CZ285149B6 - Alfa-L-Ramnosidáza, způsob její výroby a její použití - Google Patents

Abstract

Enzym -L-ramnosidáza, který katalýzuje štěpení vazby mezi terminální ramnózou a aglykonem v glykosidech obsahujících ramnózu, dále biolotechnického způsobu výroby tohoto enzymu a jeho použití k výrobě L/+: - ramnózy /6-desoxy -L-man ozy/.ŕ

Description

α-Lr-Ramnosidáza, způsob její výroby a její použití

Oblast techniky

Vynález se týká α-L-ramnosidázy, která katalyzuje štěpení vazby mezi terminální L/+/ramnózou a aglykonem u glykosidů, obsahujících ramnózu, způsobu její biotechnologické výroby a jejího použití k výrobě L/+/-ramnózy /6-desoxy-L-manózy/. Tento cukr bude v dalším označován jako L-ramnóza.

Dosavadní stav techniky

L-ramnóza se velmi dobře hodí jako chirální stavební kámen k přípravě různých organických sloučenin. L-ramnóza nebo její deriváty jsou čím dále tím více používány při syntéze farmaceutických výrobků a prostředků na ochranu rostlin, jakož i v oblasti cytologie rostlinných a živočišných buněk, mikrobiologie, imunobiologie a výroby aromatických látek. Tak lze například z L-ramnózy jako výchozí látky připravit 2,5-dimethyl-4-hydroxy-2,3-dihydrofuran3-on /Furaneol^(R)/, který rovněž slouží jako výchozí sloučenina pro různé aromatické látky v potravinářském a voňavkářském průmyslu.

Chemickou cestou je L-ramnóza přístupna jen velmi obtížně. Lze ji ale získávat z různých přírodních zdrojů extrakcí po kyselé hydrolýze, tak například z flavonových glykosidů hesperidinu, rutinu, naringinu, quercitrinu nebo například z arabské gumy nebo mořských řas /Biotechnology and Bioengineering, sv. 33, str. 365, 1989; R. J. Linhardt se sp., EP-A-0 317 033; JPA 62293/. Nevýhodou těchto způsobů jsou nákladné stupně při izolaci Lramnózy, částečně s použitím organických rozpouštědel, dále aromatické, potenciálně toxické odpadní produkty, které se vyskytují při zpracovávání a kolísavé složení obsahových látek, jež závisí na rytmu ročních období.

Fermentačně lze L-ramnózu vyrábět i ve formě heteropolysacharidů, které ji obsahují, pomocí bakterií různých rodů, jako například Alcaligenes, Acinetobacter, Klebsiella, Streptococcus nebo Lactobacillus /Enzyme Microb. Technol., sv. 10, str. 198, 1988; M. Graber se sp., J. Amer. Chem. Soc., sv. 71, str. 4124, 1945; F. G. Jarvis, M. J. Johnson, J. Bacteriol., sv. 68, str. 645, 1954; G. Hauser, M. L. Kamovsky/.

Nevýhodou těchto způsobů jsou obvykle nízké výtěžky, podmíněné viskozitou a nezbytné oddělování L-ramnózy ze směsi různých cukrů po hydrolytickém štěpení heteropolysacharidů.

Mnoho publikací a patentů se zabývá fermentačním získáváním ramnolipidů pomocí mikroorganizmu Pseudomonas aeruginosa. /Applied and Environmental Microbiology, sv. 51, č. 5, str. 985, 1986, Η. E. Reiling se sp., J. Chem. Techn. Biotechnol., sv. 45, str. 249, 1989; K. Venkata Ramana se sp., USA pat. č. 4 933 281; Daniels se sp., DOS 2 150 375; USA pat. č. 4 814 272, Wagner se sp./.

V kultivačním roztoku mikroorganizmů se vyskytují výhradně 4 ramnolipidy /RL 1 až RL 4, viz obr. 1/, které sestávají z jedné nebo dvou /L+/-ramnózových jednotek a z jedné nebo dvou βhydroxydekankarboxylových kyselin /Z. Naturforsch. 40 c, str. 61, 1985, C. Syldatk se sp./. Kvantitativně největší podíl tvoří ramnolipidy 1 a 3.

