드 또는 설페이트를 들 수 있다. 상기 무기 염을 다른 질소원에 의해 제공되는 양에 따라 조절되는 농도로 사용할 수 있다.
단백질 질소원의 농도를, 전체 단백질 질소 함량이 배양 중에 독성 폐기물의 축적에 원인이 될 수 있는 질소성 과이화상태(nitrogenous hypercatabolism)를 생성시키지 않도록 조절한다. 더욱 또한, 상기 효모 추출물에 의해 제공되는 과잉의 비타민으로 인한 실질적인 억제 효과의 출현을 방지하기 위해서, 후자를 단지 단백질 질소의 2 차 공급원으로서, 바람직하게는 5 g/ℓ의 농도로 사용한다.
유리한 실시태양에 따라, 상기 배양 배지 M1은 배지의 리터 당 30 g의 펩톤, 바람직하게는 밀 펩톤, 및 5 g의 효모 추출물을 포함한다.
상기 배양 배지는 또한 당원을 포함한다.
본 발명과 관련하여, "당원"이란 용어는 세균에 의해 대사될 수 있는 비 동물 기원의 임의의 당 공급원, 예를 들어 프럭토스, 리보스, 자일로스, 퓨코스 또는 글루코스를 의미한다. 배양 배지의 리터 당 1 내지 30 g 정도의 농도를 사용할 수 있다. 예를 들어 글루코스의 경우, 1 g/ℓ의 농도를 사용하는 것이 유리하다.
상기 배양 배지 M1은 무기 염, 및 특히 철, 마그네슘, 칼슘, 아연 및 나트륨 염, 바람직하게는 클로라이드를 하기의 양으로 또한 함유한다:
-배양 배지의 리터 당 1 내지 200 ㎎의, FeCl3 및 FeSO4로 이루어진 그룹 중에서 선택된 철염, 및 특히 120 ㎎의 FeCl3;
-배양 배지의 리터 당 1 내지 700 ㎎의, MgCl2 및 MgSO4로 이루어진 그룹 중에서 선택된 마그네슘염, 및 특히 400 ㎎의 MgCl2;
-배양 배지의 리터 당 0.5 내지 50 ㎎의 CaCl2, 및 특히 10 ㎎의 CaCl2;
-배양 배지의 리터 당 0 내지 50 ㎎의 ZnCl2, 및 특히 5 ㎎의 ZnCl2;
-배양 배지의 리터 당 10 내지 250 g, 바람직하게는 58.5 g의 NaCl.
Fe, Ce 및 Mg의 무기 염을 통상적으로는 수화된 형태로 사용한다. 본 발명과 관련하여, 하기의 수화된 염들을 배양 배지에 사용하였다: FeCl3·6H2O, MgCl2·6H2O, CaCl2·2H2O.
상기 배지 M1은 6.2 내지 7.5, 바람직하게는 6.5 값 범위 내의 초기 pH를 가지며; 이를 위해서, 완충 능을 위해 통상적으로 사용되고 상기 나타낸 값 범위의 pH를 수득할 수 있게 하는 임의의 무기 염을 필요에 따라 사용할 수 있다. 상기 pH를 측정하기 위해서, pH-미터를 사용하여 주변 온도에서 측정한다.
상기 배지 M1은 또한 삼투압 조절제, 예를 들어 글리세로포스페이트 및/또는 글리신-베타인을, 글리신-베타인의 경우 1 내지 10 mM의 농도 및 글리세로포스페이트의 경우 50 내지 100 mM의 농도로 포함할 수 있으며, 이는 상기 NaCl 농도가 1 M(58 g/ℓ)을 초과하는 경우 첨가하는 것이 유리할 수 있다.
상기 사용되는 배양 배지 M1은 바람직하게는 액체 배지에 상응한다. 그러나, 상기는 고체 형태일 수 있다. 상기 고체 또는 아가 형태는 젤 형성 물질, 대개는 아가의 액체 배지에 배양 배지 리터 당 10 내지 30 g의 농도로 첨가함으로써 획득된다.
유리한 실시태양에 따라서, 상기 배양 배지 M1은 30 g의 밀 펩톤, 5 g의 효모 추출물, 1 g의 D-글루코스 H2O, 120 ㎎의 FeCl3 ·6H2O, 400 ㎎의 MgCl2·6H2O, 10 ㎎의 CaCl2·2H2O, 58.5 g의 NaCl, 5 ㎎의 ZnCl2, 6.8 g의 (NH4)2SO4, 6 g의 NH4Cl 및 pH = 6.5를 포함하고 유리하게는 상기로 이루어진다.
상기 배양 단계를, 상기 배양 배지 M1을 예를 들어 0.2의 초기 OD680 ㎚를 갖는 접종물로 시딩하고 37 ℃에서 예를 들어 48 내지 72 시간 동안, 가능하게는 5 내지 10% 농도의 CO를 함유하는 분위기(5 유형의 경우, CO2 없이, 및 벡커 균주 사용의 경우, CO2와 함께) 하에서 배양시킴으로써 수행할 수 있다. 상기 배양 부피를 필요에 따라 변화시킬 수 있다. 400 ㎖ 내지 20 ℓ 또는 그 이상의 부피, 예를 들어 30 내지 100 ℓ를 사용할 수 있다. 상기 배양 배지의 부피 대 20%(V/V)의 배양 용기의 부피의 비를 유지시킨다. 보다 큰 부피의 경우, 산소화가 입증되며 이를 배양 중에 산소압의 조절 및 적합한 교반에 의해 조절한다.
상기 배양 단계는 필요에 따라, 생산된 폴리사카라이드의 양 및 바이오매스를 증가시키기 위해서 증가하는 부피로 연속적인 배양을 포함할 수 있다.
유리한 실시태양에 따라서, 과잉생산성 균주의 제조 방법은 리터 당
·1 내지 30 g의 식물 펩톤,
·0.5 내지 20 g의 효모 추출물,
·1 내지 30 g의 당,
·1 내지 200 ㎎의, FeCl3 및 FeSO4로 이루어진 그룹 중에서 선택된 철 염,
·1 내지 700 ㎎의, MgCl2 및 MgSO4로 이루어진 그룹 중에서 선택된 마그네슘 염,
·0.1 내지 50 ㎎의 CaCl2,
·0.1 내지 50 ㎎의 ZnCl2
·0 내지 50 g의 NaCl, 바람직하게는 6 g/ℓ
를 포함하고 pH가 6.2 내지 7.5 값의 범위 내에 있는 예비배양 배지 M0상에서 예비배양하는 단계를 포함한다.
사기 다양한 구성성분들의 정의에 대해서 상기 배양 배지 M1과 관련하여 상기에 제공된 정의들을 참고로 할 수 있다.
다른 한편으로, 예비배양 단계의 경우에, 예비배양 배지의 리터 당 3.87 또는 30 g의 펩톤, 특히 밀 펩톤을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 배지 M0 중의 NaCl의 농도는 바람직하게는 6 g/ℓ이다. 상기 예비배양 단계에서 예비배양 배지 M0는 바람직하게는 리터 당 3.87 g의 밀 펩톤을 포함하는 아가 배지, 또는 리터 당 30 g의 밀 펩톤을 포함하는 액체 배지이다.
유리한 실시태양에 따라서, 상기 예비배양 배지를 리터 당 30 g의 밀 펩톤, 5 g의 효모 추출물, 1 g의 D-글루코스 H2O, 120 ㎎의 FeCl3 ·6H2O, 400 ㎎의 MgCl2·6H2O, 10 ㎎의 CaCl2·2H2O, 6 g의 NaCl, 5 ㎎의 ZnCl2, 6.8 g의 (NH4)2SO4, 6 g의 NH4Cl 및 pH = 6.5를 포함하고 유리하게는 상기로 이루어진 예비배양 배지 M0상에서 상기 균주를 배양함으로써 수행한다.
또 다른 유리한 실시태양에 따라서, 상기 예비배양 단계를 3.87 g의 밀 펩톤 또는 액체 배지 M0의 경우 30 g/ℓ, 5 g의 효모 추출물, 1 g의 D-글루코스 H2O, 120 ㎎의 FeCl3 ·6H2O, 400 ㎎의 MgCl2·6H2O, 10 ㎎의 CaCl2·2H2O, 6 g의 NaCl, 5 ㎎의 ZnCl2, 6.8 g의 (NH4)2SO4, 6 g의 NH4Cl 및 pH = 6.5를 포함하고 유리하게는 상기로 이루어진 액체 또는 아가 예비배양 배지 상에서 상기 균주를 배양함으로써 수행한다.
상기 예비배양 단계는 상기 접종물을 증폭되게 할 수 있다. 상기를 상기 예비배양 배지 M0를 스타필로코커스 아우레우스 균주로, 예를 들어 1 x 107 CFU의 비로 시딩하고 37 ℃에서 예를 들어 5 내지 20 시간의 범위일 수 있는 기간 동안, 가능하게는 5 내지 10% 부피의 CO2를 함유하는 분위기(T5의 경우 CO2 없이, 및 벡커 균주 사용의 경우 CO2의 존재 하에) 하에서 배양시킴으로써 수행할 수 있다. 상기 배양 단계는, 상기 바이오매스를 증가시키기 위해서, 배지 M0의 증가하는 부피에서 연속적인 예비배양을 포함할 수 있다. 이어서 상기 예비배양물을 사용하여 액체 배지 M1을 접종한다. 이를 위해서, 초기 OD680 ㎚가 0.2가 되도록 하는 접종물의 양을 사용할 수 있다. 상기 예비배양 단계의 배양 부피를 통상적으로는 400 ㎖에서 20 ℓ로 변화시킬 수 있다. 바람직하게는 상기 예비배양 배지의 부피 대 20% 이하의 용기의 부피의 비를 유지시킨다.
상기 배양 단계 후에, 상기와 같이 생산된 균주를 원심분리에 의해 회수하고 20% 글리세롤을 첨가한 후에 동결 건조된 생성물 또는 동결된 생성물의 형태로 보존하거나, 또는 보다 큰 부피의 배양 배지를 시딩하기 위해서 바로 사용하거나, 또는 그 밖에 본 발명에 따른 캡슐 폴리사카라이드의 제조 방법에 바로 사용할 수 있다.
유리한 실시태양에 따라서, 상기 정의한 바와 같은 제조 방법은 과잉생산성 레이놀즈 균주의 제조 방법에 상응한다.
또 다른 유리한 실시태양에 따라서, 상기 정의한 바와 같은 제조 방법은 과잉생산성 CYL770 균주의 제조 방법에 상응한다.
본 발명은 또한 상기 정의한 바와 같은 방법에 의해 생산된, 과잉생산성 스타필로코커스 아우레우스 균주, 특히 레이놀즈, 벡커 및 CYL770 균주에 관한 것이다.
본 발명자들은 상기 배양 배지 M1을 단순화할 수 있고 본 발명에 따른 방법과 관련하여 하기 정의하는 바와 같은 배지 M2로 대체시킬 수 있음을 보이는 실험 안을 수행하였다.
또 다른 실시태양에 따라서, 단계 (a)는 배양 배지의 리터 당
·52.5 내지 100 g의 식물 펩톤, 유리하게는 밀 펩톤,
·0 내지 82.5 g의 NaCl, 유리하게는 5 내지 82.5 g, 특히 41 g/ℓ의 NaCl,
·0 내지 15 g/ℓ의 마그네슘염, 유리하게는 0.01 내지 15 g/ℓ, 특히 15 g/ℓ의 MgCl2·6H2O, 및
·0 내지 7 g/ℓ의 당, 유리하게는 0.25 내지 7 g/ℓ, 특히 0.25 g/ℓ의 D-글루코스 H2O
를 포함하고 pH가 6.3 내지 6.7 값의 범위 내에 있는 배양 배지 M2를 사용한다.
