CN104673680A - 一种链格孢属cbsx2菌株及其应用 - Google Patents

一种链格孢属cbsx2菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种链格孢属（Alternaria ochroleuca）CBSX2菌株及其应用，该菌株已于2014年12月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会，保藏号是CGMCCNO.10141。提供了链格孢属（Alternaria ochroleuca）CBSX2菌株在降解纤维素方面的作用，为纤维素的生物降解提供了新的菌种资源。

Description

一种链格孢属CBSX2菌株及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，为一种纤维素降解菌，具体为一种链格孢属（ Alternaria ochroleuca） CBSX2菌株及其应用。
背景技术
纤维素是自然界中储存量最大、分布最广泛的可再生天然碳水化合物，其主要存在于秸秆、木材等高等植物的细胞壁中，每年通过光合作用可生产纤维素逾 10 亿 吨。然而纤维素难以降解，导致其利用具有一定的局限性。长期以来，纤维素的降解主要是酸水解，在1819年，人们就发现了酸水解可以用于生产糖浆，用于各种工业需要。酸水解主要分为稀酸水解和浓酸水解法。稀酸水解的条件是在高温和高压下进行，水解反应的时间是几秒或几分钟，在连续生产中应用较多：浓酸水解则相反，它要在较低的温度和压力下进行，水解反应的时间比稀酸水解长。在酸水解的过程中会有很多因素影响单糖的得率，主要包括温度、压力、酸浓度、生物质颗粒的大小、液固比等。在酸水解的过程中，木糖很快降解为糠醛，葡萄糖降解为羟甲醇糠醛，一些抑制因子也会产生，造成了糖原的浪费，且抑制了乙醇的发酵过程，因而，酸水解纤维素工业仍需要不断地完善。
目前，降解纤维素最有效、最经济的方法是生物降解法，即通过细菌、放线菌以及真菌等生物产生的纤维素酶来催化降解纤维素。
生物法与传统化学方法相比，具有成本低和转化率高等优点。它包括酶水解和生物直接转化法。酶水解通常可以在常压下进行，酶具有很高的选择性，可直接水解成单一产物，能够得到较高的产率。由于酶水解时仅生成很少的副产物，所以简化了提纯过程，也避免了污染。而酶水解存在的问题是，酶的生产(或购买)成本很高，是现在研究的重点。直接生物转化是指由一种菌来完成纤维素的水解和发酵过程，其优点是生产纤维素酶的这个高成本的步骤可以省略，然而到目前为止仍没有发现这样的菌株，因此，生物直接转化在今天仍然不可行。
发明内容
本发明针对以上不足之处，提供了一种纤维素降解菌，链格孢属CBSX2菌株，该菌株生长快，能分泌比较完整的水解木质纤维素的酶系且酶活性高。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供了一种新的纤维素降解菌，为链格孢属（ Alternaria ochroleuca） CBSX2菌株，于2014年12月8日保藏于在北京市朝阳区北辰西路1 号院3 号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号是CGMCCNO.10141，命名为链格孢属（ Alternaria ochroleuca） CBSX2菌株。
CBSX2菌落形态为灰色绒毛状，质地紧致，在PDA上涨势很快。边缘整齐，呈波状或裂片状，在培养基表面可以看到有黑色的孢子堆形成。成熟的分生孢子具4-8个横膈膜，1-5个纵隔膜，倒棍棒形，卵形，或椭圆形，幼时孢子为透明无色，成熟后呈黑褐色，初步判定为真菌链格孢属。
CBSX2真菌与链格孢属（ Alternaria ochroleuca） 的同源相似性达到99%，氨基酸序列的相似性也达到了92%。
本发明的有益效果是：
