CN101914451B - 产α-L-鼠李糖苷酶的链格孢菌株及其培养方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及链格孢菌株及其培养方法与应用，尤其涉及一种可以产生α-L-鼠李糖苷酶的链格孢菌株及其培养方法与在柚苷水解中的应用。本发明提供一种产生α-L-鼠李糖苷酶的链格孢L1(Alternaria sp.L1)菌株、特征、培养方法及其应用于水解柚苷的方法。该菌株已于2010年3月25日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.3688。菌株链格孢(Alternaria sp.)L1菌株培养简单，遗传性质稳定，水解效率高，酶活稳定，具有很强的工业化生产优势和广阔的应用前景，可应用于食品工业中柑橘类果汁的酶法脱苦等领域。
Description
技术领域
本发明涉及链格孢菌株及其培养方法与应用，尤其涉及一种可以产生α-L-鼠李糖苷酶(EC 3.2.1.40)的链格孢菌株及其培养方法与在柚苷水解中的应用。
技术背景
柚苷是柑橘类果汁加工过程中的主要苦味物质，目前柚苷的脱除主要分为物理法和酶法。物理法存在可控性差、影响产品质量和风味、工艺较复杂等缺点，而酶法由于操作简单、易于控制、能够较好的保留产品的营养和风味等优点越来越受到重视。α-L-鼠李糖苷酶能够将柚苷水解，水解产物的苦味大大小于柚苷，从而改进果汁口感。
现报道的α-L-鼠李糖苷酶大多来源于细菌，其稳定性较差；真菌来源的酶性质稳定，但种类有限。因此寻找新的能够产生具有较强α-L-鼠李糖苷酶活性且酶性质稳定的真菌菌种，对柑橘类果汁的酶法脱苦有着重要意义。
发明内容
针对现有微生物酶法工业应用中产α-L-鼠李糖苷酶的真菌微生物种类有限，特别是产生具有较强水解活性且稳定性好的α-L-鼠李糖苷酶的微生物种类有限的不足，本发明的目的是提供一种新分离的可产生较强水解活性且稳定性好的α-L-鼠李糖苷酶的链格孢菌株，此菌产生的α-L-鼠李糖苷酶可以高效催化柚苷的水解。
发明概述
本发明的要点是提供一种产生α-L-鼠李糖苷酶的链格孢L1(Alternaria sp.L1)菌株以及其特征、培养方法及应用于水解柚苷的方法。经文献检索，目前国内外没有链格孢菌应用于水解柚苷的报道。
发明详述
产α-L-鼠李糖苷酶的链格孢L1(Alternaria sp.L1)菌株，该菌株2010年3月25日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.3688。
链格孢L1菌株在马铃薯培养基上生长迅速，2～3天菌落铺展，产生大量菌丝体，菌落初白色，3天左右时变为青褐色，并伴随培养时间的延长渐变为褐色至暗褐色，基内菌丝产生水溶性褐色色素。分生孢子梗生于气生菌丝的侧面和顶端，分隔处有隘缩，分生孢子单生或成链生于分生孢子梗上，为倒梨形或卵形，具有横、纵、斜隔膜，成砖格状分隔，表面具有疣突，呈褐色或深褐色。该菌株的18S rDNA在GenBank的登录号为FJ946316，与一株链格孢菌的18S rDNA序列(GenBankNo.EU827605.1)同源性为99％。
产α-L-鼠李糖苷酶的链格孢L1(Alternaria sp.L1)菌株的培养方法，步骤如下：
取菌种保藏编号为CGMCC No.3688的链格孢L1菌株接种至新鲜斜面培养基活化48～60小时，活化温度为28～30℃，取活化后的链格孢L1菌株接种于种子培养液，培养48小时，培养温度为28～30℃，即得；
所述斜面培养基成分如下：马铃薯200-220g/L，葡萄糖20-25g/L，琼脂15-20g/L，pH自然；优选斜面培养基成分为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂16g/L；
所述种子培养液成分如下：玉米浆30-35mL/L，酵母粉5-7g/L，磷酸氢二钾5-7g/L，pH自然；优选种子培养液成分为：玉米浆30mL/L，酵母粉5g/L，磷酸氢二钾5g/L。
优选的，所述培养温度为28℃。
产α-L-鼠李糖苷酶的链格孢L1菌株水解柚苷方面的应用。
所述产α-L-鼠李糖苷酶的链格孢L1菌株水解柚苷方面的应用，步骤如下：
(1)取经种子培养液培养后的链格孢L1菌株，按体积百分比3％的接种量转接于产酶发酵培养液中摇床培养42～48小时，培养温度为28～30℃，摇床转速为180转/分；
(2)将步骤(1)产酶发酵培养液培养后的链格孢L1抽滤，得菌丝体；
(3)将步骤(2)制得的菌丝体用液氮研磨，得破碎菌丝体；
(4)将步骤(3)制得的破碎菌丝体按质量体积比1∶5悬浮于pH6.0、10mM的醋酸缓冲液，充分混匀，得粗酶液；
(5)将步骤(4)制得的粗酶液与50mM-100mM的柚苷溶液按体积比1∶2混合，水解柚苷；水解温度为40～50℃，水解时间为10～240分钟；