사용된 용어들의 정의에 대해서, 상기 배양 배지 M1과 관련하여 상기 제공된 정의들을 참고로 할 것이다.
상기 실험 안의 결과는 식물 펩톤이 5% 이상의 전체 당 함량을 함유하는 경우 상기 배양 배지 M2에 당을 첨가할 필요가 없음을 나타낸다. 상기 후자는 당, 예를 들어 프럭토스, 글루코스, 만노트리오스, 라피노스, 슈크로스 또는 스타키오스의 혼합물을 포함할 수 있다. 이것이 상기의 경우가 아닌 경우, 상기 배양 배지에 또 다른 당원을 첨가할 필요가 있다. 이어서 상기 당을 0.25 내지 7 g/ℓ의 비로 첨가할 수 있다.
유리한 실시태양에 따라, 상기 배양 배지 M2는 당, 특히 D-글루코스·H2O 0.25 g/ℓ를 포함한다.
상기 배양 배지 M2는 유리하게는 MgCl2 및 MgSO4로 이루어진 그룹 중에서 선택된 마그네슘염을 함유할 수 있다. 본 발명자들은 마그네슘염의 첨가가 상기 배양 배지의 확고함을 증가시킬 수 있음을 입증하였다(상기 구성성분들의 변동 범위가 MgCl2의 존재 하에서 실질적으로 더 좁다). 따라서 염화 마그네슘, 특히 MgCl2·6H2O를 유리하게는 배양 배지 리터 당 0.01 내지 15 g의 범위로 상기 배지 M2에 첨가할 수 있다. 상기 배지 M2가 15 g/ℓ의 MgCl2·6H2O를 함유할 때 최상의 확고함이 관찰된다. 보다 고 농도의 마그네슘염은 임의의 추가적인 확고함의 증가를 발생시키지 않는다.
본 발명자들은 또한 개선된 폴리사카라이드 생산성이 광범위한 NaCl 농도 내에서 상기 배지 M2에 대해 관찰됨을 입증하였다. 구체적으로, 상기 NaCl은 부재하거나 또는 5 내지 100 g/배양 배지 ℓ, 유리하게는 5 내지 82.5 g/배양 배지 ℓ의 농도 범위 내로 사용될 수 있다.
더욱이 상기 실험 안은 펩톤의 농도와 NaCl의 농도 간에 강한 상호작용이 존재함을 보일 수 있었다. 따라서 본 발명에 따른 방법과 관련하여 유리하게 사용될 수 있는 농도 범위를 한정할 수 있었다.
특히 유리한 실시태양에 따라서, 상기 정의한 바와 같은 배지 M2는 52.5 내지 70 g의 식물 펩톤, 유리하게는 밀 펩톤, 및 5 내지 37 g의 NaCl을 포함한다.
또 다른 특히 유리한 실시태양에 따라서, 상기 정의한 바와 같은 배지 M2는 66 내지 82.5 g의 식물 펩톤, 유리하게는 밀 펩톤, 및 22 내지 74 g의 NaCl을 포함한다.
또 다른 특히 유리한 실시태양에 따라서, 상기 정의한 바와 같은 배지 M2는 60 내지 90.5 g의 식물 펩톤, 유리하게는 밀 펩톤, 및 35 내지 63.5 g의 NaCl을 포함한다.
또 다른 특히 유리한 실시태양에 따라서, 상기 정의한 바와 같은 배지 M2는 79 내지 95 g의 식물 펩톤, 유리하게는 밀 펩톤, 및 46 내지 82.5 g의 NaCl을 포함한다.
상기 4 개의 실시태양에 따른 배지 M2는 유리하게는 0.25 g/ℓ의 글루코스, 특히 D-글루코스, 및 15 g/ℓ의 MgCl2·6H2O를 함유할 수 있다.
특정 실시태양에 따라서, 상기 배양 배지 M2는 93 g/ℓ의 밀 펩톤, 4 g/ℓ의 NaCl, 0.25 g/ℓ의 D-글루코스 H2O 및 15 g/ℓ의 MgCl2·6H2O를 포함하고, 유리하게는 상기로 구성되며, 그의 pH는 6.3 내지 6.7 값의 범위 내에 있다. 상기와 같은 배지는 예를 들어 레이놀즈 균주로부터 40 ㎎/ℓ의 폴리사카라이드 T5의 수율을 생성시킨다.
본 발명자들은 또한 실험 안에 의해, 식물 펩톤을 65 내지 85 g, 유리하게는 75 g/ℓ의 효모 추출물로 대체한 상기 정의한 바와 같은 배지 M2를 본 발명에 따른 방법에 사용할 수 있음을 입증하였다. 상기 배지를 배양 배지 M3이라 칭한다. 따라서 본 발명에 따른 배양 배지 M3은 배양 배지의 리터 당
·65 내지 85 g/ℓ의 효모 추출물, 유리하게는 75 g/ℓ의 효모 추출물,
·0 내지 82.5 g의 NaCl, 유리하게는 5 내지 82.5 g, 특히 41 g/ℓ의 NaCl,
·0 내지 15 g/ℓ의 마그네슘 염, 유리하게는 0.01 내지 15 g/ℓ, 특히 15 g/ℓ의 MgCl2·6H2O, 및
·0 내지 7 g/ℓ의 당, 유리하게는 0.25 내지 7 g/ℓ, 특히 0.25 g/ℓ의 D-글루코스·H2O
를 포함하며 그의 pH는 6.3 내지 6.7 값의 범위 내에 있다.
추가적인 실험들은 상기 식물 펩톤 범위(상기 정의한 바와 같다)를 200 g/배양 배지 ℓ의 값으로 확장시킬 수 있음을 입증하였다. 따라서 식물 펩톤을 52.5 내지 200 g/ℓ의 비율로 함유하는 상기 정의한 바와 같은 M2 및 M3 배지를 본 발명의 범위 내에 포함시킨다.
따라서 본 발명은 상기 정의한 바와 같은 배양 배지 M2 또는 M3에 사용되는 방법에 의해 생산된 과잉생산성 스타필로코커스 아우레우스 균주, 특히 레이놀즈, 벡커, CYL770 및 CYL1892 균주에 관한 것이다.
또 다른 태양에 따라서, 본 발명은
(a) 상기 정의한 바와 같은 배양 배지 M1 또는 M2 또는 M3 상에서 상기 정의한 바와 같은 스타필로코커스 아우레우스 균주를 배양하고;
(b) 상기와 같이 제조된 배양물을 불활성화시키고,
(c) 캡슐 폴리사카라이드를 회수함
을 포함하는, 캡슐 폴리사카라이드의 제조 방법에 관한 것이다.
상기 캡슐 폴리사카라이드의 제조 방법의 배양 단계 (a)를 상기 과잉생산성 균주의 제조 방법의 단계 (a)와 관련하여 상술한 바와 동일한 조건 하에서 수행할 수 있으며, 또한 상기 정의한 바와 같은 예비배양 단계가 선행될 수 있다.
이어서 단계 (a)로부터 생성된 배양물에 불활성화 단계를 가한다.
상기 불활성화 단계는 상기 배양물을 페놀/에탄올(V/V) 혼합물로 최종 농도 2 부피%의 비율로 처리하고, 이어서 처리되는 바이오매스에 따라 6 내지 48 시간 동안 주변 온도에서, 예를 들어 자기 막대로 교반함으로써 수행할 수 있다. 상기 불활성화를 실패율 시험에 의해 입증한다. 이를 위해서, 100 마이크로리터의 처리된 배양물을 콜럼비아 아가 2% NaCl 상에 도말하고, 나란히 100 마이크로리터의 상기 처리된 배양물을 1/30의 말 혈청이 보충된 트립카제 대두 브로쓰에 시딩한다. 상기 배양물을 정지 위치에서 37 ℃에서 48 시간 동안 배양하고, 상기 브로쓰 플라스크의 마개를 비틀지 않은 채로 유지시킨다. 상기 배양물의 불활성화를 37 ℃에서 16 내지 18 시간 동안 진탕하면서 TSB 배지(혈청 첨가 없이)에서 증폭 단계를 포함하는 방법에 의해 조절하고, 이어서 콜럼비아 아가 2% NaCl의 페트리 디쉬를 150 ㎕의 상기와 같이 증폭된 배양물로 접종한다. 상기 디쉬 자체를 37 ℃에서 16 내지 18 시간 동안 두고 이어서 관찰한다. 콜로니의 결여는 상기 처리된 배양물의 성공적인 불활성화를 입증한다. 생육성 세균의 결여는 37 ℃에서 24 시간 동안 배양 후 생육의 결여에 의해 반영된다. 일단 상기 배양물의 실패율이 확립되었으면, 캡슐 폴리사카라이드를 회수한다. 상기 회수 단계는 상기 세포로부터 폴리사카라이드를 추출함을 포함한다. 다양한 추출 기법들이 문헌에 개시되어 있으며 이들 기법을 본 발명과 관련하여 사용할 수 있다. 예를 들어 문헌[Lee J.C. Infect. Immunu. 1993; 67:1853-1858; Dassy B. et al J. Gen. Microbiol. 1991; 137:1155-1162]을 참고로 할 수 있다. 121 ℃에서 오토클레이빙에 의한 추출 방법이 실시예 2.3에 예시되어 있다. 리소스타핀을 사용하는 추출 기법이 실시예 2.5에 개시되어 있다.
CYL 770 균주의 경우에, 폴리사카라이드의 대부분은 배양 상등액 내로 분비되며 따라서 후자로부터 직접 회수할 수 있다. 이를 위해서, 상기 배양의 끝에서, 상기 배지를 원심분리하고 세포 펠릿을 제거한다.
이어서 생성되는 캡슐 폴리사카라이드를 필요에 따라 정제할 수 있다. 다양한 정제 기법들이 문헌에 개시되어 있으며 본 발명과 관련하여 사용할 수 있다. 예를 들어 문헌[Lee J.C. et al 1987; 55:2191-2197; Fattom A. et al Infect. Immun. 1990; 58:2367-2374]을 참고로 할 수 있다. 정제 기법이 실시예 2.5에 예시되어 있다.
모노사카라이드의 몰 조성의 분석 및 500 MHZ에서의 양성자 NMR 분석은 폴리사카라이드가 수득되고, 그의 구조가 문헌에 개시된 바에 따르며, O-아세틸화 정도가 70% 초과이고 순도가 70% 이상임을 나타낸다. 잔류 물질은 최종 생성물 중에 단백질 유형의 잔류 물질 대략 0.5 내지 3%(w/w) 및 잔류 핵산 0.1%(w/w) 미만 및 잔류 리포테코산 및 잔류 테코산 5%(w/w) 미만의 비율로 존재한다.
상기 수득되는 캡슐 폴리사카라이드의 양을 실시예 2.4에 개시된 바와 같은 ELISA 기법에 의해 평가할 수 있다.
따라서 본 발명에 따른 PS의 제조 방법은 유리하게는, 바람직하게는 레이놀드 균주, 예를 들어 CIP 103313로부터의 T5 폴리사카라이드, 및 바람직하게는 CYL770 균주로부터의 T8 폴리사카라이드의 제조에 사용될 수 있다.