- 1 CZ 285149 B6

Obr. 1 Ramnolipidy z mikroorganizmů

ramnolipid 1

-co₂h·h₂o

ch₃ ramnolipid 2 o

I!

ramnolipid 3

-2 CZ 285149 B6

ramnolipid 4

Kromě toho je známé získávání L-ramnózy zflavonových glykosidů, ramnolipidů nebo oligosacharidů enzymatickým štěpením pomocí rozpustných nebo imobilizovaných a-Lramnosidáz naringinázy a hesperidinázy /USA pat. č. 5 077 206; Evr. pat. č. 88202595,0; P. Turecek, F. Pittner, Appl. Biochem. und Biotech. 13, 1-13, 1986/. Naringináza a hesperidináza mají vždy molekulovou hmotnost asi 90 000 a byly izolovány z mikroorganizmu Penicillium decumbens, resp. Aspergillus niger.

Naringináza a hesperidináza katalyzují štěpení vazby mezi dvěma monosacharidy, zejména odštěpení terminální ramnózy ve flavanonových glykosidech, jako například v hesperidinu, naringinu nebo v ramnolipidů 3, resp. 4.

Katalýza štěpení vazby mezi terminální ramnózou a aglykonem u glykosidů obsahujících ramnózu působením naringinázy a hesperidinázy probíhá mnohem pomaleji /faktor: 10 až 100; viz příklad provedení 1/.

To způsobuje, že k dokonalému odštěpení ramnózy ze směsi ramnolipidů 1 až 4, je zapotřebí velmi dlouhá doba, poněvadž ramnolipidy 1 a 3, které se kvantitativně v kultivačním roztoku mikroorganizmů vyskytují nejvíce, sestávají z L-ramnózy a aglykonu /mastné kyseliny/.

Podstata vynálezu

Překvapivě byla nyní z mikroorganizmu Penicillium sp. izolována α-L-ramnosidáza, která katalyzuje štěpení vazby mezi terminální L-ramnózou a aglykolem u glykosidů, jež obsahují ramnózu a má tedy opačnou specificitu při srovnání se známými a-L-ramnosidázami naringinázou a hesperidinázou.

Vynález se tedy týká

1. α-L-ramnosidázy, kterou lze získat fermentaci mikroorganizmu Penicillium sp. DSM 6825 a/nebo 6826; oddělení biomasy od kultivačního média a zahuštění supematantu;

2. α-L-ramnosidázy s molekulovou hmotností 60 000 až 100 000, která je charakterizována tím, že α-L-ramnosidáza má aminoterminální sekvenci aminokyselin

-3 CZ 285149 B6

D-T-N-D-Q-T—S-A-K—V-D-R-G-T-F-D-D-P-A-A-R-L nebo

F-F-G-S-X-Q-S-L-Y-L-K-L-V-L-K-F-G-T-L-F-D-X-A a katalyzuje štěpení vazby mezi terminální L-ramnózou a aglykonem v glykosidech, které ramnózu obsahují;

3. způsobu výroby α-L-ramnosidázy, který spočívá vtom, že se mikroorganizmus Penicillium sp. kultivuje v živném médiu tak dlouho, až se v kultuře nahromadí α-L-ramnosidáza, biomasa se oddělí od kultivačního média a takto získaný supematant se zahustí;

4. použití α-L-ramnosidázy k výrobě L-ramnózy;

5. mikroorganismu Penicillium sp. DSM 6825;

6. mikroorganismu Penicillium sp. DSM 6826.

V dalším je vynález podrobně popsán, zejména jeho výhodné způsoby provedení.

Jako L-ramnóza je označena sloučenina L/+/-ramnóza /= 6-desoxy-L-amnóza/.

Jako aglykon je označena sloučenina nebo část sloučeniny, která neobsahuje cukr. V tomto vynálezu jsou jako aglykony označovány zejména sloučeniny mastných kyselin nebo flavonů.

Pro aminokyseliny se používá zkratek, které odpovídají „Single-letter-code“, známému z odborné literatury.

