KR100397319B1 - 트레할로오스를 생성하는 미생물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 말토오스로부터 트레할로오스를 생성하는 신규한 슈도모나스 슈트트제리(Pseudomonas stutzeri) CJ38 균주에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 말토오스 용액을 본 발명의 신규한 슈도모나스 슈트트제리 CJ38 균주의 파쇄액과 혼합하여 트레할로오스를 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

트레할로오스를 생성하는 미생물{A microorganism capable of producing trehalose}

트레할로오스는 미생물, 곰팡이, 효모, 식물, 곤충, 동물 등의 여러 생물체에 광범위하게 존재하는 천연물로서 강한 보습성과 화학적 안정성 때문에 생약제재, 의약품, 식품 등의 첨가제로 주목받고 있으나 트레할로오스의 생산 가격 이높아 경제성이 없으므로 의약, 식품등의 첨가제로 사용하기는 아직 이른 한편, 트레할로오스 생산 공정에서 가장 중요시되는 점은 트레할로오스 생성 효소를 함유하고 있는 균주를 확보하는 것이며, 이러한 관점에서, 본 발명의 목적은 트레할로오스를 생산하는 신규한 미생물을 개발하는데 있다. 또한, 본 발명의 목적은 그러한 미생물을 이용하여 경제적으로 유리한 트레할로오스를 생산하는 개선된 방법을 개발하는데 있다.

트레할로오스 (α-D-글루코피라노실-α-D-글루코피라노사이드)는 글루코오스 2개 분자가 α-1, 1 결합을 형성한 비 환원성 당으로서 세균, 효모, 곰팡이, 버섯, 곤충 등 자연계에 광범위하게 존재하는 천연물이다. 트레할로오스는 생체내에서 저장 에너지원(Elbein 등: Adv. Carbohvdr. Chem. Biochem., 1974, 30, 227-256), 세포막의 구성 성분(Winder 등: Biochem. Biophys. Acta, 1964, 90, 442-444), 내 삼투성 물질로서의 기능을 갖는다. 트레할로오스의 생체내 기능 중 내 삼투성이 그의 이용 가치 때문에 많은 관심이 모아지고 있다. 효모와 대장균등에서 세포외 염류가 축적되어 삼투압이 증가되며 수분이 고갈되는 상태에 트레할로오스 합성이 유도되어 세포가 고 염류의 농도에 저항성을 갖도록한다 (Giaever 등: J. Bac., 1988,170, 2841-2849, Lillie 등: J. Bac., 1980, 143. 1384-1394). 특히 사막에 사는 식물인 Seaginella Iepidophylla는 일년 내내 사막의 건조한 기후를 버티고 우기에 소량 내리는 비에 다시 소생하는 것으로 알려져있다. Seaginella Iepidophylla가 사막의 건조한 기후에 말라죽지 않고 견딜 수 있는 능력은 이 식물에 많이 함유되어 있는 트레할로오스 때문으로 트레할로오스는 세포막의 외부를 둘러싸서 세포의 탈수를 방지하여 세포가 말라죽지 않게 한다. 트레할로오스의 강한 보습 효과와 안정성, 즉 트레할로오스는 비 환원성 당이므로 아미노산이나 단백질 등과 같은 아미노기를 가진 물질과 아미노-카보닐 반응을 일으키지 않으므로 아미노산을 함유한 물질을 손상시키지 않기때문에 트레할로오스가 생약제재나 식품, 의약품의 안정성을 높이는 첨가제로 주목받고 있다. 트레할로오스는 단일 항체 제재 등에 첨가하여 건조시켰을 때, 단일 항체의 안정성을 증가시키며, 이외에도 항체나 효소, 적혈구, 탄수화물 등의 안정성을 크게 높이며, 또한 트레할로오스는 식품에 첨가하면 건조시 방향 성분의 잔류량이 증가하므로 트레할로오스를 사용하면, 커피등 여러 건조 식품의 품질을 향상시킬 수 있다. 그러나 아직 트레할로오스는 첨가제로 사용하기는 아직 이르다. 트레할로오스가 안정제로 작용하려면 10 - 30% 가량 함유되어야 하는데, 아직까지 트레할로오스의 가격이 높아 경제성이 없으므로 트레할로오스의 생산비를 낮추기 위한 방법이 요망되고 있다. 종래의 트레할로오스 생산 방법은 효모를 이용하는 방법(1, Yoshikwa 등: Biosci. Biotech. Biochem., 1994, 58, 1226-1230)과 트레할로오스-6-포스페이트 포스파타제 (trehalose-6-phosphate phosphatase)와 트레할로오스-6-포스페이트 포스포릴라제 (trehalose-6-phosphatephosphorylase) (2, Killick 등: Arch, Biochem. Biopys., 1979, 196, 121-133)를 사용하는 방법, 말토올리고실 트레할로오스 신타제(maltooligosyl trehalose synthase (MTSase))와 말토올리고실 트레할로오스 트레할로하드롤라제 (maltooligosyl trehalose trehalohydrolase (MTHase))를 사용하는 방법(3, Nishimoto등, 1995, Biosci. Biotech. Biochem.,59, 2189 - 2190), 트레할로오스 신타제에의해 말토오스로부터 직접 한 단계의 효소 반응에 의해 트레할로오스를 합성하는 방법(4, Biosci. Biotech. Biochem., 1995, 59, 2189-2190)등이 알려져 있다. (1)의 방법은 효모 균체내에 트레할로오스의 함유량이 낮으며, 이를 추출, 정제하는 공정이 복잡하여, 생산 방법으로 적절치 못하며, (2)의 방법은 효소 기질로 사용되는 UDP-글루코오스와 UDP-글루코오스-6-포스페이트이 값이 비싸며, 효소 반응이 가역적이므로 대량 생산에 적합하지 못하다. (3)과 (4)의 방법이 대량 생산을 위한 생산법으로 모색되고 있는데, 이러한 생산 공정에서 가장 중요시되는 점은 균주의 확보이며, 이렇게 확보된 균주는 그 자체로 생산용 균주로 사용될 수 있으며, 유전공학적 방법에 의한 생산성 향상을 위한 유전자원으로도 활용될 수 있다.