또 다른 태양에 따라, 본 발명은 따라서 스타필로코커스 아우레우스의 배양에 적합한, 상기 정의한 바와 같은 배지 M0에 관한 것이다.
본 발명과 관련하여, "스타필로코커스 아우레우스의 배양에 적합한 배지"라는 표현은 먼저 680 ㎚에서 광학 밀도를 측정함으로써 측정 시 10 이상의 인자까지의 상기 바이오매스의 증가, 및 두 번째로 OD/CFU 비가 1 OD 단위 = 10 CFU/㎖ 이상 이도록 하는 생육성을 수득할 수 있게 하는 배지를 의미한다. 상기 OD/CFU 비를 측정하기 위해서, 세균 현탁액(그의 광학 밀도는 분광광도계를 사용하여 측정하였다)을 10 배 희석률을 사용하여 PBS 완충액으로 희석한다. 상기 희석액 중에 함유된 CFU의 수를 상기 희석액을 영양 배지(예를 들어 콜럼비아 아가)를 함유하는 페트리 디쉬 상에서 시딩한 후에 평가한다. 37 ℃에서 24 시간 동안 배양 후에, 상기 생육성 세균을 카운트하고 상기 생육성 세균수(콜로니 형성 단위(CFU)로서 표현됨)와 광학 밀도(OD)간의 대응을 확립시킬 수 있다.
또 다른 태양에 따라서, 본 발명은 또한 스타필로코커스 아우레우스 캡슐 폴리사카라이드의 과잉생산에 적합한, 상기 정의한 바와 같은 배양 배지 M1, M2 및 M3에 관한 것이다.
본 발명과 관련하여, "캡슐 폴리사카라이드의 과잉생산에 적합한 배지"란 표현은 캡슐 폴리사카라이드를 분비하는 스타필로코커스 아우레우스 균주의 능력을 증가시켜, 그 결과 실시예 2.4에 한정된 바와 같은 ELISA 분석에 의해 측정 시, 동일한 배양 조건 하에서, 그러나 푸트렐 배지 상에서 동일한 출발 균주를 배양시켜 생산한 것의 3 배 이상, 바람직하게는 5 배 이상, 및 특히 10 배 이상인 캡슐 폴리사카라이드를 생성시키는 배지를 의미한다.
상기 재조합 균주의 경우에, 상기 배지는 상기가 캡슐 폴리사카라이드를 분비하는 재조합 스타필로코커스 아우레우스 균주의 능력을 증가시켜, 그 결과 실시예 2.4에 한정된 바와 같은 ELISA 분석에 의해 측정 시, 동일한 배양 조건 하에서, 그러나 TSB 배지 상에서 동일한 출발 균주를 배양시켜 생산한 것의 2 배정도로 많은 캡슐 폴리사카라이드를 생성시키는 경우, 캡슐 폴리사카라이드의 과잉생산에 적합한 것으로 간주된다.
이제 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세히 개시할 것이며, 이들 실시예는 순전히 본 발명의 예시를 제공하는 것이고 결코 본 발명의 범위를 제한하는 것으로서 간주될 수 없다.
실시예
1: 배양 배지의 제조
먼저, 각 구성성분들의 모액을 제조한다. 이를 위해서, 상기 구성성분들을 정밀 저울 상에서 칭량하고 한외여과된 물(달리 나타내지 않는 경우)에 용해시킨다. 이어서 상기와 같이 수득된 용액을 0.22 마이크론 스테리컵을 통해 여과하고 암실에서 +4 ℃에서 보관한다. 밀 펩톤, 효모 추출물 및 FeCl3의 모액을 즉석에서 제조한다.
1.1-
푸트렐
배지
상기 푸트렐 배지를 문헌[Poutrel et al., (1995). Clin Diagn Lab Immunol 2, 166-171]에서 나타낸 바와 같이 다양한 모액들을 혼합시켜 제조한다. 이어서 pH를 30% NaOH를 첨가하여 7로 조절하고, 이어서 상기 배지를 0.22 마이크론을 통해 여과한다.
상기 배지의 최종 조성(g/ℓ)은 하기와 같다: L-시스틴: 0.24 g/ℓ; L-아스파트산: 2.4 g/ℓ; L-글루탐산: 2.4 g/ℓ; L-프롤린: 2.4 g/ℓ; L-아르기닌: 0.36 g/ℓ; L-글리신: 2.4 g/ℓ; L-히스티딘: 0.48 g/ℓ; L-리신 HCl: 0.6 g/ℓ; L-세린: 2.4 g/ℓ; L-발린: 0.48 g/ℓ; L-타이로신: 0.18 g/ℓ; L-쓰레오닌: 2.4 g/ℓ; L-알라닌: 2.4 g/ℓ; L-아이소류신: 0.6 g/ℓ; L-류신: 0.6 g/ℓ; L-페닐알라닌: 0.2 g/ℓ; L-트립토판: 0.06 g/ℓ; L-메티오닌: 0.18 g/ℓ; D-글루코스: 10 g/ℓ; 니코틴산: 11.94 ㎎/ℓ; 티아민 HCl: 0.6 ㎎/ℓ; 암모늄 설페이트: 6.84 g/ℓ; 칼 륨 이수소 포스페이트: 1.34 g/ℓ; 나트륨 다이포스페이트: 14.38 g/ℓ; 칼슘 클로라이드: 5 ㎎/ℓ; 코발트 클로라이드 헥사하이드레이트: 2.4 ㎎/ℓ; 구리 설페이트: 0.5 ㎎/ℓ; 마그네슘 설페이트: 5.6 ㎎/ℓ; 나트륨 클로라이드: 5.8 ㎎/ℓ; 아연 클로라이드: 3.4 ㎎/ℓ; 철 클로라이드: 27 ㎎/ℓ; 마그네슘 설페이트: 247 ㎎/ℓ.
1.2-아가 배지
M0
, 액체 배지
M0
,
M1
배지
아가 배지 M0에 대하여:
먼저, 150 ㎖의 아가 베이스를, 한외여과된 H2O 150 ㎖ 중에 3 g의 아가를 용해시켜 제조한다. 생성 조성물을 아가 그레인이 사라질 때까지(대략 30 분) 비등 수욕에 넣고 이어서 오토클레이브에서 116 ℃에서 30 분 동안 멸균시킨다.
이어서 아가 배지 M0를 다양한 모액들을 혼합하고(하기 조성에 나타낸 순서로), 생성 혼합물을 0.22 마이크론 스테리컵을 통해 여과하고, 상기와 같이 수득된 혼합물 50 ㎖을 아가 베이스에 가하여 리터 당 하기(g)를 함유하는 배지를 수득함으로써 제조한다:
밀 펩톤: 3.87 g; 효모 추출물: 5 g; D-글루코스 H2O: 1 g; NaCl: 6 g; MgCl2·6H2O: 0.4 g; (NH4)2SO4: 6.8 g; NH4Cl: 6 g; FeCl3·6H2O: 120 x 10-3 g; ZnCl2: 5 x 10-3 g; CaCl2·2H2O: 10 x 10-3 g.
이어서 8 개의 페트리 디쉬를 붓는다.
사용된 밀 펩톤은 오가노테크니(Organotechnie)(ref. 19559)로부터의 밀 펩톤에 해당한다. 사용된 효모 추출물은 벡톤 디킨슨(Beckton Dickinson)(ref. 212750)으로부터의 추출물에 해당한다.
액체 배지 M0에 대하여:
액체 배지 M0를, 다양한 모액들을 하기 조성에 나타낸 순서로 혼합하고 생성 혼합물을 0.22 마이크론 스테리컵을 통해 여과하여 리터 당 하기(g)를 함유하는 배지를 수득함으로써 제조한다:
밀 펩톤: 30 g; 효모 추출물: 5 g; D-글루코스 H2O: 1 g; NaCl: 6 g; MgCl2·6H2O: 0.4 g; (NH4)2SO4: 6.8 g; NH4Cl: 6 g; FeCl3·6H2O: 120 x 10-3 g; ZnCl2: 5 x 10-3 g; CaCl2·2H2O: 10 x 10-3 g; pH = 6.5.
배지 M1에 대하여
배지 M1을, 다양한 모액들을 하기 조성에 나타낸 순서로 혼합하고 생성 혼합물을 0.22 마이크론 스테리컵을 통해 여과하여 리터 당 하기(g)를 함유하는 배지를 수득함으로써 제조한다:
밀 펩톤: 30 g; 효모 추출물: 5 g; D-글루코스 H2O: 1 g; NaCl: 58.5 g; MgCl2·6H2O: 0.4 g; (NH4)2SO4: 6.8 g; NH4Cl: 6 g; FeCl3·6H2O: 120 x 10-3 g; ZnCl2: 5 x 10-3 g; CaCl2·2H2O: 10 x 10-3 g.
1.3-
콜럼비아
아가 2%
NaCl
1 리터의 배지에 대하여, 44 g의 콜럼비아 "혈액 아가 베이스"(Difco ref. 279240)를 칭량하고, 이어서 멸균 한외여과된 H2O 500 ㎖을 가한다. 상기 수득된 혼합물을 대략 30 분(완전한 용해 및 등명한 용액이 수득될 때까지) 동안 100 ℃에서 수욕 중에서 배양한다. 이어서 멸균 한외여과된 H2O 500 ㎖을 가한다. 상기 용액을 200 ㎖ 쇼트(Schott) 플라스크에 분배하고 이어서 116 ℃에서 30 분 동안 오토클레이빙시켜 멸균시킨다. 이어서 상기 배지를 55 ℃(수욕)에서 유지시킨 후에 페트리 디쉬(25 ㎖/디쉬)에 붓는다. 상기 디쉬를 부은 후에, 13.3 ㎖의 30% NaCl(0.22 ㎛을 통해 여과된 것)을 플라스크 200 ㎖당 가하여, 2%의 최종 농도(=2 g/100 ㎖)를 획득한다.
1.4-
트립틱
소이 아가(
GTS
)
배지 1 리터에 대하여, 40 g의 "트립틱 소이 아가"(Difco ref. 236950)를 칭량하고, 이어서 500 ㎖의 멸균 한외여과된 H2O를 가한다. 상기 수득된 혼합물을 대략 30 분(완전한 용해 및 등명한 용액이 수득될 때까지) 동안 100 ℃에서 수욕 중에서 배양한다. 이어서 멸균 한외여과된 H2O 500 ㎖을 가한다. 상기 용액을 200 ㎖ 쇼트 플라스크에 분배하고 이어서 116 ℃에서 30 분 동안 오토클레이빙시켜 멸균시킨다. 이어서 상기 배지를 55 ℃(수욕)에서 유지시킨 후에 페트리 디쉬(25 ㎖/디쉬)에 붓는다.
1.5-"박토
트립틱
소이" 브로쓰(
TSB
)
배지 1 리터에 대하여, 30 g의 "박토 트립틱 소이"(Difco ref. 211825)를 칭량하고, 이어서 500 ㎖의 멸균 한외여과된 H2O를 가한다. 상기 수득된 혼합물을 대략 30 분(완전한 용해 및 등명한 용액이 수득될 때까지) 동안 100 ℃에서 수욕 중에서 배양한다. 이어서 멸균 한외여과된 H2O 500 ㎖을 가한다. 상기 용액을 200 ㎖ 쇼트 플라스크에 분배하고 이어서 116 ℃에서 30 분 동안 오토클레이빙시켜 멸균시킨다. 이어서 상기 배지를 55 ℃(수욕)에서 유지시킨 후에 페트리 디쉬(25 ㎖/디쉬)에 붓는다.