步骤(4)所述质量体积比单位为g/mL。
所述产酶发酵培养液成分如下：玉米浆30-35mL/L，酵母粉5-7g/L，磷酸氢二钾5-7g/L，柚苷5-7g/L，pH自然；优选产酶发酵培养液成分为：玉米浆30mL/L，酵母粉5g/L，磷酸氢二钾5g/L，柚苷5g/L。
优选的，所述步骤(1)中的摇床培养时间为48小时。
优选的，所述步骤(5)中柚苷溶液的溶剂为pH6.0、10mM的醋酸缓冲液；优选的，柚苷溶液浓度为100mM。
优选的，所述步骤(5)中水解时间为40分钟。
上述斜面培养基、种子培养液和产酶发酵培养液pH无须调整，使用前都在115℃高温下灭菌30分钟。
本发明菌株链格孢(Alternaria sp.)L1菌株培养简单，遗传性质稳定，水解效率高，酶活稳定，具有很强的工业化生产优势和广阔的应用前景，可应用于食品工业中柑橘类果汁的酶法脱苦等领域。
附图说明
图1是链格孢(Alternaria sp.)L1菌株产生的α-L-鼠李糖苷酶水解柚苷后样品的高压液相色谱图；A、B、C分别为反应0分钟、10分钟、30分钟时的样品曲线，峰1为柚苷。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步阐述，但本发明所保护范围不仅限于此。
实施例中的链格孢L1(Alternaria sp.L1)菌株，该菌株2010年3月25日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.3688。
实施例中培养基组分均为市售产品。
实施例1：
(1)形态学特征观察
用接种环挑取链格孢L1 CGMCC No.3688孢子接到马铃薯培养基平板上，置28℃培养。在马铃薯培养基上生长迅速，2～3天菌落铺展，产生大量菌丝体，菌落初白色，3天左右时变为青褐色，并伴随培养时间的延长渐变为褐色至暗褐色。基内菌丝体产生水溶性褐色色素扩散到培养基中，反面呈青褐色至褐色。分生孢子梗生于气生菌丝的侧面和顶端，分隔处有隘缩，分生孢子单生或成链生于分生孢子梗上，为倒梨型或卵形，具有横、纵、斜隔膜，成砖格状分隔，表面具有疣突，呈褐色或深褐色。
上述马铃薯培养基成分是：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，pH自然。马铃薯去皮，切成块煮沸30分钟，然后用纱布过滤取汁，再加糖及琼脂，溶化后补足水至1L，115℃灭菌30分钟。
(2)18S rDNA序列测定和分析：
用基因组提取试剂盒(BioFlux)提取链格孢(Alternaria.sp)L1基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用真菌18S rDNA通用上游引物NS1(5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’)和下游引物FS2(5’-TAGGNATTCCTCGTTGAAGA-3’)PCR扩增18S rDNA序列。PCR反应体系50μL：10×PCR buffer 5μL，2.5mmol/L dNTP混合物4μL，20μmol/L引物各2μL，模板2μL，LATaq酶1μL，无菌水34μL。PCR扩增条件：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，51℃退火30秒，72℃延伸1.5分钟，30个循环；72℃延伸5分钟。所获得的扩增产物由上海生工生物工程有限公司进行序列测定，大小为1524碱基，将该序列于NCBI网站进行BLAST核苷酸比对分析，与一株链格孢菌的18S rDNA序列(GenBank No.EU827605.1)同源性为99％。
链格孢L1CGMCC No.368818S rDNA的GenBank登录号为FJ946316。
实施例2：
一种链格孢L1菌株的培养方法，步骤如下：
取链格孢L1菌株(菌种保藏号CGMCC No.3688)接种至新鲜斜面培养基活化48小时，温度为28℃，取活化后的链格孢L1菌株接种于15mL种子培养液，培养48小时。
该斜面培养基成分为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂16g/L，pH自然。115℃灭菌30分钟。
该种子培养液成分为：玉米浆30mL/L，酵母粉5g/L，磷酸氢二钾5g/L，pH自然。115℃灭菌30分钟。
稳定性实验表明，该菌株具有非常高的稳定性，数代后产酶能力没有降低。
实施例3：
利用链格孢L1菌株产生的α-L-鼠李糖苷酶水解柚苷，具体步骤如下：