Aminokyselina	Zkratka	Písmenový kód
Glycin	Gly	G
L-alanin	Ala	A
L-valin	Val	V
L-Leucin	Leu	L
L-isoleucin	Ile	I
L-fenylalanin	Phe	F
L-prolin	Pro	P
L-serin	Ser	S
L-treonin	Thr	T
L-cystein	Cys	C
L-metionin	Met	M
L-tryptofan	Trp	W
L-tyrosin	Tyr	Y
L-asparagin	Asn	N
L-glutamin	Gin	Q
L-asparágová kyselina	Asp	D
L-glutámová kyselina	Glu	E
L-lysin	Lys	K
L-arginin	Arg	R
L-histidin	His	H

-4 CZ 285149 B6 α-L-ramnosidáza může být z kultivačního média izolována jak v malých /až do 1 g/, tak i ve velkých množstvích /až do 1 kg/, poněvadž způsob výroby může být realizován jednak v laboratorním /fermentace mikroorganizmů v objemech až do 1 litru/ jednak v průmyslovém měřítku /fermentace mikroorganizmů v objemech kubických metrů/.

Molekulovou hmotnost α-L-ramnosidázy podle vynálezu lze stanovit jak gelovou elektroforézou SDS /SDS = sodium dodecyl sulphate, tj. dodecylsíran sodný/, tak i gelovou chromatografií. Tato metoda gelové chromatografie je například popsána v „Molecular Biology Of The Cell“, Bruče Alberts se sp., Garland Publishing, lne., New York and London, 3. vydání, 1983, str. 174, 265-266.

Zkratka „IEP“ znamená „isoelektrický bod“, ten je definován jako hodnota pH, při které je náboj bílkoviny, resp. v tomto případě enzymu, roven nule. Hodnota IEP se stanovuje chromatografickou fokusací.

Mikroorganizmus Penicillium sp. byl izolován z kompostu ze zahradního odpadu v 6232, Bad Soden, Německo. Izolace a čištění mikroorganismu probíhalo postupem, který je odborníkovi znám, a to ředěním kultury a naočkováním na selekční agar. Například vzorek z kompostu může být suspendován v 0,9% roztoku kuchyňské soli a z této suspenze může být založena obohacovací kultura v selekčním médiu s ramnolipidy a/nebo s deriváty ramnolipidů, s výhodou s Ci - Cig-alkylesterem ramnolipidů 2, jako jedinými zdroji uhlíku. Jako obzvláště výhodné zdroje uhlíku se používají Ci - C4-alkylestery ramnolipidů 2, například ramnolipid-2methylester nebo ramnolipid-2-terc-butylester.

Vzorce:

Ramnolipid-2-terc-butylester

ch₃

-5 CZ 285149 B6

Ramnolipid-2-methylester

Mikroorganizmy Penicillium sp. DSM 6825 a DSM 6826 mají tyto morfologické charakteristiky /podle R. A. Samsona se sp., Introduction to Food-bome Fungi, Institute of the Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences, 3. vydání, 1988/:

Penicillium sp. DSM 6825

rozvětvení konidií fialidy konidie	jednoduše přeslenovité podoby ampule ostnité
typ	Penicillium
Penicillium sp. DSM 6826
rozvětvení konidií	dvojitě přeslenovité
fialidy	lahvovité
konidie	bradavičnaté

Mikroorganizmy Penicillium sp. DSM 6825 a 6826 mohou být fermentovány společně nebo odděleně.

Místo izolátů DSM 6825 a/nebo 6826 mohou být používány mutanty a varianty, pokud produkují enzym α-L-ramnosidázu. Takové mutanty lze získávat známými způsoby pomocí fyzikálních prostředků, například ozařováním ultrafialovými nebo rentgenovými paprsky, nebo působením chemických mutagenů, například ethylmethansulfonátu /EMS/, 2-hydroxy-4-methoxybenzofenonu /MOB/ nebo N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidu /MNNG/.

Způsob výroby výše zmíněných α-L-ramnosidáz je následující:

postupně se k izolaci a vyčištění kmene Penicillium sp. /viz str. 5/ provádí mnohonásobné pasážování smíšené kultury vzniklých mikroorganizmů v selekčním médiu a dosáhne se obohacení mikroorganizmů, které produkují enzym podle vynálezu.

Takto získané mikroorganizmy se rozočkují na agarové plotny /selekční médium/, aby se ze smíšených kultur získaly čisté kultury.

-6 CZ 285149 B6

Čisté kultury se pomnoží a testuje se jejich schopnost tvorby enzymu podle vynálezu.

Ukazuje se, že mikroorganizmy druhu Penicillium sp. produkují enzym podle vynálezu. Stanovení druhu houby se uskutečňuje na základě morfologických, taxonomických a biochemických kriterií metodami, které jsou odborníkovi známy. Barva kolonií je zelená.