실시예
2: 다양한 배양 조건 하에서 유형 5 캡슐
폴리사카라이드(CP5)의
생산 평가
2.1-레이놀즈 균주 배양
동결된 물질을, 동물 기원 화합물 부재 조건 하에서 또는 표준 조건 하에서 실시하는 것을 요구하는지의 여부에 따라 제조하였다. 표준 조건의 경우, 출발 동결 건조된 물질을 콜럼비아 아가 +2% NaCl상에서 취한다. 후자를 균주에 따라 CO2와 함께 또는 상기 없이 37 ℃에서 18 시간 동안 배양한다. 상기 배양물을 다시 지수 생육기 하의 미생물을 수득하기 위해서 37 ℃에서 4 시간 동안 새로운 아가 디쉬 상에서 2차 배양한다. 이어서 상기 배양물을 20%의 글리세롤을 첨가한 트립틱 소이 브로쓰에서 회수한다. 동물 기원 화합물이 없는 조건이 요구되는 경우, 상기 예비배양을 37 ℃에서 18 시간 동안 배지 M0 상에서 수행하고 이어서 접종물을 사용하여 액체 배지 M0를 2차 배양한다. 동결을 또한 20% 글리세롤의 첨가 후에 수행한다.
상기 언급한 첫 번째 방법에 의해 수득한 동결된 레이놀즈 물질 100 ㎕를 PBS 900 ㎕에 용해시킨다.
아가 배지 M0의 2 개의 페트리 디쉬 및 콜럼비아 아가 2% NaCl의 2 개의 페트리 디쉬를 디쉬 당 150 ㎕의 세균 현탁액 층으로 시딩하고, 37 ℃에서 18 내지 20 시간 동안 배양한다.
상기 층들을 긁어내고 PBS 5 ㎖에 재현탁한다. 상기 현탁액의 OD680 ㎚를 측정하며, 이는 OD680 ㎚ = 0.2에서 50 ㎖ 삼각 플라스크를 시딩하기 위해 필요한 예비배양물의 부피를 측정할 수 있게 한다.
콜럼비아 아가 2% NaCl 상의 예비배양물을 사용하여 푸트렐 배지를 함유하는 삼각 플라스크를 시딩하고, 아가 M0 상의 예비배양물을 사용하여(37 ℃에서 18 내지 20 시간) 액체 배지 M0를 함유하는 삼각 플라스크 및 배지 M1을 함유하는 삼각 플라스크를 시딩한다. 상기 부피를 분석에 따라 변화시킬 수 있으며, 가장 통상적으로는 50 ㎖이다. 정확한 산소화를 유지시키기 위해서, 배지의 부피는 상기 삼각 플라스크 부피의 20% 이하이다.
초기 OD680 ㎚ 값의 확인 후에, 상기 삼각 플라스크들을 37 ℃에서 진탕시킨다(x 100 rpm).
상기 배양물을 t0, t8h, t24h, t32h, t48h, t56h 및 t72h에서 OD680 ㎚를 측정함으로써 모니터하고 pH를 초기 및 배양 72 시간째에 측정한다. 상기 50 ㎖ 배양물 상에서 수득한 결과를 하기 표 1 및 2에 기록한다.
| 균주 | 예비배양 배지 | OD680=1에 대한 OD/CFU | 표준 편차 |
| 레이놀즈 | 콜럼비아 아가 2% NaCl | 5.3E+08 | 8.2E+07 |
| 레이놀즈 | 아가 M0 | 4.2E+08 | 1.7E+08 |
| OD 68 ㎚ 측정 | |||
| 시간(시간) | 푸트렐 | 액체 M0 | M1 |
| 0 | 0.2 | 0.2 | 0.2 |
| 8 | 2.8 | 2.6 | 2.7 |
| 24 | 6.7 | 6.2 | 4.0 |
| 32 | 9.1 | 8.0 | 4.7 |
| 48 | 10.1 | 8.4 | 6.1 |
| 56 | 8.6 | 8.7 | 6.4 |
| 72 | 8.1 | 8.6 | 5.7 |
| 초기 pH | 7 | 6.5 | 6.5 |
| 최종 pH | 8.5 | 8.5 | 8.5 |
2.2- 배양물의 불활성화
72 시간째에, 상기 배양물을 750 ㎖의 배양물을 함유하는 4 개의 1 ℓ 쇼트 플라스크에 분배한다.
배양물 750 ㎖에 대하여 15 ㎖의 페놀/에탄올(v/v)(즉, 최종 농도 2%)을 가하고 상기 혼합물을 주변 온도에서 대략 48 시간 동안 자기 막대를 사용하여 교반한다.
실패율 시험을 하기의 방식으로 수행한다:
100 ㎕의 처리된 배양물을 콜럼비아 2% NaCl상에 도말하고,
100 ㎕의 처리된 배양물을 트립틱 소이 브로쓰 + 1/30 말 혈청 중에 시딩하고 이어서 37 ℃에서 48 시간 동안 배양한다(상기 트립틱 소이 브로쓰의 플라스크 마개는 뽑지 않은 채로 둔다). 상기와 같이 불활성화시킨 배양물을 사용하여 폴리사카라이드를 추출하고 ELISA에 의해 생산량을 평가한다.
2.3- 생산된
폴리사카라이드의
추출
이어서 상기 불활성화된 72 시간 배양물을 +4 ℃에서 3500 rpm에서 30 분 동안 원심분리시키고 배양 상등액을 분리시키고 +4 ℃에서 보관한다. 펠릿을 5 ㎖의 PBS에 용해시키고 121 ℃에서 60 분 동안 오토클레이빙시키고, 이어서 25 000 g 및 +4 ℃에서 30 분 동안 원심분리시키고, 상등액(추출물 1)을 회수한다. 상기 펠릿을 5 ㎖의 PBS에 용해시키고, 121 ℃에서 60 분간 오토클레이빙시키고, 25 000 g 및 +4 ℃에서 30 분간 원심분리시킨다. 상등액(추출물 2)을 회수한다. 추출물 1 및 2를 합하고 37 ℃에서 1 시간 동안 프로테이나제 K 50 마이크로그램/㎖로 처리하고, 이어서 상기 단백질을 75 ℃에서 20 분 동안 불활성화시킨다.
2.4-
ELISA
에 의한
폴리사카라이드
생산량의 평가
유형 5 또는 유형 8에 대한 다클론 혈청을 문헌[Karakawa et al., J Clin Microbiol. 1985 Sep; 22(3):445-7]에 개시된 방법에 따라 제조하였다. 사용된 다클론을 문헌[Hochkeppel et al., J Clin Microbiol. 1987 Mar; 25(3):526-30]에 개시된 프로토콜에 의해 제조하였으며 이는 파스퇴르 연구소에 의해 우리에게 제공되었다.
생성된 캡슐 폴리사카라이드의 양을 ELISA에 의해 측정한다. 이를 위해서, 샌드위치 ELISA 분석을 96-웰 플레이트(Nunc, Roskilde, Denmark) 상에서 수행한다. 첫 번째 단계에서, 항-CP5 단클론 항체(0.05M 탄산 나트륨 완충액 중의 1 마이크로그램/㎖, pH = 9.6(Sigma)-100 ng/웰)를 웰에 침착시키고, 상기 플레이트를 4 ℃에서 밤새 배양한다. 이어서 상기 플레이트를 0.05%의 트윈 20(Sigma)(PBS-Tween)이 보충된 PBS 완충액(Eurobio)의 웰 당 300 마이크로리터로 4 회 세척하고 이어서 37 ℃에서 1%(부피/중량)의 BSA(Eurobio)가 보충된 PBS-Tween의 웰 당 250 마이크로리터로 1 시간 동안 포화시킨다(PBS-Tween-BSA). 이어서 상기 플레이트를 PBS-Tween 용액으로 3 회 세척한다.
단계 2.3으로부터의 추출물의 일련의 2 배 희석액을 상기 PBS-Tween-BSA 용액을 사용하여 제조하고, 웰 당 100 마이크로리터의 비율로 가한다. 상기 플레이트를 37 ℃에서 90 분 동안 배양하고 이어서 PBS-Tween으로 4 회 세척한다. 문헌[Karakawa et al., 1985, J. Clin. Microbiol. 1985, Sep; 22(3):445-7]의 프로토콜에 따라 생성된 항-CP5 토끼 다클론 항체를 PBS-Tween-BSA(1/2000)로 희석하고 이어서 상기 웰에 웰 당 100 마이크로리터의 비율로 가하고, 상기 플레이트를 37 ℃에서 90 분 동안 배양한다. 이어서 상기 플레이트를 PBS-Tween으로 4 회 세척한다. PBS-Tween-BSA(1/6000)로 희석된, 항-토끼 염소 IgG 퍼옥시다제 접합물(Southern biotech)을 웰 당 100 마이크로리터의 비율로 가하고 상기 플레이트를 37 ℃에서 1 시간 동안 배양한다. 상기 플레이트를 웰 당 PBS-Tween 300 마이크로리터로 8 회 세척하고 TMB 기질(TEBU) 용액을 웰 당 100 마이크로리터로 가한 다음, 암실에서 주변 온도(대략 22 ℃)에서 15 분 동안 배양시킨다. 상기 효소 반응을 웰 당 100 마이크로리터의 1M H3PO4 1M(Sigma)을 가하여 정지시킨다.
이어서 자동 플레이트 판독기(Versamax)는 450 ㎚에서 광학 밀도를 측정한다. 대조군의 값을 감하고 그 양을 표준 곡선과 비교하여 평가한다.
결과를 하기 표 3에 보고한다.
| CP5 ELISA 분석(X3) | ||||||
| 배양 배지 | 예비배양 | 배양 부피(㎖) | 초기 OD 680 | 최종 OD 680 | 평균(㎍/배양물 ㎖) | 표준 편차 |
| 푸트렐 | 콜럼비아 아가 2% NaCl | 50 | 0.2 | 8.1 | 3.6 | 0.3 |
| 액체 M0 | 아가 M0 | 50 | 0.2 | 8.6 | 9.7 | 1.2 |
| M1 | 아가 M0 | 50 | 0.2 | 5.7 | 36.0 | 1.5 |
2.5-
폴리사카라이드
CP5
의 추출 및 정제
레이놀즈 균주를 아가 배지 M0 상의 예비배양물 및 삼각 플라스크 중의 400 ㎖의 배지 M1 중의 배양물을 포함하는 프로토콜에 따라 포인트 2.1에 개시된 바와 같이 배양한다. 상기 배양물들을 합하여 3 리터의 배양물을 수득하고 상기로부터 생성된 T5 폴리사카라이드를 추출 및 정제한다.
상기 전체 배양물을 페놀-에탄올(최종 농도 2% V/V)로 처리하여 불활성화시키고 이어서 25 000 g에서 30 분간 원심분리한다. 배양물의 리터 당 대략 10.9 g의 습윤 불활성화된 미생물 펠릿을 수득한다.
상기 미생물을 50 mM 트리스, 2 mM MgSO, pH 7.5 0.5 g/㎖의 비율로 현탁시킨다. 5 ㎎/㎖의 리소스타핀 수용액을 100 ㎍/㎖의 최종 농도를 획득하기 위해서 첨가한다. 37 ℃에서 4 시간 동안 자기 교반하면서 배양 후에, 최종 농도 5 U/㎖의 벤조나제 용액을 가하고 37 ℃에서 자기 교반하면서 2 시간 동안 배양을 수행한다.