본 발명자들은 말토오스로부터 간단한 생합성 경로를 통해 트레할로오스를 대량생산하는데 이용될 수 있는 적합한 미생물을 분리하고, 이 균주를 이용하여 의약품이나 식품등의 첨가제로 이용할 수 있을 정도의 경제적으로 트레할로오스를 대량생산하는 방법을 개발하는데 많은 노력을 기울여 왔다.

도 1은 말토오스 용액에 본 발명에 따른 미생물 슈도모나스 슈트트제리 CJ38의 세포 파쇄액을 첨가하여 반응시킨 뒤 반응액의 당들을 얇은박 크로마토그래피(TLC)로 분석한 결과의 사진이다. G, M 및 T는 각각 글루코오스, 말토오스 및 트레할로오스를 나타낸다.

도 2는 말토오스 용액에 본 발명에 따른 미생물의 세포 파쇄액을 첨가하여 반응시킨 뒤 반응액 시료 (가) 및 표준 트레할로오스 시료 (나)의 당을 기체 크로마토그래피 (GC)로 분석한 결과의 그래프이다. Tre는 트레할로오스를 나타낸다.

도 3은 표준 트레할로오스 시료 (가), 말토오스 용액에 본 발명에 따른 미생물의 세포 파쇄액을 첨가하여 반응종료 직후의 시료 (나), 및 말토오스 용액에 본 발명에 따른 미생물의 세포 파쇄액을 첨가하여 반응종료 후의 반응액에 트레할레이즈를 첨가한 시료(다)의 당을 액체 고속 크로마토그래피 (HPLC)로 분석한 결과의 그래프이다. Tre, Mal 및 Glu는 트레할로오스, 말토오스 및 글루코오스를 나타낸다.

도 4는 본 발명에 따른 미생물의 20,000배 전자현미경 관찰 사진이다.

본 발명은 말토오스를 트레할로오스로 전환시키는 능력이 있는 신규한 미생물에 관한 것이다.

본 발명자들은 트레할로오스 생합성 효소(trehalose synthase)에 의해 말토오스로부터 트레할로오스를 생산하는 미생물을 토양에서 분리 동정하였으며, 이의 미생물은 형태학적 및 생리학적 특성상 슈도모나스 슈트트제리종으로 밝혀졌으며, 이는 아직 어느 곳에서도 말토오스를 트레할로오스로 전환시킬 수 있는 능력이 있는 미생물로 보고된 바 없다. 본 발명자들은 이 미생물을 슈도모나스 슈트트제리 CJ38로 명명하고, 1997년 9월 22일자로 한국 종균협회에 기탁하고 수탁번호 KFCC-10985를 부여받았다.

지금까지 보고된 미생물은 말토오스를 트레할로오스로 전환 시키는 과정 중에 부생성물로서 글루코오스를 생성하는 반면에 본 발명에서 분리된 미생물은 트레할로오스 이외의 다른 부생성물을 생산하지 않는다는 장점을 갖는다.

이런 관점에서, 본 발명은 상기한 본 발명의 미생물 슈도모나스 슈트트제리 CJ38의 세포 파쇄액을 말토오스용액과 혼합하여 트레할로오스를 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 미생물을 분리 및 동정한 과정을 이하 실시예를 통해 상세히 기술한다.

[실시예 1]

미생물 스크리닝

토양에서 분리한 미생물 한 백금이를 LB 배양액 (이스트 익스트랙트: 0.5%,박토 트립톤: 1.0%, 소금: 0.5%)이 50ml 들어 있는 500ml 삼각 플라스크에 접종하여 28℃에서 2일간 배양하였다. 4℃, 8000 rpm에서 5 분간 원심 분리하여 균체를 회수한 다음 생리 식염수로 세척하고 10 ml의 인산 완충 용액 (10 mM, pH 7.0)에 현탁하였다. 초음파 파쇄기를 사용하여 균체를 파쇄한 다음 원심분리 (1200 rpm, 4℃,20분)하여 균체 파쇄물을 침전시킨 다음 상등액을 조효소액으로 사용하였다. 조효소액의 단백질 농도는 브레드포드법에 의하여 결정하였다. 단백질 100 ㎍, 100 mM 말토오스 20㎕ 및 100 mM 인산완충 용액 (pH 7.0) 10 ㎕를 잘 섞은 다음 최종 부피가 100 ㎕가 되도록 증류수를 가한후 30℃에서 20시간 반응시켰다. 반응액 중에 존재하는 당을 TLC, HPLC 및 GC 로 분석하였다.