目前的研究却大多集中在有限的几个菌株上，如康宁木霉、里氏木霉等。然而这些菌株仍然存在着产酶成本高，酶活性不稳定，作用pH范围狭窄等问题。因此寻找更多、更高效、作用范围更广泛的新菌种是十分必要的。本发明从长白山野生人参根内分离到几株高效降解纤维素的微生物菌株，该菌株生长快，能分泌比较完整的水解木质纤维素的酶系且酶活性高，其中菌株CBSX2纤维素降解能力最强，降解率高达23%，鉴定CBSX2菌株为链格孢属（ Alternaria ochroleuca） 。国内外关于链格孢菌属的纤维素酶的研究较少，为纤维素的生物降解提供了新的菌种资源。
附图说明
图1所示是本发明 五个时间不同真菌对秸秆的失重率；
图2 所示为CBSX2菌株菌落形态和孢子形态（40×0.65）；
图3所示为 CBSX2菌株显微形态（40×0.65）和孢子形态（100×1.4）；
图4所示为该真菌引物ITS1,ITS4扩增DNA序列；
图5菌株CBSX2通过ITS序列分析建立的系统发育树。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。
实施例1本发明纤维素降解菌链格孢属（ Alternaria ochroleuca） CBSX2菌株的分离与鉴定
（1）人参内生真菌链格孢属（ Alternaria ochroleuca） CBSX2菌株的分离
①健康的野生人参样品采集后立即处理、洗净，然后将根切成小段，用75%的酒精冲洗，用10%巴氏消毒液洗18分钟，最后用无菌水冲洗4次；
② 将上述消毒过的根在无菌条件下分别切割成0.5cm长的小段接种于孟加拉红培养基平板上，置于28℃度培养箱培养5天后，即可见样品切割过的边缘长出菌丝，经孟加拉红培养基平板反复分离、纯化，将得到的真菌菌落4℃保藏。
孟加拉红培养基配方及制作方法如下：蛋白胨5g，葡萄糖10g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁(MgSO4·7H2O) 0.5g，琼脂20g，1/3000孟加拉红溶液100mL，蒸馏水1000mL，氯霉素0.1g。上述各成分加入蒸馏水中溶解后，再加孟加拉红溶液。另用少量乙醇溶解氯霉素，加入培养基中，分装后，121℃灭菌20min。
③具有纤维素分解能力的菌株的筛选：
分解纤维素的微生物种类很多,人们研究较多的是真菌和细菌,但由于细菌产的纤维素酶多为胞内酶,所以真菌更是成为人们研究的焦点,在研究过程中,纤维素酶活的测定方法十分繁琐,而采用平板菌落筛选则可粗略判断纤维素酶的酶活,从而减少试验的工作量，经改良后的刚果红纤维素琼脂平板培养基配方为3(NH4)2SO4 2g,MgSO4 0.5g,K2HPO4 1g,NaCl 0.5g,纤维素粉2g,刚果红0.4g,琼脂20g,水1000mL,自然pH值,其中纤维素粉以0.1mol/L的盐酸处理24h,之后水洗至pH值中性,过滤，烘干。经流水冲洗24h后烘干,不仅单菌落生长良好,大小适度,且红色水解圈边缘清晰,大小分明,效果甚佳。
将分离得到的单菌落点种于刚果红纤维素琼脂平板上,在28℃恒温培养箱中培养2-7d,挑选出在平板上生长快的红色浓郁透明水解圈的菌落,并测定其水解圈的大小。对水解圈和菌落直径比值最大的菌落在进行划线分离,接种于保藏培养基上保存，命名为CBSX2。
表1 CBSX在刚果红平板上水解圈与菌落大小 
名称 水解圈直径（cm） 菌落直径(cm) 比值
CBSX 11.5 4.5 2.56
（2）鉴定
野生人参内生真菌CBSX2菌株为链格孢属（ Alternaria ochroleuca） 的菌种形态和分类依据
将③分离的单孢菌株接于PDA平板中央，置于25℃光暗交替培养，7d 后于显微镜下观察分生孢子和分生孢子梗形态，用目镜测微尺测量分生孢子及分生孢子梗的大小。同时记录下各菌株在PDA 平板上的生物学形态，如菌丝形态、色素类型、孢子形态等特征，参照文献[张天宇．中国真菌志．北京: 科学出版社，2003；魏景超．真菌鉴定手册．上海: 上海科学技术出版，1979；孙霞．链格孢属真菌现代分类方法研究[D] 泰安: 山东农业大学，2006]及真菌辞典第九版分类系统进行真菌种类鉴定。