采用实施例2所述方法培养链格孢L1菌株(菌种保藏号CGMCC No.3688)，后转接于500mL产酶发酵培养液中扩大培养42小时，培养温度为28℃，摇床转速为180转/分，链格孢L1菌株在上述培养基中生长产酶良好，其中，产酶发酵培养液成分为：玉米浆30mL/L，酵母粉5g/L，磷酸氢二钾5g/L，柚苷5g/L，pH自然。将经过产酶发酵培养液培养后的链格孢L1菌株抽滤获得菌丝体，将菌丝体用液氮进行研磨，研磨后的破碎菌丝体按质量体积比1∶5(g/mL)的比例悬浮于pH6.0、10mM的醋酸缓冲液，充分混匀，得粗酶液。
取50μL上述粗酶液，与100μL、pH6.0醋酸缓冲液配制的100mM的柚苷溶液混合，50℃水浴摇床反应，不同时间取样，进行高压液相色谱分析。
对上述水解产物进行分析，反应进行10分钟，约有60％的柚苷发生水解；反应进行30分钟，约有98％的柚苷水解(如图1所示)；反应进行40分钟后，柚苷被完全水解。
上述HPLC分析所用设备及条件：Agilent 1200LC高压液相色谱仪；Agilent G1314B紫外检测器；ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(4.6×150mm)；流动相为23％乙腈，流速为1mL/min，柱温25℃。样品煮沸离心，加入乙腈稀释到一定浓度，用0.2μm滤膜过滤后进样分析。
Claims (10)
1.产α-L-鼠李糖苷酶的链格孢L1(Alternaria sp.L1)菌株，该菌株2010年3月25日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.3688。
2.权利要求1所述的一种产生α-L-鼠李糖苷酶的链格孢L1(Alternaria sp.L1)菌株的培养方法，步骤如下：
取菌种保藏编号为CGMCC No.3688的链格孢L1菌株接种至新鲜斜面培养基活化48～60小时，活化温度为28～30℃，取活化后的链格孢L1菌株接种于种子培养液，培养48小时，培养温度为28～30℃，即得；
所述斜面培养基成分如下：马铃薯200-220g/L，葡萄糖20-25g/L，琼脂15-20g/L，pH自然；所述种子培养液成分如下：玉米浆30-35mL/L，酵母粉5-7g/L，磷酸氢二钾5-7g/L，pH自然。
3.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述斜面培养基成分为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂16g/L；种子培养液成分为：玉米浆30mL/L，酵母粉5g/L，磷酸氢二钾5g/L。
4.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述培养温度为28℃。
5.权利要求1所述产α-L-鼠李糖苷酶的链格孢L1(Alternaria sp.L1)菌株水解柚苷方面的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤如下：
(1)取经种子培养液培养后的链格孢L1菌株，按体积百分比3％的接种量转接于产酶发酵培养液中摇床培养42～48小时，培养温度为28～30℃，摇床转速为180转/分；
(2)将步骤(1)产酶发酵培养液培养后的链格孢L1抽滤，得菌丝体；
(3)将步骤(2)制得的菌丝体用液氮进行研磨，得破碎菌丝体；
(4)将步骤(3)制得的破碎菌丝体按质量体积比1∶5悬浮于pH6.0、10mM的醋酸缓冲液，充分混匀，得粗酶液；
(5)将步骤(4)制得的粗酶液与50mM-100mM的柚苷溶液按体积比1∶2混合，水解柚苷；水解温度为40～50℃，水解时间为10～240分钟；
步骤(4)所述质量体积比单位为g/mL；
产酶发酵培养液成分如下：玉米浆30-35mL/L，酵母粉5-7g/L，磷酸氢二钾5-7g/L，柚苷5-7g/L，pH自然。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述产酶发酵培养液成分为：玉米浆30mL/L，酵母粉5g/L，磷酸氢二钾5g/L，柚苷5g/L。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中的摇床培养时间为48小时。
9.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述步骤(5)中柚苷溶液的溶剂为pH6.0、10mM的醋酸缓冲液；柚苷溶液浓度为100mM。
10.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述步骤(5)中水解时间为40分钟。
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