원심분리(25 000 g, 30 분) 후에, 상기 추출 상등액을 수확하고, 합하고 한외여과한다. 상기 상등액을 사전에 H2O로 1/4로 희석하여 상기 한외여과 시스템에 대해 충분한 부피를 수득한다. 상기 한외여과를 하기의 조건 하에서 2 UF 59 kD 카세트상에서 수행한다: H2O: 10 부피; 이어서 50 mM 트리스, pH 8.0: 3 부피. 체류물의 부피는 상기 한외여과 동안 일정하게 남아있는다. 상기 체류물 구성성분을 CP5 추출물이라 칭한다.
상기 CP5 추출물을 MgCl2(최종 농도 1 mM) 및 벤조나제(최종 농도 5 U/㎖, 즉 ∼40 U/g의 처리된 습윤 미생물)의 존재 하에서 교반하면서 37 ℃에서 배양한다. 3 시간 배양 후에, 상기 벤조나제를 5 U/㎖의 최종 농도로 가하고 3 시간 동안 계속 배양한다. 10 ㎎/㎖의 프로나제 수용액을 가하여, 1 mM의 최종 농도로 CaCl2가 보충된, 4 U/㎖(즉 ∼30 U/g의 처리된 습윤 미생물)의 최종 농도를 획득한다. 이어서 상기 혼합물을 37 ℃에서 15 시간 동안 배양한다. 핵산 및 단백질 단편을 제거하기 위해서, 하기의 조건 하에 2 개의 UF 50 Kd 카세트상에서 50 kD 한외여과를 수행한다: H2O: 10 부피; 이어서 50 mM 트리스, pH 8.0: 3 부피. 체류물의 부피는 상기 한외여과 동안 일정하게 남아있는다. 하기를 상기 수득된 체류물에 가하고 혼합물을 3 시간 동안 자기 교반하면서 배양한다: 최종 농도 1 mM의 MgCl2, 최종 농도 0.1 U/㎖의 벤조나제.
10 ㎎/㎖의 프로나제 수용액을 최종 농도 1 mM로 CaCl2가 보충된, 0.1 U/㎖d의 최종 농도로 가하고, 이어서 상기 혼합물을 37 ℃에서 2 시간 동안 배양한다.
이어서 하기의 조건 하에 2 개의 UF 30 Kd 카세트상에서 한외여과를 수행한다: H2O: 10 부피; 이어서 50 mM 트리스, pH 7.5: 3 부피. 수득된 체류물은 희끄무레한 침전물/혼탁을 나타내며, 이를 8000 g에서 30 분간 원심분리에 의해 제거한다.
이어서 이온 교환 크로마토그래피 상에서 정제 단계를 수행한다.
상기는 잔류 물질, 특히 테이코산(TA) 및 리포테이코산(LTA)을 제거할 수 있다.
하기의 조건들을 사용한다: 3 개의 5 ㎖ Hi Trap Q HP 컬럼을 일렬로 연결하고(Ref: Amersham 17-1154-01); 평형 완충액: 20 mM 트리스, pH 7.5; 유속: 2 ㎖/분; 샘플을 평형 완충액에 주입한다.
용출:
-20 mM 트리스, pH 7.5: 5 컬럼 부피
-20 mM 트리스, pH 7.5, 0-0.5 M NaCl의 구배: 10 컬럼 부피
-20 mM 트리스, 0.5 M NaCl, pH 7.5: 5 컬럼 부피
-20 mM 트리스, pH 7.5, 0.5-1 M NaCl의 구배: 5 컬럼 부피
-20 mM 트리스, 1 M NaCl, pH 7.5: 5 컬럼 부피
-20 mM 트리스, pH 7.5: 5 컬럼 부피
상기 용출을 206 및 280 ㎚에서의 흡광도 측정에 의해 모니터한다. CZE 분석은 상기 크로마토그래피 동안 용출된 다양한 구성성분들을 확인할 수 있게 한다.
상기 CP5 폴리사카라이드를 0.2M 내지 0.3M의 NaCl 농도로 용출시킨다. 사용된 크로마토그래피 조건 하에서, 상기 폴리사카라이드는 잔류 물질, 특히 테이코산(NaCl 0.36M과 0.48 M 사이에서 용출됨) 및 리포테이코산(NaCl 0.74M과 0.86M 사이에서 용출됨)으로부터 명백히 분리된다.
CP5를 함유하는 분획들을 합하고 20 부피(2 내지 3 개 욕)의 0.5 M 수성 NaCl 용액, 및 이어서 20 부피(3 내지 4 개 욕)의 한외여과된 물에 대해 +4 ℃에서 투석한다.
상기 정제된 생성물을 -20 ℃에서 동결 건조 및 보존한다.
배양물 3 리터로부터, 정제의 끝에서 74 ㎎의 T5 캡슐 폴리사카라이드가 수득된다. 생성물의 특징을 하기 표 4에 기록한다.
| CP5 분석 | O-아세틸(분말 중량에 의한 CP) | O-아세틸(CP CE 분석) | 단백질 | DNA | |||
| 분석 방법 | NMR | 비색측정 | 직접 미세 BCA | 피코그린 | |||
| 단위 | 분말의 중량에 대한 상대% | Mmol/㎎ CP | Mol/mol UR | Mmol/㎎ CP | Mol/mol UR | 분말의 중량에 대한 W/W% | 분말의 중량에 대한 W/W% |
| 결과 | 80% | 1.32 | 0.87 | 1.65 | 1.08 | 2.7% | <0.1% |
실시예
3: 다양한 배양 조건 하에서 유형 8 캡슐
폴리사카라이드
(
CP8
) 생산성의 평가
상기 평가를 벡커 및 CYL770 균주 상에서 수행한다.
3.1-
벡커
균주의 배양
동결된 물질을, 동물 기원 화합물 부재 조건 하에서 또는 표준 조건 하에서 실시하는 것을 요구하는지의 여부에 따라 2 가지 상이한 방식으로 제조한다. 표준 조건의 경우, 초기 동결 건조된 물질을 콜럼비아 아가 +2% NaCl상에서 취한다. 후자를 균주에 따라 CO2와 함께 또는 상기 없이 37 ℃에서 18 시간 동안 배양한다. 상기 배양물을 다시 지수 생육기 하의 미생물을 수득하기 위해서 37 ℃에서 4 시간 동안 새로운 아가 디쉬 상에서 2차 배양한다. 이어서 상기 배양물을 트립틱 소이 브로쓰에서 회수하고, 여기에 20%의 글리세롤을 첨가한다. 동물 기원 화합물이 없는 조건이 요구되는 경우, 상기 예비배양을 37 ℃에서 18 시간 동안 배지 M0 상에서 수행하고 이어서 접종물을 사용하여 액체 배지 M0를 2차 배양한다. 동결을 또한 20% 글리세롤의 첨가 후에 수행한다.
상기 트립틱 소이 브로쓰 방법에 의해 수득한 동결된 벡커물질 100 ㎕를 PBS 900 ㎕에 용해시킨다. 3 개의 아가 M0 페트리 디쉬, 2 개의 콜럼비아 아가 2% NaCl 페트리 디쉬 및 하나의 GTS 페트리 디쉬를 디쉬 당 150 ㎕의 세균 현탁액 층으로 시딩한다. 상기 디쉬들을 37 ℃ + 5% CO2에서 18/20 시간 동안 배양한다.
상기 층들을 긁어내고 PBS 5 ㎖에 재현탁한다. 상기 현탁액의 OD680 ㎚를 측정하며, 이는 OD680 ㎚ = 0.2에서 50 ㎖ 삼각 플라스크를 시딩하기 위해 필요한 예비배양물의 부피를 측정할 수 있게 한다.
콜럼비아 아가 2% NaCl 상의 예비배양물을 사용하여 푸트렐 배지를 함유하는 삼각 플라스크를 시딩하고, GTS 상의 예비배양물을 사용하여 TSB를 함유하는 삼각 플라스크를 시딩하고, 아가 배지 M0 상의 예비배양물을 사용하여 액체 배지 M0를 함유하는 삼각 플라스크 및 배지 M1을 함유하는 삼각 플라스크를 시딩한다. 정확한 산소화를 유지시키기 위해서, 배지의 부피는 상기 삼각 플라스크 부피의 20% 이하이다.
초기 OD680 ㎚ 값의 확인 후에, 상기 삼각 플라스크들을 37 ℃에서 진탕시킨다(x 100 rpm).
유사한 실험들을 400 ㎖의 배양 배지를 함유하는 삼각 플라스크에서 수행한다.
3.2-
CYL770
균주의 배양
재조합 CYL770 균주에 대하여, 상기 동결된 물질의 제조 방법은 TSB 배지 또는 액체 배지 M0 상에서의 초기 동결된 물질의 2차 배양을 사용한다. 상기 배양을 37 ℃에서 진탕과 함께 5 시간 동안 수행한다. 상기 동결을 상기 배지에 20%의 글리세롤을 첨가한 후에 수행한다.
상기와 같이 수득한 1 ㎖의 하나의 동결된 CYL770 물질을 10 ㎖의 액체 배지 M0에 용해시키고 이어서 50 ㎖ 삼각 플라스크에 넣고 100 rpm에서 진탕시키면서 37 ℃에서 18/20 시간 동안 배양한다. 두 번째 동결된 CYL770 물질을 TSB 배지 10 ㎖에 용해시키고 이어서 진탕하면서 이전과 동일한 조건 하에 둔다.
상기 액체 예비배양물의 OD680 ㎚를 측정하며, 이는 OD680 ㎚ = 0.2에서 50 ㎖ 삼각 플라스크를 시딩하기 위해 필요한 예비배양물의 부피를 측정할 수 있게 한다.
TSB 중의 예비배양물은 TSB를 함유하는 삼각 플라스크를 시딩할 수 있게 하며, 액체 M0 중의 예비배양물은 배지 M1을 함유하는 삼각 플라스크를 시딩할 수 있게 한다. 정확한 산소화를 유지시키기 위해서, 배지의 부피는 상기 삼각 플라스크 부피의 20% 이하이다.
초기 OD680 ㎚ 값의 확인 후에, 상기 삼각 플라스크들을 37 ℃에서 진탕시킨다(x 100 rpm).
유사한 실험들을 400 ㎖의 배양 배지를 함유하는 삼각 플라스크에서 수행한다.
3.3-배양물의
모니터링
상기 배양물을 t0, t8h, t24h, t32h, t48h, t56h 및 t72h에서 OD680 ㎚를 측정함으로써 모니터한다.
pH를 초기 및 배양 72 시간째에 측정한다. 상기 50 ㎖ 배양물 상에서 수득한 결과를 하기 표 5에 기록한다.
| 벡커 | CYL770 | |||||
| 시간(시간) | 푸트렐 | 액체 M0 | M1 | TSB | TSB | M1 |
| 0 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.2 | 0.2 | 0.2 |
| 8 | 3.3 | 3.2 | 3.6 | 5.7 | 3.3 | 2.3 |
| 24 | 7.4 | 8.0 | 4.9 | 7.1 | 5.6 | 3.4 |
| 32 | 7.8 | 8.6 | 5.9 | 7.4 | 5.9 | 4.0 |
| 48 | 8.3 | 8.6 | 6.3 | 7.5 | 4.7 | 5.8 |
| 56 | 8.1 | 8.5 | 5.3 | 5.7 | 3.9 | 5.1 |
| 72 | 7.0 | 7.5 | 6.6 | 5.8 | 2.9 | 5.4 |
| 초기 pH | 7 | 6.5 | 6.5 | 7 | 7 | 6.5 |
| 최종 pH | 9 | 8.5 | 8.5 | 9 | 9 | 8.5 |
3.4-배양물의 불활성화
배양물들을 상기 포인트 2.2에 개시된 바와 동일한 프로토콜에 따라 불활성화시킨다. 상기 생성된 폴리사카라이드의 추출을 상기 포인트 2.3에 개시된 바와 동일한 프로토콜에 따라 수행한다.