Kontrola schopnosti kolonii mikroorganizmu Penicillium sp. produkovat enzym podle vynálezu vede k izolaci dvou kmenů, které se vyznačují mimořádně vysokou produkcí a-L-ramnosidázy. Tyto dva kmeny jsou Penicillium sp. DSM 6825 a DSM 6826.

Kmeny byly uloženy v Německé sbírce mikroorganizmů a buněčných kultur, s. s r. o. /Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, GmbH/, Mascheroder Weg IB, 3400 Braunschweig, Německo, podle pravidel Budapešťské smlouvy, dne 29. listopadu 1991, pod čísly Penicillium sp. DSM 6825 a 6826.

Kultivace zmíněných mikroorganizmů se provádí za podmínek, které jsou obvyklé pro kmeny Penicillium sp. Proto se předpěstování uskutečňuje na komplexních nebo definovaných médiích; tato média obsahují s výhodou kvasničný extrakt, kaseinový hydrolyzát, kukuřičný výluh, masový extrakt, pepton, kasein, želatinu, trypton, dusičnan, amoniový ion nebo močovinu jako zdroje dusíku a škrob, dextrin, sacharózu, glukózu, glycerol nebo sladový extrakt jako zdroje uhlíku.

Jako další komponenty mohou být použity hořčík, vápník, sodík, draslík, železo, zinek, kobalt nebo fosforečnan. Jako mimořádně výhodné se ukázalo být použití ramnolipidů nebo jejich alkylesterů /surové směsi nebo čištěné ramnolipidy/ jako zdrojů uhlíku, a to samotných nebo v kombinaci s dalšími zdroji uhlíku.

Kultivace probíhá při teplotě 27 °C po dobu 72 až 120 hodin. Popřípadě nezbytná izolace a-Lramnosidázy se provádí obvyklým způsobem, například oddělením biomasy filtrací nebo odstřeďováním, při čemž je α-L-ramnosidáza obsažena převážně v supematantu.

Supematant může být koncentrován ultrafiltrací nebo může být lyofílizován. Další čisticí stupně, jako například srážení, chromatografie na anexech, chromatografická fokusace, HlC-chromatografie /Hydrophobic Interaction Chromatography/, vytěsňovací nebo afinitní chromatografie, mohou být prováděny podle požadované čistoty enzymu.

S výhodou se provádí čištění oddělením biomasy filtrací, následující ultrafiltrací, aby se zvýšila koncentrace enzymu v získaném supematantu, závěrečnou chromatografii na anexech, chromatografickou fokusací a nakonec vytěsňovací chromatografíí.

α-L-Ramnosidáza podle vynálezu má molekulovou hmotnost 60 000 až 100 000 v závislosti na stupni glykosidace a isoelektrický bod 5,6 až 5,8. Optimální hodnota pH při štěpení pnitrofenyl-a-L-ramnopyranosidu je 5,0 až 5,5, optimální teplota je 50 až 55 °C.

Stanovení aminoterminální sekvence u α-L-ramnosidázy z kmene Penicillium sp. DSM 6286 a z naringinázy se provádí zásadně postupem podle Edmana, který je znám z literatury. Při tomto postupu se řetězce aminokyselin smísí za vhodných podmínek s fenylisothiokyanátem. Tato chemická sloučenina se přednostně aduje na volnou aminoterminální aminoskupinu. Za přítomnosti bezvodé kyseliny se koncová aminokyselina odštěpí jako karbamoylový derivát. Tato sloučenina se zkoumá, aby se identifikovala koncová aminokyselina. Zbytek řetězce aminokyselin /kterému nyní chybí původní aminokyselina/ se může znovu podrobit reakci s fenylisothiokyanátem, aby se identifikovala následující aminokyselina atd. V principu je možné provádět tento postup mnohonásobně krok za krokem, takže lze odvodit celkovou frekvenci

-7 CZ 285149 B6 aminokyselin v řetězci. V tomto případě se kromě toho provádí stanovení N-terminální sekvencování aminokyselin v plynné fázi sekvencátorem /typ 477 A od firmy Applied Biosystems/ a analýza aminokyselin pomocí analyzátoru aminokyselin /typ 130 A PTC-Analyzer od firmy Applied Biosystems/. Tyto metody jsou publikovány ve FEBS Letters, sv. 292, str. 405 5 409, 1991.