CBSX2用PDA培养基培养后，菌落形态如图2所示为灰色绒毛状，质地紧致，在PDA培养基上涨势很快。边缘整齐,呈波状或裂片状,在培养基表面可以看到有黑色的孢子堆形成。成熟的分生孢子具4-8个横膈膜,1-5个纵隔膜,倒棍棒形，卵形，或椭圆形，幼时孢子为透明无色，成熟后呈黑褐色；
供试菌株在PDA 平板上培养3-5d 后，从菌落边缘取菌丝块，移到50mL马铃薯—葡萄糖培养液中，25℃条件下摇床150r /min 震荡培养2d，经滤纸抽滤菌丝，用无菌水冲洗3次后，用灭菌吸水纸吸去多余的水分，置于－20℃冰箱中保存备用。采用CTAB (Cetyltriethy lammonium Bromide) 法[林加涵，魏文铃，彭宣宪．现代生物学实验(下册)．北京: 高等教育出版社，2001]提取各菌株菌丝体总DNA，电泳检测定量后待用。
用真菌通用引物ITS4 和ITS5 扩增总DNA，ITS 区PCR 产物经纯化后直接用于测序，测序后的序列经校正后，在核酸序列数据库GenBank 中进行同源序列搜索( BLAST 搜索)，比较测试菌株同现有数据库中相应序列的相似程度。基于blast搜索，选取与研究菌株序列最接近的种或最靠近的进化分支代表菌株的序列进行比对，利用Mega6.0软件通过ML算法，利用bootstrap 1000次建树结果建立进化树（如图4所示）。结果表明CBSX2真菌与链格孢属（ Alternaria ochroleuca） 的同源相似性达到99%，氨基酸序列的相似性也达到了92%。
实施例2 CBSX2对纤维素降解能力的测定
①挑取分离纯化后的CBSX2不同菌落做5个重复，分别为1， 2, 3,4，5，制备菌液，将5ml菌液接种到50ml发酵培养基中28℃恒温震荡培养,驯化3-4次,降解周期逐渐缩短,以提高菌株对天然纤维素的降解能力；
菌液制备方法为：在PDA 平板上培养3 ～ 5d 后，从菌落边缘取菌丝块，移到50mL 马铃薯——葡萄糖培养液中，25℃条件下摇床150r /min 震荡培养2d。
发酵培养基配方为：秸秆10 g，(NH4)2SO4 4 g，K2HPO4 1 g，MgSO4· 7H2O 0.5 g，KH2PO4 1 g，蛋白胨1 g，酵母膏1 g，H2O 1000 mL，pH 7.0-7.2。
②将第一步驯化后的菌液，每个重复取1ml菌液接到50ml发酵培养基中28℃恒温振荡培养,另外取1ml无菌水放入50ml发酵培养基中28℃恒温振荡培养作为对照ck，分别在0d,4d,8d,12d,16d的时候测定各重复及对照的秸秆失重情况,记录秸秆失重率。
秸秆失重率计算方法:将上述5个时间的培养物,用无菌水冲洗经200目的尼龙网过滤清洗数次,挤干水分,至105℃烘箱干燥至恒重。 
式中:G一滤纸失重率(%)
M1一接种前稻草恒重(g)
M0一降解后稻草恒重(g)
结果（如图1）：
通过测定CBSX2菌株的秸秆降解率，未接种纤维素降解菌的对照CK其降解率仅为2.3%，CBSX2表现出的效果最好达到了23%。
    当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不仅限于上述举例，本技术领域的技术人员在本发明的实质范围内所做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种链格孢属（ Alternaria ochroleuca） CBSX2菌株，其特征在于：于2014年12月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会，保藏号是CGMCCNO.10141。
2.权利要求1所述链格孢属（ Alternaria ochroleuca） CBSX2菌株的应用，其特征在于：用于降解纤维素。
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