3.5-
ELISA
에 의한
폴리사카라이드
생성량의 평가
상기 생성된 폴리사카라이드 양의 평가를 상기 포인트 2.4에 개시된 바와 동일한 ELISA 분석을 사용하여 수행하나, 단 사용 항체는 항-CP8 항체이며 분석을 펠릿 추출물 및 배양 상등액 상에서 수행한다. 흡착을 1/20 000 배 희석된 단클론 K8-24를 함유하는 복수를 사용하여 수행하였으며, 토끼 다클론 항체는 1/1000 배 희석된 흡착 혈청이다.
상기 50 ㎖ 및 400 ㎖의 배양물에 대해 획득한 결과들을 하기 표 6에 기록한다. 상기 400 ㎖ 배양물에 대하여, 분석을 50 ㎖ 배양물의 단일 샘플 상에서 매번 수행하고 이어서 전체 량을 계산하여 표 6에 기록한다.
| CP8의 ELISA 분석(X2) | ||||||
| 펠릿 | 상등액 | |||||
| 균주 | 배양물 | 예비배양물 | 평균(㎍/배양물 ㎖) | 표준 편차 | 평균(㎍/배양물 ㎖) | 표준 편차 |
| 벡커(50 ㎖) | 푸트렐 | 컬럼비아 아가 2% NaCl | 1.3 | 0 | 1.8 | 0 |
| 액체 M0 | 아가 M0 | 1.9 | na | 3.6 | na | |
| M1 | 아가 M0 | 14.0 | 1.6 | 43.2 | 2.2 | |
| TBS | GTS | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 벡커 (400 ㎖) | M1 | 아가 M0 | 23.04 | 57.6 | ||
| CYL770 (50 ㎖) | M1 | 액체 M0 | 8.7 | 0.5 | 534.2 | 75.2 |
| TSB | TSB | 4.7 | 1.3 | 244 | na | |
| CYL770 (400 ㎖) | M1 | 액체 M0 | 27.18 | na | 579.6 | na |
| TSB | TSB | 3.6 | na | 216 | na | |
na: 적용할 수 없음
3.6-생성된
PS
의 회수 및 정제
T8 폴리사카라이드를 T5 폴리사카라이드의 수득을 위해 실시예 2에 개시한 바와 같은 방법을 사용하여 배지 M1 중의 벡커 균주의 400 ㎖ 삼각 플라스크 배양물로부터 회수하였다.
상기 T8 폴리사카라이드를 또한 배지 M-1 중의 CYL770 균주의 400 ㎖ 삼각 플라스크 배양물 및 TSB 배지 상의 배양물로부터 정제하였다. 이를 위해서, 배양물 800 ㎖을 상술한 방법에 따라 페놀-에탄올로 처리하여 불활성화시키고, 이어서 25 000 gdptj 30 분간 원심분리시킨다. 상등액 720 ㎖을 수득하였다.
상기 상등액 500 ㎖에 4%의 나트륨 아세테이트 최종 농도가 수득되게 하는 양의 나트륨 아세테이트를 가한다. 상기 상등액을 주변 온도에서 30 분간 교반한다. 이어서, 50%의 최종 에탄올 농도가 획득되도록 하는 에탄올의 양을 가한다. 이어서 상기 상등액을 주변 온도에서 30 분간 교반하고, 이어서 +4 ℃에서 밤새 교반 없이 보관한다.
15 000 g에서 30 분간 원심분리 후에, 상등액을 수확한다. 나트륨 아세테이트 및 에탄올을 상기 상등액에 가하여 최종 4%의 나트륨 아세테이트 농도 및 85%의 에탄올 농도를 획득한다. 상기 현탁액을 주변 온도에서 30 분간 교반하고, 이어서 교반 없이 밤새 4 ℃에서 보관한다. 15000 g에서 30 분간 원심분리 후에, 펠릿을 수확한다.
상기와 같이 수득한 펠릿을 한외여과된 물(원심분리된 배양 상등액의 부피에 대해 5 배 농축) 100 ㎖로 용해시킨다. 주변 온도에서 펠릿이 완전히 용해될 때까지 자기 교반 후에, 상기 수득된 현탁액을 2 리터의 한외여과된 물에 투석시키고, 상기 일 동안 조변 온도에서 욕을 3 회 교환하며, 이어서 4 ℃에서 밤새 단계를 수행한다. 이어서 트리스 및 MgCl2를 50 mM의 트리스 및 1 mM의 MgCl2의 최종 농도를 획득하기 위해서 상기 현탁액에 가한다. 상기 용액을 교반하면서 벤조나제(최종 농도 5 U/㎖)의 존재 하에 37 ℃에서 배양한다. 3 시간 배양 후에, 벤조나제를 5 U/㎖의 최종 농도로 가하고 3 시간 동안 계속 배양한다.
10 ㎎/㎖의 프로나제 수용액을, 1 mM의 최종 농도로 CaCl2를 보충시킨, 4 U/㎖의 최종 농도를 획득하기 위해 가한다. 이어서 상기 단계를 37 ℃에서 15 시간 동안 배양한다. 가시적인 탁함/유백색이 나타나면, 8000 g에서 30 분 동안 원심분리를 수행한다.
30 kDa 한외여과를 단백질과 핵산 단편의 제거를 위해 하기의 조건 하에서 수행한다: H2O: 10 부피; 이어서 20 mM 트리스, pH 7.5:3 부피.
상기 한외여과 중에 체류물의 부피를 일정하게 유지시키고 매우 약하게 착색된 등명한 용액을 수득한다.
상기 획득된 체류물이 임의의 탁함/유백색을 나타내면, 후자를 8000 g에서 30 분간 원심분리에 의해 제거한다.
이어서 이온 교환 크로마토그래피 단계를, 상기 잔류 물질, 특히 테이코산(TA) 및 리포테이코산(LTA)의 제거를 완료하기 위해, 하기의 조건 하에서 수행한다: Q 세파로스 HP 젤: 2 ㎖ Hi Trap Q HP 컬럼; 평형 완충액: 20 mM 트리스, pH 7.5; 유속: 2 ㎖/분; 샘플을 평형 완충액에 주입한다. 젤 20 ㎖ 당 배양 상등액 125 ㎖의 당량을 주입한다; 용출:
-20 mM 트리스, pH 7.5: 5 컬럼 부피
-20 mM 트리스, pH 7.5, 0-0.5 M NaCl의 구배: 20 컬럼 부피
-20 mM 트리스, 0.5 M NaCl, pH 7.5: 5 컬럼 부피
-20 mM 트리스, 1 M NaCl, pH 7.5: 5 컬럼 부피
-20 mM 트리스, pH 7.5: 5 컬럼 부피
상기 용출을 206 및 280 ㎚에서의 흡광도 측정에 의해 모니터한다. CZE 분석은 상기 크로마토그래피 동안 용출된 다양한 구성성분들을 확인할 수 있게 한다.
상기 CP8 폴리사카라이드를 0.2M 내지 0.3M의 NaCl 농도로 용출시킨다. 사용된 크로마토그래피 조건 하에서, 상기 폴리사카라이드는 상기 크로마토그래피 단계 후에 잔류 물질(그의 양은 작다), 특히 테이코산(NaCl 0.36M과 0.48 M 사이에서 용출됨) 및 리포테이코산(NaCl 0.74M과 0.86M 사이에서 용출됨)으로부터 명백히 분리된다.
CP8을 함유하는 분획들을 합하고 20 부피(2 내지 3 개 욕)의 0.5 M 수성 NaCl 용액, 및 이어서 20 부피(3 내지 4 개 욕)의 한외여과된 물에 대해 +4 ℃에서 투석한다. 높은 NaCl 농도에서의 단계는 트리스의 유효한 제거를 가능하게 한다.
상기 정제된 생성물을 -20 ℃에서 동결 건조 및 보존한다.
상기와 같이 수득된 결과를 하기 표 7에 기록한다.
| CP8 분석 | O-아세틸(분말 중량에 의한 CP) | O-아세틸(CP CE 분석) | 단백질 | DNA | |||
| 분석 방법 | CZE | 비색측정 | 직접 미세 BCA | 피코그린 | |||
| 단위 | 분말의 중량에 대한 상대% | Mmol/㎎ CP | Mol/mol UR | Mmol/㎎ CP | Mol/mol UR | 분말의 중량에 대한 W/W% | 분말의 중량에 대한 W/W% |
| 벡커(P005) 펠릿 액체 M0/M1 | 71% | 0.93 | 0.61 | 1.31 | 0.86 | 2.2% | nd |
| CYL770(P006) 상등액 M0/M1 | 85% | 1.03 | 0.68 | 1.22 | 0.80 | 0.5% | <0.1% |
| CYL770(P007) 상등액 TSB/TSB | 62% | 1.08 | 0.71 | 1.75 | 1.14 | 3.5% | nd |
nd = 측정 안됨
실시예
4: 30 리터 발효기에서
스타필로코커스
아우레우스
레이놀즈 유형 5 균주
4.1-
BTS
배지 +
NaCl
상에서의 배양
포인트 2.1의 첫 번째 방법에 의해 제조된 동결된 레이놀즈 균주를 각각 NaCl(55 g/ℓ)이 보충된 200 ㎖의 트립틱 소이 브로쓰를 함유하는 2 개의 2 ℓ 배플 달린 삼각 플라스크(E1 및 E2)에 0.5 부피%의 비율로 접종한다. 상기 삼각 플라스크를 37 ℃에서 175 rpm으로 진탕시키면서 5±1 시간(E1) 또는 48 시간(E2) 동안 배양한다.
20 리터의 동일 배지를 함유하는 30 리터의 브라운 발효기를 ∼1.38 x 1011 CFU(∼5 시간의 배양물 및 4에 가까운 삼각 플라스크에서의 최종 OD600 ㎚)에서 평가된 예비 배양물(E1) 70 ㎖로 접종한다. 상기 배양을 하기의 조건 하에서 수행한다: 온도: 37 ℃; 배양 기간: 48±2 시간; 25% NH4OH 및 10% H3PO4로 6.50에서 조절된 pH; 30% PO2(단계적으로 조절; 20 내지 80% 교반, 20(1 vvm) 내지 60%(3 vvm)의 공기, 0 내지 100%의 산소 농축); 압력: 100 mbar; 1/50 스트럭톨(strukol)에 의한 소포 조절.
상기 배양물을 첫 번째 시간 동안 규칙적인 샘플을 취하여 모니터하고, 또한 600 ㎚에서 OD를 확인하기 위해서 20±2 시간의 배양, 24±2 시간의 배양, 및 42±2 시간의 배양으로 모니터하며; 건조 중량을 측정하고; 생육성을 측정하고; 형태를 관찰하고; 글루코스를 분석하고; 아세테이트를 분석하고; 폴리사카라이드 생산성을 4±2 시간, 18±2 시간, 24±3 시간, 44±3 시간 및 48±2 시간의 배양 후에 OD=50의 6 개 펠릿 상에서 ELISA 분석에 의해 측정한다.