U α-L-ramnosidázy bylo možno zjistit tuto aminoterminální parciální sekvenci:

D-T-N-D-Q-T-S-A-K-V-D-R-G-T-F-D-D-P-A-A-R-L nebo

F-F-G-S-X-Q-S-L-Y-L-K-L-V-L-K-F-G-T-L-F-D-X-A.

α-L-ramnosidáza podle vynálezu může být používána ve volné nebo imobilizované formě, přičemž k tomuto účelu přicházejí v úvahu všechny schůdné metody imobilizace. Jako nosiče lze používat například silikagel /z úsporných důvodů/.

α-L-ramnosidáza katalyzuje štěpení vazby mezi terminální L-ramnózou a aglykolem u glyko20 sidů, které obsahují ramnózu a je tudíž vhodný k přípravě ramnózy.

Štěpení se provádí ve vodných roztocích, které jsou nebo nejsou pufrovány. Vodnými roztoky jsou například kultivační média mikroorganizmu /pufrování není nutné/ nebo destilovaná voda. V tomto případě je nutné pufrování fosfátovým pufrem nebo Tris-pufrem, s výhodou amonium25 acetátovým pufrem /koncentrace pufru 5 až 100 mM, s výhodou 10 až 50 mM/. Vodný roztok má hodnotu pH 3,5 až 8, s výhodou pH 5 až 6. Teplota potřebná pro aktivitu enzymu je v rozmezí 4 až 65 °C, s výhodou 45 až 55 °C. Reakční doba závisí na množství enzymu a substrátu a nepatrně též na teplotě. Při teplotě 45 až 55 °C je reakční doba 2 až 24 hodiny, s výhodou 5 až 8 hodin. Při vyšších teplotách je účelná kratší reakční doba, poněvadž se enzym snáze degraduje. Množství 30 substrátu v násadě /= množství ramnolipidů/je maximálně 200 g/litr, množství enzymu 0,1 až j/g ramnolipidů, s výhodou 1 až 10 j/g a obzvláště výhodně 5 j/g ramnolipidů.

Po ukončení reakce se L-ramnóza izoluje z roztoku oddělením tukové fáze odstředěním nebo dekantací, až nastane rozdělení fází, popřípadě se dostatečně provádí čiření vodné fáze, například 35 pomocí aktivního uhlí. Čiřením se rozumí odstranění látek, které způsobují zákal nebo zbarvení.

Tento stupeň má význam tehdy, má-li se získat co nejčistší L-ramnóza. Nakonec se vodný roztok zahustí a L-ramnóza se nechá vykrystalovat.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Štěpení ramnolipidů 1 a 3 pomocí naringinázy a hesperidinázy g ramnolipidů 1 nebo 3 se emulguje ve 100 ml amoniumacetátového pufru /50 mM, pH 5,5/ nebo redestilované vody a přidá se 150 j naringinázy nebo hesperidinázy /od firmy Siama, Německo/. Reakce probíhá při 70 °C za míchání. Hodnoty v_max, získané za těchto podmínek, jsou 50 shrnuty v tabulce 1. Naringináza rozštěpí při tom za 4 h /hesperidináza za 7 h/ výchozích 10 g ramnolipidů 3 ve 2,5 g ramnózy /výtěžek asi 98%/ a ramnolipid 1. Štěpení ramnolipidů 1 probíhá podstatně pomaleji /viz tabulku 1/ a neúplně, pravděpodobně následkem působení enzymu po relativně dlouhou dobu.

- 8 CZ 285149 B6

Reakce byla sledována chromatografii na tenké vrstvě, kvantitativní stanovení bylo provedeno pomocí HPLC.

DC: eluční roztok deska detekční činidlo vyvíjení

CHCI3/CH3OH/HAC 65 : 5 : 2 křemelina 60 F 254

MeOH/HAc/H2SC>4 konc./anisaldehyd : 10 : 5 : 1 min při 120 °C.