[실시예 2]

TLC에 의한 트레할로오스 분석

반응이 끝난 반응 혼합액 5㎕를 Kieselgel 60 TLC판 (머크사, 독일)에 점적한 다음 n-부탄올-피리딘-물 (7:3:1)의 용매가 들어 있는 용기에 넣어 시료를 전개한 후 메틸알콜 속에 들어 있는 20% 황산 용액을 분무한 다음 110℃에서 10분간 건조시켜 시료 속의 당들을 확인하였다. 1000개 가량의 토양 미생물을 조사한 결과 이중 2개의 미생물이 말토오스를 트레할로오스로 전환시키는 능력이 있음이 확인되었다. 도 1에서 보면 반응 초기 시료에서는 트레할로오스가 존재하지 않으나 반응 종료 후의 시료에서는 트레할로오스 표준 시료와 같은 위치에서 당이 검출되었다.

[실시예 3]

기체 크로마토그래피에 의한 트레할로오스 분석

반응이 끝난 혼합액 10 ㎕를 감압 건조기로 완전히 말린 뒤 이를 디메틸포름 아미드 20㎕에 용해시킨 다음 1% 트리메틸클로로실란을 함유한 비스(트리메틸)트리플로로아세트아미드를 동 부피를 가하여 트리메틸실란 유도체를 만들었다. 이중 1 ㎕를 취하여 GC 분석에 사용하였다. 도 2에서 보는 바와 같이 표준 트레할로오스 시료와 같은 시간에서 반응액의 피크가 관찰되었다.

[실시예 4]

HPLC에 의한 트레할로오스의 분석

반응이 끝난 혼합액의 절반을 취하여 동 부피의 페놀을 처리하여 단백질을 제거한 다음 HPLC 분석용 시료로 사용하였다. 시료 용액은 표준 트레할로오스와 같은 시간에서 피크를 보이는 것이 관찰되었다. 한편 반응이 끝난 혼합액의 나머지 절반을 100℃에서 10분간 가열 처리하여 효소 활성을 정지시킨 다음 여기에 α-1,1-트레할로오스에 특이적으로 작용하는 트레할레이즈 (시그마)를 처리하여 37℃에서 2 시간 반응시켰다. 반응 종료 후 동 부피의 페놀 용액을 가하여 단백질을 제거한 다음 HPLC 분석을 실시한 결과 표준 트레할로오스와 같은 시간에서 관찰되는 피크가 없어지는 것이 관찰되었다.

TLC, GC, HPLC 분석 결과로부터 본 발명자들이 분리 동정한 균주는 말토오스를 트레할로오스로 전환시킬 수 있는 능력이 있음이 확인되었다.

[실시예 5]

말토오스를 트레할로오스로 전환시킬 수 있는 미생물의 동정

본 발명에서 분리한 토양 미생물의 형태를 전자 현미경으로 관찰하였으며,그 결과 미생물은 간균이고 편모를 갖고 있으며, O/F 테스트 결과 호기성이고, 그램 염색시 음성 반응을 보인다. 이 미생물의 생리학적 특징에 의한 분리 동정 결과가 표 1에 요약되어 있다. 이상의 성질에 의거하여 문헌 (Bergay's Manual of Systemic Bacteriology, 1984)을 참고로 하여 이미 문헌과 특허에 발표된 미생물과 비교하여 보았다. 그 결과 본 발명에서 분리한 균의 특성이 99%가 슈도모나스 슈트트제리 종으로 밝혀졌다.

[표 1]

생리학적 특성

본 발명의 미생물 슈도모나스 슈트트제리 CJ38은 말토오스로부터 트레할로오스를 생성하는 능력을 갖고 있을 뿐만아니라 말토오스를 트레할로오스로 전환시키는 과정 중에 글루코오스와 같은 부생성물을 생성하지 않고 오로지 트레할로오스만을 생성한다는 이점을 지니고 있다. 따라서, 이와 같은 특성을 지닌 미생물을 이용했을 때 트레할로오스를 경제적인 가격으로 대량생산할 수 있다.

Claims (6)

1. 말토오스로부터 트레할로오스를 생성하는 슈도모나스 슈트트제리 CJ38 균주(KFCC-10985).
2. 제 1 항에 있어서, 부산물로서 글루코오스를 생성하지 않는 균주.
3. 제 1 항 또는 2 항에 있어서, 편모를 1개 지닌 균주.
4. 제 1 항 또는 2 항에 있어서, 그람 음성인 균주.
5. 제 1 항 또는 2 항에 있어서, 호기성인 균주.
6. 말토오스 용액을 제 1 항에 따른 균주의 파쇄액과 혼합하여 트레할로오스를 제조하는 방법.

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