상기 세포를 1 ℓ 원심분리 버킷(12 버킷/20 ℓ의 배양물)에서 48±2 시간 후에 수확하고 7000 g에서 4 ℃에서 20 분 동안 원심분리한다. 상등액의 제거 후에 습윤 중량을 측정한다. 상기 펠릿을 페놀/에탄올에 의한 미생물 불활성화, 및 이어서 실시예 2의 방법에 따른 T5 폴리사카라이드의 회수 및 정제로 이루어진 단계까지 ≤-20 ℃에서 보존한다. 상기 두 번째 삼각 플라스크(E2)를 10 시간, 24 시간 및 48 시간의 배양 시에 CP5 캡슐의 생산성을 추적하기 위해서 48 시간에 걸쳐 모니터한다.
4.2-
푸트렐
배지상에서의
배양
포인트 2.1에 개시된 첫 번째 방법에 따라 제조된 스타필로코커스 아우레우스 레이놀즈 유형 5 균주의 동결된 물질을 각각 200 ㎖의 푸트렐 배지를 함유하는 2 개의 2 ℓ 배플 달린 삼각 플라스크(E1 및 E2)에 1 부피%의 비율로 접종한다. 상기 삼각 플라스크를 37 ℃에서 175 rpm에서 16±2 시간) 동안 배양한다. 상기 예비배양물을 모으고 이를 발효기 접종에 사용한다. 20 리터의 푸트렐 배지를 함유하는 30 리터의 비. 브라운 발효기에서의 배양을 하기의 조건 하에서 수행한다: 온도: 37 ℃; 배양 기간: 48±2 시간; 25% NH4OH 및 10% H3PO4로 6.50에서 조절된 pH; 30% PO2(단계적으로 조절; 20 내지 80% 교반, 20(1 vvm) 내지 60%(3 vvm)의 공기, 0 내지 100%의 산소 농축); 압력: 100 mbar; 1/50 스트럭톨(strukol)에 의한 소포 조절.
상기 배양물을 첫 번째 시간 동안 모니터하고, 또한 600 ㎚에서 OD를 확인하기 위해서 20±2 시간의 배양 및 30±2 시간의 배양 모니터하며; 건조 중량을 측정하고; 생육성을 측정하고; 형태를 관찰하고; 글루코스를 분석하고; 아세테이트를 분석하고; 유리 아미노산을 분석하고 폴리사카라이드 생산성을 ELISA 분석에 의해 측정한다.
상기 세포를 48±2 시간 배양 후에 수확한다.
2 ℓ의 수확물을 2 ℓ 쇼트 플라스크에서 수확하고 페놀/에탄올(v/v)로 2%(V/V)의 최종 농도로 처리한다. 상기 혼합물을 22±3℃에서 6±1 시간으로 교반한다. 상등액을 상기 배양물의 나머지로부터 제거한 후에, 세균 펠릿을 최소 부피의 PBS 완충액으로 용해시키고 이어서 상기 실시예 2에 개시된 방법에 따라 폴리사카라이드를 불활성화하고 회수하기 위해서 오토클레이빙시킨다.
상기 배양물의 나머지를 1 ℓ 원심분리 버킷(12 버킷/배양물 18 ℓ)에서 수확하고 7000 g에서 4 ℃에서 20 분 동안 원심분리시킨다. 습윤 중량을 상등액의 제거 후에 측정한다. 2 리터의 상등액을 0.45 ㎛ 여과 및 121 ℃에서 55 분의 오토클레이빙 후에 ≤-20 ℃에서 보존한다.
상기 12 펠릿을 울트라튜랙스를 사용하여 최소 부피의 PBS 완충액(대략 650 ㎖)에 재현탁시킨다. 상기 현탁액을 모으고, 균질화하고 3 개의 500 ㎖ 쇼트 플라스크(대략 300 ㎖/쇼트 플라스크)에 균등하게 분배한 후에 121 ℃에서 55 분 동안 오토클레이빙한다. 이어서 상기 오토클레이빙된 현탁액을 모으고 폴리사카라이드를 상기 실시예 2에 개시된 프로토콜에 따라 회수한다.
4.3-
콜럼비아
배지 +
NaCl
상에서의 배양
포인트 2.1에 개시된 첫 번째 방법에 따라 제조된 동결된 스타필로코커스 아우레우스 레이놀즈 유형 5 물질을 각각 200 ㎖의 콜럼비아 매질 + 20 g/ ℓ의 NaCl(Difco ref. 2944201)을 함유하는 2 개의 2 ℓ 배플 달린 삼각 플라스크에 1 부피%의 비율로 접종한다. 상기 삼각 플라스크를 37 ℃에서 175 rpm에서 진탕시키면서 24±2 시간 동안 배양한다. 24±2 시간 후에, 상기 예비배양물을 모으고 이를 발효기 접종에 사용한다. 20 리터의 동일한 배지를 함유하는 30 리터의 비. 브라운 발효기에서의 배양을 하기의 조건 하에서 수행한다: 온도: 37 ℃; 배양 기간: 24±2 시간; 25% NH4OH 및 10% H3PO4로 7.00에서 조절된 pH; 30% PO2(단계적으로 조절; 20 내지 80% 교반, 20(1 vvm) 내지 60%(3 vvm)의 공기, 0 내지 100%의 산소 농축); 압력: 100 mbar; 1/50 스트럭톨(strukol)에 의한 소포 조절.
상기 배양물을 600 ㎚에서 OD를 확인하기 위해서 규칙적인 샘플을 취하여 규칙적으로 모니터하고; 건조 중량을 측정하고; 생육성을 측정하고; 형태를 관찰하고; 글루코스를 분석하고; 아세테이트를 분석하고; 폴리사카라이드 생산성을 ELISA 분석에 의해 측정한다.
상기 세포를 24±2 시간 배양 후에 수확한다. 최종 배양물을 1 ℓ 원심분리 버킷(12 버킷/배양물 20 ℓ)으로 옮기고 7000 g에서 4 ℃에서 20 분 동안 원심분리시킨다. 습윤 중량을 상등액의 제거 후에 측정한다. 원심분리 후에, 상기 12 펠릿을 울트라튜랙스를 사용하여 1 내지 1.2 ℓ의 최소 부피의 PBS 완충액에 재현탁시킨다. 상기 현탁액을 모으고, 균질화하고 500 ㎖ 쇼트 플라스크에 균등하게 분배하고 이어서 121 ℃에서 55 분 동안 오토클레이빙한다. 이어서 상기 오토클레이빙된 현탁액을 모으고 폴리사카라이드를 상기 실시예 2에 개시된 프로토콜에 따라 회수한다.
4.4-배지
M1
상에서의 배양
상기 포인트 2.1에 개시된 첫 번째 방법에 따라 제조된 동결된 스타필로코커스 아우레우스 레이놀즈 유형 5 물질을 150 ㎕/디쉬의 비율로 아가 배지 M0의 대략 10 개의 디쉬를 접종하기 위해서 완충액 9 ㎖ 당 동결된 물질 1 ㎖의 비율로 1C PBS 완충액에 용해시킨다.
상기 디쉬를 37 ℃에서 15 내지 18 시간 동안 배양한다. 37 ℃에서 15 내지 18 시간 동안 배양 후에, 형성된 층들을 긁어내고 그 후에 각각의 삼각 플라스크에 0.2에 가까운 초기 OD600 ㎚를 갖도록 동일한 조성의 2 개의 삼각 플라스크(200 ㎖/2 ℓ - E1 및 E2)를 접종하기 위해서 배지 M1에 재현탁시킨다. 상기 삼각 플라스크를 175 rpm에서 대략 5 시간(지수기에서 배양, E1) 또는 72 시간(E2) 동안 진탕시키면서 37 ℃에서 배양한다.
E1 배양물(3에 가까운 OD600 ㎚)의 일부를 사용하여 0.02에 가까운 초기 OD600 ㎚를 갖도록 20 ℓ의 배지 M1을 함유하는 30 ℓ 비. 브라운 발효기를 접종한다. 상기 배양을 하기의 조건 하에서 수행한다: 온도: 37 ℃; 배양 기간: 72±4 시간; 25% NH4OH 및 10% H3PO4로 6.50에서 조절된 pH; 30% PO2(단계적으로 조절; 20 내지 80% 교반, 20(1 vvm) 내지 60%(3 vvm)의 공기, 0 내지 100%의 산소 농축); 압력: 100 mbar; 1/50 스트럭톨(strukol)에 의한 소포 조절.
이어서 1 ℓ의 배양물을 원심분리 버킷에서 수확하고 상등액의 제거 후에 습윤 중량을 측정하기 위해서 7000 g에서 4 ℃에서 20 분간 원심분리한다. 펠릿을 ≤-20 ℃에서 보존한다.
상기 배양물의 나머지를 50 ℓ 날젠에서 수확하고 페놀/에탄올(최종 농도 2% V/V)로 불활성화시키고 폴리사카라이드를 상기 실시예 2에 개시된 프로토콜에 따라 회수한다.
획득된 모든 결과들을 하기 표 8에 기록한다.
| 배지 | 콜럼비아+NaCl | 푸트렐 | BTS+NaCl | M1 |
| 최종 OD | 21 | 16 | 17 | 16 |
| [CP5] 추출 리소스태핀 | nd | 6.6 ㎎/ℓ | nd | 130 ㎎/ℓ |
| [CP5] 추출 오토클레이브 | 0.2 ㎎/ℓ | 3.7 ㎎/ℓ | 3.5 ㎎/ℓ | 40 ㎎/ℓ |
| 비 수율(㎍/OD) | 0.01 | 0.23 | 0.21 | 2.5 |
Claims (29)
- (a) 배양 배지의 리터 당·5 내지 100 g의 식물 펩톤,·0.5 내지 20 g의 효모 추출물,·1 내지 30 g의 당,·1 내지 200 ㎎의, FeCl3 및 FeSO4로 이루어진 그룹 중에서 선택된 철 염,·1 내지 700 ㎎의, MgCl2 및 MgSO4로 이루어진 그룹 중에서 선택된 마그네슘 염,·0.1 내지 500 ㎎의 CaCl2,·0 내지 50 ㎎의 ZnCl2·10 내지 250 g의 NaCl, 바람직하게는 58.5 g/ℓ를 포함하고 pH가 6.2 내지 7.5 값의 범위 내에 있는 배양 배지 M1 상에서 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 균주를 배양하고,(b) 임의로 상기와 같이 생산된 균주를 상기 배양 배지로부터 회수함을 포함하는, 과잉생산성 스타필로코커스 아우레우스 균주의 제조 방법.
- 제 1 항에 있어서,상기 단계 (a)의 배양 배지 M1이 밀 펩톤을 포함하는 과잉생산성 균주의 제 조 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,상기 배양 배지 M1이 배양 배지의 리터 당·30 g의 밀 펩톤,·5 g의 효모 추출물,·1 g의 D-글루코스 H2O,·120 ㎎의 FeCl3 ·6H2O,·400 ㎎의 MgCl2·6H2O,·10 ㎎의 CaCl2·2H2O,·58.5 g의 NaCl,·5 ㎎의 ZnCl2,·6.8 g의 (NH4)2SO4,·6 g의 NH4Cl 및 pH = 6.5를 포함하는 과잉생산성 균주의 제조 방법.