Tabulka 1

Enzymatické štěpení ramnolipidu 1 a 3 pomocí hesperidinázy a naringinázy /hodnoty v_max se vztahují na lj aktivity α-L-ramnosidázy; lj je definována jako množství enzymu, které je schopno rozštěpit 1 pmol p-nitrofenyl-a-L-ramnopyranosidu/

Hesperidináza: /Sigma č. H-8137, Penicillium spec./ „v_max“ ramnolipid 3: ~ 50 pg min~‘j^_1 „v_max“ ramnolipid 1: ~ 0,5 pg min“¹]¹

Naringináza /Sigma č. N-1385, Penicillium decumbens/ „v_max“ ramnolipid 3: ~ 60 pg min^-Ij^_1 „v_max“ ramnolipid 1: ~ 5,0 pg min^_Ij^_1

HPLC: sloupec předsloupec teplota eluens průtok nanesení detekce

HPAP /100 x 7,8 mm/ Biorad

Carbo P /30 x 4,6/ Biorad °C redestilovaná voda

0,4 ml/min μΐ diferenciální refraktometr /Beckmann/

Zpracování ramnózy se provádí obvyklým postupem, který je popsán v literatuře /PCT-EP 9135 01426/.

Příklad 2

Štěpení ramnolipidů 1 a 3 působením α-L-ramnosidázy z mikroorganizmu Penicillium sp. DSM 6825 a/nebo 6826 g ramnolipidu 1 nebo 3 se emulguje ve 100 ml amoniumacetátového pufru /50 mM, pH 5,0/ nebo redestilované vody a přidá se 150 j enzymu podle vynálezu. Štěpení probíhá při 50 °C za 45 míchání. Hodnoty v_max, které byly získány za uvedených podmínek, jsou shrnuty v tabulce 2. aL-ramnosidáza rozštěpí při tom asi za 5 až 8 hodin /a-L-ramnosidáza z Penicillium sp. DSM 6825 asi za 8 hodin; α-L-ramnosidáza z Penicillium DSM 6826 asi za 5 hodin/ 10 g výchozího ramnolipidu 1 ve 3,05 g ramnózy /výtěžek asi 94 %/ a v příslušnou mastnou kyselinu. Štěpení ramnolipidu 3 probíhá podstatně pomaleji /viz tabulku 2/ a neúplně, pravděpodobně rovněž 50 dívky inaktivaci enzymu v průběhu poměrně dlouhé doby.

-9CZ 285149 B6

Tabulka 2

Enzymatické štěpení ramnolipidů. Hodnoty v_max se vztahují na 1 jednotku aktivity a-Lramnosidázy; 1 jednotka je definována jako množství enzymu, které je schopno rozštěpit za 1 min 1 pmol p-nitrofenyl-a-L-ramnopyranosidu:

α-L-ramnosidáza z Penicillium sp. 6825:	Penicillium sp. DSM 6825 „vmax“ ramnolipid 3: ~ 0,03 pg min1]1 „vmax“ ramnolipid 1: ~ 40,0 pg min”1]1
α-L-ramnosidáza z Penicillium sp. 6826:	Penicillium sp. DSM 6826 „Vmax“ ramnolipid 3: ~ 0,05 pg min”1]”1 „Vmax“ ramnolipid 1: ~ 70,0 pg min*1]1

L-ramnóza se izoluje opět známými metodami, navíc je možno izolovat odštěpenou mastnou kyselinu extrakcí v kyselém prostředí.

Příklad 3

Vyhledávání kmenů, které produkují a-L-ramnosidázu

Z různých vzorků půdy byly obohacovány mikroorganizmy na živných médiích, obsahujících ramnolipid-2-methylester, resp. ramnolipid-2-terc.-butylester jako jediný zdroj uhlíku, s použitím běžných mikrobiologických metod /Drews, Mikrobiologisches Praktikum, 45 - 84, Springer Verlag 1983/ a byly izolovány čisté kultury. Přibližně ze 400 izolovaných kmenů bylo asi 37 schopno odbourávat ramnolipidy. Pouze u části kmenů bylo možno prokázat i signifikantní a-Lramnosidázovou aktivitu; při tom bylo prokázáno, že dva kmeny /Penicillium sp. DSM 6825 a Penicillium sp. DSM 6826/jsou obzvláště dobrými producenty.

Jako substrát pro důkaz α-L-ramnosidázové aktivity se používá p-nitrofenyl-a-L-ramnopyranosid. 10 mg tohoto substrátu se rozpustí v 10 ml amoniumacetátového pufru /pH 5,5 50 mM/. 900 μΐ tohoto roztoku se smíchá se 100 μΐ filtrátu kultury nebo buněčného lyzátu a inkubuje při 40 °C. Po 0, 3, 6, 9 a 12 minutách se odebere množství 200 μΐ a smíchá s 800 μΐ borátového pufru /200 mM, pH 9/. Odštěpování p-nitrofenolu se sleduje fotometricky při 410 nm, jako kontrola sloužila maringináza /podle Romera se sp., Anal. Biochem. 149, 566 571 /1985//.

Příklad 4

Získávání α-L-ramnosidázy pomocí kmenů Penicillium sp. DSM 6825 a Penicillium sp. DSM 6826

Kmeny se nejprve rozetřou na agarové plotny s médiem HA /kvasničný extrakt 4 g/litr, sladový extrakt 10 g/litr, glukóza 4 g/litr, agar 20 g/litr, pH 6,0/ a inkubují 10 až 14 dní při teplotě 25 °C až do stadia dobré sporulace. Ze dvou dobře porostlých ploten se připraví suspenze spor /50 ml 0,9% roztok chloridu sodného; 0,05% roztok smáčedla Tween 80/ a použije k zaočkování 10 litrů produkčního média.

Jako produkční médium se použije tento živný roztok: 3 g/litr ramnolipidů 1 nebo 2 nebo alkylesteru nebo jejich směsi /například koncentrovaný filtrát kultury Pseudomonas aeruginosa, 1 g/litr primárního fosforečnanu draselného, 0,5 g/litr síranu amonného, 0,1 g/litr heptahydrátu

-10CZ 285149 B6 síranu hořečnatého, 0,1 g/litr chloridu vápenatého, 0,1 g/litr hydrolyzátu kaseinu, pH 5,5/. Kultivace probíhá v lOlitrovém reaktoru s listovým míchadlem, při 300 ot/min, vzdušnění 0,6 obj./min, teplota 27 °C při pH 5,5. Doba kultivace je 5 až 10 dnů.

Po ukončení fermentace se buňky oddělí filtrací a filtrát se sterilně zfíltruje /0,22 pm/. Tento filtrát obsahuje největší podíl /přes 90 %/ aktivity a-L-ramnosidázy /5000 j/litr/ a může se přímo nebo po lyofylizaci, popřípadě po zahuštění ultrafiltrací membránou /10 000/, použít ke štěpení ramnolipidů.

Příklad 5

Izolace a charakterizace α-L-ramnosidázy získané z Penicillium sp. DSM 6826

Při dalším čištění α-L-ramnosidázy se vycházelo z koncentrátu, který měl aktivitu 50 j/ml.

Jako první stupeň se provádí chromatografie na sloupci Sepharose Q s použitím 20 mM Tris/kyselina chlorovodíková, pH 7,6. Eluce se provádí gradientem chloridu sodného 0 až 0,5 M; dosažený výtěžek je asi 80%, faktor čištění 5; enzym vykazuje specifickou aktivitu 62j/mg bílkoviny.

Tato frakce se dále chromatografuje na sloupci Mono P /Pharmacia//25 mM imidazol/kyselina chlorovodíková proti PBE 74, pH 5,0, 1 : 12/. Eluce α-L-ramnosidázy se provádí při hodnotě pH 5,6 až 5,8. Výtěžek je asi 70 %.

Po odpovídajícím přepufrování se bílkovina chromatografuje na sloupci Superosy 12 /1 x30cm/. Jako pufr slouží 100 mM amoniumacetát, pH 5,0 se 100 mM chloridu sodného. Kontrola pomocí gelové elektroforézy SDS poskytne pásy bílkoviny v oblasti 60 až 100 kd, v závislosti na stupni glykosidace enzymu.

S čištěným enzymem byly prováděny testy, které jsou shrnuty v následující tabulce.

Tabulka 3

Vliv různých látek na aktivitu α-L-ramnosidázy podle vynálezu:

Látka % aktivity

Kontrola100

Chlorid vápenatý /20 mM/127

Síran hořečnatý /2 mM/106

Chlorid draselný /100 mM/69

Chlorid česný /2 mM/96

Chlorid kobaltnatý /2 mM/41

Chlorid měďnatý /0,5 mM/40

Chlorid železnatý /0,5 mM/100

Chlorid manganatý /2 mM/27

Chlorid zinečnatý /2 mM/65

Ethylendiamintetraoctová kys. /10 mM/22

Ethylendiamintetraoctová kys. /chlorid vápenatý /10/10 mM/90

EGTA/10mM/60

EGTA/síran hořečnatý /10/10 mM/124

-11CZ 285149 B6

L-ramnóza /0,5 M/

L-ramnóza /1,0 M/

L-ramnóza/1,5 M/

39,5

26,4

Příklad 6

Stanovení N-terminální sekvence u α-L-ramnosidázy z kmene Penicillium sp. DSM 6826 a u naringinázy