- 제 4 항에 있어서,상기 배지 M1이 리터 당 30 g의 밀 펩톤, 5 g의 효모 추출물, 1 g의 D-글루 코스 H2O, 120 ㎎의 FeCl3 ·6H2O, 400 ㎎의 MgCl2·6H2O, 10 ㎎의 CaCl2·2H2O, 58.5 g의 NaCl, 5 ㎎의 ZnCl2, 6.8 g의 (NH4)2SO4, 6 g의 NH4Cl 및 pH = 6.5로 이루어진 제조 방법.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,·3 내지 50 g의 식물 펩톤,·0.5 내지 20 g의 효모 추출물,·1 내지 30 g의 당,·1 내지 200 ㎎의, FeCl3 및 FeSO4로 이루어진 그룹 중에서 선택된 철 염,·1 내지 700 ㎎의, MgCl2 및 MgSO4로 이루어진 그룹 중에서 선택된 마그네슘 염,·0.1 내지 50 ㎎의 CaCl2,·0 내지 50 ㎎의 ZnCl2·2 내지 50 g의 NaCl, 바람직하게는 6 g/ℓ를 포함하고 pH가 6.2 내지 7.5 값의 범위 내에 있는 배양 배지 M0 상에서 예비 배양하는 단계를 포함하는 과잉생산성 균주의 제조 방법.
- 제 5 항에 있어서,상기 예비배양 단계의 배지 M0이 3.87 g 또는 30 g의 밀 펩톤을 포함하는 제조 방법.
- 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서,상기 예비배양 단계의 배지 M0이·3.87 g 또는 30 g의 밀 펩톤 및·5 g의 효모 추출물,·1 g의 D-글루코스 H2O,·120 ㎎의 FeCl3 ·6H2O,·400 ㎎의 MgCl2·6H2O,·10 ㎎의 CaCl2·2H2O,·6 g의 NaCl,·5 ㎎의 ZnCl2,·6.8 g의 (NH4)2SO4,·6 g의 NH4Cl 및 pH = 6.5를 포함하는 제조 방법.
- (a) 배양 배지의 리터 당·52.5 내지 100 g의 식물 펩톤, 유리하게는 밀 펩톤,·0 내지 82.5 g의 NaCl, 유리하게는 5 내지 82.5 g, 특히 41 g/ℓ의 NaCl,·0 내지 15 g/ℓ의, MgSO4 및 MgCl2로 이루어진 그룹 중에서 선택된 마그네슘염, 유리하게는 0.01 내지 15 g/ℓ, 특히 15 g/ℓ의 MgCl2·6H2O, 및·0 내지 7 g/ℓ의 당, 유리하게는 0.25 내지 7 g/ℓ, 특히 0.25 g/ℓ의 D-글루코스·H2O를 포함하고 pH가 6.3 내지 6.7 값의 범위 내에 있는배양 배지 M2 상에서 스타필로코커스 아우레우스 균주를 배양하고,(b) 임의로, 상기와 같이 생산된 균주를 상기 배양 배지로부터 회수함을 포함하는 과잉생산성 스타필로코커스 아우레우스 균주의 제조 방법.
- 제 8 항에 있어서,상기 배양 배지 M2가 93 g/ℓ의 밀 펩톤, 4 g/ℓ의 NaCl, 0.25 g/ℓ의 D-글루코스·H2O 및 15 g/ℓ의 MgCl2·6H2O를 포함하고, 바람직하게는 상기로 이루어지고, 그의 pH가 6.3 내지 6.7 값의 범위 내에 있는 과잉생산성 균주의 제조 방법.
- ·65 내지 85 g, 유리하게는 75 g의 효모 추출물,·0 내지 82.5 g의 NaCl, 유리하게는 5 내지 82.5 g, 특히 41 g/ℓ의 NaCl,·0 내지 15 g/ℓ의, MgSO4 및 MgCl2로 이루어진 그룹 중에서 선택된 마그네슘염, 유리하게는 0.01 내지 15 g/ℓ, 특히 15 g/ℓ의 MgCl2·6H2O, 및·0 내지 7 g/ℓ의 당, 유리하게는 0.25 내지 7 g/ℓ, 특히 0.25 g/ℓ의 D-글루코스·H2O를 포함하고 pH가 6.3 내지 6.7 값의 범위 내에 있는 배양 배지 M3 상에서 스타필로코커스 아우레우스 균주를 배양하고,(b) 임의로, 상기와 같이 생산된 균주를 상기 배양 배지로부터 회수함을 포함하는 과잉생산성 스타필로코커스 아우레우스 균주의 제조 방법.
- 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 청구된 바와 같은 과잉생산성 스타필로코커스 아우레우스 균주 T5의 제조 방법.
- 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 청구된 바와 같은 과잉생산성 스타필로코커스 아우레우스 균주 T8의 제조 방법.
- (a) 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 정의한 바와 같은 배양 배지 M1 또는 제 8 항 또는 제 9 항에 정의한 바와 같은 배양 배지 M2 또는 제 10 항에 정의한 바와 같은 배양 배지 M3 상에서 스타필로코커스 아우레우스 균주를 배양하고,(b) 상기와 같이 생성된 배양물을 불활성화시키고,(c) 캡슐 폴리사카라이드를 회수함을 포함하는, 캡슐 폴리사카라이드의 제조 방법.
- 배양 단계의 배지 M1이 밀 펩톤을 포함하는 캡슐 폴리사카라이드의 제조 방법.
- 제 13 항 또는 제 14 항에 있어서,상기 배양 단계의 배지 M1이 배양 배지의 리터 당 30 g의 밀 펩톤, 5 g의 효모 추출물, 1 g의 D-글루코스 H2O, 120 ㎎의 FeCl3 ·6H2O, 400 ㎎의 MgCl2·6H2O, 10 ㎎의 CaCl2·2H2O, 58.5 g의 NaCl, 5 ㎎의 ZnCl2, 6.8 g의 (NH4)2SO4, 6 g의 NH4Cl 및 pH = 6.5를 포함하는 캡슐 폴리사카라이드의 제조 방법.
- 제 15 항에 있어서,상기 배양 배지 M1이 배양 배지의 리터 당 30 g의 밀 펩톤, 5 g의 효모 추출물, 1 g의 D-글루코스 H2O, 120 ㎎의 FeCl3 ·6H2O, 400 ㎎의 MgCl2·6H2O, 10 ㎎의 CaCl2·2H2O, 58.5 g의 NaCl, 5 ㎎의 ZnCl2, 6.8 g의 (NH4)2SO4, 6 g의 NH4Cl 및 pH = 6.5로 이루어진 캡슐 폴리사카라이드의 제조 방법.
- 제 13 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 정의한 바와 같은 예비배양 단계를 포함하는 캡슐 폴리사카라이드의 제조 방법.
- 제 13 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 정의한 바와 같은 방법에 의해 수득한 과잉생산성 스타필로코커스 아우레우스 균주.
- 제 18 항에 정의한 바와 같은 과잉생산성 레이놀즈(Reynolds) 균주.
- 제 18 항에 정의한 바와 같은 과잉생산성 벡커(Becker) 균주.
- 제 18 항에 정의한 바와 같은 과잉생산성 CYL770 균주.
- 제 18 항에 정의한 바와 같은 과잉생산성 CYL1892 균주.
- ·3 내지 50 g의 식물 펩톤,·0.5 내지 20 g의 효모 추출물,·1 내지 30 g의 당,·1 내지 200 ㎎의, FeCl3 및 FeSO4로 이루어진 그룹 중에서 선택된 철 염,·1 내지 700 ㎎의, MgCl2 및 MgSO4로 이루어진 그룹 중에서 선택된 마그네 슘 염,·0.1 내지 50 ㎎의 CaCl2,·0 내지 50 ㎎의 ZnCl2·2 내지 50 g의 NaCl, 바람직하게는 6 g/ℓ를 포함하고 pH가 6.2 내지 7.5 값의 범위 내에 있는 스타필로코커스 아우레우스의 배양에 적합한 배지 M0.
- 제 23 항에 있어서,(a) 3.87 g 또는 30 g의 밀 펩톤 및(b) 5 g의 효모 추출물,(c) 1 g의 D-글루코스 H2O,(d) 120 ㎎의 FeCl3 ·6H2O,(e) 400 ㎎의 MgCl2·6H2O,(f) 10 ㎎의 CaCl2·2H2O,(g) 6 g의 NaCl,(h) 5 ㎎의 ZnCl2,(i) 6.8 g의 (NH4)2SO4,(j) 6 g의 NH4Cl 및 pH = 6.5를 포함하는 배지 M0.
- ·5 내지 100 g의 식물 펩톤,·0.5 내지 20 g의 효모 추출물,·1 내지 30 g의 당,·1 내지 200 ㎎의, FeCl3 및 FeSO4로 이루어진 그룹 중에서 선택된 철 염,·1 내지 700 ㎎의, MgCl2 및 MgSO4로 이루어진 그룹 중에서 선택된 마그네슘 염,·0.1 내지 500 ㎎의 CaCl2,·0 내지 50 ㎎의 ZnCl2·10 내지 250 g의 NaCl, 바람직하게는 58.5 g/ℓ를 포함하고 pH가 6.2 내지 7.5 값의 범위 내에 있는, 캡슐 폴리사카라이드의 과잉생산에 적합한 배양 배지 M1.
- 제 25 항에 있어서,·30 g의 밀 펩톤,·5 g의 효모 추출물,·1 g의 D-글루코스 H2O,·120 ㎎의 FeCl3 ·6H2O,·400 ㎎의 MgCl2·6H2O,·10 ㎎의 CaCl2·2H2O,·58.5 g의 NaCl,·5 ㎎의 ZnCl2,·6.8 g의 (NH4)2SO4,·6 g의 NH4Cl 및 pH = 6.5를 포함하는 배양 배지 M1.
- 배양 배지의 리터 당·52.5 내지 100 g의 식물 펩톤, 유리하게는 밀 펩톤,·0 내지 82.5 g의 NaCl, 유리하게는 5 내지 82.5 g, 특히 41 g/ℓ의 NaCl,·0 내지 15 g/ℓ의 마그네슘염, 유리하게는 0.01 내지 15 g/ℓ, 특히 15 g/ℓ의 MgCl2·6H2O, 및·0 내지 7 g/ℓ의 당, 유리하게는 0.25 내지 7 g/ℓ, 특히 0.25 g/ℓ의 D-글루코스 H2O를 포함하고 pH가 6.3 내지 6.7 값의 범위 내에 있는캡슐 폴리사카라이드의 과잉생산에 적합한 배지 M2.
- 제 27 항에 있어서,배양 배지의 리터 당 93 g/ℓ의 밀 펩톤, 41 g/ℓ의 NaCl, 0.25 g/ℓ의 D-글루코스 H2O 및 15 g/ℓ의 MgCl2·6H2O를 포함하고, 그의 pH가 6.3 내지 6.7 값의 범위 내에 있는 배양 배지 M2.
- 배양 배지의 리터 당·65 내지 85 g의 효모 추출물, 유리하게는 75 g의 효모 추출물,·0 내지 82.5 g의 NaCl, 유리하게는 5 내지 82.5 g, 특히 41 g/ℓ의 NaCl,·0 내지 15 g/ℓ의 마그네슘 염, 유리하게는 0.01 내지 15 g/ℓ, 특히 15 g/ℓ의 MgCl2·6H2O, 및·0 내지 7 g/ℓ의 당, 유리하게는 0.25 내지 7 g/ℓ, 특히 0.25 g/ℓ의 D-글루코스 H2O를 포함하고 pH가 6.3 내지 6.7 값의 범위 내에 있는, 캡슐 폴리사카라이드의 과잉생산에 적합한 배양 배지 M3.
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