Enzym, který byl získán podle příkladu 5 z kmene Penicillium sp. DSM 6826 a stejným postupem čištěná naringináza z kmene Penicillium decumbens /surový enzym, Sigma č. N-1385/ se ještě jednou čistí na akrylamidovém gelu /10%/ a po transferu polypeptidů se přenesou pomocí obtiskové metody na ProBlot-membránu /firma Applied Biosystems//Sequencers, č. 42, duben 1990, Applied Biosystems/. Naringináza při tom vykázala jeden pás, zatímco čištěný enzym z kmene DSM 6826 se rozdělil ve dva velmi blízko sousedící pásy.

Pomocí sekventátoru peptidů /typ 477a od firmy Applied Biosystems/ se stanoví N-terminální sekvence tří polypeptidových řetězců. Výsledky v tabulce 4 zřetelně ukazují, že oba polypeptidové řetězce u aktivních preparátů z kmene DSM 6826 se liší od řetězce naringinázy /Sigma č. N-1385/.

Tabulka 4

Peptid	N-terminální sekvence
Naringináza /96 000 d/	ASVPXGEXILAPSSIELIPT
a-L-ramnosidáza 6826, peptid I /96 000 d/	DTNDQTSAKVDRGTFDDPAARL
a-L-ramnosidáza 6826, peptid II /83 500 d/	FFGSX,QSLYLKLVLKGTLFD/X2/A

X[ znamená pravděpodobně cystein

X₂ aminokyselina nebyla stanovena

Průmyslová využitelnost

Enzym α-L-ramnosidáza, připravitelný způsobem podle tohoto vynálezu, významně zjednodušuje získávání L-ramnózy, důležitého meziproduktu pro syntézy ve farmaceutickém, potravinářském a voňavkářském průmyslu.

Claims (12)

1. α-L-ramnosidáza, připravitelná fermentací mikroorganizmu Penicillium sp. DSM 6825 a/nebo 6826, oddělením biomasy od kultivačního média a zahuštěním supematantu.

2. α-L-ramnosidáza podle nároku 1, s molekulovou hmotností 60 000 až 100 000, obsahující aminoterminální sekvenci aminokyselin

D-T-N-D-Q-T-S-A-K-V-D-R-G-T-F-D-D-P-A-A-R-L nebo

F-F-G-S-X-Q-S-L-Y-L-K-L-V-L-K-F-G-T-L-F-D-X-A a katalyzující štěpení vazby mezi terminální ramnózou a aglykonem v glykosidech, které obsahují ramnózu.

3. α-L-ramnosidáza podle nároku 2, pocházející z mikroorganizmu Penicillium sp.

4. α-L-ramnosidáza podle nároku 1 nebo 2, jejíž isoelektrický bod zjištěný pomocí chromatografické fokusace má hodnotu 5,6 až 5,8.

5. α-L-ramnosidáza podle jednoho nebo více z nároků 2 až 4, pocházející z mikroorganizmu Penicillium sp. DSM 6825 a/nebo 6826.

6. α-L-ramnosidáza podle nároku 2, kde aglykonem je mastná kyselina.

7. α-L-ramnosidáza podle nároku 1 nebo 2 katalyzující štěpení ramnolipidů.

8. Způsob výroby α-L-ramnosidázy podle nároku 1 kultivací mikroorganismu Penicillium sp. v živném médiu, vyznačující se tím, že se v živném médiu kultivuje mikroorganizmus Penicillium sp. DSM 6825 a/nebo DSM 6826, až se v kultuře nahromadí a-Lramnosidáza, biomasa se oddělí od kultivačního média a takto získaný supematant se zahustí.

9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že se použije živné médium obsahující jako zdroje uhlíku ramnolipidy a/nebo deriváty ramnolipidů.

10. Použití α-L-ramnosidázy podle nároku 1 nebo 2 k přípravě L-ramnózy.

11. Mikroorganizmus Penicillium sp. DSM 6825, produkující α-L-ramnosidázu podle nároku 1.

12. Mikroorganizmus Penicillium sp. DSM 6826, produkující α-L-ramnosidázu podle nároku 1.